JP2022525848A - クラッベ病の治療に有用な組成物 - Google Patents

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Abstract

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの髄腔内送達用に製剤化された組成物であって、クラッベ患者への投与のためのヒトガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）遺伝子を担持するＡＡＶｈｕ６８カプシドを含む、組成物が提供される。新規の遺伝子配列およびその使用も提供される。【選択図】

Description

パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、約４．７キロ塩基（ｋｂ）の長さの一本鎖直鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを有する小さな非エンベロープ性の正二十面体ウイルスである。野生型ゲノムは、ＤＮＡ鎖の両端に逆位末端配列（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔｓ、ＩＴＲ）、ならびに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であるｒｅｐおよびｃａｐを含む。Ｒｅｐは、ＡＡＶの生活環に必要なｒｅｐタンパク質をコードする４つの重複遺伝子から構成され、ｃａｐは、カプシドタンパク質の重複ヌクレオチド配列であるＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含有し、自己集合して正二十面体対称のカプシドを形成する。
複製欠陥ヒトパルボウイルスに由来する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、遺伝子送達に好適なビヒクルとして記載されている。典型的には、機能的なｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子がベクターから除去されると、複製欠陥ベクターが得られる。これらの機能は、ベクター産生システムの中で提供されるが、最終ベクターには存在しない。
これまで、ヒトまたは非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離されたいくつかの異なる十分に特徴付けられたＡＡＶが存在している。異なる血清型のＡＡＶは、異なるトランスフェクション効率を示し、異なる細胞または組織に対して指向性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示すことが見出されている。多くの異なるＡＡＶ系統群（ｃｌａｄｅ）が、ＷＯ２００５／０３３３２１号に記載されており、その中には系統群Ｆが含まれ、ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３１、およびＡＡＶｈｕ３２という３つのメンバーのみを有することが特定されている。ＡＡＶ９の構造分析は、Ｍ．Ａ．ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（Ｊｕｎｅ
２０１２）ｖｏｌ．８６ ｎｏ．１２ ６９４７－６９５８．に提供されている。本論文では、ＡＡＶ９が（合計）６０コピーの３つの可変タンパク質（ｖｐ）を有することが報告され、それは、ｃａｐ遺伝子によってコードされ、重複配列を有する。これらには、ＶＰ１（８７ｋＤａ）、ＶＰ２（７３ｋＤａ）、およびＶＰ３（６２ｋＤａ）が含まれ、それぞれ、１：１：１０の予測された比率で存在する。ＶＰ３の配列全体は、ＶＰ２内にあり、ＶＰ２のすべては、ＶＰ１内にある。ＶＰ１は、固有のＮ末端ドメインを有する。精密化された座標および構造因子は、ＲＣＳＢ ＰＤＢデータベースから受入番号３ＵＸ１で入手可能である。
異なる組織を脱標的化または標的化するには、いくつかの異なるＡＡＶ９バリアントが操作されている。例えば、Ｎ．Ｐｕｌｉｃｈｅｒｉａ，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌｉｖｅｒ－ｄｅｔａｒｇｅｔｅｄ ＡＡＶ９ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉａｃ ａｎｄ Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ”，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ，１９，ｎｏ．６，ｐ．１０７０－１０７８（Ｊｕｎｅ ２０１１）を参照されたい。血液脳関門を横切って遺伝子を送達するためのＡＡＶ９バリアントの開発も報告されている。例えば、Ｂ．Ｅ．Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．２，ｐ２０４－２１１（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ １ Ｆｅｂ ２０１６）ａｎｄ Ｃａｌｔｅｃｈ ｐｒｅｓｓ ｒｅｌｅａｓｅ，Ａ．Ｗｅｔｈｅｒｓｔｏｎ，ｗｗｗ．ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ－ｃｅｎｔｒａｌ．ｃｏｍ／２０１６／０２／１０／ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ－ｄｅｌｉｖｅｒｙ－ｏｆ－ｇｅｎｅｓ－ｔｈｒｏｕｇｈ－ｔｈｅ－ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ－ｂａｒｒｉｅｒ／，ａｃｃｅｓｓｅｄ １０／０５／２０１６を参照されたい。また、ＷＯ２０１６／０４９２３０１およびＵＳ８，７３４，８０９も参照されたい。
ＡＡＶｈｕ６８は、天然源由来のカプシド遺伝子の増幅後に同定され、最近、新しいＡＡＶカプシドとして同定された。また、ＷＯ２０１８／１６０５８２も参照されたい。このＡＡＶは、ＡＡＶ９と同様に、系統群Ｆ内にある。
クラッベ病（Ｋｒａｂｂｅ ｄｉｓｅａｓｅ）（グロボイド細胞白質ジストロフィー、ＧＬＤ）は、加水分解酵素であるガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）をコードする遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体劣性のリソソーム蓄積症（ＬＳＤ）である（Ｗｅｎｇｅｒ Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．７０（１）：１－９）。この酵素は、ほぼ髄鞘のみに見られるガラクトシルセラミド（セラミド）およびガラクトシルスフィンゴシン（サイコシン）を含む特定のガラクト脂質の分解に関与している。クラッベ病では、ＧＡＬＣ欠損症は、リソソーム内のサイコシン（ただし、ガラクトシルセラミドではない）の毒性蓄積を引き起こす（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ ｅｔ ａｌ．，１９８０）。サイコシンの蓄積は、ミエリンを産生するＣＮＳのオリゴデンドロサイトおよびＰＮＳのシュワン細胞に対して、特に毒性があり、これらの細胞型の急速かつ広範な死をもたらす。ＣＮＳおよびＰＮＳの両方におけるミエリン分解は、反応性アストロサイトのグリオーシスおよび多核巨マクロファージ（「グロボイド細胞」）の浸潤を伴う（Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．（２００３）Ｊ Ｃｈｉｌｄ Ｎｅｕｒｏｌ．１８（９）：５９５－６０３）。ガラクトシルセラミドは、主に別の酵素であるＧＭ１ガングリオシドβ－ガラクトシダーゼによる加水分解（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２６０（２８）：１４９８２－７）およびガラクトシルセラミド合成の停止に寄与するオリゴデンドロサイトの死（Ｓｖｅｎｎｅｒｈｏｌｍ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．２１（１）：５３－６４）により、ＧＡＬＣ活性が不在の場合は蓄積しない。
現在、クラッベ病に対して利用可能な唯一の疾患修飾治療は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）であり、これは、多くの場合、臍帯血移植（ＵＣＢＴ）、同種末梢血幹細胞、または同種骨髄によって提供される。ＨＳＣＴを使用した乳児性クラッベ病を有する患者の治療は、わずかに成功しただけであり、典型的には、１歳の誕生日を迎える前に症状を呈する。乳児性クラッベ病における明らかな症状の発症後に実施される場合、ＨＳＣＴは、最小限の神経学的改善のみを提供し、実質的に生存率を改善しない（Ｅｓｃｏｌａｒ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３５２（２０）：２０６９－８１）。ＨＳＣＴは、症候前患者で実施された場合に効果的であり得るが、それでも、運動転帰は悪い（Ｅｓｃｏｌａｒ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ
Ｍｅｄ．３５２（２０）：２０６９－８１、Ｗｒｉｇｈｔ Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．８９（１３）：１３６５－１３７２、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｋ Ｂ．Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖ．２（１）：４９－６０）。３０日齢前に移植を受けた乳児は、後に移植を受ける乳児と比較して、より良好な生存率および機能的転帰を有した（Ａｌｌｅｗｅｌｔ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２４（１１）：２２３３－２２３８）。症候前の移植は、症状発症後の未治療のまたは治療された乳児性クラッベ病患者と比較して、顕著に良好な転帰をもたらすことが報告されており、進行性の中枢髄鞘形成、正常な受容言語、症状重症度の減衰、およびより長い生存期間を伴う（Ｅｓｃｏｌａｒ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３５２（２０）：２０６９－８１、Ｄｕｆｆｎｅｒ Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ．１１（６）：４５０－４、Ｗｒｉｇｈｔ Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．８９（１３）：１３６５－１３７２）。それでも、症状の出現前に治療されたほとんどの小児は、身長および体重について平均をかなり下回ったままであり、軽度の痙攣から独立した歩行の不能にわたって進行性の粗大運動遅延を有する（Ｅｓｃｏｌａｒ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．３５２（２０）：２０６９－８１、Ｄｕｆｆｎｅｒ Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００９
）Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ．１１（６）：４５０－４）。一部の子供は、後天性小頭症、胃瘻造設の必要性、および構音障害を含む残存障害も有する（Ｄｕｆｆｎｅｒ Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ．１１（６）：４５０－４）。さらに、ＨＳＣＴは、ＣＮＳ特異的疾患の病理にのみ影響を及ぼすように見える。末梢神経障害などのＰＮＳ病理に関連する臨床的特徴は、ＨＳＣＴの影響を受けないままである。これらの結果は、ＨＳＣＴの限界を強調するものであり、特に早期発症型では、疾患の急速な進行は、造血幹細胞が移植され、ＣＮＳに移行し、分化し、ＧＡＬＣ分泌および交差補正（すなわち、矯正細胞によって分泌される酵素がＧＡＬＣ欠損細胞によって取り込まれるプロセス）を通して治療効果がもたらされるのに必要な時間を上回る。
当該技術分野では、クラッベ病患者に対する改善された治療の必要性が、依然として存在する。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物が提供され、中枢神経系の細胞を標的とするＡＡＶカプシドと、（ｉ）タンパク質の発現を指示する配列の制御下で、配列番号１０のアミノ酸配列を有する成熟ガラクトシルセラミダーゼタンパク質をコードするガラクトシルセラミダーゼのコード配列、および（ｉｉ）ベクターゲノムをＡＡＶカプシド中にパッケージングするために必要なＡＡＶ逆位末端反復を含むベクターゲノムと、を含み、ベクターゲノムが、ＡＡＶカプシド中にパッケージングされる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである。特定の実施形態では、コード配列は、配列番号９の核酸配列、またはそれと９５％～９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、コード配列は、配列番号１０の成熟タンパク質、および中枢神経系のヒト細胞に好適な外因性シグナルペプチドをコードする。特定の実施形態では、調節配列は、ベータアクチンプロモーター、イントロン、および／またはウサギグロビンポリＡを含む。特定の実施形態では、組成物は、ベクターゲノムＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ｒＢＧを有するｒＡＡＶを含む。
特定の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルスが提供され、中枢神経系の細胞を標的とするＡＡＶカプシドと、（ｉ）成熟ガラクトシルセラミダーゼタンパク質の発現を指示する調節配列の制御下で、配列番号１０のアミノ酸配列を有する成熟ガラクトシルセラミダーゼタンパク質をコードするガラクトシルセラミダーゼのコード配列、および（ｉｉ）ベクターゲノムをＡＡＶカプシド中にパッケージングするために必要なＡＡＶ逆位末端配列を含むベクターゲノムと、を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである。特定の実施形態では、コード配列は、配列番号９の核酸配列、またはそれと９５％～９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、コード配列は、配列番号１０の成熟タンパク質、および中枢神経系のヒト細胞に好適な外因性シグナルペプチドをコードする。特定の実施形態では、調節配列は、ベータアクチンプロモーター、イントロン、および／またはウサギグロビンポリＡを含む。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ＲＢＧである。
特定の実施形態では、組成物が提供され、クラッベ病の治療に有用なｒＡＡＶのストックを含む。特定の実施形態では、組成物の使用が提供され、医薬品の調製におけるｒＡＡＶのストックを含む。特定の実施形態では、提供される組成物は、末梢神経の機能障害を治療する、かつ／またはクラッベ病を治療するのに有用である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、造血幹細胞療法、骨髄移植、および／または基質合成抑制療法（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）との併用療法として投与可能である。
特定の実施形態では、シグナルペプチドをコードするガラクトシルセラミダーゼのコード配列、および配列番号１０（ａａ４３～６８５）のアミノ酸配列を有する成熟ヒトガラ
クトシルセラミダーゼタンパク質を含むプラスミドが提供される。特定の実施形態では、プラスミドは、配列番号９の核酸配列、またはそれと９５％～９９．９％同一の配列を含む。
特定の実施形態では、クラッベ病によって引き起こされる呼吸不全および運動機能喪失を引き起こす末梢神経の機能障害を矯正し、またはクラッベ病によって引き起こされる発作の発症もしくは頻度の遅延させる、クラッベ病を治療するための組成物の使用が提供され、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のストックを含む組成物を、患者に投与することを含み、当該ｒＡＡＶが、（ａ）中枢神経系中の細胞を標的とするＡＡＶカプシドと、（ｂ）タンパク質の発現を指示する調節配列の制御下で、配列番号１０のアミノ酸配列を有する成熟ガラクトシルセラミダーゼタンパク質をコードするガラクトシルセラミダーゼのコード配列を含む、ベクターゲノムと、を含み、当該ベクターゲノムが、ベクターゲノムをＡＡＶカプシド中にパッケージングするために必要なＡＡＶ逆位末端配列をさらに含み、当該ベクターゲノムが、当該ＡＡＶカプシド中にパッケージングされる。特定の実施形態では、患者は、後期乳児性クラッベ病（ＬＩＫＤ）を有する。特定の実施形態では、患者は、若年性クラッベ病（ＪＫＤ）を有する。特定の実施形態では、患者は、思春期／成人発症性クラッベ病を有する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）、骨髄移植、および／または基質合成抑制療法との併用療法として投与される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶは、髄腔内、脳室内、または実質内投与を介して送達される。
特定の実施形態では、提供される組成物は、髄腔内、脳室内、実質内投与用に製剤化される。特定の実施形態では、組成物は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる大槽への（大槽内）後頭下注入を介して、単回用量として投与される。
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の本発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。
ＡＡＶ９（配列番号４）およびＡＡＶｈｕ６８（配列番号２）のカプシド配列の整列を提供する。ＡＡＶ９とＡＡＶｈｕ６８カプシドとの間で異なる２つのアミノ酸は、カプシドのＶＰ１（６７、１５７）およびＶＰ２（１５７）領域に位置する。略語：ＡＡＶ９：アデノ随伴ウイルス血清型９、ＡＡＶｈｕ６８：アデノ随伴ウイルス血清型ｈｕ６８、ＶＰ１：ウイルスタンパク質１、ＶＰ２：ウイルスタンパク質。 ＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ｒＢＧベクターゲノムの概略図を示す。線形マップは、ベクターゲノムを示し、遍在性ＣＢ７プロモーターの制御下で、ヒトＧＡＬＣを発現するように設計されている。ＣＢ７は、ＣＭＶ ＩＥエンハンサーとニワトリβ－アクチン（ＣＢ）プロモーターとの間のハイブリッドからなる。略語：ＣＭＶ ＩＥサ：イトメガロウイルス最初期、ＧＡＬＣ：ガルクトシルセラミダーゼ、ＩＴＲ：逆位末端配列、ＰｏｌｙＡ：ポリアデニル化、ｒＢＧ：ウサギβ－グロビン。 操作ｃＧＡＬＣ遺伝子（ｃＧＡＬＣｃｏ）が挿入された、ｐＥＮＮ ＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＲＢＧ（ｐ１０４４）のベクターマップを示す。 Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）の神経病理学的および行動学的表現型の進行を示す。マウスは、細胞傷害性サイコシンの蓄積、続いて食作用性グロボイド細胞によるＰＮＳ白質およびＣＮＳ白質の浸潤を示す。髄鞘形成の最初の期間の後、脱髄は、ＰＮＳ、続いてＣＮＳにおいてより少ない程度で観察され、それぞれ髄鞘を形成するシュワン細胞およびオリゴデンドロサイトの死に起因する。行動表現型は、振戦、痙攣、後肢の脱力、続いて麻痺および減量からなるＰＮＤ２０頃に現れ、ＰＮＤ４０頃に安楽死を必要とする。（Ｎｉｃａｉｓｅ Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．９４（１１）：１０４９－６１）から抜粋。略語：ＣＮＳ：中枢神経系、ＰＮＤ：生後日数、ＰＮＳ：末梢神経系、ｔｗｉ、痙攣機能喪失アレル。 Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスモデルを使用したＡＡＶ．ＣＢ７．ｃＧＡＬＣｃｏ．ｒＢＧ遺伝子療法の評価のための研究設計を示す。 症候前ＴｗｉｔｃｈｅｒマウスへのｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの静脈内または脳室内投与後の生存曲線を示す。新生児Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスへの、ＰＮＤ０に対する高用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ（１．００×１０１１ＧＣ［１．００×１０１４ＧＣ／ｋｇに相当］）のＩＶ投与により、生存期間の中央値が４９日（Ｎ＝６）になった。ＰＮＤ０における、新生仔Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスへの５倍低い用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ（２．００×１０１０ＧＣ）のＩＣＶ投与により、生存期間の中央値が６１．５日（Ｎ＝１０）になった。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを投与されたＴｗｉｔｃｈｅｒマウスの生存期間を、ビヒクル（ＰＢＳ）をＩＣＶ投与された対照としての同齢の（ａｇｅ－ｍａｔｃｈｅｄ）Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスの生存期間と比較した（Ｎ＝８）。略語：ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＶ：脳室内、ＩＶ：静脈内、Ｎ：動物数、ＰＮＤ：生後日数。 異なるＡＡＶカプシドを使用した、症候前ＴｗｉｔｃｈｅｒマウスへのＧＡＬＣの脳室内送達後の生存曲線を示す。ＡＡＶｈｕ６８ベクター（ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ）を、ＰＮＤ０で、２．００×１０１０ＧＣの用量でＩＣＶ投与すると、生存期間の中央値が６１．５日（Ｎ＝１０）になった。ＰＮＤ０で、２．００×１０１０ＧＣの用量のＡＡＶ１、ＡＡＶ３ｂ、またはＡＡＶ５のベクターをＩＣＶ投与すると、生存期間の中央値が６０日未満になり（ＡＡＶ１：５７日間［Ｎ＝６］、ＡＡＶ３ｂ：５１日間［Ｎ＝９］、ＡＡＶ５：５１日間［Ｎ＝６］）、一方、ＰＮＤ０で、ビヒクルのみ（ＰＢＳ）をＩＣＶ投与された対照Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスでは、生存期間の中央値が４３日（Ｎ＝８）を示した。略語：ＡＡＶ３ｂ：ＡＡＶ血清型３ｂ、ＡＡＶ５：ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ１：ＡＡＶ血清型１、およびＡＡＶｈｕ６８：ＡＡＶ血清型ｈｕ６８（ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ）、ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＶ：脳室内、Ｎ：動物数、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＰＮＤ：生後日数。 症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに異なる用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを脳室内投与した後の神経運動機能を示す。症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、ＰＮＤ０で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを、２．００×１０１０ＧＣ（Ｎ＝１０）、５．００×１０１０ＧＣ（Ｎ＝１２）、または１．００×１０１１ＧＣ（Ｎ＝１２）の用量でＩＣＶ投与された。脳質量１グラム当たりの用量（新生仔マウスでは０．１５ｇ）は、それぞれ１．３０×１０１１ＧＣ／ｇ、３．３０×１０１１ＧＣ／ｇ、および６．７０×１０１１ＧＣ／ｇに相当した。対照として、ＰＮＤ０で、同齢の症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）（Ｎ＝８）、および同齢の非罹患マウス（ｔｗｉ／＋または＋／＋、Ｎ＝１４）に、ＰＢＳがＩＣＶ投与された。ＰＮＤ３５で、神経運動機能は、最初５ＲＰＭで回転し、１２０秒間かけて４０ＲＰＭまで増加する加速ロッド上で走るマウスが落下するまでの時間（秒）によって評価された。＊＊ｐ＜０．０１は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、ダンの多重比較検定によって測定される。略語：ＡＮＯＶＡ：分散分析、ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＶ：脳室内、Ｎ：動物数、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＰＮＤ：生後日数、ＲＰＭ：１分間あたりの回転数。 症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに、異なる用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを、脳室内投与した後の生存曲線を示す。ビヒクル（ＰＢＳ）をＩＣＶ投与された対照Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、生存期間の中央値が４３日（Ｎ＝８）を示した。ＰＮＤ０で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣをＩＣＶ投与されたＴｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、２．００×１０１０ＧＣ（Ｎ＝１０）の用量では６１．５日、５．００×１０１０ＧＣ（Ｎ＝１２）の用量では９９日、１．００×１０１１ＧＣ（Ｎ＝１２）の用量では１３０日の生存期間の中央値を示した。脳質量１グラム当たりのｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの用量（新生仔マウスでは０．１５ｇ）は、それぞれ１．３０×１０１１ＧＣ／ｇ、３．３０×１０１１ＧＣ／ｇ、および６．７０×１０１１ＧＣ／ｇに相当した。略語：ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＶ：脳室内、Ｎ：動物数、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＰＮＤ：生後日数。 症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに対するｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの脳室内投与後の神経運動機能を示す。症候前新生仔Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、ＰＮＤ０で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを１．００×１０１１ＧＣ（Ｎ＝１２）の用量でＩＣＶ投与された。早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、ＰＮＤ１２で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを１．００×１０１１ＧＣ（Ｎ＝１２）または２．００×１０１１ＧＣ（Ｎ＝１１）のいずれかの用量でＩＣＶ投与された。後期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、ＰＮＤ２１で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを２．００×１０１１ＧＣ（Ｎ＝１６）のより高い用量でＩＣＶ投与された。同齢の非罹患マウス（ｔｗｉ／＋および＋／＋、Ｎ＝２７）および罹患Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ、Ｎ＝１５）は、ＰＮＤ１２で、対照としてビヒクル（ＰＢＳ）をＩＣＶ投与された。ＰＮＤ３５で、神経運動機能は、最初５ＲＰＭで回転し、１２０秒間かけて４０ＲＰＭまで増加する加速ロッド上で走るマウスが落下するまでの時間（秒）によって評価された。＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いてダンの多重比較検定によって決定される。略語：ＡＮＯＶＡ：分散分析、ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＶ：脳室内、Ｎ：動物数、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＰＮＤ：生後日数、ＲＰＭ：１分間あたりの回転数。 症候性ＴｗｉｔｃｈｅｒマウスにｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを脳室内投与した後の生存曲線を示す。ＰＮＤ１２で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを１．００×１０１１ＧＣ（Ｎ＝１２）または２．００×１０１１ＧＣ（Ｎ＝１１）のいずれかの用量でＩＣＶ投与された早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、それぞれ７１日または８１日の生存期間の中央値を有した。ＰＮＤ２１で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを２．００×１０１１ＧＣ（Ｎ＝１６）の用量でＩＣＶ投与された後期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、生存期間の中央値が５１．５日であった。比較として、ＰＮＤ０またはＰＮＤ１２のいずれかで、ビヒクル（ＰＢＳ）をＩＣＶ投与された対照Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ、既存対照、研究１［ＰＮＤ０］からＮ＝８および研究２［ＰＮＤ１２］からＮ＝４）は、生存期間の中央値が５０日未満を示した。略語：ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＶ：脳室内、Ｎ：動物数、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＰＮＤ：生後日数。 症候性ＴｗｉｔｃｈｅｒマウスにｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを脳室内投与した後の、臨床スコアリングおよび神経運動機能を示す。早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ、Ｎ＝９）は、ＰＮＤ１２で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを２．００×１０１１ＧＣの用量でＩＣＶ投与された。同齢の早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ、Ｎ＝９）、非罹患Ｔｗｉｔｃｈｅｒヘテロ接合マウス（ｔｗｉ／＋、Ｎ＝１０）、および野生型マウス（Ｎ＝８）は、ＰＮＤ１２で、対照として、ＰＢＳをＩＣＶ投与された。（図１１Ａ）各マウスを、臨床スコアリング評価を使用して、クラスピング（ｃｌａｓｐｉｎｇ）能力、歩行、振戦、後弯（ｋｙｐｈｏｓｉｓ）、および毛皮の質について、ＰＮＤ２２に始めてＰＮＤ４０での剖検まで、毎日評価した。各動物に累積スコアを割り当て、次いで、研究期間中のＡＡＶ処置によって正規化した。スコアがより高いほど、臨床状態がより悪いことを示す。（図１１Ｂ）ＰＮＤ３５で、神経運動機能は、最初５ＲＰＭで回転し、１２０秒間かけて４０ＲＰＭまで増加する加速ロッド上で走るマウスが落下するまでの時間（秒）によって評価された。＊ｐ＜０．０５は、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、ダン多重比較検定によって決定される。略語：ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＶ：脳室内、Ｎ：動物数、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＰＮＤ：生後日数、ＲＰＭ：１分間あたりの回転数。 症候性ＴｗｉｔｃｈｅｒマウスにｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを脳室内投与した後の坐骨神経の組織学を示す。早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ、Ｎ＝９）は、ＰＮＤ１２で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを２．００×１０１１ＧＣの用量でＩＣＶ投与された。同齢の早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ、Ｎ＝９）および非罹患野生型マウス（Ｎ＝８）は、ＰＮＤ１２で、対照として、ＰＢＳをＩＣＶ投与された。２８日後のＰＮＤ４０で、マウスを剖検し、坐骨神経の試料を得た。ルクソールブルーおよびＰＡＳ反応染色を組織切片上で行い、それぞれミエリン（濃い染色）およびグロボイド細胞（薄い染色）を可視化した。略語：ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＶ：脳室内、Ｎ：動物数、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＰＡＳ：過ヨウ素酸シッフ、ＰＮＤ：生後日数。 生後１２日目に症候性ＴｗｉｔｃｈｅｒマウスにｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを脳室内投与した２８日後のＧＡＬＣ活性を示す。早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ、Ｎ＝９）は、ＰＮＤ１２で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを２．００×１０１１ＧＣの用量でＩＣＶ投与された。同齢の早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ、Ｎ＝９）および非罹患野生型マウス（Ｎ＝８）は、ＰＮＤ１２で、対照として、ＰＢＳをＩＣＶ投与された。２８日後のＰＮＤ４０で、マウスを剖検し、脳、肝臓、および血清の試料を得た。フルオロフォアベースのアッセイを使用して、ＧＡＬＣ酵素活性のレベル（相対ＦＵ）を定量した。略語：ＦＵ：蛍光単位、ＧＡＬＣ：ガラクトシルセラミダーゼ、ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＶ：脳室内、Ｎ：動物数、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＰＮＤ：生後日数。 ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣおよび骨髄移植の併用療法後の暫定的な生存曲線を示す。Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）を、ＢＭＴのみ（Ｎ＝１３、ＰＮＤ１０）、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣのみ（Ｎ＝１２、ＰＮＤ０、またはＮ＝１３、ＰＮＤ１２、ＩＣＶ、１．００×１０１１ＧＣ）、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣに続いてＢＭＴ（Ｎ＝７、それぞれＰＮＤ０およびＰＮＤ１０）、またはＢＭＴに続いてｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ（Ｎ＝７、それぞれＰＮＤ１０およびＰＮＤ１２）で処理した。ＰＢＳを投与されたＴｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、既存対象としてのみ機能した（Ｎ＝８、研究１、ＰＮＤ０、Ｎ＝４、研究２、ＰＮＤ１２）。生存の中間結果が示されており、実験はまだ進行中である。略語：ＢＭＴ：骨髄移植、ＧＣ：ゲノムコピー、ＩＣＶ：脳室内、Ｎ：動物数、ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水、ＰＮＤ：生後日数 クラッベイヌの神経病理および行動表現型の進行を示す（Ｗｅｎｇｅｒ Ｄ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ Ｈｅｒｅｄ．９０（１）：１３８－４２、Ｂｒａｄｂｕｒｙ Ａ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ Ｊ．２９（６）：４１７－４２４、Ｂｒａｄｂｕｒｙ Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６ｂ）９４（１１）：１００７－１７、Ｂｒａｄｂｕｒｙ Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（７）：７８５－８０１）。破線は、指定された表現型についての前の時点に関するデータが記載されていないことを示す。＊星印は、組織学で観察される脱髄を指す。略語：ＢＡＥＲ：脳幹聴性誘発応答、ＣＮＳ：中枢神経系、ＭＲＩ：磁気共鳴画像法、ＮＣＶ：神経伝導速度、ＰＮＳ：末梢神経系。 第１のファースト・イン・ヒューマン臨床試験の第１／２相の設計を示す。コホート１（低用量）およびコホート２（高用量）で、３人の対象にそれぞれ投薬し、その後、対象＃３および＃６の後に必須の安全委員会の審査を行う。コホート１およびコホート２の第１の対象の登録後、３０日間の間隔を置いて、各コホートの次の２人の対象が同時に登録される。コホート３（ＭＴＤ）の６人の対象が、時間差投与（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｄｏｓｉｎｇ）なしで、同時に登録される。略語：ＦＩＨ：ファースト・イン・ヒューマン、ＬＴＦＵ：長期フォローアップ、ＭＴＤ：最大耐容用量。 提案された第１／２相試験の安全性評価のための決定木を示す。＊治験中止基準には、治験責任医師によって評価された治験薬またはＩＣＭ注入手順に関連するグレード３以上の有害事象（ＡＥ）が複数の対象に発生した場合が含まれる。＊＊メディカルレビューは、メディカルモニターによって、主任治験責任医師と共に行われる。＊＊＊コホート３の対象が同時に登録される。ＭＴＤでの投薬は、各対象間の４週間の安全性観察期間とずれることはない。コホート３の最初の３人の対象が登録された後、安全性委員会の審査を必要としない。略語：ＡＥ：有害事象、ＩＣＭ：大槽内、ＭＴＤ：最大耐容用量、ＳＲＴ：安全性審査トリガー。 第１／２相試験のイベントスケジュールの表を示す。 ＨＳＣＴの８週間後の野生型およびＴｗｉｔｃｈｅｒ（クラッベ）マウスの小脳におけるＧＦＰ＋ドナー細胞の脳生着を示す。 操作ＧＡＬＣ（ｃＧＡＬＣｃｏ）または天然イヌＧＡＬＣ（ｃＧＡＬｎａｔ）の配列のいずれかを有するｒＡＡＶｈｕ６８を投与されたＴｗｉｔｃｈｅｒマウスにおける血清ＧＡＬＣ活性の比較を示す。生存率の向上は、天然配列を有するｒＡＡＶｈｕ６８と比較して、ｒＡＡＶｈｕ．ｃＧＡＬＣｃｏが投与されたＴｗｉｔｃｈｅｒマウスで観察された。 トランスプラスミドｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲ（ｐ００６８）の線形ベクターマップを示す。略語：ＡＡＶ２：アデノ随伴ウイルス血清型２、ＡＡＶｈｕ６８：アデノ随伴ウイルス血清型ｈｕ６８、ｂｐ：塩基対、Ｃａｐ：カプシド、ＫａｎＲ：カナマイシン耐性、Ｏｒｉ：複製起点、Ｒｅｐ：レプリカーゼ。 アデノウイルスヘルパープラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）を示す。（図２２Ａ）親プラスミドｐＢＨＧ１０から、中間体ｐＡｄΔＦ１およびｐＡｄΔＦ５を介した、ヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ６の誘導。（図２２Ｂ）ｐＡｄΔＦ６のアンピシリン耐性遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子に置き換えて、ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）を得た。 クラッベイヌにおけるＡＡＶ．ＣＢ７．ｃＧＡＬＣｃｏ．ｒＢＧ遺伝子療法の評価のための研究設計を示す。 ＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣをクラッベイヌにＩＣＭ投与した後の生存およびＣＳＦへの酵素分泌を示す。（図２４Ａ）生存曲線（継続中）。（図２４Ｂおよび図２４Ｃ）蛍光基質（Ｍａｒｋｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，カタログ番号Ｍ２７７４）を使用した、ＣＳＦ中のＧＡＬＣ活性の測定。 ＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣを投与した後の、クラッベイヌにおける脛骨運動神経（図２５Ａ）、ならびに橈骨感覚神経（図２５Ｂ）、坐骨運動神経（図２５Ｃ）、および尺骨運動神経（図２５Ｄ）における神経伝導速度（ＮＣＶ）を示す。周期的なＮＣＶ記録は、クラッベシャム（ｓｈａｍ）処置イヌでの遅延シグナル（図２５Ａ）または未検出シグナル（図２５Ｂ）シグナルを示し、一方、４匹すべてのｒＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣ処置動物は、同齢のＷＴ対照イヌと同様の正常化された速度を有する。 シャムおよびｒＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣ処置クラッベイヌの神経学的検査の結果を示す。 シャム処置およびＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣ処置クラッベイヌ由来の脳切片の組織学からの結果を示す。（図２６Ａ）ミエリンのルクソールブルー染色。（図２６Ｂ）ＩＢＡ１免疫染色（ミクログリアマーカー）および（図２６Ｃ）その定量。 ビヒクルまたはＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣのいずれかを受けた野生型（ビヒクル処置）およびクラッベイヌの体重曲線を示す。 シャム処置のクラッベイヌおよび野生型イヌ、ならびにＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣを投与されたクラッベイヌにおける、ＣＳＦおよび感覚ニューロンの安全性モニタリングを示す。（図２８Ａ）ＣＳＦ髄液細胞増多。（図２８Ｂ）ＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣ処置クラッベイヌ由来の後根神経節の組織学。 シャム処置のクラッベイヌおよび野生型イヌ、ならびにＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣを投与されたクラッベイヌにおける、ＭＲＩ測定値を示す。 図２９ＡにおけるＭＲＩ測定の累積スコアリングの結果を示す。 ベクター生成のための製造プロセスのフロー図を示す。略語：ＡＥＸ：アニオン交換、ＣＲＬ：Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｄｄＰＣＲ：デジタルドロップレットポリメラーゼ連鎖反応、ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地、ＤＮＡ：デオキシリボ核酸、ＦＦＢ：最終製剤緩衝液、ＧＣ：ゲノムコピー、ＨＥＫ２９３：ヒト胎児由来腎臓２９３細胞、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、ＰＥＩ：ポリエチレンイミン、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＴＦＦ：接線流濾過、ＵＳＰ：米国薬局方、ＷＣＢ：作業用細胞バンク。 ベクター製剤のための製造プロセスフロー図を示す。略語：Ａｄ５：アデノウイルス血清型５、ＡＵＣ：分析用超遠心分離、ＢＤＳ：バルク原薬、ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン、ＣＺ：Ｃｒｙｓｔａｌ Ｚｅｎｉｔｈ、ｄｄＰＣＲ：ドロップレットデジタルポリメラーゼ連鎖反応、Ｅ１Ａ：初期領域１Ａ（遺伝子）、ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ、ＦＤＰ：最終製剤、ＧＣ：ゲノムコピー、ＨＥＫ２９３：ヒト胎児由来腎臓２９３細胞、ＩＴＦＦＢ：髄腔内最終製剤緩衝液、ＫａｎＲ：カナマイシン耐性（遺伝子）、ＭＳ：質量分析、ＮＧＳ：次世代配列決定、ｑＰＣＲ：定量的ポリメラーゼ連鎖反応、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＴＣＩＤ５０：５０％組織培養感染量、ＵＰＬＣ：超高速液体クロマトグラフィ、ＵＳＰ：米国薬局方。
ヒトガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）タンパク質を発現する組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）、ならびにｒＡＡＶを含む組成物およびその使用が提供される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣは、症候性の幼児性クラッベ患者（幼児性クラッベ病、ＥＩＫＤ）の疾患修飾治療を初めて提供する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣは、症候前乳児患者のための治療を提供する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣは、呼吸不全および運動機能喪失を引き起こす末梢神経を矯正することができる療法を提供する。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣは、ベネフィットリスク比が現在唯一の疾患修飾治療である造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）には有利ではない遅発患者の治療のための追加の選択肢を提供する。
本明細書で使用される場合、「ｒＡＡＶ．ＧＡＬＣ」は、ＡＡＶカプシドを有するｒＡＡＶを指し、その中にパッケージングされる、少なくともガラクトシルセラミダーゼタンパク質（酵素）のコード配列を含むベクターゲノムを有する。ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＡＬＣは、ＡＡＶカプシドがＡＡＶｈｕ６８カプシドであるｒＡＡＶを指し、本明細書で定義される。以下の実施例は、他のＡＡＶカプシドも示す。
「ｃＧＡＬＣ」という用語は、イヌＧＡＬＣを発現するコード配列を指し、イヌにおける研究のための以下の実施例で使用される。イヌＧＡＬＣは、２６ｂｐのシグナルペプチド、および全長が６６９アミノ酸のタンパク質を有する。
「ｈＧＡＬＣ」という用語は、ヒトＧＡＬＣのコード配列を指す。
ｈＧＡＬＣのアイソフォーム１は、正規配列であり、６８５アミノ酸長である。そのアミノ酸配列は、配列番号６に再現される。成熟タンパク質は、約アミノ酸４３～約６８５に位置し、シグナルペプチドは、１～４２位に位置するが、いくつかの示唆によると、開始Ｍｅｔは、位置１ではなく位置１７である。ＧＡＬＣの複数のアイソフォーム（アイソフォーム１～５）が知られており、３０超の天然バリアントが記載されているが、本発明者らは、位置６４１にスレオニン（Ｔ）からアラニン（Ａ）への変異を有するバリエーションが特に望ましいことを発見した。この配列は、配列番号１０に提供される。このバリアントは、ヒトガラクトシルセラミダーゼ（ｈＧＡＬＣ）のコード配列によってコードされるタンパク質配列であり、本明細書に提供されるｒＡＡＶおよびベクターゲノムの実施例に例示される。ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）はガラクトセレブロシダーゼとしても知られており、これらの名称は互換的に使用される。特定の実施形態では、このバリアントは、酵素補充療法または併用療法で使用され得る。
本明細書で使用される場合、「ＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ｒＢＧ」は、ベクターゲノ
ム（例えば、図２に示される）を指し、遍在性ＣＢ７プロモーターの制御下で、ヒトＧＡＬＣのコード配列を含み、少なくともＣＭＶ ＩＥ（サイトメガロウイルス最初期）エンハンサー、キメライントロン、およびウサギβ－グロビン（ｒＢＧ）ポリＡ配列を含み、それらのすべては、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲに隣接している。特定の実施形態では、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ｒＢＧは、配列番号１０のアミノ酸配列を有する成熟ＧＡＬＣタンパク質をコードするＧＡＬＣのコード配列を含む。特定の実施形態では、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ｒＢＧは、配列番号９の核酸配列、またはそれと９５％～９９．９％同一の配列を含むＧＡＬＣのコード配列を含む。さらに別の実施形態では、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ｒＢＧベクターゲノムは、配列番号１９を含む。特定の実施形態では、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ｒＢＧは、配列番号１０の成熟タンパク質のコード配列および外因性シグナルペプチドを含む。
特定の実施形態では、天然シグナルペプチドのすべてまたは一部が除去され、外因性シグナルペプチドで置換された、少なくとも成熟ＧＡＬＣ（ａａ１－１７、またはａａ１－４２）を含む融合タンパク質が企図される。かかる融合タンパク質は、外因性シグナルペプチド、および少なくとも成熟ヒトＧＡＬＣタンパク質（例えば、配列番号６または配列番号１０のアミノ酸４３～６９５）を含んでいてもよい。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＮＳのヒト細胞に好適な外因性シグナルペプチド（すなわち、ヒトＣＮＳに存在する細胞におけるタンパク質（すなわち、ｈＧＡＬＣ）の産生、細胞内輸送、および／または分泌を改善するために、天然シグナルペプチドが置換されたシグナルペプチド）を含む。ＣＮＳのヒト細胞に好適な外因性シグナルペプチドとしては、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ１２、ＩＬ１８など）、インスリン、アルブミン、β－グルクロニダーゼインスリン、アルカリプロテアーゼ、フォン・ウィルブランド因子（ＶＷＦ）、またはフィブロネクチンの分泌シグナルペプチドに天然に見られるものが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂ＿ｍａｍｍａｌｉａも参照されたい）。
また、本発明では、本明細書に提供されるＧＡＬＣタンパク質（例えば、配列番号６、配列番号１０、または成熟ＧＡＬＣを含む融合タンパク質）をコードする核酸配列も包含される。特定の実施形態では、コード配列は、タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列である。しかし、対応するＲＮＡ配列も包含される。
特定の実施形態では、核酸コード配列は、配列番号５のｃＤＮＡ配列、またはそれと９５％～９９．９％同一の配列、もしくはその断片を有する。好適な断片としては、成熟タンパク質のコード配列（約ｎｔ１２７～約ｎｔ２０５８）、またはシグナルペプチドの断片を有する成熟タンパク質のコード配列（例えば、約ｎｔ５４～約ｎｔ２０５８）が挙げられる。特定の実施形態では、コード配列は、配列番号５の成熟ｈＧＡＬＣ（ｎｔ１２７～２０５８）またはそのリーダーもしくは外因性リーダーを含む融合タンパク質をコードする核酸配列、あるいはそれと９５％～９９．９％同一の配列を有する。特定の実施形態では、コード配列は、配列番号５の成熟ｈＧＡＬＣをコードする核酸配列（ｎｔ１２７～２０５８）、またはそれと９５％～９９．９％同一の配列、あるいはその断片（リーダー配列および成熟ｈＧＡＬＣの断片を含む）を有する。特定の実施形態では、コード配列は、配列番号１０のアミノ酸配列を有する全長ヒトＧＡＬＣタンパク質をコードする。特定の実施形態では、コード配列は、配列番号５のｈＧＡＬＣリーダー（核酸１～１２６）および成熟タンパク質（核酸１２７～２０５８によってコードされる）をコードする。
特定の実施形態では、発現カセットは、後根神経節（ｄｒｇ）におけるｈＧＡＬＣの発現を抑制する１つ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む（例えば、２０２０年２月１２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９／６７８７２号を参照されたい（参照により本
明細書に援用される））。
本明細書で使用される場合、クラッベ病（グロボイド細胞白質ジストロフィー（ＧＬＤ）としても知られている）は、ミエリンのガラクト脂質の分解を担う酵素であるガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）の活性に影響を与える変異によって引き起こされるリソソーム蓄積症である。いくつかのタイプのクラッベ病が記載されており、酵素欠損の重症度に依存する。最も重篤なものから最も重篤でない酵素欠損症は、６ヶ月齢以下の発症によって定義される早期乳児性クラッベ病（ＥＩＫＤ）、７ヶ月から１２ヶ月の発症によって定義される後期乳児性クラッベ病（ＬＩＫＤ）、１３ヶ月から１０歳の発症によって定義される若年性クラッベ病（ＪＫＤ）、および思春期／成人発症性クラッベ病である。
特定の実施形態では、有効量のｒＡＡＶ．ＧＡＬＣベクターは、ＣＳＦ中のＧＡＬＣ酵素のレベルを、正常レベルの約３０％～約１００％以内に増加させる。他の実施形態では、有効量のｒＡＡＶ．ＧＡＬＣベクターは、血漿中のＧＡＬＣ酵素のレベルを、正常レベルの約３０％～約１００％以内に増加させる。特定の実施形態では、より低い量の増加したＧＡＬＣのＣＳＦレベルまたは血漿レベルが観察されるが、本明細書に記載されるように、クラッベ病に関連する症状のうちの１つ以上で改善が観察される。
「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は、２つの要素、ＡＡＶカプシド、およびＡＡＶカプシド内にパッケージされた少なくとも非ＡＡＶコード配列を含むベクターゲノムを含むＤＮＡｓｅ耐性ウイルス粒子である。特に明記しない限り、この用語は「ｒＡＡＶベクター」という句と互換的に使用され得る。ｒＡＡＶは、任意の機能的ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子または機能的ＡＡＶキャップ遺伝子を欠き、子孫を生成することができないため、「複製欠陥ウイルス」または「ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、唯一のＡＡＶ配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）であり、ＩＴＲ間に位置する遺伝子および調節配列がＡＡＶカプシド内にパッケージされることを可能にするために、典型的にはベクターゲノムの５’および３’最末端に位置する。
本明細書で使用される場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシドの内側にパッケージされる核酸配列を指す。かかる核酸配列は、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。本明細書の実施例では、ベクターゲノムは、少なくとも５’から３’に、ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、コード配列、およびＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。ＡＡＶ２からのＩＴＲ、カプシドとは異なる供給源ＡＡＶ、または完全長ＩＴＲ以外が選択され得る。特定の実施形態では、ＩＴＲは、産生中のｒｅｐ機能またはトランス相補ＡＡＶを提供するＡＡＶと同じＡＡＶ供給源由来である。さらに、他のＩＴＲが使用され得る。さらに、ベクターゲノムは、遺伝子産物の発現を指示する制御配列を含む。ベクターゲノムの好適な成分が本明細書でより詳細に考察される。
ＡＡＶｈｕ６８
以下の実施例で記載されるように、本発明で提供されるｒＡＡＶは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを含む。例えば、ＷＯ２０１８／１６０５８２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。ＡＡＶｈｕ６８は、系統群Ｆ内にある。ＡＡＶｈｕ６８（配列番号２）は、ｖｐ１の位置６７および１５７の２つのコードされたアミノ酸によって、別の系統群ＦのウイルスであるＡＡＶ９（配列番号４）とは異なる。対照的に、他の系統群ＦのＡＡＶ（ＡＡＶ９、ｈｕ３１、ｈｕ３１）は、位置６７にＡｌａおよび位置１５７にＡｌａを有する。
ｒＡＡＶｈｕ６８は、ＡＡＶｈｕ６８のカプシドおよびベクターゲノムからなる。一実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８を含む組成物は、ｖｐ１タンパク質の異種集団、ｖｐ２タンパク質の異種集団、およびｖｐ３タンパク質の異種集団の集合体を含む。本明細書で使
用される、ｖｐカプシドタンパク質を参照するために使用される場合、「異種」という用語またはその任意の文法的変形は、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２、またはｖｐ３モノマー（タンパク質）を有する、同じではない要素からなる集団を指す。配列番号２は、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質のコードされたアミノ酸配列を提供する。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含み、配列番号２の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基が含まれる。例えば、特定の亜集団は、配列番号２のアスパラギン－グリシン対中に少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高脱アミド化アスパラギン（Ｎ）位置を含み、任意選択的に、他の脱アミド化アミノ酸をさらに含み、脱アミド化は、アミノ酸の変化および他の任意選択的な修飾をもたらす。これらおよび他の修飾の様々な組み合わせは、本明細書に記載されている。
本明細書で使用される場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、少なくとも１つの定義された共通の特徴を有し、少なくとも１つの群メンバーから参照群のすべてのメンバーよりも少ないメンバーからなるｖｐタンパク質の群を指す。
例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中の少なくとも１つの（１）ｖｐ１タンパク質であり、すべてのｖｐ１タンパク質未満である。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、別途指定されない限り、組み立てられたＡＡＶカプシド中のすべてのｖｐ３タンパク質よりも少ない１つ（１）ｖｐ３タンパク質であり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質は、ｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質は、ｖｐタンパク質の別個の亜集団であり得、ｖｐ３は、組み立てられたＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質のさらなる亜集団であり得る。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの高度脱アミド化アスパラギン、例えば、アスパラギン－グリシン対で異なる修飾を有するサブ集団を含み得る。
別途指定されない限り、高度な脱アミド化とは、参照アミノ酸の位置で予測されたアミノ酸配列と比較して、参照アミノ酸の位置で、少なくとも４５％の脱アミド化、少なくとも５０％の脱アミド化、少なくとも６０％の脱アミド化、少なくとも６５％の脱アミド化、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、最大約１００％の脱アミド化を指す（例えば、配列番号２のアミノ酸５７で、少なくとも８０％のアスパラギンが、総ｖｐ１タンパク質に基づいて脱アミド化され得、または配列番号２のアミノ酸４０９で、２０％のアスパラギンが、総ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質に基づいて脱アミド化され得る）。かかる割合は、２Ｄゲル、質量分析技術、または他の好適な技術を使用して決定され得る。
本明細書に提供されるように、配列番号２の各脱アミド化されたＮは、独立して、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）、アスパルテート、ならびに／またはＡｓｐおよびｉｓｏＡｓｐの相互変換ブレンド、あるいはこれらの組み合わせであり得る。α－およびイソアスパラギン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形態では、比率は、１０：１～１：１０のアスパラギン酸対イソアスパラギン酸、約５０：５０のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、もしくは約１：３のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、または別の選択された比率であり得る。特定の実施形態では、配列番号２の１つ以上のグルタミン（Ｑ）は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、すなわちα－グルタミン酸、γ－グルタミン酸（Ｇｌｕ）、またはα－およびγ－グルタミン酸のブレンド（共通のグルタルイミド中間体を介して相互変換され得る）に脱アミド化され得る。α－およびγ－グルタミン酸の任意の好適な比率が存在し得る。例えば、特定の実施形
態では、比率は、１０：１～１：１０のα対γ、約５０：５０のα：γ、もしくは約１：３のα：γ、または別の選択された比率であり得る。
したがって、ｒＡＡＶｈｕ６８は、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３タンパク質のｒＡＡＶｈｕ６８カプシド内の亜集団を含み、最低でも、少なくとも１つの高度に脱アミド化されたアスパラギンを含む少なくとも１つの亜集団を含む。さらに、他の修飾は、特に選択されたアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基位置での異性化を含み得る。さらに他の実施形態では、修飾は、Ａｓｐ位置でのアミド化を含み得る。
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、少なくとも４個～少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３の亜集団を含み、そのうちの少なくとも１～１０％が、配列番号２のコードされたアミノ酸配と比較して、脱アミド化されている。これらの大部分はＮ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基は脱アミド化され得る。
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、さらに、以下のうちの１つ以上を特徴とする。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質が、配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１タンパク質、配列番号１から産生されたｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号２の１～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする配列番号１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１の少なくともヌクレオチド４１２～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、および／または配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３タンパク質、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号２の少なくとも約アミノ酸２０３～７３６の予測されたアミノ酸配列をコードする、配列番号１の少なくともヌクレオチド６０７～２２１１と少なくとも７０％同一の核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質、を含む。
追加的に、または代替的に、任意選択的に、位置１５７にバリンを含むｖｐ１タンパク質の異種集団、任意選択的に、位置１５７にバリンを含むｖｐ２タンパク質の異種集団、およびｖｐ３タンパク質の異種集団を含むＡＡＶカプシドが提供され、少なくともｖｐ１およびｖｐ２タンパク質の亜集団は、位置１５７にバリンを含み、任意選択的に、配列番号２のｖｐ１カプシドの番号付けに基づいて、位置６７にグルタミン酸をさらに含む。追加的に、または代替的に、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号２の少なくとも約アミノ酸１３８～７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、および配列番号２の少なくともアミノ酸２０３～７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含むＡＡＶｈｕ６８カプシドが提供され、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、アミノ酸修飾を有する亜集団を含む。
ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質は、典型的には、配列番号２の全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸１～７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる選択的スプライシングバリアントとして発現される。任意選択的に、ｖｐ１コード配列は、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質を発現するために単独で使用さ
れる。あるいは、この配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、または配列番号２のａａ２０３～７３６をコードする配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列、のうちの１つ以上と共発現され得る。追加的に、または代替的に、ｖｐ１コード配列および／またはｖｐ２コード配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（例えば、配列番号１のｎｔ４１２～２２１２１）、または配列番号２の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列と、共発現され得る。
本明細書に記載されるように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号２のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸配列、および任意選択的に、追加の核酸配列（例えば、ｖｐ１および／またはｖｐ２固有領域を含まないｖｐ３タンパク質をコードする配列）からカプシドを発現する産生システムで産生されるｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生から得られたｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、およびｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内、およびｖｐ３タンパク質内に亜集団を含有し、配列番号２の予測されるアミノ酸残基からの修飾を有する。これらの亜集団は、少なくとも脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基が含まれる。例えば、アスパラギン－グリシン対中のアスパラギンは、高度に脱アミド化されている。
一実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１核酸配列は、配列番号１の配列、またはそれに相補的な鎖、例えば、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡを有する。特定の実施形態では、ｖｐ２および／またはｖｐ３タンパク質は、追加的または代替的に、例えば、選択された発現系においてｖｐタンパク質の比を変化させるために、ｖｐ１とは異なる核酸配列から発現され得る。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）をコードする核酸配列も提供される。特定の実施形態では、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１のｎｔ４１２～２２１１）をコードする核酸配列も提供される。
しかしながら、配列番号２のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列は、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの産生に使用するために選択され得る。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号１と少なくとも７０％～９９％同一、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の核酸配列、または配列番号１の約ｎｔ４１２～約ｎｔ２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８～７３６）をコードする。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１の約ｎｔ６０７～約
ｎｔ２２１１の核酸配列、または配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１と少なくとも７０％～９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一の配列を有し、配列番号２のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３～７３６）をコードする。
ＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）、またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む、このｒＡＡＶｈｕ６８カプシドをコードする核酸配列を設計することは、当該技術分野の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１に提供される。他の実施形態では、配列番号１と７０％～９９．９％同一の核酸配列を選択して、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を発現し得る。特定の他の実施形態では、核酸配列は、配列番号１と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％～９９．９％同一である。かかる核酸配列は、選択されたシステム（すなわち、細胞型）における発現のためにコドン最適化され得、様々な方法によって設計することができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開された方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えば、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して実行され得る。１つのコドン最適化方法は、例えば、米国国際特許公開第ＷＯ ２０１５／０１２９２４号に記載され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。また、例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号および米国特許公開第２００６／０１３６１８４号を参照されたい。好適には、製品のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を修正する。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＯＲＦの断片のみが改変され得る。これらの方法のうちの１つを使用することによって、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用して、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生することができる。コドンへの実際の変更を実行するため、または本明細書に記載されるように設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、いくつかのオプションが利用可能である。かかる修飾または合成は、当業者に周知の標準的かつ日常的な分子生物学的操作を使用して行うことができる。１つのアプローチでは、各８０～９０ヌクレオチドの長さ、および所望の配列の長さにまたがる一連の相補的オリゴヌクレオチド対は、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、アニーリングの際に、付着末端を含む８０～９０塩基対の二本鎖断片が形成されるように合成され、例えば、対の各オリゴヌクレオチドは、対の他のオリゴヌクレオチドと相補的である領域を超えて３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の塩基を伸長するように合成される。オリゴヌクレオチドの各対の一本鎖末端は、オリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖末端とアニールするように設計される。オリゴヌクレオチド対をアニールさせ、次いで、これらの二本鎖断片のおよそ５～６個を、凝集性一本鎖末端を介して一緒にアニールさせ、次いで、それらを一緒にライゲーションし、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次いで、構築物を標準的な方法で配列決定する。一緒にライゲーションされた８０～９０塩基対断片の５～６個の断片、すなわち、約５００塩基対の断片からなるこれらの構築物のいくつかを調製し、所望の配列全体が一連のプラスミド構築物で表されるようにする。次いで、これらのプラスミドの挿入物を適切な制限酵素で切断し、一緒にライゲーションして、最終構築物を形成する。次いで、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。追加の方法は、当業者にはすぐに明らかであろう。さらに、遺伝子合成は、商業的に容易に利用可能である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１、ｖｐ２およびｖｐ３タンパク質のＮ－Ｇ対のアスパラギン（Ｎ）は、高度に脱アミド化される。ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質の場合、４個の残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は、様々なロッ
トにわたって７０％超の脱アミド化レベルを日常的に示し、ほとんどの場合、９０％超である。さらなるアスパラギン残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、およびＱ５９９）も、様々なロットにわたって最大約２０％の脱アミドレベルを示す。脱アミド化レベルは、最初にトリプシン消化を使用して特定され、キモトリプシン消化で検証された。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、高度に脱アミド化されたｒＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質に少なくとも４つのアスパラギン（Ｎ）位置を有する、ＡＡＶのｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３カプシドタンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、約２０～５０％のＮ－Ｎ対（Ｎ－Ｎ－Ｎトリプレットを除く）は、脱アミド化を示す。特定の実施形態では、第１のＮは、脱アミド化されている。特定の実施形態では、第２のＮは、脱アミド化されている。特定の実施形態では、脱アミド化は、約１５％～約２５％の脱アミド化である。配列番号２の位置２５９のＱにおける脱アミド化は、ＡＡＶｈｕ６８タンパク質のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３カプシドタンパク質の約８％～約４２％である。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質のＤ２９７におけるアミド化によってさらに特徴付けられる。特定の実施形態では、配列番号２の番号付けに基づいて、ＡＡＶｈｕ６８カプシドのｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３タンパク質の位置２９７のＤの約７０％～約７５％がアミド化されている。特定の実施形態では、カプシドのｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３の少なくとも１つのＡｓｐは、Ｄ－Ａｓｐに異性化される。かかる異性体は、一般に、配列番号２の番号付けに基づいて、残基位置９７、１０７、３８４のうちの１つ以上のＡｓｐの約１％未満の量で、存在する。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質を有するＡＡＶＶｈｕ６８カプシドを有し、以下の表で示される位置に、１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の脱アミド化された残基の組み合わせを含む亜集団を有する。ｒＡＡＶの脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動、および／または質量分析、および／またはタンパク質モデリング技術を使用して決定され得る。オンラインクロマトグラフィは、ＮａｎｏＦｌｅｘ ｓｏｕｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに結合されたＡｃｃｌａｉｍ ＰｅｐＭａｐカラムおよびＴｈｅｒｍｏ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実行され得る。ＭＳデータは、Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦのデータ依存性Ｔｏｐ－２０法を使用して取得され、調査スキャン（２００～２０００ｍ／ｚ）から、最も豊富でまだ配列決定されていない前駆体イオンを動的に選択する。シーケンシングは、予測自動増加制御で決定された１ｅ５イオンの標的値で、より高いエネルギー衝突解離断片化を介して行われ、４ｍ／ｚのウィンドウで前駆体の単離を行った。ｍ／ｚ ２００で１２０，０００の解像度で、調査スキャンを取得した。ＨＣＤスペクトルの解像度は、最大イオン注入時間が５０ｍｓ、正規化された衝突エネルギーが３０、ｍ／ｚが２００で、３０，０００に設定され得る。Ｓ－レンズＲＦレベルを５０に設定して、消化物からのペプチドが占めるｍ／ｚ領域の透過率を最適化できる。前駆体イオンは、単一、割り当てられていない、または断片化選択から６つ以上の電荷状態で除外され得る。ＢｉｏＰｈａｒｍａ Ｆｉｎｄｅｒ １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、取得したデータの分析に使用され得る。ペプチドマッピングのために、固定変更としてカルバミドメチル化が設定された単一エントリのタンパク質ＦＡＳＴＡデータベース、可変修飾として酸化、脱アミド、およびリン酸化の設定、１０ｐｐｍ質量精度、高プロテアーゼ特異性、ならびにＭＳ／ＭＳスペクトルに対する信頼レベル０．８を使用して検索を行う。好適なプロテアーゼの例としては、例えば、トリプシンまたはキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は、無傷分子の質量＋
０．９８４ Ｄａ（－ＯＨおよび－ＮＨ２基の質量差）を付加するので、脱アミド化ペプチドの質量分析的同定は比較的簡単である。特定のペプチドの脱アミド化の割合は、脱アミド化ペプチドの質量面積を、脱アミド化ペプチドおよび天然ペプチドの面積の合計で割ることによって決定される。考えられる脱アミド化部位の数を考慮すると、異なる部位で脱アミド化されている同重体は、単一のピークで共移行し得る。したがって、複数の潜在的脱アミド部位を有するペプチドに由来する断片イオンを使用して、複数の脱アミド部位を特定または区別することができる。これらの事例では、観察された同位体パターン内の相対強度を使用して、異なる脱アミド化ペプチド異性体の相対的存在量を特異的に決定することができる。この方法は、すべての異性体種についての断片化効率が同じであり、脱アミド化部位において独立していることを想定する。これらの例示的な方法のいくつかの変形が使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。例えば、好適な質量分析器は、例えば、Ｗａｔｅｒｓ ＸｅｖｏもしくはＡｇｉｌｅｎｔ ６５３０などの四重飛行質量分析器（ＱＴＯＦ）、またはＯｒｂｉｔｒａｐ ＦｕｓｉｏｎまたはＯｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）などのオービトラップ装置を含み得る。好適な液体クロマトグラフィシステムとしては、例えば、ＷａｔｅｒｓまたはＡｇｉｌｅｎｔシステム（１１００または１２００シリーズ）からのＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステムが含まれる。好適なデータ分析ソフトウェアとしては、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、ＰｉｎｐｏｉｎｔおよびＰｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）が含まれ得る。さらに他の技法は、例えば、２０１７年６月１６日にオンラインで公開されたＸ．Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５－２６７に記載され得る。
Figure 2022525848000001
Figure 2022525848000002
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドが、配列番号２のアミノ酸配列の番号付けに基づいて、少なくとも４５％のＮ残基が、位置Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、および／またはＮ５１２のうちの少なくとも１つで脱アミド化されているカプシドタンパク質を有することを特徴とする。特定の実施形態では、これらのＮ－Ｇの位置（すなわち、配列番号２のアミノ酸配列の番号付けに基づいて、Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、および／またはＮ５１２）のうちの１つ以上で、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも９０％のＮ残基が脱アミド化されている。これらおよび他の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドが、配列番号２のアミノ酸配列の番号付けに基づいて、位置Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７、および／またはＱ５９９のうちの１つ以上で、約１％～約２０％のＮ残基が脱アミド化を有する、タンパク質の集団を有することを特徴とする。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８は、配列番号２のアミノ酸配列の番号付けに基づいて、位置Ｎ３５、Ｎ５７、Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３２９、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４５２、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９、Ｎ７３５のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせで脱アミド化されている、ｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３タンパク質の少なくとも亜集団を含む。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、１つ以上のアミド化アミノ酸を有し得る。
さらに他の修飾が観察されるが、それらのほとんどは、あるアミノ酸が異なるアミノ酸残基に変換されることはない。任意選択的に、カプシドのｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３中の少なくとも１つのＬｙｓが、アセチル化されている。任意選択的に、カプシドのｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３中の少なくとも１つのＡｓｐが、Ｄ－Ａｓｐに異性化されている。任意選択的に、カプシドのｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３中の少なくとも１つのＳ（Ｓｅｒ、セリン）が、リン酸化されている。任意選択的に、カプシドのｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３中の少なくとも１つのＴ（Ｔｈｒ、スレオニン）が、リン酸化されている。任意選択的に、カプシドのｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３中の少なくとも１つのＷ（ｔｒｐ、トリプトファン）が、酸化されている。任意選択的に、カプシドのｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３中の少なくとも１つのＭ（Ｍｅｔ、メチオニン）が、酸化されている。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、１つ以上のリン酸化を有する。例えば、特定のｖｐ１カプシドタンパク質は、位置１４９でリン酸化され得る。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団であって、ｖｐ１タンパク質が、位置６７のグルタミン酸（Ｇｌｕ）および／または位置１５７のバリン（Ｖａｌ）を含む、ｖｐ１タンパク質の異種集団、任意選択的に、位置１５７のバリン（Ｖａｌ）を含むｖ
ｐ２タンパク質の異種集団、およびｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２のアミノ酸配列の残基番号付けに基づいて、ｖｐ１タンパク質の位置５７に位置するアスパラギン－グリシン対の少なくとも６５％のアスパラギン（Ｎ）、およびｖｐ１、ｖ２、およびｖｐ３タンパク質の位置３２９、４５２、および／または５１２のアスパラギン－グリシン対の少なくとも７０％のアスパラギン（Ｎ）が脱アミド化されている、少なくとも１つの亜集団を含み、脱アミド化が、アミノ酸変化をもたらす。
本明細書でより詳細に論じられるように、脱アミド化アスパラギンは、アスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換アスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、またはそれらの組み合わせに脱アミド化され得る。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８は、さらに、以下のうちの１つ以上を特徴とする：（ａ）ｖｐ２タンパク質の各々は、独立して、配列番号２の少なくともｖｐ２タンパク質をコードする核酸配列の産物である、（ｂ）ｖｐ３タンパク質の各々は、独立して、配列番号２の少なくともｖｐ３タンパク質をコードする核酸配列の産物である、（ｃ）ｖｐ１タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１、または配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％）同一の配列であり、配列番号２のアミノ酸配列をコードする。任意選択的に、その配列は、ｖｐ１、ｖｐ２、およびｖｐ３タンパク質を発現するために単独で使用される。あるいは、この配列は、ｖｐ１の固有領域（約ａａ１～約ａａ１３７）および／またはｖｐ２の固有領域（約ａａ１～約ａａ２０２）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８
ｖｐ３のアミノ酸配列（約ａａ２０３～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（例えば、配列番号１の約ｎｔ６０７～約ｎｔ２２１１）、または配列番号２のａａ２０３～７３６をコードする配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列、のうちの１つ以上と共発現され得る。追加的に、または代替的に、ｖｐ１コード配列および／またはｖｐ２コード配列は、ｖｐ１固有領域（約ａａ１～約１３７）を有しない配列番号２のＡＡＶｈｕ６８ ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８～７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（例えば、配列番号１のｎｔ４１２～２２１１）、または配列番号２の約ａａ１３８～７３６をコードする配列番号１と少なくとも７０％～少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％）同一の配列と、共発現され得る。
追加的に、または代替的に、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の番号付けに基づいて、位置Ｎ５７、Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３２９、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４５２、Ｎ４７７、Ｎ５１２、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９のうちの１つ以上、またはそれらの組み合わせで脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を少なくとも含み、（ｅ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の番号付けに基づいて、位置Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９のうちの１つ以上、またはこれらの組み合わせで１％～２０％の脱アミノ化を含むｖｐ１、ｖｐ２、および／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含み、（ｆ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の番号付けに基づいて、ｖｐ１タンパク質の位置５７のＮの６５％～１００％が脱アミド化されているｖｐ１の亜集団を含み、（ｇ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質の位置５７のＮの７５％～１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質の亜集団を含み、（ｈ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の番号付けに基づいて、位置３２９のＮの８０％～１００％が脱アミノ化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、および／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含み、（ｉ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の番号付けに基づいて、位置４５２のＮの８０％～１００％が脱アミノ化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、および／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含み、（ｊ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号２の番号付けに基づいて、位置５１２のＮの８０％～１００％が脱アミノ化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質、および／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含み、（ｋ）ｒＡＡＶは、約１のｖｐ１タンパク質：約１～１．５のｖｐ２タンパク質：３～１０のｖｐ３タンパク質の比率で、約６０個の総カプシドタンパク質を含み、（ｌ）ｒＡＡＶは、約１のｖｐ１タンパク質：約１のｖｐ２タンパク質：３～９のｖｐ３タンパク質の比率で、約６０個の総カプシドタンパク質を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８は、アスパラギン－グリシン対のグリシンを変更して、脱アミド化を低減するように修飾される。他の実施形態では、アスパラギンは、異なるアミノ酸、例えば、より遅い速度で脱アミド化されるグルタミン、またはアミド基を欠くアミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギンが、アミド基を含む）、および／またはアミン基を欠くアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが、アミド基を含む）に変更される。本明細書で使用される場合、アミドまたはアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファン、および／またはプロリンを指す。記載されるような修飾は、コードされたＡＡＶｈｕ６８のアミノ酸配列に見出されるアスパラギン－グリシン対のうちの１つ、２つ、または３つにあり得る。特定の実施形態では、かかる修飾は、アスパラギン－グリシン対の４つすべてでは行われない。したがって、より低い脱アミド化率を有する、ｒＡＡＶｈｕ６８および／または操作されたｒＡＡＶｈｕ６８バリアントの脱アミド化を低減するための方法が提供される。加えて、または代替え的に、１つ以上の他のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変更して、ｒＡＡＶｈｕ６８の脱アミド化を低減し得る。
これらのアミノ酸修飾は、従来の遺伝子工学技術によって行われ得る。例えば、修飾されたＡＡＶｈｕ６８ ｖｐのコドンを含む核酸配列が生成され得、配列番号２の位置５８、３３０、４５３、および／または５１３のグリシン（アスパラギン－グリシン対）をコードするコドンのうちの１～３個が、グリシン以外のアミノ酸をコードするように修飾される。特定の実施形態では、修飾アスパラギンコドンを含む核酸配列は、配列番号２の位置５７、３２９、４５２、および／または５１２に位置するアスパラギン－グリシン対のうちの１～３個が操作され得、アスパラギン以外のアミノ酸をコードするように修飾される。各修飾コドンは、異なるアミノ酸をコードし得る。代替的に、改変されたコドンのうちの１個以上は、同じアミノ酸をコードし得る。特定の実施形態では、これらの修飾ＡＡＶｈｕ６８核酸配列は、天然ｈｕ６８カプシドよりも低い脱アミド化を含むカプシドを有する変異体ｒＡＡＶｈｕ６８を生成するために使用され得る。かかる変異ｒＡＡＶｈｕ６８は、免疫原性を低下させ、かつ／または貯蔵（特に、懸濁液形態での貯蔵）の際の安定性を増加させ得る。本明細書で使用される場合、「コドン」は、アミノ酸をコードする配列における３つのヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、「コードされたアミノ酸配列」は、アミノ酸に翻訳される参照核酸配列の既知のＤＮＡコドンの翻訳に基づいて予測されるアミノ酸を指す。以下の表は、ＤＮＡコドンおよび２０個の共通アミノ酸を例示し、１文字コード（ＳＬＣ）および３文字コード（３ＬＣ）の両方を示す。
Figure 2022525848000003
ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、特定の実施形態で有用であり得る。例えば、かかるカプシドは、遺伝子療法の患者におけるＡＡＶｈｕ６８濃度レベルをモニタリングするためのアッセイに有用なモノクローナル抗体の生成および／または試薬の生成に使用され得る。有用な抗ＡＡＶｈｕ６８抗体を産生するための技術、かかる抗体または空のカプシドの標識、および好適なアッセイフォーマットは、当業者に既知である。
特定の実施形態では、配列番号１の核酸配列、または本明細書に記載の修飾（例えば、脱アミド化アミノ酸）を含む配列番号２のｖｐ１のアミノ酸配列をコードする少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の配列、を使用して産生される。特定の実施形態では、ｖｐ１アミノ酸配列は、配列番号２に再現される。
本明細書で使用される場合、ＡＡＶの群に関連する「系統群（ｃｌａｄｅ）」という用語は、互いに系統的に関連するＡＡＶの群を指し、ＡＡＶ ｖｐ１アミノ酸配列の整列に基づいて、少なくとも７５％のブートストラップ値（少なくとも１０００反復のうち）お
よび０．０５以下のポアソン補正距離測定値による隣接結合アルゴリズム（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して決定される。隣接結合アルゴリズムは、文献に記載されている。例えば、Ｎｅｉ ａｎｄ Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。コンピュータプログラムが利用可能であり、それを使用して、このアルゴリズムを実装することができる。例えば、ＭＥＧＡ ｖ２．１プログラムは、修正Ｎｅｉ－Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装する。これらの技術およびコンピュータプログラム、ならびにＡＡＶ ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を使用して、当業者は、選択されたＡＡＶが、本明細書で特定される１つの系統群（ｃｌａｄｅ）に含まれるか、別の系統群に含まれるか、またはこれらの系統群の外にあるかを容易に決定することができる。例えば、Ｇ Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００４ Ｊｕｎ；７８（１０：６３８１－６３８８（系統群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦを同定する）、およびＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５３０５５３～ＡＹ５３０６２９を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。
本明細書で使用される場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、複数のＡＡＶ９ ｖｐタンパク質からなる自己集合ＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ９ ｖｐタンパク質は、典型的には、配列番号４のｖｐ１のアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＳ９９２６４）をコードする配列番号３の核酸配列によってコードされる選択的スプライスバリアントとして発現される。これらのスプライスバリアントは、配列番号４の異なる長さのタンパク質をもたらす。特定の実施形態では、「ＡＡＶ９カプシド」は、ＡＡＳ９９２６４と９９％同一、または配列番号４と９９％同一のアミノ酸配列を有するＡＡＶを含む。また、ＵＳ７９０６１１１およびＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。本明細書で使用される「ＡＡＶ９バリアント」には、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１、およびＵＳ８，７３４，８０９に記載のバリアントが含まれる。
カプシド、それ故にコード配列を産生する方法、ならびにｒＡＡＶウイルスベクターの産生方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、核酸またはその断片に言及する場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴って別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてヌクレオチド配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、またはそのオープンリーディングフレーム、または少なくとも１５ヌクレオチド長である別の好適な断片にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
核酸配列の文脈で「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または「パーセント同一」という用語は、最大限対応するように整列させたときに同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性の比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コード配列の全長、または、望ましくは、少なくとも約５００～５０００個のヌクレオチドの断片にわたり得る。しかしながら、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は少なくとも約２０～２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８～３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの、より小さい断片間の同一性も望まれ得る。同様に、「パーセント配列同一性」は、タンパク質の全長わたるアミノ酸配列またはその断片について容易に決定することができる。好適には、断片は、少なくとも約８アミノ酸長であり、最大で約７００アミノ酸長であり得る。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「実質的相同性」または「実質的類似性」という用語は、アミノ酸またはその断片に言及する場合、適切なアミノ酸の挿入または欠失を伴って別のアミノ酸（またはその相補鎖）と最適に整列した場合、整列した配列の少なくとも約９５～９９％においてアミノ酸配列の同一性がある。好ましくは、相同性は、全長配列、もしくはそのタンパク質、例えば、ｃａｐタンパク質、ｒｅｐタンパク質、または少なくとも８アミノ酸長であるそれらの断片、もしくはより好ましくは、少なくとも１５アミノ酸長にわたる。好適な断片の例は、本明細書に記載されている。
「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは、少なくとも９０％の同一性、より好ましくは、９７％超の同一性を意味する。同一性は、当業者に既知のアルゴリズムおよびコンピュータプログラムを用いることによって、当業者によって容易に決定される。
一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス間の「同一性」、「相同性」、または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」、または「類似性」は、「整列された」配列を参照して決定される。「整列した」配列または「整列」とは、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指し、参照配列と比較して、多くの場合、欠損または追加の塩基またはアミノ酸についての補正を含む。実施例では、公開されたＡＡＶ９配列を参照点として使用してＡＡＶ整列を行う。整列は、公共のまたは市販のいずれかの様々な多重配列整列プログラムを用いて行われる。かかるプログラムの例としては、インターネット上のウェブサーバを通してアクセス可能な「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ」、「ＣＡＰ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」、および「ＭＥＭＥ」が挙げられる。かかるプログラムの他のソースは、当業者に既知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩユーティリティもまた使用される。また、当該技術分野で既知のいくつかのアルゴリズムが存在し、上に記載のプログラムに含まれるものを含め、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる。別の例として、ポリヌクレオチド配列は、ＧＣＧバージョン６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、照会配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および検索配列（ｓｅａｒｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の最良の重複領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、ＧＣＧバージョン６．１（参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるように、Ｆａｓｔａ（商標）をそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ６およびスコアリングマトリックスのためのＮＯＰＡＭ因子）と共に使用して決定することができる。「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、および「Ｍａｔｃｈ－Ｂｏｘ」プログラムなどの多重配列整列プログラムもまた、アミノ酸配列に対して利用可能である。一般に、これらのプログラムのいずれかがデフォルト設定で使用されるが、必要に応じて、当業者は、これらの設定を変更することができる。あるいは、当業者は、別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができ、参照のアルゴリズムおよびプログラムによって提供されるように、少なくとも同一性のレベルまたは整列が提供される。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ
ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２－２６９０（１９９９）を参照されたい。
ｒＡＡＶベクター
上述のように、ＡＡＶｈｕ６８の配列およびタンパク質は、ｒＡＡＶの産生に有用であり、組換えＡＡＶベクター（アンチセンス送達ベクター、遺伝子療法ベクター、またはワクチンベクターであり得る）にも有用である。さらに、本明細書に記載の操作されたＡＡ
Ｖカプシド（例えば、配列番号２のｖｐ１カプシドタンパク質の番号付けに対して、位置６７、１５７、またはその両方に変異体アミノ酸を有するＡＡＶカプシド）は、標的細胞および組織へのいくつかの好適な核酸分子の送達のためのｒＡＡＶベクターを操作するために使用され得る。
ＡＡＶカプシド中にパッケージングされ宿主細胞に送達されるゲノム配列は、典型的には、最低でもトランス遺伝子、およびその調節配列、およびＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）から構成される。一本鎖ＡＡＶおよび自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶの両方がｒＡＡＶに含まれる。導入遺伝子は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害剤）、または他の遺伝子産物をコードするベクター配列とは異種の核酸コード配列である。
特に、本開示は、ヒトガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）のコード配列を含むｒＡＡＶを提供する。一部の実施形態では、コード配列は、操作されたＧＡＬＣコード配列である。一部の実施形態では、コード配列は、配列番号９のｃＧＡＬＣ遺伝子（ｃＧＡＬＣｃｏ）の配列である。
核酸コード配列は、標的組織の細胞中で導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で調節要素に作動可能に連結される。一部の実施形態では、調節配列は、ベータアクチンプロモーター、イントロン、およびウサギグロビンポリＡを含む。特定の実施形態では、調節配列は、配列番号１３を有する。特定の実施形態では、調節配列は、配列番号１５を有する。特定の実施形態では、調節配列は、配列番号１６を有する。
ベクターのＡＡＶ配列は、典型的には、シス作用性５’および３’逆位末端反復配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５ １６８（１９９０）を参照されたい）。ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする全体配列が分子内で使用されるが、これらの配列のある程度の軽微な修飾が許容される。これらのＩＴＲ配列を修飾する能力は、当技術分野の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）；ａｎｄ Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０ ５３２（１９９６）を参照されたい）。本発明で利用されるかかる分子の一例は、選択された導入遺伝子配列および関連する調節要素が５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子を含む「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給するものとは異なるＡＡＶ由来である。一実施形態では、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列である。Ｄ配列および末端分離部位（ｔｒｓ）が欠失している、ΔＩＴＲと称される５’ＩＴＲの短縮バージョンが記載されている。他の実施形態では、全長ＡＡＶ５’および３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ起源からのＩＴＲが選択されてもよい。ＩＴＲの起源がＡＡＶ２からであり、ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ起源からのものである場合、得られたベクターは、シュードタイプであると称され得る。しかし、これらの要素の他の構成も好適であり得る。
組換えＡＡＶベクターについて上述した主要要素に加えて、ベクターは、プラスミドベクターでトランスフェクトされた、または本発明により産生されたウイルスに感染した細胞中でその転写、翻訳、および／または発現を可能にするような様式で導入遺伝子と作動可能に連結される必要な従来の制御要素も含む。本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」配列は、目的の遺伝子と隣接する発現制御配列、および目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。
調節制御要素は、典型的には、発現制御配列の一部として、例えば、選択される５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置するプロモーター配列を含む。構成的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８およびＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］、組織特異的プロモーター、または生理学的ヒントに応答するプロモーターが、本明細書に記載されるベクターに使用され得る。プロモーターは、異なる供給源、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０最初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリモマウイルスプロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または神経膠原線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）潜伏関連プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ニューロン特異的プロモーター（ＮＳＥ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、ｈＳＹＮ、メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）プロモーター、ＣＢＡ、マトリックス金属タンパク質プロモーター（ＭＰＰ）、およびニワトリベータアクチンプロモーターから選択され得る。プロモーターに加えて、ベクターは、１つ以上の他の適切な転写開始、終結、エンハンサー配列、スプライシングおよびポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えばＷＰＲＥ、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を増強する配列、および必要に応じて、コードされた産物の分泌を増強する配列を含み得る。好適なエンハンサーの例は、ＣＭＶエンハンサーである。他の適切なエンハンサーには、所望の標的組織適応症に適切なものが含まれる。一実施形態では、発現カセットは、１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは、２つ以上の発現エンハンサーを含む。これらのエンハンサーは同じであっても、互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーは、ＣＭＶ前初期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２つのコピーに存在し得る。あるいは、エンハンサーの二重コピーは、１つ以上の配列により分離される。さらに別の実施形態では、発現カセットは、イントロン、例えば、ニワトリベータアクチンイントロンをさらに含む。他の好適なイントロンには、当該技術分野で既知のものが含まれ、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８号などに記載されている。好適なポリＡ配列の例には、例えば、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、および合成ポリＡが含まれる。任意選択的に、１つ以上の配列を選択して、ｍＲＮＡを安定させてもよい。かかる配列の一例は、修飾ＷＰＲＥ配列であり、これは、ポリＡ配列の上流およびコード配列の下流で操作され得る［例えば、ＭＡ Ｚａｎｔａ－Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５－６１９．を参照されたい。
これらのｒＡＡＶは、特に、防御免疫を誘導することを含む、治療目的および免疫化のための遺伝子送達に適している。さらに、本発明の組成物は、インビトロで所望の遺伝子産物を産生するために使用され得る。インビトロ産生のために、所望の産物（例えば、タンパク質）は、所望の産物をコードする分子を含むｒＡＡＶで宿主細胞をトランスフェクションし、発現を可能にする条件下で細胞培養物を培養した後、所望の培養物から得ることができる。次いで、発現した産物は、所望される場合、精製および単離され得る。トランスフェクション、細胞培養、精製、および単離に好適な技術は、当業者に既知である。
ｒＡＡＶベクター産生
ＡＡＶウイルスベクター（例えば、組換え（ｒ）ＡＡＶ）の産生における使用のために、発現カセットは、パッケージング宿主細胞に送達される任意の好適なベクター、例えば、プラスミド上に担持され得る。本発明において有用なプラスミドは、とりわけ、原核細胞、昆虫細胞、哺乳類細胞におけるインビトロでの複製およびパッケージングに適しているように操作され得る。好適なトランスフェクション技術およびパッケージ宿主細胞は、既知であり、かつ／または当業者によって容易に設計することができる。
ベクターとしての使用に好適なＡＡＶを生成および単離するための方法は、当該技術分野において既知である。一般に、例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ａｓ ａ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９－１４５、Ｂｕｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：７１７－７３３、および以下に引用される参考文献を参照されたい（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。遺伝子をビリオンにパッケージするために、ＩＴＲは、発現カセットを含む核酸分子と同じ構築物中でシスに必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子は、トランスで供給され得る。
一実施形態では、本明細書に記載される発現カセットは、ウイルスベクターを産生するために、その上に運ばれる免疫グロブリン構築物配列をパッケージング宿主細胞に導入する遺伝要素（例えば、シャトルプラスミド）に操作される。一実施形態では、選択される遺伝子要素は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、およびプロトプラスト融合を含む任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージ細胞に送達され得る。安定したＡＡＶパッケージ細胞も作製することができる。代替的には、発現カセットは、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを生成するために、またはインビトロでの抗体の混合物の産生のために使用され得る。かかる構築物を作製するために使用される方法は、核酸操作における技術者に既知であり、遺伝子工学、組換え工学、および合成技術を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
用語「ＡＡＶ中間体」または「ＡＡＶベクター中間体」は、それにパッケージされた所望のゲノム配列を欠失している組み立てられたｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空の」カプシドと称され得る。そのようなカプシドは、発現カセットの検出可能なゲノム配列をまったく含まないか、または遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にパッケージされたゲノム配列のみを含み得る。これらの空のカプシドは、宿主細胞に目的の遺伝子を導入するために非機能的である。
本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、既知の技法を使用して産生されてもよい。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、ＵＳ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。かかる方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列、機能的ｒｅｐ遺伝子、最低限でもＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）および導入遺伝子からなる発現カセット、ならびに発現カセットをＡＡＶカプシドタンパク質にパッケージングするのを許可する十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。カプシドを産生する方法、そのためのコード配列、およびｒＡＡＶウイルスベクターを産生するための方法が記載されている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１－６０８６（２００３）およびＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
一実施形態では、組換えｒＡＡＶｈｕ６８を産生するために有用な産生細胞培養物が提供される。かかる細胞培養物は、宿主細胞中でｒＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を発現する核酸、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシド中にパッケージングするのに好適な核酸分子（例
えば、ＡＡＶ ＩＴＲを含むベクターゲノム）、および宿主細胞で産物の発現を指示する配列と作動可能に連結された遺伝子産物をコードする非ＡＡＶ核酸配列、ならびに組換えＡＡＶｈｕ６８カプシドへの核酸分子のパッケージングを可能にするのに十分なＡＡＶ ｒｅｐ機能およびアデノウイルスヘルパー機能を含む。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、とりわけヒト胚性腎臓２９３細胞）または昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス）で構成される。
好適には、ｒｅｐ機能は、ベクターゲノムに存在するＩＴＲと同じ供給源から、またはベクターゲノムをＡＡＶカプシド中にパッケージングする別の供給源（例えば、ＡＡＶｈｕ６８）由来のＡＡＶによって提供される。特定の実施形態では、ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶ２由来である。別の実施形態では、ｒｅｐタンパク質は、ＡＡＶｈｕ６８ｒｅｐ以外の異種ｒｅｐタンパク質であり、例えば、限定されないが、ＡＡＶ１ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ２ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ３ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ４ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ５ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ６ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ７ ｒｅｐタンパク質、ＡＡＶ８ ｒｅｐタンパク質、またはｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、ｒｅｐ４０、ｒｅｐ６８／７８、およびｒｅｐ４０／５２、またはそれらの断片、あるいは別の供給源であり得る。これらのＡＡＶｈｕ６８または変異体ＡＡＶカプシド配列のうちのいずれかは、産生細胞でそれらの発現を指示する外因性調節制御配列の制御下にあり得る。
一実施形態では、細胞は、適切な細胞培養（例えば、ＨＥＫ２９３）細胞において製造される。本明細書に記載される遺伝子療法ベクターを製造するための方法は、当該分野においてよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの産生のために使用されるプラスミドＤＮＡの産生、ベクターの産生、およびベクターの精製を含む。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶベクターであり、産生されたプラスミドは、ＡＡＶゲノムおよび目的の遺伝子をコードするＡＡＶシス－プラスミド、ＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶトランス－プラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地への培地交換、ベクターを含む細胞および培養培地の回収などの方法ステップを含み得る。回収されたベクター含有細胞および培養培地は、本明細書では粗細胞回収物と称される。さらに別のシステムでは、遺伝子治療ベクターは、バキュロウイルスベースベクターによる感染によって昆虫細胞に導入される。これらの産生システムに関するレビューについては、概して、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ－ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０：９２２－９２９を参照されたい（各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に援用される）。これらおよび他のＡＡＶ生産システムの製造および使用方法は、以下の米国特許にも記載され、それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：５，１３９，９４１、５，７４１，６８３、６，０５７，１５２、６，２０４，０５９、６，２６８，２１３、６，４９１，９０７、６，６６０，５１４、６，９５１，７５３、７，０９４，６０４、７，１７２，８９３、７，２０１，８９８、７，２２９，８２３、および７，４３９，０６５。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣの製造プロセスは、プラスミドＤＮＡによるＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを伴う。単一バッチまたは複数バッチは、ＰＡＬＬ ｉＣＥＬＬｉｓバイオリアクターで、ＨＥＫ２９３細胞のＰＥＩ媒介性三重トランスフェクションによって産生される。回収したＡＡＶ材料は、可能な場合、使い捨ての閉鎖型バイオプロセッシングシステムにおいて、清澄化、ＴＦＦ、アフィニティク
ロマトグラフィ、およびアニオン交換クロマトグラフィによって順次精製される。
粗細胞回収物は、その後、ベクター回収物の濃縮、ベクター回収物の透析濾過、ベクター回収物の顕微溶液化、ベクター回収物のヌクレアーゼ消化、顕微溶液化された中間体の濾過、クロマトグラフィによる粗精製、超遠心分離による粗精製、接線流濾過による緩衝液交換、および／またはバルクベクターを調製するための製剤化および濾過などの、方法ステップに供される。
２工程の高塩濃度でのアフィニティクロマトグラフィ精製、続いて、アニオン交換樹脂クロマトグラフィを用いて、ベクター薬物製品を精製し、空のカプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号、およびその優先権書類、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第許６２／３２２，０７１号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ９」という題名の第６２／２２６，３５７号により詳細が記載されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ８のための精製方法、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６号、およびその優先権文書、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０９８号、および２０１５年１２月１１日に出願された第６２／２６６，３４１号、ならびにｒｈ１０については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号、およびその優先権文書、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０５５号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶｒｈ１０」という題名の第６２／２６６，３４７号、ならびにＡＡＶ１については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号、およびその優先権文書、２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０８３号、および２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ＡＡＶ１」という第６２／２６，３５１号にあり、それらは参照によりそのすべてが本明細書に組み込まれる。
空および充填粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書の実施例では、イオジキサノール勾配で精製された調製物、ここで、ＧＣの数＝粒子の数）についてのＶＰ３バンド容量が、ロードされたＧＣ粒子に対してプロットされる。得られた線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を用いて、試験物ピークのバンド容量中の粒子の数を算出する。次いで、ロードした２０μＬあたりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて、粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割って、ゲノムコピーに対する粒子の比（ｐｔ／ＧＣ）を得る。Ｐｔ／ｍＬ～ＧＣ／ｍＬは、空ｐｔ／ｍＬを与える。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割って、次いで１００を掛けることよって、空粒子のパーセンテージを得る。
一般に、空のカプシドおよびパッケージングされたゲノムを含むＡＡＶベクター粒子をアッセイするための方法は、当該分野において既知である。例えば、Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２－１３３０、Ｓｏｍｍｅｒ
ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２－１２８を参照されたい。変性したカプシドについて試験するために、本方法は、３つのカプシドタンパク質を分離することができる任意のゲル（例えば、緩衝液中に３～８％のＴｒｉｓ－アセテートを含む勾配ゲル）からなるＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動に処理済みＡＡＶストックを供し、次いで、試料材料が分離するまでゲルを泳動し、ナイロンまたはニトロセルロースの膜（好ましくは、ナイロン）にゲルをブロットすることを含む。抗ＡＡＶカプシド抗体は、次いで、変性したカプシドタンパク質に結合する一次抗体、好ましくは、抗
ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくは、Ｂ１抗ＡＡＶ－２モノクローナル抗体として使用される（Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１－９２９３）。次いで、一次抗体に結合し、一次抗体、より好ましくは、抗体に共有結合した検出分子を含有する抗－ＩｇＧ抗体、最も好ましくは、西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合したヒツジ抗－マウスＩｇＧ抗体との結合を検出するための手段を含む、二次抗体が使用される。一次抗体と二次抗体との間の結合を半定量的に決定するために、結合を検出するための方法が使用され、好ましくは、放射性アイソトープ放射、電磁放射、または比色変化を検出することができる検出方法、最も好ましくは、化学発光検出キットが使用される。例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、カラムフラクションからの試料を取って、還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含有するＳＤＳ－ＰＡＧＥ充填緩衝液中で加熱することができ、カプシドタンパク質は、プレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えば、Ｎｏｖｅｘ）中で分解された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を製造元の指示に従って用いて、銀染色を実施してもよく、または他の適切な染色方法、すなわち、ＳＹＰＲＯルビーもしくはクーマシー染色を実施してもよい。一実施形態では、カラムフラクション中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は、定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）により測定されることができる。試料は希釈され、ＤＮａｓｅ Ｉ（または別の適切なヌクレアーゼ）で消化されて、外因性ＤＮＡが除去される。ヌクレアーゼの不活化後、試料はさらに希釈され、プライマーおよびプライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）蛍光発生プローブを用いて増幅される。規定レベルの蛍光（閾値サイクル、Ｃｔ）に到達するのに必要とされるサイクル数は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム上で各試料について測定される。ＡＡＶベクター中に含有されるものと同一の配列を含有するプラスミドＤＮＡを利用して、Ｑ－ＰＣＲ反応における標準曲線を作成する。試料から得られたサイクル閾値（Ｃｔ）値を用いて、プラスミド標準曲線のＣｔ値に対してそれを正規化することにより、ベクターゲノム力価を決定した。デジタルＰＣＲに基づくエンドポイントアッセイも使用されることができる。
一態様では、広域スペクトルのセリンプロテアーゼ、例えば、プロテイナーゼＫ（例えば、Ｑｉａｇｅｎから商業的に入手可能なもの）を利用する最適化されたｑ－ＰＣＲ方法が使用される。より具体的には、最適化されたｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮａｓｅ Ｉ消化の後に、試料をプロテアーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテアーゼＫで処理し、続いて、熱失活させることを除き、標準的なアッセイと同様である。適切には、試料は、試料サイズと等しい量のプロテアーゼＫ緩衝液で希釈される。プロテアーゼＫ緩衝液は、２倍以上に濃縮され得る。典型的には、プロテアーゼＫ処理は、約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬで変動し得る。処理ステップは、一般に、約５５℃で約１５分間実施されるが、より低い温度で（例えば、約３７℃～約５０℃）より長い時間にわたって（例えば、約２０分間～約３０分間）、またはより高い温度で（例えば、最高約６０℃）より短い時間にわたって（例えば、約５～１０分間）実施されてもよい。同様に、熱失活は、一般に、約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げてもよく（例えば、約７０～約９０℃）、時間を延ばしてもよい（例えば、約２０分間～約３０分間）。次いで、試料は希釈され（例えば、１０００倍）、標準的なアッセイで記載されるように、ＴａｑＭａｎ分析に供される。
追加的に、または代替的に、ドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）が使用されてもよい。例えば、ｄｄＰＣＲによる一本鎖および自己相補的なＡＡＶベクターゲノム力価を測定するための方法が記載されている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ，Ｈｕ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４ Ａｐｒ；２５（２）：１１５－２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１４ Ｆｅｂ １４を参照されたい。
簡潔には、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶｈｕ６８粒子をゲノム欠損ＡＡＶｈｕ６８中間体から分離するための方法は、組換えＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子およびＡＡＶｈｕ６８９カプシド中間体を含む懸濁液を高性能液体クロマトグラフィに供することを含み、ＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子およびＡＡＶｈｕ６８中間体を、１０．２のｐＨで平衡化した強アニオン交換樹脂に結合させ、約２６０および約２８０での紫外吸光について溶出液をモニタリングしながら、塩勾配に供する。ｒＡＡＶ９ｈｕ６８にはあまり最適ではないが、ｐＨは約１０．０～１０．４の範囲であり得る。この方法では、ＡＡＶｈｕ６８完全カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比が変曲点に到達した場合に溶出するフラクションから回収される。一実施例では、アフィニティクロマトグラフィ工程のために、透析濾過された産物を、ＡＡＶ２／ｈｕ６８血清型を効率的に捕らえるＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ－ＡＡＶ２／９アフィニティ樹脂（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に適用してもよい。これらのイオン条件下、残留細胞ＤＮＡおよびタンパク質の有意なパーセンテージは、カラムの中を流れ、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉する。
組成物および使用
本明細書では、少なくとも１つのｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣストック（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８ストックまたは変異体ｒＡＡＶストック）および任意の担体、賦形剤および／または防腐剤を含む組成物が提供される。ｒＡＡＶストックは、同じである複数のｒＡＡＶベクターを指し、例えば、濃度および用量単位の考察において以下に記載される量である。
本明細書で使用される場合、「担体」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質に対するかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補足有効成分を組成物中に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されるときにアレルギーまたは類似の有害反応を生じない分子実体および組成物を指す。リポソーム、ナノカプセル、微粒子、ミクロスフェア、脂質粒子、小胞などの送達ビヒクルが、本発明の組成物を好適な宿主細胞に導入するために使用され得る。特に、ｒＡＡＶベクター送達ベクターゲノムは、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかに封入された送達ために製剤化され得る。
一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤を含み、例えば、生理的に適合するｐＨおよび塩濃度に緩衝される水性液体懸濁液である。任意選択的に、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、投与時に凍結乾燥され、再構成され得る。
好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせが、非毒性である非イオン界面活性剤の中から選択されてもよい。一実施形態では、例えば、中性ｐＨを有し、平均分子量８４００を有するポロキサマー１８８としても知られているＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などの、一級ヒドロキシル基末端の二機能的ブロックコポリマー界面活性剤が選択される。他の界面活性剤および他のポロキサマー、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ ＨＳ１５（マクロゴール－１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、およびポリエチレングリコールが選択され得る。一実施形態では、製剤は、ポロキサマーを含有する。これらのコポリマーは、一般に、文字「Ｐ」（ポロキサマーの）に続いて、３桁の数字を
用いて命名され、初めの２桁の数字×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおよその分子質量を与えるものであり、最後の数字×１０は、ポリオキシエチレン含有量のパーセンテージを与えるものである。一実施形態では、ポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は、懸濁液の最高約０．０００５％～約０．００１％の量で存在してもよい。
ベクターは、細胞をトランスフェクトするのに十分な量で投与され、十分なレベルの遺伝子導入および発現を提供して、過度の悪影響なしに、または医学的に許容される生理学的効果を伴う治療効果を提供し、これは当業者によって決定され得る。従来および薬学的に許容される投与経路には、所望の臓器（例えば、肝臓（任意で肝動脈を介して）、肺、心臓、眼、腎臓）、経口、吸入、鼻腔内、髄腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮膚内、および他の親の投与経路への直接送達が含まれるが、これらに限定されない。投与経路は、所望される場合、組み合わされてもよい。
ウイルスベクターの用量は、主に、治療される状態、患者の年齢、体重、および健康状態などの要因に依存し、したがって、患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクターの治療有効なヒト投薬量は、概して、約２５～約１０００マイクロリットル～約１００ｍＬの約１×１０９～１×１０１６ゲノムウイルスベクターの濃度を含む溶液の範囲である。任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、かかる投薬量を調整してもよく、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療用途に応じて変化し得る。導入遺伝子の発現レベルをモニタリングして、ウイルスベクター（好ましくは、ミニ遺伝子を含有するＡＡＶベクター）をもたらす投薬頻度を決定することができる。任意選択的に、治療目的で記載されているものと同様の投薬レジメンは、本発明の組成物を使用した免疫に利用され得る。
複製欠陥ウイルス組成物は、投薬量単位で製剤化され、ヒト患者にとって、約１．０×１０９ＧＣ～約１．０×１０１６ＧＣの範囲にある量の複製欠陥ウイルス（体重７０ｋｇの平均対象を治療するため）を含み、その範囲内のすべての整数または分数量、好ましくは１．０×１０１２ＧＣ～１．０×１０１４ＧＣの範囲に含むことができる。一実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または分数量を含む、用量あたり少なくとも１ｘ１０９、２ｘ１０９、３ｘ１０９、４ｘ１０９、５ｘ１０９、６ｘ１０９、７ｘ１０９、８ｘ１０９、または９ｘ１０９ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×１０１１ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×１０１２ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×１０１３ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×１０１４ＧＣを含むように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量あたり少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×１０１５ＧＣを含むように製剤化される。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内のすべての整数
または小数を含む、用量あたり１×１０１０～約１×１０１２ＧＣの範囲であり得る。一実施形態では、ヒトへの適用のために、用量は、範囲内のすべての整数または小数を含む、用量あたり１．４×１０１３～約４×１０１４ＧＣの範囲であり得る。
これらの上記用量は、治療される領域の大きさ、使用されるウイルス力価、投与経路、および方法の所望の効果に応じて、約２５～約１０００マイクロリットルの範囲の様々な容量の担体、賦形剤、もしくは緩衝液製剤、またはその範囲内のすべての数を含むより高い容量で投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤、または緩衝液の容量は、少なくとも約２５μＬである。一実施形態では、容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、容量は、約２２５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２５０μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約２７５μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３００μＬである。さらに別の実施形態では、容積は、約３２５μＬである。別の実施形態では、容量は、約３５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約３７５μＬである。別の実施形態では、容量は、約４００μＬである。別の実施形態では、容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、容量は、約５５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、容量は、約６５０μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００μＬである。別の実施形態では、容量は、約７００～１０００μＬである。
治療的に有効な髄腔内／大槽内用量のｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣは、約１×１０１１～７．０×１０１４ＧＣ（一定用量）の範囲であり、１０９～５×１０１０ＧＣ／ｇ患者の脳質量と同等である。代替的には、以下の治療的に有効な一定用量が、示された年齢群の患者に投与されることができる。
・新生児：約１×１０１１～約３×１０１４ＧＣ、
・３～９ヶ月：約６×１０１２～約３×１０１４ＧＣ、
・９ヶ月～６歳：約６×１０１２～約３×１０１４ＧＣ、
・３～６歳：約１．２×１０１３～約６×１０１４ＧＣ、
・６～１２歳：約１．２×１０１３～約６×１０１４ＧＣ、
・１２歳以上：約１．４×１０１３～約７．０×１０１４ＧＣ、
・１８歳以上（成人）：約１．４×１０１３～約７．０×１０１４ＧＣ。
特定の実施形態では、用量は、約１ｘ１０９ＧＣ／ｇ脳質量～約１ｘ１０１２ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約３ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約３ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、約５ｘ１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～約１．８５ｘ１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の範囲であり得る。乳児と青年／成人との間のスケーリングに関して、脳質量は、場合によっては、４～１２ヶ月齢では約６００ｇ～約８００ｇ、９ヶ月～１８ヶ月齢では約８００ｇ～約１０００ｇ、１８ヶ月～３歳齢では約１０００ｇ～約１１００ｇ、青年もしくは成人ヒトでは１１００ｇ～約１３００ｇ、または成人ヒトでは約１３００ｇであると推定される。
一実施形態では、ウイルス構築物は、少なくとも約１×１０９ＧＣ～約１×１０１５、または約１×１０１１～５×１０１３ＧＣの用量で送達され得る。これらの用量の送達に適切な容量および濃度は、当業者によって決定され得る。例えば、約１μＬ～１５０ｍＬの容量が選択されてもよいが、より高容量が、成人用に選択されてもよい。典型的に、新生児用に好適な容量は、約０．５ｍＬ～約１０ｍＬ、より年長の乳児用に、約０．５ｍＬ～約１５ｍＬが選択される。幼児のためには、約０．５ｍＬ～約２０ｍＬの容量が選択さ
れてもよい。小児用に、最大約３０ｍＬの容量が選択されてもよい。プレティーンおよびティーンには、最大約５０ｍＬの容量が選択されてもよい。さらに他の実施形態では、患者は、選択された約５ｍＬ～約１５ｍＬ、または約７．５ｍＬ～約１０ｍＬの容量で髄腔内投与を受けることができる。他の好適な容量および投薬量が決定されてもよい。任意の副作用に対する治療効果のバランスをとるために、かかる投薬量を調整してもよく、かかる投薬量は、組換えベクターが利用される治療用途に応じて変化し得る。
上述の組換えベクターは、公開された方法に従って宿主細胞に送達され得る。好ましくは生理学的に適合性のある担体に懸濁されたｒＡＡＶは、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与され得る。特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、ｒＡＡＶは、食塩水、界面活性剤、および生理学的に適合性のある塩、または塩の混合物を含有する水性溶液中に好適に懸濁される。好適には、製剤は、生理学的に許容されるｐＨ、例えば、ｐＨ６～９、またはｐＨ６．５～７．５、ｐＨ７．０～７．７、またはｐＨ７．２～７．８の範囲に調整される。脳脊髄液のｐＨは約７．２８～約７．３２であるので、髄腔内送達のためには、この範囲内のｐＨが望ましく、静脈内送達のためには、約６．８～約７．２のｐＨが望ましい可能性がある。しかし、最も広い範囲内の他のｐＨ、およびこれらの部分範囲が、他の送達経路用に選択されてもよい。
別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む。好適な担体は、導入ウイルスが向けられる適応症を考慮して、当業者により容易に選択され得る。例えば、１つの好適な担体は、生理食塩水を含み、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）と共に製剤化され得る。他の例示的な担体としては、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油、および水が含まれる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが注入チューブに付着するのを防ぐが、インビボでｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含むべきである。
一実施例では、製剤は、例えば、水中に、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム・７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム・２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む、緩衝生理食塩水溶液を含有することができる。好適には、髄腔内送達のためには、モル浸透圧濃度は、脳脊髄液と適合する範囲内（例えば、約２７５～約２９０）である、例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６－ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意選択的に、髄腔内送達のために、商業的に入手可能な希釈剤は、懸濁化剤として使用され得るか、または別の懸濁化剤および他の任意の賦形剤と組み合わせて使用され得る。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。
特定の実施形態では、製剤は、重炭酸ナトリウムを含まない緩衝生理食塩水溶液を含有し得る。かかる製剤は、ハーバード緩衝液などの緩衝生理食塩水溶液を含有してもよく、水中に、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、およびそれらの混合物のうちの１つ以上を含む。水溶液は、ポロキサマーであるＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）Ｐ１８８をさらに含んでもよく、これは、ＢＡＳＦから市販され、以前、Ｌｕｔｒｏｌ（登録商標）Ｆ６８という商品名で販売されていた。水溶液は、７．２のｐＨを有し得る。
他の実施形態では、製剤は、１つ以上の透過促進剤を含んでもよい。好適な透過促進剤の例としては、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、
カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、またはＥＤＴＡを含んでもよい。
任意選択的に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶおよび担体に加えて、防腐剤または化学的安定剤などの他の従来の医薬成分を含み得る。好適な例示的な防腐剤としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、およびパラクロロフェノールが含まれる。好適な化学安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。
本発明による組成物は、上記に定義されるような薬学的に許容される担体を含み得る。好適には、本明細書に記載される組成物は、有効量の薬学的に好適な担体に懸濁された、および／または注入、浸透ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、または別のデバイスもしくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合された１つ以上のＡＡＶを含む。一実施例では、組成物は、髄腔内送達用に製剤化される。
本明細書で使用される場合、用語「髄腔内送達」または「髄腔内投与」は、脊柱管への注入を介する、より具体的には、脳脊髄液（ＣＳＦ）へ到達するようにクモ膜下腔への注入による、薬物の投与経路を指す。髄腔内送達は、腰椎穿刺、脳室内（側脳室内（ＩＣＶ）を含む）、後頭下／槽内、および／またはＣ１－２穿刺を含み得る。例えば、材料は、腰部穿刺により、クモ膜下腔空間にわたって拡散させるために導入され得る。別の実施例では、注入は、大槽内であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「大槽内送達」または「大槽内投与」は、小脳延髄大槽の脳脊髄液への直接的な薬物の投与経路、より具体的には、後頭下穿刺による、もしくは大槽内への直接注入による、または永続的に配置されたチューブによる、薬物の投与経路を指す。
本明細書で使用される場合、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）という用語は、軸に沿って作成された一連の平面断面画像から、コンピュータによって身体構造の三次元画像が構築される放射線撮影を指す。
本明細書で提供されるｒＡＡＶ．ＧＡＬＣベクターおよび組成物は、ＧＡＬＣ酵素活性の欠損レベルに関連する状態を矯正するのに有用である。特定の実施形態では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ＧＡＬＣベクターおよび組成物は、ＧＡＬＣの欠損によって引き起こされる末梢神経の機能障害を治療するのに有用であり、ＧＡＬＣの欠損によって引き起こされる呼吸不全および／もしくは運動機能喪失を治療するのに有用であり、クラッベ病を治療するのに有用であり、かつ／または患者のクラッベ病に関連する症状を治療するのに有用である。
特定の実施形態では、有効量のｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣを含む組成物は、早期乳児性クラッベ病（ＥＩＫＤ）を有する６ヶ月齢未満の患者に投与される。特定の実施形態では、患者は、６ヶ月齢未満であり、ＥＩＫＤよりも重症ではないＧＡＬＣ酵素欠損症を有する。
特定の実施形態では、有効量のｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣを含む組成物は、６ヶ月齢以上（例えば、７ヶ月～約１２ヶ月齢）の後期乳児性クラッベ病（ＬＩＫＤ）を有する患者に投与される。特定の実施形態では、患者は、６ヶ月齢以上、または約７ヶ月～１２ヶ月齢であり、ＬＩＫＤよりも重篤ではないＧＡＬＣ酵素欠損症を有する。
特定の実施形態では、患者は、１歳超（例えば、１３ヶ月～１０歳）であり、若年性クラッベ病（ＪＫＤ）を有する。特定の実施形態では、患者は、１３ヶ月齢～１０歳齢であ
り、ＪＫＤよりも重症ではないＧＡＬＣ酵素欠損症を有する。
特定の実施形態では、患者は、１０歳齢を超え（例えば、１０歳以上～１２歳、または１０歳以上～１８歳）、青年もしくは成人発症性クラッベ病を有する。
上述の実施形態のいずれかにおいて、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣ療法は、造血幹細胞補充療法、骨髄移植（ＢＭＴ）、および／または基質合成抑制療法（ＳＲＴ）との併用療法として投与され得る。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣ療法（例えば、ＥＩＫＤ）に続いて、ＨＳＣＴまたはＢＭＴなどの併用療法、または酵素補充療法が行われる。特定の実施形態では、治療は、ベクターの投与後に、迅速な酵素産生をもたらす（治療後１週間以内を含む）。
特定の実施形態では、酵素補充療法は、配列番号１０のヒトＧＡＬＣタンパク質の投与を含む。他の実施形態では、他のｈＧＡＬＣタンパク質バリアント（例えば、本明細書で特定される正規配列、または操作されたタンパク質）は、酵素補充療法で使用され得る。異なるｈＧＡＬＣタンパク質の組み合わせは、酵素補充療法において使用され得る。かかる実施形態では、ｈＧＡＬＣタンパク質は、好適な産生システムを使用してインビトロで産生され得る。例えば、Ｃ．Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，２００５／１０／０１を参照されたい。酵素補充療法は、グロボイド細胞白質ジストロフィーのマウスモデルにおける初期の臨床表現型の実質的な改善をもたらす（ＦＡＳＥＢ ｊｏｕｒｎａｌ，Ｔｈｅ ＦＡＳＥＢ
Ｊｏｕｒｎａｌ １９（１１）：１５４９－５１，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００５）。ｈＧＡＬＣタンパク質は、これらに限定されないが、静脈内、腹腔内、または髄腔内経路を含む、任意の好適な経路による送達のために製剤化され得る（例えば、生理学的に適合する生理食塩水溶液に懸濁され得る）。好適な用量は、１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってよく、週に１回、または必要に応じて、多かれ少なかれ頻繁に（例えば、２日に１回、２週間に１回等）再投与されてよい。ｈＡＡＶｈｕ６８．ＧＡＬＣベクターのＣＳＦ投与を使用して、脳および血清中のＧＡＬＣレベルは、毒性がなく、超生理学的であり得、ＣＮＳおよびＰＮＳにおける神経運動機能および髄鞘形成の改善が観察され得る。新生仔にＣＳＦ投与し、その後、出生後条件付け動物モデルにおいて骨髄移植を行った場合、明らかな徴候が不在のまま、生存期間が延長され得る（例えば、３００日超に）。症候前クラッベ患者では、ＡＡＶ．ｃＧＡＬＣの単回大槽注入は、表現型の矯正、生存率の増加、神経伝導の正常化、および／または脳ＭＲＩの改善を提供し得る。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣ療法は、ＨＳＣＴまたはＢＭＴ（例えば、ＬＩＫＤまたはＪＫＤ）の後に提供される。しかしながら、特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣは、ＨＳＣＴまたはＢＭＴが必要とされない十分なＧＡＬＣレベルを提供する。
治療の目標は、ｒＡＡＶベースのＣＮＳおよびＰＮＳに指向性の遺伝子療法を介して、患者の欠陥ＧＡＬＣを機能的に置き換えることである。ＥＩＫＤまたはＬＩＫＤの患者に対する療法の有効性は、以下のＥＩＫＤまたはＬＩＫＤの症状のうちの１つ以上における改善を評価することによって測定することができる：泣きおよび易刺激性、痙攣、握拳、笑顔の喪失、頭部制御不良および摂食困難、精神悪化および運動悪化、緊張亢進または緊張低下、発作、失明、難聴、および生存率の増加（ＥＩＫＤの場合、治療しないと、典型的には２歳前に死亡し、ＬＩＫＤの場合、３～５歳まで延命し得る）。加えて、これらおよび他のクラッベ患者について、治療の有効性は、イメージング（例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ））を介してモニタリングされ得る、末梢神経およびＣＮＳ白質（深部脳白質および歯状／小脳白質）の両方に影響を及ぼす髄鞘形成不全および脱髄の減少、異常な神経伝導速度（ＮＣＶ）および／もしくは脳幹聴性誘発電位（ＢＡＥＰ）の減少、脳脊髄液
および／もしくは血漿中で観察され得るＧＡＬＣレベルの増加、ならびに／またはサイコシンの蓄積の減少によって評価され得る。
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物が提供され、中枢神経系の細胞を標的とし、タンパク質の発現を指示する調節配列の制御下で配列番号１０のアミノ酸配列を有する成熟ガラクトシルセラミダーゼのタンパク質をコードするガラクトシルセラミダーゼのコード配列を含むベクターゲノムがその中にパッケージングされるＡＡＶカプシドを含み、当該ベクターゲノムは、ベクターゲノムをＡＡＶカプシド中にパッケージングするために必要なＡＡＶ逆位末端配列をさらに含む。
特定の実施形態では、クラッベ病の治療に有用な組成物が提供され、ＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ｒＢＧのベクターゲノムを有するｒＡＡＶｈｕ６８を含む。一実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１９のコード配列を有する。
特定の実施形態では、ＧＡＬＣ欠損によって引き起こされる末梢神経の機能障害を矯正するための方法、および／またはＧＡＬＣ欠損によって引き起こされる呼吸不全および運動機能喪失を治療するための方法における、組成物の使用が提供される。特定の実施形態では、本方法は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のストックを含む組成物を投与することを含み、組換えアデノ随伴ウイルスが、（ａ）中枢神経系の細胞を標的とし、（ｂ）のベクターゲノムがその中にパッケージングされるＡＡＶカプシドと、（ｂ）タンパク質の発現を指示する調節配列の制御下で、配列番号１０のアミノ酸配列を有する成熟ガラクトシルセラミダーゼのタンパク質をコードするガラクトシルセラミダーゼのコード配列を含むベクターゲノムであって、ベクターゲノムをＡＡＶカプシド中にパッケージングするのに必要なＡＡＶ逆位末端配列をさらに含む、ベクターゲノムと、を含む。
特定の実施形態では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣ組成物は、早期乳児性クラッベ病の患者の治療のために髄腔内に送達される。特定の実施形態では、本明細書に提供される組成物は、後期乳児性クラッベ病（ＬＩＫＤ）を有する患者の治療のために髄腔内に送達される。特定の実施形態では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣ組成物は、若年性クラッベ病（ＪＫＤ）の患者の治療のために髄腔内に送達される。特定の実施形態では、本明細書に提供されるｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣ組成物は、青年または成人発症性クラッベ病を有する患者の治療のために髄腔内に送達される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣ組成物は、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）、骨髄移植、および／または基質合成抑制療法との併用療法として投与される。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣ組成物は、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる大槽への（大槽内）後頭下注入を介して、単回用量として投与される。
ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣの投与は、疾患進行を安定化させ（生存率によって測定される）、発達および運動のマイルストーンの喪失を防ぎ、新たなマイルストーンの獲得を潜在的に支援し、発作の発症および頻度を。したがって、特定の実施形態では、治療をモニタリングするための方法が提供され、エンドポイントは、例えば、３０日、９０日、および／または６ヶ月で測定され、次いで、例えば、２年間の短期フォローアップ期間中に、６ヶ月ごとに測定される。特定の実施形態では、測定頻度は、長期延長中に１２ヶ月ごとに１回まで減らされる。標的集団における疾患の重症度を考慮すると、対象は、登録によって運動スキルが達成したか、他の運動マイルストーンを発達させてその後に失われたか、または運動マイルストーンの発達の兆しがまだ示されていない場合がある。評価は、すべてのマイルストーンについて、達成した年齢（ａｇｅ－ａｔ－ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ）および喪失した年齢（ａｇｅ－ａｔ－ｌｏｓｓ）を追跡する。特定の実施形態では、マイルストーンは、例えば、支持なしで座る、四つんばいで這う、介助で立つ、介助で歩く、独りで立つ、および／または独りで歩くのうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、治
療は、発作活動の発症遅延、および／または発作事象の頻度の減少をもたらす。
特定の実施形態では、対象における治療をモニタリングする方法は、臨床尺度を使用して、適応行動、認知、言語、運動機能、および／または健康関連の生活の質における発達および変化に対する治療の効果を定量する。尺度およびドメインには、例えば、乳幼児発達のベイリー尺度（認知、言語、運動、社会性－情動、および適応行動の５つのドメインにわたって乳児および幼児の発達を評価する）、ヴァインランド適応行動尺度（第３版）（コミュニケーション、日常生活スキル、社会化、運動スキル、および不適応行動の５つのドメインにわたって、誕生から成人まで（０～９０歳）の適応行動を評価する）、ピーボディ発達運動尺度－第２版（誕生から５歳の小児までの相互に関連する運動機能を測定し、評価は、反射、静止、運動、物体操作、把握、および視覚－運動統合の６つのドメインに焦点を当てる）、乳幼児生活の質質問票（ＩＴＱＯＬ）（２ヶ月から５歳までの幼児のために設計された健康関連の生活の質の親の報告による尺度）、および早期学習のミューレン尺度（６８ヶ月までの乳児および幼児における言語、運動、および知覚能力を評価する）が含まれる。特定の実施形態では、治療の効果は、髄鞘形成、髄鞘形成に関連する機能転帰、および潜在的な疾患バイオマーカーの変化を評価することによって、モニタリングまたは測定される。特定の実施形態では、中枢および末梢の脱髄は、対象の治療後に、進行が遅延するか、または停止する。中枢の脱髄は、白質領域の拡散テンソル磁気共鳴画像法（ＤＴ－ＭＲＩ）異方性測定、および皮質脊髄運動路）の線維追跡によって追跡することができ、それらの変化は、疾患の状態および進行の指標となる。末梢脱髄は、運動神経（深腓骨神経、脛骨神経、および尺骨神経）および感覚神経（腓腹神経および正中神経）の神経伝導速度（ＮＣＶ）検査を介して間接的に測定して、生物学的に活性なミエリンの変化（すなわち、Ｆ波および遠位潜時、振幅、または応答の有無）を示す変動をモニタリングすることができる。
特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣ投与後の治療をモニタリングする方法が提供され、治療前に著しい視力喪失を発症していない対象に対して、視力喪失の遅延または不在について対象を評価する。したがって、視覚誘発電位（ＶＥＰ）の測定は、中心視の障害または損失の指標としての視覚刺激に対する応答を客観的に測定するために使用される。特定の実施形態では、対象は、例えば、脳幹聴性誘発応答（ＢＡＥＲ）検査を使用して、治療後の難聴についてモニタリングされる。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ．ｈＧＡＬＣ投与後の治療をモニタリングする方法が提供され、対象のサイコシンレベルが測定される。
「ａ」または「ａｎ」という用語は、１つ以上を指すことに留意されたい。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」、および「少なくとも１つ（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的ではなく包括的に解釈されるべきである。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「なっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語、およびその変形は、包括的ではなく排他的に解釈されるべきである。本明細書の様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言葉を用いて示されているが、他の状況では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という言葉を用いて解釈および記載されるべきことも意図される。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、別途指定されない限り、与えられた参照から１０％（±１０％）の可変性を意味する。
本明細書で使用される場合、「疾患」、「障害」、および「状態」は、対象における異常な状態を示すために互換的に使用される。
「発現」という用語は、本明細書で最も広い意味で使用され、ＲＮＡまたはＲＮＡおよびタンパク質の産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特に、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は、一過性または安定であり得る。
本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、それらのための他の調節配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、２つ以上の発現カセットを含み得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、「発現カセット」と互換的に使用され得る。典型的に、ウイルスベクターを産生するためのかかる発現カセッは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルに隣接する本明細書に記載される遺伝子産物のコード配列、および本明細書に記載のものなどの他の発現制御配列を含む。
略称「ｓｃ」は、自己相補性（ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）を指す。「自己相補的ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列によって担持されるコード領域が、分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染の際、第２の鎖の細胞介在性の合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、即時の複製および転写が可能な１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ユニットを形成する。例えば、Ｄ Ｍ ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ，“Ｓｅｌｆ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ ２００１），Ｖｏｌ ８，Ｎｕｍｂｅｒ １６，Ｐａｇｅｓ１２４８－１２５４．を参照されたい。自己相補的なＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、同第７，１２５，７１７号、および同第７，４５６，６８３号に記載されている（その各々は、その全体が参照により本明細書に援用される）。
タンパク質または核酸を参照して使用される場合、「異種性」という用語は、タンパク質または核酸が、天然では互いに同じ関係で見出されない、２つ以上の配列または部分配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するために配置された関連のない遺伝子からの２つ以上の配列を有する核酸は、典型的に、組換えにより産生される。例えば、一実施形態では、核酸は、ある遺伝子由来のプロモーターを有し、異なる遺伝子由来のコード配列の発現を指示するように配置される。故に、コード配列に関しては、プロモーターは、異種性である。
「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」は、合成または人工ウイルス粒子を指し、ここで、目的の遺伝子を含有する発現カセットは、ウイルスカプシドまたはエンベロープ中にパッケージされ、ウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージされた任意のウイルスゲノム配列は、複製欠損である、すなわち、それらは、後代ビリオンを産生することができないが、標的細胞に感染する能力を保持することができる。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まないが（ゲノムは、人工ゲノムの増幅およびパッケージングに必要とされるシグナルに隣接する目的の導入遺伝子のみを含む「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」であるように操作され得る）、これらの遺伝子は、産生中に供給され得る。したがって、それは、後代ビリオンによる複製および感染が、複製に必要とされるウイルス酵素の存在下以外で生じることができないために、遺伝子療法における使用のために安全であると考えられる。
多くの場合、ｒＡＡＶ粒子は、ＤＮａｓｅ耐性として参照される。しかし、このエンドヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）に加えて、他のエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼが、汚染核酸を除去するために本明細書に記載の精製工程において使用され得る。かかるヌクレアーゼは、一本鎖ＤＮＡおよび／または二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡを分解するために選択され得る。かかる工程は、単一のヌクレアーゼ、または異なる標的に指向性のヌクレアーゼの混合物を含み得、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼであり得る。
「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ＡＡＶカプシドが、宿主細胞に遺伝子を送達するように設計された発現カセットの周りで完全に構築されていることを示し、産生プロセスから存在し得る汚染核酸を除去するように設計されたヌクレアーゼインキュベーション工程の間の分解（消化）から、これらのパッケージングされたゲノム配列を保護する。
本明細書で使用される場合、「有効量」は、標的細胞においてベクターゲノム由来の遺伝子産物の量を送達および発現するｒＡＡＶ組成物の量を指す。有効量は、ヒト患者ではなく、動物モデルに基づいて決定され得る。適切なマウスモデルの実施例は、本明細書に記載されている。
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって、および本明細書で使用されている多数の用語に対して当業者に一般的な手引きを提供する公開された文書を参照することによって、一般的に理解されているものと同じ意味を有する。
以下の実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明を限定することを意図するものではない。
Figure 2022525848000004
Figure 2022525848000005
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Figure 2022525848000007
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実施例１－組換えＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ
ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣは、ヒトＧＡＬＣをコードする操作された配列を担持するＡＡＶである。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣのＡＡＶｈｕ６８カプシドは、アミノ酸レベルでＡＡＶ９と９９％同一である。ＡＡＶ９カプシド［配列番号４］とＡＡＶｈｕ６８カプシド［配列番号２］との間で異なる２つのアミノ酸は、カプシドのＶＰ１（６７および１５７）およびＶＰ２（１５７）領域に位置し、図１で特定されている。例えば、ＷＯ２０１８／１６０８５２を参照されたい（参照により本明細書に援用される）。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣは、ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する導入遺伝子カセットをコードするＡＡＶシスプラスミド、ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐの遺伝子をコードするＡＡＶトランスプラスミド（ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲ）、およびヘルパーアデノウイルスプラスミド（ｐＡｄΔＦ６．ＫａｎＲ）を用いたＨＥＫ２９３細胞の三重プラスミドトランスフェクションによって産生される。
Ａ．ＡＡＶベクターゲノムプラスミドの配列エレメント
ベクターゲノムの線形マップを図２に示す。ベクターゲノムは、以下の配列エレメントを含む：
逆位末端配列（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｐｅａｔ、ＩＴＲ）ＩＴＲは、同一の逆相補配列であり、ＡＡＶ２（１３０ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＣ＿００１４０１）に由来し、ベクターゲノムのすべての要素に隣接する。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶおよびアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供される場合、ベクターＤＮＡの複製起点およびベクターゲノムのパッケージングシグナルの両方として機能する。したがって、ＩＴＲ配列は、ベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要とされるシス配列のみを表す。
ヒトサイトメガロウイルス最初期エンハンサー（ＣＭＶ ＩＥ）：このエンハンサー配列は、ヒト由来のＣＭＶ（３８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｋ０３１０４．１）から得られ、下流導入遺伝子の発現を増加させる。
ニワトリβ－アクチンプロモーター（ＢＡ）この遍在性プロモーター（２８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）を選択して、任意のＣＮＳ細胞型における導入遺伝子の発現を駆動させた。
キメライントロン（ＣＩ）ハイブリッドイントロンは、ニワトリβ－アクチンスプライスドナー（９７３ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ００１８２．１）およびウサギβ－グロビンスプライスアクセプターのエレメントを含む。イントロンは転写されるが、その両端のいずれかにある配列と合わせて、スプライシングによって成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）から除去される。発現カセットにおけるイントロンの存在は、核から細胞質へのｍ
ＲＮＡ輸送を促進し、それにより、翻訳のためのｍＲＮＡの一定レベルの蓄積を高めることが示されている。これは、遺伝子発現レベルの増加を意図した遺伝子ベクターにおいて共通の特徴である。
コード配列：ヒトＧＡＬＣ遺伝子の操作されたｃＤＮＡは、ヒトガラクトシルセラミダーゼのタンパク質をコードし、これは、ミエリンガラクト脂質の加水分解および分解を担うリソソーム酵素である（２０５５ｂｐ、６８５アミノ酸［ａａ］、ＧｅｎＢａｎｋ：ＥＡＷ８１３６１．１）。
ウサギβグロビンのポリアデニル化シグナル（ｒＢＧ ＰｏｌｙＡ）：ｒＢＧ ＰｏｌｙＡシグナル（１２７ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ：Ｖ００８８２．１）は、ｃｉｓで導入遺伝子のｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化を促進する。このエレメントは、転写終結、新生転写物の３’末端での特異的切断事象、および長いポリアデニル鎖付加のためのシグナルとして機能する。
Ｂ．トランスプラスミド：ｐＡＡＶ２／１．ＫａｎＲ（ｐ００６８）
ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲ（ｐ００６８）は、図２１に提示されている。
ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドは、ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲ（ｐ００６８）である。ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲプラスミドは、長さ８０３０ｂｐであり、ＡＡＶベクターゲノムの複製およびパッケージングに必要とされる４つの野生型ＡＡＶ２レプリカーゼ（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする。また、ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドは、ＡＡＶベクターゲノムを収容するためにＡＡＶ血清型ｈｕ６８のビリオンシェルに組み立てる３つのＷＴ ＡＡＶｈｕ６８ビリオンタンパク質カプシド（Ｃａｐ）タンパク質をコードする。
ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲトランスプラスミドを作製するために、（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳベクターに由来するプラスミド骨格上の野生型ＡＡＶ２ ｒｅｐおよびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子をコードする）プラスミドｐＡＡＶ２／９ｎ（ｐ００６１－２）由来のＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を除去し、ＡＡＶｈｕ６８ ｃａｐ遺伝子と置換した。アンピシリン耐性（ＡｍｐＲ）遺伝子をカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子で置換し、ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲ（ｐ００６８）を得た。このクローニング戦略では、ＡＡＶ ｐ５プロモーター配列（通常、ｒｅｐの発現を駆動する）を、ｒｅｐの５’末端からｃａｐの３’末端へ移し、ｒｅｐの上流の切断型ｐ５プロモーターを残す。この切断型プロモーターは、ｒｅｐの発現を下方制御し、結果として、ベクターの産生を最大化する役割を果たす（図２１）。
プラスミドのすべての成分部分は、直接配列決定によって検証されている。
Ｃ．アデノウイルスヘルパープラスミド：ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）
アデノウイルスヘルパープラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）は、（図２２Ｂ）に提示されている。
Ｐｌａｓｍｉｄ ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）は、サイズが１５，７７０ｂｐである。このプラスミドには、ＡＡＶの複製に重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡが含まれている（アデノウイルスＥ１の機能は、ＨＥＫ２９３細胞によって提供される）。しかしながら、このプラスミドには、他のアデノウイルスの複製遺伝子または構造遺伝子は含まれていない。プラスミドは、アデノウイルスＩＴＲなどの複製に重要なシスエレメントを含んでおらず、したがって、感染性のアデノウイルスが産生されることは予想されない。プラスミドは、Ａｄ５のＥ１、Ｅ３欠失分
子クローン（ｐＢＨＧ１０、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド）に由来した。Ａｄ５に欠失を導入して、不要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去し、かつアデノウイルスＤＮＡの量を、３２ｋｂから１２ｋｂへ削減した（図２２Ａ）。最終的に、アンピシリン耐性遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子に置き換えて、ｐＡｄｅｌｔａＦ６（ＫａｎＲ）を作製した（図２２Ｂ）。このプラスミドに残るＥ２、Ｅ４、およびＶＡＩのアデノウイルス遺伝子は、ＨＥＫ２９３細胞に存在するＥ１と共に、ＡＡＶベクターの産生に必要である。それぞれ図３０および図３１に示されるフローチャートに従って、ベクターを産生し、製剤を調製する。
実施例２－ＧＡＬＣ欠損ＴｗｉｔｃｈｅｒマウスモデルにおけるＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの送達
以下に記載される研究は、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスモデルを使用して、操作されたヒトＧＡＬＣ配列（配列番号９）をコードするｒＡＡＶｈｕ６８ベクター（図２）をＣＳＦに送達して、治療レベルのＧＡＬＣ発現レベルを達成し、疾患のいくつかのバイオマーカーを救出する（ｒｅｓｃｕｅ）可能性を確立した。Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス研究の概要は、図４Ｂに提供されている。
Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスは、１９７６年にＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで自然突然変異として同定された、クラッベ病の天然の近交系モデルである（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０２（２）：４７９－４８３）。罹患したマウスは、Ｇａｌｃ遺伝子のＧからＡへの変異からなる、Ｔｗｉｔｃｈｅｒの機能喪失アレル（ｔｗｉ）についてホモ接合性である。この変異は、早期終止コドン（Ｗ３３９Ｘ）をもたらす。切断型のＧＡＬＣタンパク質は、０％に近い残留酵素活性を有し、これは、乳児形態のクラッベ病の患者において観察されるＧＡＬＣ活性レベルと類似している。ヘテロ接合保因マウス（ｔｗｉ／＋）は、表現型的に正常である。
Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスにおける疾患の進行は、十分に立証されており（図４Ａ）、表５に提示された様々な神経病理学的および行動学的欠陥の表現型模写の乳児性クラッベ病。乳児性クラッベ患者のように、マウスにおけるＧＡＬＣの欠損は、細胞傷害性の脂質中間体であるサイコシンの蓄積をもたらす。Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスは、同様に、食作用性のサイコシン充填グロボイド細胞（マクロファージおよび／またはミクログリアの系統に由来すると考えられている）によるＰＮＳおよびＣＮＳ白質の大規模な浸潤を示す（Ｔａｎａｋａ Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．４５４（１）：３４０－３４６、Ｌｅｖｉｎｅ Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｉｎｔｌ Ｊ
Ｄｅｖ Ｎｅｕｒｏ．１２（４）：２７５－２８８）。これは、クラッベ患者の疾患の主要な特徴の１つである脱髄をもたらす。正常な髄鞘形成の初期期間の後、罹患したＴｗｉｔｃｈｅｒマウスは、ＰＮＳでは、髄鞘形成シュワン細胞の死により、１０日齢以降に髄鞘を失い（Ｊａｃｏｂｓ Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ．５５（３）：２８５－３０４）、ＣＮＳでは、髄鞘形成オリゴデンドロサイトの死により、２０日齢以降に髄鞘を失う。おそらく、この遅延のために、脱髄は、これらのマウスのＣＮＳよりも末梢神経でより深刻である（Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．＆Ｓｕｚｕｋｉ Ｋ．（１９８３）Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．１１１（３）：３９４－３９７）。ついには、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスは、症状の発症後に一貫した急速な神経学的悪化を示し、これは、症状の発症時、乳児性クラッベ患者でも同様に観察される。これらのマウスにおける行動症状には、ヒト患者で観察されたものを思わせる運動表現型を含まれ、およそ２０日齢で見られる振戦、攣縮、および後肢の脱力が含まれる。マウスは、最終的には、４０日齢頃までに重度の体重減少および麻痺を特徴とする人道的エンドポイントへと進む（Ｗｅｎｇｅｒ Ｄ．Ａ．（２０００）Ｍｏｌｅｃ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ．６（１１）：４４９－４５１）。
乳児性クラッベの患者は、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスと同様の臨床的特徴を示す。したがって、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスモデルは、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの有効性（生存、運動機能、ならびに脳および神経の病理を改善するための、酵素活性の救出）を評価するのに適切であり、乳児性クラッベの徴候を支持する。以下に記載されるＴｗｉｔｃｈｅｒマウスを使用した研究は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの有効性を実証し、単回ＩＣＶ投与（ＩＣＭが技術的に実現可能ではないマウスモデルにおいて、最も効果的な投与経路）の後、関連組織で活性型ＧＡＬＣ酵素を発現させて、生存を救出し、運動機能を改善し、ＣＮＳおよびＰＮＳの組織病理を改善した。
症候前新生仔Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス
この研究の目的は、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスモデルで最大の有効性を達成するための最適なＲＯＡ、カプシド血清型、および用量範囲を確立することであった。これらの研究のために、疾患救出の観察の変化を最大化するのに、症候前の新生仔マウスを選択した。
最適なＲＯＡを確立するために、側頭静脈への注入によるＩＶ経路を、ＩＣＶ経路と比較した。これは、新生仔動物において、両方の経路がＣＮＳおよびＰＮＳを形質導入することができるためである。ＰＮＤ０で、症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）に、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを、いずれか１．００×１０１１ＧＣの用量でＩＶ投与するか、または５倍低い２．００×１０１０ＧＣの用量でＩＣＶ投与した。ＩＶ用量は、ＣＮＳの形質導入を達成するために必要な高用量である１．００×１０１４ＧＣ／ｋｇに対応することから、選択され、５倍低いＩＣＶ用量は、ＣＳＦへの直接投与が、より低い用量でもＣＮＳの形質導入を容易にするため、選択された。対照として、症候前の同齢の（ａｇｅ－ｍａｔｃｈｅｄ）Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ）をＩＣＶ注入した。動物は、最大体重の２０％を超える体重減少および／または後肢麻痺によって定義される人道的エンドポイントに到達したときに安楽死させ、生存を記録した。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣのより高い用量（１．００×１０１１ＧＣ）でのＩＶ投与は、未処置の対照と比較して、いくつかの延命効果をもたらした。しかしながら、ＩＶ投与と比較して、５倍低い用量（２．００×１０１０ＧＣ）でＩＣＶ投与されたｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣは、優れた延命効果を付与した（図５）。したがって、以降の研究では、ＩＣＶの投与経路（ＲＯＡ）が選択された。
ヒトＧＡＬＣをコードするベクターゲノムの神経系送達のための最良のＡＡＶカプシドを特定するために、４つの異なるＡＡＶカプシドを試験した。カプシドには、ＡＡＶ血清型３ｂ（ＡＡＶ３ｂ）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、およびＡＡＶ血清型ｈｕ６８（ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ）が含まれた。各ＡＡＶベクターは、２．００×１０１０ＧＣの用量でＩＣＶ投与された。これは、症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスにおいて、効果的に延命させながら、短い研究期間を可能にする、以前に確立された低用量およびＲＯＡである（図５）。対照として、一群の前症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスは、ＰＮＤ０で、ビヒクルのみ（ＰＢＳ）をＩＣＶ投与された。４つすべてのカプシドは、ビヒクル処置対照と比較して、生存率を向上させたが、ＡＡＶｈｕ６８カプシド（ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ）は、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ１よりも優れた生存率をもたらした（図６）。したがって、以降の研究では、ＡＡＶｈｕ６８カプシド（ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ）が選択された。
用量範囲を決定するために、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを、ＰＮＤ０で、新生仔症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに、２．００×１０１０ＧＣ、５．００×１０１０ＧＣ、または１．００×１０１１ＧＣの用量でＩＣＶ投与した。対照として、ビヒクル（ＰＢＳ）を、ＰＮＤ０で、同齢の症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒ（ｔｗｉ／ｔｗｉ）マウス、および非罹患ヘテロ接合マウス（ｔｗｉ／＋）および野生型マウスにＩＣＶ投与した。
ＰＮＤ３５で、ロッドアッセイを使用して、マウスの移動性および協調性を評価した（図７）。ロータロッドは、マウスが走る加速ロッドであり、アッセイの開始からマウスがロッドから落下する時点までの時間は、運動協調性と相関することが十分に確立されている。ＰＮＤ３５の時点は、人道的安楽死エンドポイントに到達する前に、罹患したＴｗｉｔｃｈｅｒマウスが測定可能な運動障害を示す時点であることから、選択された。ロータロッドアッセイで、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ投与後の運動性および協調性の部分的な救出が明らかになった。レスキューの程度は用量依存的であるように見え、１．００×１０１１ＧＣの最高のｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ用量の場合、有意に長い落下潜時が観察された（ｐ＜０．０１）（図７）。
ロータロッドアッセイに続いて、すべての処置群について生存を追跡した。ビヒクルで処置されたＴｗｉｔｃｈｅｒ（ｔｗｉ／ｔｗｉ）対照と比較して、ＰＮＤ０で症候前にｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣが投与されたＴｗｉｔｃｈｅｒ（ｔｗｉ／ｔｗｉ）マウスの生存率において、用量依存的な増加が観察された。１．００×１０１１ＧＣの最高のｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ用量を投与されたマウスにおいて、最長の生存期間の中央値（１３０日）が観察された（図８）。
併せると、最適なＲＯＡ、カプシド、および用量範囲を特定するためのこれらのＰＯＣ実験は、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスにおいて症状発症前に投与された場合、神経運動機能の維持および生存期間の延長におけるｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの有効性を実証する。
症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス
この研究の目的は、行動症状の発症前の疾患病理の早期段階（ＰＮＤ１２、「早期症候性」と称される）の間で、またはマウスが行動症状を示す場合の疾患病理の後期段階（ＰＮＤ２１、「後期症候性」と称される）の間で投与したときの、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの有効性を検討することであった。なぜなら、本発明者らは、症状発症後に登録された患者と同様の文脈を再現したかったからである。さらに、マウスは、ＰＮＤ０では、早産の胎児と同等の脳成熟を有するが、ＰＮＤ１２およびＰＮＤ２１では、２ヶ月齢および９ヶ月齢にそれぞれ置き換えられ（ｗｗｗ．ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇｔｉｍｅ．ｏｒｇ）、これは、ＦＩＨの対象となる乳児集団をより密接に再現する。
早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスは、ＰＮＤ１２で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを、１．００×１０１１ＧＣまたは２．００×１０１１ＧＣのいずれかの用量でＩＣＶ投与され、一方、別のコホートの後期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスは、ＰＮＤ２１で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを、２．００×１０１１ＧＣのより高い用量でＩＣＶ投与された。低用量の１．００×１０１１ＧＣは、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスの生存率を増加させる点で最も有効な用量であることが見出されたため、投与のために選択された（上述）。より重度の脱髄を有するマウスにはより高い用量が必要であり得ることが仮定されたため、より高いｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ用量である２．００×１０１１ＧＣもまた、ＰＮＤ２１でのマウスの処置に利用された。対照として、早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）および非罹患ヘテロ接合マウス（ｔｗｉ／＋）は、ビヒクルのみ（ＰＢＳ）を、ＰＮＤ１２でＩＣＶ投与され、研究１からの履歴データを使用して、ＰＮＤ０で１．１１×１０１１ＧＣを投与されたＴｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）と比較した。
Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）が測定可能な運動障害を示す時点であるＰＮＤ３５で、ロータロッドアッセイを使用して、マウスの移動性および協調性を評価した。ロータロッドアッセイでは、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを、ＰＮＤ０で、症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに１．００×１０１１ＧＣ（ｐ＜０．０１）の用量で投与したとき
の、またはＰＮＤ１２で、早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに１．００×１０１１ＧＣ（ｐ＜０．００１）もしくは２．００×１０１１ＧＣ（ｐ＜０．０１）のいずれかの用量で投与したときの、運動性および協調性の部分的な救出が明らかになった。ＰＮＤ２１で、後期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに、２．００×１０１１ＧＣのｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ用量を投与したところ、運動性および協調性の有意な救出は観察されなかった（図９）。
ロータロッドアッセイに続いて、すべての処置群について生存を追跡した。ビヒクル処理Ｔｗｉｔｃｈｅｒ対照と比較して、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの投与後、早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ＰＮＤ１２で投与）、および後期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ＰＮＤ２１で投与）の両方で、より長い生存が観察された。しかしながら、最大の生存は、早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに、ＰＮＤ１２で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを、２．００×１０１１ＧＣの高用量で投与したときに得られた（図１０）。
併せると、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスの生存および神経運動機能の改善は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣが、疾患の早期段階で投与された場合に、より効果的であり得ることを示唆した。
症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスにおける薬理試験
この研究の目的は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの投与後の薬理学的、機能的、および組織病理学的な読み出しを評価することである。先の研究では、生存分析を容易にするために、人道的エンドポイントで動物を犠牲にしたため、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスおよびビヒクル処置対照における年齢適合させた時点での薬理学および組織学的読み出しの収集が妨げられた。したがって、本研究では、これらのエンドポイントを検討した。
早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、ＰＮＤ１２で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを、２．００×１０１１ＧＣの用量でＩＣＶ投与された。対照として、ＰＢＳを、同齢の非罹患Ｔｗｉｔｃｈｅｒヘテロ接合マウス（ｔｗｉ／＋）および野生型マウスに、ＰＮＤ１２でＩＣＶ投与した。最大の有効性を達成するために、２．００×１０１１ＧＣのｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ用量をＰＯＣに選択し、投薬日としてＰＮＤ１２を選択した。それは、２ヶ月齢の乳児（ＦＩＨ試験の対象となる乳児集団を反映する）に相当する脳成熟を有する動物において（ｗｗｗ．ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇｔｉｍｅ．ｏｒｇ）、ＰＮＳ脱髄の発症後間もないためである。
ＰＮＤ２２から、すべてのマウスを、臨床徴候について毎日モニタリングした。ＰＮＤ２２は、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスで行動表現型が観察可能である最も早い時期であるため、この評価の最初の時点として選択した。臨床徴候は、表１に詳述されるように、クラスピング能力、歩行、振戦、後弯、および毛皮の質の非公開の評価を使用してスコアリングけされた。これらの尺度は、典型的に示される症状に基づいて、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスの臨床状態を効果的に評価する。０以上のスコアは臨床的悪化を示す。
Figure 2022525848000009
この評価を使用して、ＰＮＤ１２にｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを投与された早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、０に近い臨床スコアを示し、これは、野生型および非罹患Ｔｗｉｔｃｈｅｒヘテロ接合体（ｔｗｉ／＋）のスコアと同等であった。対照的に、同齢のビヒクル処置Ｔｗｉｔｃｈｅｒ（ｔｗｉ／ｔｗｉ）マウスは、ほとんどの時間経過にわたってより高い評価スコアを示し、臨床的悪化を示した（図１１Ａ）。
相補的な機能アッセイとして、ＰＮＤ３５で、ロータロッド試験を実施し、神経運動表現型を評価した。ＰＮＤ１２でｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを投与された早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、野生型および非罹患Ｔｗｉｔｃｈｅｒヘテロ接合体（ｔｗｉ／＋）のものと同等の落下潜時を示し、一方、同齢のビヒクル処置Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）は、著しく短い落下潜時を示し（ｐ＜０．０５）、神経運動機能の悪化を示した（図１１Ｂ）。
機能的エンドポイントに対するｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ投与の観察された利益が組織学的な改善と相関するかどうかを決定するために、すべてのマウスをＰＮＤ４０で剖検し、後肢の坐骨神経を組織学的に調べた。ＰＮＤ４０は、未処置またはビヒクル処置のＴｗｉｔｃｈｅｒマウスが人道的エンドポイントに到達するおよその齢であり、神経病理が最も重篤な時点であるため、剖検時点として選択された。Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスでは、ＣＮＳと比較して、末梢神経が脱髄によってより影響を受けるため、組織学的検査には
、坐骨神経を選択した。さらに、患者におけるＨＳＣＴによるＰＮＳの矯正の欠如は、乳幼児患者において未だに満たされていない主なニーズであることから、ＰＮＳに対するｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ投与の効果の検討が興味深い。
坐骨神経の切片を、ミエリン（濃い染色）およびグロボイド細胞（薄い染色）の視覚化のために処理した（図１２）。ＰＮＤ４０では、ビヒクル処置野生型対照の坐骨神経は、ミエリンが豊富であり、概してグロボイド細胞の浸潤を有しない。しかしながら、ビヒクル処置症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）では、坐骨神経において重度の亜全脱髄が観察され、神経肥厚およびグロボイド細胞の浸潤を伴った。対照的に、ミエリンは、ＰＮＤ１２にｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを投与した症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）の坐骨神経で保たれていたが、同齢の野生型マウスで通常観察される程ではなかった。ビヒクル処置Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスと比較して、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ処置Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスの神経でも、より少数のグロボイド細胞が観察された。これらのデータは、機能的エンドポイントと相関しており、疾患進行の早期段階でｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを投与された症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスにおける臨床スコアおよび神経運動機能の改善が、基礎疾患の神経病理の逆転または発症の遅延のいずれかに関連し得ることを示唆する。
最後に、剖検の日（ＰＮＤ４０）に、脳、肝臓、および血清の試料を野生型マウスおよびＴｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）から得て、導入遺伝子産物であるＧＡＬＣの活性レベルを定量した。フルオロフォアベースのＧＡＬＣ活性アッセイを使用してＧＡＬＣを定量することで、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの投与後に、ＡＡＶベクターが形質導入され、機能的な酵素が発現されたことを確認した。野生型動物をこのアッセイの対照として使用した。Ｔｗｉｔｃｈｅｒヘテロ接合（ｔｗｉ／＋）マウスは、観察可能な表現型を有しないにもかかわらず、それらのマウスでＧＡＬＣの活性レベルが低下しているため除外した。神経系がＧＡＬＣ送達の標的組織であるため、脳を調べ、肝臓および血清も調べて、末梢臓器系における形質導入を評価した。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを２．００×１０１１ＧＣの用量でＩＣＶ投与して２８日後、Ｔｗｉｔｃｈｅｒ（ｔｗｉ／ｔｗｉ）の脳、肝臓、および血清において、ＧＡＬＣ活性の超生理学的レベルが観察され、ビヒクル処置Ｔｗｉｔｃｈｅｒ（ｔｗｉ／ｔｗｉ）マウスおよび野生型対照の同じ組織で観察されたレベルよりも高かった（図１３Ａ～図１３Ｃ）。
併せると、これらのデータは、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを早期症候性Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスに投与することで、ＧＡＬＣ活性の超生理学的レベルをもたらし、重症度の低い臨床症状（神経運動機能障害、ＰＮＳ脱髄、およびグロボイド細胞の神経病理）と相関することを実証した。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ投与と組み合わせた骨髄移植の効果
この研究では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣと骨髄移植（ＢＭＴ）の二重療法の潜在的な利点を調査した。本発明者らは、クラッベ病の顕著な神経炎症成分のため、この併用療法を調査した。理論上、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、ＣＮＳのＧＡＬＣ酵素のさらなる供給源（移植細胞およびｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣで形質導入されたニューロンに由来するマクロファージ／ミクログリア細胞由来）を提供する一方、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣは、ＨＳＣＴによって影響を受けないＰＮＳに対する矯正を提供するため、相乗効果がある。さらに、この研究では、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣが、１）ＮＢＳプログラムを通して最初にＨＳＣＴを受け、その後に遺伝子療法を受けた患者、および／または２）適格であれば、最初に遺伝子療法を受け、その後にＨＳＣＴを受けた患者において有効であり得るかどうかを評価するために、異なる併用療法の設計を調べた。
表２に、併用療法研究を要約する。
Figure 2022525848000010
併用療法によるより良好な応答が予測されたため、１．００×１０１１ＧＣのｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ用量を利用した（以前の研究のｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ単剤療法で使用された用量よりも、低い用量のｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを可能にする）。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの有効性は、生存、体重、および神経学的観察（例えば、振戦および異常なクラスピング反射の存在）の観点から評価される。
群１～３の生存データを、図１４Ａ、図１４Ｂに示す。これまで、最良の生存は、ＰＮＤ０でのｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣのＩＣＶ投与、その後のＰＮＤ１０でのＢＭＴの投与による組み合わせで、症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウス（ｔｗｉ／ｔｗｉ）（群２）を処置することで達成された。明らかな徴候がない場合、生存期間は３００日超に延びた。これらのマウスは、前述の臨床評価に基づいて、より良好な身体状態にあるように見え（表１）、わずかな振戦を示したが、目立った歩行異常はなく、クラスピングもない（分析はまだ進行中、データ未記載）。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの前にＢＭＴを受けたマウス（群３）は、現在まだ生存しているが（Ｎ＝３／７）、顕著な振戦、一部の歩行異常、および体重減少を示す。しかし、ＢＭＴと組み合わせたブスルファン条件付けレジメンは、１０日齢より若いマウスにおいて毒性であり、群２および群３の両方のマウスで、併用療法の順序にかかわらず、ＢＭＴの前またはすぐ後のいずれかで、死亡率の増加を示した。群４は、早期症候性患者に遺伝子療法が投与され、続いてＢＭＴが投与される臨床的に関連性のある状況を模倣するように注入されている。
併せると、これらのデータは、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ処置をその後のＢＭＴと組み合わせることが、クラッベ病のマウスモデルにおいて各処置単独よりも高い有効性を提供し得ることを示唆する。
実施例３－ＴｗｉｔｃｈｅｒマウスモデルにおけるｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＡＬＣの最小有効用量（ＭＥＤ）の特定
ＭＥＤ試験は、非ヒト霊長類薬理学－毒性学研究用に製造された毒性学的ベクターロットを使用して、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスで実施される。この研究は、少なくとも２つの時点を含み、４つの用量レベルを評価して、ＭＥＤ、薬理、および組織病理（有効性および安全性）を決定する。用量レベルを、パイロット用量範囲研究およびヒトに合わせてスケーリングしたときの最大実行可能用量に基づいて選択した。早期症候性患者を模倣するために、ＰＮＤ１２で、動物にＩＣＶ注入する。動物の一部は、注入後１ヶ月で犠牲にし（ビヒクル処置が人道的エンドポイントに到達した場合）、同齢の対照と比較して薬理学および有効性の読み出しを取得する（研究３よりも同様の設計）。残りのマウスを、人道的エンドポイントまで追跡して、生存に対する処置の効果を評価する。存命中評価（体重、臨床スコアリングおよびロータロッドアッセイ）を行う担当者は、マウスの処置および遺伝子型に対して盲検化されている。
ＭＥＤは、ロータロッドアッセイ、標的臓器におけるＧＡＬＣ活性レベル、およびＣＮＳおよびＰＮＳにおける神経病理の矯正（すなわち、髄鞘形成の改善、グロボイド細胞浸潤の減少）を使用して、延命効果、臨床的スコアリング、体重、神経運動機能の分析に基づいて決定される。
研究設計および研究スケジュールは、以下の表３および表４に示される。
Figure 2022525848000011
Figure 2022525848000012
実施例４－クラッベイヌを処置するためのＡＡＶ媒介性遺伝子療法の有効性－大槽を介したｒＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｃＧＡＬＣｃｏ．ｒＢＧの注入
有益な疾患モデルでありながら、Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスにはいくつかの制限がある。マウスは、軽度のＣＮＳ関与のみを示し、より重度のＣＮＳ特徴である脳萎縮の脱髄の呈する乳児性クラッベ患者とは異なる。さらに、マウスのサイズが小さいことは、実験的な課題を提起する。ＩＣＶ経路は、マウスにおいて使用されなければならない。その理由は、それらのサイズが小さいため、意図された臨床経路（ＩＣＭ）を介してＡＡＶベクターを確実に注入することが困難になるからである。所望の薬理学的アッセイのすべてについても、マウスから、十分な量のＣＳＦおよび血液の連続試料を得ることができない。したがって、ｒＡＡＶｈｕ６８．ＧＡＬＣによる処置は、クラッベ病のイヌモデルであるより
大きな動物において評価され、これらの技術的制約を克服し、治療アプローチの拡張性を確認することができる。
Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスと同様に、クラッベイヌは、ミスセンス変異（Ｙ１５８Ｓ）を引き起こすＧＡＬＣ遺伝子における自然発生的なＡからＣへの変異に由来する天然に存在する常染色体劣性疾患モデルである。変異体ＧＡＬＣタンパク質は、０％に近い残留酵素活性を有し、これは、乳児形態のクラッベ病を有する患者において観察されるＧＡＬＣ活性レベルと類似している。ヘテロ接合イヌは症状を示さない一方で、変異に関してホモ接合のイヌは影響を受ける。
クラッベイヌは、表５に要約されるように、乳児性クラッベ病に類似する重篤な表現型を示す。クラッベイヌ表現型の進行はＴｗｉｔｃｈｅｒマウスよりも十分に特徴付けられていないが、罹患したクラッベイヌは、ＣＮＳおよび末梢神経の両方に影響を及ぼす脱髄およびグロボイド細胞の蓄積を示す。約４～６週齢で後肢の脱力、胸肢ジスメトリア、振戦を発症する。乳児性クラッベ患者と同様に、クラッベイヌは、症状の発症後に一貫した急速な神経学的悪化を呈する。最終的に、これらの症状は、重度の運動失調、骨盤肢麻痺、消耗、尿失禁、および感覚障害を特徴とする人道的エンドポイントまで、１５週齢頃までに進行する（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ Ｔ．Ｆ．＆Ｋｕｒｔｚ Ｈ．Ｊ．（１９７２）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．６６（２）：３７５－８、Ｗｅｎｇｅｒ Ｄ．Ａ．（２０００）Ｍｏｌｅｃ Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ．６（１１）：４４９－４５１、Ｂｒａｄｂｕｒｙ Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２９（７）：７８５－８０１）。
Figure 2022525848000013
この研究の目的は、大型動物疾患モデルにおけるｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣに類似するＡＡＶベクターの有効性を評価することによって、治療アプローチの拡張性を評価することである。これを達成するために、本発明者らは、クラッベ病の天然に存在するイヌ
モデルを利用し、ＧＡＬＣの操作されたイヌのバージョン（ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｃＧＡＬＣｃｏ．ｒＢＧ）をコードするｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣに類似するベクターを、意図された臨床経路（ＩＣＭ）を介して投与した（図３）。外来の導入遺伝子に対する誇張された免疫応答のリスクを制限するために、ＧＡＬＣのイヌバージョンを導入遺伝子として選択したが、ベクターの他のエレメントは、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ（遍在性ＣＢ７プロモーターおよびＡＡＶｈｕ６８カプシドを含む）と同じである。
図２３に、研究設計が提供されている。イヌ（Ｎ＝７匹、合計）に、３．００×１０１３ＧＣの用量のＧＡＬＣ発現ＡＡＶベクター（Ｎ＝４匹の罹患イヌ）またはビヒクル（人工ＣＳＦ、Ｎ＝２匹の罹患イヌ、Ｎ＝１匹の健常な野生型同腹仔）のいずれかを、２～３週齢でＩＣＭ注入した。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣは、症候前Ｔｗｉｔｃｈｅｒマウスにおいて、後の時点で処置された症候性マウスと比較して、より効果的であることが見出されたため、行動症状の発症前に、イヌをできるだけ早期に処置することを確実にするために、動物の齢を選択した（実施例２を参照されたい）。
Figure 2022525848000014
投薬後、動物は、毎日モニターされ（ケージぎわの観察）、毎週計量され、隔週ビデオ録画された。また、それらは脳ＭＲＩを受け、定期的に完全な身体検査、神経学的検査、神経伝導の記録、およびＢＡＥＲの記録を受けた。これらの検査の目的は、ＣＮＳおよびＰＮＳの完全性を評価することであった。有効性の読み出しには、脳の髄鞘形成（注入の８週間後のＭＲＩ、ＢＡＥＲ、および末期エンドポイントでの組織学によって評価される）、末梢神経の髄鞘形成（末期エンドポイントでのＮＣＶおよび組織学によって評価される）、神経学的検査、および身体検査（体重、歩行、反射、固有受容、オープンエリアでプレイするイヌのビデオ録画、隔週）が含まれた。加えて、注入されたベクターがｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣと同等であるため、薬理学、安全性、およびベクター生体分布を評価し、意図された臨床ＲＯＡ（ＩＣＭ投与）を使用した。神経伝導評価は、ミエリンの完全性の間接的な測定として、神経の完全性を測定した。ＢＡＥＲ記録は、ＣＮＳ（すなわち、脳幹）の聴覚路における伝導およびミエリン完全性を試験することを除いて、ＮＣＶと類似している。安全性の読み出しには、注入前０日目、ならびに１４、２８、５６、７０、１２０、および１８０日目（それぞれ±２日）の定期的な血球数（ＣＢＣ）、血清化学、および凝固が含まれる。また、ＣＳＦは、その量で疾患の矯正（リピドミクス、サイコシン濃度）およびＷＢＣ数（髄液細胞増多）を安全性の読み出しとして調べることが可能である場合に、リピドミクスバイオマーカー分析および細胞カウント用に処理された。５６日目に、イヌをＭＲＩ（Ｔ１およびＴ２強調）により検査し、ＣＮＳにおける髄鞘形成を観察した。ＧＡＬＣの酵素活性は、以下に示された時点で、ベースラインでのＣＳＦおよび血清の両方で評価して、ＣＮＳおよびＰＮＳで分泌される活性型の治療酵素の量
を測定した。イヌにおける既知のクラッベ病の進行に対応する適切な時点で完全なデータを収集しながら、動物の鎮静を最小限に抑えるために、各アッセイのための試験日を選択した（図１５）。
安全性およびバイオマーカー分析のために、血液およびＣＳＦを採取した。組織病理用に組織の包括的リストをサンプリングして、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの投与が脱髄および神経炎症を低減するかどうかを決定した。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの形質導入および発現を、生物分布により評価した。ＧＡＬＣ酵素活性の読み出し（図２４Ｂおよび図２４Ｃ）は、すべての処置されたクラッベイヌで、ＣＳＦへの急速な酵素分泌があることを示した。
症候前クラッベイヌでは、３．００×１０１３ＧＣでのｒＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣの単回大槽注入は、表現型矯正（図２５Ｅ）、生存率増加（図２４Ａ）、神経伝導の正常化（図２５Ａ～図２５Ｄ）、正常な血液検査、および改善された脳ＭＲＩ（図２９Ａおよび図２９Ｂ）を提供し、アプローチの拡張性を実証した。脳組織学は、対照に対して、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣクラッベイヌにおいて改善された髄鞘形成（図２６Ａ）および減少した神経炎症（小脳白質におけるＩＢＡ１染色）（図２６Ｂ）を示した。この研究で最初にＧＡＬＣ発現ベクターまたはビヒクルのいずれかを投与されたイヌは、いずれも有害事象を発現していない。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｃＧＡＬＣを投与されたクラッベイヌは、正常な成長を示し（図２７）、ＣＳＦ髄液細胞増多（図２８Ａ）および組織病理学的病変（図２８Ｂ）の不在に基づいて、６ヶ月目での毒性は観察されなかった。後肢の重度のペレシス、尿失禁、頭部振戦、および歩行運動を除く運動失調を含むクラッベ病の進行により、ビヒクルで処置されたイヌは、８週目および１２週目に安楽死させなければならなかった。注入後４５週間を超えて、すべてのベクターで処置されたイヌは、明るく、注意深く、症状がないように見え、すべてイヌが、クラッベイヌの最大平均寿命を超えた。
研究スケジュールおよびエンドポイントを、以下の表６に提示する。
Figure 2022525848000015
Figure 2022525848000016
実施例５－非ヒト霊長類における毒性試験
毒性試験は、マウスＭＥＤ試験で使用されたものと同じｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣのベクターロットを使用して実施した。ＮＨＰは、ヒトのサイズおよびＣＮＳ解剖学的構造をより良好に再現し、臨床ＲＯＡ（ＩＣＭ）を使用して処置することができるため、ＮＨＰで実施される。サイズ、解剖学的構造、およびＲＯＡの類似性から、代表的なベクター分布および形質導入プロファイルが得られることが予想され、マウスまたはイヌにおいて可能な毒性の評価よりも、正確な毒性の評価が可能になる。加えて、げっ歯類モデルまたはイヌモデルよりも、ＮＨＰにおいてより厳密な神経学的評価を実施することができ、ＣＮＳ毒性のより敏感な検出が可能になる。
ベクターのＩＣＭ投与により、ＣＳＦ区画内で即時のベクター分布がもたらされる。用量は、脳質量によってスケーリングされ、ＣＳＦ区画のサイズの近似値を提供する。用量変換は、新生仔マウスでは０．１５ｇ（Ｇｕ Ｚ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ
Ｏｎｅ．７（７）：ｅ４１５４２．）、幼若－成体マウスでは０．４ｇ（Ｇｕ Ｚ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．７（７）：ｅ４１５４２．）、幼若および成体アカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）では９０ｇ（Ｈｅｒｎｄｏｎ Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．１９（３）：２６７－７２）、イヌでは６０ｇ、４～１２ヶ月齢の乳児では８００ｇ、ならびに成人ヒトでは１３００ｇ（Ｄｅｋａｂａｎ Ａ．Ｓ．（１９７８）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．４（４）：３
４５－５６）の脳質量に基づく。ＮＨＰ毒性試験、マウスＭＥＤ試験の用量、および同等のヒト用量を、表７に示す。
Figure 2022525848000017
幼若アカゲザルは、提案された第１／２相試験の集団と解剖学的に類似するように、疾患の標的に応じて選択される。ＮＨＰ毒性試験の用量は、第１／２相臨床試験で使用される用量を反映し、以下を考慮して選択される：１）薬理試験の結果、および２）最大実現可能用量を考慮して、薬理試験からのＮＨＰおよびヒトへの用量の置き換え。
したがって、１８０日間のＧＬＰ準拠の安全性試験は、ＩＣＭ投与後のｒＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｃＧＡＬＣｃｏ．ｒＢＧ（ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ）の毒性を調べるために、成体アカゲザルで実施される。ＡＡＶのＩＣＭ投与後、分泌された導入遺伝子産物が安定した定常レベルに到達するのに十分な時間を与えるために、１８０日間の評価期間が選択された。表８および表９に、研究設計を概説する。幼若アカゲザル（およそ１．５歳）は、合計４．５０×１０１２ＧＣもしくは合計１．５０×１０１３ＧＣのいずれか（またはビヒクル）を受ける。用量レベルは、脳質量によってスケーリングされた場合、ＭＥＤ試験で評価された用量に相当するように選択された（マウスでは０．４ｇ、アカゲザルでは９０ｇを仮定）。高用量は、クラッベイヌモデルにおいて評価された用量に相当する（６０ｇの脳重量を仮定）。ベースラインの神経学的検査、臨床病理学（鑑別を伴う細胞数、臨床化学、および凝固パネル）、ＣＳＦ化学、およびＣＳＦ細胞診が行われる。ベクター（またはビヒクル）の投与後、動物を、苦痛および異常行動の徴候について毎日モニタリングする。
血液およびＣＳＦの臨床病理評価ならびに神経学的検査は、ベクターまたはビヒクルの投与後に３０日間、およびその後３０日間ごとに実施する。ベースラインおよびその後の３０日ごとの時点で、抗ＡＡＶｈｕ６８の中和抗体（ＮＡｂ）およびＡＡＶｈｕ６８に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答ならびにＧＡＬＣ産物を、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって評価する。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣまたはビヒクル投与後の９０日目または１８０日目のいずれかで、動物を安楽死させ、組織を採取して、包括的な顕微鏡組織病理学的検査を行う。組織病理学的検査は、ＣＮＳ組織（脳、脊髄、および後根神経節）および肝臓に焦点を当てている。なぜなら、これらはｒＡＡＶｈｕ６８ベクターのＩＣＭ投与後に最も重度に形質導入された組織であるからである。さらに、リンパ球は、剖検時にこれらの臓器内のカプシドおよび導入遺伝子産物の両方に反応するＴ細胞の存在を評価するために、体循環（ＰＢＭＣ）、脾臓、およびＣＮＳ流入領域リンパ節から採取される。組織は、任意の所見がベクターの生体分布のさらなる分析を必要とする場合に、採取され、保存される。
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実施例６－ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣによるクラッベ病の治療
ＦＩＨ治験は、ＧＡＬＣ遺伝子におけるホモ接合変異または複合ヘテロ接合変異によって引き起こされる、乳児形態のクラッベ病を有する小児患者におけるｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの単回ＩＣＭ投与の第１／２用量漸増試験である。このＦＩＨ治験では、少なくとも１２名の対象が登録され、治療を受ける。これらの対象は、２年間フォローアップされ、草案「ＦＤＡ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｆｏｌｌｏｗ－Ｕｐ ａｆｔｅｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」（Ｊｕｌｙ ２０１８）に記載されているアデノウイルスベクターに関して推奨されるＬＴＦＵに沿って、投与後の計５年間の長期フォローアップ（ＬＴＦＵ）が続く。主要目的は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの安全性および耐容性を評価することである。本研究の副次目的は、疾患に関連する評価（生存率、年齢に適した神経認知測定、および年齢に適した運動および／または言語学的評価を含む）に対するｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの影響を評価することである。これらのエンドポイントは、疾患の専門家および臨床医と協議して、未治療の乳児性クラッベ病患者の疾患の進展に関する観察に基づいて、選択される。
任意選択的に、ＨＳＣＴとＡＡＶ遺伝子療法の併用療法を評価してもよい。
ＦＩＨは、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの非盲検、多施設、用量漸増試験であり、乳児形態のクラッベ病を有する小児対象における安全性、耐容性、および探索的有効性のエンドポイントを評価する。用量漸増段階では、２つの用量レベルのｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを、対象への時間差の順次投与による、単回ＩＣＭ投与の安全性および耐容性を評価する。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ用量レベルは、ＧＬＰ ＮＨＰ毒性試験およびマウス（ＭＥＤ）試験のデータに基づいて決定され、低用量（コホート１に投与）および高用量（コホート２に投与）からなる。両方の用量レベルは、許容される場合、より高い用量が有利であると予想されることを理解して、治療上の利益を与えると予想される。低用量、続いて高用量の順次評価は、試験された用量の最大耐容用量（ＭＴＤ）の特定を可能にする。最後に、拡大コホート（コホート３）は、ＭＴＤのｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣを受容する（図１６）。ベクターの投与後の迅速なＧＡＬＣ酵素産生（治療後１週間で）は、延長された治療ウィンドウを提供する。
乳児性クラッベ病は、症状が現れると急速な疾患経過を特徴とするため、一部の新生児が出生時に疾患の徴候を呈することを考慮すると、提案された研究設計は、コホート１（低用量）およびコホート２（高用量）における最初の患者の投薬の３０日後、その対象に対する治験責任医師のベネフィット－リスク評価に基づいて、対象の同時登録を可能にする。この根拠は、患者が疾患の進行を経験したために治療ウィンドウを逃すリスクが、次の患者に投薬される前の長期の安全性フォローアップの潜在的な利益を上回ることである。患者が数週間のうちに実質的な疾患進行を経験するこのようなシナリオは、ニューヨークのＮＢＳを通じて特定されたＥＩＫＤ患者で観察された不良の移植転帰の考えられる原因として挙げられており（Ｗａｓｓｅｒｓｔｅｉｎ Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ．１８（１２）：１２３５－１２４３）、治療のために患者を迅速に照会する必要性を強調した。
独立した安全委員会は、コホート間および第２のコホートの完全な登録後に蓄積されたすべての安全性データの安全性審査を行い、治験のさらなる実施に関する勧告を行う。また、安全審査委員会は、安全審査トリガー（ＳＲＴ）が観察された場合はいつでも審査を実施する。各コホートにおける第１の対象と第２の対象との間の１ヶ月間の投与間隔は、急性免疫反応、免疫原性または他の用量制限的な毒性を示すＡＥの評価、ならびに非臨床試験において２～４週間以内に生じるＤＲＧの形質導入に続く感覚神経病理の発症の予想される時間経過と一致する可能性のある任意の感覚神経障害の臨床審査を可能にする。
追加の対象は、ＭＴＤを受ける拡大コホートに登録される。これらの追加の対象の登録は、対象間の４週間の観察期間を必要としない（図１６）。任意選択的に、このコホートは、ＨＳＣＴとｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣによる併用療法を受ける。
すべての処置された対象を、２年間経過観察し、安全性プロファイルを評価し、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの薬物動態および有効性の特性を特徴付ける。対象は、試験のＬＴＦＵ期間中、さらに３年間（投与後、合計５年間）経過観察され、長期的な臨床転帰が評価される。これは、“ＦＤＡ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｆｏｌｌｏｗ－Ｕｐ ａｆｔｅｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”（Ｊｕｌｙ ２０１８）に準拠している。
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統計的方法
安全性評価のための統計的比較は計画されていない。すべての結果は説明のみである。データを列挙し、要約表を作成する。
二次エンドポイントおよび探索的エンドポイントについて統計的比較を実施する。各時点での測定値は、各対象のベースライン値、ならびに同齢の健康な対照からのデータ、および各エンドポイントで利用可能な場合は同等のコホート特性を有するクラッベ病患者からの自然歴データと比較される。
すべてのデータは、対象のデータリストに表示される。カテゴリー変数は、頻度およびパーセンテージを使用して要約され、連続変数は、記述統計量（非見逃し観察の数、平均値、標準偏差、中央値、最小値、および最大値）を使用して要約される。グラフ表示は、適切に提示される。
集団の根拠
試験集団－小児患者
ＦＩＨは、９ヶ月齢以前に症状が発症した乳児対象に焦点を当てており、これらの患者にはＨＳＣＴが適応されないことから、満たされていないニーズが最も高い集団を表している。さらに、これらの患者は、運動障害および認知障害の両方の提示において均質である、急速かつ高度に予測可能な減退を伴う非常に破壊的な疾患経過を有する（Ｂａｓｃｏｕ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．１３（１）：１２６）。実際、９ヶ月齢以前に症状を呈する患者は、早期乳幼児性クラッベ病に類似した疾患経過を有し、急速かつ重度の認知障害および運動障害が進行し、疾患の初期徴候および症状に続いていかなる機能的スキルも獲得できない。これらの患者の大部分は、生後数年以内に死亡すると予想される（２年生存率は、２６～５０％の範囲である）（Ｄｕｆｆｎｅｒ Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ．４５（３）：１４１－８、Ｂｅｌｔｒａｎ－Ｑｕｉｎｔｅｒｏ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．１４（１）：４６）。９～１２
ヶ月齢で発症した乳児の表現型は、より多様であり、一部は、重度の早期乳児性クラッベ病表現型を示すが、他は、（ほぼ）正常な認知を伴うより軽度の疾患症状を有し、適応および微細運動スキルが著しく優れているため、９～１２ヶ月齢で発症した新たに診断された患者の表現型を予測することが困難になる（Ｂａｓｃｏｕ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．１３（１）：１２６）。その結果、集団は、症状発症が９ヶ月齢未満の対象に限定され、その予測可能で急速な減少が、合理的なフォローアップ期間内に、頑強な研究設計および機能的転帰の評価を支援する。この群では、治療により、疾患進行が安定化し、獲得した発達マイルストーンおよび運動マイルストーンなどのスキルの喪失が防止され、生存期間が延長し、発作の発症が遅延または防止されると期待される。
基礎となる病態生理が共有されているにもかかわらず、成人のクラッベ表現型および疾患経過は、壊滅的な乳児性クラッベ病の形態からすると顕著に軽度であるため、成人における疾患の安定化の実証は、乳児性クラッベ病の治療を信頼する理由を提供しない。重要なことに、成人性クラッベ病の発症は非常に多様であり、進行がより遅く、より変わりやすく、衰退は数年から数十年にわたって起こる（Ｊａｒｄｉｍ Ｌ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ．５６（８）：１０１４－７、Ｄｅｂｓ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｊ Ｉｎｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ．３６（５）：８５９－６８）。長期にわたる自然経過の中で、治験療法の有効性を明確に示すことができる臨床試験を設計することは非常に困難であろう。ＨＳＣＴが疾患の発現を安定させるか、または改善させることができる治療オプションを提供するという事実は、別の重要な考慮事項である（Ｓｈａｒｐ Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ．１０：５７－９、Ｌａｕｌｅ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ．２８（３）：２５２－２５５）。最後に、ＮＢＳは、米国では広く採用されておらず、ヨーロッパでは利用できず、曖昧で非特異的な臨床症状は、成人性クラッベ病が引き続き過小診断されていることを意味し、したがって、そのような患者へのアクセスが非常に稀である（Ｗａｓｓｅｒｓｔｅｉｎ Ｍ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｄ．１８（１２）：１２３５－１２４３）。
試験集団－重篤な疾患を有する対象の除外
ほとんど不可逆的であると考えられるＣＮＳ傷害を伴うクラッベ病の性質、および乳幼児集団における非常に急速な疾患進行を考慮すると、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣは、難聴、盲目、原始反射の喪失を伴う重度の脱力を含む、疾患の後期に固有に関連する徴候を示さない、無病または軽度から中等度の疾患を有する患者において最大の利益の可能性を与えると予想される（Ｅｓｃｏｌａｒ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．１１８（３）：ｅ８７９－８９）．さらに、異常な瞳孔反射、衝動性（ｊｅｒｋｙ）の眼球運動、または視覚追跡障害は、中等度の徴候および症状を有する患者よりも非常に進行性の疾患でより一般的であり、典型的には、疾患の初期段階では観察されない（Ｅｓｃｏｌａｒ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ．１１８（３）：ｅ８７９－８９）．したがって、これらの徴候のうちの１つ以上の証拠は、進行性疾患の指標と見なされ、治験から除外される。重度の障害のため、これらの患者は、低レベルの臨床機能での疾患の安定化を超えて療法から実質的な利益を得る可能性は低く、ベネフィット／リスクプロファイルは好ましくなく、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの有効性の評価を妨げる様々な臨床評価および計測評価に対して床効果を示す。この集団はまた、疾患の後遺症の進行状態のため、治療に関連しない安全性の懸念に対するリスクが高い可能性を示し、本治験から除外されている。
治験責任医師の意見では、小児が進行性疾患の他の徴候を有し、治療から利益を得る可能性が低い場合を除いて、臨床的な発作を有する患者は治験から除外されない。これは、１）発作が進行性疾患と一意に関連しておらず、２）発作が治験のエンドポイントであり
、発作を有する患者を除外すると、発作を経験しにくい集団に研究が偏る可能性があるためである。
試験集団－症候前対象の包含
症候性乳幼児クラッベ病患者は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣのみが評価される用量漸増部分の試験（コホート１およびコホート２）から除外される。これらの患者に対して、少なくとも米国では、ＨＳＣＴは、たとえそれが疾患の進行を遅延させるだけであるとしても、治療オプションおよび選択される治療と見なされる。米国ＫＯＬの一般的な見解は、過度に狭い治療ウィンドウが、少なくとも部分的な利益をもたらすことが示されている治療へのアクセスを患者から効果的に奪うことになるため、この集団では証明されていない治験療法を試験することは非倫理的であると見なされるであろうというものである（すなわち、遺伝子療法が不成功であることが証明された場合、ＨＳＣＴを用いて「救出」される時間がない可能性が高い）。したがって、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣは、最も明確な満たされていないニーズを有する患者（すなわち、ＨＳＣＴの対象とならない徴候および症状を有する乳児性クラッベ病の患者）のために確保されるべきである。
本発明者らの前臨床研究は、いずれかのアプローチ単独よりも遺伝子療法とＨＳＣＴの併用の優れた有効性を確認し、したがって、ＨＳＣＴとｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの併用療法は、ＦＩＨ試験の拡大コホートとして評価される（コホート３）。このコホートは、ＨＳＣＴの文脈で、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの安全性および有効性を評価し、前臨床データがＨＳＣＴ単独よりも改善された有効性を信頼する理由を提供する場合にのみ進行するため、本書に概説されている基準を満たす症候性患者および症候前患者の両方が登録の対象となる。
試験集団－下限年齢の正当性
症状の発症は、周産期に、または子宮内でさえ起こり得ることを考慮すると、治療は、潜在的な利益を最大化するために可能な限り早期に行われる。したがって、本研究の最低年齢は、現在のコンセンサスガイドラインでは、適格な患者において１ヶ月齢以前のＨＳＣＴが推奨されているため、投薬時に１ヶ月齢として選択された（Ｋｗｏｎ Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．１３（１）：３０）。対象が１ヶ月以上であることを要求することにより、対象および家族は、本治験への資格を得る前に、他の形態の標準治療を考慮することができる。
下限の年齢を選択する際の別の考慮事項は、このような若い患者で治療（具体的には、ＩＣＭ処置）が安全に実行できるようにすることである。１週齢または２週齢の幼児からの画像スキャンを慎重に検討した後、ペンシルベニア大学の専門の介入放射線科医により、治療の根拠が裏付けられている限り、１ヶ月齢の乳児でＣＴガイドによるＩＣＭ投与を行うことに特定の解剖学的懸念はないことが確認された。
エンドポイント
安全性および耐容性を主要エンドポイントとして測定することに加えて、副次的および探索的な薬力学的および有効性のエンドポイントが、現在の文献に基づいて、クラッベ病を専門とする一流の臨床医と協議して、この試験のために選択された。これらのエンドポイントは、この集団において有意義な機能転帰および臨床転帰を示すことが期待される。エンドポイントは、図１８Ａ～図１８Ｃに示されるように、鎮静および／または腰椎穿刺を必要とするものを除いて、３０日目、９０日目および６ヶ月目に測定され、次いで、２年間の短期フォローアップ期間中は、６ヶ月ごとに測定される。長期フォローアップ段階では、測定頻度は１２ヶ月ごとに１回に減らされる。これらの時点を選択して、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの安全性および耐容性の完全な評価を容易にした。未治療の乳児クラッベ患者における急速な疾患進行を考慮して、早期の時点および６ヶ月間隔も選択され
た。これにより、未治療比較データが存在するフォローアップ期間にわたって、治療された対象における薬力学および臨床有効性の測定値の完全な評価が可能になる。ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣ投与後、対象は、草案“ＦＤＡ Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｌｏｎｇ Ｔｅｒｍ Ｆｏｌｌｏｗ－Ｕｐ Ａｆｔｅｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”（Ｊｕｌｙ ２０１８）に従って、安全性と有効性に関して、合計５年間、引き続きモニタリングされる。
疾患進行および臨床転帰
乳児集団における疾患進行の急速かつ均一な速度を考慮して（Ｄｕｆｆｎｅｒ Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ．．４５（３）：１４１－８、Ｂａｓｃｏｕ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．１３（１）：１２６）、主要な転帰の評価のための２年間のフォローアップは、経時的なｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの影響を評価するのに十分であると考えられる。さらに、治療後５年目までのＬＴＦＵは、長期的な転帰を評価するために、また、ＨＳＣＴ後の症候前患者で観察される転帰と同様のまたはそれより優れた機能レベルで生存期間を延長し、患者を安定化させる上で治療が有効であるかどうかを評価するために、非常に有益である。
ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの投与は、生存率によって測定される疾患進行を安定させ、発達マイルストーンおよび運動マイルストーンの喪失を防ぎ、新たなマイルストーンの獲得を潜在的に支援し、発症および発作の頻度。死亡は、典型的には、早期乳児性クラッベ病と診断された大部分の患者について生後３年間で発生し、症状の発症が７～１２ヶ月からの患者を組み込んだ後期乳幼児集団では、死亡率の中央値が５年に延長する（Ｄｕｆｆｎｅｒ Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ．４６（５）：２９８－３０６）。発症が９ヶ月齢以前の患者に選択基準を限定することによって、集団は、より重度の幼児様表現型および疾患経過を有する（Ｂａｓｃｏｕ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．１３（１）：１２６）。未治療の乳児性クラッベ病の症例で見られる急速な減少を考慮すると、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣによる治療は、フォローアップ期間中に平均寿命を延ばす。運動マイルストーンの発達は、対象の登録時の年齢および病期に依存する（Ｂａｓｃｏｕ Ｎ．，ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．１３（１）：１２６、Ｂｅｌｔｒａｎ－Ｑｕｉｎｔｅｒｏ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．１４（１）：４６）。標的集団における疾患の重症度を考慮すると、対象は、登録によって運動スキルが達成したか、他の運動マイルストーンを発達させてその後に失われたか、または運動マイルストーンの発達の兆しがまだ示されていない場合がある。評価は、すべてのマイルストーンについて、達成した年齢（ａｇｅ－ａｔ－ａｃｈｉｅｖｅｍｅｎｔ）および喪失した年齢（ａｇｅ－ａｔ－ｌｏｓｓ）を追跡する。運動マイルストーンの達成度は、ＷＨＯ基準に基づいて、６つの粗大マイルストーンに対して定義され、表１１に概説されている。
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乳児性クラッベ病を有する対象は、生後数週間または数ヶ月以内に症状を発症する可能性があり、第１のＷＨＯ運動マイルストーン（支えなしで座ること）の獲得が、典型的には、４ヶ月齢以前に現れないことを考慮すると（中央値：５．９ヶ月齢）、このエンドポイントは、特に治療時により明らかな症状を有していた対象において、治療的利益の程度を評価するための感度を欠く場合がある。このため、乳児に適用され得る年齢に適した発達マイルストーンの評価も含まれる（Ｓｈａｒｐ Ｍ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＪＩＭＤ Ｒｅｐ．１０：５７－９）．１つの欠点は、公開されたツールは、臨床医および親が使用することを意図しており、通常の範囲を参照せずにマイルストーン獲得の典型的な年齢前後でのスキルを整理することである。しかしながら、このデータは、乳児性クラッベ病を有する未治療の小児または定型発達の小児における典型的な獲得時期と比較して、経時的な発達マイルストーンの保持、獲得、または喪失を要約するために有益であり得る。
発作は、乳児集団に現れる症状ではないが、約３０～６０％の乳児患者は、最終的には、疾患の後期段階で発作を発症する（Ｄｕｆｆｎｅｒ Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ．４５（３）：１４１－８）。発作活動の発症の遅延により、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣによる治療が、この集団における発作の発症を予防もしくは遅延させ得るか、または発作事象の頻度を減少させ得るかのいずれかを決定す
ることが可能になる。親は、発作の発症、頻度、長さ、および種類を追跡する、発作日記をつけるように求められる。これらの記載事項（ｅｎｔｒｉｅｓ）は、各来院時に臨床医と話し合い、解釈される。
探索的尺度として、臨床スケールを使用して、適応行動、認知、言語、運動機能、および健康に関連する生活の質における発達および変化に対するｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの影響を定量化する。提案された各尺度は、クラッベ集団または関連集団のいずれかで使用されている。
スケールおよび関連するドメインを、以下に簡潔に説明する。
・乳幼児発達のベイリー尺度（第３版）：認知、言語、運動、社会性－情動、および適応行動の５つのドメインにわたって、乳児および幼児の発達を評価する。すべてのドメインは、治験で評価される。
・ヴァインランドの適応行動尺度（第３版）：コミュニケーション、日常生活スキル、社会化、運動スキル、不適応行動の５つの領域にわたって、誕生から成人（０～９０歳）までの適応行動を評価する。第２版から第３版への改善点は、発達障害をよりよく理解できるように質問が組み込まれている。
・ピーボディ発達運動尺度－第２版：出生から５歳児までの相互に関連する運動機能を測定する。評価は、反射、静止、歩行運動、物体操作、把握、および視覚－運動統合の６つの領域に焦点を当てる。
・乳幼児生活の質質問票（ＩＴＱＯＬ）：親の報告による２ヶ月齢の乳児から５歳齢の幼児までの乳幼児用に設計された健康関連の生活の質の尺度。
・早期学習のミューレン尺度：６８ヶ月齢までの乳幼児における言語、運動、および知覚の能力を評価する。
疾患バイオマーカー
ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの疾患病理に対する効果を評価するために、髄鞘形成の変化、髄鞘形成に関連する機能転帰、および潜在的な疾患バイオマーカーを測定する。疾患の主要な特徴としての中枢および末梢の脱髄は、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの投与により、進行が遅延するか、または停止する。中枢の脱髄は、白質領域の拡散テンソル磁気共鳴画像法（ＤＴ－ＭＲＩ）異方性測定、および皮質脊髄運動路の線維追跡によって追跡され、それらの変化は、病状および進行の指標となる（ＭｃＧｒａｗ Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ．２３６（１）：２２１－３０、Ｅｓｃｏｌａｒ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２００９）ＡＪＮＲ Ａｍ Ｊ Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ．３０（５）：１０１７－２１）。末梢の脱髄は、運動神経（深腓骨神経、脛骨神経、および尺骨神経）および感覚神経（腓腹神経および正中神経）の神経伝導速度（ＮＣＶ）検査を介して間接的に測定され、生物学的に活性なミエリンの変化（すなわち、Ｆ波および遠位潜時、振幅、または応答の有無）を示す変動モニタリングする。
ある研究によると、視覚障害の発症は、早期乳児性クラッベで一般的であり、その集団の６１．２％が、疾患のある時点で視力喪失を発症している（Ｄｕｆｆｎｅｒ Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｕｒｏｌ．４５（３）：１４１－８）。発作と同様に、視力喪失は一般的な症状ではない。これは、治療前に著しい視力喪失を発症していない対象の視力喪失を遅延または予防するために、ｒＡＡＶｈｕ６８．ｈＧＡＬＣの能力を評価する機会を提供する。したがって、視覚誘発電位（ＶＥＰ）の測定は、中心視の障害または損失の指標としての視覚刺激に対する応答を客観的に測定するために使用される。難聴は、疾患進行中も一般的であり、聴覚異常の早期徴候は、脳幹聴性誘発応答（ＢＡＥＲ）検査を介して測定される。
ＧＡＬＣは、サイコシンの加水分解を担う。クラッベ病におけるＧＡＬＣの欠損は、中
枢および末梢の両方でサイコシンの蓄積をもたらす。サイコシンレベルの増加は、クラッベ病の指標として提案されている（Ｅｓｃｏｌａｒ Ｍ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｍｅｔａｂ．１２１（３）：２７１－２７８）。乳児性クラッベの早期の重度の症例の検出におけるその使用を支持する証拠は存在するが、後期の疾患ではサイコシンレベルも低下する可能性があるため、治療後の経時的なサイコシンレベルの変動の解釈が困難になる可能性がある。したがって、サイコシンレベルの低下の証拠だけでは、それが臨床疾患の安定化を伴わない限り、治療効果の十分な証拠にはならない。
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含む配列を提供する。
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Figure 2022525848000033
Figure 2022525848000034
本明細書に引用されるすべての文書は、参照により本明細書に援用され、本明細書に添えて提出される配列および配列表（「１８－８５８４ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」とラベル付けされている）のテキストも、本明細書に援用される。２０１９年２月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８１０，７０８号、２０１９年３月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／８１７，４８２号、２０１９年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８７７，７０７号、および２０１９年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９１６，６５２号は、それらの配列表と共に、それらの全体が参照により援用される。本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の趣旨から逸脱することなく修正を行うことができることが理解されよう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内であることが意図される。

Claims (55)

  1. 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む組成物であって、前記ｒＡＡＶが、
    （ａ）中枢神経系の細胞を標的とするＡＡＶカプシドと、
    （ｂ）（ｉｉ）ベクターゲノムであって、（ｉ）シグナルペプチド、および少なくとも配列番号１０のａａ４３～６８５のアミノ酸配列を有する成熟ヒトガラクトシルセラミダーゼのタンパク質をコードし、前記タンパク質の発現を指示する調節配列の制御下にある、ガラクトシルセラミダーゼのコード配列、ならびに（ｉｉ）前記ベクターゲノムを前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングするのに必要なＡＡＶ逆位末端配列、を含む、ベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングされる、組成物。
  2. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記コード配列が、配列番号１０の全長ヒトガラクトシルセラミダーゼのシグナルペプチドおよび成熟ヒトガラクトシルセラミダーゼのタンパク質（アミノ酸１～６８５）をコードする、請求項１または請求項２に記載の組成物。
  4. 前記コード配列が、外因性ペプチドのコード配列と配列番号９のヌクレオチド１２７～２０５５の核酸配列もしくはそれと９５％～９９．９％同一の配列とを有するか、または配列番号９のヌクレオチド１～２０５５のヌクレオチド配列もしくはそれと９５％～９９．９％同一の配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記コード配列が、配列番号１０の前記成熟ヒトガラクトシルセラミダーゼのタンパク質（アミノ酸４３～６８５）および中枢神経系のヒト細胞に好適な外因性シグナルペプチドをコードする、請求項１または請求項２に記載の組成物。
  6. 前記調節配列が、ベータアクチンプロモーター、イントロン、およびウサギグロビンポリＡを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記調節配列が、配列番号１３を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記調節配列が、配列番号１５を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記調節配列が、配列番号１６を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記ベクターゲノムが、配列番号１９のｎｔ１９８～４１６８の配列を有するＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ＲＢＧを含む、請求項１または２に記載の組成物。
  11. 前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ、前記コード配列、および前記調節配列、ならびにＡＡＶ２の３’ＩＴＲをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記組成物が、患者への髄腔内送達に好適な水性液体をさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記組成物が、人工脳脊髄液および界面活性剤を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記組成物が、髄腔内送達用に製剤化され、１．４×１０１３～４×１０１４ＧＣの前
    記ｒＡＡＶを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記組成物が、大槽内送達用に製剤化され、１．４×１０１３～４×１０１４ＧＣの前記ｒＡＡＶを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 組換えアデノ随伴ウイルスであって、（ａ）中枢神経系の細胞を標的とするＡＡＶカプシドと、（ｂ）ベクターゲノムであって、（ｉ）シグナルペプチド、および配列番号１０のａａ４３～６８５のアミノ酸配列を有する成熟ヒトガラクトシルセラミダーゼのタンパク質をコードし、前記シグナルペプチドおよび成熟ヒトガラクトシルセラミダーゼのタンパク質の発現を指示する調節配列の制御下にある、ガラクトシルセラミダーゼのコード配列、ならびに（ｉｉ）前記ベクターゲノムを前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングするのに必要なＡＡＶ逆位末端配列、を含む、ベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングされる、組換えアデノ随伴ウイルス。
  17. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである、請求項１６に記載のｒＡＡＶ。
  18. 前記コード配列が、外因性シグナルペプチドのコード配列と配列番号９のヌクレオチド１２７～２０５５もしくはそれと９５％～９９．９％同一の配列とを有するか、または配列番号９のヌクレオチド１～２０５５のヌクレオチド配列もしくはそれと９５％～９９．９％同一の配列を有する、請求項１６または１７に記載のｒＡＡＶ。
  19. 前記コード配列が、アミノ酸４３～６８５（配列番号１０）の前記成熟タンパク質と、外因性シグナルペプチドとをコードする、請求項１６～１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  20. 前記調節配列が、ニワトリベータアクチンプロモーター、イントロン、およびウサギグロビンポリＡを含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  21. 前記調節配列が、配列番号１３を含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  22. 前記調節配列が、配列番号１５を含む、請求項１６～２１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  23. 前記調節配列が、配列番号１６を含む、請求項１６～２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  24. 前記ベクターゲノムが、配列番号１９のｎｔ１９８～４１６８の配列を有するＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ＲＢＧを含む、請求項１６～２３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  25. 前記ベクターゲノムが、ＡＡＶ２の５’ＩＴＲ、前記コード配列、および前記調節配列、ならびにＡＡＶ２の３’ＩＴＲを含む、請求項１６～２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
  26. ＡＡＶｈｕ６８カプシドおよびＣＢ７．ＣＩ．ｈＧＡＬＣ．ＲＢＧベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス。
  27. 請求項１６～２６のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のストックを含む組成物であって、クラッベ病の治療に有用である、組成物。
  28. 医薬品の調製における、請求項１６～２６のいずれか一項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のストックを含む組成物の使用。
  29. 前記組成物が、末梢神経の機能障害を治療するのに、かつ／またはクラッベ病を治療するのに有用である、請求項２７に記載の組成物または請求項２８に記載の使用。
  30. 前記ｒＡＡＶが、造血幹細胞療法または骨髄移植との併用療法として投与可能である、請求項２７に記載の組成物または請求項２８に記載の使用。
  31. 前記ｒＡＡＶが、基質合成抑制療法との併用療法として投与可能である、請求項２７に記載の組成物または請求項２８に記載の使用。
  32. シグナルペプチドと、配列番号１０のアミノ酸４３～６８５のアミノ酸配列を有する成熟ヒトガラクトシルセラミダーゼのタンパク質と、をコードするガラクトシルセラミダーゼのコード配列を含む、プラスミド。
  33. 前記コード配列が、配列番号９の核酸配列、またはそれと９５％～９９．９％同一の配列を有する、請求項３２に記載のプラスミド。
  34. クラッベ病を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のストックを含む組成物を投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、（ａ）中枢神経系の細胞を標的とするＡＡＶカプシドと、（ｂ）ベクターゲノムであって、シグナルペプチド、および配列番号１０のアミノ酸４３～６８５のアミノ酸配列を有する成熟ヒトガラクトシルセラミダーゼのタンパク質をコードし、前記タンパク質の発現を指示する調節配列の制御下にある、ガラクトシルセラミダーゼのコード配列を含む、ベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、前記ベクターゲノムを前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングするのに必要なＡＡＶ逆位末端配列をさらに含み、前記ベクターゲノムが、前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングされる、方法。
  35. クラッベ病によって引き起こされる呼吸不全および運動機能喪失を引き起こす末梢神経の機能障害を矯正するための方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のストックを含む組成物を、特許に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、（ａ）中枢神経系の細胞を標的とするＡＡＶカプシドと、（ｂ）ベクターゲノムであって、シグナルペプチド、および配列番号１０のアミノ酸４３～６８５のアミノ酸配列を有する成熟ヒトガラクトシルセラミダーゼのタンパク質をコードし、前記タンパク質の発現を指示する調節配列の制御下にある、ガラクトシルセラミダーゼのコード配列を含む、ベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、前記ベクターゲノムを前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングするのに必要なＡＡＶ逆位末端配列をさらに含み、前記ベクターゲノムが、前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングされる、方法。
  36. クラッベ病によって引き起こされる発作の発症または頻度を遅延させる方法であって、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）のストックを含む組成物を、患者に投与することを含み、前記ｒＡＡＶが、（ａ）中枢神経系の細胞を標的とするＡＡＶカプシドと、（ｂ）ベクターゲノムであって、シグナルペプチド、および配列番号１０のアミノ酸４３～６８５のアミノ酸配列を有する成熟ヒトガラクトシルセラミダーゼのタンパク質をコードし、前記タンパク質の発現を指示する調節配列の制御下にある、ガラクトシルセラミダーゼのコード配列を含む、ベクターゲノムと、を含み、前記ベクターゲノムが、前記ベクターゲノムを前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングするのに必要なＡＡＶ逆位末端配列をさらに含み、前記ベクターゲノムが、前記ＡＡＶカプシド中にパッケージングされる、方法
    。
  37. 前記患者が、早期乳児性クラッベ病（ＥＩＫＤ）を有する、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記患者が、後期乳児性クラッベ病（ＬＩＫＤ）を有する、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記患者が、若年性クラッベ病（ＪＫＤ）を有する、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記患者が、青年／成人性クラッベ病を有する、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記ＡＡＶカプシドが、ＡＡＶｈｕ６８カプシドである、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 前記コード配列が、外因性ペプチドのコード配列と配列番号９のヌクレオチド１２７～２０５５もしくはそれと９５％～９９．９％同一の配列とを有するか、または配列番号９のヌクレオチド１～２０５５のヌクレオチド配列もしくはそれと９５％～９９．９％同一の配列を有する、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記コード配列が、配列番号１０のアミノ酸４３～６８５の前記成熟ヒトガラクトシルセラミダーゼのタンパク質および外因性シグナルペプチドをコードする、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の方法。
  44. 前記調節配列が、ベータアクチンプロモーター、イントロン、およびウサギグロビンポリＡを含む、請求項３４～４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ｒＡＡＶが、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）または骨髄移植との併用療法として投与される、請求項３４～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 前記ＨＳＣＴまたは骨髄移植が、ｒＡＡＶ投与の投与前に実施される、請求項４５に記載の方法。
  47. 前ｒＡＡＶが、基質合成抑制療法との併用療法として投与される、請求項３４～４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記組成物が、髄腔内、脳室内、または実質内投与用に製剤化される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  49. 前記ｒＡＡＶが、髄腔内、脳室内、または実質内投与を介して送達される、請求項３４～４７のいずれか一項に記載の方法。
  50. 前記組成物が、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる大槽への（大槽内）後頭下注入を介して、単回用量として投与するために製剤化される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組成物。
  51. 前記組成物が、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）ガイドによる大槽への（大槽内）後頭下注入を介して、単回用量として投与される、請求項３４～４７のいずれか一項に記載の方
    法。
  52. 前記組成物が、１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量の前記ｒＡＡＶを髄腔内投与するために製剤化される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  53. 前記組成物が、前記ｒＡＡＶの１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量～５×１０１１ＧＣ／ｇ脳質量の用量で髄腔内投与される、請求項３４～４７のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記組成物が、１．４×１０１３～４×１０１４ＧＣの用量の前記ｒＡＡＶを投与するために製剤化される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組成物。
  55. 前記組成物が、ヒト患者に投与され、１．４×１０１３～４×１０１４ＧＣの用量の前記ｒＡＡＶが投与される、請求項３４～４７のいずれか一項に記載の方法。
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