KR20210131855A - R-point 조절 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물, 상기 복합체의 형성 여부를 이용한 폐암 치료제 스크리닝 방법 및 폐암 진단 방법 - Google Patents

R-point 조절 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물, 상기 복합체의 형성 여부를 이용한 폐암 치료제 스크리닝 방법 및 폐암 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 혈청 자극 후 1 내지 2시간 후에 Runx3-BRD2 복합체가 형성되고, BRD2 내의 BD1은 아세틸화한 Runx3의 라이신 잔기 94번과 171번에 결합하고, BD2는 아세틸화한 히스톤4의 라이신 잔기 5번(H4K5-ac), 히스톤4의 라이신 잔기 12번(H4K12-ac) 및 히스톤3의 라이신 잔기 14번(H3K14-ac)과 결합하며, BRD2는 C-말단 부분을 통해서 MLL1, MLL5 및 SWI/SNF가 RUN3-BRD2 복합체의 BRD2와 결합하여 RUNX3-BRD2-MLL1/5-SWI/SNF 복합체를 형성하며, 상기 복합체는 R-point 결정에 기여한다는 것을 보여줌으로써, RUNX3가 R-point의 파이오니어 인자(pioneer factor)라는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선별된 피검물질은 Runx3 단백질과 병용투여 되어 K-Ras 돌연변이 폐선암의 치료제로 사용될 수 있고, 복합체의 형성을 확인하면 K-Ras 돌연변이 폐선암을 진단할 수 있으며, Runx3-BRD2-MLL1 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포를 투여하면 K-Ras 돌연변이 폐선암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

R-point 조절 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물, 상기 복합체의 형성 여부를 이용한 폐암 치료제 스크리닝 방법 및 폐암 진단 방법{A pharmaceutical compositon for treating lung cancer comprising R-point regulatory protein complex as an active ingredient, a screening method for treating lung cancer using the formation of the complex, and a method for diagnosing lung cancer}
본 발명은 R-point 조절 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물, 상기 복합체의 형성 여부를 이용한 폐암 치료제 스크리닝 방법 및 폐암 진단 방법에 관한 것이다.
폐암은 암으로 인한 사망 중 가장 높은 비중을 차지하는 암으로, 전세계적으로 매년 약 130만 명 이상이 폐암으로 사망한다. 폐암은 암 세포의 크기와 형태에 따라 암 세포의 크기가 작은 경우 소세포폐암(small cell lung cancer), 암 세포의 크기가 작지 않은 경우 비소세포폐암(Non-small cell lung cancer)으로 분류된다. 이 중 소세포폐암은 전체 폐암 중 약 15%를 차지하고, 흡연자에게 많이 나타나며 공격적 형태의 암으로 생존률이 낮다. 비소세포폐암은 다시 편평상피암(squamous cell carcinoma), 대세포암(large cell carcinoma) 및 폐선암(lung adenocarcinoma)으로 나뉘어진다. 폐선암은 폐의 선(腺) 조직, 즉 체액을 분비하는 기능을 가지는 세포인 작은 말초 기관지 상피에 생기는 암으로, 비흡연자나 여성에게 많이 나타나며 크기가 작아도 전이가 되는 경우가 빈번하다. 폐선암은 폐암의 약 35~40%를 차지한다고 알려져있다.
표적 암치료법 개발 연구는 암 유전자의 기능을 억제시키거나 또는 암 억제 유전자의 기능을 활성화시켜 암 세포를 제어하는 전략을 중심으로 진행되고 있다. 암 유전자 중 K-Ras의 돌연변이에 의한 K-Ras 기능의 비정상적인 활성화는 인체 암 발병의 주요 원인 중 하나로 알려져 있다. 폐암의 경우에도 K-Ras 돌연변이가 관찰되며 특히 폐선암의 경우 약 35%에서 K-Ras 돌연변이가 발생 되는 것으로 알려져 있다. 이에, K-Ras 기능의 활성화에 의해 발병되는 암을 치료하기 위하여 K-Ras의 기능을 억제하여 암을 치료하는 방법에 대해 연구가 이루어져 왔다. 그러나 K-Ras의 기능을 직접적으로 억제하는 전략은 정상 세포에도 심각한 손상을 입히는 부작용을 초래하므로 성공적인 항암제로 개발되지 못하고 있다. 따라서 암 유전자의 기능을 억제하는 전략 대신 암 억제 유전자의 저해된 기능을 활성화시키는 전략이 각광받고 있다.
암 억제 유전자(Tumor suppressor gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포 사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 지금까지 sPD-1, VHL, MMAC1, DCC, p53, NF1, WT1, Rb, BRCA1 및 BRCA2 등 의 암 억제 유전자가 밝혀졌으며, 그 중 p53 또는 Rb 유전자는 K-Ras 돌연변이 암에서 그 기능이 빈번히 억제되어 있음이 보고되면서, 이러한 억제 유전자의 복구를 통하여 K-Ras 돌연변이 암의 치료가 가능한지 여부가 항암제 개발 연구 분야에 있어 큰 관심의 대상이 되었다. 이에 대표적인 암 억제유전자인 p53 유전자의 기능 복구를 통하여 K-Ras 돌연변이 폐선암(lung adenocarcinoma)을 치료하고자 하는 시도가 있었으나, 초기 폐선암(lung adenoma)이 치료되지 않아 성공하지 못하였다(Feldser, D. M. et al., Nature, 468: 572-575, 2010, Junttila, M. R. et al., Nature, 468: 567-571, 2010). 또한, Rb 유전자 기능 복구를 통해서도 K-Ras 돌연변이 폐암을 치료하지 못함이 밝혀졌다(Walter, D.M. et al. Nature 2019). 상기와 같은 결과는 초기 암이 빠르게 악성 암으로 발전하기 때문에 단순히 암 억제 유전자의 기능을 복구한다고 해도 이미 발병한 암의 치료 효과는 나타나지 않는다는 것을 의미하며(Berns A., Nature, 468:519-520, 2010), 아직까지 암 억제 유전자의 활성화를 통하여 K-Ras 돌연변이 폐암의 치료에 성공한 예는 보고된 바 없다.
K-Ras 돌연변이 암에서 Runx3 유전자의 암 억제 유전자로서 기능이 저해되어 있음과(RUNX3 Protects against Oncogenic KRAS. (2013). Cancer Discovery, 4(1), 14-14), 특히 K-Ras 돌연변이에 의해 유발되는 폐선암에서 Runx3 유전자의 활성이 저해되어 있음이 보고된 바 있다(Lee, K.S., Lee, Y.S., Lee, J.M., Ito, K., Cinghu, S., Kim, J.H., Bae, S.C. Oncogene, 29(23): 3349-61, 2010).
세포 주기(cell cycle)이란 하나의 세포가 분열하여 두 개의 세포로 나누어지는 일련의 과정이 순차적으로 일어나는 것으로, 세포 주기가 순차적으로 조절되는지 여부는 비정상적으로 세포가 분열하여 발생하는 암의 발생에 중요한 역할을 한다. 세포의 증식은 유사분열(Mitosis)과 세포질분열(Cytokinesis) 과정을 통해 이루어진다. 유사분열은 핵 내에서 일어나는 복잡한 과정으로 새로운 세포가 본래의 세포와 똑같은 염색체의 수와 형태를 갖도록 하고, 세포질 분열은 유사분열이 완결되기 전에 시작되며 세포질을 이등분하여 두 개의 세포를 만든다.
세포 주기는 Mitosis(M phase)와 간기(Interphase)로 이루어져 있으며, 간기는 다시 DNA가 복제되는 S phase와 휴지기인 G1, G2 phase로 구성된다. 간기는 세포가 새로운 물질과 세포 내 소기관을 합성하고 성장하는 시기이며, G2 phase까지 초기 세포 함유물을 거의 두 배로 증가시킨다. 일반적으로 세포 주기의 시작은 G1 phase 후기에서 시작되는데, 이 시점을 포유동물 세포에서는 'Restriction point'라고 한다. 즉, 세포 주기가 시작점을 지나게 되면 다시는 뒤쪽으로 되돌아갈 수 없다. 세포 주기는 방향성을 가지며 순차적으로 진행되는 과정이기 때문에 만약 DNA 복제 과정에 문제가 발생하거나 복제된 상동염색체 분리에 이상이 발생할 경우 비정상적인 세포가 만들어질 수 있는데, 이런 비정상 세포들은 세포 사멸(cell death, apoptosis) 과정을 거쳐 제거되지만, 그렇지 않은 경우 비정상적으로 계속 분열을 하여 암을 일으키는 원인이 된다.
유사분열 자극(mitogenic stimulation)의 반응에 대해서, 세포는 후기 G1기로 진행할 것인지, G0기 돌아갈 것인지 아니면 세포 사멸을 일으킬 것인지에 관한 중요한 결정을 한다. 이 결정은 restriction-point(R-point)에서 이루어지며, 이와 관련된 의사결정 과정은 거의 모든 암세포에서 교란되어 있고, R-point 의사 결정 과정은 수백 개의 유전자 조절이 관련되어있다. 유전자들의 침묵이 유도되기 위해서는, 조절 영역 내에서 표적 위치들은 전사 인자에 의해 새롭게 결합되어야 하며, 발현을 개시한다. 다른 전사 인자에 독립적으로 응축된 염색질에 결합하는 능력을 가지고 있고 염색질 접근성을 조절할 수 있는 특별한 전사 인자를 파이오니어 인자(pioneer factor)라고 지칭한다.
염색질 접근성과 유전자 전사를 조절하기 위해서, 파이오니어 인자(pioneer factor)는 coactivators, corepressors, histone-modifying complexes, chromatin-remodeling complexes 그리고 basal transcription machinery를 포함한 여러 단백질들의 복잡한 네트워크를 필요로 한다. 예를 들어, Trithorax group(TrxG) 과 Polycomb group(PcG) 단백질들은 각각 전사를 활성화 시키거나 억제시키는데 필요한 히스톤 변형에 관여한다. TrxG 단백질은 히스톤 변형 인자(histone modifier) 와 뉴클레오좀 리모델링 인자(nucleosome remodelers)의 두 가지 범주로 크게 분류될 수 있다. 히스톤 변형 인자인 TrxG는 전사 활성을 유도하는데 필요한 히스톤3번의 라이신 잔기 4번에 메틸화를 일으키는 mixed-lineage leukemia family members (MLLs)을 포함한다. 한편으로는, TrxG 뉴클레오좀 리모델링 인자는 전사 인자 및 basal transcription machinery의 결합을 용이하게 하는 SWI-SNF 복합체를 포함한다. PcG 복합체는 Polycomb repressor complex 1 와 2(PRC1 와 PRC2)의 두 가지 범주로 분류된다. 이 두 복합체는 여러 단백질로 구성되어 있다. PRC1은 BMI1 과 ring finger protein 1(RING1) 또는 ring finger protein 2(RNF2)을 포함하고 있는 반면, PRC2는 불활성화 염색질의 특징인 히스톤3의 라이신 잔기 27번을 트리메틸화시키는 EED 와 enhancer of zeste homologs(EZH1 과 EZH2)를 포함하고 있다. 이러한 염색질 조절 인자들을 불러들임으로써, 세포들은 적시에 정확한 표적 좌위에 신호 의존적인 유전자 발현을 조절한다.
DNA에 결합하는 전사 인자인 RUNX3는 lineage determination에서 중추적인 역할을 한다(Ito, Y., Bae, S. C. & Chuang, L. S. The RUNX family: developmental regulators in cancer. Nat. Rev. Cancer 15, 81-95 (2015).). 생쥐의 폐에서 RUNX3의 결실은 폐 선종의 발생을 초래하고, K-Ras에 의해서 유도되는 선암(ADCs)으로의 진행을 가속화한다. 생쥐의 배아 섬유아세포에서, RUNX3의 결실은 R-point을 교란시켜 형질전환을 일으킨다(Chi, X. Z. et al. Runx3 plays a critical role in restriction-point and defense against cellular transformation. Oncogene 36, 6884-6894 (2017).).
이에, 본 발명자들은 RUNX3가 RAS 신호에 의존적인 방식으로 표적 좌위에 BRD2, MLL1, MLL5 및 SWI/SNF 단백질들을 순차적으로 불러들여 복합체를 형성하는데에 중요한 역할을 하는 R-point의 파이오니어 인자(pioneer factor)이며, 이것이 적절한 R-point 결정을 할 수 있게 한다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 Runx3 단백질, BRD2, MLL1, MLL5 및 SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable)를 포함하는 복합체의 형성을 확인하여 폐암 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Runx3 단백질, BRD2, MLL1, MLL5 및 SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable)를 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계를 포함하는 폐암의 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질, BRD2(Bromodomain-containing protein 2) 및 MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 복합체 단백질을 포함하는 폐암의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) Runx3 단백질이 하향 조절되어 있는 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질 및 BRD2(Bromodomain-containing protein 2)을 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 및
3) 상기 단계 1)의 세포에서 Runx3 단백질, BRD2, MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 단백질을 포함하는 복합체, Runx3 단백질, BRD2 및 MLL5(Mixed lineage leukemia protein-5) 단백질을 포함하는 복합체, 또는 Runx3 단백질, BRD2, MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 단백질 및 MLL5(Mixed lineage leukemia protein-5) 단백질을 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는 폐암의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 개체로부터 채취한 세포에서 Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질 및 BRD2(Bromodomain-containing protein 2)을 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 세포에서 Runx3 단백질, BRD2, MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 단백질을 포함하는 복합체, Runx3 단백질, BRD2 및 MLL5(Mixed lineage leukemia protein-5) 단백질을 포함하는 복합체, 또는 Runx3 단백질, BRD2, MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 단백질 및 MLL5(Mixed lineage leukemia protein-5) 단백질을 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는 폐암의 진단 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질, BRD2(Bromodomain-containing protein 2) 및 MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 복합체 단백질, 상기 복합체 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포를 유효성분으로 포함하는 폐암의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서는 혈청 자극 후 1 내지 2시간 후에 Runx3-BRD2 복합체가 형성되고, BRD2 내의 BD1은 아세틸화한 Runx3의 라이신 잔기 94번과 171번에 결합하고, BD2는 아세틸화한 히스톤4의 라이신 잔기 5번(H4K5-ac), 히스톤4의 라이신 잔기 12번(H4K12-ac) 및 히스톤3의 라이신 잔기 14번(H3K14-ac)과 결합하며, BRD2는 C-말단 부분을 통해서 MLL1, MLL5 및 SWI/SNF가 RUN3-BRD2 복합체의 BRD2와 결합하여 RUNX3-BRD2-MLL1/5-SWI/SNF 복합체를 형성하며, 상기 복합체는 R-point 결정에 기여한다는 것을 보여줌으로써, RUNX3가 R-point의 파이오니어 인자(pioneer factor)라는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선별된 피검물질은 Runx3 단백질과 병용투여 되어 K-Ras 돌연변이 폐선암의 치료제로 사용될 수 있고, 복합체의 형성을 확인하면 K-Ras 돌연변이 폐선암을 진단할 수 있으며, Runx3-BRD2-MLL1 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포를 투여하면 K-Ras 돌연변이 폐선암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 BRD2 구조 및 상호 작용 단백질의 개략도를 나타낸 것으로, BD1은 Lys-94 및 Lys-171에서 아세틸화 된 RUNX3과 상호 작용하고 BD2는 아세틸화 된 히스톤 H4K4-ac, H4K12-ac 및 H3K14-ac와 상호 작용하며, C-말단 영역은 TFIID 및 SWI/SNF 복합체와 상호 작용하는 것을 확인한 도이다.
도 1b 및 도 1c는 HEK293 세포를 24시간 동안 혈청 고갈시킨 후 10% 혈청으로 자극하여 유사분열 자극(mitogenic stimulation)을 유도하고, Runx3와 복합체를 형성하는 단백질의 수준을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 도이다.
도 1d는 HEK293 세포를 대조군 siRNA(si-con) 또는 BRD2-특이적 siRNA(si-BRD2)로 처리하여 BRD2를 녹다운 시킨 경우, 유사분열 자극(mitogenic stimulation)을 유도하여 단백질 간의 시간 의존적 상호 작용을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 도이다.
도 1e는 HEK293 세포를 Myc RUNX3, Flag-BRD2-WT, Flag-BRD2-ΔCt(C-말단 a-633-802가 없음), Flag-BRD2-ΔBD1(BD1이 없음) 또는 Flag-BRD2-ΔBD2(BD2가 없음)로 형질 감염시키고, 세포를 24시간 동안 혈청 고갈시킨 후 10% 혈청으로 자극하여, 단백질의 상호 작용을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 도이다.
도 1f는 CRISPR/Cas9 방법에 의해 ARF 인핸서 영역(ntd-1466)의 RUNX3 결합 부위(GACCGCA)를 HEK293 세포에서 제거하여 HEK293-ARF-RX-D 세포주를 수득하고, 야생형 HEK293 세포(HEK293-ARF-WT) 및 HEK293-ARF-RX-D 세포를 24시간 동안 혈청 고갈시키고, 세포를 10% 혈청으로 처리하고, 각 단백질의 ARF 프로모터에 대한 결합을 ChIP 분석에 의해 측정한 도이다.
도 1g는 R-point 조절 과정에서 RUNX3 표적 유전자 좌위에서의 순차적 분자 사건의 개략도를 나타낸 것으로, RUNX3은 H3K27-me3로 표시된 응축된 염색질에 결합하고, p300은 유전자 좌 아세틸화된 RUNX3 및 히스톤에 동원된 후, BRD2는 2개의 브로모도메인(BD1 및 BD2)을 통해 아세틸화 된 RUNX3 및 아세틸화 된 히스톤 둘 다에 결합하고, 혈청 자극 후 1시간에, SWI/SNF 및 TFIID는 BRD2의 C-말단 영역을 통해 유전자 좌위로 동원되어 Rpa-RX3-AC를 형성한 것을 나타낸 것이다.
도 2a는 미끼로서 Gal4-BRD2(aa 450-802)를 사용한 효모 2-하이브리드 스크리닝을 수행하여 RNF2 및 MLL5를 BRD2 결합 단백질로 확인한 도이다.
도 2b는 HEK293 세포를 24시간 동안 혈청 고갈시킨 후 10% 혈청으로 자극하여, 세포를 수확하고, RUNX3, BRD2, 사이클린 D1, MLL1, MLL5, RNF2, BMI1, EZH2, EED 및 HDAC4 사이의 시간-의존적 상호 작용을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 도이다.
도 2c는 혈청 자극 후 RUNX3-MLL1 및 RUNX3-MLL5의 물리적 결합을 근접 결찰 분석(PLA)을 통해 확인한 도이다.
도 2d는 초파리 눈의 발생에서 Lozenge(a Drosophila homolog of the RUNX family genes) 와 Trithorax(a Drosophila homolog of the MLL family genes)의 유전적 상호 작용을 관찰한 도이다.
도 2e는 ChIP 분석을 통해 자극 후 1 내지 4시간에 MLL1/5는 ARF의 좌위에 결합하였고, 이와 같은 시간대에 그 좌위에서 H3K4-me3이 많이 나타남을 확인한 도이다.
도 2f는 R-point transition의 개략도를 나타낸 것으로, 혈청 자극 후 1시간에, RUNX3는 p300, BRD2, H4K12-ac, SWI/SNF, TFIID 및 MLL1/5를 비롯한 다양한 단백질과 결합하여 Rpa-RX3-AC를 형성하고, 혈청 자극 후 2시간에서 4시간 사이에 Rpa-RX3-AC는 PRC1-CyclinD1-HDAC4와 상호 작용하여 일시적인 복합체 Rpa-RX3-TR과 상호 작용하며, 이어서 Rpa-RX3-TR을 파괴하여(4시간) Rpa-RX3-RE를 형성함(8시간)을 확인한 도이다.
도 3a는 RNF2-사이클린 D1, EZH2-사이클린 D1, HDAC4-사이클린 D1 및 RNF2 HDAC4 복합체의 시간 의존적 형성은 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, NF2-Cyclin D1의 결합이 혈청 자극 후 2시간에서 일어났고, 그 후 점차 그 결합이 약해지는 것을 확인한 도이다.
도 3b는 HEK293 세포를 HA-Cyclin D1, Myc-HDAC4 및 Flag-RNF2로 형질 감염시키고, 단백질 간의 상호 작용을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정 한 도이다.
도 3c 및 3d는 HA-Cyclin D1, Myc-RNF2 및 Myc-HDAC4를 시험관 내에서 번역하고 단백질 간의 상호 작용을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, 자극 후 2시간에서 PRC1이 Cyclin D1과 결합하고, 그 뒤에 PRC1-Cyclin D1-HDAC4 복합체로 만들어짐을 확인한 도이다.
도 3e는 pRB 및 CDK4/6과 상호 작용하는 것으로 알려진 사이클린 D1 영역을 확인한 도이다.
도 3f는 HEK293 세포를 대조군 또는 HDAC4-특이적 siRNA(si-con 또는 si-HDAC4)로 처리하고, 24시간 동안 혈청을 고갈시킨 후, 혈청으로 자극하여 BRD2-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, HDAC4의 녹다운은 RUNX3-BRD2의 분리를 억제함을 확인한 도이다.
도 3g는 HEK293 세포를 대조군, RNF2-특이적, 또는 Cyclin D1-특이적 siRNA (si-con, si-RNF2 또는 si-CycD1)로 처리하고, 24시간 동안 혈청을 고갈시킨 후, 혈청으로 자극하여 BRD2-RUNX3, Cyclin D1-RUNX3, HDAC4-RUNX3 및 RNF2-BRD2 복합체의 시간 의존적 형성을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, RNF2 또는 Cyclin D1의 녹다운은 RUNX3-Cyclin D1, RUNX3-HDAC4 그리고 RNF2-BRD2의 결합을 감소시켰고, 효과적으로 RUNX3-BRD2 결합의 분리가 억제됨을 확인한 도이다.
도 3h는 Rpa-RX3-TR 형성 과정의 개략도를 나타낸 것으로, PRC1-Cyclin D1-HDAC4 복합체가 Rpa-RX3-AC와 결합하고, Rpa-RX3-TR을 형성한 후, 이 복합체가 H4K12의 탈 아세틸화와 H2A의 유비퀴틴화에 의해 표적 좌위의 염색질 비활성화를 일으킨다는 것을 확인한 도이다.
도 4a는 HEK293 세포를 24시간 동안 혈청 고갈시키고, 10 % 혈청으로 자극하여, BRD2-RUNX3, E2F1-RUNX3, CDK4-RUNX3, Cyclin D1-RUNX3, HDAC4-RUNX3, p16INK4a-CDK4, p21-CDK4, Cyclin D1-CDK4 및 HDAC4-CDK4 복합체의 시간 의존적 형성을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)으로 측정하고, pRB(Ser-795에서) 및 ERK1/2의 시간-의존적 인산화를 면역 블롯팅(IB)으로 측정하여, E2F1이 RUNX3와 결합한 것을 확인한 도이다.
도 4b는 혈청 자극 후 2시간에 근접 결찰 분석(PLA)을 통해서 RUNX3와 CDK4사이의 물리적 결합을 확인한 도이다.
도 4c는 HEK293 세포를 대조군 또는 CDK4-특이적 siRNA(si-con 또는 si-CDK4)로 처리하고, 24시간 동안 혈청이 고갈된 후, 혈청으로 자극한 BRD2-RUNX3, CDK4-RUNX3, HDAC4-RUNX3 및 Cyclin D1-RUNX3 복합체 및 인산화된 RUNX3의 시간 의존적 형성은 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정되었다. ARF의 시간 의존적 발현은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, CDK4의 녹다운을 RUNX3와 Cyclin D1, HDAC4와의 결합을 현저하게 감소시킴을 확인한 도이다.
도 4d는 BRD2-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, ARF의 시간 의존적 발현은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, CDK4의 약리학적 활성 억제는 8시간까지 Rpa-RX3-AC와 ARF의 발현을 유지함을 확인한 도이다.
도 4e는 Ser-356에서 시간 의존적 RUNX3-CDK4 상호 작용 및 RUNX3 인산화를 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, RUNX3-CDK4의 결합을 보여줌과 동시에 내인성 RUNX3의 인산화를 확인한 도이다.
도 4f 및 도 4g는 BRD2-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성, Ser-356에서의 RUNX3 인산화 및 ARF 발현을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, 과발현시킨 Myc-RUNX3-S356A 와 BRD2사이의 결합과 ARF의 발현은 혈청 자극 후 8시간까지 유지되고, Myc-RUNX3-S356E은 RUNX3와 BRD2의 결합과 분리에 아무런 영향을 주지 못함을 확인한 도이다.
도 4h는 CDK4에 의존적인 RUNX3 Ser356의 인산화는 RUNX3로부터 BRD2를 방출하기 위해서 필요하지만 충분한 것은 아니라는 것을 나타내는 분자적 사건들의 순서도이다.
도 5a는 ERK1/2의 인산화뿐만 아니라 BRD2-RUNX3 및 p300-RUNX3의 시간 의존적 상호 작용을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, MEK1 억제제의 처리는 BRD2-RUNX3 와 p300-RUNX3 결합을 제거함을 확인한 도이다.
도 5b는 Ser-356에서 BRD2-RUNX3 및 CDK4-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성 및 RUNX3의 인산화 및 Ser-795에서 pRB를 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, Cyclin D1의 녹다운은 효과적으로 pRB의 인산화(S795)를 감소시켰지만, RUNX3의 인산화(S356)에는 영향을 주지 않음을 확인한 도이다.
도 5c는 JNK-CDK4 복합체의 시간-의존적 형성 및 Ser-356에서 RUNX3의 인산화 및 Thr-172에서 CDK4의 인산화를 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, JNK가 혈청 자극 후 2시간에서 CDK4의 T172에 인산화를 시킨다는 것을 확인한 도이다.
도 5d는 Ser-356에서 BRD2-RUNX3 및 RUNX3-CDK4 복합체의 시간 의존적 형성 및 RUNX3의 인산화를 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, ARF의 시간 의존적 발현은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, JNK 활성의 약리학적 억제는 RUNX3 ser-356의 인산화를 두드러지게 감소시켰고 Rpa-RX3-AC를 8시간까지 유지시킴을 확인한 도이다.
도 5e는 Ser-356에서 BRD2-RUNX3 및 CDK4-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성 및 RUNX3의 인산화를 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, ARF의 시간 의존적 발현은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, siRNA에 의한 JNK의 녹다운 또한 RUNX3 Ser356의 인산화를 감소시켰고 Rpa-RX3-AC를 유지시킴을 확인한 도이다.
도 5f는 Ser-356에서 BRD2-RUNX3 및 CDK4-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성 및 RUNX3의 인산화는 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, pRB의 시간-의존적 인산화 및 ARF의 발현을 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, 과발현 시킨 CDK4-WT은 혈청 자극 후 2-4시간에 Myc-RUNX3를 인산화 시켰으나, Flag-CDK4-T172A(JNK에 의해 인산화가 일어나지 않게 만든 돌연변이체)는 RUNX3 Ser356에 인산화를 시키는 못한 것을 확인한 도이다.
도 5g는 BRD2-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, ARF의 시간 의존적 발현은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, PI3K catalytic subunit(PIK3CA, encoding p110α)의 녹다운은 Cyclin D1의 수준을 감소시켰으며 Rpa-RX3-AC를 유지시켰고 ARF의 발현을 8시간까지 연장시킴을 확인한 도이다.
도 5h는 BRD2-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성은 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, ARF의 시간 의존적 발현은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, mTOR 신호 전달에 의해 인산화된 리보솜 단백질 S6 키나제 베타-1(S6K1)을 제어에 사용됨을 확인한 도이다.
도 6은 R-point transition을 조절하는데 있어서 RAS 경로의 역할을 나타낸 개략도로, RAS-RAF-MEK 경로는 Rpa-RX3-AC의 형성을 촉진하고 PRC1-Cyclin D1-HDAC4 복합체의 형성을 억제하며, RAS-RAC-JNK 경로는 Rpa-RX3-AC 내에서 CDK4를 활성화하고, RAS-PI3K 경로는 Cyclin D1의 번역에 기여함으로써 Rpa-RX3-TR의 형성을 촉진함을 나타낸 도이다.
도 7a는 Rpa-RX3-AC, Rpa-RX3-TR 및 Rpa-RX3-RE의 성분들 사이의 시간 의존적 상호 작용은 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, ARF, p53, p21 및 Myc-K-RasG12V의 발현 수준은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, 발암성 K-RAS (Myc-K-RASG12V)의 과발현은 RUNX3와 p300, BRD2, SWI/SNF, TFIID, 그리고 CDK4의 결합을 촉진했고, 그 복합체는 8시간까지 유지함을 확인한 도이다.
도 7b는 p14ARF 프로모터 및 히스톤 마크에 대한 Rpa-RX3-AC, Rpa-RX3-TR 및 Rpa-RX3-RE의 성분의 결합(H4K12-ac, H3K27-me3, H3K4-me3 및 H2A-K119-Ubi)이 표시된 지점에서 ChIP에 의해 유전자 좌위에서 측정한 것으로, 발암성 K-RAS의 발현이 ARF 좌위에 Rpa-RX3-AC의 결합을 유지시켰지만, Cyclin D1, HDAC4 와 PRC1의 결합은 억제함을 확인한 도이다.
도 7c는 Rpa-RX3-AC의 연장된 결합 및 발암성 K-RAS의 발현에 의한 ARF 유전자 좌위에서 H4K12-ac 및 H3K4-me3 히스톤 마커의 유지는 유전자에서 RUNX 결합 부위의 제거로써 폐지됨을 확인한 도이다.
도 7d는 RUNX3-p300 및 BRD2-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성은 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, ARF 및 p53의 시간-의존적 발현을 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, 발암성 K-RAS에 더하여, 발암성 B-RAF(BRAFV600E)도 Rpa-RX3-AC를 유지시켰고, ARF의 발현도 연장시켰으며, 장기간 동안 p53을 안정화시킴을 확인한 도이다.
도 7e는 CyclinD1-HDAC4 및 CyclinD1-RNF2의 시간 의존적 상호 작용은 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, 과발현된 MEK1-CA는 CyclinD1-RNF2 결합을 유지했지만 CyclinD1-HDAC4 결합은 억제하였는데, 이는 MEK1-CA가 PRC1/CyclinD1/HDAC4 복합체 형성을 억제함으로써 R-point의 전환이 억제되었음을 확인한 도이다.
도 7f는 정상적인 RAS 및 발암성 RAS에 의한 R-point의 서로 다른 조절에 대한 개요를 나타낸 도이다.
도 8은 정상적인 유사 분열 신호에 대한 R-point transition 및 R-point 관련 염색질 dynamics의 개요를 나타낸 도이다.
도 9a는 ERT2 융합 단백질은 4-하이드록시타목시펜(4OHT) 처리 후 8시간에 핵에 위치함을 확인한 도이다.
도 9b는 세포주들이 발암성 KRAS를 발현했음에도 불구하고, 유도자가 없는 경우 혈청 자극 후 어느 시점에서도 Rpa-RX3-AC를 형성한 세포주는 없고, 유도자 처리 후 8시간에서 H460-ERT2-RUNX3-K94/171R 세포주가 아닌 H460-ERT2-RUNX3 세포에서만 Rpa-RX3 AC을 형성하고, 유도자가 처리된 H460-ERT2-RUNX3 세포에서 Rpa-RX3-AC는 유지되고 ARF-p53 경로가 활성화되었음을 확인한 도이다.
도 9c는 유도자가 처리된 H460-ERT2-RUNX3 세포에서 Rpa-RX3-AC가 그것의 표적 좌위에 장기간 결합된다는 것을 확인한 도이다.
도 9d는 유도자 처리 후 여러 시간대에서 유세포 분석을 수행하여 유도자 처리한 H460-ERT2-RUNX3 세포의 세포사멸율이 유도자 처리 후 16 시간에 증가하기 시작해 그 이후 더욱 증가하고, H460-vec 세포와 H460-ERT2RUNX3-K94/171R 세포는 세포사멸이 일어나지 않음을 확인한 도이다.
도 10a는 pCS4-3Myc-RUNX3로, Runx3 단백질을 발현하는 플라스미드의 모식도를 나타낸 도이다.
도 10b는 pCS4-3Flag-BRD2로, BRD2를 발현하는 플라스미드의 모식도를 나타낸 도이다.
도 10c는 pCS4-3HA-MLL1로, MLL1을 발현하는 플라스미드의 모식도를 나타낸 도이다.
도 10d는 pCS4-3HA-Runx3-BRD2로, Runx3와 BRD2 사이에 정지코돈인 TAG, TAA, TGA를 포함하지 않는 뉴클레오티드 1개 이상 300개 이하로 이루어진 뉴클레오티드 공간자(spacer)를 포함하는 Runx3 단백질 및 BRD2를 동시에 발현하는 플라스미드의 모식도를 나타낸 도이다.
도 10e는 pCS4-3HA-Runx3-BRD2-MLL1로, Runx3와 BRD2 사이 및 BRD2와 MLL1 t사이에 정지코돈인 TAG, TAA, TGA를 포함하지 않는 뉴클레오티드 1개 이상 300개 이하로 이루어진 뉴클레오티드 공간자(spacer)를 포함하는 Runx3 단백질, BRD2 및 MLL1을 동시에 발현하는 플라스미드의 모식도를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) Runx3 단백질이 하향 조절되어 있는 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질 및 BRD2(Bromodomain-containing protein 2)을 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 및
3) 상기 단계 1)의 세포에서 Runx3 단백질, BRD2, MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 단백질을 포함하는 복합체, Runx3 단백질, BRD2 및 MLL5(Mixed lineage leukemia protein-5) 단백질을 포함하는 복합체, 또는 Runx3 단백질, BRD2, MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 단백질 및 MLL5(Mixed lineage leukemia protein-5) 단백질을 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는 폐암의 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 피검물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물, 세포 추출액, 식물 추출액 또는 동물 조직 추출액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 스크리닝 방법은
4) 상기 단계 1)의 세포에서 Runx3 단백질, BRD2, MLL1, MLL5 및 SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable)를 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 복합체에서 Runx과 BRD2의 결합 및 BRD2 C-말단과 MLL1, MLL5 및 SWI/SNF의 결합이 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 2), 단계 3) 및 단계 4)의 복합체 형성 및 단계 5)의 결합은 웨스턴 블랏팅(Western blotting), 면역침강법(immunoprecipitation assay), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA) 및 면역조직화학법으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법으로 측정할 수 있다.
Runx3(Runt-related transcription factor 3) 유전자는 Runx1, Runx2 및 Runx3로 구성된 Runt 패밀리 유전자 중 하나이다. Runt 패밀리 유전자들은 정상적인 발달 및 종양화 과정에서 중요한 역할을 담당하는데, TGF-β와 그 신호전달을 중재하는 하위인자인 Smad 패밀리의 전사 조절 인자로 기능한다. Runx1은 포유류의 조혈작용에, Runx2는 골 형성에 주요한 역할을 하며 Runx3은 주로 과립성 위 점막세포에서 발현되고, 위 상피의 세포분화를 저해하는 역할을 한다. 이들 세 유전자는 염색체 1p, 6p 와 21q의 유전자 좌위에 위치하고 있는데, 이중 Runx3 유전자는 1p36. 11-1p36. 13에 위치한다. Runx3 유전자 자리는 다양한 암에서 손실되거나 반접합체 결손 등의 영향을 받는 위치 중 하나이다. 또한, Runx3는 다양한 종류의 암에서 불활성화되어있는 것으로 밝혀져, 항암제 개발의 새로운 타겟으로 각광받고 있다. 이처럼 Runx3는 암의 형성을 억제하는 암 억제 유전자로 작용할 뿐 아니라, 암 전이를 억제한다고도 알려져 있다. Runx3는 세포의 분열과 사멸의 운명을 결정하는 Restriction-point에서 중요한 역할을 하여 상황에 따라 세포분열을 유도하기도 하고 세포사멸을 유도하기도 한다 (Lee et al., Nat Commun. 2019 ;10(1): RUNX3 regulates cell cycle-dependent chromatin dynamics by functioning as a pioneer factor of the restriction-point). 폐 상피 세포에서 K-Ras 암 유전자 돌연변이가 발생하였을 때 Runx3는 Restriction-point에서 세포사멸 운명을 결정하는데 기여함으로써 암세포를 사멸시킨다 (Lee et al., Nat Commun. 2019 ;10(1)).
Runx3 단백질은 상기 Runx3 유전자에 의해 발현되는 Runt 패밀리에 관련된 전사 인자 3(Runt-related transcription factor 3)을 의미한다.
상기 단계 1)의 세포는 폐암 세포일 수 있고, 일례로 H460 세포주, A549 세포주, Calu-6 세포주일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
BET(Bromodomain and exterminal domain) 단백질은 epigenetic reader로서 히스톤의 아세틸화된 라이신 잔기에 결합한다. 이를 통해 브로모도메인-함유 단백질들은 직접적으로 크로마틴의 특정 부위에서 nuclear-macromolecular complex를 이루고 DNA 복제, DNA damage repair, chromatin remodeling, 전사 조절과 같은 생물학적인 과정을 조절하게 된다. BET family 단백질들은 BRD2, BRD3, BRD4 그리고 Brdt가 있으며, 전사조절에서의 역할이 잘 알려져 있다[P. Filippakopoulos, S. Knapp, Drug discovery, 13 (2014) 337-356].
그 중 BRD2(Bromodomain-containing protein 2)는 핵 안에 존재하는 신호전달 매개체 역할을 하는 인자로 포유류 세포에 광범위하게 발현하며, 세포 주기 조절, 전사 조절에 중요한 역할을 한다.
상기 BRD2는 아세틸화된 Runx3에 결합한다.
MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1)는 MLL 패밀리 멤버 단백질 중 하나로, Histone-lysine N-methyltransferase 2A 라고도 하며, 유전자 전사의 양성 글로벌 조절 인자로 간주되는 히스톤 메틸 트랜스퍼라제이다. 이 단백질은 전사 활성화 도메인 9aaTAD를 포함하는 히스톤-변형 효소 그룹에 속하며 전사 메모리의 후성 유전적 유지에 관여한다.
MLL5(Mixed lineage leukemia protein-5)는 MLL 패밀리 멤버 단백질 중 하나로, 리신 메틸 트랜스퍼라제 2E라고도 하며, 염색질의 활성화에 기여하는 TrxG 히스톤 변형자(TrxG histone modifier)로 기능한다.
상기 MLL1 및 MLL5는 BRD2 C-말단 부위의 아미노산 450 내지 802부분과 물리적으로 결합한다.
BRD2와 MLL1 및 MLL5 사이의 결합은 유사분열 자극(mitogenic stimulation) 후 1 내지 2시간 후에 형성된다.
SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable)는 진핵 생물에서 발견되는 ATP- 의존성 크로마틴 리모델링 콤플렉스의 아종으로, DNA가 포장되는 방식을 리모델링하는 단백질 그룹이다. 이 복합체는 SWI 및 SNF 유전자와 다른 폴리펩티드의 산물 인 여러 단백질로 구성되어 있다.
SWI/SNF는 BRD2의 C-말단 부분을 통하여 BRD2와 결합한다.
상기 단계 2), 단계 3) 및 단계 4)의 복합체는 유사 분열 자극(mitogenic stimulation)을 받은 경우 형성된다.
상기 단계 2), 단계 3) 및 단계 4)의 복합체는 Restriction point(R-point) 결정에 기여한다.
Restriction point(R-point)는 세포가 생명을 지속하거나 사멸하도록 스스로 결정하는 절차로, 세포분열 과정의 한 단계이다. 정상 세포는 삶의 결정을 스스로 내려 분열하지만 암세포와 같은 비정상 세포는 이 R-point에서 스스로 사멸을 결정하여 인체 내에서 스스로 돌연변이 세포를 제거하고 정상 세포를 유지해 나간다.
상기 BRD2의 브로모도메인 1(bromodomain 1, BD1)은 Runx3의 라이신(lysine) 잔기 94번과 171번에 결합을 한다.
상기 BRD2의 브로모도메인 2(bromodomain 2, BD2)는 Runx3의 아세틸화한 히스톤4의 라이신 잔기 5번, 히스톤4의 라이신 잔기 12번 및 히스톤3의 라이신 잔기 14번과 결합을 한다.
상기 스크리닝 방법에 의해 선별된 폐암의 치료제는 Runx3 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포와 병용 투여될 수 있다.
상기 Runx3 단백질은 당업계의 통상적인 화학적 합성 방법(W. H. Freeman and Co., Proteins; structures and molecular principles, 1983)으로 합성될 수 있으며, 통상적인 유전공학적 방법(Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 등)에 의해 제조될 수 있다.
상기 Runx3 단백질은 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 단백질은 본 발명의 단백질과 80％ 이상, 구체적으로 90％ 이상, 더욱 구체적으로 95％ 이상으로 상동성을 가질 수 있다.
상기 Runx3 단백질은 서열번호 17의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 또는 동물 유래일 수 있다.
상기 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18의 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA일 수 있다.
상기 벡터는 치료대상이 되는 개체에 본 발명의 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키기 위한 운반 매개체를 의미하며, 치료대상이 되는 개체에서 발현되기 적합한 프로모터, 인핸서, 상기 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 전사종결 부위 등을 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 특정 기관 및 조직 특이적 프로모터가 사용될 수 있으며 해당 기관 및 조직에서 증식할 수 있도록 복제기점을 포함할 수 있다.
상기 벡터에 의해 형질전환되는 바이러스는 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus), 헤스페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 및 렌티바이러스(Lentivirus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus)는 목적 외래유전자가 삽입되어 상기 외래 유전자를 발현할 수 있는 아데노-부속 바이러스를 지칭하며, 재조합 아데노 부속 바이러스 벡터로도 지칭된다.
상기 재조합 아데노-부속 바이러스(recombinant adeno-associated virus, rAAV)는 좁은 의미에서는 재조합 아데노-부속 바이러스에 의하여 감염된 세포에서 외래유전자가 발현될 수 있도록 제조된 외래유전자가 포함된 발현벡터를 의미하나, 넓은 의미에서는 하기의 AAV rep-cap 유전자의 발현 벡터 및 헬퍼 플라스미드 또는 헬퍼 바이러스를 포함하여, 세포에 형질도입되어 재조합 아데노 부속 바이러스를 형성시키는데 필요한 일체의 벡터를 의미한다.
AAV rep-cap 유전자의 발현벡터는 상기 재조합 아데노 부속 바이러스 발현벡터로부터 유래한 게놈의 복제에 필요한 효소(rep) 및 아데노 바이러스 입자의 형성을 위한 외피 단백질(cap)을 각각 코딩하는 유전자의 발현벡터를 의미하며, 상기 재조합 아데노-부속 바이러스 발현벡터와 동시 형질 도입됨으로써 재조합 아데노-부속 바이러스의 세포내 생성이 가능하다. 헬퍼 바이러스는 독자적으로 복제가 불가능한 아데노-부속 바이러스의 감염성 입자를 형성시킬 수 있도록 도와주는 바이러스를 의미하며, 아데노 바이러스, 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 등이 여기에 속하며, 헬퍼 플라스미드(helper plasmid)는 상기 헬퍼 바이러스의 기능을 대행하는 플라스미드를 의미한다. 한편, 상기 AAV rep-cap 유전자 발현벡터 및 헬퍼 플라스미드는 하나의 벡터로 구현될 수 있는데, 대표적인 예로는 pDG(DKFZ, Germany)가 있다. 상기 AAV rep-cap 유전자 발현벡터 및 헬퍼 바이러스 또는 헬퍼 플라스미드는 모두 독자적으로 감염성 아데노-부속 바이러스 입자를 형성시킬 수 없는 rAAV 발현벡터를 도와 감염성 rAAV 입자를 형성시킬 수 있기 때문에, 본 문서에서는 편의상, AAV rep-cap 유전자 및 아데노 부속 바이러스 감염성 입자 형성에 필요한 상기 아데노 바이러스 기원 유전자를 동시에 포함하는 플라스미드(예를 들어, pDG)를 헬퍼 플라스미드로 지칭하며, 상기 헬퍼 플라스미드와 헬퍼바이러스를 포괄하여 헬퍼벡터(helper vector)라고 지칭한다.
상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 경우 0.05 내지 500 mg을 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 내지 300 mg을 함유하는 것이 더욱 바람직하며, Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 103 내지 1012 IU(10 내지 1010 PFU)를 함유하는 것이 바람직하고, 105 내지 1010 IU을 함유하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 재조합 바이러스는 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스인 것이 바람직한데, 치료를 위한 상기 바이러스의 수는 벡터 게놈을 포함한 바이러스 입자 내지는 감염 가능한 바이러스 수로 나타낼 수 있다. 즉, 바이러스 입자의 1% 내외가 실제로 감염 가능한 바이러스의 유효 개수이므로, 이를 나타내기 위하여 IU(infection unit) 또는 PFU(plaque forming unit)를 사용한다.
상기 벡터에 의해 형질전환되는 세포는 박테리아일 수 있다.
상기 박테리아는 비병원성 또는 비독성일 수 있고, 리스테리아(Listeria) 속, 쉬겔라(Shigella)속, 살모넬라속 또는 대장균(E.coli) 등 일 수 있으며, 상기 벡터를 상기 박테리아에 도입시킴으로써 상기 벡터 내에 포함되어 있는 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산하게 할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).
상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 세포의 경우, 103 내지 108개를 함유하는 것이 바람직하고, 104 내지 107개를 함유하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 폐암은 폐선암 또는 K-Ras 돌연변이 폐선암일 수 있다.
상기 K-Ras 돌연변이 폐암은 K-Ras 돌연변이 유전자는 활성화되고, 암 억제 유전자는 비활성화 되어 있는 폐암이다.
상기 암 억제 유전자는 sPD-1, VHL, MMAC1, DCC, p53, NF1, WT1, Rb, BRCA1, BRCA2 및 Runx3 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 암 억제 유전자는 Runx3 유전자일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 폐선암은 K-Ras 단백질의 12번째 아미노산이 글리신(glycine, G)에서 아스파르트산(aspartate, D), 시스테인(cysteine, C) 또는 발린(valine, V)으로 치환된 돌연변이에 의해 유도된 폐선암일 수 있다.
상기 폐선암은 K-Ras 단백질의 13번째 아미노산이 글리신(glycine, G)에서 시스테인(cysteine, C) 또는 아스파르트산(aspartate, D)으로 치환된 돌연변이에 의해 유도된 폐선암일 수 있다.
상기 폐선암은 K-Ras 단백질의 18번째 아미노산이 알라닌(alanine, A)에서 아스파르트산(aspartate, D)으로 치환된 돌연변이에 의해 유도된 폐선암일 수 있다.
상기 폐선암은 K-Ras 단백질의 61번째 아미노산이 글루타민(glutamine, Q)에서 히스티딘(histidine, H)으로 치환된 돌연변이에 의해 유도된 폐선암일 수 있다.
상기 폐선암은 K-Ras 단백질의 117번째 아미노산이 라이신(lysine, K)에서 아스파라긴(asparagine, N)으로 치환된 돌연변이에 의해 유도된 폐선암일 수 있다.
상기 단계 3)의 BRD2 C-말단은 BRD2 단백질의 450번째 아미노산부터 802번째 아미노산까지일 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 개체로부터 채취한 세포에서 Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질 및 BRD2(Bromodomain-containing protein 2)을 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 세포에서 Runx3 단백질, BRD2, MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 단백질을 포함하는 복합체, Runx3 단백질, BRD2 및 MLL5(Mixed lineage leukemia protein-5) 단백질을 포함하는 복합체, 또는 Runx3 단백질, BRD2, MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 단백질 및 MLL5(Mixed lineage leukemia protein-5) 단백질을 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는 폐암의 진단 방법을 제공한다.
또한, 상기 진단 방법은
3) 상기 단계 1)의 세포에서 Runx3 단백질, BRD2, MLL1, MLL5 및 SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable)를 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
상기 단계 1), 단계 2) 및 단계 3)의 복합체의 형성은 웨스턴 블롯(western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 이중 루시퍼라제 측정법(dual luciferase reporter assay), 효소면역분석법(ELISA) 및 면역조직화학법(immunohistochemistry)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 측정하는 것일 수 있다.
상기 단계 1)의 BRD2는 아세틸화된 Runx3에 결합할 수 있다.
상기 단계 1), 단계 2) 및 단계 3)의 복합체는 유사 분열 자극(mitogenic stimulation)을 받은 경우 형성될 수 있다.
상기 단계 3)의 복합체는 Restriction point(R-point) 결정에 기여할 수 있다.
상기 단계 1), 단계 2) 또는 단계 3)의 복합체가 형성되지 않는 경우 폐암으로 진단할 수 있다.
상기 폐암은 K-Ras 돌연변이 폐선암일 수 있다.
또한, 본 발명은 Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질, BRD2(Bromodomain-containing protein 2) 및 MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 복합체 단백질, 상기 복합체 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포를 유효성분으로 포함하는 폐암의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 폐암은 폐선암 또는 K-Ras 돌연변이 폐선암일 수 있다.
상기 Runx3 단백질은 서열번호 17의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18의 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 BRD2은 서열번호 19의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 BRD2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 20의 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 MLL1는 서열번호 21의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 MLL1를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 22의 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA일 수 있다.
상기 바이러스는 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 아데노 부속 바이러스(Adeno-associated virus), 헤스페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 및 렌티바이러스(Lentivirus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 세포는 박테리아일 수 있고, 상기 박테리아는 리스테리아(Listeria) 속, 쉬겔라(Shigella)속, 살모넬라속 또는 대장균(E.coli)일 수 있다.
상기 K-Ras 돌연변이 폐선암은 K-Ras 돌연변이 유전자는 활성화되고, Runx3 유전자는 비활성화되어 있는 폐선암일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 혈청 자극 후 1 내지 2시간 후에 Runx3-BRD2 복합체가 형성되고, BRD2 내의 BD1은 아세틸화한 Runx3의 라이신 잔기 94번과 171번에 결합하고, BD2는 아세틸화한 히스톤4의 라이신 잔기 5번(H4K5-ac), 히스톤4의 라이신 잔기 12번(H4K12-ac) 및 히스톤3의 라이신 잔기 14번(H3K14-ac)과 결합하며, BRD2는 C-말단 부분을 통해서 MLL1, MLL5 및 SWI/SNF가 RUN3-BRD2 복합체의 BRD2와 결합하여 RUNX3-BRD2-MLL1/5-SWI/SNF 복합체를 형성하며, 상기 복합체는 R-point 결정에 기여한다는 것을 보여줌으로써, RUNX3가 R-point의 파이오니어 인자(pioneer factor)라는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선별된 피검물질은 Runx3 단백질과 병용투여 되어 K-Ras 돌연변이 폐선암의 치료제로 사용될 수 있고, 복합체의 형성을 확인하면 K-Ras 돌연변이 폐선암을 진단할 수 있으며, Runx3-BRD2-MLL1 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포를 투여하면 K-Ras 돌연변이 폐선암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
1. 세포주 준비
HEK293 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)를 10% 소 태아 혈청(Gibco BRL) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 보충된 DMEM 배지(Gibco BRL, Thermo Fisher Scientific, MA, USA, MA)에서 유지시켰다.
WI-38 세포(Lonza, Basel, Switzerland)는 10% 소 태아 혈청(Gibco BRL), 1% MEM 비 필수 아미노산(Gibco BRL) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 보충된 DMEM 배지(Gibco BRL, Thermo Fisher Scientific, MA, USA, MA, USA)에서 유지되었다.
H460 세포(ATCC, Manassas, VA, USA) 및 H460 안정 세포주는 10% 소 태아 혈청(Gibco BRL) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco BRL)에서 유지되었다. 모든 세포주는 5% CO2와 함께 37℃에서 배양되었다.
2. 초파리 유전학( Drosophila genetics)
GMR-Gal4는 Bloomington Drosophila Stock Center(Bloomington, IN, USA)로부터 입수하였다. UAS-Lz는 U. Banerjee(University of California, Los Angeles, CA, USA)로부터 제공 받았다. Trithorax(G14137)의 업스트림 규제 영역 내에 인핸서 P 요소 삽입을 보유한 EP 라인은 GeneExel(KIST, 대전, 한국)에서 입수하였다. 초파리 스톡은 25℃에서 표준 옥수수 가루-효모-한천 배지에서 유지 및 배양되었다.
3. DNA 형질감염, 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅 ( IB )
리포펙타민 플러스 시약 및 리포펙타민(Invitrogen)을 사용하여 모든 세포주에서 일시적인 형질 감염을 수행하였다. 세포 용해물을 적절한 단클론 또는 다클론 항체(2㎍ 항체/500㎍ 용해물 샘플)와 함께 4℃에서 3시간 동안 배양한 다음 단백질 G-Sepharose beads(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)와 함께 배양하였다. 4℃에서 1시간 내인성 단백질의 검출을 위해, 용해물을 적절한 단클론 또는 다클론 항체(희석 범위 1:1000 내지 1:3000)와 4℃에서 6 내지 12시간 동안 배양한 다음 단백질 G-Sepharose beads(Amersham Pharmacia Biotech)를 4℃에서 3 시간 동안 가열하였다. 면역 침전물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔에서 분해하고 PVDF 막(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮겼다. 막을 차단한 후 적절한 항체로 면역 블롯팅하고, ECL 용액(Amersham Pharmacia Biotech)으로 처리한 후 Amersham ™ Imager 600 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)에서 시각화 하였다.
4. 항체
Cyclin D1(Cat # sc-20044), CDK4(Cat # sc-260), HDAC4(Cat # sc-11418), pc-Jun(Cat # SC-822), p-ATF(Cat # SC-8398), p110(Cat # SC-7174), p300(Cat # sc-584), p53(Cat # sc-126), p21(Cat # sc-397), p14(Cat # sc-8340, Cat # sc-53640), ERK1(Cat # SC-94), ERK1/2(Cat # SC-135900) ), E2F1(Cat # sc-137059), TAF1(Cat # sc-735), TAF7(Cat # sc-292282), TBP(Cat # sc-421), BRG-1(Cat # sc-17796, Cat # sc-10768) 및 BAF155(Cat # sc-10756)는 Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA)로부터 입수하였고, 모든 항체를 1:1000으로 희석시켰다.
H2AK119-ub(Cat # 8240 S), H3K412-ac(Cat # 2591 S), H3K27-me3(Cat # 9733 S), H3K4-me3(Cat # 9751 S), RNF2(Cat # 5694 S), BMI1(Cat # 6964 S), EZH2(Cat # 5246 S), phospho-pRB(Ser-795)(Cat # 9301 S), phospho-ERK1/2(Cat # 9101S), JNK(Cat # 92525), S6K(Cat # 2708 S), p-S6K(Cat # 9234 S), p38 MAPK(Cat # 9212 S) 및 아세틸화 된 Lys(Cat # 9441L)를 표적화하는 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)로부터 얻었고, 모든 항체는 1:1000으로 희석되었다.
RUNX3(5G4)(Cat # ab40278), p16(Cat # ab108349) 및 EED(Cat # ab4469)를 표적으로 하는 항체는 Abcam(Cambridge, UK)에서 얻었고, 모든 항체는 1:3000으로 희석되었다.
HA(12CA5; 희석 1:1000; Cat # 11 666606001, 독일 만하임 Roche Applied Science), FLAG(M2; 희석 1:3000; Cat # F1804, Sigma, MO, USA), Myc(9E10 희석 1:1000; Cat # sc-40, 산타 크루즈 바이오 테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), BRD2(M01; 희석 1:1000; Cat # H00006046-M01, 대만 타이베이시, Abnova), pRB(희석 1:1000; Cat # 554136, BD Biosciences, CA, USA), p-CDK4(희석 1:1000; Cat # PA5-64482, Invitrogen, CA, USA), MLL5(희석 1:1000; Cat # STJ27895, St. John 's Laboratory, London, UK) 및 MLL1(희석 1:1000; Cat # A300-374A, Bethyl Laboratories Inc., TX, USA)을 면역 블롯팅 및 면역 침전에 사용하였다. 항 Runx3-phospho-S356(희석 1:1000)을 Ser-356에서 인산화된 합성 Runx3 펩티드에 대해 토끼 다클론 항혈청으로 만들었다.
5. 시험관 내 번역
TnT® 커플링 된 망상 적혈구 용해 시스템(Promega, Madison, WI, USA)은 T7 또는 SP6 RNA 폴리머라제 프로모터의 다운 스트림에 클로닝된 유전자의 전사 및 번역을 위해 2가지 구성으로 이용 가능하다. 이들 시스템을 사용하기 위해, SP6 프로모터를 함유하는 2.0㎍의 원형 플라스미드 DNA를 TnT® 용해물 및 TnT® Quick Master Mix에 직접 첨가한 다음, 30℃에서 1.5 시간 동안 50㎕ 반응 부피에서 배양하였다. 합성된 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였다.
6. 근접 결찰 분석( PLA )
PLA는 Duolink® In Situ PLA® 키트(미국 미주리 주 세인트 루이스 소재의 시그마)를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 세포를 성장 및 고정시키고 투과화 시켰다. 이어서, 샘플을 검사할 2개의 단백질에 대한 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하고, 세척하였다[버퍼 A : 0.01M Tris-HCl (pH 7.4), 0.15M NaCl 및 0.05 % 트윈 20], 37℃에서 특정 프로브를 사용하여 60분 동안 배양하고, F-액틴으로 염색하여 세포질을 가시화하고, 버퍼 B[0.2M Tris-HCl (pH 7.5) 및 0.1M NaCl]로 세척하였다. 신호는 형광 현미경(Carl Zeiss AXIO Zoom.V16 및 ApoTome.2)에서 별개의 형광점으로 시각화되었다. Zen 2012 Blue Edition 소프트웨어(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)를 사용하여 백그라운드 보정, 원시 이미지의 대비 조정 및 형광 신호의 정량화를 수행했다.
7. 억제제 및 siRNA
CDK4 억제제(PD0332991), JNK 억제제(JNK-IN-8), MEK1 억제제(U0126), p38 MAPK 억제제(SB203580) 및 라파마이신(R8781)은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 세포를 CDK4 억제제(500nM), JNK 억제제(1μM), MEK1 억제제(1μM), p38 MAPK 억제제(1μM) 또는 라파마이신(100nM)으로 처리하고, 혈청 자극 후 지정된 시점에 수확하였다. 혈청 고갈(serum starvation) 전에 RNAiMAX(Invitrogen, CA, USA)를 사용하여 50 nM siRNA로 HEK293 세포를 형질 감염시켜 녹다운 분석을 수행하였다. 혈청 자극 후 지시된 시점에 세포를 수확하였다. BRD2, p53, CDK4, RNF2 및 Cyclin D1 siRNA는 Bioneer(대전, 한국)에서 구입하였다. HDAC4 siRNA는 Cell Signaling Technology에서 구입했다. siRNA의 서열은 하기 표 1과 같다.
명칭 서열(5'->3') 서열번호
si-BRD2 센스 CACUUGGCCUGCAUGACUA 서열번호 1
si-BRD2 안티센스 UAGUCAUGCAGGCCAAGUG 서열번호 2
si-p53 센스 CAGUUUGAGGUGCGUGUU 서열번호 3
si-p53 안티센스 AACACGCACCUCAAAGCUG 서열번호 4
si-CDK4 센스 CCAGAAUCUACAGCUACCA 서열번호 5
si-CDK4 안티센스 UGGUAGCUGUAGAUUCCUGG 서열번호 6
si-Cyclin D1 센스 GACCUUCGUUGCCCUCUGU 서열번호 7
si-Cyclin D1 안티센스 ACAGAGGGCAACGAAGGUC 서열번호 8
si-RNF2 센스 UGAUAGGGUAUUGAGUGUA 서열번호 9
si-RNF2 안티센스 UACACUCAAUACCCUAUCA 서열번호 10
8. ARF 인핸서 영역에서 Runx3 결합 위치의 결실
CRISPR/Cas9 방법에 의해 CDKN2A (p14ARF) 인핸서 영역(ntd-1466)에서 Runx- 결합 부위(GACCGCA)를 결실시키기 위해, HEK293 세포를 pRGEN-CDKN2A 표적 플라스미드(표적 서열: 5'-GACGGATCCAGGCAGACCGCAGG) 및 pRGEN-Cas9-Hyg-CMV(ToolGen, Seoul, South Korea)로 형질 감염시켰다.
세포를 800㎍/㎖ 하이그로마이신 B(H3274; 시그마)를 함유하는 표준 배양 배지(10% DMEM 배지)에서 유지시켰다. 그 후 하이그로마이신 B-내성 세포를 선택하였다. ARF 프로모터 영역에서 Runx3-결합 부위의 결실은 뉴클레오타이드 시퀀싱에 의해 확인되었다.
9. 크로마틴 면역 침전(Chromatin immunopricipitation , ChIP ) 분석
크로마틴 면역 침전 분석 키트를 사용하여 크로마틴 면역 침전 분석을 수행 하였다 (cat # 17-295; Millipore). HEK293 세포 또는 H460-유도된 안정한 세포주를 24시간 동안 혈청을 고갈시키고, 10% 혈청 또는 10% 혈청/1μM 4-OHT(Sigma)로 처리하고, 표시된 시점에서 수확하고, 포름알데히드(1% [v/v,] 10분, 37℃). 크로마틴을 항체로 면역 침전시켰다. p14 프로모터 영역을 하기 표 2의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다.
명칭 서열(5'->3') 서열번호
p14ARF-정방향 AGTGGCTACGTAAGAGTGATCGC 서열번호 11
p14ARF-역방향 CTTACAGATCAGACGTCAAGCCC 서열번호 12
10. 염색체 입체 형태 포착 분석(Chromosome conformation capture assay)
간단히 말하면, 1.0×107개의 세포를 10% 소 태아 혈청을 함유하는 10㎖의 포스페이트-완충 식염수(PBS) 중 2% 포름알데히드를 사용하여 가교시키고, 실온에서 10분 동안 배양하였다. 반응 튜브를 1.425㎖의 1M 글리신으로 켄칭하였다.
고정된 세포를 차가운 PBS로 2회 세척한 후 1㎖의 차가운 PBS를 사용하여 수확하였다. 수확된 세포를 5㎖의 차가운 용해 완충액[10mM Tris-HCl (pH 7.5), 10mM NaCl, 0.2 % NP-40 및 프로테아제 억제제]에 재현탁시키고, 얼음에서 10분 동안 배양하였다. 용해물을 4℃에서 10분 동안 400g에서 원심분리 하였다. 펠렛화 된 핵을 0.5㎖의 1.2× 제한 효소로 세척하였다
완충액을 넣은 다음 0.5㎖의 동일한 완충액에 재현탁시켰다. SDS를 0.3%의 최종 농도로 첨가하고, 펠렛된 핵을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다.
Triton X-100을 2%의 최종 농도로 첨가하여 SDS를 켄칭하고, 핵을 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 다음으로, 400 U의 XbaI를 첨가하고, 샘플을 37℃에서 밤새 배양하였다. SDS를 1.6%의 농도로 첨가하고, 샘플을 65℃에서 25분 동안 배양하였다. 소화된 게놈 DNA를 1% Triton X-100을 함유하는 6.125㎖의 차가운 1.15× 결찰 완충액에 현탁시켰다. T4 DNA 리가아제(100 U)를 첨가하고, 반응 혼합물을 16 ℃에서 4시간 동안 배양한 후, 실온에서 30분 동안 배양하였다. 이어서, 반응 혼합물을 65℃에서 밤새 300㎍의 단백질 분해 효소 K로 처리하였다. 페놀-클로로포름법으로 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA를 150㎕의 10mM Tris(pH 7.5)에 용해시켰다. 하기 표 3의 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 DNA를 증폭시켰다.
명칭 서열(5'->3') 서열번호
3C 분석 프라이머 A-정방향 GGCGCCAGGCCGGGTCGA 서열번호 13
3C 분석 프라이머 B-역방향 TCGCGTCCCCGCTCCCCTATT 서열번호 14
3C 분석 프라이머 C-정방향 CAGCCTCCTGATTGGCGGATAG 서열번호 15
3C 분석 프라이머 D-역방향 CCACCATCTTCCCACCCTCAG 서열번호 16
11. 효모 단백질 잡종법(Yeast two-hybrid screening)
효모 단백질 잡종법은 Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid system(Clontech/Takara, Mountain View, CA, USA)를 이용하여, BRD2의 C-말단 영역(aa 450-802)을 미끼로 사용하였다.
먹이 단백질은 보편적인 인간 cDNA 라이브러리(Cat. No. 630481; Clontech/Takara)로부터 발현되었다. 미끼 및 먹이 변형된 효모(균주 Y187)를 교배시키고, 생성된 이배체를 DDO(SD-Leu/-Trp) 배지에서 배양하여 두 플라스미드의 존재를 선택하였다. 이어서, 이배체를 단백질-단백질 상호 작용을 나타내는 이배체를 선택하기 위한 DDO/X/A(SD-Leu/-Trp/X-α-gal/ABA) 및 QDO/X/A(SD-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal/ABA) 배지에서 배양하였다.
선택 배지에서의 성장이 HIS3, ADE2, ABA 및 MEL1 리포터 유전자 발현에만 의존한다는 것을 보장하기 위해 콜로니 도금 전에 10배 연속 희석을 수행하였다. 선택된 콜로니를 DNA 시퀀싱에 적용하였다.
12. 유세포 분석
세포는 FITC-Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 및 프로피디움 요오다이드 DNA 염색 프로토콜을 사용하여 수확되고 처리되었다. 세포 자멸사 및 세포주기는 BD FACS 캘리버 머신(BD Biosciences)상에서 유세포 분석에 의해 분석되었다. FlowJo 소프트웨어(https://www.flowjo.com)를 사용하여 모든 데이터를 결정했다.
13. RNA-시퀀싱 분석
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit(Illumina, San Diego, CA, USA)를 사용하여 RNAseq 라이브러리의 제조를 위해 단리된 전체 RNA를 처리하였다. 라이브러리의 품질 및 크기는 Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 키트 (Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 평가되었다. 모든 라이브러리는 CFX96 실시간 시스템 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 qPCR에 의해 정량화되고 NextSeq500 시퀀서(Illumina)에서 시퀀싱되었다. 원시 판독에서 시퀀싱 어댑터 및 저품질베이스는 Cutadapt 소프트웨어를 사용하여 다듬었다.
세척된 고품질 판독 값은 STAR 소프트웨어를 사용하여 인간 참조 게놈 hg19 (https://genome.ucsc.edu)에 매핑되었다. 2개의 선택된 생물학적 조건 사이에서 차등적으로 발현된 유전자는 Cufflinks package(http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/papers/)에서 Cuffdiff에 의해 확인되었다.
14. 정량 및 통계 분석
세포주 연구의 경우, PermutMatrix 소프트웨어를 사용하여 로그 랭크 테스트로 히트맵을 분석했다. 유전자 클러스터링은 DAVID Bioinformatics Resources 6.8을 사용하여 분석되었다.
< 실험예 1> Runx3 - BRD2 뉴클레오좀 복합체가 불러들이는 SWI / SNF와 TFIID 확인
Restriction point의 결정은 혈청 자극 후 3 내지 4시간 후에 이루어진다. 일전에 혈청 자극 후 1 내지 2시간 후에 Runx3-BRD2 복합체가 형성되고, 이 복합체는 수백 개의 유전자를 조절함으로써 R-point 결정에 기여한다는 것이 개시된 바 있다(Chi, X. Z. et al. Runx3 plays a critical role in restriction-point and defense against cellular transformation. Oncogene 36, 6884?6894 (2017).). BRD2는 2개의 bromodomain(BD1과 BD2)을 포함하고 있으며, 이들 각각은 고유한 단백질과 상호 작용을 한다. Runx3 단백질과 다른 단백질의 상호 작용을 유사 분열 자극(mitogenic stimulation) 후 하기와 같이 확인하였다.
도 1a에 나타난 바와 같이, BD1은 아세틸화한 Runx3의 라이신 잔기 94번과 171번에 결합을 하며, BD2는 아세틸화한 히스톤4의 라이신 잔기 5번(H4K5-ac), 히스톤4의 라이신 잔기 12번(H4K12-ac) 그리고 히스톤3의 라이신 잔기 14번(H3K14-ac)과 결합하며, BRD2는 C-말단 부분을 통해서 SWI/SNF 및 TFIID와 결합한다. 또한, RUNX3는 BRD2를 통해서 이러한 복합체들과 결합한다.
특히, 도 1b에 나타난 바와 같이, 유사 분열 자극(mitogenic stimulation) 후 1 내지 2시간 후에 BRD2, RUNX3 그리고 아세틸화 한 히스톤4의 라이신 12번 사이뿐만 아니라 p300, Runx3 그리고 아세틸화 한 히스톤4의 라이신 12번 사이의 상호 작용도 관찰했다. RUNX3와 아세틸화 한 히스톤4의 라이신 잔기 12번 사이의 상호 작용은 BRD2의 녹다운으로 현저히 감소했다.
상기 결과는 R-point 이전에 RUNX3가 p300을 표적 좌위로 가이드하고, 그것은 히스톤들을 아세틸화 시키며, BRD2는 2개의 bromodomain을 통해서 아세틸화 한 RUNX3와 히스톤들 둘 다에 결합한다는 것을 시사한다.
또한, 도 1c에 나타난 바와 같이, 세포 분열 자극 1시간 후에 TAF1(활성화된 TAF1), TAF7(TAF 억제) 그리고 TBP가 BRD2와 RUNX3와 복합체를 형성한다는 것을 발견했다. 그 후에, TAF7은 복합체로부터 분리되고, TFIID는 RUNX3-BRD2 결합 후에 활성화된다. 또한, 세포 분열 자극 후 4시간 후에 TAF1 및 TBP는 RUNX3로부터 분리된다. 이와 유사하게, BRG-1과 BAF155(SWI/SNF 복합체의 구성 요소)도 또한 세포 분열 자극 후 1 내지 2시간 후에 RUNX3와 BRD2에 결합하고, 4시간 후에 분리되었다. RUNX3-BRD2 복합체와 SWI/SNF 및 TFIID 복합체와의 결합은 근접 결찰 분석(PLA)을 통해서 확인되었다.
상기 결과들은 일관되게, R-point에 관련되어 있는 단백질들[p14ARF(이하 ARF), p53과 p21]의 발현은 RUNX3가 BRD2, SWI/SNF 그리고 TFIID와 결합할 때와 같은 시간대에 유도되었음을 제시한다.
도 1d에 나타난 바와 같이, BRD2의 녹다운 실험은 SWI/SNF 및 TFIID 복합체는 BRD2를 통해서 RUNX3와 결합한다는 것을 보여주었다. 상기 결과는 RUNX3-BRD2 복합체의 일시적인 형성이 R-point에 특이적임을 제시한다.
< 실험예 2> RUNX3는 R-point의 파이오니어 인자(pioneer factor)임을 확인
Runx3의 다른 단백질과의 분자 결합의 시간적 순서를 설명하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
구체적으로, Flag-BRD2-WT, Flag-BRD2-ΔCt(C-말단 부분의 아미노산 633-802 제거), Flag-BRD2-ΔBD1(BD1 제거) 또는 Flag-BRD2-ΔBD2(BD2 제거)와 함께 Myc-RUNX3를 세포에 감염시켰다. 그 후, 혈청 자극 후 2시간에서 단백질들의 결합을 분석하기 위해서 면역 침전/면역 블롯팅(IP/IB) 기법을 수행하였다. RUNX3-p300의 결합은 BRD2와는 무관함이 도 1d의 결과로부터 확인되므로, RUNX3-p300의 결합은 돌연변이 BRD2의 발현에 영향을 받지 않았다(도 1e). 따라서, RUNX3-p300의 결합은 RUNX3-BRD2의 결합보다 더 일찍 일어날 것이라고 예측했다.
BRD2의 C-말단 부분의 제거(Flag-BRD2-ΔCt)는 RUNX3-H4K12-ac의 결합에는 영향을 주지 않으면서 RUNX3와 TFIID 및 SWI/SNF의 결합을 폐지 시킨 반면, BRD2의 BD1 또는 BD2의 제거는 RUNX3-H4K12-ac의 결합을 폐지시켰다(도 1e).
상기 결과들은 BRD2가 BD1 및 BD2를 통해서 각각 아세틸화 된 RUNX3와 아세틸화 된 히스톤4에 동시에 결합한다는 것을 제시한다. 특히 BRD2-ΔBD2는 RUNX3, SWI/SNF, 그리고 TFIID와의 결합에 실패했다(도 1e). 이러한 결과들은 RUNX3와 히스톤 모두에 결합한 BRD2(RUNX3-BRD2-뉴클레오좀 복합체)만이 SWI/SNF 및 TFIID 복합체에 결합할 수 있다는 것을 시사한다. 이러한 결과들을 바탕으로, 인핸서 영역의 RUNX3 결합 부분에서 RUNX3가 p300에 의해서 조절되는 히스톤 아세틸화를 촉진하고, RUNX3-BRD2-H4K12-ac 복합체의 형성을 통해서 프로모터 영역(target loci)에 결합한 다음, RUNX3는 BRD2를 통해서 표적 좌위로 SWI/SNF 및 TFIID 복합체를 불러들인다는 결론을 내렸다.
특정 염색질 좌위에서 RUNX3에 의해 조절되는 SWI/SNF 및 TFIID 복합체의 불러들임을 확인하기 위해서, ARF(CDKN2A) 좌위를 모델로 선택했다. ARF는 세포의 삶과 죽음에 중요한 RUNX3의 타겟 유전자이기 때문에, ARF의 발현 조절이 R-point 결정을 보여줄 수 있을 것으로 예측했다. ARF 프로모터는 전사 개시 부위의 상류에 있는 1466개의 염기들에서 완벽하게 일치하는 RUNX consensus 결합 부위를 가지고 있다. CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여, HEK293-ARF-RX-D 세포를 만들기 위해 HEK293 세포에서 RUNX3 결합 부분을 제거하고, 크로마틴 면역 침전(Chromatin immunopricipitation, ChIP) 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 1f에 나타난 바와 같이, HEK293 세포(HEK293-ARF-WT)에서 혈청 자극 후 1시간에서 RUNX3가 ARF 좌위에 결합했고, 이 결합은 8시간 동안 계속 유지되어 있는 것을 확인하였다. 혈청 자극 후 1시간 후에 p300, BRD2와 SWI/SNF 및 TFIID 구성 요소들은 좌위에 결합하였고, 그 결합은 2시간에 분리되는 TAF7은 제외하고 4시간까지 유지되었다. 이와는 다르게 HEK293-ARF-RX-D 세포에서는 그 좌위에서 이러한 단백질들의 결합이 나타나지 않았다. 상기 결과는 RUNX consensus 부분에 RUNX3의 결합이 표적 좌위에서 염색질-리모델링 복합체와 기초 전사 기체(basal transcriptional machinery)를 불러들이는데 중요하다는 것을 제시한다.
또한, 도 1f에 나타난 바와 같이, HEK293-ARF-WT 세포에서, 혈청 자극 전(0시간)에 H3K27-me3(억제된 histone modification)은 ARF 프로모터 영역 안에서 많이 나타났다(도 1f). 특히, H3K27-me3은 혈청 자극 후 1 내지 4시간에서 H3K4-me3(활성화된 histone modification)으로 대체된 반면, H3K27-me3는 8시간 후에 다시 복원되었다. 이와 비슷하게, H4K12-ac(활성화된 histone modification)는 혈청 자극 후 1 내지 4시간에 나타났지만, 그 후에는 사라졌다. 이와는 대조적으로, HEK293-ARF-RX-D 세포에서 혈청 자극 후 오랫동안 H3K27-me3 modification은 유지되었고, H4K12은 아세틸화 되지 못하였다.
상기 결과는 혈청 자극 후 1 내지 2시간에 RUNX3가 결합 자리에 결합하여 표적 좌위의 염색질 구조를 열고 활성화 시키고, 그런 다음 그 좌위를 닫는다는 것을 보여줌으로써, RUNX3가 R-point의 파이오니어 인자(pioneer factor)라는 것을 보여주었다. 우리는 R-point 이전에 형성된 RUNX3가 포함된 복합체를 R-point-associated RUNX3-containing activator complex(Rpa-RX3-AC)로 명명했다.
도 1f에 나타난 바와 같이, HEK293-ARF-WT 세포에서, BRD2, SWI/SNF(BRG-1 및 BAF155) 그리고 TFIID(TBP, TAF1 및 TAF7)는 자극 후 4시간까지 ARF 좌위에 결합하였지만, 이 단백질들은 오직 2시간까지만 RUNX3에 결합한다. 이러한 결과들은 아마도 열린 염색질에 불려온 히스톤과 다른 DNA 결합 단백질들의 상호작용을 통해 BRD2가 RUNX3로부터 분리된 후에도 잠시 동안 ARF 좌위에 결합된 상태로 유지된다는 것을 보여준다. 이러한 분자적 사건의 순서는 도 1g에 요약되어 있다. 이 모델은 R-point 동안 Rpa-RX3-AC를 통하여 인핸서는 프로모터에 결합한다는 것을 제안한다. 혈청 자극 후 2시간에 ARF 좌위에서 이 인핸서와 프로모터의 결합은 염색체 입체 형태 포착 분석(Chromosome conformation capture assay, 3C 분석)를 통해서 확인되었다.
< 실험예 3> RUNX3는 MLL1 /5, PRC1 그리고 PRC2를 불러들임을 확인
RUNX3-BRD2 복합체가 어떻게 히스톤 modification을 제어하는지를 확인하기 위해서, 미끼로 BRD2의 C-말단 부위(aa 450-802)를 사용하여 효모 단백질 잡종법(yeast two-hybrid screening)을 통해 염색질 역학에서 서로 반대되는 역할을 하는 MLL5와 RNF2를 확인하였다. MLL5는 염색질의 활성화에 기여하는 TrxG 히스톤 변형자(histone modifier)이며, 반면에 RNF2는 염색질을 비활성화 시키는 PRC1 복합체의 구성 요소이다.
도 2b에 나타난 바와 같이, BRD2와 MLL 패밀리 멤버 사이의 결합의 분석은 혈청 자극 후 1 내지 2시간 후에서 BRD2가 MLL1과 MLL5와 결합하고, 이 단백질들은 같은 시간대에 RUNX3와 결합하였다. 혈청 자극 후 2시간에 RUNX3와 MLL1/5사이의 물리적 결합은 근접 결찰 분석(PLA)을 통해 확인하였다(도 2c). 또한 Lozenge(a Drosophila homolog of the RUNX family genes) 와 Trithorax(a Drosophila homolog of the MLL family genes)의 유전적 상호 작용은 초파리 눈의 발생에서도 관찰되었다.
도 2e에 나타난 바와 같이, ChIP 분석은 자극 후 1-4시간에 MLL1/5는 ARF의 좌위에 결합하였고, 이와 같은 시간대에 그 좌위에서 H3K4-me3이 많이 나타났다. 이러한 결과들은 MLL1/5가 히스톤 변형을 활성화 시키는 RUNX3-BRD2 복합체 결합을 통해 염색질에 불려온다는 것을 보여준다. 따라서, MLL1/5는 Rpa-RX3-AC의 추가 구성 요소이다.
BRD2와 PRC1의 구성요소 사이의 결합 분석은 혈청 자극 후 4 내지 8시간 후에 BRD2가 RNF2와 BMI1에 결합한다는 것을 보여주었다. 그 시간에, RUNX3는 BRD2대신에 Cyclin D1과 HADC4와 결합했고, 자극 후 8시간에 EED와 EZH2(PRC2의 구성 요소)는 RUNX3와 결합하였다(도 2b). ChIP 분석은 그 좌위에서 H4K12-ac는 나타나지 않고 H3K27-me3은 많이 나타나는 R-point 이후에 Cyclin D1, HDAC4 그리고 EZH2가 염색질에 결합된다는 것을 보여주었다(도 2e). 4시간 이후에, RNF2는 잠시 RUNX3와 BRD2에 결합하였고(도 2b), 표적 좌위에 불려왔다. 이것은 Rpa-RX3-AC가 파괴되기 전에(세포 분열 자극 후 2 내지 4시간 사이) PRC1과 Rpa-RX3-AC는 일시적인 복합체를 형성하였다는 것을 보여주었다. 이 일시적인 조합을 R-point-associated RUNX3-containing transient complex(Rpa-RX3-TR)로 명명했다(도 2f).
세포 분열 자극 후 4 내지 8시간에서, RUNX3와 BRD2는 분리된 복합체로 존재했다: RUNX3는 Cyclin D1, HDAC4, 그리고 PRC2와 함께 복합체를 형성하였고(도 2b), 그것은 타겟 염색질 좌위에 남아있었지만(도 2e), BRD2는 BRD2-PRC1 복합체를 형성한(도 2b) 이후에 타겟 염색질 좌위로부터 떨어져 나갔다(도 2e). RUNX3-Cyclin D1-HDAC4-PRC2 복합체는 염색질을 비활성화시키기 때문에, 우리는 그 복합체를 R-point-associated RUNX3-containing repressor complex(Rpa-RX3-RE)라고 명명하였다(도 2f).
< 실험예 4> PRC1 - Cyclin D1- HDAC4 복합체는 Rpa -RX3-AC와 결합한다.
상기 실험예 3에서 명명한 R-point-associated RUNX3-containing transient complex(Rpa-RX3-TR)가 어떻게 형성되는지를 확인하였다.
혈청 자극 후 2시간부터 Cyclin D1이 발현되기 시작하였고, 이 Cyclin D1의 발현은 RUNX3와는 무관하다. 도 3a에 나타난 바와 같이, 면역 침전/면역 블롯팅(IP/IB) 분석은 RNF2-Cyclin D1의 결합이 혈청 자극 후 2시간에서 일어났고, 그 후 점차 그 결합이 약해지는 것을 보여주었다. RNF2-HDAC4의 결합은 오직 혈청 자극 후 4시간에서만 관찰된 반면, HDAC4-Cyclin D1의 결합은 자극 후 4시간에서부터 일어났고, 그 후 점차 그 결합이 강해졌다.
이러한 결과들은 자극 후 2시간에서 PRC1이 Cyclin D1과 결합하고, 그 뒤에 PRC1-Cyclin D1-HDAC4 복합체로 만들어진다는 것을 제시한다. 자극 후 4시간에서 PRC1-Cyclin D1-HDAC4 복합체의 형성은 이 유전자들을 세포에 감염시킨 후 IP/IB 분석을 통해서 관찰하였고(도 3b), 이 단백질들 사이의 직접적인 결합은 시험관 내에서 만들어진 단백질들을 가지고 IP/IB를 통해서 확인하였다(도 3c 및 도 3d). 이런 결합들에 대한 도메인 맵핑 분석 결과는 도 3e에 나타나 있다.
PRC1, Cyclin D1 그리고 HDAC4는 혈청 자극 후 4시간에 타겟 좌위에 결합하였다(도 2e). 특히, small-interfering RNA(siRNA)에 의해서 조절된 HDAC4의 녹다운은 RUNX3-BRD2의 분리를 억제하였다(도 3f). 이와 비슷하게, RNF2 또는 Cyclin D1의 녹다운은 RUNX3-Cyclin D1, RUNX3-HDAC4 그리고 RNF2-BRD2의 결합을 감소시켰고, 효과적으로 RUNX3-BRD2 결합의 분리가 억제되었다(도 3g). 이러한 결과들은 개별적인 구성 요소보다는 PRC1-Cyclin D1-HDAC4 복합체로 Rpa-RX3-AC와 결합하고 Rpa-RX3-TR을 형성한다는 것을 시사한다. p300에 의해서 일어난 RUNX3의 아세틸화는 HDAC4에 의해서 효과적으로 제거되었기 때문에, Rpa-RX3-TR의 구성요소인 HDAC4는 RUNX3의 탈 아세틸화에 중요한 역할을 하여 BRD2 및 다른 BRD2와 관련된 단백질들을 방출시킨다.
염색질의 비활성화는 HDAC4에 의한 히스톤 탈 아세틸화와 RNF2에 의한 H2A의 라이신 잔기 119번의 유비퀴틴화(H2A-K119-ub)에 관계가 있다. 이것과 일치하게, 자극 후 4-8시간에 H4K12의 아세틸화는 감소하였고(도 1f), H2A의 라이신 잔기 119번의 유비퀴틴화(H2A-K119-ub)은 ARF의 좌위에 많이 나타났다(도 2e). 이러한 결과들은 PRC1-Cyclin D1-HDAC4 복합체가 Rpa-RX3-AC와 결합하고 그 다음 Rpa-RX3-TR을 형성하게 되고, 그런 다음 이 복합체가 H4K12의 탈 아세틸화와 H2A의 유비퀴틴화에 의해 타겟 좌위의 염색질 비활성화를 일으킨다는 것을 보여준다(도 3h).
< 실험예 5> CDK4와 cyclin D1의 결합은 Rpa -RX3-TR의 형성을 일으킴을 확인
이전에, hypo-인산화된 pRB가 RUNX3-BRD2에 결합하고, R-point commitment에 기여한다는 것이 알려져 있다. 또한, 자극 후 1 내지 2시간에서 E2F1이 RUNX3와 결합하였다(도 4a). pRB의 ser 795번이 Cyclin D1-CDK4/6에 의해서 인산화 되면 pRB-E2F1 복합체가 RUNX3로부터 방출되었다(도 4a). 이러한 결과들은 CDK4가 pRB를 인산화시키기 위해서 Rpa-RX3-AC에 접근한다는 것을 시사한다. IP/IB 분석은 CDK4가 RUNX3에 2시간 이후에 결합하고, 그 결합이 그 후에 약해지는 것을 보여주었다 (도 4a). CDK4가 RUNX3에 결합하고 있는 동안에 CDK4는 ARF 좌위에 결합하고 있었다 (도 2e). RUNX3와 CDK4사이의 이러한 물리적 결합은 혈청자극 후 2시간에 보이는 것을 근접 결찰 분석(PLA) 실험을 통해서 확인되었다(도 4b). 이러한 결과들은 세포주기 조절에서 중요한 역할을 하는 pRB 및 E2F1과 함께 CDK4가 Rpa-RX3-AC의 구성 요소임을 입증한다.
비록 혈청 자극 후 2시간에 pRB와 CDK4는 Rpa-RX3-AC에 결합하지만, CDK4에 의해서 일어나는 pRB의 인산화는 자극 후 4시간에서 발생한다(도 4a). CDK4와 그것의 결합 단백질들 사이의 결합 시간 분석은 CDK4가 자극 후 1시간에 p16과 결합한 후, 2시간에서 p16에서 p21로 바뀌는 것을 보여주었다(도 4a). p21은 Cyclin D1과 CDK4의 결합을 촉진한다. 그러나 2시간부터 발현을 하는 Cyclin D1은 RNF2와 결합을 하지만, 같은 시간대에 p21과 결합하고 있는 CDK4는 없었다(도 3a와 4a). 이 cyclin D1-CDK4 결합은 Rpa-RX3-TR이 형성된 이후 (4시간에서) 관찰되었다(도 4a). 특히, CDK4의 녹다운은 RUNX3와 Cyclin D1, HDAC4와의 결합을 현저하게 감소시켰다(도 4c). 따라서, RUNX3-BRD2의 결합과 ARF의 발현은 8시간까지 유지되었다 (도 4c). 이러한 결과들은 Rpa-RX3-AC의 CDK4와 PRC1-Cyclin D1-HDAC4의 Cyclin D1은 Rpa-RX3-TR을 형성할 수 있는 두 복합체의 결합을 위한 도킹 사이트를 제공한다는 것을 시사한다.
< 실험예 6> Cyclin D1과 CDK4는 R-point transition에 기여한다.
R-point transition에 CDK4의 역할을 조사했다. CDK4의 약리학적 활성 억제는 8시간까지 Rpa-RX3-AC와 ARF의 발현을 유지하였다(도 4d). 이러한 결과들은 Rpa-RX3-AC에서 Cyclin D1-CDK4의 결합에 의한 CDK4의 활성화는 R-point transition을 일으킨다는 것을 보여주었다.
CDK4는 RUNX3의 Ser-356을 인산화시킨다고 알려져 있으므로, RUNX3의 인산화된 Ser-356 펩타이드를 인식하는 항체를 제조하였다. 이 항체는 RUNX3-CDK4의 결합을 보여줌과 동시에 내인성 RUNX3의 인산화를 보여주었다(혈청 자극 후 2 내지 4시간)(도 4e). RUNX3의 인산화는 CDK4의 녹다운으로 두드러지게 감소하였다(도 4c). 특히, 과발현시킨 Myc-RUNX3-S356A와 BRD2 사이의 결합과 ARF의 발현은 혈청 자극 후 8시간까지 유지되었다(도 4f). 그러나 RUNX3가 마치 인산화 되어 있는 것처럼 보이게 만든 돌연변이체인 Myc-RUNX3-S356E은 RUNX3와 BRD2의 결합과 분리에 아무런 영향을 주지 못하였다(도 4g). 이러한 결과들은 CDK4에 의존적인 RUNX3 Ser356의 인산화는 RUNX3로부터 BRD2를 방출하기 위해서 필요하지만 충분한 것은 아니라는 것을 시사한다. 이 분자적 사건들의 순서는 도 4h에 요약되어있다.
< 실험예 7> R-point transition에 기여하는 다양한 경로의 확인
MEK1 억제제의 처리는 BRD2-RUNX3 와 p300-RUNX3 결합을 억제시킨다(도 5a). 상기 결과는 RAS-MEK 신호 경로가 Rpa-RX3-AC의 형성을 자극한다는 것을 보여준다.
Cyclin D1-CDK4의 결합은 혈청 자극 후 4시간에서 발생했고, Cyclin D1-CDK4에 의존적인 pRB의 인산화 또한 같은 시간대에서 발생하였다(도 4a). 그러나 특히 CDK4에 의존적인 RUNX3의 인산화는 Cyclin D1-CDK4의 결합보다 더 빠른 시간인 혈청 자극 후 2시간에서 발생하였다(도 4c 및 도 4e). Cyclin D1의 녹다운은 효과적으로 pRB의 인산화(S795)를 감소시켰지만, RUNX3의 인산화(S356)에는 영향을 주지 않았다(도 5b). 이러한 결과들은 CDK4가 RUNX3의 인산화를 촉진하기 위해서 Cyclin D1에 무관한 방법으로 활성화 되어진다는 것을 제안한다.
CDK4의 활성화는 CDK-활성화 키나아제(CAK)의 활성화에 의존한다. JNK는 CDK4의 T172을 인산화시키는 CAK들 중 하나로 알려져 있다. 우리는 JNK가 혈청 자극 후 2시간에서 CDK4의 T172에 인산화를 시킨다는 것을 발견하였다(도 5c). JNK 활성의 약리학적 억제는 RUNX3 ser-356의 인산화를 두드러지게 감소시켰고 Rpa-RX3-AC를 8시간까지 유지시켰다(도 5d). 이와 비슷하게, siRNA에 의한 JNK의 녹다운 또한 RUNX3 Ser356의 인산화를 감소시켰고 Rpa-RX3-AC를 유지시켰다(도 5e). 과발현시킨 CDK4-WT은 혈청 자극 후 2 내지 4시간 후에 Myc-RUNX3를 인산화시켰다. 그러나 Flag-CDK4-T172A(JNK에 의해 인산화가 일어나지 않게 만든 돌연변이체)는 RUNX3 Ser356에 인사화를 시키는 것에 실패했다(도 5f). Flag-CDK4-T172A는 혈청 자극 후 심지어 더 일찍 RUNX3와 결합을 하였고, 오랫동안 분리되지 않았다(도 5f). 이와 일관되게, Flag-CDK4-T172A는 Rpa-RX3-AC를 계속 유지하였고 ARF의 발현도 8시간까지 연장시켰다(도 5f). 이러한 결과들은 JNK 경로 또한 CDK4의 활성화를 통해서 R-point transition에 기여한다는 것을 시사한다.
Rpa-RX3-TR의 형성에 중요한 역할을 하는 Cyclin D1의 전사와 번역은 각각의 RAS-RAF와 RAS-PI3K 경로들을 통해서 자극되어 진다고 알려져 있다. 예상대로, PI3K catalytic subunit(PIK3CA, encoding p110α)의 녹다운은 Cyclin D1의 수준을 감소시켰으며 Rpa-RX3-AC를 유지시켰고 ARF의 발현을 8시간까지 연장시켰다(도 5g). 라파마이신을 이용한 RAS-PI3K-AKT 경로의 하류 이펙터인 mTOR의 억제 또한 Rpa-RX3-AC를 유지시켰고 ARF의 발현을 8시간까지 연장시켰다(도 5h). 이러한 결과들은 PI3K 경로 또한 Cyclin D1을 유도하는 것에 의해서 Rpa-RX3-AC에서 Rpa-RX3-TR로의 transition에 기여한다는 것을 시사한다.
상기 결과는 RAS(MEK, JNK, and PI3K)의 하류에서 세 개의 주요한 경로들이 분명한 단계에서 R-point transition에 기여한다는 것을 시사한다. 이들 경로의 R-point에 대한 각각의 단계에서 기여는 도 6에 요약되어있다.
< 실험예 8> 발암성 K-RAS의 R-point transition을 억제 확인
Rpa-RX3-AC에서 Rpa-RX3-TR로부터의 transition은 오직 MEK의 활성이 감소한 후에 발생한다는 것을 보여주었다(도 4a, p-ERK1/2). 따라서, 우리는 만약 RAS-RAF-MEK 경로가 구성적으로 활성화되어 있다면 어떤 일이 일어날지에 의문점을 가졌다. 발암성 K-RAS(Myc-K-RASG12V)의 과발현은 RUNX3와 p300, BRD2, SWI/SNF, TFIID, 그리고 CDK4의 결합을 촉진했고, 그 복합체는 8시간까지 유지되었다(도 7a). 이와는 대조적으로, Myc-K-RASG12V의 발현은 RUNX3, Cyclin D1와 HDAC4사이의 결합을 억제하였으며, 게다가 BRD2와 PRC1사이의 결합도 억제하였다(도 7a).
ChIP 분석은 발암성 K-RAS의 발현이 ARF 좌위에 Rpa-RX3-AC의 결합을 유지시켰지만, Cyclin D1, HDAC4 와 PRC1의 결합은 억제했다(도 7b). 상기 결과는 발암성 K-RAS가 Rpa-RX3-AC 형성을 촉진하고, Rpa-RX3-TR의 형성을 억제한다는 것을 보여준다. 게다가, 발암성 K-RAS는 PRC1-Cyclin D1 복합체의 형성은 촉진하였지만, 그 복합체로 HDAC4가 들어가는 것은 억제되었다(도 7a). 따라서, 발암성 K-RAS는 PRC1-Cyclin D1 복합체에 HDAC4의 결합을 억제하는 것에 의해서 Rpa-RX3-TR 형성을 억제한다.
ChIP 분석 결과 Myc-KRASG12V의 발현에 의해 H4K12-ac 및 H3K4-me3 히스톤 마커가 오랫동안 유지된 것으로 나타났다(도 7b). 이것과 일관 되게, Myc-KRASG12V가 발현되었을 때 ARF와 p21(Rpa-RX3-AC의 target)은 감소하지 않고 장기간 유지되었다(도 7a).
Rpa-RX3-AC의 연장된 결합 및 발암성 K-RAS의 발현에 의한 ARF 유전자 좌위에서 H4K12-ac 및 H3K4-me3 히스톤 마커의 유지는 유전자에서 RUNX 결합 부위의 제거로써 폐지되었다(도 7c). 발암성 K-RAS에 더하여, 발암성 B-RAF(BRAFV600E)도 Rpa-RX3-AC를 유지시켰고, ARF의 발현도 연장시켰으며, 장기간 동안 p53을 안정화시켰다(도 7d). 이러한 결과들은 정상 세포의 R-point에서 ARF 좌위가 Rpa-RX3-AC에 의해 열리고 닫히지만, 발암성 K-RAS 또는 발암성 B-RAF를 발현하는 세포에서는 Rpa-RX3-AC→Rpa-RX3-TR 전환의 실패로 인해 닫히지 않는다.
과발현된 MEK1-CA는 Cyclin D1-RNF2 결합을 유지했지만 Cyclin D1-HDAC4 결합은 억제하였는데, 이는 MEK1-CA가 PRC1/CyclinD1/HDAC4 복합체 형성을 억제함으로써 R-point의 전환이 억제되었음을 나타낸다(도 7e). 정상적인 RAS 및 발암성 RAS에 의한 R-point의 서로 다른 조절에 대한 개요는 도 7f에 나와있다. 정상적인 유사 분열 신호에 대한 R-point transition 및 R-point 관련 염색질 dynamics의 개요는 도 8에 나타나 있다.
< 실험예 9> RUNX3의 K-RAS-유도 종양 형성에 의한 종양 발생 억제 확인
H460 인간 대세포폐암 세포주(증폭 없이 활성화된 K-RAS, 비활성화되어 있는 RUNX3, ARF wild-type, p53 wild-type)의 내인성 발암 K-RAS에 대한 RUNX3의 방어 역할을 하기와 같이 확인하였다.
형질 감염 실험기법을 통해, H460-vec, H460-ERT2-RUNX3(ERT2가 결합된 야생형 RUNX3를 발현함) 및 H460ERT2-RUNX3-K94/171R(ERT2가 결합된 돌연변이체 RUNX3를 발현함)의 세포주를 얻었다. ERT2 융합 단백질은 4-하이드록시타목시펜(-4OHT) 처리 후 8시간에 핵에 위치했다(도 9a). 비록 그 세포주들이 발암성 KRAS를 발현했음에도 불구하고, 유도자(inducer)가 없는 경우 혈청 자극 후 어느 시점에서도 Rpa-RX3-AC를 형성한 세포주는 없었다(도 9b). 유도자 처리 후 8시간에서 H460-ERT2-RUNX3-K94/171R 세포주가 아닌 H460-ERT2-RUNX3 세포에서만 Rpa-RX3 AC을 형성하였다(도 9b). 유도자가 처리된 H460-ERT2-RUNX3 세포에서 Rpa-RX3-AC는 유지되고 ARF-p53 경로가 오랫동안 활성화되었다(도 9b). ChIP 분석 결과는 유도자가 처리된 H460-ERT2-RUNX3 세포에서 Rpa-RX3-AC가 그것의 표적 좌위에 장기간 결합된다는 것을 보여주었다(도 9c). 이것과 일치하게, 유도 후 8 내지 16 시간에서 H460-ERT2-RUNX3 세포에서는 H4K12-ac과 H3K4-me3이 표적 좌위에 관찰된 반면 H3K27-me3은 보이지 않았지만, H460-ERT2-RUNX3K94/171R 세포에서는 그렇지 않았다(도 9c). 이러한 결과들은 유도자가 처리된 H460-ERT2-RUNX3 세포가 R-point 방어 프로그램을 통해 내인성 발암성 K-RAS에 명확하게 반응했음을 나타내지만, RUNX3가 결핍되어 있는 parental H460 세포나 H460-ERT2-RUNX3-K94/171R 세포에서 이 과정은 나타나지 않는다는 것을 보여주었다.
유도자 처리 후 여러 시간대에서 유세포 분석은 유도자 처리한 H460-ERT2-RUNX3 세포의 사멸된 세포 비율이 유도자 처리 후 16시간에 증가하기 시작해 그 이후 더욱 증가한 것으로 나타났다(도 9d). si-RNA에 의한 p53의 녹다운에 의해서 세포사멸은 두드러지게 억제되었다(도 9d). 따라서 4-OHT 처리된 H460- ERT2-RX3 세포는 G1 단계에서 세포사멸 경로로 들어가는 것으로 보인다. H460-vec 세포와 H460-ERT2RUNX3-K94/171R 세포는 세포사멸을 겪지 않았다(도 9d). 이러한 결과들은 Rpa-RX3-AC가 세포를 내인성 발암성 K-RAS에 대해 방어하고, ARF-p53 경로가 R-point 방어 프로그램에 관여하고 있음을 보여준다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Screening methods of drug candidates for treating lung cancer <130> 2020P-11-079 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-BRD2 sense <400> 1 cacuuggccu gcaugacua 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-BRD2 antisense <400> 2 uagucaugca ggccaagug 19 <210> 3 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-p53 sense <400> 3 caguuugagg ugcguguu 18 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-p53 antisense <400> 4 aacacgcacc ucaaagcug 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-cdk4 sense <400> 5 ccagaaucua cagcuacca 19 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-cdk4 antisense <400> 6 ugguagcugu agauuccugg 20 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-cyclin D1 sense <400> 7 gaccuucguu gcccucugu 19 <210> 8 <211> 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gtgatttctt caggtggaga ggaacgactg 8100 gcatcccata atttatttcg ggaggaggaa cagtgtgatc ttccaaaaat ctcacagttg 8160 gatggtgttg atgatgggac agagagtgat actagtgtca cagccacaac aaggaaaagc 8220 agccagattc caaaaagaaa tggtaaagaa aatggaacag agaacttaaa gattgataga 8280 cctgaagatg ctggggagaa agaacatgtc actaagagtt ctgttggcca caaaaatgag 8340 ccaaagatgg ataactgcca ttctgtaagc agagttaaaa cacagggaca agattccttg 8400 gaagctcagc tcagctcatt ggagtcaagc cgcagagtcc acacaagtac cccctccgac 8460 aaaaatttac tggacaccta taatactgag ctcctgaaat cagattcaga caataacaac 8520 agtgatgact gtgggaatat cctgccttca gacattatgg actttgtact aaagaatact 8580 ccatccatgc aggctttggg tgagagccca gagtcatctt catcagaact cctgaatctt 8640 ggtgaaggat tgggtcttga cagtaatcgt gaaaaagaca tgggtctttt tgaagtattt 8700 tctcagcagc tgcctacaac agaacctgtg gatagtagtg tctcttcctc tatctcagca 8760 gaggaacagt ttgagttgcc tctagagcta ccatctgatc tgtctgtctt gaccacccgg 8820 agtcccactg tccccagcca gaatcccagt agactagctg ttatctcaga ctcaggggag 8880 aagagagtaa ccatcacaga aaaatctgta gcctcctctg aaagtgaccc agcactgctg 8940 agcccaggag tagatccaac tcctgaaggc cacatgactc ctgatcattt tatccaagga 9000 cacatggatg cagaccacat ctctagccct ccttgtggtt cagtagagca aggtcatggc 9060 aacaatcagg atttaactag gaacagtagc acccctggcc ttcaggtacc tgtttcccca 9120 actgttccca tccagaacca gaagtatgtg cccaattcta ctgatagtcc tggcccgtct 9180 cagatttcca atgcagctgt ccagaccact ccaccccacc tgaagccagc cactgagaaa 9240 ctcatagttg ttaaccagaa catgcagcca ctttatgttc tccaaactct tccaaatgga 9300 gtgacccaaa aaatccaatt gacctcttct gttagttcta cacccagtgt gatggagaca 9360 aatacttcag tattgggacc catgggaggt ggtctcaccc ttaccacagg actaaatcca 9420 agcttgccaa cttctcaatc tttgttccct tctgctagca aaggattgct acccatgtct 9480 catcaccagc acttacattc cttccctgca gctactcaaa gtagtttccc accaaacatc 9540 agcaatcctc cttcaggcct gcttattggg gttcagcctc ctccggatcc ccaacttttg 9600 gtttcagaat ccagccagag gacagacctc agtaccacag tagccactcc atcctctgga 9660 ctcaagaaaa gacccatatc tcgtctacag acccgaaaga ataaaaaact tgctccctct 9720 agtacccctt caaacattgc cccttctgat gtggtttcta atatgacatt gattaacttc 9780 acaccctccc agcttcctaa tcatccaagt ctgttagatt tggggtcact taatacttca 9840 tctcaccgaa ctgtccccaa catcataaaa agatctaaat ctagcatcat gtattttgaa 9900 ccggcacccc tgttaccaca gagtgtggga ggaactgctg ccacagcggc aggcacatca 9960 acaataagcc aggatactag ccacctcaca tcagggtctg tgtctggctt ggcatccagt 10020 tcctctgtct tgaatgttgt atccatgcaa actaccacaa cccctacaag tagtgcgtca 10080 gttccaggac acgtcacctt aaccaaccca aggttgcttg gtaccccaga tattggctca 10140 ataagcaatc ttttaatcaa agctagccag cagagcctgg ggattcagga ccagcctgtg 10200 gctttaccgc caagttcagg aatgtttcca caactgggga catcacagac cccctctact 10260 gctgcaataa cagcggcatc tagcatctgt gtgctcccct ccactcagac tacgggcata 10320 acagccgctt caccttctgg ggaagcagac gaacactatc agcttcagca tgtgaaccag 10380 ctccttgcca gcaaaactgg gattcattct tcccagcgtg atcttgattc tgcttcaggg 10440 ccccaggtat ccaactttac ccagacggta gacgctccta atagcatggg actggagcag 10500 aacaaggctt tatcctcagc tgtgcaagcc agccccacct ctcctggggg ttctccatcc 10560 tctccatctt ctggacagcg 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tacagctgaa gtcagctcgg agggcaacta gcatggatct gccaatgccc 11460 atgcgcttcc ggcacttaaa aaagacttct aaggaggcag ttggtgtcta caggtctccc 11520 atccatggcc ggggtctttt ctgtaagaga aacattgatg caggtgagat ggtgattgag 11580 tatgccggca acgtcatccg ctccatccag actgacaagc gggaaaagta ttacgacagc 11640 aagggcattg gttgctatat gttccgaatt gatgactcag aggtagtgga tgccaccatg 11700 catggaaatg ctgcacgctt catcaatcac tcgtgtgagc ctaactgcta ttctcgggtc 11760 atcaatattg atgggcagaa gcacattgtc atctttgcca tgcgtaagat ctaccgagga 11820 gaggaactca cttacgacta taagttcccc attgaggatg ccagcaacaa gctgccctgc 11880 aactgtggcg ccaagaaatg ccggaagttc ctaaactaa 11919

Claims (7)

1) Runx3 단백질이 하향 조절되어 있는 세포에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포에서 Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질 및 BRD2(Bromodomain-containing protein 2)을 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 및
3) 상기 단계 1)의 세포에서 Runx3 단백질, BRD2, MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 단백질을 포함하는 복합체, Runx3 단백질, BRD2 및 MLL5(Mixed lineage leukemia protein-5) 단백질을 포함하는 복합체, 또는 Runx3 단백질, BRD2, MLL1(Mixed lineage leukemia protein-1) 단백질 및 MLL5(Mixed lineage leukemia protein-5) 단백질을 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 를 포함하는 폐암의 치료제 스크리닝 방법.
제1항에 있어서,
4) 상기 단계 1)의 세포에서 Runx3 단백질, BRD2, MLL1, MLL5 및 SWI/SNF(SWItch/Sucrose Non-Fermentable)를 포함하는 복합체의 형성을 확인하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 복합체에서 Runx과 BRD2의 결합 및 BRD2 C-말단과 MLL1, MLL5 및 SWI/SNF의 결합이 대조군에 비해 증가하는 피검물질을 선별하는 단계; 를 더 포함하는 폐암의 치료제 스크리닝 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 BRD2는 아세틸화된 Runx3에 결합하는 것인, 폐암의 치료제 스크리닝 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 2) 및 단계 3)의 복합체는 유사 분열 자극(mitogenic stimulation)을 받은 경우 형성되는 것인, 폐암의 치료제 스크리닝 방법.
제2항에 있어서, 상기 단계 4)의 복합체는 유사 분열 자극(mitogenic stimulation)을 받은 경우 형성되는 것인, 폐암의 치료제 스크리닝 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 복합체는 Restriction point(R-point) 결정에 기여하는 것인, 폐암의 치료제 스크리닝 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스크리닝 방법에 의해 선별된 폐암의 치료제는 Runx3 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포와 병용 투여되는 것인, 폐암의 치료제 스크리닝 방법.
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