JP4283531B2 - マスト細胞の細胞死誘発剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＭＩＴＦ変異体を用いた医薬用途に関する。より詳細にはＭＩＴＦ変異体を構成要素とする融合蛋白質の医薬用途に関する。
【０００２】
【従来技術】
ＭＩＴＦ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒの略）は生体内に存在する転写制御因子の一種であり、マスト細胞に特有な、ｃ−ｋｉｔ遺伝子発現調節能を有する蛋白質である。
【０００３】
ＭＩＴＦは既知の物質である（非特許文献１）が、最初に見出されたのはＭＩＴＦをコードする遺伝子であった。すなわち、当該遺伝子は、ｍｉ／ｍｉマウスの原因遺伝子として単離された。ｍｉ／ｍｉマウスにおいては、ＭＩＴＦ遺伝子に突然変異、すなわちＭＩＴＦ遺伝子の転写活性化領域の１アミノ酸欠失が生じたため、正常なＭＩＴＦが発現されない。ｍｉ／ｍｉマウスは、眼球の形成不全、メラノサイトの欠損、マスト細胞の消失、骨大理石症を主な症状とする変異マウスであり、メラノサイト、マスト細胞、網膜色素上皮細胞、破骨細胞などの組織で分化異常を呈する。ｍｉ／ｍｉマウスにおけるこれらの細胞の分化異常は、正常ＭＩＴＦが発現されずＭＩＴＦによる遺伝子転写活性化が行われないことに起因する。
【０００４】
また、正常マウスの組織あるいは培養細胞株を用いたノザンブロットによる発現組織分布の解析で、ＭＩＴＦｍＲＮＡが、心臓、メラノサイト、マスト細胞で発現していることが認められた。近年では、ＭＩＴＦにはｃＤＮＡの５’末端の配列が異なるアイソフォーム、すなわちメラノサイト型（Ｍタイプ）、心臓型（Ｈタイプ）、Ａタイプが存在することが報告されている（非特許文献２）。ＭＩＴＦ遺伝子は１０個（Ｍタイプ）あるいは１１個（Ａ、Ｈタイプ）のエクソンから構成されており、エクソン２以降は３タイプ共ほぼ共通である。Ｍタイプにおいては、６アミノ酸をコードする１８塩基からなるエクソン５ｂの付加の有無によって、さらに２つのタイプに区別される。ＡとＨのタイプはエクソン１Ｂ以降が完全に一致しており、５’末端のエクソン１が異なる。Ａ、ＨタイプとＭタイプとは、エクソン２以降は共通であるが、Ｍタイプにはエクソン２の上流にエクソン１Ｂがなく、特異的なエクソン１がつながる。また、ゲノム配列からそれぞれのタイプのプロモーターは異なっていることが明らかになっている。
【０００５】
ＭＩＴＦ蛋白質は、核移行領域、転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域、二量体形成領域およびＭＩＴＦ自体の活性化領域からなることが推定されており、これら領域を含むことは既知の全てのタイプで共通である。ＭＩＴＦ蛋白質は、その構造の中央にｂＨＬＨ−Ｚｉｐ（ｂａｓｉｃ−ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ／ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ）を有する転写制御因子であり、二量体を形成してＤＮＡに結合し、対象となる遺伝子の転写を活性化する。ＡタイプとＨタイプの転写活性能には大きな差違があることが報告されており、両タイプ間で遺伝子配列の異なるエクソン１に、転写活性を制御する機能があると推測される。
【０００６】
また、ＭＩＴＦ蛋白質は、メラノサイトにおいては転写制御因子として作用し、メラノサイトの増殖分化、ならびにメラニン合成系等に関わっていることが報告されている。
【０００７】
マスト細胞においても、ＭＩＴＦ蛋白質はｃ−ｋｉｔ遺伝子発現を調節する転写制御因子（ｃ−ｋｉｔプロモーターを活性化する転写因子）として作用することが報告されている（非特許文献３）。ｃ−ｋｉｔ遺伝子は造血前駆細胞、マスト細胞、色素細胞、生殖細胞で発現されており、これら細胞の増殖分化を、Ｓｌ因子の作用により制御している。マスト細胞において、ＭＩＴＦ蛋白質は、ｃ−ｋｉｔ遺伝子発現を制御することによりマスト細胞の生存維持に関わっていると考えられる。
【０００８】
マスト細胞はアレルギー疾病に関与していることが古くから報告されている（非特許文献４）。また、アレルギー疾病以外にマスト細胞が関わる疾病として、自己免疫疾患、肺線維症、癌、マストサイトーシス、マストサイトーマ等が挙げられる。
【０００９】
一方、ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎの略）は、生体膜を貫通して蛋白質を細胞内に移行させる（取り込ませる）働きを有するドメインの総称である。例えば、ＨＩＶ抗原中のドメイン単位で分析したところ、ＴＡＴ由来ペプチドの部分が、ＨＩＶ抗原を正常なＴ細胞内に移行させる働きを有しており、これが細胞感染の一因であることが確認されている（非特許文献５）。こうした知見がベースとなって、ＴＡＴと同じような働きを有する各種ＰＴＤが存在すること、これらのＰＴＤと各種蛋白質を融合させることにより細胞内に移行させる手法が報告されている（非特許文献６）。
【００１０】
しかしながら、ＭＩＴＦあるいはマスト細胞に関して、ＰＴＤを利用して細胞内に移行させる技術については、今までのところ報告例は見出されていない。
【００１１】
【特許文献１】
国際公開第００／４７７６５号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第０１／６６７３５号パンフレット
【特許文献３】
特表２００１−５１３９８７号公報
【特許文献４】
特表２００２−５０５０７７号公報
【特許文献５】
特表平５−５０５１０２号公報
【特許文献６】
特表２００２−５１２８０８号公報
【非特許文献１】
セル（Ｃｅｌｌ）、１９９３年、７４巻、３９５〜４０４頁
【非特許文献２】
生化学、１９９９年、７１巻１号、６１〜６４頁
【非特許文献３】
ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、１９９６年、８８巻４号、１２２５〜１２３３頁
【非特許文献４】
ＩｇＥ，ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）１４７、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ出版社、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ．、１９８９年
【非特許文献５】
セル（Ｃｅｌｌ）、１９８８年、５５巻、１１７９〜１１８８頁
【非特許文献６】
カレント・オピニオン・イン・モレキュラ・セラピューティクス（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）２０００、２０００年、２巻２号、１６２〜１６７頁
【非特許文献７】
トレンズ・イン・ジェネティクス（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１９９５年、１１巻1１号、４４２〜４４８頁
【非特許文献８】
プロシーディング・ネイショナル・アカデミック・ソサイアティ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９８８年、８５巻、８９９８〜９００２頁
【非特許文献９】
カレント・プロトコールズ・イン・イムノロジー（ウィレイ）セクション［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ）Ｓｅｃｔｉｏｎ］７．２５．２
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＭＩＴＦ変異体を用いた新規な医薬用途を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の事情を考慮して研究を行った結果、ＭＩＴＦ変異体とＰＴＤを組合せることにより、マスト細胞の細胞死を誘発できることを見出して本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、ＰＴＤおよびＭＩＴＦ変異体から構成される融合蛋白質を有効成分とするマスト細胞の細胞死誘発剤；ＰＴＤおよびＭＩＴＦ変異体から構成される融合蛋白質を有効成分とするマスト細胞が関与する疾患の予防治療剤；ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤおよびＭＩＴＦ変異体から構成される融合蛋白質において、ＭＩＴＦ変異体がＭＩＴＦのｍｉ変異体、ｗｈ変異体、ＨＬＨ断片またはＡタイプのＮ末領域（１−３０５）断片であり、ＰＴＤがＴＡＴ由来ペプチドである、当該融合蛋白質；前記の融合蛋白質および製剤学的に許容しうる担体を含む医薬組成物；前記の融合蛋白質の製造方法において、遺伝子工学的手法を用いて融合蛋白質を産生する工程を含む、当該製造方法；前記の融合蛋白質をコードするＤＮＡ、に関するものである。以下の詳細を説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
Ａ．ＭＩＴＦ変異体
本発明で用いられるＭＩＴＦ変異体は、天然型（野生型）ＭＩＴＦの変異体であって、ＭＩＴＦ阻害活性を有するものであれば、特に限定されるものではない。具体的には、ＭＩＴＦのｍｉ変異体、ＭＩＴＦのｗｈ変異体、その他のＭＩＴＦ変異体、例えば、スプライシングバリアント（Ａ体、Ｈ体、Ｍ体、Ｎ体由来のいずれでも可）、あるいはＭＩＴＦの部分構造であってＭＩＴＦ阻害活性を有するもの、例えば、ｂＨＬＨ−Ｚｉｐ（Ｍ体のＮ末１９６番目から２８５番目まで）断片、その部分を含むＮ末側断片、Ａ体のＮ末領域（Ｎ末１番目から３０５番目まで）断片などが例示される。具体的には、非特許文献７、特許文献１、特許文献２などに開示されたＭＩＴＦ変異体などが挙げられる。特に好ましい変異体は、ｍｉ変異体、ｗｈ変異体、ｂＨＬＨ−Ｚｉｐ断片（以下、ＨＬＨ断片）、Ａ体のＮ末領域（１−３０５）断片である。これらのアミノ酸配列、塩基配列の関係は表１のとおりである。
【００１６】
【表１】
【００１７】
また、これらの変異体の構造類似体であっても、当該変異体と実質的に同程度のＭＩＴＦ阻害活性を有するものも本発明の範疇に含まれる。例えば、上述のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入または付加したものであって、当該変異体と実質的に同程度の活性を有するものであってもよい。
【００１８】
Ｂ．ＰＴＤ
本発明で用いられるＰＴＤは、細胞内に取り込まれる（移行する）性質を有するものであれば、特に限定されるものではなく、公知のものを利用できる。具体的には、前記の文献（非特許文献６）中の１６４頁表２に列挙された各種オリゴペプチド、特許文献３、特許文献４、特許文献５で開示されたＰＴＤ用の各種オリゴペプチドなどが例示される。より好ましいＰＴＤは、ＴＡＴ由来ペプチド（アミノ酸配列はＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号７、好ましい塩基配列は同８で各々示される）である。ＰＴＤはＭＩＴＦ変異体のＮ末側、Ｃ末側のいずれに結合していてもよい。また、結合は直接でもよく、架橋剤（リンカー）を介して間接的なものであってもよい。リンカーとしてはグリシン残基などが例示される。
【００１９】
Ｃ．その他の構成要素（ドメイン）
本発明の融合蛋白質は、精製用アフィニティクロマトにおけるリガンドに対して親和性を有するものを結合していてもよい。当該ドメインは特に限定されるものではなく、公知のものを利用することができる。このような関係にあるものとしては、抗原とその抗体、受容体とそのリガンド、Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）とＨｉｓＴａｇ、アビジン（またはストレプトアビジン）とビオチン、などが例示される。より好ましいのは、ＨｉｓＴａｇ（アミノ酸配列はＭＧＧＳＨＨＨＨＨＨ、配列番号９、好ましい塩基配列は同１０で各々示される）である。本ドメインは融合蛋白質のＮ末側、Ｃ末側のいずれに結合していてもよい。また、結合は直接でもよく、架橋剤（リンカー）を介して間接的なものであってもよい。リンカーとしてはグリシン残基などが例示される。
【００２０】
Ｄ．融合蛋白質の調製
本発明の融合蛋白質の調製方法としては、▲１▼融合蛋白質全体を、化学的合成手法を用いて合成する方法、▲２▼上記の各構成要素（ドメイン）を各々別個に調製した後に、化学的な反応手段を用いて結合する方法、▲３▼各構成要素をコードする遺伝子を連結した上で遺伝子工学的手法を用いて一気に融合蛋白質として発現させる方法などが例示される。▲２▼の場合、各構成要素の調製方法としては、化学的合成方法、細胞培養法、遺伝子工学的な手法を用いる方法などが挙げられる。ＰＴＤはＨＩＶ抗原からの切断・単離によっても調製することもできる。
【００２１】
例えば、融合蛋白質を遺伝子工学手法により調製する場合で説明する。
１）融合蛋白質をコードするＤＮＡを調製する。当該調製は常法により行われる。まず、ＭＩＴＦ変異体をコードする遺伝子を調製する。当該遺伝子の調製は、適当な細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で増幅することにより得ることができる。具体的には、ｍＲＮＡの抽出は、市販のｍＲＮＡ抽出用キットなどを用いて行い、逆転写、ｃＤＮＡ合成および増幅は、市販のｃＤＮＡ増幅キットなどを用いた５’−ＲＡＣＥ法（非特許文献８）または適当なプライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法などにより行うことができる。また、適当な細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、当該遺伝子をＰＣＲで増幅して得ることもできる。また、公知の報告例、例えば、上述の非特許文献１、特許文献２で開示されたＭＩＴＦをコードする遺伝子を利用することもできる。例えば、本発明のＨＬＨ断片はＭＩＴＦのＭタイプから、ＡタイプのＮ末領域（１−３０５）断片はＭＩＴＦのＡタイプ（ＭＩＴＦ Ａ／ｐＣＤＮＡ３）から、各々調製することかできる。
【００２２】
次いで、ＰＴＤをコードする遺伝子を上記と同様の方法により調製し、ＭＩＴＦ変異体をコードする遺伝子と連結する。ＨｉｓＴａｇについても同様である。また、ＨｉｓＴａｇを担持する市販のプラスミド（ｐＴｒｃＨｉｓＢ、インビトロジェン社）を用いて、ＰＴＤ−ＭＩＴＦ変異体からなる融合蛋白質をコードするＤＮＡを挿入することにより、本発明の融合蛋白質をコードするＤＮＡを調製することができる。
【００２３】
２）ＤＮＡを適当なベクターに組込んで発現用ベクターを調製する。当該ベクターは特定のプロモーターの制御下に融合蛋白質を発現するために用いる。その組込みは常法により行われる。
【００２４】
上記得られた目的のＤＮＡを精製し、ベクターＤＮＡに導入して、宿主・ベクター系を構築することができる。宿主・ベクター系は一般に宿主細胞とコンパチブルな種に由来するレプリコンと、当該宿主を組合せて使用する。ベクターＤＮＡは、複製起点、プロモーター、制御配列（エンハンサー）、シグナル配列、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス配列、ポリＡ付加部位、転写終結配列（ターミネーター）などを有する。また、形質転換細胞中で表現型の選択が可能となるマーカーの配列を有していてもよい。ベクターＤＮＡとしては、例えば、染色体、エピソーム由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来のベクター、またはバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、などのウイルス由来のベクター、あるいはコスミドおよびファージミドなどが挙げられる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクターなどを用いることができる。
【００２５】
プロモーターは公知のものが挙げられ、発現のための宿主に合わせて選択することができる。例えば、大腸菌を宿主とする場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター（ｔｒｐプロモーターの−３５領域とｌａｃプロモーターの−１０領域を連結した合成プロモーター）、Ｔ７プロモーターなどのプロモーターが例示される。また、当該発現ベクターはａｍｐ ｒなどのマーカー遺伝子を担持していてもよい。
【００２６】
ベクターＤＮＡに本発明に係るＤＮＡを組み込む方法は、自体公知の方法を適用し得る。例えば、適当な制限酵素を選択し、処理して目的のＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的のＤＮＡに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。また、宿主に導入するベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、目的とする蛋白質の製造が可能である。
【００２７】
３）発現用ベクターを宿主に導入して形質転換体を調製する。形質転換は常法により行われる。宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞などを用いることができる。好ましくは大腸菌である。また、栄養要求性株、抗生物質感受性株を宿主とすることもできる。
【００２８】
形質転換体を調製する方法としては、プラスミドを直接宿主細胞内に導入する方法、プラスミドを染色体上に組込む方法などが挙げられる。前者としては、プロトプラストポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法などが例示される。後者としては、宿主染色体中に存在する遺伝子の一部のＤＮＡ配列をプラスミドに含有させて、その相同な配列部分を利用して、プラスミドまたはその線状断片を相同組換えにより宿主染色体上に導入することができる。
【００２９】
４）形質転換体を培養し、融合蛋白質を産生する。培養は常法により宿主に応じて適用な培地、培養条件（温度、時間など）を用いて行われる。大腸菌を用いる場合の培養条件としては通常、１５〜４３℃（好ましくは３０〜３７℃）程度で、１〜１００時間程度行う。また、必要に応じて通気や攪拌を加えることもできる。培養形式としては、回分培養、半回分培養（フェッド・バッチ培養）、連続培養のいずれであってもよい。
【００３０】
５）産生された融合蛋白質を精製する。宿主として大腸菌を用いた場合はまず菌体を超音波粉砕等の処理により当該蛋白を可溶化する。産生された融合蛋白質の精製は自体公知の手法により行うことができる（特許文献６など）。例えば、Ｎｉカラムを用いる方法、陰イオン交換体処理、透析処理などが例示される。また、本発明の融合蛋白質は変性剤（カオトロピック剤）処理後に変性剤を除去して得られたものを用いることが好ましい。変性剤としては尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸塩などが例示される。変性剤処理時の変性剤の添加条件としては、濃度１〜１０Ｍ程度が例示される。具体的には融合蛋白質と変性剤を接触させて処理した後に、変性剤の共存下にＮｉカラムを用いて処理を行い、さらに陰イオン交換体または透析処理により変性剤を除去する操作を行って、当該融合蛋白質を精製する。
【００３１】
Ｅ．調製された融合蛋白質の性状
本発明の融合蛋白質は、細胞内、特にマスト細胞内に移行する性質を有するものである。好ましくは、ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤおよびＭＩＴＦ変異体から構成される。このものは１０〜１００キロダルトン（ｋＤａ）程度の分子量を有する。好適には、Ｎ末側からみて、ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤ、ＭＩＴＦ変異体の順番に並んだものである。具体的な配列としては、表２に示すとおりである。
【００３２】
【表２】
【００３３】
Ｆ．製剤化
本発明の融合蛋白質の製剤化には、自体公知の手法を用いることができる。例えば融合蛋白質に、製剤学的に許容しうる担体を添加あるいは混合すればよい。製剤化により得られた医薬組成物において、融合蛋白質の濃度として０．１〜１００μｇ／ｍＬまたは０．１〜１００ｎＭ程度が例示される。
【００３４】
Ｇ．用途
本発明のＭＩＴＦ変異体（または、それを用いた融合蛋白質）はマスト細胞内に移行することにより内在性ＭＩＴＦの活性を阻害する、前駆細胞からのマスト細胞の分化を阻害する、マスト細胞の生存を阻害する、成熟マスト細胞に細胞死（アポトーシス）を誘導する、などの作用を有する。従って、本発明の製剤は、マスト細胞が関与する各種疾患の予防・治療に有用であることが期待される。当該疾患としては、例えば、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、肺線維症、癌、マストサイトーシス、マストサイトーマ等が挙げられる。
【００３５】
Ｈ．用法・用量
本発明の融合蛋白質の用法・用量としては、生体内において０．００１〜１０μｇ／ｍＬ程度の濃度で存在するように、投与量を選択すればよい。あるいは投与量として、１０μｇ〜５０ｍｇ程度が例示される。投与経路としては、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、気道内投与などが例示される。
【００３６】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために実施例、製剤例および実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３７】
実施例１
１）融合蛋白質発現プラスミドの構築
発現プラスミドは、大腸菌用発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（インビトロジェン社、Ｎｏ．Ｖ３６０−２０）のＨｉｓＴａｇ配列の上流に存在するＮｃｏＩサイトとマルチクローニングサイト中のＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に、精製用のＨｉｓＴａｇの下流にＰＴＤ配列が接続し、その下流にＭＩＴＦ変異体のｃＤＮＡを接続したＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦ変異体の遺伝子を挿入することにより構築した。図１を参照のこと。
【００３８】
ＭＩＴＦのｃＤＮＡへのＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤ配列の付加はＰＣＲ法を用いて行った。まず、ＭＩＴＦ ＭタイプのｃＤＮＡ（ｐＳＵ０５４、ＭＩＴＦ−Ｍ／ｐＴ７ Ｂｌｕｅ）を鋳型にして、ＭＩＴＦおよびＢａｍＨＩサイトを含む上流部分をＰＣＲ法により増幅した。さらに４種類のプライマー（Ｍ−ｔａｔ、Ｔａｔ３、Ｔａｔ ２、Ｔａｔ １）を用いてＭＩＴＦの転写開始コドンの上流にＨｉｓＴａｇと制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を付加するまで伸長させた後に、大腸菌用発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（このものはｌａｃ Ｐ／ＯおよびＡｍｐ ｒを担持してなる）のＮｃｏＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間にクローニングした。
【００３９】
各プライマーは以下の塩基配列を有する。
Ｍ−ｔａｔ（配列番号１７）： ＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧＣＴＡＧＡＡＴＡＣＡＧＴＣＡＣＴＡＣＣ
Ｔａｔ ３（配列番号１８）： ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧ
Ｔａｔ ２（配列番号１９）： ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧ
Ｔａｔ １（配列番号２０）： ＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧ
【００４０】
次いで、Ｍタイプ（ｐＳＵ０５４）、ｍｉ変異体（ｐＳＵ０６１、ＭＩＴＦ−Ｍｍｉ／ｐＴ７ Ｂｌｕｅ）、ｗｈ変異体（ｐＳＵ０６２、ＭＩＴＦ−Ｍ ｗｈ／ｐＴ７ Ｂｌｕｅ）をそれぞれＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ消化することにより、ＭＩＴＦｃＤＮＡの下流部分を単離した。この部分に変異部分も含まれる。単離したｃＤＮＡ断片を、上流部分をクローニングしたプラスミドのＢａｍＨＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に挿入した。プラスミドｐＳＵ８１は正常型ＭＩＴＦであるＭタイプを含む融合蛋白質の遺伝子を挿入したものである。ｐＳＵ０８２はｍｉ変異体を、ｐＳＵ０８３はｗｈ変異体を含む融合蛋白質を各々挿入したものである。
【００４１】
２）融合蛋白質の発現
構築した発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５α（東洋紡）に導入し形質転換した。５０ｍＬのＬ−Ｂｒｏｔｈ（５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に、大腸菌を１白金耳量となるように植菌し、３７℃で１７時間培養した。さらに、１ＬのＬ−Ｂｒｏｔｈ（５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび０．２％のグルコースを含む）に、培養液を１％となるように植菌した。Ａ６００の濁度が約０．１となるまで３７℃で培養した後に、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度０．４ｍＭとなるように添加した。２時間培養後に大腸菌を集菌した。
【００４２】
３）融合蛋白質の精製
大腸菌を遠心分離にて回収し、８Ｍの尿素、０．１Ｍの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０、ｐＨは以下同様）中で超音波粉砕し可溶化した。得られたＬｙｓａｔｅを８Ｍの尿素、０．１Ｍの塩化ナトリウム、１０ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）カラムにアプライし、同緩衝液で洗浄した。カラムに結合した蛋白をＡ液として同緩衝液、Ｂ液として２００ｍＭのイミダゾールを含む同緩衝液を用いたイミダゾールの濃度直線勾配法で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｔｅｆｃｏ社）で解析して目的の分子量を示す画分をプールした。
【００４３】
溶出液１容量に対して、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を１容量、４Ｍの尿素を含む同緩衝液を２容量、各々添加して希釈した溶液を、４Ｍの尿素、２５ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化した四級アンモニウム塩型強陰イオン交換体（商品名Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ファルマシア社）にアプライし、同緩衝液で洗浄した。次に、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄して尿素を除去した後に、１Ｍの塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムに結合した蛋白を溶出した。溶出した融合蛋白質は１０％グリセロールを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（等張化リン酸緩衝液）に対して透析した後に分注して−８０℃で保存した。
【００４４】
得られた最終産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、還元条件下で約５０キロダルトンの分子量を示すバンドが観察された。このバンドはウサギ抗ＭＩＴＦ抗体と反応した。なお、このウサギ抗ＭＩＴＦ抗体は、ウサギにＭＩＴＦのＣ末２０アミノ酸残基のペプチドを免疫して得られた抗血清を、同ペプチドを結合したカラムを用いてアフィニティ精製を行うことにより、同ペプチドを特異的に認識する抗体を調製したものである。
【００４５】
製剤例１
本発明の融合蛋白質、および、１０％グリセロールを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳからなる組成物を調製した。
【００４６】
実験例１
１）まず、本発明の融合蛋白質が細胞内に移行しているかどうかを確認した。実施例１で調製したＭＩＴＦ変異体の融合蛋白質をＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソチオシアネート）で常法により蛍光標識し、ＣＯＳ７細胞に添加した。添加１時間後にＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ） Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディキンソン社）を用いて、蛍光強度を測定した。その結果を表３に示す。
【００４７】
【表３】
【００４８】
表３から明らかなように強い蛍光が細胞に会合（アソシエート）していることが観察され、当該融合蛋白質が細胞内に効率よく移行していることが確認された。
【００４９】
２）本発明の融合蛋白質が細胞内に移行して内在性ＭＩＴＦの活性を阻害するか調べる目的でルシフェラーゼ分析を行った。
【００５０】
発現用プラスミドとして、正常ＭＩＴＦ発現用プラスミドｐＳＵ０６３（ＭＩＴＦ−Ｍ／ｐＣＤＮＡ３）、ｃ−ｋｉｔ遺伝子プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を接続したプラスミドを調製するための各種ベクター、すなわち、Ｃ−ｋｉｔ−Ｒｌｕｃ発現用ベクターｐＳＵ０５３（Ｃ−ｋｉｔ／Ｒ−ｌｕｃ）、ルシフェラーゼ発現用ベクターｐＧＬ２（Ｌｌｕｃ、プロメガ社）を用いた。各プラスミドを、ＣＯＳ７細胞に導入（トランスフェクト）した。その条件は以下のとおり。プラスミドの使用量は、６ｃｍのディッシュ当たり３μｇ（ｐＳＵ０６３：ｐＳＵ０５３：ｐＧＬ２＝１：１：０．１）。プラスミドの導入にはトランスフェクションキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、＃２００３８５）を用いた。
【００５１】
６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０５個の細胞を植え込み、１７時間ＣＯ２インキュベータに静置した。１０μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ １（前記キットに添付されている試薬。２．５Ｍ ＣａＣｌ２からなる）に９０μＬの蒸留水と３μｇのＤＮＡを添加した後に、等量のＳｏｌｕｔｉｏｎ ２［前記キットに添付されている試薬。２×ＰＢＳ（ｐＨ６．９５）からなる］を加え、室温で２０分間静置した。混合したＤＮＡ溶液を培養液に添加した。２４時間後に上記の培地を交換し、１μｇ／ｍＬの本発明の融合蛋白質（実施例１で調製）を添加した。
【００５２】
本発明の融合蛋白質の添加４８時間後に細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、６穴のディシュ当たり０．５ｍＬのｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを添加し、スクレーバーを用いて細胞を掻き採った。細胞を１．５ｍＬ容のチューブに移し、１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。ルシフェラーゼ活性の測定は、Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（プロメガ社）を用いて行った。９６穴プレート上で２０μＬの遠心上清に、１００μＬのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩを添加・混合し、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。さらに混合液に１００μＬのＳｔｏｐ＆Ｇｏ Ｒｅａｇｅｎｔを添加・混合し、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ−ｌｕｃ）活性を測定した。Ｒ−ｌｕｃの数値をｐＧＬ２で補正後、ＰＢＳ添加におけるＲ−ｌｕｃを１としたときの値に換算した。その結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
【００５４】
なお、表中のｍｉはＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｍｉ変異体からなる融合蛋白質、ｗｈはＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｗｈ変異体からなる融合蛋白質、を各々示す。
【００５５】
ＣＯＳ細胞が発現するルシフェラーゼ活性も本発明の融合蛋白質存在下で阻害され、当該融合蛋白質が細胞内に移行して内在性ＭＩＴＦを阻害することが示唆された。
【００５６】
実験例２
本発明の融合蛋白質がＳＣＦで誘導されるマスト細胞の分化系にどのように影響するかを確認した。
【００５７】
正常マウスから骨髄細胞を調製し、その２×１０６個／穴を、１０％のＦＣＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、２μｇ／ｍＬの本発明の融合蛋白質（ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｗｈ変異体）を含むＲＰＭＩ１６４０中で骨髄細胞因子（ＳＣＦ、ＩＢＬ社）５０〜１００ｎｇ／ｍＬの存在下に２４穴プレートにて培養した。週に一度培地を半量交換し、その際にＳＣＦも添加した。３７℃で２１日間培養した後に、マスト細胞数、ｃ−ｋｉｔおよびＩｇＥ受容体の発現量を測定した。
【００５８】
マスト細胞数の測定はトルイジン青染色法によった。トルイジン青染色は非特許文献９に従い、ｐＨ２．７の染色液を用いて行った。
【００５９】
ｃ−ｋｉｔの発現量の測定はＦＡＣＳを用いて行った。細胞を、０．１％のＮａＮ３、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ１００μＬに懸濁し、５〜１０μｇ／ｍＬのＲ−ＰＥ（Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）あるいはＲ−ＰＥ標識ラットＩｇＧ２Ｂ，ｋ ｉｓｏｔｙｐｅ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）と氷中で１時間インキュベーションした。洗浄後に１μｇ／ｍＬのヨウ化ピリジウムを添加して、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（前記）で解析した。ＩｇＥ受容体の発現量の測定は、５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識マウスＩｇＥを用いて同様にＦＩＴＣによる解析を行った。マスト細胞数に関する結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】
【００６１】
本発明の融合蛋白質の添加群では、培養２１日目でマスト細胞数が未添加群に比べて１０分の１以下に減少していた。また、ｃ−ｋｉｔの発現に関する培養２１日目の結果を表６に示す。
【００６２】
【表６】
【００６３】
本発明の融合蛋白質の添加群では、培養２１日目でｃ−ｋｉｔの発現量が未添加群に比べて１０分の１以下に減少していた。また、ＩｇＥ受容体の発現量は変化がなかった（実験データは示さず）。このように本発明の融合蛋白質はマスト細胞前駆細胞のＳＣＦ受容体ｃ−ｋｉｔの発現を特異的に阻害し、その結果、マスト細胞の分化を強く阻害することが確認された。
【００６４】
実験例３
本発明の融合蛋白質の、成熟マスト細胞への影響を確認する目的で、線維芽細胞との共培養系でのマスト細胞生存への影響を確認した。
【００６５】
正常マウスから脾細胞を調製し、１０％のＦＣＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０中でＩＬ−３（ＧＥＮＺＹＭＥ社）またはＷＥＨＩ−３細胞ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地（ＷＥＨＩ−３ＣＭ）存在下に３週間以上培養して、脾臓由来培養マスト細胞（ＳＭＣ）を得た。６穴プレートに線維芽細胞のＮＩＨ−３Ｔ３（理研セルバンク）をコンフルエントまで培養し、当該ＳＭＣをＩＬ−３およびＷＥＨＩ−３ＣＭを含まず、かつ、１μｇ／ｍＬの本発明の融合蛋白質を含む、上記の培地に懸濁し、３×１０５個で播種した。２〜３日ごとに新鮮培地に交換した。３７℃で１５日間培養した後に、マスト細胞数、ヒスタミン量およびキマーゼ活性を測定した。各種実験系を表７に示す。
【００６６】
【表７】
【００６７】
ヒスタミンの定量はＲＩＡ法（栄研化学）によった。顆粒中のキマーゼ活性の測定は特異的な合成基質であるＮ−サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（シグマ社）を用いて行った。結果を表８に示す。
【００６８】
【表８】
【００６９】
線維芽細胞と正常マスト細胞を共培養するとマスト細胞は長期間生存し続けた。また、ＭＩＴＦに異常を持つ人為的に作成したｍｉマスト細胞（ｍｉ／ｍｉＳＭＣ、天然には存在しない）は線維芽細胞との共培養においてアポトーシスにより２週間以内に死滅した。正常マスト細胞と線維芽細胞の共培養に本発明の融合蛋白質（ｍｉ変異体型、ｗｈ変異体型）を添加すると、マスト細胞の生存は阻害され、ｍｉマスト細胞と同様に２週間後にはほとんどが死滅した。マスト細胞数の低下は、ヒスタミン量の低下およびキマーゼ活性の低下によっても確認された。この結果、本発明の融合蛋白質は、成熟マスト細胞にアポトーシスを誘導することが示唆された。
【００７０】
実験例４
本発明の融合蛋白質の添加濃度における影響を調べた。ＭＣ／９マスト細胞株（ＡＴＣＣより入手）をＦＩＴＣ標識したＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｗｈ変異体からなる融合蛋白質の存在下または非存在下に、ＦＡＣＳ染色緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ）中で氷上１時間インキュベートした。洗浄後にヨウ化ピリジウムを添加して死細胞をゲートアウトし、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（前記）で解析した。結果を表９に示す。
【００７１】
【表９】
【００７２】
表９の結果から、本発明の融合蛋白質の添加濃度に依存して、当該融合蛋白質が細胞内により高濃度で移行していることが判明した。
【００７３】
実施例２： ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＨＬＨ
１）発現ベクターの構築
発現ベクター作成の鋳型としては正常型のＭＩＴＦのＭタイプ（ｐＳＵ０５４）を用いた。ＨＬＨ断片はＭタイプのＮ末１９６番目から２８５番目のアミノ酸までの領域をＰＣＲ法により増幅した。増幅断片のＮ末側には、プライマー（Ｔａｔ１、Ｔａｔ２、Ｔａｔ３およびＨＬＨ Ｆ）を用い、ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤと制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を付加した。またＣ末側には制限酵素ＸｂａＩの認識配列を付加した。増幅断片をＮｃｏＩ＋ＸｂａＩで消化し、実施例１で作成したｐＳＵ０８１のＮｃｏＩ−ＸｂａＩ領域と置換した。当該増幅断片をＴＡクローニングし塩基配列が正しいことを確認した。構築したベクターｐＳＵ０８５はｌａｃプロモーター、ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＨＬＨ領域の融合蛋白質のＤＮＡ、ａｍｐ ｒから構成される（図２）。
【００７４】
プライマーＨＬＨ Ｆは以下の塩基配列を有する。
ＨＬＨ Ｆ（配列番号２５）：ＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧＴＴＧＧＣＴＡＡＡＧＡＧＡＧＧ
２）実施例１に準じて融合蛋白質を産生・精製した。
【００７５】
実施例３： ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのＡタイプＮ末領域
１）発現ベクターの構築
ｐＳＵ０６４（ＭＩＴＦのＡタイプ／ｐＣＤＮＡ３、特許文献２を参照のこと）を鋳型に、２種類のプライマー（ｐＴＤ３−ＭＩＴＦａ、ＭＩＴＦＲ−Ｎ）を用いてＰＣＲを行い、Ｎ末領域（Ｎ末１番目から３０５番目までのアミノ酸）を増幅した。ｐＴＤ３−ＭＩＴＦａの５’末端にはＳａｃＩＩサイトを、ＭＩＴＦＲ−Ｎの５’末端にはＥｃｏＲＩサイトを付加した。増幅断片をＳａｃＩＩ＋ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＳＵ０９３（ｐＴｒｃＨｉｓを基本骨格とするＰＴＤカセット発現ベクター）の同サイト間に挿入した（図３）。構築した発現ベクターｐＳＵ０８７は、ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＡタイプのＮ末領域の順にＤＮＡ断片がつながり、ｌａｃプロモーターの制御下に融合蛋白質が発現する。
【００７６】
各プライマーは以下の塩基配列を有する。
ｐＴＤ３−ＭＩＴＦａ（配列番号２６）： ＣＧＣＣＧＣＧＧＡＡＴＧＣＡＧＴＣＣＧＡＡＴＣＧＧＧＡＡＴＣ
ＭＩＴＦＲ−Ｎ（配列番号２７）： ＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＧＧＧ
【００７７】
２）実施例１に準じて融合蛋白質を産生した後、これを精製する際に、Ｎｉ−アガロースの代わりにＴＡＬＯＮ（商品名、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて行った。精製物は１０％グリセロール／ＰＢＳ溶液として調製した。
【００７８】
実施例４： ｐＥＴ１４ｂを用いた発現ベクターの構築
ｐＳＵ０８３（ｗｈ系）のＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ断片とｐＥＴ１４ｂ（Ｔ７プロモーター、ＨｉｓＴａｇ、ａｍｐ ｒを連結してなる。Ｔａｋａｒａ）の同領域を置換して発現ベクターｐＳＵ１２１を構築した（図４）。このｐＳＵ１２１はＴ７プロモーターの下流に、ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤ配列、ＭＩＴＦのｗｈタイプがつながり、大腸菌の菌体内において、Ｔ７プロモーターの制御下に融合蛋白質（ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｗｈタイプ）を発現する。
【００７９】
実施例１に従い、大腸菌をフラスコで培養し、融合蛋白質（ｗｈ系）を産生した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを用いた精製を実施例１に準じて行った後に、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｄｉａｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて透析し脱尿素処理を行った。溶媒としては２９０ｍＭソルビトール、１０μＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）を用いた。培養液１Ｌ当たり約１０ｍｇの融合蛋白質が精製された。
【００８０】
実施例５： 精製工程（ＨＬＨ）
融合蛋白質（ＨＬＨ系、実施例２により調製）をＱ−セファロースカラムから１Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）で溶出し、回収した画分を、使用前にＰＤ−１０カラム（ファルマシア）を用いてＰＢＳに置換した。
【００８１】
実施例６： 高密度培養（ｗｈ系）
発現ベクターｐＳＵ０８３を大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、形質転換体を調製した。ＥＢＭ００１００１０培地（アンピシリン添加）を用いてジャーファーメンターで３７℃１６時間培養し、融合蛋白質を産生した。精製は実施例１に準じて行った。
【００８２】
実施例７： 高密度培養（ＨＬＨ）
ｐＳＵ０８５を用いて実施例６に準じて融合蛋白質を産生した。精製を実施例１に準じて行うに際し以下の点を変更した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース処理時に８Ｍ尿素の代わりに６Ｍ塩酸グアニジンを用いたこと、陰イオン交換体処理の代わりに分子量３０００カット膜を用いて濃縮した後に、０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）で平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマシア）で脱塩したこと。０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に対して透析し分注して−８０℃で保存した。インビボで使用する際にはＮａＣｌ濃度を０．１５Ｍとなるように希釈して用いた。
【００８３】
製剤例２
融合蛋白質、１０％グリセロール、ＰＢＳからなる組成物を調製した。
【００８４】
製剤例３
融合蛋白質、０．１５〜１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４〜８）溶液として調製した。
【００８５】
実験例５（精製結果）
各種融合蛋白質（実施例１〜３により調製）を大腸菌菌体より精製し、その分子量、収量（４Ｌフラスコ培養当たり）を表１０に示した。なお、融合蛋白質（ＡタイプのＮ末領域）の分子量は３７ｋＤａであった。
【００８６】
【表１０】
【００８７】
実験例６（インビトロ阻害）
実験例３に準じて実験した。１０ｎＭの融合蛋白質を１７日間作用させた後にマスト細胞数、ヒスタミン、トリプターゼ、キマーゼを測定した。結果を表１１に示す。
【００８８】
【表１１】
【００８９】
表中の数値は平均±標準偏差を示す。また＊＊は溶媒群との間に、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で有意差があることを示す。また＊は同じくｐ＜０．０１で有意差があることを示す。以下同様。
【００９０】
実験例７（同上）
実験例３に準じて実験した。２０ｎＭの融合蛋白質を１５日間作用させた後にマスト細胞比率を測定した。結果を表１２に示す。本発明の融合蛋白質はマスト細胞の生存を抑制した。
【００９１】
【表１２】
【００９２】
実験例８（同上）
１）実験例２に準じて実験を行った。マウス骨髄細胞（２×１０６／ウェル）をＳＣＦの存在下に融合蛋白質を添加して２８日間培養したときのマスト細胞数を求めた。例数は３とした。結果を表１３に示す。
【００９３】
【表１３】
【００９４】
２）実験は１）に準じて行った。融合蛋白質の添加濃度は２．５ｎＭとした。ヒスタミン濃度、キマーゼ活性を求めた。結果を表１４に示す。
【００９５】
【表１４】
【００９６】
３）実験は１）と同様に行った。融合蛋白質の添加濃度は２．５〜２０ｎＭとした。細胞数とキマーゼ活性を求めた。例数は２とした。結果を表１５に示す。
【００９７】
【表１５】
【００９８】
実験例９（ヒトマスト細胞への作用）
１）ヒトＣＤ３４陽性骨髄細胞（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）２×１０４／ウェルを、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（１０ｎｇ／ｍｌ）、融合蛋白質（ＨＬＨ系）を添加した培養液を週に一度、半量交換しながら９週間培養し、細胞数、回収した細胞についてｌｙｓａｔｅ中のキマーゼ活性、ヒスタミン含量を測定した。培養液は５％ＦＣＳを含むＭｅｄｉａＩ（免疫生物研究所）を用いた。例数は３とした。その結果、本発明の融合蛋白質はヒトマスト細胞分化を阻害した（表１６）。
【００９９】
【表１６】
【０１００】
２）ヒトＣＤ３４陽性骨髄細胞を１）に準じてサイトカインの存在下に８週間培養し、途中まで分化した未成熟なマスト細胞を調製した。細胞を一旦回収、遠心洗浄し、新しくプレートに培養液中で７×１０５／ウェルずつ播種し、融合蛋白質（ＨＬＨ系を１０または５０ｎＭ添加）を添加した同培養液（前記のサイトカインを含む）を用いて培養を継続した。週に一度培養液を半量交換した。培養２週間後に細胞数、キマーゼ活性、ヒスタミン含量を測定した。また当該細胞をＰＥ標識抗ｃ−ｋｉｔ抗体（あるいはＰＥ標識対照抗体）で染色し、ＦＡＣＳで解析した。その結果、本発明の融合蛋白質は未成熟マスト細胞に作用してｃ−ｋｉｔ発現を阻害し、ヒトマスト細胞の成熟を阻害した（表１７）。
【０１０１】
【表１７】
【０１０２】
３）ヒトＣＤ３４陽性骨髄細胞を１）に準じてサイトカインの存在下に１２週間培養し、分化完了した成熟なマスト細胞を調製した。細胞を一旦回収、遠心洗浄し、新しくプレートに培養液中で２．４×１０４／ウェルずつ播種し、融合蛋白質（ＨＬＨ系を２、１０または５０ｎＭ添加）を添加した同培養液（前記のサイトカインを含む）を用いて培養を継続した。週に一度培養液を半量交換した。培養３週間後に細胞数、ヒスタミン含量を測定した。その結果、本発明の融合蛋白質は濃度依存的にヒスタミン含量を低下させ、成熟ヒト骨髄培養マスト細胞の機能を抑制した（表１８）。
【０１０３】
【表１８】
【０１０４】
実験例１０（インビボ阻害）
１）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに融合蛋白質（ｗｈ系）６０μｇを２００μＬのＰＢＳ中で週３回４週間まで腹腔内投与した。最終投与の翌日に腹腔細胞を回収し、以下の項目を測定した。例数は４とした。投与４週間の結果を表１９に示す。
【０１０５】
総細胞数： コールターカウンターまたは血球計数装置により測定した。
マスト細胞： スメア標本をトルイジンブルーで染色し、陽性の比率を算出した。
ヒスタミン： 腹腔細胞懸濁液にトリトンＸ１００を添加してＬｙｓａｔｅを調製し、ＬｙｓａｔｅについてＥＬＩＳＡキットにより測定した。
ｃ−ｋｉｔおよびＩｇＥ受容体両陽性細胞： 回収した腹腔細胞をＰＥ標識抗ｃ−ｋｉｔ抗体およびマウスＩｇＥ／ビオチン標識抗ＩｇＥ抗体／ＡＰＣ標識ストレプトアビジンで二重染色しＦＡＣＳで解析した。
【０１０６】
【表１９】
【０１０７】
２）１０または５０μｇの融合蛋白質（ｗｈ系、いずれも２００μＬベヒクル中で）をマウス腹腔内に２週間投与した。例数は１０とした。１）と同様にして各項目を測定した。結果を表２０に示す。
【０１０８】
【表２０】
【０１０９】
３）１０μｇの融合蛋白質（ＨＬＨ系）を３５０μＬベヒクル中でマウス腹腔内に１３日間投与した。マスト細胞数、ヒスタミン含量の測定は１）に準じて行った。結果を表２１に示す。
【０１１０】
【表２１】
【０１１１】
本発明の融合蛋白質（ｗｈ系、ＨＬＨ系）はいずれの実験系においてもインビボでマスト細胞数を減少させた。
【０１１２】
【発明の効果】
本発明によれば、ＭＩＴＦ変異体を用いて、マスト細胞の細胞死を誘発することができる。よって、マスト細胞が関与する各種疾患の予防・治療に有用な薬剤を臨床の場に提供することができる。
【０１１３】
【配列表】
配列表配列番号１：ＭＩＴＦのｍｉ変異体のアミノ酸配列
配列表配列番号２：その塩基配列
配列表配列番号３：ＭＩＴＦのｗｈ変異体のアミノ酸配列
配列表配列番号４：その塩基配列
配列表配列番号５：ｂＨＬＨ−Ｚｉｐ断片のアミノ酸配列
配列表配列番号６：その塩基配列
配列表配列番号７：ＴＡＴ由来ペプチドのアミノ酸配列
配列表配列番号８：その塩基配列
配列表配列番号９：ＨｉｓＴａｇのアミノ酸配列
配列表配列番号１０：その塩基配列
配列表配列番号１１：ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｍｉ変異体からなる融合蛋白質のアミノ酸配列
配列表配列番号１２：その塩基配列
配列表配列番号１３：ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｗｈ変異体からなる融合蛋白質のアミノ酸配列
配列表配列番号１４：その塩基配列
配列表配列番号１５：ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｂＨＬＨ−Ｚｉｐ断片からなる融合蛋白質のアミノ酸配列
配列表配列番号１６：その塩基配列
配列表配列番号１７：プライマーＭ−Ｔａｔの塩基配列
配列表配列番号１８：プライマーＴａｔ ３の塩基配列
配列表配列番号１９：プライマーＴａｔ ２の塩基配列
配列表配列番号２０：プライマーＴａｔ １の塩基配列
配列表配列番号２１：ＭＩＴＦのＡタイプＮ末領域（１−３０５）のアミノ酸配列
配列表配列番号２２：その塩基配列
配列表配列番号２３：ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのＡタイプＮ末領域（１−３０５）からなる融合蛋白質のアミノ酸配列
配列表配列番号２４：その塩基配列
配列表配列番号２５：プライマーＨＬＨ Ｆ
配列表配列番号２６：プライマーｐＴＤ３−ＭＩＴＦａ
配列表配列番号２７：プライマーＭＩＴＦＲ−Ｎ
【０１１４】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の融合蛋白質（ｍｉ系、ｗｈ系）および当該融合蛋白質を発現するプラスミドｐＳＵ０８２（ｍｉ系／ｐＴｒｃＨｉｓＢ）、ｐＳＵ０８３（ｗｈ系／ｐＴｒｃＨｉｓＢ）の構造を概略的に示したものである。
【図２】本発明の融合蛋白質（ＨＬＨ系）および当該融合蛋白質を発現するプラスミドｐＳＵ０８５（ＨＬＨ系／ｐＴｒｃＨｉｓＢ）の構造を概略的に示したものである。
【図３】本発明の融合蛋白質（ＡタイプＮ末領域）を発現するプラスミドｐＳＵ０８７（ＡタイプＮ末領域／ｐＳＵ０９３）の構築手順を概略的に示したものである。
【図４】本発明の融合蛋白質（ｗｈ系）を発現するプラスミドｐＳＵ１２１（ｗｈ系／ｐＥＴ１４）の構築手順を概略的に示したものである。
【発明の属する技術分野】
本発明はＭＩＴＦ変異体を用いた医薬用途に関する。より詳細にはＭＩＴＦ変異体を構成要素とする融合蛋白質の医薬用途に関する。
【０００２】
【従来技術】
ＭＩＴＦ（ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒの略）は生体内に存在する転写制御因子の一種であり、マスト細胞に特有な、ｃ−ｋｉｔ遺伝子発現調節能を有する蛋白質である。
【０００３】
ＭＩＴＦは既知の物質である（非特許文献１）が、最初に見出されたのはＭＩＴＦをコードする遺伝子であった。すなわち、当該遺伝子は、ｍｉ／ｍｉマウスの原因遺伝子として単離された。ｍｉ／ｍｉマウスにおいては、ＭＩＴＦ遺伝子に突然変異、すなわちＭＩＴＦ遺伝子の転写活性化領域の１アミノ酸欠失が生じたため、正常なＭＩＴＦが発現されない。ｍｉ／ｍｉマウスは、眼球の形成不全、メラノサイトの欠損、マスト細胞の消失、骨大理石症を主な症状とする変異マウスであり、メラノサイト、マスト細胞、網膜色素上皮細胞、破骨細胞などの組織で分化異常を呈する。ｍｉ／ｍｉマウスにおけるこれらの細胞の分化異常は、正常ＭＩＴＦが発現されずＭＩＴＦによる遺伝子転写活性化が行われないことに起因する。
【０００４】
また、正常マウスの組織あるいは培養細胞株を用いたノザンブロットによる発現組織分布の解析で、ＭＩＴＦｍＲＮＡが、心臓、メラノサイト、マスト細胞で発現していることが認められた。近年では、ＭＩＴＦにはｃＤＮＡの５’末端の配列が異なるアイソフォーム、すなわちメラノサイト型（Ｍタイプ）、心臓型（Ｈタイプ）、Ａタイプが存在することが報告されている（非特許文献２）。ＭＩＴＦ遺伝子は１０個（Ｍタイプ）あるいは１１個（Ａ、Ｈタイプ）のエクソンから構成されており、エクソン２以降は３タイプ共ほぼ共通である。Ｍタイプにおいては、６アミノ酸をコードする１８塩基からなるエクソン５ｂの付加の有無によって、さらに２つのタイプに区別される。ＡとＨのタイプはエクソン１Ｂ以降が完全に一致しており、５’末端のエクソン１が異なる。Ａ、ＨタイプとＭタイプとは、エクソン２以降は共通であるが、Ｍタイプにはエクソン２の上流にエクソン１Ｂがなく、特異的なエクソン１がつながる。また、ゲノム配列からそれぞれのタイプのプロモーターは異なっていることが明らかになっている。
【０００５】
ＭＩＴＦ蛋白質は、核移行領域、転写活性化領域、ＤＮＡ結合領域、二量体形成領域およびＭＩＴＦ自体の活性化領域からなることが推定されており、これら領域を含むことは既知の全てのタイプで共通である。ＭＩＴＦ蛋白質は、その構造の中央にｂＨＬＨ−Ｚｉｐ（ｂａｓｉｃ−ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ／ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒ）を有する転写制御因子であり、二量体を形成してＤＮＡに結合し、対象となる遺伝子の転写を活性化する。ＡタイプとＨタイプの転写活性能には大きな差違があることが報告されており、両タイプ間で遺伝子配列の異なるエクソン１に、転写活性を制御する機能があると推測される。
【０００６】
また、ＭＩＴＦ蛋白質は、メラノサイトにおいては転写制御因子として作用し、メラノサイトの増殖分化、ならびにメラニン合成系等に関わっていることが報告されている。
【０００７】
マスト細胞においても、ＭＩＴＦ蛋白質はｃ−ｋｉｔ遺伝子発現を調節する転写制御因子（ｃ−ｋｉｔプロモーターを活性化する転写因子）として作用することが報告されている（非特許文献３）。ｃ−ｋｉｔ遺伝子は造血前駆細胞、マスト細胞、色素細胞、生殖細胞で発現されており、これら細胞の増殖分化を、Ｓｌ因子の作用により制御している。マスト細胞において、ＭＩＴＦ蛋白質は、ｃ−ｋｉｔ遺伝子発現を制御することによりマスト細胞の生存維持に関わっていると考えられる。
【０００８】
マスト細胞はアレルギー疾病に関与していることが古くから報告されている（非特許文献４）。また、アレルギー疾病以外にマスト細胞が関わる疾病として、自己免疫疾患、肺線維症、癌、マストサイトーシス、マストサイトーマ等が挙げられる。
【０００９】
一方、ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｄｏｍａｉｎの略）は、生体膜を貫通して蛋白質を細胞内に移行させる（取り込ませる）働きを有するドメインの総称である。例えば、ＨＩＶ抗原中のドメイン単位で分析したところ、ＴＡＴ由来ペプチドの部分が、ＨＩＶ抗原を正常なＴ細胞内に移行させる働きを有しており、これが細胞感染の一因であることが確認されている（非特許文献５）。こうした知見がベースとなって、ＴＡＴと同じような働きを有する各種ＰＴＤが存在すること、これらのＰＴＤと各種蛋白質を融合させることにより細胞内に移行させる手法が報告されている（非特許文献６）。
【００１０】
しかしながら、ＭＩＴＦあるいはマスト細胞に関して、ＰＴＤを利用して細胞内に移行させる技術については、今までのところ報告例は見出されていない。
【００１１】
【特許文献１】
国際公開第００／４７７６５号パンフレット
【特許文献２】
国際公開第０１／６６７３５号パンフレット
【特許文献３】
特表２００１−５１３９８７号公報
【特許文献４】
特表２００２−５０５０７７号公報
【特許文献５】
特表平５−５０５１０２号公報
【特許文献６】
特表２００２−５１２８０８号公報
【非特許文献１】
セル（Ｃｅｌｌ）、１９９３年、７４巻、３９５〜４０４頁
【非特許文献２】
生化学、１９９９年、７１巻１号、６１〜６４頁
【非特許文献３】
ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、１９９６年、８８巻４号、１２２５〜１２３３頁
【非特許文献４】
ＩｇＥ，ｍａｓｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ）１４７、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ出版社、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ．、１９８９年
【非特許文献５】
セル（Ｃｅｌｌ）、１９８８年、５５巻、１１７９〜１１８８頁
【非特許文献６】
カレント・オピニオン・イン・モレキュラ・セラピューティクス（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）２０００、２０００年、２巻２号、１６２〜１６７頁
【非特許文献７】
トレンズ・イン・ジェネティクス（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１９９５年、１１巻1１号、４４２〜４４８頁
【非特許文献８】
プロシーディング・ネイショナル・アカデミック・ソサイアティ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９８８年、８５巻、８９９８〜９００２頁
【非特許文献９】
カレント・プロトコールズ・イン・イムノロジー（ウィレイ）セクション［Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ）Ｓｅｃｔｉｏｎ］７．２５．２
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＭＩＴＦ変異体を用いた新規な医薬用途を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の事情を考慮して研究を行った結果、ＭＩＴＦ変異体とＰＴＤを組合せることにより、マスト細胞の細胞死を誘発できることを見出して本発明を完成した。
【００１４】
すなわち、本発明は、ＰＴＤおよびＭＩＴＦ変異体から構成される融合蛋白質を有効成分とするマスト細胞の細胞死誘発剤；ＰＴＤおよびＭＩＴＦ変異体から構成される融合蛋白質を有効成分とするマスト細胞が関与する疾患の予防治療剤；ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤおよびＭＩＴＦ変異体から構成される融合蛋白質において、ＭＩＴＦ変異体がＭＩＴＦのｍｉ変異体、ｗｈ変異体、ＨＬＨ断片またはＡタイプのＮ末領域（１−３０５）断片であり、ＰＴＤがＴＡＴ由来ペプチドである、当該融合蛋白質；前記の融合蛋白質および製剤学的に許容しうる担体を含む医薬組成物；前記の融合蛋白質の製造方法において、遺伝子工学的手法を用いて融合蛋白質を産生する工程を含む、当該製造方法；前記の融合蛋白質をコードするＤＮＡ、に関するものである。以下の詳細を説明する。
【００１５】
【発明の実施の形態】
Ａ．ＭＩＴＦ変異体
本発明で用いられるＭＩＴＦ変異体は、天然型（野生型）ＭＩＴＦの変異体であって、ＭＩＴＦ阻害活性を有するものであれば、特に限定されるものではない。具体的には、ＭＩＴＦのｍｉ変異体、ＭＩＴＦのｗｈ変異体、その他のＭＩＴＦ変異体、例えば、スプライシングバリアント（Ａ体、Ｈ体、Ｍ体、Ｎ体由来のいずれでも可）、あるいはＭＩＴＦの部分構造であってＭＩＴＦ阻害活性を有するもの、例えば、ｂＨＬＨ−Ｚｉｐ（Ｍ体のＮ末１９６番目から２８５番目まで）断片、その部分を含むＮ末側断片、Ａ体のＮ末領域（Ｎ末１番目から３０５番目まで）断片などが例示される。具体的には、非特許文献７、特許文献１、特許文献２などに開示されたＭＩＴＦ変異体などが挙げられる。特に好ましい変異体は、ｍｉ変異体、ｗｈ変異体、ｂＨＬＨ−Ｚｉｐ断片（以下、ＨＬＨ断片）、Ａ体のＮ末領域（１−３０５）断片である。これらのアミノ酸配列、塩基配列の関係は表１のとおりである。
【００１６】
【表１】
また、これらの変異体の構造類似体であっても、当該変異体と実質的に同程度のＭＩＴＦ阻害活性を有するものも本発明の範疇に含まれる。例えば、上述のアミノ酸配列において、１または複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入または付加したものであって、当該変異体と実質的に同程度の活性を有するものであってもよい。
【００１８】
Ｂ．ＰＴＤ
本発明で用いられるＰＴＤは、細胞内に取り込まれる（移行する）性質を有するものであれば、特に限定されるものではなく、公知のものを利用できる。具体的には、前記の文献（非特許文献６）中の１６４頁表２に列挙された各種オリゴペプチド、特許文献３、特許文献４、特許文献５で開示されたＰＴＤ用の各種オリゴペプチドなどが例示される。より好ましいＰＴＤは、ＴＡＴ由来ペプチド（アミノ酸配列はＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、配列番号７、好ましい塩基配列は同８で各々示される）である。ＰＴＤはＭＩＴＦ変異体のＮ末側、Ｃ末側のいずれに結合していてもよい。また、結合は直接でもよく、架橋剤（リンカー）を介して間接的なものであってもよい。リンカーとしてはグリシン残基などが例示される。
【００１９】
Ｃ．その他の構成要素（ドメイン）
本発明の融合蛋白質は、精製用アフィニティクロマトにおけるリガンドに対して親和性を有するものを結合していてもよい。当該ドメインは特に限定されるものではなく、公知のものを利用することができる。このような関係にあるものとしては、抗原とその抗体、受容体とそのリガンド、Ｎｉ−ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）とＨｉｓＴａｇ、アビジン（またはストレプトアビジン）とビオチン、などが例示される。より好ましいのは、ＨｉｓＴａｇ（アミノ酸配列はＭＧＧＳＨＨＨＨＨＨ、配列番号９、好ましい塩基配列は同１０で各々示される）である。本ドメインは融合蛋白質のＮ末側、Ｃ末側のいずれに結合していてもよい。また、結合は直接でもよく、架橋剤（リンカー）を介して間接的なものであってもよい。リンカーとしてはグリシン残基などが例示される。
【００２０】
Ｄ．融合蛋白質の調製
本発明の融合蛋白質の調製方法としては、▲１▼融合蛋白質全体を、化学的合成手法を用いて合成する方法、▲２▼上記の各構成要素（ドメイン）を各々別個に調製した後に、化学的な反応手段を用いて結合する方法、▲３▼各構成要素をコードする遺伝子を連結した上で遺伝子工学的手法を用いて一気に融合蛋白質として発現させる方法などが例示される。▲２▼の場合、各構成要素の調製方法としては、化学的合成方法、細胞培養法、遺伝子工学的な手法を用いる方法などが挙げられる。ＰＴＤはＨＩＶ抗原からの切断・単離によっても調製することもできる。
【００２１】
例えば、融合蛋白質を遺伝子工学手法により調製する場合で説明する。
１）融合蛋白質をコードするＤＮＡを調製する。当該調製は常法により行われる。まず、ＭＩＴＦ変異体をコードする遺伝子を調製する。当該遺伝子の調製は、適当な細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼを用いてｃＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法で増幅することにより得ることができる。具体的には、ｍＲＮＡの抽出は、市販のｍＲＮＡ抽出用キットなどを用いて行い、逆転写、ｃＤＮＡ合成および増幅は、市販のｃＤＮＡ増幅キットなどを用いた５’−ＲＡＣＥ法（非特許文献８）または適当なプライマーを用いた逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法などにより行うことができる。また、適当な細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、当該遺伝子をＰＣＲで増幅して得ることもできる。また、公知の報告例、例えば、上述の非特許文献１、特許文献２で開示されたＭＩＴＦをコードする遺伝子を利用することもできる。例えば、本発明のＨＬＨ断片はＭＩＴＦのＭタイプから、ＡタイプのＮ末領域（１−３０５）断片はＭＩＴＦのＡタイプ（ＭＩＴＦ Ａ／ｐＣＤＮＡ３）から、各々調製することかできる。
【００２２】
次いで、ＰＴＤをコードする遺伝子を上記と同様の方法により調製し、ＭＩＴＦ変異体をコードする遺伝子と連結する。ＨｉｓＴａｇについても同様である。また、ＨｉｓＴａｇを担持する市販のプラスミド（ｐＴｒｃＨｉｓＢ、インビトロジェン社）を用いて、ＰＴＤ−ＭＩＴＦ変異体からなる融合蛋白質をコードするＤＮＡを挿入することにより、本発明の融合蛋白質をコードするＤＮＡを調製することができる。
【００２３】
２）ＤＮＡを適当なベクターに組込んで発現用ベクターを調製する。当該ベクターは特定のプロモーターの制御下に融合蛋白質を発現するために用いる。その組込みは常法により行われる。
【００２４】
上記得られた目的のＤＮＡを精製し、ベクターＤＮＡに導入して、宿主・ベクター系を構築することができる。宿主・ベクター系は一般に宿主細胞とコンパチブルな種に由来するレプリコンと、当該宿主を組合せて使用する。ベクターＤＮＡは、複製起点、プロモーター、制御配列（エンハンサー）、シグナル配列、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス配列、ポリＡ付加部位、転写終結配列（ターミネーター）などを有する。また、形質転換細胞中で表現型の選択が可能となるマーカーの配列を有していてもよい。ベクターＤＮＡとしては、例えば、染色体、エピソーム由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来のベクター、またはバキュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、などのウイルス由来のベクター、あるいはコスミドおよびファージミドなどが挙げられる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクターなどを用いることができる。
【００２５】
プロモーターは公知のものが挙げられ、発現のための宿主に合わせて選択することができる。例えば、大腸菌を宿主とする場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター（ｔｒｐプロモーターの−３５領域とｌａｃプロモーターの−１０領域を連結した合成プロモーター）、Ｔ７プロモーターなどのプロモーターが例示される。また、当該発現ベクターはａｍｐ ｒなどのマーカー遺伝子を担持していてもよい。
【００２６】
ベクターＤＮＡに本発明に係るＤＮＡを組み込む方法は、自体公知の方法を適用し得る。例えば、適当な制限酵素を選択し、処理して目的のＤＮＡを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的のＤＮＡに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ挿入することによっても、所望の組換えベクターが得られる。また、宿主に導入するベクターＤＮＡとして発現ベクターを使用すれば、目的とする蛋白質の製造が可能である。
【００２７】
３）発現用ベクターを宿主に導入して形質転換体を調製する。形質転換は常法により行われる。宿主としては、大腸菌、枯草菌、酵母、動物細胞などを用いることができる。好ましくは大腸菌である。また、栄養要求性株、抗生物質感受性株を宿主とすることもできる。
【００２８】
形質転換体を調製する方法としては、プラスミドを直接宿主細胞内に導入する方法、プラスミドを染色体上に組込む方法などが挙げられる。前者としては、プロトプラストポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法などが例示される。後者としては、宿主染色体中に存在する遺伝子の一部のＤＮＡ配列をプラスミドに含有させて、その相同な配列部分を利用して、プラスミドまたはその線状断片を相同組換えにより宿主染色体上に導入することができる。
【００２９】
４）形質転換体を培養し、融合蛋白質を産生する。培養は常法により宿主に応じて適用な培地、培養条件（温度、時間など）を用いて行われる。大腸菌を用いる場合の培養条件としては通常、１５〜４３℃（好ましくは３０〜３７℃）程度で、１〜１００時間程度行う。また、必要に応じて通気や攪拌を加えることもできる。培養形式としては、回分培養、半回分培養（フェッド・バッチ培養）、連続培養のいずれであってもよい。
【００３０】
５）産生された融合蛋白質を精製する。宿主として大腸菌を用いた場合はまず菌体を超音波粉砕等の処理により当該蛋白を可溶化する。産生された融合蛋白質の精製は自体公知の手法により行うことができる（特許文献６など）。例えば、Ｎｉカラムを用いる方法、陰イオン交換体処理、透析処理などが例示される。また、本発明の融合蛋白質は変性剤（カオトロピック剤）処理後に変性剤を除去して得られたものを用いることが好ましい。変性剤としては尿素、塩酸グアニジン、チオシアン酸塩などが例示される。変性剤処理時の変性剤の添加条件としては、濃度１〜１０Ｍ程度が例示される。具体的には融合蛋白質と変性剤を接触させて処理した後に、変性剤の共存下にＮｉカラムを用いて処理を行い、さらに陰イオン交換体または透析処理により変性剤を除去する操作を行って、当該融合蛋白質を精製する。
【００３１】
Ｅ．調製された融合蛋白質の性状
本発明の融合蛋白質は、細胞内、特にマスト細胞内に移行する性質を有するものである。好ましくは、ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤおよびＭＩＴＦ変異体から構成される。このものは１０〜１００キロダルトン（ｋＤａ）程度の分子量を有する。好適には、Ｎ末側からみて、ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤ、ＭＩＴＦ変異体の順番に並んだものである。具体的な配列としては、表２に示すとおりである。
【００３２】
【表２】
Ｆ．製剤化
本発明の融合蛋白質の製剤化には、自体公知の手法を用いることができる。例えば融合蛋白質に、製剤学的に許容しうる担体を添加あるいは混合すればよい。製剤化により得られた医薬組成物において、融合蛋白質の濃度として０．１〜１００μｇ／ｍＬまたは０．１〜１００ｎＭ程度が例示される。
【００３４】
Ｇ．用途
本発明のＭＩＴＦ変異体（または、それを用いた融合蛋白質）はマスト細胞内に移行することにより内在性ＭＩＴＦの活性を阻害する、前駆細胞からのマスト細胞の分化を阻害する、マスト細胞の生存を阻害する、成熟マスト細胞に細胞死（アポトーシス）を誘導する、などの作用を有する。従って、本発明の製剤は、マスト細胞が関与する各種疾患の予防・治療に有用であることが期待される。当該疾患としては、例えば、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、肺線維症、癌、マストサイトーシス、マストサイトーマ等が挙げられる。
【００３５】
Ｈ．用法・用量
本発明の融合蛋白質の用法・用量としては、生体内において０．００１〜１０μｇ／ｍＬ程度の濃度で存在するように、投与量を選択すればよい。あるいは投与量として、１０μｇ〜５０ｍｇ程度が例示される。投与経路としては、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、気道内投与などが例示される。
【００３６】
【実施例】
本発明をより詳細に説明するために実施例、製剤例および実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。
【００３７】
実施例１
１）融合蛋白質発現プラスミドの構築
発現プラスミドは、大腸菌用発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（インビトロジェン社、Ｎｏ．Ｖ３６０−２０）のＨｉｓＴａｇ配列の上流に存在するＮｃｏＩサイトとマルチクローニングサイト中のＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に、精製用のＨｉｓＴａｇの下流にＰＴＤ配列が接続し、その下流にＭＩＴＦ変異体のｃＤＮＡを接続したＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦ変異体の遺伝子を挿入することにより構築した。図１を参照のこと。
【００３８】
ＭＩＴＦのｃＤＮＡへのＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤ配列の付加はＰＣＲ法を用いて行った。まず、ＭＩＴＦ ＭタイプのｃＤＮＡ（ｐＳＵ０５４、ＭＩＴＦ−Ｍ／ｐＴ７ Ｂｌｕｅ）を鋳型にして、ＭＩＴＦおよびＢａｍＨＩサイトを含む上流部分をＰＣＲ法により増幅した。さらに４種類のプライマー（Ｍ−ｔａｔ、Ｔａｔ３、Ｔａｔ ２、Ｔａｔ １）を用いてＭＩＴＦの転写開始コドンの上流にＨｉｓＴａｇと制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を付加するまで伸長させた後に、大腸菌用発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓＢ（このものはｌａｃ Ｐ／ＯおよびＡｍｐ ｒを担持してなる）のＮｃｏＩサイトとＢａｍＨＩサイトの間にクローニングした。
【００３９】
各プライマーは以下の塩基配列を有する。
Ｍ−ｔａｔ（配列番号１７）： ＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧＣＴＡＧＡＡＴＡＣＡＧＴＣＡＣＴＡＣＣ
Ｔａｔ ３（配列番号１８）： ＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧ
Ｔａｔ ２（配列番号１９）： ＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧ
Ｔａｔ １（配列番号２０）： ＴＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴＧ
【００４０】
次いで、Ｍタイプ（ｐＳＵ０５４）、ｍｉ変異体（ｐＳＵ０６１、ＭＩＴＦ−Ｍｍｉ／ｐＴ７ Ｂｌｕｅ）、ｗｈ変異体（ｐＳＵ０６２、ＭＩＴＦ−Ｍ ｗｈ／ｐＴ７ Ｂｌｕｅ）をそれぞれＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩ消化することにより、ＭＩＴＦｃＤＮＡの下流部分を単離した。この部分に変異部分も含まれる。単離したｃＤＮＡ断片を、上流部分をクローニングしたプラスミドのＢａｍＨＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトの間に挿入した。プラスミドｐＳＵ８１は正常型ＭＩＴＦであるＭタイプを含む融合蛋白質の遺伝子を挿入したものである。ｐＳＵ０８２はｍｉ変異体を、ｐＳＵ０８３はｗｈ変異体を含む融合蛋白質を各々挿入したものである。
【００４１】
２）融合蛋白質の発現
構築した発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５α（東洋紡）に導入し形質転換した。５０ｍＬのＬ−Ｂｒｏｔｈ（５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む）に、大腸菌を１白金耳量となるように植菌し、３７℃で１７時間培養した。さらに、１ＬのＬ−Ｂｒｏｔｈ（５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび０．２％のグルコースを含む）に、培養液を１％となるように植菌した。Ａ６００の濁度が約０．１となるまで３７℃で培養した後に、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度０．４ｍＭとなるように添加した。２時間培養後に大腸菌を集菌した。
【００４２】
３）融合蛋白質の精製
大腸菌を遠心分離にて回収し、８Ｍの尿素、０．１Ｍの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０、ｐＨは以下同様）中で超音波粉砕し可溶化した。得られたＬｙｓａｔｅを８Ｍの尿素、０．１Ｍの塩化ナトリウム、１０ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＤＴＴを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ社）カラムにアプライし、同緩衝液で洗浄した。カラムに結合した蛋白をＡ液として同緩衝液、Ｂ液として２００ｍＭのイミダゾールを含む同緩衝液を用いたイミダゾールの濃度直線勾配法で溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｔｅｆｃｏ社）で解析して目的の分子量を示す画分をプールした。
【００４３】
溶出液１容量に対して、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を１容量、４Ｍの尿素を含む同緩衝液を２容量、各々添加して希釈した溶液を、４Ｍの尿素、２５ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化した四級アンモニウム塩型強陰イオン交換体（商品名Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ファルマシア社）にアプライし、同緩衝液で洗浄した。次に、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液で洗浄して尿素を除去した後に、１Ｍの塩化ナトリウムを含む同緩衝液でカラムに結合した蛋白を溶出した。溶出した融合蛋白質は１０％グリセロールを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（等張化リン酸緩衝液）に対して透析した後に分注して−８０℃で保存した。
【００４４】
得られた最終産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、還元条件下で約５０キロダルトンの分子量を示すバンドが観察された。このバンドはウサギ抗ＭＩＴＦ抗体と反応した。なお、このウサギ抗ＭＩＴＦ抗体は、ウサギにＭＩＴＦのＣ末２０アミノ酸残基のペプチドを免疫して得られた抗血清を、同ペプチドを結合したカラムを用いてアフィニティ精製を行うことにより、同ペプチドを特異的に認識する抗体を調製したものである。
【００４５】
製剤例１
本発明の融合蛋白質、および、１０％グリセロールを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳからなる組成物を調製した。
【００４６】
実験例１
１）まず、本発明の融合蛋白質が細胞内に移行しているかどうかを確認した。実施例１で調製したＭＩＴＦ変異体の融合蛋白質をＦＩＴＣ（フルオレセイン・イソチオシアネート）で常法により蛍光標識し、ＣＯＳ７細胞に添加した。添加１時間後にＦＡＣＳ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ） Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディキンソン社）を用いて、蛍光強度を測定した。その結果を表３に示す。
【００４７】
【表３】
表３から明らかなように強い蛍光が細胞に会合（アソシエート）していることが観察され、当該融合蛋白質が細胞内に効率よく移行していることが確認された。
【００４９】
２）本発明の融合蛋白質が細胞内に移行して内在性ＭＩＴＦの活性を阻害するか調べる目的でルシフェラーゼ分析を行った。
【００５０】
発現用プラスミドとして、正常ＭＩＴＦ発現用プラスミドｐＳＵ０６３（ＭＩＴＦ−Ｍ／ｐＣＤＮＡ３）、ｃ−ｋｉｔ遺伝子プロモーターの下流にルシフェラーゼ遺伝子を接続したプラスミドを調製するための各種ベクター、すなわち、Ｃ−ｋｉｔ−Ｒｌｕｃ発現用ベクターｐＳＵ０５３（Ｃ−ｋｉｔ／Ｒ−ｌｕｃ）、ルシフェラーゼ発現用ベクターｐＧＬ２（Ｌｌｕｃ、プロメガ社）を用いた。各プラスミドを、ＣＯＳ７細胞に導入（トランスフェクト）した。その条件は以下のとおり。プラスミドの使用量は、６ｃｍのディッシュ当たり３μｇ（ｐＳＵ０６３：ｐＳＵ０５３：ｐＧＬ２＝１：１：０．１）。プラスミドの導入にはトランスフェクションキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、＃２００３８５）を用いた。
【００５１】
６ウェルプレートに１ウェル当たり１×１０５個の細胞を植え込み、１７時間ＣＯ２インキュベータに静置した。１０μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ １（前記キットに添付されている試薬。２．５Ｍ ＣａＣｌ２からなる）に９０μＬの蒸留水と３μｇのＤＮＡを添加した後に、等量のＳｏｌｕｔｉｏｎ ２［前記キットに添付されている試薬。２×ＰＢＳ（ｐＨ６．９５）からなる］を加え、室温で２０分間静置した。混合したＤＮＡ溶液を培養液に添加した。２４時間後に上記の培地を交換し、１μｇ／ｍＬの本発明の融合蛋白質（実施例１で調製）を添加した。
【００５２】
本発明の融合蛋白質の添加４８時間後に細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、６穴のディシュ当たり０．５ｍＬのｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを添加し、スクレーバーを用いて細胞を掻き採った。細胞を１．５ｍＬ容のチューブに移し、１４０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心した。ルシフェラーゼ活性の測定は、Ｄｕａｌ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（プロメガ社）を用いて行った。９６穴プレート上で２０μＬの遠心上清に、１００μＬのＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩを添加・混合し、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。さらに混合液に１００μＬのＳｔｏｐ＆Ｇｏ Ｒｅａｇｅｎｔを添加・混合し、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒ−ｌｕｃ）活性を測定した。Ｒ−ｌｕｃの数値をｐＧＬ２で補正後、ＰＢＳ添加におけるＲ−ｌｕｃを１としたときの値に換算した。その結果を表４に示す。
【００５３】
【表４】
なお、表中のｍｉはＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｍｉ変異体からなる融合蛋白質、ｗｈはＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｗｈ変異体からなる融合蛋白質、を各々示す。
【００５５】
ＣＯＳ細胞が発現するルシフェラーゼ活性も本発明の融合蛋白質存在下で阻害され、当該融合蛋白質が細胞内に移行して内在性ＭＩＴＦを阻害することが示唆された。
【００５６】
実験例２
本発明の融合蛋白質がＳＣＦで誘導されるマスト細胞の分化系にどのように影響するかを確認した。
【００５７】
正常マウスから骨髄細胞を調製し、その２×１０６個／穴を、１０％のＦＣＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノール、２μｇ／ｍＬの本発明の融合蛋白質（ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｗｈ変異体）を含むＲＰＭＩ１６４０中で骨髄細胞因子（ＳＣＦ、ＩＢＬ社）５０〜１００ｎｇ／ｍＬの存在下に２４穴プレートにて培養した。週に一度培地を半量交換し、その際にＳＣＦも添加した。３７℃で２１日間培養した後に、マスト細胞数、ｃ−ｋｉｔおよびＩｇＥ受容体の発現量を測定した。
【００５８】
マスト細胞数の測定はトルイジン青染色法によった。トルイジン青染色は非特許文献９に従い、ｐＨ２．７の染色液を用いて行った。
【００５９】
ｃ−ｋｉｔの発現量の測定はＦＡＣＳを用いて行った。細胞を、０．１％のＮａＮ３、０．１％のＢＳＡを含むＰＢＳ１００μＬに懸濁し、５〜１０μｇ／ｍＬのＲ−ＰＥ（Ｒ−ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）標識抗マウスｃ−ｋｉｔ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）あるいはＲ−ＰＥ標識ラットＩｇＧ２Ｂ，ｋ ｉｓｏｔｙｐｅ ｓｔａｎｄａｒｄ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）と氷中で１時間インキュベーションした。洗浄後に１μｇ／ｍＬのヨウ化ピリジウムを添加して、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（前記）で解析した。ＩｇＥ受容体の発現量の測定は、５μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ標識マウスＩｇＥを用いて同様にＦＩＴＣによる解析を行った。マスト細胞数に関する結果を表５に示す。
【００６０】
【表５】
本発明の融合蛋白質の添加群では、培養２１日目でマスト細胞数が未添加群に比べて１０分の１以下に減少していた。また、ｃ−ｋｉｔの発現に関する培養２１日目の結果を表６に示す。
【００６２】
【表６】
本発明の融合蛋白質の添加群では、培養２１日目でｃ−ｋｉｔの発現量が未添加群に比べて１０分の１以下に減少していた。また、ＩｇＥ受容体の発現量は変化がなかった（実験データは示さず）。このように本発明の融合蛋白質はマスト細胞前駆細胞のＳＣＦ受容体ｃ−ｋｉｔの発現を特異的に阻害し、その結果、マスト細胞の分化を強く阻害することが確認された。
【００６４】
実験例３
本発明の融合蛋白質の、成熟マスト細胞への影響を確認する目的で、線維芽細胞との共培養系でのマスト細胞生存への影響を確認した。
【００６５】
正常マウスから脾細胞を調製し、１０％のＦＣＳ、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭの２−メルカプトエタノールを含むＲＰＭＩ１６４０中でＩＬ−３（ＧＥＮＺＹＭＥ社）またはＷＥＨＩ−３細胞ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ培地（ＷＥＨＩ−３ＣＭ）存在下に３週間以上培養して、脾臓由来培養マスト細胞（ＳＭＣ）を得た。６穴プレートに線維芽細胞のＮＩＨ−３Ｔ３（理研セルバンク）をコンフルエントまで培養し、当該ＳＭＣをＩＬ−３およびＷＥＨＩ−３ＣＭを含まず、かつ、１μｇ／ｍＬの本発明の融合蛋白質を含む、上記の培地に懸濁し、３×１０５個で播種した。２〜３日ごとに新鮮培地に交換した。３７℃で１５日間培養した後に、マスト細胞数、ヒスタミン量およびキマーゼ活性を測定した。各種実験系を表７に示す。
【００６６】
【表７】
ヒスタミンの定量はＲＩＡ法（栄研化学）によった。顆粒中のキマーゼ活性の測定は特異的な合成基質であるＮ−サクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ（シグマ社）を用いて行った。結果を表８に示す。
【００６８】
【表８】
線維芽細胞と正常マスト細胞を共培養するとマスト細胞は長期間生存し続けた。また、ＭＩＴＦに異常を持つ人為的に作成したｍｉマスト細胞（ｍｉ／ｍｉＳＭＣ、天然には存在しない）は線維芽細胞との共培養においてアポトーシスにより２週間以内に死滅した。正常マスト細胞と線維芽細胞の共培養に本発明の融合蛋白質（ｍｉ変異体型、ｗｈ変異体型）を添加すると、マスト細胞の生存は阻害され、ｍｉマスト細胞と同様に２週間後にはほとんどが死滅した。マスト細胞数の低下は、ヒスタミン量の低下およびキマーゼ活性の低下によっても確認された。この結果、本発明の融合蛋白質は、成熟マスト細胞にアポトーシスを誘導することが示唆された。
【００７０】
実験例４
本発明の融合蛋白質の添加濃度における影響を調べた。ＭＣ／９マスト細胞株（ＡＴＣＣより入手）をＦＩＴＣ標識したＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｗｈ変異体からなる融合蛋白質の存在下または非存在下に、ＦＡＣＳ染色緩衝液（０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ）中で氷上１時間インキュベートした。洗浄後にヨウ化ピリジウムを添加して死細胞をゲートアウトし、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（前記）で解析した。結果を表９に示す。
【００７１】
【表９】
表９の結果から、本発明の融合蛋白質の添加濃度に依存して、当該融合蛋白質が細胞内により高濃度で移行していることが判明した。
【００７３】
実施例２： ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＨＬＨ
１）発現ベクターの構築
発現ベクター作成の鋳型としては正常型のＭＩＴＦのＭタイプ（ｐＳＵ０５４）を用いた。ＨＬＨ断片はＭタイプのＮ末１９６番目から２８５番目のアミノ酸までの領域をＰＣＲ法により増幅した。増幅断片のＮ末側には、プライマー（Ｔａｔ１、Ｔａｔ２、Ｔａｔ３およびＨＬＨ Ｆ）を用い、ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤと制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を付加した。またＣ末側には制限酵素ＸｂａＩの認識配列を付加した。増幅断片をＮｃｏＩ＋ＸｂａＩで消化し、実施例１で作成したｐＳＵ０８１のＮｃｏＩ−ＸｂａＩ領域と置換した。当該増幅断片をＴＡクローニングし塩基配列が正しいことを確認した。構築したベクターｐＳＵ０８５はｌａｃプロモーター、ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＨＬＨ領域の融合蛋白質のＤＮＡ、ａｍｐ ｒから構成される（図２）。
【００７４】
プライマーＨＬＨ Ｆは以下の塩基配列を有する。
ＨＬＨ Ｆ（配列番号２５）：ＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＧＧＴＡＴＧＴＴＧＧＣＴＡＡＡＧＡＧＡＧＧ
２）実施例１に準じて融合蛋白質を産生・精製した。
【００７５】
実施例３： ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのＡタイプＮ末領域
１）発現ベクターの構築
ｐＳＵ０６４（ＭＩＴＦのＡタイプ／ｐＣＤＮＡ３、特許文献２を参照のこと）を鋳型に、２種類のプライマー（ｐＴＤ３−ＭＩＴＦａ、ＭＩＴＦＲ−Ｎ）を用いてＰＣＲを行い、Ｎ末領域（Ｎ末１番目から３０５番目までのアミノ酸）を増幅した。ｐＴＤ３−ＭＩＴＦａの５’末端にはＳａｃＩＩサイトを、ＭＩＴＦＲ−Ｎの５’末端にはＥｃｏＲＩサイトを付加した。増幅断片をＳａｃＩＩ＋ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＳＵ０９３（ｐＴｒｃＨｉｓを基本骨格とするＰＴＤカセット発現ベクター）の同サイト間に挿入した（図３）。構築した発現ベクターｐＳＵ０８７は、ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＡタイプのＮ末領域の順にＤＮＡ断片がつながり、ｌａｃプロモーターの制御下に融合蛋白質が発現する。
【００７６】
各プライマーは以下の塩基配列を有する。
ｐＴＤ３−ＭＩＴＦａ（配列番号２６）： ＣＧＣＣＧＣＧＧＡＡＴＧＣＡＧＴＣＣＧＡＡＴＣＧＧＧＡＡＴＣ
ＭＩＴＦＲ−Ｎ（配列番号２７）： ＧＡＡＴＴＣＡＣＴＡＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴＣＡＧＡＣＴＣＴＧＴＧＧＧＧ
【００７７】
２）実施例１に準じて融合蛋白質を産生した後、これを精製する際に、Ｎｉ−アガロースの代わりにＴＡＬＯＮ（商品名、ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて行った。精製物は１０％グリセロール／ＰＢＳ溶液として調製した。
【００７８】
実施例４： ｐＥＴ１４ｂを用いた発現ベクターの構築
ｐＳＵ０８３（ｗｈ系）のＮｃｏＩ−ＮｄｅＩ断片とｐＥＴ１４ｂ（Ｔ７プロモーター、ＨｉｓＴａｇ、ａｍｐ ｒを連結してなる。Ｔａｋａｒａ）の同領域を置換して発現ベクターｐＳＵ１２１を構築した（図４）。このｐＳＵ１２１はＴ７プロモーターの下流に、ＨｉｓＴａｇ、ＰＴＤ配列、ＭＩＴＦのｗｈタイプがつながり、大腸菌の菌体内において、Ｔ７プロモーターの制御下に融合蛋白質（ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｗｈタイプ）を発現する。
【００７９】
実施例１に従い、大腸菌をフラスコで培養し、融合蛋白質（ｗｈ系）を産生した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロースを用いた精製を実施例１に準じて行った後に、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｄｉａｌｙｚｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて透析し脱尿素処理を行った。溶媒としては２９０ｍＭソルビトール、１０μＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）を用いた。培養液１Ｌ当たり約１０ｍｇの融合蛋白質が精製された。
【００８０】
実施例５： 精製工程（ＨＬＨ）
融合蛋白質（ＨＬＨ系、実施例２により調製）をＱ−セファロースカラムから１Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）で溶出し、回収した画分を、使用前にＰＤ−１０カラム（ファルマシア）を用いてＰＢＳに置換した。
【００８１】
実施例６： 高密度培養（ｗｈ系）
発現ベクターｐＳＵ０８３を大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、形質転換体を調製した。ＥＢＭ００１００１０培地（アンピシリン添加）を用いてジャーファーメンターで３７℃１６時間培養し、融合蛋白質を産生した。精製は実施例１に準じて行った。
【００８２】
実施例７： 高密度培養（ＨＬＨ）
ｐＳＵ０８５を用いて実施例６に準じて融合蛋白質を産生した。精製を実施例１に準じて行うに際し以下の点を変更した。Ｎｉ−ＮＴＡアガロース処理時に８Ｍ尿素の代わりに６Ｍ塩酸グアニジンを用いたこと、陰イオン交換体処理の代わりに分子量３０００カット膜を用いて濃縮した後に、０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）で平衡化したＰＤ−１０カラム（ファルマシア）で脱塩したこと。０．５Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に対して透析し分注して−８０℃で保存した。インビボで使用する際にはＮａＣｌ濃度を０．１５Ｍとなるように希釈して用いた。
【００８３】
製剤例２
融合蛋白質、１０％グリセロール、ＰＢＳからなる組成物を調製した。
【００８４】
製剤例３
融合蛋白質、０．１５〜１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４〜８）溶液として調製した。
【００８５】
実験例５（精製結果）
各種融合蛋白質（実施例１〜３により調製）を大腸菌菌体より精製し、その分子量、収量（４Ｌフラスコ培養当たり）を表１０に示した。なお、融合蛋白質（ＡタイプのＮ末領域）の分子量は３７ｋＤａであった。
【００８６】
【表１０】
実験例６（インビトロ阻害）
実験例３に準じて実験した。１０ｎＭの融合蛋白質を１７日間作用させた後にマスト細胞数、ヒスタミン、トリプターゼ、キマーゼを測定した。結果を表１１に示す。
【００８８】
【表１１】
表中の数値は平均±標準偏差を示す。また＊＊は溶媒群との間に、ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔｅｓｔによりｐ＜０．０５で有意差があることを示す。また＊は同じくｐ＜０．０１で有意差があることを示す。以下同様。
【００９０】
実験例７（同上）
実験例３に準じて実験した。２０ｎＭの融合蛋白質を１５日間作用させた後にマスト細胞比率を測定した。結果を表１２に示す。本発明の融合蛋白質はマスト細胞の生存を抑制した。
【００９１】
【表１２】
実験例８（同上）
１）実験例２に準じて実験を行った。マウス骨髄細胞（２×１０６／ウェル）をＳＣＦの存在下に融合蛋白質を添加して２８日間培養したときのマスト細胞数を求めた。例数は３とした。結果を表１３に示す。
【００９３】
【表１３】
２）実験は１）に準じて行った。融合蛋白質の添加濃度は２．５ｎＭとした。ヒスタミン濃度、キマーゼ活性を求めた。結果を表１４に示す。
【００９５】
【表１４】
３）実験は１）と同様に行った。融合蛋白質の添加濃度は２．５〜２０ｎＭとした。細胞数とキマーゼ活性を求めた。例数は２とした。結果を表１５に示す。
【００９７】
【表１５】
実験例９（ヒトマスト細胞への作用）
１）ヒトＣＤ３４陽性骨髄細胞（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ社）２×１０４／ウェルを、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（１０ｎｇ／ｍｌ）、融合蛋白質（ＨＬＨ系）を添加した培養液を週に一度、半量交換しながら９週間培養し、細胞数、回収した細胞についてｌｙｓａｔｅ中のキマーゼ活性、ヒスタミン含量を測定した。培養液は５％ＦＣＳを含むＭｅｄｉａＩ（免疫生物研究所）を用いた。例数は３とした。その結果、本発明の融合蛋白質はヒトマスト細胞分化を阻害した（表１６）。
【００９９】
【表１６】
２）ヒトＣＤ３４陽性骨髄細胞を１）に準じてサイトカインの存在下に８週間培養し、途中まで分化した未成熟なマスト細胞を調製した。細胞を一旦回収、遠心洗浄し、新しくプレートに培養液中で７×１０５／ウェルずつ播種し、融合蛋白質（ＨＬＨ系を１０または５０ｎＭ添加）を添加した同培養液（前記のサイトカインを含む）を用いて培養を継続した。週に一度培養液を半量交換した。培養２週間後に細胞数、キマーゼ活性、ヒスタミン含量を測定した。また当該細胞をＰＥ標識抗ｃ−ｋｉｔ抗体（あるいはＰＥ標識対照抗体）で染色し、ＦＡＣＳで解析した。その結果、本発明の融合蛋白質は未成熟マスト細胞に作用してｃ−ｋｉｔ発現を阻害し、ヒトマスト細胞の成熟を阻害した（表１７）。
【０１０１】
【表１７】
３）ヒトＣＤ３４陽性骨髄細胞を１）に準じてサイトカインの存在下に１２週間培養し、分化完了した成熟なマスト細胞を調製した。細胞を一旦回収、遠心洗浄し、新しくプレートに培養液中で２．４×１０４／ウェルずつ播種し、融合蛋白質（ＨＬＨ系を２、１０または５０ｎＭ添加）を添加した同培養液（前記のサイトカインを含む）を用いて培養を継続した。週に一度培養液を半量交換した。培養３週間後に細胞数、ヒスタミン含量を測定した。その結果、本発明の融合蛋白質は濃度依存的にヒスタミン含量を低下させ、成熟ヒト骨髄培養マスト細胞の機能を抑制した（表１８）。
【０１０３】
【表１８】
実験例１０（インビボ阻害）
１）Ｃ５７ＢＬ／６マウスに融合蛋白質（ｗｈ系）６０μｇを２００μＬのＰＢＳ中で週３回４週間まで腹腔内投与した。最終投与の翌日に腹腔細胞を回収し、以下の項目を測定した。例数は４とした。投与４週間の結果を表１９に示す。
【０１０５】
総細胞数： コールターカウンターまたは血球計数装置により測定した。
マスト細胞： スメア標本をトルイジンブルーで染色し、陽性の比率を算出した。
ヒスタミン： 腹腔細胞懸濁液にトリトンＸ１００を添加してＬｙｓａｔｅを調製し、ＬｙｓａｔｅについてＥＬＩＳＡキットにより測定した。
ｃ−ｋｉｔおよびＩｇＥ受容体両陽性細胞： 回収した腹腔細胞をＰＥ標識抗ｃ−ｋｉｔ抗体およびマウスＩｇＥ／ビオチン標識抗ＩｇＥ抗体／ＡＰＣ標識ストレプトアビジンで二重染色しＦＡＣＳで解析した。
【０１０６】
【表１９】
２）１０または５０μｇの融合蛋白質（ｗｈ系、いずれも２００μＬベヒクル中で）をマウス腹腔内に２週間投与した。例数は１０とした。１）と同様にして各項目を測定した。結果を表２０に示す。
【０１０８】
【表２０】
３）１０μｇの融合蛋白質（ＨＬＨ系）を３５０μＬベヒクル中でマウス腹腔内に１３日間投与した。マスト細胞数、ヒスタミン含量の測定は１）に準じて行った。結果を表２１に示す。
【０１１０】
【表２１】
本発明の融合蛋白質（ｗｈ系、ＨＬＨ系）はいずれの実験系においてもインビボでマスト細胞数を減少させた。
【０１１２】
【発明の効果】
本発明によれば、ＭＩＴＦ変異体を用いて、マスト細胞の細胞死を誘発することができる。よって、マスト細胞が関与する各種疾患の予防・治療に有用な薬剤を臨床の場に提供することができる。
【０１１３】
【配列表】
配列表配列番号１：ＭＩＴＦのｍｉ変異体のアミノ酸配列
配列表配列番号２：その塩基配列
配列表配列番号３：ＭＩＴＦのｗｈ変異体のアミノ酸配列
配列表配列番号４：その塩基配列
配列表配列番号５：ｂＨＬＨ−Ｚｉｐ断片のアミノ酸配列
配列表配列番号６：その塩基配列
配列表配列番号７：ＴＡＴ由来ペプチドのアミノ酸配列
配列表配列番号８：その塩基配列
配列表配列番号９：ＨｉｓＴａｇのアミノ酸配列
配列表配列番号１０：その塩基配列
配列表配列番号１１：ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｍｉ変異体からなる融合蛋白質のアミノ酸配列
配列表配列番号１２：その塩基配列
配列表配列番号１３：ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｗｈ変異体からなる融合蛋白質のアミノ酸配列
配列表配列番号１４：その塩基配列
配列表配列番号１５：ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのｂＨＬＨ−Ｚｉｐ断片からなる融合蛋白質のアミノ酸配列
配列表配列番号１６：その塩基配列
配列表配列番号１７：プライマーＭ−Ｔａｔの塩基配列
配列表配列番号１８：プライマーＴａｔ ３の塩基配列
配列表配列番号１９：プライマーＴａｔ ２の塩基配列
配列表配列番号２０：プライマーＴａｔ １の塩基配列
配列表配列番号２１：ＭＩＴＦのＡタイプＮ末領域（１−３０５）のアミノ酸配列
配列表配列番号２２：その塩基配列
配列表配列番号２３：ＨｉｓＴａｇ−ＰＴＤ−ＭＩＴＦのＡタイプＮ末領域（１−３０５）からなる融合蛋白質のアミノ酸配列
配列表配列番号２４：その塩基配列
配列表配列番号２５：プライマーＨＬＨ Ｆ
配列表配列番号２６：プライマーｐＴＤ３−ＭＩＴＦａ
配列表配列番号２７：プライマーＭＩＴＦＲ−Ｎ
【０１１４】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の融合蛋白質（ｍｉ系、ｗｈ系）および当該融合蛋白質を発現するプラスミドｐＳＵ０８２（ｍｉ系／ｐＴｒｃＨｉｓＢ）、ｐＳＵ０８３（ｗｈ系／ｐＴｒｃＨｉｓＢ）の構造を概略的に示したものである。
【図２】本発明の融合蛋白質（ＨＬＨ系）および当該融合蛋白質を発現するプラスミドｐＳＵ０８５（ＨＬＨ系／ｐＴｒｃＨｉｓＢ）の構造を概略的に示したものである。
【図３】本発明の融合蛋白質（ＡタイプＮ末領域）を発現するプラスミドｐＳＵ０８７（ＡタイプＮ末領域／ｐＳＵ０９３）の構築手順を概略的に示したものである。
【図４】本発明の融合蛋白質（ｗｈ系）を発現するプラスミドｐＳＵ１２１（ｗｈ系／ｐＥＴ１４）の構築手順を概略的に示したものである。
Claims (9)
- ＰＴＤおよび、ＭＩＴＦ阻害活性を有するＭＩＴＦ変異体であるＭＩＴＦのＡタイプのＮ末領域（１-３０５）断片から構成される融合蛋白質。
- 配列表の配列番号２３で示されるアミノ酸配列で表される請求項１に記載の融合蛋白質。
- 融合蛋白質が、配列表の配列番号２３で示されるアミノ酸配列の１又は複数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入又は付加してなる融合蛋白質であり、かつその活性が配列表の配列番号２３で示されるアミノ酸配列で構成される融合蛋白質が有するＭＩＴＦ阻害活性と同等であるアミノ酸配列で表される請求項1に記載の融合蛋白質。
- 請求項２に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
- 配列表の配列番号２４で示される塩基配列からなる請求項４に記載のＤＮＡ。
- 融合蛋白質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡが、配列表の配列番号２４で示される塩基配列の１又は複数個の塩基を置換してなるＤＮＡであり、かつそのアミノ酸配列で構成される融合蛋白質が有するＭＩＴＦ阻害活性が配列表の配列番号２３で示されるアミノ酸配列で構成される融合蛋白質が有するＭＩＴＦ阻害活性と同等であるアミノ酸配列をコードする請求項４に記載のＤＮＡ。
- 請求項１に記載の融合蛋白質を有効成分とする、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、肺線維症、癌、マストサイトーマ又はマストサイトーシスから選ばれる疾患の予防及び／又は治療剤。
- 請求項１に記載の融合蛋白質及び製剤学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。
- 請求項１に記載の融合蛋白質を有効成分とするマスト細胞の細胞死誘発剤。
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