JP2003523732A - マルチジンクフィンガー転写因子の核酸との結合 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、転写因子を特定する方法であって、潜在的転写因子をコードしているライブラリーをスクリーニングするためのおとりとして、少なくとも配列ＣＡＣＣＴを含む核酸配列を細胞に与え、特異性試験を実施して、該因子を単離することを含む方法に関する。好ましくは、該おとりは、ＣＡＣＣＴを２回含み、より詳しくは、該おとりは、配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎはスペーサー配列である）のうち一つを含む。本発明による方法を用いて特定される転写因子は、たとえば両手を有するジンクフィンガー転写因子のような、ジンクフィンガーの隔てられたクラスターを含む。本発明は、さらに、少なくとも一つのそのような、ＳＩＰ１と称されるジンクフィンガー転写因子が、Ｅ−カドヘリンの発現の下向調節によって腫瘍の転移を誘導することを開示する。そのため、ＳＩＰ１活性に干渉する化合物は、腫瘍の浸潤および転移を予防するのに用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、転写因子を特定する方法であって、潜在的転写因子をコードしてい
るライブラリーをスクリーニングするためのおとりとして、少なくとも配列ＣＡ
ＣＣＴを含む核酸配列を細胞に与え、特異性試験を実施して、該因子を単離する
ことを含む方法に関する。好ましくは、該おとりは、ＣＡＣＣＴを２回含み、よ
り詳しくは、該おとりは、配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−
ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（
Ｎはスペーサー配列である）のうち一つを含む。

【０００２】 本発明による方法を用いて特定される転写因子は、たとえば両手を有するジン
クフィンガー転写因子のような、ジンクフィンガーの分離したクラスターを含む
。本発明は、さらに、少なくとも一つのそのような、ＳＩＰ１と称されるジンク
フィンガー転写因子が、Ｅ−カドヘリンの発現の下向調節によって腫瘍の転移を
誘導することを開示する。そのため、ＳＩＰ１の活性に干渉する化合物は、腫瘍
の浸潤および転移を予防するのに用いることができる。

【０００３】 （発明の背景） ジンクフィンガーは、真核生物に見出される最も一般的なＤＮＡ結合モチーフ
の一つである。酵母ゲノムがコードしている５００のジンクフィンガータンパク
質が存在し、すべての哺乳動物遺伝子のおそらく１％は、タンパク質を含むジン
クフィンガーをコードしていると推計される。これらは、亜鉛の配位に利用でき
るシステインおよびヒスチジン残基の数と位置とに従って分類される。ツメガエ
ル属の転写因子IIIAに代表される〔１９〕、ＣＣＨＨクラスが最大である。これ
らのタンパク質は、縦列反復中に二つまたはそれ以上のフィンガーを有する。対
照的に、ステロイド受容体は、システイン残基のみを有するにすぎず、それらが
、４（Ｃ₄）〜５（Ｃ₅）個のシステインによる２種類の亜鉛配位構造を形成して
いる〔２８〕。ジンクフィンガーの第三のクラスは、ＣＣＨＣフィンガーを有す
る。ショウジョウバエ属、および哺乳動物やレトロウイルスタンパク質に見出さ
れるＣＣＨＣフィンガーは、共通配列Ｃ−Ｘ₂−Ｃ−Ｘ₄−Ｈ−Ｘ₄−Ｃを示す〔
７、２１、２４〕。最近、Ｃ−Ｘ₅−Ｃ−Ｘ₁₂−Ｈ−Ｘ₄−Ｃ型の、ＣＣＨＣフィ
ンガーの新規な立体配置が、神経ジンクフィンガー因子／ミエリン転写因子ファ
ミリーに見出された〔１１、１２、３６〕。最後に、ＧＡＬ４やＣＨＡ４のよう
な、いくつかの酵母転写因子は、２個の亜鉛イオンを配位する、非典型的なＣ₆
ジンクフィンガー構造を有する。

【０００４】 ジンクフィンガーは、通常、１タンパク質あたり複数のコピー（３７以下）と
して見出される。これらのコピーは、縦列アレーに組織化されることができて、
単一クラスターまたは複数クラスターを形成するか、またはタンパク質全体に分
散されることができる。いくつかのファミリーの転写因子は、大幅に分離した２
個（または３個）のクラスターをそのタンパク質配列中に有する、同じ全体的構
造を共有する。第一のもの、すなわちＭＢＰ／ＰＲＤII−ＢＦ１転写因子ファミ
リーは、Drosophila、SchnurriおよびSpalt遺伝子を包含する〔１、３、６、１
４、３３〕。ＭＢＰ−１（ＰＲＤII−ＢＦ１としても知られる）とＭＢＰ−２と
は、ともに、二つのＣＣＨＨジンクフィンガーの大幅に分離した２個のクラスタ
ーを有する。ＭＢＰ−１とＭＢＰ−２との間の全体的類似性は、５１％であるが
、Ｎ末端およびＣ末端双方のジンクフィンガークラスターについては、保存はは
るかに高い（９０％以上）〔３３〕。このことは、これらのタンパク質の機能に
おける両クラスターの重要な役割を示している。加えて、ＭＢＰ−１のＮ末端お
よびＣ末端ジンクフィンガークラスターは、互いに非常に相同性に富む〔３〕。
神経特異的なジンクフィンガー因子１および因子３（ＮＺＦ−１およびＮＺＦ−
３）はもとより、ミエリン転写因子１（ＭｙＴ１、ＮＺＦ−２としても知られる
）も、ＣＣＨＣジンクフィンガーの大幅に分離した二つのクラスターを有するタ
ンパク質のもう一つのファミリーに属する〔１１、１２、３６〕。ＭＢＰタンパ
ク質と同様に、異なるＮＺＦ因子が、高度の配列同一性（８０％以上）をそれぞ
れのジンクフィンガークラスター間に示すのに対し、ジンクフィンガークラスタ
ー領域外の配列は、非常に多様である〔３６〕。加えて、これらのクラスターは
、それぞれ、独立にＤＮＡに結合することができ、類似する中核的共通配列を認
識する〔１１〕。ＮＺＦ−３は、この共通配列のただ一つのコピーを有するＤＮ
Ａ要素に結合するが、この配列の２コピーを有する二***した要素との相対的親
和性の顕著な増加を示すことが示された〔３６〕。このことは、ＮＺＦ因子は、
反復される配列にも結合し得ることを示唆する。しかし、この二裂要素とのＮＺ
Ｆ−３の協同的結合の裏にある機序は、今のところ不明である。ショウジョウバ
エ属のＺｆｈ−１、および脊椎動物のδＥＦ１タンパク質（ＺＥＢまたはＡＲＥ
Ｂ６としても知られる）は、転写因子の第三のファミリーに属する。このファミ
リーは、ＣＣＨＨジンクフィンガーの分離した２クラスター、およびホメオドメ
イン様構造の存在を特徴とする（図１Ａを参照されたい）〔４、５、３５〕。δ
ＥＦ１では、Ｎ末端およびＣ末端クラスターも、非常に相同性に富み、非常に類
似する中核共通配列に独立に結合することが示された〔１０〕。最近、Ｎ末端ま
たはＣ末端のいずれかを欠く、δＥＦ１の突然変異型は、そのＤＮＡ結合能を失
っていることが示されたが、これは、両クラスターとも、ＤＮＡとのδＥＦ１の
結合に必要とされることを示している〔３１〕。Ｅｖｉ−１転写因子は、１０個
のＣＣＨＨジンクフィンガーを有することが示されたが；７ジンクフィンガーは
、Ｎ末端領域に存在し、３ジンクフィンガーは、Ｃ末端にある〔２２〕。この因
子では、上記の転写因子とは状況が異なるが、それは、この二つのクラスターが
、完全長Ｅｖｉ−１によって同時に結合される、異なる二つの標的配列に結合す
るからである〔２０〕。完全長Ｅｖｉ−１の結合は、主として、二つの標的配列
が一定の相対的配向に位置するときに観察されるが、これら二つの標的配列間に
、最適な間隔のための厳格な必要条件が存在するわけではない。

【０００５】 細胞−細胞接着は、細胞分化、組織発生、および組織のホメオスタシスの際の
支配的な必要性である。崩壊した細胞−細胞接着の効果は、多くの癌で示されて
いて、転移、および劣悪な予後が、細胞−細胞接着の喪失と相関している。Ｅ−
カドヘリン、ホモフィリックなＣａ²⁺依存性貫膜接着分子、および付随するカテ
ニンは、上皮の細胞結合系の主要な構成要素のいくつかである。Ｅ−カドヘリン
は、腫瘍細胞系統で〔４６、４７〕、またin vivoでの腫瘍モデル系で〔４８〕
浸潤抑制の強力な役割を果たす。腫瘍の進行の際のＥ−カドヘリン発現の喪失は
、１５を越える異なる種類の癌腫について記載されている〔４９〕。大規模な分
析により、Ｅ−カドヘリン対立遺伝子の双方の体細胞不活化突然変異の結果とし
ての、異常なＥ−カドヘリン発現は、まれであり、これまでは、ほぼびまん性胃
癌および浸潤性小葉性乳癌に限定されていることが明らかにされた〔５０、５１
〕。ノーザンブロット分析およびin situハイブリダイゼーション研究により、
ヒトの癌腫におけるＥ−カドヘリン免疫反応性の低下は、ｍＲＮＡレベルの低下
と相関することが解明された〔５２〜５４〕。マウスおよびヒトのＥ−カドヘリ
ンプロモーター配列の解析により、ＣＣＡＡＴボックスおよびＧＣボックスを包
含する正の調節要素とともに、強力なリプレッサーの役割を有する二つのＥボッ
クス（ＣＡＮＮＴＧ）を有する、保存されたモジュラー構造が解明された〔５５
、５６〕。Ｅ−カドヘリンプロモーターの二つのＥボックスの突然変異分析は、
Ｅ−カドヘリンの上皮特異的な発現の調節における決定的な役割を立証した。こ
れら二つのＥボックス要素の突然変異は、脱分化した癌細胞におけるＥ−カドヘ
リンプロモーターの上向調節を生じるが、野生型プロモーターは、低い活性を示
す〔５５、５６〕。

【０００６】 （発明の要約） ＤＮＡ結合の機序は、上記の錯体因子のほとんどについて、僅かに理解されて
いるにすぎないままである。δＥＦ１およびＳＩＰ１のような、両手を有するジ
ンクフィンガー転写因子の新生ファミリーに属する脊椎動物転写因子のＤＮＡ結
合特性を特徴付けることが、本発明である。ＳＩＰ１は、この転写因子ファミリ
ーの一員であって、最近単離され、Ｓｍａｄ相互作用性タンパク質として特徴付
けられた〔３４〕。骨格の発生、および筋細胞分化に関与する転写因子である、
該ＳＩＰ１およびδＥＦ１は、同じファミリーの転写因子に属する。これらは、
ＣＣＨＣジンクフィンガーの、高い配列同一性（＞９０％）を共有する、分離し
た２クラスターを有する。これらの転写因子のＤＮＡ結合特性を調べた。ＳＩＰ
１のＮ末端およびＣ末端クラスターは、高い配列相同性を示すばかりでなく、本
発明によれば、それぞれ、５′−ＣＡＣＣＴという配列に結合する。さらに、Br
achyury、α４−インテグリンおよびＥ−カドヘリンのような標的遺伝子候補の
プロモーター領域内の完全長ＳＩＰ１およびδＥＦ１に対する高親和性結合部位
は、一つのＣＡＣＣＴ配列と一つのＣＡＣＣＴＧ配列とで構成される、二裂要素
である。両配列の相対的配向のためには、厳格な必要条件は全く観察されず、そ
れら（Ｎとも称される）の間隔は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、
１０．．．．．ないし少なくとも４４bpまで変動し得る。これらの二裂要素に結
合するには、両ＳＩＰ１ジンクフィンガークラスターの完全性が必要であり、そ
れらが、ともに、ＤＮＡとの結合に関与することを示している。さらに、ＳＩＰ
１は、一方のジンクフィンガークラスターをＣＡＣＣＴに接触させ、他方のジン
クフィンガークラスターをＣＡＣＣＴＧ配列に結合させることによって、単量体
としてＣＡＣＣＴ−Ｘ_N−ＣＡＣＣＴＧ部位に結合する。結合のこの新規な様式
は、ジンクフィンガーの分離したクラスターを有するその他の転写因子に一般化
できる可能性があり、その他のＳｍａｄ結合タンパク質に適用され得る。その上
、Ｓｍａｄ相互作用性タンパク質であるＳＩＰ１は、Ｅ−カドヘリン陰性のヒト
癌腫細胞系で高率の発現を示して、Ｅ−カドヘリン転写の下向調節を招く。Ｅ−
カドヘリン陽性のＭＤＣＫ細胞におけるＳＩＰ１の条件的発現も、Ｅ−カドヘリ
ンを介しての細胞間接着、および同時に誘導される浸潤を廃棄する。そのため、
ＳＩＰ１は、たとえば抗ＳＩＰ１抗体、ＳＩＰに特異的に結合する小分子、アン
チセンス核酸、およびリボザイムのような、ＳＩＰ１産生に干渉するか、または
その活性が腫瘍の浸潤および転移を阻害できる、強力な浸潤促進分子および化合
物であると考えられる。

【０００７】 したがって、本発明は、アクチベーターおよび／またはリプレッサーのような
転写因子を特定する方法であって、潜在的転写因子をコードしているライブラリ
ーをスクリーニングするためのおとりとして、少なくとも配列ＣＡＣＣＴ、好ま
しくはＣＡＣＣＴ配列を２回含む核酸配列を細胞に与え、特異性試験を実施して
、該因子を単離することを含む方法に関する。もう一つの実施態様では、おとり
は、配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴ
Ｇ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎは、スペーサー配列
である）のうち一つを含む。後者のスペーサー配列は、長さが変動することがで
き、Ｎ＝０bpないしＮ＝４４bp以上までのいかなる数の塩基対（bp）を有するこ
ともできる。したがって、たとえば、Ｎは、長さが０、１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０
、７０、８０、９０、１００、２００、３００または４００bpであることができ
る。

【０００８】 本発明による方法を用いて特定される転写因子は、たとえば両手を有するジン
クフィンガー転写因子のような、ジンクフィンガーの分離したクラスターを含む
。

【０００９】 上に列挙された配列は、いかなるプロモーター領域を起源としてもよいが、好
ましくは、Brachyury、α４−インテグリン、フォリスタチンまたはＥ−カドヘ
リンから選ばれる群（標的遺伝子とも称される。以下を参照されたい）を起源と
する。

【００１０】 上に参照した方法によって得られる転写因子も、やはり本発明の一部である。

【００１１】 もう一つの実施態様では、本発明は、上記のとおりに得られる転写因子に対し
て干渉能を有する化合物を特定する方法であって、

【００１２】 （ａ）特定しようとする潜在的化合物を含むサンプルを、（ｉ）おとりとしての
、配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ
−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎは、スペーサー配列で
ある）のうち一つを含むヌクレオチド配列、および（ii）該ヌクレオチド配列と
結合できるタンパク質を含む試験系に加え、

【００１３】 （ｂ）該サンプルを該系内で、該化合物またはその誘導体もしくはその相対物と
該タンパク質との相互作用を許すのに充分な期間温置し、そして

【００１４】 （ｃ）該ヌクレオチド配列に結合したタンパク質の量および／または活性を該添
加の前後で比較する ことを含む方法に関する。

【００１５】 ヌクレオチド配列に結合したタンパク質の量を、試験サンプルの添加の前後で
比較することは、たとえば、ゲルバンドシフトアッセイまたはフィルター結合ア
ッセイを用いて達成することができる。次の工程としては、こうして特定された
化合物を、当業者に公知の方法に従って、単離し、場合により精製し、さらに分
析することができる。工程（ａ）（ii）のタンパク質は、該ヌクレオチド配列に
結合できるいかなるタンパク質であることもできるが、好ましくは、ＳＩＰ１の
ようなＳｍａｄ相互作用性タンパク質である。

【００１６】 後者の方法によって特定された化合物も、本発明の一部である。用語「転写因
子に対する干渉能を有する化合物」によって、転写因子の生物活性を調整する（
すなわち阻害、弱化、強化する）ことができる化合物を意味する。より具体的に
は、後者の化合物は、ＳＩＰ１の産生および／もしくは生物活性を完全にか、ま
たは部分的に阻害することができる。そのような化合物の例は、ＳＩＰ１タンパ
ク質に特異的に結合する小分子もしくは抗ＳＩＰ１抗体、またはそれから誘導さ
れる機能的フラグメント、あるいはＳＩＰ１、またはＳＩＰ１が結合するプロモ
ーター領域と結合する小分子をコードしている、ｍＲＮＡに結合するアンチセン
ス核酸もしくはリボザイムである。ちなみに、本発明は、ＳＩＰ１によるＥ−カ
ドヘリン発現の調節を調整する化合物に関する。

【００１７】 より具体的には、本発明は、ＳＩＰ１の産生および／または活性の阻害を通じ
て、標的遺伝子Ｅ−カドヘリンの発現の下向調節を阻害する化合物に関する。換
言すれば、本発明は、ＳＩＰ１によるＥ−カドヘリン発現の下向調節に起因する
、腫瘍の浸潤および／もしくは転移を予防または治療するための医薬として用い
ることができる化合物に関する。後者の化合物を生成かつ使用する方法は、以下
に例示する。

【００１８】 本発明の対象範囲には、該方法を実施するための試験キットであって、少なく
とも（ｉ）配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ、Ａ
ＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎは、スペーサ
ー配列である）のうち一つを含むヌクレオチド配列、および（ii）該ヌクレオチ
ド配列と結合できるタンパク質を含む試験キットも属する。

【００１９】 もう一つの実施態様では、本発明は、当技術に開示されたような、いわゆるツ
ーハイブリッドスクリーニングアッセイに対する代替策に関する。いくつかの手
段および方法が、タンパク質の結合パターンを特定するために開発されている。
その結果、数多くの個々の結合タンパク質の特定が行われた。これらのタンパク
質の多くは、いわゆるツーハイブリッド系を用いて見出されている。ツーハイブ
リッドクローニング系は、いくつかの研究室で開発された〔Chien et al., 1991
；Durfee et al., 1993；Gyuris et al., 1993〕。すべてが、三つの基本的な構
成要素；すなわち、ＤＮＡ結合ドメインに融合した既知タンパク質の発現のため
の酵母ベクター、転写活性化ドメインに融合した、ｃＤＮＡにコードされたタン
パク質の発現を指図する酵母ベクター、およびＤＮＡ結合ドメインのための結合
部位を有する酵母リポーター遺伝子を有する。これらの構成要素は、詳細が系ご
とに異なる。すべての系は、Ｇａｌ４またはＬｅｘＡのいずれかからのＤＮＡ結
合ドメインを利用する。Ｇａｌ４ドメインは、リポーター遺伝子の上流に置くこ
とができる充分に定義された結合部位に高い親和性でそれが結合する、酵母の核
に効率的に局在する〔Silver et al., 1986〕。ＬｅｘＡは、核局在シグナルを
保有しないが、酵母核に進入し、充分なレベルで発現されるとき、リポーター遺
伝子の上流に置かれたＬｅｘＡ結合部位（オペレーター）を効率的に占拠する〔
Brent et al., 1985〕。固有の酵母タンパク質は、ＬｅｘＡオペレーターには全
く結合しない。

【００２０】 異なる系は、異なるリポーターも利用する。ほとんどの系は、ＧＡＬ１遺伝子
またはＣＹＣ１遺伝子のいずれかからの、ｌａｃＺに融合した酵母プロモーター
を用いる〔Yocum et al., 1984〕。これらのｌａｃＺ融合は、多コピーの酵母プ
ラスミドに駐在するか、または酵母染色体に組み込まれている。ｌａｃＺ融合を
適切なリポーターにするには、ＧＡＬ１またはＣＹＣ１転写調節領域を除去し、
用いようとするＤＮＡ結合ドメインによって認識される結合部位と置き換えてい
る。ｌａｃＺリポーターの活性化のためのスクリーンは、Ｘ−Ｇａｌを含む指標
プレート（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）
に、酵母を播種することによって実施し；この培地で、リポーターが転写される
酵母が、β−ガラクトシドを産生し、青色に変色する。いくつかの系は、第二の
リポーター遺伝子、および特定の培地で成長するのにこのリポーターの発現を必
要とする酵母菌株を用いる。これらの「選別できるマーカー」遺伝子は、通常、
アミノ酸の生合成に必要とされる酵素をコードしている。そのようなリポーター
は、青い酵母に対する視覚的なスクリーンではなく、相互作用性タンパク質をコ
ードするｃＤＮＡについての選別を与えるという顕著な利点を有する。マーカー
遺伝子から適切なリポーターを作るには、それらの上流の転写調節要素を、ＤＮ
Ａ結合ドメインに対する結合部位と置き換えている。ＨＩＳ３およびＬＥＵ２遺
伝子は、ともに、それぞれヒスチジンまたはロイシンのいずれかを欠く培地で成
長するのにその発現を必要とする、適切な酵母菌株と結び付いたリポーターとし
て用いられている。最後に、異なる系は、活性化に関連付けられたｃＤＮＡタン
パク質を発現するための異なる手段を用いる。現在のすべての図式で、ｃＤＮＡ
にコードされたタンパク質は、アミノ末端の活性化ドメインによって発現される
。用いられる活性化ドメインは、Ｇａｌ４からの非常に強い活性化ドメイン、ヘ
ルペス・シンプレックスウイルスタンパク質ＶＰ１６からの非常に強い活性化ド
メイン、またはＢ４２と呼ばれる細菌に由来する、比較的弱い活性化ドメインを
包含する。活性化に関連付けられた、ｃＤＮＡにコードされたタンパク質は、構
成的プロモーター、またはＧＡＬ１遺伝子のそれのような条件的プロモーターの
いずれかから発現される。条件的プロモーターを用いることは、リポーター遺伝
子の活性化が、活性化に関連付けられたｃＤＮＡタンパク質の発現に依存するこ
とを迅速に証明するのを可能にする。

【００２１】 上記の考察から、結合タンパク質を発見するためのツーハイブリッド系が過去
に用いられたことは明らかである。しかし、慣用のツーハイブリッド系は、他の
タンパク質に結合できるタンパク質性分子を発見する際の貴重な手段であると証
明されてはいるが、（非常に）人工的な系である。いかなるツーハイブリッド系
の特徴も、融合タンパク質を、その結合相手が探索される部分と、結合の検出を
可能にするリポーター部分とで構成することである。妥当な結合相手を見出すに
は、いくつかの基準が満たされなければならず、その一つは、当然、該タンパク
質中の、他のタンパク質との結合が生じる領域を正しく選ぶことである。前もっ
て正確に予測するための、不可能ではないにしても、はるかに困難であるもう一
つの基準は、該領域の正しい折り畳み（すなわち、天然タンパク質中の該領域の
折り畳みに充分に類似する、該領域の折り畳み）を達成することである。正しい
折り畳みは、まずもって、該融合タンパク質を生成するために選ばれる実際のア
ミノ酸配列に依存する。妥当な結合相手の特定を決定するもう一つの要因は、結
合が検出できる感度である。

【００２２】 上記の慣用のツーハイブリッド系に対する代替策も、本発明で提供される。し
たがって、本発明のこれに代わる目的は、転写アクチベーターの活性の再構成を
用いて、タンパク質間の相互作用、およびその限りでの相互作用に対する、他の
化合物の影響を検出するためのin vivoでの方法およびキットを提供することで
ある。この再構成は、二つの、いわゆるハイブリッドのキメラまたは融合タンパ
ク質を利用する。これら二つの融合タンパク質は、それぞれ、互いに独立に、配
列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ
−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎは、スペーサー配列である
）のうち一つを含む核酸配列に対して弱い親和性を示す。しかし、いずれの融合
タンパク質も、独立に、該配列に結合させようとし、その結果、二つの融合タン
パク質のそれぞれにそれぞれ有効な試験タンパク質が、密接に接近したとき、配
列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ
−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎは、スペーサー配列である
）のうち一つを含む該核酸配列に対する結合親和性は、はるかに強くなる。二つ
の試験タンパク質が、実際に作用し合えるならば、その結果として、それらは、
転写アクチベーターの２ドメインを密接に接近させる。この接近は、転写を生じ
るのに充分であって、配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧ
ＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎは
、スペーサー配列である）のうち一つを含む核酸配列に隣接して位置するマーカ
ー遺伝子の活性によって、検出することができる。これによれば、第一の相互作
用性タンパク質と第二の相互作用性タンパク質との相互作用を検出する方法であ
って、

【００２３】 （ａ）適する宿主細胞に、配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−
ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（
Ｎは、スペーサー配列である）のうち一つを含む核酸配列と結合できるＤＮＡ結
合ドメインに融合した、第一の相互作用性タンパク質を含む第一の融合タンパク
質を与え、

【００２４】 （ｂ）該適する宿主細胞に、配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ
−ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ
（Ｎは、スペーサー配列である）のうち一つを含む核酸配列と結合できるＤＮＡ
結合ドメインに融合した、第二の相互作用性タンパク質を含む第二の融合タンパ
ク質を与え、

【００２５】 （ｃ）該宿主細胞を、第一の相互作用性タンパク質と第二の相互作用性タンパク
質とを密接に接近させる条件に付し、そして

【００２６】 （ｄ）該宿主細胞内に存在し、該核酸配列に隣接して位置する検出可能な遺伝子
が、第一および第二の相互作用性タンパク質間の相互作用の不在下で発現された
場合より大きい程度に発現されたか否かを決定することを含む方法が提供される
。

【００２７】 一例として、特定のタンパク質（おとり）に対する結合相手（獲物）が特定さ
れている場合、おとりを含む第一融合タンパク質は、たとえば、配列ＣＡＣＣＴ
−Ｎ−ＡＧＧＴＧの配列ＣＡＣＣＴ（またはＡＧＧＴＧ）に結合し、獲物を含む
第二融合タンパク質は、（それぞれ）配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧＴＧの配列Ａ
ＧＧＴＧ（またはＣＡＣＣＴ）に結合するため、マーカー遺伝子の転写が生じる
ことは、明らかであると思われる。

【００２８】 本発明は、最後に、新たな配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ
−ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ
（Ｎは、上記に定義されたとおりのスペーサー配列である）に、かつ少なくとも
配列ＣＡＣＣＴを含むその他いかなる配列にも加えて、該配列の、既に記載され
た標的配列Brachyury、α４−インテグリン、フォリスタチンまたはＥ−カドヘ
リンとは異なる新規標的遺伝子を、当業者に公知のいかなる方法にもよって特定
するために用いる用途に関する。

【００２９】 下記の定義は、本明細書で本発明を記載するのに用いられる様々な用語の意味
および対象範囲を例示かつ定義するために説明され、それらの意味は、以下、明
快さを旨としてさらに詳述される。

【００３０】 「核酸」または「核酸配列」は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、二本鎖もしくは一
本鎖ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、または当業者に公知のいかなる形態の核酸
配列も意味する。

【００３１】 本願に用いられる用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、互換性を有
する。「ポリペプチド」は、アミノ酸の重合体（アミノ酸配列）を意味し、特定
の長さの分子を意味しない。したがって、ペプチドおよびオリゴペプチドは、ポ
リペプチドの定義内に包含される。この用語は、ポリペプチドの転写後修飾、た
とえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などを意味するか、または包含する
。この定義に包含されるのは、たとえば、アミノ酸（たとえば非天然アミノ酸等
々）の一つまたはそれ以上の類似体を含むポリペプチド、置換された結合を有す
るポリペプチド、ならびに天然に産するもの、および天然に産しないもの双方の
、当技術に公知のその他の修飾である。上記のタンパク質およびポリペプチドは
、指定された核酸配列から必ずしも翻訳されず；ポリペプチドは、たとえば化学
的合成、または組換え発現系の発現、または適切なウイルス系からの単離を包含
する、いかなる方式で生成されてもよい。アミノ酸の１種類もしくはそれ以上の
類似体、リン酸化されたアミノ酸、または非天然アミノ酸を含んでもよい。アミ
ノ酸の類似体を配列に挿入する方法は、当技術に公知である。ポリペプチドは、
当業者に公知である、一つまたはそれ以上の標識を含んでもよい。これに関連し
て、タンパク質は、当技術に公知の慣用の方法によってさらに修飾されてよいこ
とも理解される。タンパク質を与えることによって、生物学的活性を保持するフ
ラグメント、すなわち成熟した、加工された形態を決定することも可能である。
このことは、成熟タンパク質から誘導された、その結合活性に死活的に重要なア
ミノ酸配列を含む、キメラのタンパク質およびペプチドの構成を可能にする。そ
の他の機能性アミノ酸配列は、たとえば化学的手段によって、タンパク質に物理
的に結合されるか、または当技術に公知の組換えＤＮＡ手法によって融合されて
もよい。

【００３２】 用語「誘導体」、「配列の機能性フラグメント」または「配列の機能性部分」
は、参照された本来の配列の断端配列を意味する。断端配列（核酸またはタンパ
ク質配列）は、長さに大きな変動幅があることができ；最小の大きさは、参照さ
れた本来の配列の少なくとも同等の機能および／または活性を配列に与えるのに
充分な大きさの配列であるのに対し、最大の大きさは、非常に重要ということは
ない。いくつかの用途では、最大の大きさは、通常、本来の配列の望みの活性お
よび／または機能を与えるのに必要とされるより実質的に大きくはない。代表的
には、断端アミノ酸配列は、長さが約５〜約６０アミノ酸にわたることになる。
しかし、より代表的には、配列は、長さが約５０アミノ酸の最大値、好ましくは
約３０アミノ酸の最大値であると思われる。約１０、１２または１５アミノ酸以
上で、約２０〜２５アミノ酸の最大値以下の配列を選ぶのが、通常望ましい。

【００３３】 用語「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列
」、「ＤＮＡ配列」または「核酸分子」は、本明細書に用いられる限りで、いか
なる長さのヌクレオチド、すなわちリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレ
オチドのいずれかの重合体形態を意味する。この用語は、分子の一次構造のみを
意味するにすぎない。したがって、この用語は、二本鎖および一本鎖ＤＮＡとＲ
ＮＡとを包含する。また、天然に産するヌクレオチドの一つまたはそれ以上の、
公知の形式の修飾、たとえばメチル化、すなわち類似体との「キャップ」置換も
包含する。

【００３４】 「コーディング配列」は、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、ｍＲＮＡ
に転写され、かつ／またはポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。
コーディング配列の境界は、５′末端の翻訳開始コドン、および３′末端の翻訳
終止コドンによって決定される。コーディング配列は、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組
換えヌクレオチド配列またはゲノムＤＮＡを包含するが、これらに限定されない
ことができるが、イントロンは、一定の状況下に存在してもよい。

【００３５】 「転写因子」により、プロモーター、または付近のＤＮＡ配列に結合して、転
写開始を促進するか、または阻害する一群のタンパク質を意味する。

【００３６】 「プロモーター」により、ＲＮＡポリメラーゼのホロ酵素によって認識されて
、転写を開始する、配向されたＤＮＡ配列をが意味する。「ＲＮＡポリメラーゼ
」により、ＤＮＡテンプレートに相補的なＲＮＡを合成する、多サブユニットの
酵素を意味する。「ホロ酵素」により、多サブユニットよりなる酵素の活性形態
を意味する。

【００３７】 単数形または複数形の用語「抗体」は、ＳＩＰ−１のような転写因子に対して
特異的に誘導されたとして特徴付けられる抗体、またはそのいかなる機能性誘導
体にも関し、該抗体は、好ましくは、Ｆ（ａｂ′）₂、Ｆ（ａｂ）もしくは一本
鎖Ｆ_V型のモノクローナル抗体；またはその抗原結合フラグメント、あるいはそ
れから誘導されるいかなる種類の組換え抗体でもある。本発明のモノクローナル
抗体は、たとえば、ＳＩＰ１もしくはそのいかなる機能性誘導体に対しても免疫
感作された動物、特にマウスまたはラットの脾臓細胞と、骨髄腫細胞系の細胞と
から、古典的方法に従って形成され、それが該動物の免疫感作に初めに用いられ
たＳＩＰ１もしくはそのいかなる機能性誘導体も認識するモノクローナル抗体を
産生できる能力によって選別されるのが当然である、いかなるハイブリドーマに
よって産生することもできる。本発明のこの実施態様によるモノクローナル抗体
は、ＨおよびＬ鎖をコードしているマウスおよび／もしくはヒトゲノムＤＮＡ配
列、またはＨおよびＬ鎖をコードしているｃＤＮＡクローンから出発して、組換
えＤＮＡ技術を用いて製造された、マウスモノクローナル抗体のヒト向けにした
ものであってもよい。これに代えて、該モノクローナル抗体は、ヒトモノクロー
ナル抗体であってもよい。そのようなヒトモノクローナル抗体は、たとえば、Ｐ
ＣＴ／ヨーロッパ特許第99/03605号公報に記載されたとおり、重症の併発性免疫
不全（ＳＣＩＤ）のマウスのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）再集団形成によって
か、または米国特許第5,545,808号明細書に記載されたとおり、ヒト抗体を産生
できるトランスジェニックな非ヒト動物を用いることによって製造される。これ
らのモノクローナル抗体から誘導された、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）′₂およびｓｓＦ
ｖ（「一本鎖可変フラグメント」）のようなフラグメントも、本来の結合特性を
保持しているならば、本発明の一部を形成する。そのようなフラグメントは、た
とえば、パパイン、ペプシンその他のプロテアーゼによる抗体の酵素消化によっ
て、一般的に生成される。モノクローナル抗体またはそのフラグメントが様々な
用途に向けて修飾できることは、当業者には周知である。該抗体は、酵素、蛍光
または放射能の形式の適切な標識によって標識化することもできる。

【００３８】 用語「小分子」は、たとえば、組合せおよび天然の生成物ライブラリーから、
当技術に周知の方法によって得ることができる、小さい有機分子その他の薬物候
補に関する。固相の支持体に付着させたアミノ酸の可能なすべての組合せよりな
るランダムペプチドライブラリーを用いて、ＳＩＰ１にか、またはＳＩＰ１が結
合させたプロモーター領域に結合できるペプチドを特定してよい。ペプチドライ
ブラリーのスクリーニングは、ＳＩＰ１の生物学的活性を阻害するよう作用する
、製剤用薬剤の発見に治療上の価値を有する可能性がある。

【００３９】 用語「アンチセンス核酸」および「リボザイム」は、ＳＩＰ１ｍＲＮＡの翻訳
を阻害するよう機能する分子を意味する。アンチセンス核酸またはアンチセンス
ＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡに結合し、タンパク質の翻訳を阻害す
ることによって、ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するよう作用する。リボザイムは、
ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機
序は、相補的標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーショ
ンと、その後のエンドヌクレアーゼによる切断とを伴う。本発明の範囲内には、
ＳＩＰ１ＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ的切断を特異的かつ効率的に触媒する
、加工されたハンマーヘッドモチーフのリボザイム分子がある。可能ないかなる
ＲＮＡ標的の特異的リボザイム切断部位も、初めは、下記の配列、すなわちＧＵ
Ａ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位について、標的分子を走査す
ることによって特定される。特定されたならば、標的遺伝子の切断部位を有する
領域に相当する、１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌク
レオチド配列を不適切にし得る、二次構造のような予測された構造的特徴につい
て評価することができる。標的候補の適切性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイ
を用いて、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対するそれ
らの利用可能性を試験することによっても評価し得る。本発明のアンチセンスＲ
ＮＡおよびＤＮＡ分子の双方ならびにリボザイムは、ＲＮＡ分子の合成のための
当技術に公知のいかなる方法によっても調製し得る。これらは、オリゴデオキシ
リボヌクレオチドを化学的に合成するための、たとえば固相ホスホロアミダイト
化学合成のような、当技術に周知の手法を包含する。これに代えて、ＲＮＡ分子
は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードしているＤＮＡ配列の、in vitroおよびin
vivo転写によって生成してもよい。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ
６ポリメラーゼプロモーターのような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを
包括する、非常に多様なベクターに組み込んでよい。これに代えて、用いるプロ
モーターに応じて、アンチセンスＲＮＡを構成的にか、または誘導的に合成する
アンチセンスｃＤＮＡを、細胞系に安定的に導入することもできる。

【００４０】 上記の抗体、小分子、アンチセンス核酸およびリボザイムは、ＳＩＰ１による
Ｅ−カドヘリン発現の下向調節を阻害することによって、腫瘍の浸潤および／ま
たは転移を防止かつ／もしくは治療するための「医薬」として用いることができ
る。腫瘍が悪性であることは、腫瘍細胞が転移し（身体に広範囲に侵入し、陰険
な手段によって広まり）、結果的に、すべての悪性細胞を根絶できない限りは患
者を死亡させる、固有の性癖を意味する。したがって、転移は、悪性であること
の傑出した特徴性である。転移は、腫瘍細胞の、発祥の部位から、循環系その他
の経路によって運ばれる性癖であって、結果的に、それがこれらの細胞を、身体
のほとんどすべての組織および器官に定着させる。対照的に、良性腫瘍の細胞は
、発祥部位を中心とする一つの固体の塊体に互いに接触して、不変的に留まる。
良性腫瘍細胞は、物理的に連続しているため、位置が適当であれば、外科手術に
よって完全に除去し得る。しかし、悪性細胞−それぞれが個々に、新たな、分離
した部位に新たな細胞の塊体（新たな腫瘍）を（細胞***を通じて）生じ得る能
力を保有する−の散布は、成長の最も初期以外には、すべて、１回の外科手術の
操作による完全な根絶を阻む。本発明の「医薬」が、照射、化学療法または外科
手術のような、当技術に公知のその他いかなる腫瘍治療法とも併用できることは
明らかであると思われる。

【００４１】 上記の小分子に関して、用語「医薬」は、上記の小分子と、製薬上許容され得
る担体または賦形剤（両用語は、相互可換的に用いることができる）とを含む、
上記のとおりの疾病を治療するための組成物に関する。当業者に公知の適切な担
体または賦形剤は、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース液、ハンク液、固
定油、オレイン酸エチル、生理食塩水中の５％デキストロース、等張性および化
学的安定性を増進する物質、緩衝液および防腐剤である。適するその他の担体は
、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、および
アミノ酸共重合体のような組成物を摂取している個体に有害な抗体の産生をそれ
自体は誘導しない、いかなる担体も包含する。この「医薬」は、当業者の知識内
の適するいかなる方法によって投与してもよい。好適な投与経路は、非経口投与
である。非経口投与の際は、本発明の医薬は、溶液、懸濁液またはエマルション
のような単位投与量注射可能形態として、上記に定義されたとおりの製薬上許容
され得る賦形剤と結合して配合されることになる。しかし、投与量および投与方
式は、個体に依存することになる。一般的には、該医薬は、本発明の分子が、１
μg/kg〜１０mg/kg、より好ましくは１０μg/kg〜５mg/kg、最も好ましくは０．
１〜２mg/kgの用量で与えられるよう投与する。好ましくは、大型丸剤の用量と
して与える。連続注入も、用いてよく、浸透ミニポンプを通じての連続皮下送達
を包含する。その場合、該医薬は、毎分５〜２０μg/kg、より好ましくは毎分７
〜１５μg/kgの用量で注入してよい。

【００４２】 本発明の抗体、アンチセンス核酸およびリボザイムに関しては、治療のための
「医薬」の好適な投与方式は、上記分子を送達するために遺伝子療法を用いるこ
とである。遺伝子療法は、患者の細胞への治療的核酸の送達による治療を意味す
る。これは、Lever and Goodfellow 1995；Br. Med. Bull., 51, 1-242；Culver
1995；Lwdlwy, F.D., 1995, Hum. Gene Ther., 6, 1129に詳細に総説されてい
る。遺伝子療法を達成するには、患者の細胞に遺伝子を送達する方法と、いかな
る治療的遺伝子の効果的な生成も確保する、追加的な方法とが存在しなければな
らない。遺伝子の送達を達成するには、二つの一般的な取組み方があり；それは
、非ウイルス性送達、およびウイルス介在遺伝子療法である。

【００４３】 下記の実施例は、本発明の好適な特徴を、より充分に例示するが、決して発明
を限定しようとするものではない。

【００４４】 （実施例） −少なくともＣＡＣＣＴの配列を含む核酸配列の特徴付け 序論および要約 −ＳＩＰ１およびδＥＦ１は、一つのＣＡＣＣＴ配列、および一つのＣＡＣＣＴ
Ｇ配列を含む標的部位に結合する 本発明は、ＳＩＰ１のＤＮＡ結合特性に関する。上記のとおり、最近単離され
たＳｍａｄ相互作用性タンパク質であるＳＩＰ１は、両手を有するジンクフィン
ガー転写因子の新たに独立したファミリーに属する〔３４〕。ＳＩＰ１の構成は
、δＥＦ１、すなわちこのファミリーの原型成員のそれに非常に類似している。
いずれのタンパク質も、ＤＮＡとの結合に関与する、ジンクフィンガーの二つの
大幅に分離したクラスターを含む。これら二つのジンクフィンガークラスター内
では、アミノ酸配列相同性は、非常に高い（９０％より大）のに対し、他の領域
では、より明白ではない。この知見は、両タンパク質とも、類似のＤＮＡ標的に
類似の様式で結合すると思われることを示唆する。実際、ＳＩＰ１とともにδＥ
Ｆ１も、同等の親和力で、異なる多くの標的部位に結合し、それらは、常に、二
つのＣＡＣＣＴ配列を有する。ここで試験されたすべての標的部位について、両
ＣＡＣＣＴ配列の完全性が、ＳＩＰ１またはδＥＦ１のいずれの結合にも絶対的
に必要である。

【００４５】 ＳＩＰ１_FSは、ツメガエル属の胚で過剰発現されたとき、Ｘｂｒａ２発現を阻
害し〔３４〕、ＳＩＰ１_FSは、二つのＣＡＣＣＴ配列に接触することによってＸ
ｂｒａ２プロモーターに結合する。ツメガエル属のトランスジェニック胚を用い
た最近の研究は、２．１kbのＸｂｒａ２プロモーター配列が、Ｘｂｒａ２自体と
同じドメイン内のリポータータンパク質を発現するのに充分であることを示して
いる〔１７〕。しかし、このプロモーターにおける、下流のＣＡＣＣＴ部位（Xb
ra−Ｄ）内での（ゲル減速アッセイ（ゲルシフト法）に見られるような）ＳＩＰ
１の結合を破壊する点突然変異は、重大な効果を有する。マーカータンパク質の
発現は、早期に（すなわち第９期に）始まり、ここで、異所性の部位、たとえば
外胚葉、中胚葉および内胚葉細胞の大部分に見出される〔１７〕。このことは、
下流のＣＡＣＣＴ部位内に位置するこのヌクレオチドが、Ｘｂｒａ２遺伝子の正
しい空間的かつ時間的発現に必要とされることを示す。加えて、上流のＣＡＣＣ
Ｔ配列に突然変異が導入されたときは、Ｘｂｒａ２の、下流のＣＡＣＣＴ部位内
の突然変異と同じ、未成熟かつ異所性の発現が観察された。したがって、ＥＭＳ
ＡでのＳＩＰ１またはδＥＦ１の結合に影響することが知られている、下流また
は上流のいずれかのＣＡＣＣＴでの突然変異は、同じ表現型をin vivoで与えて
、ツメガエル属δＥＦ１様タンパク質が、Ｘｂｒａ２遺伝子の調節に参加するこ
とを示す。加えて、これらのin vivoでのデータは、ここに提示されたin vitro
での結合実験からの結論：すなわち、ＳＩＰ１／δＥＦ１様転写因子は、Ｘｂｒ
ａ２プロモーターの発現を調節するのに、二つのＣＡＣＣＴ部位を必要とするこ
とを裏付ける。

【００４６】 二つのＣＡＣＣＴ配列を含むすべてのプロモーター領域が、ＳＩＰ１またはδ
ＥＦ１結合部位を表すわけではない。特に、Ｘｂｒａ−ＷＴ要素中に存在する上
流ＣＡＣＣＴ配列を含む、Ｘｂｒａ−Ｆプローブの重複は、ＳＩＰ１またはδＥ
Ｆ１のいずれの結合にも不応性である。その上、ＳＩＰ１_NZFもＳＩＰ１_CZFも、
この部位（Ｘｂｒａ−Ｆ）に単量体または二量体として効率的に結合することが
できる。そのため、ＣＡＣＣＴに加えて他の配列も、高親和性結合部位を生成す
るのに必要とされる可能性がある。ＣＡＣＣＴＧは、常に、これらのジンクフィ
ンガークラスターの結合のための、より優れた標的部位であると思われる。実際
、高親和性ＣＡＣＣＴＧ部位（Ｘｂｒａ−Ｅ）は、ＳＩＰ１_NZFまたはＳＩＰ１_{C ZF} クラスターのいずれをも結合することが示された。加えて、ＣＡＣＣＴＡへの
ＣＡＣＣＴＧ部位の改変は、ＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１のＸｂｒａプロモーター
との結合に強い影響を及ぼして、この３′−グアニン残基の重要性を確認する。
すべてのＳＩＰ１およびδＥＦ１標的部位の配列を比較することによって、最小
共通配列は、１ＣＡＣＣＴ配列および１ＣＡＣＣＴＧ配列で構成されることが見
出されて、これら二つの配列がＳＩＰ１またはδＥＦ１に対する高親和力結合部
位を形成するのに充分であることを立証した。

【００４７】 上流ＣＡＣＣＴ配列は、ＳＩＰ１_CZFまたはＳＩＰ１_NZFを結合できないが、こ
の配列は、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブという文字列内で、完全長ＳＩＰ１に接触さ
れる。上流ＣＡＣＣＴ配列は、Ｘｂｒａ−ＷＴとのＳＩＰ１_FSの結合には必須条
件である。そのため、上流ＣＡＣＣＴ配列をもう一つの高親和性ＣＡＣＣＴＧ部
位（Ｘｂｒａ−Ｅ）と組み合わせたとき、この低親和性部位（Ｘｂｒａ−Ｆ）は
、ＳＩＰ１_FSの結合に付されるようになる。ＳＩＰ１_FSは、そのジンクフィンガ
ークラスターの一つの結合を通じてその標的プロモーターを高親和性ＣＡＣＣＴ
Ｇ部位（たとえばＸｂｒａ−Ｅ）に接触させるモデルが好都合であって、その後
に、低親和性ＣＡＣＣＴ部位（Ｘｂｒａ−Ｆ）の第二のクラスターによる接触が
生じ、この追加の相互作用が、ＳＩＰ１の結合を強く安定化する。したがって、
ＣＡＣＣＴ部位は、遺伝子発現の調節に重要な機能をなおも有し得るが、それ自
体でさえ、ＳＩＰ１_NZF、ＳＩＰ１_CZFまたはＳＩＰ１_FSのいずれをも結合しない
。

【００４８】 δ１−クリスタリンエンハンサーからのＤＣ５プローブは、δＥＦ１を特異的
に結合することが以前示された〔３１〕。しかし、このプローブは、ＣＡＣＣＴ
部位を一つのみ含むにすぎない。そのため、δＥＦ１に対する高親和性結合部位
は、１ＣＡＣＣＴ配列および１ＣＡＣＣＴＧ配列を含まなければならないことが
ここで立証されたにもかかわらず、特定の場合、たとえばＤＣ５プローブでは、
１ＣＡＣＣＴ部位が、この種の転写因子の結合に充分であると思われるのを除外
することはできない。

【００４９】 −ＳＩＰ１ＤＮＡ結合様式 ＥＭＳＡで独立に試験したとき、Ｃ末端とともにＮ末端のＳＩＰ１またはδＥ
Ｆ１のジンクフィンガークラスターが、非常に類似するＣＡＣＣＴ含有共通配列
に結合する。ＳＩＰ１とδＥＦ１との双方について、ＮＺＦ３およびＮＺＦ４は
、それぞれＣＺＦ２およびＣＺＦ３との大規模なアミノ酸配列相同性を共有する
。この相同性は、これら二つのクラスターが、類似する共通配列に結合できる理
由を説明し得る。加えて、ＳＩＰ１またはδＥＦ１は、いくつかの潜在的標的部
位に結合するのに二つのＣＡＣＣＴ配列を必要とすることが示されている。これ
らに結果に基づき、ＳＩＰ１およびδＥＦ１は、その標的要素に、一方のジンク
フィンガークラスターはＣＡＣＣＴ部位の一つに接触するが、他方のクラスター
は、第二のＣＡＣＣＴ部位に接触するというようにして、結合するということが
提唱されている（図２モデル１を参照されたい）。代替的な１モデルは、ＳＩＰ
１またはδＥＦ１は、単独二量体化してから、これらの標的部位に高い親和性で
結合できるということであると思われる（モデル２）。ＳＩＰ１_NZFのＤＮＡ結
合能は、ＮＺＦ３またはＮＺＦ４のいずれかの突然変異によって破壊される。同
様に、ＣＺＦ２またはＣＺＦ３内の突然変異も、ＳＩＰ１_CZFの結合能に影響す
る。これらの突然変異を、完全長ＳＩＰ１という状況に導入したとき、ＳＩＰ１ _FS の結合は、それ以上観察されない。このことは、二つのジンクフィンガークラ
スターの結合活性は、ＳＩＰ１_FSの、二つ一組のＣＡＣＣＴ部位を含むその標的
要素との結合に必要とされることを明白に示している。同様に、δＥＦ１の両ジ
ンクフィンガークラスターの完全性がＤＮＡを結合させるにも必要であることが
、以前に示された〔３１〕。これらの所見は、両ジンクフィンガークラスターは
、ＤＮＡに直接接触することを示している。したがって、二量体モデル（図２モ
デル２）では、一つのＳＩＰ１分子のＳＩＰ１_NZFは、一方のＣＡＣＣＴ配列に
結合し、第二のＳＩＰ１分子のＳＩＰ１_CZFは、他方のＣＡＣＣＴ配列に接触す
ることになる。そのような二量体の立体配置が存在するとするならば、それぞれ
、ＣＺＦまたはＮＺＦ内に異なる突然変異を有する完全長ＳＩＰ１分子の一定の
組合せは、その標的ＤＮＡに結合できる機能性二量体の形成を許すに違いないと
仮定することができる。試験された４種類のＳＩＰ１_FS突然変異種（ＮＺＦ３mu
t、ＮＺＦ４mut、ＣＺＦ２mutおよびＣＺＦ３mut）の可能な組合せのうち、ＥＭ
ＳＡにＤＮＡ／ＳＩＰ１複合体を生じさせるものは皆無であった。このことは、
ＳＩＰ１二量体の存在に対する反論となる。加えて、異なる標識を与えたＳＩＰ
１_FS分子を用いた、ＥＭＳＡ中のＳＩＰ１二量体の検出は、可能でもなく、その
二量体複合体を異なる抗体でスーパーシフトすることもできなかった。そのため
、ＳＩＰ１が、単量体として、一つのＣＡＣＣＴ配列と一つのＣＡＣＣＴＧ配列
を有する標的部位に結合するモデル１に支持が与えられる。

【００５０】 本発明では、二つのＣＡＣＣＴ配列の相対的配向、またはこれらの配列間の間
隔取りのいずれもが、ＳＩＰ１_FSまたはδＥＦ１の結合に非常に重要ではないこ
とが示された。このことは、これらの転写因子が、これらの異なる標的部位との
結合を適応される、高度に柔軟性に富む二次構造を示すに違いないことを立証す
る。ＳＩＰ１およびδＥＦ１内の二つのジンクフィンガークラスター間の長いリ
ンカー領域は、これらのタンパク質の二次構造におけるこの柔軟性を許す可能性
がある。これらの転写因子は、少なくとも４４bp隔てられたＣＡＣＣＴ配列を有
する部位（Ｅｃａｄ−ＷＴ）に結合することができて、プロモーター配列の約５
０bpの領域が、網羅され、そのため、ＳＩＰ１_FSまたはδＥＦ１がこのプロモー
ターに結合されたならば、転写アクチベーターに、より接近できなくなる可能性
があることを示唆している。このことは、ＳＩＰ１またはδＥＦ１は、ＳＩＰ１
またはδＥＦ１が網羅するこの領域内で結合する、転写アクチベーターと競合す
ることによって、転写リプレッサーとして機能することができることを示す。

【００５１】 −その他のファミリーの転写因子は、ＳＩＰ１に類似する機序でＤＮＡを結合し
得る。 このＤＮＡ結合の新たな様式も、ＳＩＰ１およびδＥＦ１のように、ＭＢＰ／
ＰＲＤII−ＢＦ１ファミリーのそれのようなジンクフィンガーの隔離されたクラ
スターを有する、その他の転写因子ファミリーに一般化し得る〔１、３、６、２
９、３３〕。ＳＩＰ１およびδＥＦ１についてと同様に、これらのジンクフィン
ガークラスターの保存は、このファミリーの異なる成員間で非常に強い〔１〕。
加えて、Ｃ末端クラスターは、Ｎ末端クラスターと高度に相同であり、ＰＲＤII
−ＢＦ１の場合、これらのクラスターは、独立に試験したとき、同じ配列に結合
する〔３〕。そのため、この種の転写因子は、一方のジンクフィンガークラスタ
ーと一方の配列との、および他方のクラスターと第二の配列との接触によって、
二つの反復される配列に結合し得る。同様に、ＮＺＦファミリーの転写因子の異
なる成員も、ジンクフィンガーの大幅に分離した二つのクラスターを有する〔１
１、１２、３６〕。ＭｙＴ１、ＮＺＦ−１およびＮＺＦ−３は、すべて、同じ共
通要素のＡＡＡＧＴＴＴに結合する。二つのＣＡＣＣＴ配列を含む要素との有意
に高い親和性を示す、ＳＩＰ１およびδＥＦ１についてと同様に、二つのＡＡＡ
ＧＴＴＴ配列を含む要素は、ＮＺＦ−３との顕著に高い親和性を示した〔３６〕
。このことは、これらの転写因子に対する高親和性結合部位を生成するためにも
、二つのＡＡＡＧＴＴＴ配列が必要であり、それらは、ＳＩＰ１およびδＥＦ１
と類似の機序で、ＤＮＡを結合する可能性があることを示唆する。最後に、Ｎ末
端に７ジンクフィンガー、およびＣ末端に３ジンクフィンガーを有する、Ｅｖｉ
−１タンパク質は、二つの共通配列に結合する。それは、第一部分とのＮ末端ジ
ンクフィンガークラスターの結合と、第二部分とのＣ末端クラスターの結合とを
伴い得る機序によって、複合共通配列（GACAAGATAAGATAA-N_1-28-CTCATCTTC）に
結合する〔２０〕。結論として、ここで記載されたＤＮＡ結合の様式は、ＳＩＰ
１／δＥＦ１ファミリーの転写因子に適用可能であるばかりでなく、より普遍的
でもある。

【００５２】 ＳＩＰ１は、Ｓｍａｄ１相互作用性タンパク質としてクローニングしたが、Ｓ
ｍａｄ２、３および５とも作用し合うことが示された〔３４〕。Ｓｍａｄタンパ
ク質は、ＢＭＰ／ＴＧＦ−βシグナリングカスケードに関与するシグナル伝達体
である〔１３〕。ＴＧＦ−βリガンドがセリン／トレオニンキナーゼ受容体複合
体に結合すると、受容体で調節されるＳｍａｄタンパク質は、Ｉ型受容体によっ
てリン酸化され、核へと移動して、標的遺伝子の転写を調整する。ＳＩＰ１とＳ
ｍａｄとの間の相互作用は、リガンド刺激の際にのみ観察されるにすぎず、Ｓｍ
ａｄは、ＳＩＰ１と作用し合える前に、活性化される必要があることを示す〔３
４〕。意外にも、ＳＩＰ１と類似の機序でＤＮＡを結合し得る転写因子である、
Ｅｖｉ−１は、Ｓｍａｄ３相互作用性タンパク質である〔１５〕。これまでは、
Ｅｖｉ−１は、Ｓｍａｄ３とＤＮＡとの結合を阻害したが、Ｅｖｉ−１の標的プ
ロモーターに対する効果が確かにあることが示された。ヒトＰＲＤII−ＢＦ１転
写因子のDrosophilaの相同体であるSchnurriは、やはりＳＩＰ１タンパク質と類
似の機序でＤＮＡを結合し得るタンパク質である。興味深いことに、Schnurriは
、ｄｐｐシグナリング経路での核タンパク質標的であることが提唱された〔１、
６〕。ｄｐｐは、ＴＧＦ−βファミリーの一員である。このことは、Schnurriを
、脊椎動物のＳｍａｄのDrosophila相同体である、DrosophilaＭａｄタンパク質
に対する核標的の候補にする。そのため、ＳＩＰ１が利用するＤＮＡ結合の様式
は、Ｓｍａｄ相互作用性タンパク質を有するその他のジンクフィンガーに一般化
することができ、核内のいくつかのＳｍａｄの相手の共通の特徴を表す。

【００５３】 これらの結果に基づき、δＥＦ１ファミリーの転写因子に関するＤＮＡ結合の
新規な様式が立証される。ＤＮＡ結合のこの様式は、ジンクフィンガーの分離さ
れたクラスターを有するその他のファミリーの転写因子にも該当する。

【００５４】 本実施例に用いた材料および方法 プラスミドの構築 哺乳動物細胞での発現のため、ＳＩＰ１〔３４〕およびδＥＦ１〔５〕のｃＤ
ＮＡをｐＣＳ３にサブクローニングした〔２７〕。このプラスミドでは、ＳＩＰ
１およびδＥＦ１の読取り枠は、（Ｍｙｃ）₆タグにＮ末端で融合している。Ｓ
ＩＰ１ｃＤＮＡは、pCDNA3（Invitrogen）にも、ＦＬＡＧというタグとのＮ末端
融合としてクローニングした。ＳＩＰ１_NZFおよびＳＩＰ１_CZFの発現のためには
、それぞれ第１〜３８９、および第９７７〜１，２１４アミノ酸をコードしてい
るｃＤＮＡフラグメントを、ｐＣＳ３にサブクローニングした。ＳＩＰ１_CZF（
第９５７〜１，１５６アミノ酸として）およびＳＩＰ１_NZF（第９０〜３８３ア
ミノ酸として）は、大腸菌でのＧＳＴ融合タンパク質（pGEX-5X-1中、Pharmacia
）として産生され、ＧＳＴ精製モジュール（Pharmacia）を用いて精製した。Ａ
ＲＥＢ６でなされたもの〔１０〕と同一の突然変異も、ＳＩＰ１ジンクフィンガ
ーに導入した。ジンクフィンガーＮＺＦ３、ＮＺＦ４、ＣＺＦ２およびＣＺＦ３
の突然変異誘発は、その第三ヒスチジンのセリンへの置換を伴う。これらの突然
変異は、下記のプライマーによる取組方に基づくＰＣＲを用いて導入した：

【００５５】

【表１】

【００５６】 突然変異させたそれぞれのクラスターを、ｐＣＳ３内の完全長ＳＩＰ１に再クロ
ーニングして、それぞれＮＺＦ３mut、ＮＺＦ４mut、ＣＺＦ２mutおよびＣＺＦ
３mutと名付けた、突然変異させたＳＩＰ１タンパク質を哺乳動物細胞内で産生
させた。さらに、これらの突然変異させたクラスターを、pGEX5-X2（Pharmacia
）にサブクローニングし、大腸菌内にＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＮＺＦ３
mut、ＧＳＴ−ＮＺＦ４mut、ＧＳＴ−ＣＺＦ２mutおよびＧＳＴ−ＣＺＦ３mut）
として産生させた。構成体は、すべて、制限マッピングおよび配列決定によって
確認した。

【００５７】 細胞培養およびＤＮＡトランスフェクション ＣＯＳ１の細胞を、１０％ウシ胎児血清で強化したＤＭＥＭ中で増殖させた。
細胞を、Fugene（Boehringer Mannheim）を製造者のプロトコルに従って用いて、
トランスフェクションし、３０〜４８時間後に捕集した。

【００５８】 ゲル減速アッセイ Ｘｂｒａ−ＷＴというオリゴヌクレオチドは、Ｘｂｒａ２というプロモーター
の−３４４〜−２９４の領域にまたがる〔１６〕。α４−インテグリンプロモー
ターの−４１２〜−３５２の領域は、α４Ｉ−ＷＴオリゴヌクレオチド内に存在
する〔２６〕。Ｅｃａｄ−ＷＴプローブは、ヒトＥｃａｄプロモーターの−８６
〜−１７の領域を含む〔２〕。野生型、および突然変異させた二本鎖プローブの
上方の鎖の配列を、表１に列挙した。二本鎖オリゴヌクレオチドは、〔³²Ｐ〕−
γ−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）で標
識化した。異なるｐＣＳ３ベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞〔
２５〕から、総細胞抽出物を調製して、完全長ＳＩＰ１、完全長δＥＦ１、およ
びＳＩＰ１の異なる突然変異形態〔２５〕の合成、または等量のＭｙｃ標識化Ｓ
ＩＰ１およびＦＬＡＧ標識化ＳＩＰ１の同時産生を許した。ＧＳＴ−ＳＩＰ１融
合タンパク質を、ＧＳＴ精製モジュール（Pharmacia）を用いて、大腸菌抽出物
から精製し、ゲル減速で試験した。ＤＮＡ結合アッセイ（２０μl）は、２５℃
で、前記〔３０〕のδＥＦ１結合緩衝液中のＣＯＳ１総細胞タンパク質１μg、
ポリｄｌ−ｄＣ１μg、³²Ｐ標識化二本鎖オリゴヌクレオチド（約１０⁴のチェレ
ンコフカウント）１０pgを用いて実施した。スーパーシフトの実験には、この抽
出物を、抗Ｍｙｃ抗体（Santa Cruz）または抗ＦＬＡＧ抗体（Kodak）とともに
温置した。競合させるには、過剰量の未標識化二本鎖オリゴヌクレオチドを、標
識化したプローブとともに加えた。結合反応は、０．５ｘＴＢＥ緩衝液中に調製
した４％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド／ビスアクリルアミド、１９
：１）に装荷した。電気泳動の後、ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに感光させた。
すべての実験は、少なくとも３回反復した。

【００５９】 メチル化干渉アッセイ Ｘｂｒａ−ＷＴプローブの上方および下方の鎖を、別個に標識化し、過剰量の
総補的ＤＮＡ鎖でアニーリング下。プローブを、沈澱させ、硫酸ジメチルで処理
した（８）。メチル化されたプローブ（１０⁵チェレンコフカウント）を、ＳＩ
Ｐ１_FSまたはＳＩＰ１_CZFのいずれかを発現するＣＯＳ１細胞からの総細胞抽出
物１０μgとともに、１０ｘゲル減速反応（上記を参照されたい）（最終体積：
２００μl）ちゅうで温置した。２５℃で２０分温置した後、生成物を、４％ポ
リアクリルアミドゲルに装荷し、電気泳動を、ゲル減速アッセイについてのとお
りに実施した。次いで、ゲルをＤＥＡＥ−セルロース膜にブロットさせ；移転を
、０．５ｘＴＢＥ緩衝液中で１００Ｖで３０分間実施した。次いで、膜を１時間
感光させ、ＳＩＰ１_FS（またはＳＩＰ１_CZF）に対応する帯域、および遊離プロ
ーブを、６５℃で、高塩類条件（１MＮａＣｌ、２０mMトリス、pH７．５、１mM
ＥＤＴＡ）を用いて溶出させた。溶出したＤＮＡを、沈澱させ、ピペリジンで処
理した〔１８〕。水中での可溶化と、減圧下での液体の蒸発とのいくつかの周期
の後、得られたＤＮＡペレットを、配列決定用緩衝液（９７．５％の脱イオンホ
ルムアミド、それぞれ０．３％のブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノ
ール、１０mMＥＤＴＡ）１０μl中で溶解し、８５℃で５分間変性させた。遊離
プローブおよび結合プローブについて同じ量のカウント（１，５００チェレンコ
フカウント）を、２０％ポリアクリルアミド−８M尿素の配列決定用ゲルに装荷
した。ゲルを、０．５ｘＴＢＥ中で２，０００Vで１時間泳動させた。その後、
ゲルを、５０％メタノール／１０％酢酸中で定着させ、乾燥した。次いで、ゲル
を、オートラジオグラフィーに感光させた。

【００６０】 ウエスタンブロット分析 トランスフェクションした細胞を、ＰＢＳ−Ｏ（１３７mMＮａＣｌ、２．７mM
ＫＣｌ、６．５mMＮａ₂ＨＰＯ₄、１．５mMＫＨ₂ＰＯ₄）で洗浄し、分離緩衝液（
１０mMトリス、pH７．５、１mMＥＤＴＡ、１０％グリセリン；プロテアーゼ阻害
剤（プロテアーゼ阻害剤カクテル錠；Boehringer Mannheim）を含有）中で捕集
し、低回転数遠心分離によってペレット化した。次いで、細胞を、１０mMトリス
、pH７．４、１２５mMＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００に可溶化した。直接電
気泳動分析には、ゲルサンプル緩衝液を、細胞溶解液に加え、サンプルを沸騰さ
せた。その他の実験には、溶解液を、初めに、抗Ｍｙｃまたは抗ＦＬＡＧ抗体の
いずれかによる免疫沈降に付した。抗体は、細胞溶解液のアリコートに加え、４
℃で終夜温置した。細胞溶解液の抗体および結合タンパク質を、複合体として、
プロテインＡ−セファロースに４℃で２時間カップリングさせた。免疫沈降物を
、ＮＥＴ緩衝液（５０mMトリス、pH８．０、１５０mMＮａＣｌ、０．１％ＮＰ４
０、１mMＥＤＴＡ、０．２５％ゼラチン）中で４回洗浄し、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミド（７．５％）ゲル電気泳動によって分離させ、電気泳動によってニトロ
セルロース膜に移転した。膜を、３％（w/v）脱脂乳を含有するＴＢＳＴ（１０m
Mトリス、pH７．５、１５０mMＮａＣｌ、０．１％トィーン２０）中で２時間遮
断し、一次抗体（１μg/ml）とともに２時間、次いでセイヨウワサビペルオキシ
ダーゼに結合した二次抗体とともに温置した。免疫反応性帯域は、増強化学ルミ
ネッセンス試薬（ＮＥＮ）で検出した。

【００６１】 アフリカツメガエルXenopus laevisの遺伝子導入、およびホールマウントin sit
uハイブリダイゼーション Ｘｂｒａ２−ＧＦＰについてトランスジェニックであるツメガエル属の胚を、
前記のとおりであるが（Kroll & Amaya, 1996）、下記の変更を加えて生成した
。１卵あたり５nlの***核懸濁液の一定体積を、５nlあたり２個の核という理論
的濃度で注入するために、Drummond Nanoinjectを用いた。約８００個の卵を、
卵抽出物の温置によって注入した。この手順の結果、胚の１０〜３０％の率の好
成績の分割を生じた。これらのうち、５０〜８０％は、嚢胚形成を完了し、２０
〜３０％は、許容されるならば、正常な遊泳オタマジャクシへとさらに発生した
。遺伝子導入頻度は、発現によって解析された限りで、５０〜９０％の変動幅を
有した。胚は、NiewkoopおよびFaberに従って〔Niewkoop & Faber, 1967〕段階
決定した。最低３０個の発現中の胚を、構成体、および示された段階に従って分
析した。ＧＦＰリポーター遺伝子に対するホールマウントin situハイブリダイ
ゼーションは、前記のとおり〔Latinkic et al., 1997〕であった。色彩検出の
後、胚を脱水し、ベンジルアルコール／安息香酸ベンジルの２：１混合物中で脱
色した。

【００６２】

【表２】 表１．本研究に用いたすべてのプローブのリスト。ＣＡＣＣＴ配列は、太字で強
調してある。間隔取り（右の列）は、二つのＣＡＣＣＴ配列の間に存在するヌク
レオチドの数である。下線を施した間隙は、野生型プローブからのヌクレオチド
の欠失に相当する。多くのプローブについては、導入された突然変異の解釈を容
易にするために、野生型プローブと比較して変化している残基のみが示されてい
るにすぎない。

【００６３】 以下の８段落は、さらに記載された実験を実施するために、いくつかの追加の
「材料および方法」を含む。

【００６４】 −Ｘｂｒａ２プロモーターからの異なるプローブによるゲル減速アッセイ ³²Ｐで標識化された異なるＸｂｒａプローブ（１０pg）を、ｐＣＳ３−ＳＩＰ
１_CZF、ｐＣＳ３−ＳＩＰ１_FSでトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞、また
は偽トランスフェクションした細胞からの総タンパク質抽出物１μgとともに温
置した。

【００６５】 −Ｘｂｒａ２プロモーターとのＳＩＰ１_FSの結合の際に、二つのＣＡＣＣＴ部位
は接触する ＸｂｒａＷＴの上流ＣＡＣＣＴ配列（走査突然変異形成によって明らかにされ
る限りでの、表１を参照されたい）または下流ＣＡＣＣＴ配列（表１の別の箇所
を参照されたい）内での突然変異のみが、ＳＩＰ１_FSの結合を廃止する。メチル
化干渉アッセイは、ＳＩＰ１_FSが、双方のＣＡＣＣＴ配列に接触することを示し
ている。上方または下方の鎖のいずれかが標識化されたＸｂｒａＷＴを、メチル
化し、ｐＣＳ３−ＳＩＰ１_FSまたはｐＣＳ３−ＳＩＰ１_CZFのいずれかでトラン
スフェクションしたＣＯＳ１細胞からの総抽出物とともに温置した。シフト複合
体または未結合ＤＮＡ（ＦＲＥＥ）内で減速したＤＮＡを、精製し、ピペリジン
で切断し、配列決定用ゲル上で泳動させた。グアニン残基を、遊離プローブ内で
メチル化した。Ｘｂｒａ２プロモーターからの上流または下流ＣＡＣＣＴ配列を
示す。

【００６６】 −二つのＣＡＣＣＴ配列は、Ｘｂｒａ２、α４−インテグリンおよびＥ−カドヘ
リンプロモーターとのＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１の結合に必要である Ｘｂｒａ２プロモーターとのδＥＦ１の結合；α４−インテグリンプロモータ
ーとのＳＩＰ１およびδＥＦ１の結合；過剰量の標識化されていない野生型およ
び突然変異結合部位との競合を包含する、α４−インテグリンプロモーターとの
ＳＩＰ１およびδＥＦ１の結合；Ｅ−カドヘリンプロモーターとのＳＩＰ１およ
びδＥＦ１の結合。それぞれの結合反応で、標識化されたプローブ１０pgを、ｐ
ＣＳ３−ＳＩＰ１_FSまたはｐＣＳ３−δＥＦ１のいずれかでトランスフェクショ
ンしたＣＯＳ１細胞から調製した総細胞タンパク質抽出物１μgとともに温置し
た。競合実験では、非標識化ＤＮＡ５ngおよび５０ngを、標識化プローブと同時
に加えた。Ｍｙｃのタグに対する抗体を、結合反応、およびスーバーシフトした
複合体に加えた。δＥＦ１およびＳＩＰ１減速複合体が立証された。すべてのプ
ローブの配列については、表１を参照されたい。

【００６７】 −ＣＡＣＣＴ配列の間隔取りおよび相対的配向は、Ｘｂｒａ２プロモーターとの
ＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１の結合に死活的に重要ではない。 標識化プローブ１０pgを、ｐＣＳ３−ＳＩＰ１_FSまたはｐＣＳ３−δＥＦ１の
いずれかでトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞から調製した総細胞タンパク
質抽出物１μgとともに温置した。Ｘｂｒａ−Ｅプローブ１０pg、およびＸｂｒ
ａ−Ｆプローブ１０pgを、同じ結合反応に用いた。明快で比較になる提示を理由
として、ＳＩＰ１結合反応からの遊離プローブは、割愛した。

【００６８】 −ＤＮＡとのＳＩＰ１_FSの結合には、両ＳＩＰ１ジンクフィンガークラスターの
完全性が必要である ＮＺＦ３、ＮＺＦ４、ＣＺＦ２、ＣＺＦ３内の突然変異は、ＳＩＰ１_NZFまた
はＳＩＰ１_CZFのいずれかのジンクフィンガークラスターのＤＮＡ結合活性を失
わせる。野生型および突然変異ジンクフィンガークラスターをＧＳＴに融合させ
、融合タンパク質を大腸菌内に生成した。精製後、等量の各融合タンパク質（０
．１ng）を、標識化したＸｂｒａ−Ｅプローブ１０pgとともに温置した。ＮＺＦ
３、ＮＺＦ４、ＣＺＦ２またはＣＺＦ３内の突然変異は、Ｘｂｒａ−ＷＴプロー
ブとのＳＩＰ１_FSの結合に影響を及ぼす。標識化したＸｂｒａ−ＷＴプローブ１
０pgを、ｐＣＳ３−ＳＩＰ１_FS、ｐＣＳ３−ＳＩＰ１_NZF3mut、ｐＣＳ３−ＳＩ
Ｐ１_NZF4mut、ｐＣＳ３−ＳＩＰ１_CZF2mutまたはｐＣＳ３−ＳＩＰ１_CZF3mutの
いずれかでトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞から調製した総細胞タンパク
質抽出物１μgとともに温置した。異なるＳＩＰ１突然変異体を発現する２種類
のＣＯＳ細胞抽出物（それぞれ１μg）の可能なすべての組合せを試験した。Ｍ
ｙｃのタグに対する抗体を、結合反応に加え、スーバーシフトされた複合体、お
よびＳＩＰ１_FS減速された複合体が表示された。ＮＺＦ３、ＮＺＦ４、ＣＺＦ２
またはＣＺＦ３内の突然変異は、α４−インテグリンプロモーターとのＳＩＰ１ _FS の結合を廃止する。標識化したα４Ｉ−ＷＴプローブ１０pgを、ｐＣＳ３−Ｓ
ＩＰ１_FS、ｐＣＳ３−ＳＩＰ１_NZF3mut、ｐＣＳ３−ＳＩＰ１_NZF4mut、ｐＣＳ３
−ＳＩＰ１_CZF2mutまたはｐＣＳ３−ＳＩＰ１_CZF3mutのいずれかでトランスフェ
クションしたＣＯＳ１細胞から調製した総細胞タンパク質抽出物１μgとともに
温置した。Ｍｙｃのタグに対する抗体を、結合反応に加え、スーバーシフト複合
体、およびＳＩＰ１_FS減速複合体が表示された。ＳＩＰ１突然変異体は、同等の
量でＣＯＳ細胞内に産生された。ＣＯＳ細胞総抽出物１０μgを、抗Ｍｙｃ抗体
を用いたウエスタンブロット分析によって分析した。ＳＩＰ１突然変異体の発現
レベルは、実際に、ＳＩＰ１−ＷＴ発現レベルより僅かに高い。

【００６９】 −ＳＩＰ１_FSは、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブに単量体として結合する 標識化Ｘｂｒａ−ＷＴプローブ１０pgを、等量のｐＣＳ３−ＳＩＰ１_FS（Ｍｙ
ｃタグ付き）およびｐＣＤＮＡ３−ＳＩＰ１（Ｆｌａｇタグ付き）でトランスフ
ェクションしたＣＯＳ１細胞から調製した総細胞タンパク質１μgとともに温置
した。抗Ｆｌａｇおよび抗Ｍｙｃ抗体を、結合アッセイに別個にか、または双方
を加えた。ＦｌａｇおよびＭｙｃスーバーシフト複合体が表示される。

【００７０】 −ＳＩＰ１リプレッサー活性には、ＣＺＦまたはＮＺＦの完全性が必要である リポータープラスミドのｐ３ＴＰ−Ｌｕｘからの、複数のＣＡＣＣＴを含む人
工プロモーターから誘導された、ゲル精製フラグメントとのＳＩＰ１_FSの結合。
抗Ｍｙｃタグ抗体を加えた；スーバーシフト複合体が表示される。ｐ３ＴＰ−Ｌ
ｕｘリポーターベクターと一緒のｐＣＳ３−ＳＩＰ１_FS、ｐＣＳ３−ＣＺＦ３−
ＭｕｔまたはｐＣＳ３−ＮＺＦ３−Ｍｕｔの同時トランスフェクションアッセイ
。活性は、全ＳＩＰ１_FSリプレッサー活性（これを１００％とする）の百分率で
表される。

【００７１】 −突然変異させたＸｂｒａ２プロモーターの変種（Ｘｂｒａ２−Ｍｕｔ）のトラ
ンスジェニックなカエル胚における異所性活性 野生型および突然変異（Ｘｂｒａ−Ｍｕｔ；表１を参照されたい）Ｘｂｒａ２
プロモーター要素とのＳＩＰ１_FSの結合。ＧＦＰリポーターを駆動する野生型の
か、または点突然変異させた２．１kbのＸｂｒａ２プロモーターフラグメントに
ついてトランスジェニックである、ツメガエル属の胚のＧＦＰｍＲＮＡに対する
ホールマウントin situハイブリダイゼーション。すべての胚を第１１期で固定
し、シグナルの、より良好な視覚化のために透明化した。百分率は、中間的表現
型を示す（すなわち、トランスジェニック胚の３５％が、正常なＸｂｒａ２の発
現パターンを示し、６５％は、異所性発現を示した）。

【００７２】 （結果） −ＳＩＰ１は、δＥＦ１に類似の構造を有する ＳＩＰ１は、Ｓｍａｄ結合性タンパク質として最近単離され、Ｓｍａｄ１、Ｓ
ｍａｄ５およびＳｍａｄ２を、リガンド依存性の様式で（ＢＭＰおよびアクチビ
ン経路内で）結合する〔３４〕。ＳＩＰ１は、両手を有するジンクフィンガー／
ホメオドメイン転写因子の、脊椎動物δＥＦ１およびショウジョウバエ属Ｚｆｈ
−１も包含するファミリーの新たな一員である〔４、５〕。これらと同様に、Ｓ
ＩＰ１は、二つの大幅に分離したジンクフィンガークラスターを有する。４本の
ジンクフィンガー（３ＣＣＨＨおよび１ＣＣＨＣフィンガー）よりなる１クラス
ターは、タンパク質のＮ末端領域に位置し、３ＣＣＨＨジンクフィンガーよりな
るもう一つのクラスターは、Ｃ末端領域に存在する（図１Ａ）。ＳＩＰ１とδＥ
Ｆ１との間には、高度の配列同一性が、Ｎ末端ジンクフィンガークラスター内（
８７％）、およびＣ末端ジンクフィンガークラスター内（９７％）で明らかであ
る（図１Ｂを参照されたい）のに対し、二つのタンパク質は、ジンクフィンガー
クラスター外の領域では、より少なく保存されている〔３４〕。したがって、Ｓ
ＩＰ１およびδＥＦ１は、非常に類似する配列に結合するものと想定される。加
えて、δＥＦ１のＮ末端およびＣ末端ジンクフィンガークラスターは、中核的Ｃ
ＡＣＣＴ共通配列を有する、非常に類似する配列に結合する〔１０〕。Ｎ末端ク
ラスター内では、δＥＦ１_NZF3とδＥＦ１_NZF4との双方が、ＣＡＣＣＴ共通配列
に結合するための主な決定要因であり、Ｃ末端クラスターの結合には、δＥＦ１ _CZF2 およびδＥＦ１_CZF3が必要とされる〔１０〕。その上、δＥＦ１_NZF3+NZF4
ドメインは、δＥＦ１_CZF2+CZF3ドメインとの高度の相同性（６７％）を示し、
これが、これら二つのクラスターが、ＤＮＡ上の類似の共通標的部位に結合する
理由を説明し得る（図１Ｃ）。結合に不可欠の、かつδＥＦ１_NZF3+NZF4とδＥ
Ｆ１_CZF2+CZF3との間に保存されている、すべての残基は、ＳＩＰ１_NZF3+NZF4と
ＳＩＰ１_CZF2+CZF3との間にも保存されている。併せて考えると、これらの比較
は、ＳＩＰ１のＮ末端およびＣ末端ジンクフィンガークラスター内は、非常に類
似する標的配列にも結合すると思われる。

【００７３】 −Ｘｂｒａ２プロモーターとのＳＩＰ１の結合には、二つのＣＡＣＣＴ部位が必
要である ＣＡＣＣＴ部位は、Ｘｂｒａ２プロモーターとのＳＩＰ１の結合に必要である
。ＣＡＣＣＴ部位は、Ｘｂｒａ２プロモーターとのＳＩＰ１の結合に必要である
。ＣＡＣＣＴ部位は、Ｘｂｒａ２プロモーターとのＳＩＰ１の結合に必要である
。ＣＡＣＣＴ部位は、Ｘｂｒａ２プロモーターとのＳＩＰ１の結合に必要である
。ＣＡＣＣＴ部位は、Ｘｂｒａ２プロモーターとのＳＩＰ１の結合に必要である
。ＳＩＰ１は、ツメガエル属のＸｂｒａ２プロモーターに結合し、ツメガエル属
の胚で過剰発現されたとき、Ｘｂｒａ２ｍＲＮＡの発現を抑制する〔３４〕。Ｘ
ｂｒａ２プロモーターは、いくつかのＣＡＣＣＴ配列を含み、うち二つは、アク
チビンによる誘導に必要な領域（−３８１〜−２３１）に位置する〔１６〕。そ
れぞれ、上流ＣＡＣＣＴおよび下流ＡＧＧＴＧ（すなわち、もう一つのＤＮＡ鎖
での５′−ＣＡＣＣＴ）である、これら二つの部位は、２４bp隔たっている。こ
れらの部位とのＳＩＰ１の結合の必要条件をさらに解明するため、対応する５０
bp長のオリゴヌクレオチド（Ｘｂｒａ−ＷＴ；すべてのプローブのリストについ
ては、表１を参照されたい）を、プローブとして、電気泳動移動度シフトアッセ
イ（ＥＭＳＡ）に用いた。下流ＡＧＧＴＧ部位のＡＧＡＴＧへの突然変異を有す
る、Ｘｂｒａ−Ｄプローブも含めた。類似の突然変異は、κＥ２エンハンサーと
のδＥＦ１の結合を廃止することが以前に示された〔３０〕。加えて、本発明者
らは、下流の部位（プローブＸｂｒａ−Ｅ）、および上流の部位（プローブＸｂ
ｒａ−Ｆ）も、より短いプローブとして独立に試験した。これらのプローブを、
ＳＩＰ１の、Ｍｙｃタグ付きＣ末端ジンクフィンガークラスター（ＳＩＰ１_CZF
）、ＳＩＰ１の、Ｍｙｃタグ付きＮ末端ジンクフィンガークラスター（ＳＩＰ１ _NZF ）、または完全な大きさのＭｙｃタグ付きＳＩＰ１（ＳＩＰ１_FS）を発現す
る、ＣＯＳ細胞の総抽出物とともに温置した。

【００７４】 偽トランスフェクションしたＣＯＳ細胞を、対照としてＡプローブとともに用
いたとき、二つの弱い複合体、および一つの強い複合体が視覚化された。競合体
のオリゴヌクレオチドを用いると、二つの弱い複合体は、非特異性に変化したの
に対し、強い、急速に移動する複合体は、Ｘｂｒａプローブとの結合に対する特
異性を示す。後者の所見は、ＣＯＳ細胞が、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブに結合でき
る内在性タンパク質を含むことを示唆する。ＳＩＰ１_CZFが抽出物中に存在する
ときは、ＣＯＳ抽出物からの内在性結合活性に加えて、強い、徐々に移動する複
合体が観察された。この複合体は、抗Ｍｙｃ抗体とスーパーシフトすることがで
きて、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブとのＳＩＰ１_CZFの結合に起因することを確認す
る。下流部位（Ｘｂｒａ−Ｄプローブ）の突然変異は、このＳＩＰ１_CZF複合体
の形成に強い影響を及ぼした。その上、ＳＩＰ１_CZFは、Ｘｂｒａ−Ｅプローブ
に結合するが、Ｘｂｒａ−Ｆプローブには結合せず、下流部位が、ＳＩＰ１_CZF
の結合に不可欠であり、ＳＩＰ１_CZFは、この部位に排他的に結合し得ることを
示す。Ｘｂｒａ−Ｆプローブで視覚化される強い複合体は、ＳＩＰ１_FS抽出物中
、および偽抽出物中にも存在し、これまで特性記述されなかった、Ｘｂｒａ−Ｆ
プローブに結合する内在性ＣＯＳ細胞タンパク質を起源とする。加えて、ＳＩＰ
１_NZFを含有するＣＯＳ細胞抽出物は、ＳＩＰ１_CZFで得られたのと類似する結合
パターンをＥＭＳＡで示した。δＥＦ１における〔１０〕と同様に、ＳＩＰ１の
二つのジンクフィンガークラスターが、ともに、類似のＤＮＡ結合の特徴を有す
ることは明白である。

【００７５】 ＳＩＰ１_FSに対応する強い複合体は、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブでも生成される
。ＣＯＳ細胞におけるＳＩＰ１_CZF産生のレベルは、ＳＩＰ１_FSのレベルより約
５０倍も高いことに言及するのは重要である。ＥＭＳＡ反応のそれぞれについて
、本発明者らは、常に、同じ量の未精製ＣＯＳ細胞タンパク質を用いた。Ｘｂｒ
ａ−ＷＴプローブとのＳＩＰ１_FSの結合は、ＳＩＰ１_CZFの結合と同程度に強い
。興味深いことに、このことは、Ｘｂｒａ−ＷＴに対するＳＩＰ１_FSの親和性が
、ＳＩＰ１_CZFのそれより少なくとも５０倍高いことを示す。ＳＩＰ１_FS複合体
は、ＳＩＰ１_CZFおよびＳＩＰ１_NZFと同様に、突然変異させたＸｂｒａ−Ｄプロ
ーブを用いたときに不在である。したがって、ＳＩＰ１_FSの結合には、完全な下
流部位がやはり必要とされる。Ｘｂｒａ−ＷＴおよびＸｂｒａ−Ｅプローブに類
似する親和性で結合する、ＳＩＰ１_CZFおよびＳＩＰ１_NZFとは対照的に、ＳＩＰ
１_FSは、Ｘｂｒａ−Ｅプローブとは結合しない。ＳＩＰ１_CZFおよびＳＩＰ１_NZF と同様に、ＳＩＰ１_FSは、Ｘｂｒａ−Ｆプローブとは結合しない。本発明者らは
、下流部位（ＡＧＧＴＧ）は、ＳＩＰ１_FSがＸｂｒａ２プロモーターに結合する
のに必要であると結論する。しかし、この部位は、ＳＩＰ１_FSの結合には、Ｘｂ
ｒａ−Ｅプローブの上流の追加の配列が必要であることから、充分ではない。Ｓ
ＩＰ１_FSがＸｂｒａ−Ｅプローブと結合できなかった一つの理由は、それがＸｂ
ｒａ−ＷＴプローブより短いことから、単に、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの長さであ
る可能性がある。これを試験するため、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの上流にランダム
配列（Ｒｄｍ）を含むプローブを調製して、それをＸｂｒａ−ＷＴプローブと同
じ長さまで延長した（表１）。Ｒｄｍ＋Ｘｂｒａ−Ｅプローブに効率的に結合す
るＳＩＰ１_CZFとは対照的に、ＳＩＰ１_FSは、結合することができなかった。こ
の結果は、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの長さ自体は、ＳＩＰ１_FSがこのプローブに結
合できないことの原因ではないことを立証している。

【００７６】 Ｘｂｒａ−Ｆオリゴヌクレオチドも、ＳＩＰ１_FSの結合に必要な配列を有する
ことを実証するために、このオリゴヌクレオチドとともに、ＡＲＥＢ６タンパク
質によって強く結合されることが公知である〔１０〕、もう一つのＣＡＣＣＴ部
位の上流のランダム配列も融合した（それぞれ、プローブＸｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥ
Ｂ６およびＲｄｍ＋ＡＲＥＢ６）。ＳＩＰ１_CZFは、等しい親和性で、Ｘｂｒａ
−Ｆ＋ＡＲＥＢ６およびＲｄｍ＋ＡＲＥＢ６の双方のプローブを結合して、ＡＲ
ＥＢ６配列も、ＳＩＰ１_CZFによって認識されることを示した。しかし、ＳＩＰ
１_FSは、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６プローブにのみ結合するが、Ｒｄｍ＋ＡＲＥ
Ｂ６には結合しない。このことは、Ｘｂｒａ−Ｆオリゴヌクレオチドは、ＳＩＰ
１_FSの結合に必要な配列を含むことを確認する。加えて、Ｘｂｒａ−Ｅプローブ
とＡＲＥＢ６プローブとに共通する唯一の特徴は、ＣＡＧＧＴＧＴ配列であって
、Ｘｂｒａ−Ｅプローブ中のこのＣＡＧＧＴＧＴ以外の配列は、ＳＩＰ１_FSの結
合に全く必要ないことを示唆する。ＳＩＰ１_FSがＸｂｒａ−Ｅプローブに結合で
きない理由の一つは、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの長さが、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブ
の長さより短いからである可能性がある。この仮説を試験するため、Ｘｂｒａ−
Ｅプローブの上流にランダム配列を含むプローブを調製して、Ｘｂｒａ−ＷＴプ
ローブと同じ長さを得た。このプローブに効率的に結合するＳＩＰ１_CZFとは対
照的に、ＳＩＰ１_FSは、結合できなかった。この結果は、Ｘｂｒａ−Ｅプローブ
の長さは、ＳＩＰ１_FSがこのプローブに結合しない理由ではなかったことを明白
に示す。Ｘｂｒａ−Ｆオリゴヌクレオチドも、ＳＩＰ１_FSの結合に必要な配列を
有することを実証するために、このオリゴヌクレオチドとともに、ＡＲＥＢ６タ
ンパク質を強く結合することが公知である、もう一つのＣＡＣＣＴ部位の上流の
ランダム配列も融合した（それぞれ、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６およびＲｄｍ＋
ＡＲＥＢ６）。ＳＩＰ１_CZFは、等しい親和性で、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６お
よびＲｄｍ＋ＡＲＥＢ６の双方のプローブを結合して、ＡＲＥＢ６配列も、ＳＩ
Ｐ１_CZFによって認識されることを示すことを観察した。しかし、ＳＩＰ１_FSは
、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６プローブにのみ結合するが、Ｒｄｍ＋ＡＲＥＢ６プ
ローブには結合しない。このことは、Ｘｂｒａ−Ｆオリゴヌクレオチドは、ＳＩ
Ｐ１_FSの結合に必要な配列を含むことを確認する。加えて、Ｘｂｒａ−Ｅプロー
ブとＡＲＥＢ６プローブとに共通する唯一の通性は、ＡＧＧＴＧ配列であって、
Ｘｂｒａ−Ｅプローブ中のこのＡＧＧＴＧ以外の配列は、ＳＩＰ１_FSの結合に全
く必要ないことを示唆する。ＳＩＰ１_FSがＸｂｒａ−Ｅプローブに結合できない
理由の一つは、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの長さが、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブの長さ
より短いからである可能性がある。この仮説を試験するため、Ｘｂｒａ−Ｅプロ
ーブの上流にランダム配列を含むプローブを調製して、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブ
と同じ長さを得た。このプローブに効率的に結合するＳＩＰ１_CZFとは対照的に
、ＳＩＰ１_FSは、結合できなかった。この結果は、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの長さ
は、ＳＩＰ１_FSがこのプローブに結合しない理由ではなかったことを明白に示す
。Ｘｂｒａ−Ｆオリゴヌクレオチドも、ＳＩＰ１_FSの結合に必要な配列を有する
ことを実証するために、このオリゴヌクレオチドとともに、ＡＲＥＢ６タンパク
質を強く結合されることが公知であるもう一つのＣＡＣＣＴ部位の上流にランダ
ム配列も融合した（それぞれ、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６およびＲｄｍ＋ＡＲＥ
Ｂ６）。ＳＩＰ１_CZFは、等しい親和性で、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６およびＲ
ｄｍ＋ＡＲＥＢ６の双方のプローブを結合して、ＡＲＥＢ６配列も、ＳＩＰ１_{CZ F} によって認識されることを示すことを観察した。しかし、ＳＩＰ１_FSは、Ｘｂ
ｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６プローブにのみ結合するが、Ｒｄｍ＋ＡＲＥＢ６プローブ
には結合しない。このことは、Ｘｂｒａ−Ｆオリゴヌクレオチドは、ＳＩＰ１_FS の結合に必要な配列を含むことを確認する。加えて、Ｘｂｒａ−ＥプローブとＡ
ＲＥＢ６プローブとに共通する唯一の通性は、ＡＧＧＴＧ配列であって、Ｘｂｒ
ａ−Ｅプローブ中のこのＡＧＧＴＧ以外の配列は、ＳＩＰ１_FSの結合に全く必要
ないことを示唆する。ＳＩＰ１_FSがＸｂｒａ−Ｅプローブに結合できない理由の
一つは、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの長さが、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブの長さより短
いからである可能性がある。この仮説を試験するため、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの
上流にランダム配列を含むプローブを調製して、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブと同じ
長さを得た。このプローブに効率的に結合するＳＩＰ１_CZF（図２、列６）とは
対照的に、ＳＩＰ１_FSは、結合できなかった（列３）。この結果は、Ｘｂｒａ−
Ｅプローブの長さは、ＳＩＰ１_FSがこのプローブに結合しない理由ではなかった
ことを明白に示す。

【００７７】 Ｘｂｒａ−Ｆオリゴヌクレオチドも、ＳＩＰ１_FSの結合に必要な配列を有するこ
とを実証するために、このオリゴヌクレオチドとともに、ＡＲＥＢ６タンパク質
を強く結合することが公知である、もう一つのＣＡＣＣＴ部位の上流にランダム
配列も融合した（それぞれ、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６およびＲｄｍ＋ＡＲＥＢ
６）。列４および５で、ＳＩＰ１_CZFは、等しい親和性で、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲ
ＥＢ６およびＲｄｍ＋ＡＲＥＢ６の双方のプローブを結合して、ＡＲＥＢ６配列
も、ＳＩＰ１_CZFによって認識されることを示すことを観察した。しかし、ＳＩ
Ｐ１_FSは、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６プローブにのみ結合し（列１）、Ｒｄｍ＋
ＡＲＥＢ６プローブには結合しない。このことは、Ｘｂｒａ−Ｆオリゴヌクレオ
チドは、ＳＩＰ１_FSの結合に必要な配列を含むことを確認する。加えて、Ｘｂｒ
ａ−ＥプローブとＡＲＥＢ６プローブとに共通する唯一の特徴は、ＡＧＧＴＧ配
列であって、Ｘｂｒａ−Ｅプローブ中のこのＡＧＧＴＧ以外の配列は、ＳＩＰ１ _FS の結合に全く必要ないことを示唆する。ＳＩＰ１_FSがＸｂｒａ−Ｅプローブに
結合できない理由の一つは、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの長さが、Ｘｂｒａ−ＷＴプ
ローブの長さより短いからである可能性がある。この仮説を試験するため、Ｘｂ
ｒａ−Ｅプローブの上流にランダム配列を含むプローブを調製して、Ｘｂｒａ−
ＷＴプローブと同じ長さを得た。このプローブに効率的に結合するＳＩＰ１_CZF
（図２、列６）とは対照的に、ＳＩＰ１_FSは、結合できなかった（列３）。この
結果は、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの長さは、ＳＩＰ１_FSがこのプローブに結合しな
い理由ではなかったことを明白に示す。Ｘｂｒａ−Ｆオリゴヌクレオチドも、Ｓ
ＩＰ１_FSの結合に必要な配列を有することを実証するために、このオリゴヌクレ
オチドとともに、ＡＲＥＢ６タンパク質を強く結合することが公知である、もう
一つのＣＡＣＣＴ部位の上流にランダム配列も融合した（それぞれ、Ｘｂｒａ−
Ｆ＋ＡＲＥＢ６およびＲｄｍ＋ＡＲＥＢ６）。列４および５で、ＳＩＰ１_CZFは
、等しい親和性で、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６およびＲｄｍ＋ＡＲＥＢ６の双方
のプローブを結合して、ＡＲＥＢ６配列も、ＳＩＰ１_CZFによって認識されるこ
とを示すことを観察した。しかし、ＳＩＰ１_FSは、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６プ
ローブにのみ結合し、Ｒｄｍ＋ＡＲＥＢ６プローブには結合しない。このことは
、Ｘｂｒａ−Ｆオリゴヌクレオチドは、ＳＩＰ１_FSの結合に必要な配列を含むこ
とを確認する。加えて、Ｘｂｒａ−ＥプローブとＡＲＥＢ６プローブとに共通す
る唯一の通性は、ＡＧＧＴＧ配列であって、Ｘｂｒａ−Ｅプローブ中のこのＡＧ
ＧＴＧ以外の配列は、ＳＩＰ１_FSの結合に全く必要ないことを示唆する。ＳＩＰ
１_FSがＸｂｒａ−Ｅプローブに結合できない理由の一つは、Ｘｂｒａ−Ｅプロー
ブの長さが、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブの長さより短いからである可能性がある。
この仮説を試験するため、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの上流にランダム配列を含むプ
ローブを調製して、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブと同じ長さを得た。このプローブに
効率的に結合するＳＩＰ１_CZF（図２、列６）とは対照的に、ＳＩＰ１_FSは、結
合できなかった（列３）。この結果は、Ｘｂｒａ−Ｅプローブの長さは、ＳＩＰ
１_FSがこのプローブに結合しない理由ではなかったことを明白に示す。Ｘｂｒａ
−Ｆオリゴヌクレオチドも、ＳＩＰ１_FSの結合に必要な配列を有することを実証
するために、このオリゴヌクレオチドとともに、ＡＲＥＢ６タンパク質を強く結
合することが公知である、もう一つのＣＡＣＣＴ部位の上流にランダム配列も融
合した（それぞれ、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６およびＲｄｍ＋ＡＲＥＢ６）。列
４および５で、ＳＩＰ１_CZFは、等しい親和性で、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６お
よびＲｄｍ＋ＡＲＥＢ６の双方のプローブを結合して、ＡＲＥＢ６配列も、ＳＩ
Ｐ１_CZFによって認識されることを示すことを観察した。しかし、ＳＩＰ１_FSは
、Ｘｂｒａ−Ｆ＋ＡＲＥＢ６プローブにのみ結合し、Ｒｄｍ＋ＡＲＥＢ６プロー
ブには結合しない。このことは、Ｘｂｒａ−Ｆオリゴヌクレオチドは、ＳＩＰ１ _FS の結合に必要な配列を含むことを確認する。加えて、Ｘｂｒａ−Ｅプローブと
ＡＲＥＢ６プローブとに共通する唯一の通性は、ＡＧＧＴＧ配列であって、Ｘｂ
ｒａ−Ｅプローブ中のこのＡＧＧＴＧ以外の配列は、ＳＩＰ１_FSの結合に全く必
要ないことを示唆する。

【００７８】 Ｘｂｒａ−Ｅ配列と結び付いてＳＩＰ１_FSの結合に必要とされる、Ｘｂｒａ−
Ｆ内の配列をマッピングするために、Ｘｂｒａ−Ｆ部分内に隣接する三重突然変
異を有する、長さがＸｂｒａ−ＷＴに同一の一連のプローブを調製した（表１を
参照されたい）。これらの突然変異プローブのうち３種類（すなわちＸｂｒａ−
Ｌ、Ｘｂｒａ−ＭおよびＸｂｒａ−Ｎ）のみが、ＳＩＰ１_FSの結合に影響したに
すぎない。実際、上流ＣＡＣＣＴ配列は、Ｘｂｒａ−Ｆプローブ内で完全であっ
て、Ｌ、ＭおよびＮプローブ内では改変された。本発明者らは、ＳＩＰ１_FSが、
上流ＣＡＣＣＴをＣＡＴＣＴに変更した、点突然変異を有するＸｂｒａ−Ｓプロ
ーブに結合しないことも示した。この突然変異は、Ｘｂｒａ−Ｄプローブ内でな
された下流ＡＧＡＴＧの突然変異に類似している。

【００７９】 上記の結果は、Ｘｂｒａプロモーター内の両ＣＡＣＣＴ配列に接触するＳＩＰ
１_FSについて示している。これらの部位の重要性をさらに調べるため、ＤＮＡメ
チル化干渉アッセイを実施した。下流ＡＧＧＴＧ（ＳＩＰ_DO）の３個のＧ、およ
び上流ＣＡＣＣＴ（ＳＩＰ_UP）の２個のＧのメチル化は、未結合プローブに対比
してＳＩＰ１_FS結合プローブで有意に低く、これらのＧのメチル化が、ＳＩＰ１ _FS の結合に干渉することを示唆する。このことは、これらの残基がＳＩＰ１_FSの
結合に不可欠であることを、強く裏付ける。ＳＩＰ_DOに非常に近接して位置する
２個のＧの一方のメチル化も、ＳＩＰ１_FSの結合に干渉することも観察されてい
る。その結果、こうして、ＳＩＰ１_FSについては、二つのＣＡＣＣＴ配列、およ
びそれらの完全性がＤＮＡ結合に必要とされることが示されている。

【００８０】 −ＳＩＰ１およびδＥＦ１は、異なる潜在的部位候補に結合するためには二つの
ＣＡＣＣＴ配列を必要とする ＳＩＰ１およびδＥＦ１は、非常に高度に保存されたジンクフィンガークラス
ターを有する、非常に類似する構造を有し、これら二つのタンパク質は、類似す
る方法でＤＮＡを結合する可能性が高い。δＥＦ１も、両ＣＡＣＣＴ配列に接触
することによって、Ｘｂｒａ２プロモーターに結合するか否かを詳述するが、こ
れは、以前には報告されていない。Ｍｙｃタグ付きδＥＦ１を、ＣＯＳ細胞内で
発現させ、対応する核抽出物を、ＷＴ、および一連の突然変異Ｘｂｒａプローブ
によるＥＭＳＡで試験した。δＥＦ１は、両ＣＡＣＣＴ部位を含むＸｂｒａ−Ｗ
Ｔプローブに強く結合する。しかし、ＳＩＰ１_FSと同様に、δＥＦ１は、下流Ｃ
ＡＣＣＴ部位のみを含むＸｂｒａ−Ｅプローブも、上流ＣＡＣＣＴ部位のみを含
むＸｂｒａ−Ｆプローブも結合しない。加えて、上流ＣＡＣＣＴ（Ｘｂｒａ−Ｓ
）または下流ＣＡＣＣＴ部位（Ｘｂｒａ−Ｄ）のいずれかの点突然変異も、δＥ
Ｆ１の結合を廃止した。したがって、ＳＩＰ１_FSと同様に、完全長δＥＦ１も、
Ｘｂｒａ２プロモーターに結合するには両ＣＡＣＣＴ配列の完全性を必要とする
。二つのＣＡＣＣＴ部位が、ＳＩＰ１_FSはもとよりδＥＦ１の結合にも要求され
ることは、Ｘｂｒａ２プロモーターに独自であり得る。そのため、次の疑問は、
二つのＣＡＣＣＴ配列は、他の標的部位に結合するのにもＳＩＰ１／δＥＦ１に
ついて必要か否かを解析することであった。推定されるδＥＦ１およびＳＩＰ１
結合要素は、いくつかのプロモーターに存在する。推定される一つのδＥＦ１結
合要素は、実際に二つの完全な、分離したＣＡＣＣＴ部位を有し、ヒトα４−イ
ンテグリン遺伝子のプロモーター内に見出された〔２３〕。興味深いことに、両
部位とも、Ｅ２ボックスのそれの中に含まれる。これら二つのＣＡＣＣＴ部位の
突然変異は、筋芽細胞におけるα４−インテグリン遺伝子発現の抑制へと導いて
、δＥＦ１が、α４−インテグリン遺伝子転写のリプレッサーであることを示唆
する〔２３〕。これら二つのＣＡＣＣＴ部位は、プロモーター内で近接して位置
する（間隔取りは３４bpである）ことから、両ＣＡＣＣＴ配列がδＥＦ１の結合
に必要とされるか否かを調べた。そのために、α４−インテグリンプロモーター
の両ＣＡＣＣＴ部位に重複する、６０bp長のプローブ（α４Ｉ−ＷＴ）を、二つ
の突然変異させたもの（すなわち、上流（α４Ｉ−Ｂ）または下流のいずれかの
ＣＡＣＣＴ部位に点突然変異を有するもの（それぞれ、α４Ｉ−Ｂまたはα４Ｉ
−Ａ、表１を参照されたい）とともに合成した。これらのプローブを、結合につ
いて、δＥＦ１またはＳＩＰ１_FSでトランスフェクションした細胞のＣＯＳ細胞
抽出物によるＥＭＳＡで試験した。δＥＦ１およびＳＩＰ１_FSは、ともに、α４
Ｉ−ＷＴプローブとの強い複合体を形成する。δＥＦ１複合体は、抗Ｍｙｃ抗体
によって完全にスーパーシフトされて、その特異性を立証する。ＳＩＰ１とδＥ
Ｆ１との双方の結合は、上流もしくは下流ＣＡＣＣＴ部位のいずれかの突然変異
によって、廃止されるか、または強く影響される。その上、競合実験は、５０ng
の非標識化α４Ｉ−ＷＴプローブが、α４Ｉ−ＷＴプローブとのＳＩＰ１または
δＥＦ１の結合を廃止するのに充分であるのに対し、５０ngの非標識化α４Ｉ−
Ａまたはα４Ｉ−Ｂプローブのいずれかは、そうではないことを明らかにした。
本発明者らは、ＳＩＰ１_FSとともにδＥＦ１も、α４−インテグリン遺伝子のプ
ロモーターとの結合に二つのＣＡＣＣＴ部位の完全性を要求すると結論する。

【００８１】 本発明者らは、ヒトＥ−カドヘリン遺伝子のプロモーター内の、近接して位置
する二つのＣＡＣＣＴ部位も見出した。このＥ−カドヘリンプロモーターの両Ｃ
ＡＣＣＴ部位を含むオリゴヌクレオチドを、プローブとして（Ｅｃａｄ−ＷＴ）
ＳＩＰ１_FSまたはδＥＦ１抽出物とともにＥＭＳＡに用いた。ＳＩＰ１_FSはもと
よりδＥＦ１も、このプローブと複合体を形成する。しかし、上流（Ｅｃａｄ−
Ａプローブ）または下流（Ｅｃａｄ−Ｂプローブ）ＣＡＣＣＴ部位のいずれかを
突然変異させたとき（表１、下部を参照されたい）、ＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１
の結合は廃止された。このことも、このプロモーター内の二つのＣＡＣＣＴ部位
が、両手を有するジンクフィンガー／ホメオドメイン転写因子の結合のための高
親和性部位を表すことを示唆する。

【００８２】 Ｘｂｒａ−ＷＴ、α４Ｉ−ＷＴおよびＥｃａｄ−ＷＴプローブの整列から（表
１を参照されたい）、明らかな相同性は、一つのＣＡＣＣＴＧ部位および第二の
ＣＡＣＣＴ部位以外は観察されなかった。本発明者らの上記の結果、およびこの
整列は、これらの配列のみが、ＳＩＰ１_FSまたはδＥＦ１のいずれかの結合に参
加するにすぎないことを示す。したがって、本発明者らは、標的プロモーターと
結合するには、ＳＩＰ１_FSまたはδＥＦ１は、少なくとも一つのＣＡＣＣＴ部位
、および一つのＣＡＣＣＴＧ部位を要求すると結論する。

【００８３】 −ＣＡＣＣＴ部位の間隔取りの変化および配向 Ｘｂｒａ−ＷＴ、α４Ｉ−ＷＴおよびＥｃａｄ−ＷＴプローブ内では（表１）
、二つのＣＡＣＣＴ部位間の間隔取りは、それぞれ２４bp、３４bpおよび４４bp
であった。ＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１は、これらのプローブに効率的に結合する
ことから、これは、これらのタンパク質が、二ＣＡＣＣＴ部位間の２４〜４４bp
以上にわたる間隔取りに順応できることを示す。二ＣＡＣＣＴ部位間の間隔取り
が、結合のための重要なパラメーターであるか否かをさらに調べるため、これら
の部位間に欠失を有する異なるＸｂｒａプローブを生成した。二つの突然変異プ
ローブ（Ｘｂｒａ−ＢおよびＸｂｒａ−Ｃ）は、３個のアデニンの欠失があるの
に対し、プローブＸｂｒａ−Ｕは、１０ヌクレオチドの欠失がある（表１）。こ
れらのプローブを、ＳＩＰ１_FSまたはδＥＦ１のいずれかを発現するＣＯＳ細胞
からの細胞抽出物によるＥＭＳＡで試験した。ＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１は、と
もに、Ｘｂｒａ−ＷＴ、Ｘｂｒａ−Ｂ、Ｘｂｒａ−ＣおよびＸｂｒａ−Ｕプロー
ブに等しい親和性で結合する。異なるプロモーターについて示された結果によっ
て、既に示唆されたとおり、このことは、同じプロモーター要素内でも、二ＣＡ
ＣＣＴ部位間の間隔取りは、これら二つの転写因子の結合に決定的なパラメータ
ーではないことを示す。

【００８４】 Ｘｂｒａ−ＷＴ、α４Ｉ−ＷＴおよびＥｃａｄ−ＷＴプローブの詳細な比較に
よって、Ｘｂｒａ−ＷＴおよびα４Ｉ−ＷＴプローブの場合、二ＣＡＣＣＴ部位
の配向は、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧＴＧであるのに対し、Ｅｃａｄ−ＷＴでは、
配向はＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴであることを観察した。ＣＡＣＣＴ部位の非
回文性の特徴のため、これら二つの部位は、実質的に異なると想定することがで
きると思われる。しかし、ＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１は、これらの異なって配向
された部位に、同等の親和性で結合する（上記を参照されたい）。このことは、
ＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１が、二つのＣＡＣＣＴ部位の配向と無関係に結合でき
ることを示唆する。

【００８５】 ＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１のＤＮＡ結合能に関して二ＣＡＣＣＴ部位の配向を
さらに調べるため、追加のプローブを設計した。プローブＸｂｒａ−ＥＥは、Ｘ
ｂｒａ−Ｅプローブの縦列反復を含むのに対し、プローブＸｂｒａ−ＥｒＥは、
同じＸｂｒａ−Ｅ配列の逆方向反復を含む。加えて、上流ＣＡＣＣＴ部位（プラ
スそれぞれの側に一つの余分な塩基対）を、下流のＡＧＧＴＧ配列で置き換え、
またその逆も実施した、Ｘｂｒａ−Ｖを合成した。最後に、Ｘｂｒａ−Ｗプロー
ブでは、下流部位のみを、上流ＣＡＣＣＴ配列で置き換えた。これらすべてのプ
ローブを、ＳＩＰ１_FSまたはδＥＦ１のいずれかを発現するＣＯＳ細胞から調製
した抽出物によるＥＭＳＡでやはり試験した。Ｘｂｒａ−ＥＥプローブとのＳＩ
Ｐ１_FSまたはδＥＦ１の最強の結合が観察された。したがって、ＳＩＰ１_FSおよ
びδＥＦ１は、単一のＣＡＣＣＴ部位を含むＸｂｒａ−Ｅとは結合できないが、
この配列を倍化したときは、強く結合することができて、やはり、二ＣＡＣＣＴ
部位の必要性を示す。加えて、この二つのＣＡＣＣＴ部位は、同じＤＮＡフラグ
メントに存在しなければならず、別個の二本の鎖に存在してはならないことも、
明白である（下記を参照されたい）。ＳＩＰ１およびδＥＦ１は、Ｘｂｒａ−Ｅ
ｒＥに結合して、やはり、二ＣＡＣＣＴ部位のそれぞれの配向は、結合に決定的
に重要ではないことを示唆する。さらに、上流および下流部位の双方を切り換え
ること（プローブＸｂｒａ−Ｖ）、または上流部位のみを下流部位の第二のコピ
ーで置き換えること（プローブＸｂｒａ−Ｗ）は、ＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１結
合に対して効果がなかった。これらの実験から、本発明者らは、二ＣＡＣＣＴ部
位の間隔取り、またはこれら二部位のそれぞれの配向は、いずれも、両手を有す
るジンクフィンガー／ホメオドメイン転写因子のin vitroでの結合に決定的に重
要ではないと結論する。

【００８６】 意外にも、必ずしもすべてのＣＡＣＣＴ倍化部位が、これらの因子を結合でき
るわけではない。実際、Ｘｂｒａ−Ｅ配列と組み合わせて、ＳＩＰ１_FSおよびδ
ＥＦ１の結合に必要であることが示された、Ｘｂｒａ−Ｆ配列の倍化は、ＳＩＰ
１_FSおよびδＥＦ１の結合に不応性である。このことは、Ｘｂｒａ−Ｆという文
字列内のＣＡＣＣＴ部位が、低親和性部位であり、このＣＡＣＣＴ部位に隣接す
る配列が、親和性を最適化し得ることを示唆する。

【００８７】 加えて、Ｃ末端クラスターまたはＮ末端クラスターは、いずれも、Ｘｂｒａ−
Ｆプローブに独立に結合できないということは、この部位が、低親和性を示すと
いう仮定を確認する。対照的に、Ｘｂｒａ−Ｅプローブ中に存在するＣＡＣＣＴ
部位は、ＳＩＰ１_CZFおよびＳＩＰ１_NZFを結合することができ、この要素の倍化
は、ＳＩＰ１_FSおよび完全長δＥＦ１の双方に対する高親和性結合部位を生じる
。このことは、下流部位中の末端Ｇの塩基が、高親和性結合部位と低親和性のそ
れとの識別も許し得ることを示唆する。しかし、Ｘｂｒａ−ＦのＣＡＣＣＴ部位
は、他方のクラスターが、（Ｘｂｒａ−Ｅの）付近の高親和性ＣＡＣＣＴＧ部位
を占拠したならば、ＳＩＰ１_FSのジンクフィンガークラスターの一方のみを結合
し得る。この末端Ｇ塩基という残基のＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１の結合に対する
重要性を確認するため、下流ＣＡＣＣＴＧ部位をＣＡＣＣＴＡへと突然変異誘発
した（プローブＸｂｒａ−Ｚ）。Ｘｂｒａ−ＺプローブとのＳＩＰ１_FSまたはδ
ＥＦ１の結合は、（Ｘｂｒａ−ＷＴプローブと比較すると）強く低下して、この
Ｇ塩基の残基が、ＳＩＰ１_FSおよびδＥＦ１の双方に対する高親和性結合部位の
生成に重要であることを示唆する。

【００８８】 最後に、ＳＩＰ１_FSまたはδＥＦ１を加える前に、Ｘｂｒａ−ＥとＸｂｒａ−
Ｆプローブとを混合したときは、いかなる結合も観察されず、やはり、両ＣＡＣ
ＣＴ部位が、cisの立体配置で、すなわち同じＤＮＡ上に存在しなければならな
いことを示す。

【００８９】 −ＤＮＡとの結合には、ＳＩＰ１の二つのジンクフィンガークラスターが要求さ
れ、完全でなければならない ＳＩＰ１およびδＥＦ１は、二ＣＡＣＣＴ部位を含むＤＮＡ要素に結合し、こ
れらのタンパク質は、ともに、ＣＡＣＣＴ部位に独立して結合できる、２クラス
ターのジンクフィンガーを有する。その後の研究で、本発明者らは、ＳＩＰ１_FS のＤＮＡとの結合のための各ジンクフィンガークラスターの重要性を評価したい
と考えた。δＥＦ１_NZFのＮ末端クラスターの第三または第四ジンクフィンガー
のいずれかを破壊する突然変異は、ＤＮＡとのこのクラスターの結合を廃止する
ことが示された。同様に、Ｃ末端クラスターの第二または第三ジンクフィンガー
の突然変異誘発も、ＣＡＣＣＴとのδＥＦ１_NZFの結合を廃止した〔１０〕。そ
のため、ＳＩＰ１_NZFおよびＳＩＰ１_CZFクラスターに、δＥＦ１のと類似する突
然変異を導入した。これらの突然変異および野生型クラスターを、ＧＳＴに融合
させ、融合タンパク質を細菌から精製した。野生型のＳＩＰ１_NZFおよびＳＩＰ
１_CZFの双方が、Ｘｂｒａ−Ｅプローブに強く結合することを立証した。しかし
、同じ量の精製した突然変異クラスター／ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−ＮＺ
Ｆ３、ＧＳＴ−ＮＺＦ４、ＧＳＴ−ＣＺＦ２およびＧＳＴ−ＣＺＦ３）では、Ｘ
ｂｒａ−Ｅプローブとの結合は、これらの融合タンパク質のいずれによっても全
く検出できなかった。実際、これらの突然変異も、各クラスター（ＳＩＰ１_NZF
およびＳＩＰ１_CZF）がＣＡＣＣＴ部位に独立に結合できる能力を破壊する。

【００９０】 次いで、同様な突然変異を、完全な大きさのＳＩＰ１に導入し（ＮＺＦ３−Ｍ
ｕｔ、ＮＺＦ４−Ｍｕｔ、ＣＺＦ２−ＭｕｔおよびＣＺＦ３−Ｍｕｔ）、これら
のＳＩＰ１突然変異体をＣＯＳ細胞内で、Ｍｙｃタグ付きタンパク質として過剰
発現させた。異なる突然変異体の発現は、抗Ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロ
ット分析によって確認し、正規化した。ＥＭＳＡによって、ＷＴＳＩＰ１は、Ｘ
ｂｒａ−ＷＴプローブに強く結合し、ＳＩＰ１複合体が、抗Ｍｙｃ抗体との温置
の際にスーパーシフトされることが観察された。対照的に、完全な大きさのＳＩ
Ｐ１の突然変異形態のうち、ＳＩＰ１様複合体またはＳＩＰ１スーパーシフト複
合体を形成できたものは皆無であった。同じ観察が、αＩ４−ＷＴプローブをプ
ローブとして用いたときになされた。結論として、完全な大きさのＳＩＰ１は、
その標的に結合するためには、完全な両ジンクフィンガークラスターの結合能を
必要とし、それは、必然的に二ＣＡＣＣＴ部位を含む。ＳＩＰ１のリプレッサー
活性に対するこれらの突然変異の効果を、ｐ３ＴＰ−Ｌｕｘリポータープラスミ
ドを用いるとともに、トランスフェクションアッセイで試験した。このプラスミ
ドは、それぞれが一つのＣＡＣＣＴを有する、３コピーの、ヒトコラゲナーゼプ
ロモーターの−７３〜−４２の領域を網羅する配列を有する〔de Groot & Kruij
er, 1990〕。ＳＩＰ１は、この多量体化した要素を含むフラグメントに結合した
が、ＮＺＦ３−ＭｕｔまたはＣＺＦ３−Ｍｕｔは、いずれも、結合できなかった
。ＣＨＯ細胞内でのＳＩＰ１の過剰発現は、ｐ３ＴＰ−Ｌｕｘの基底転写活性の
強い抑制へと導く。しかし、この抑制は、ＤＮＡ結合に欠陥があるＳＩＰ１突然
変異体（ＮＺＦ３−ＭｕｔまたはＣＺＦ３−Ｍｕｔ）の過剰発現の際に、６〜７
倍低かった。したがって、ＳＩＰ１のＤＮＡ結合と、最適な、すなわち野生型の
リプレッサー活性との双方に、両ジンクフィンガークラスターの完全性が必要で
ある。

【００９１】 −ＳＩＰ１は、ＤＮＡに単量体として結合する 両ＳＩＰ１ジンクフィンガークラスターの完全性が、二ＣＡＣＣＴ配列とのそ
の結合に要求されるという所見は、ＳＩＰ１が、各ジンクフィンガークラスター
が一ＣＡＣＣＴ部位に接触する、単量体として結合するか否かを試験するよう本
発明者らを促した。しかし、ＳＩＰ１は、その標的部位に単量体として結合する
との仮説も立てることができる。このことは、二量体のＳＩＰ１タンパク質の一
方は、そのＮ末端ジンクフィンガークラスターを通じて一ＣＡＣＣＴ部位を結合
するが、第二のＳＩＰ１分子は、そのＣ末端ジンクフィンガークラスターを通じ
てＤＮＡに接触すると思われることを意味し得る。結果的に、完全な大きさのＳ
ＩＰ１という文字列におけるＮＺＦとＣＺＦとの突然変異体の一定の組合せ（上
記を参照されたい）が、ＤＮＡを結合する二量体の立体配置を生じることになる
。既に示したとおり、試験したＣＺＦ突然変異とのＮＺＦの組合せのうち、Ｘｂ
ｒａ−ＷＴプローブとの結合が検出できたものは皆無であった。これらの突然変
異が二量体形成にも影響すると思われることを除外することはできないが、同じ
突然変異が、ＤＮＡ結合能とともに単量体−単量体相互作用にともに影響する可
能性は非常に低い。その上、異なる二つの突然変異体、すなわち一クラスター内
の異なる突然変異が、全く同じに振る舞うことになる可能性は非常に低い。した
がって、ＳＩＰ１は、ＤＮＡに二量体としては結合しないと考えた。両ジンクフ
ィンガークラスターの完全性が、二つのＣＡＣＣＴ配列とのＳＩＰ１の結合に要
求されるという所見は、ＳＩＰ１が単量体として結合し、各ジンクフィンガーク
ラスターは、一つのＣＡＣＣＴ部位に接触することを示唆する。しかし、ＳＩＰ
１は、その標的部位を二量体として結合するとの仮説を立てることができる。こ
のことは、二量体のＳＩＰ１分子の一方は、そのＮ末端ジンクフィンガークラス
ターを通じて一ＣＡＣＣＴ部位を結合するが、第二のＳＩＰ１分子は、そのＣ末
端ジンクフィンガークラスターを通じてＤＮＡに接触すると思われることを意味
すると思われる。両ジンクフィンガークラスターが結合に必要であることから、
ＤＮＡと作用し合わないジンクフィンガークラスターは、そうして、二量体形成
に関与すると思われる。結果的に、ＮＺＦとＣＺＦとの突然変異体の何らかの組
合せ（上記を参照されたい）が、ＤＮＡを結合する二量体の立体配置を生じるこ
とになる。ＮＺＦとＣＺＦとの突然変異の組合せのうち、Ｘｂｒａ−ＷＴプロー
ブとの結合が検出できたものは皆無であった。これらの突然変異が潜在的な二量
体形成にも影響することを除外することはできないが、同じ突然変異が、ＤＮＡ
結合能とともにタンパク質−タンパク質相互作用にともに影響する可能性は非常
に低い。その上、異なる二つの突然変異体、すなわち一クラスター内に異なる突
然変異を有するものが、同じに振る舞うことになる可能性は非常に低い。これら
の所見は、ＳＩＰ１がＤＮＡを二量体としては結合しないことを示す。両ジンク
フィンガークラスターの完全性が、二つのＣＡＣＣＴ配列とのＳＩＰ１の結合に
要求されるという所見は、ＳＩＰ１が単量体として結合し、各ジンクフィンガー
クラスターは、一つのＣＡＣＣＴ部位に接触することを示唆する。しかし、ＳＩ
Ｐ１は、その標的部位を二量体として結合するとの仮説を立てることができる。
このことは、二量体のＳＩＰ１分子の一方は、そのＮ末端ジンクフィンガークラ
スターを通じて一ＣＡＣＣＴ部位を結合するが、第二のＳＩＰ１分子は、そのＣ
末端ジンクフィンガークラスターを通じてＤＮＡに接触すると思われることを意
味すると思われる。両ジンクフィンガークラスターが結合に必要であることから
、ＤＮＡと作用し合わないジンクフィンガークラスターは、そうして、二量体形
成に関与すると思われる。結果的に、ＮＺＦとＣＺＦとの突然変異体の何らかの
組合せ（上記を参照されたい）が、ＤＮＡを結合する二量体の立体配置を生じる
ことになる。ＮＺＦとＣＺＦとの突然変異の組合せのうち、Ｘｂｒａ−ＷＴプロ
ーブとの結合が検出できたものは皆無であった。これらの突然変異が潜在的な二
量体形成にも影響することを除外することはできないが、同じ突然変異が、ＤＮ
Ａ結合能とともにタンパク質−タンパク質相互作用にともに影響する可能性は非
常に低い。その上、異なる二つの突然変異体、すなわち一クラスター内に異なる
突然変異を有するものが、同じに振る舞うことになる可能性は非常に低い。これ
らの所見は、ＳＩＰ１がＤＮＡを二量体としては結合しないことを示す。両ジン
クフィンガークラスターの完全性が、二つのＣＡＣＣＴ配列とのＳＩＰ１の結合
に要求されるという所見は、ＳＩＰ１が単量体として結合し、各ジンクフィンガ
ークラスターは、一つのＣＡＣＣＴ部位に接触することを示唆する。しかし、Ｓ
ＩＰ１は、その標的部位を二量体として結合するとの仮説を立てることができる
。このことは、二量体のＳＩＰ１分子の一方は、そのＮ末端ジンクフィンガーク
ラスターを通じて一ＣＡＣＣＴ部位を結合するが、第二のＳＩＰ１分子は、その
Ｃ末端ジンクフィンガークラスターを通じてＤＮＡに接触すると思われることを
意味すると思われる。両ジンクフィンガークラスターが結合に必要であることか
ら、ＤＮＡと作用し合わないジンクフィンガークラスターは、そうして、二量体
形成に関与すると思われる。結果的に、ＮＺＦとＣＺＦとの突然変異体の何らか
の組合せ（上記を参照されたい）が、ＤＮＡを結合する二量体の立体配置を生じ
ることになる。図５Ａに示したとおり、ＮＺＦとＣＺＦとの突然変異の組合せの
うち、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブとの結合が検出できたものは皆無であった。これ
らの突然変異が潜在的な二量体形成にも影響すると思われることを除外すること
はできないが、同じ突然変異が、ＤＮＡ結合能とともにタンパク質−タンパク質
相互作用にともに影響する可能性は非常に低い。その上、異なる二つの突然変異
体、すなわち一クラスター内に異なる突然変異を有するものが、同じに振る舞う
ことになる可能性は非常に低い。これらの所見は、ＳＩＰ１がＤＮＡを二量体と
しては結合しないことを示す。両ジンクフィンガークラスターの完全性が、二つ
のＣＡＣＣＴ配列とのＳＩＰ１の結合に要求されるという所見は、ＳＩＰ１が単
量体として結合し、各ジンクフィンガークラスターは、一つのＣＡＣＣＴ部位に
接触することを示唆する。しかし、ＳＩＰ１は、その標的部位を二量体として結
合するとの仮説を立てることができる。このことは、二量体のＳＩＰ１タンパク
質の一方は、そのＮ末端ジンクフィンガークラスターを通じて一ＣＡＣＣＴ部位
を結合するが、第二のＳＩＰ１分子は、そのＣ末端ジンクフィンガークラスター
を通じてＤＮＡに接触すると思われることを意味することになる。両ジンクフィ
ンガークラスターが結合に必要であることから、ＤＮＡと作用し合わないジンク
フィンガークラスターは、そうして、二量体形成に関与すると思われる。結果的
に、ＮＺＦとＣＺＦとの突然変異体の何らかの組合せ（上記を参照されたい）が
、ＤＮＡを結合する二量体の立体配置を生じることになる。図５Ａに示したとお
り、ＮＺＦとＣＺＦとの突然変異の組合せのうち、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブとの
結合が検出できたものは皆無であった。これらの突然変異が潜在的な二量体形成
にも影響することを除外することはできないが、同じ突然変異が、ＤＮＡ結合能
とともにタンパク質−タンパク質相互作用にともに影響する可能性は非常に低い
。その上、異なる二つの突然変異体、すなわち一クラスター内に異なる突然変異
を有するものが、同じに振る舞うことになる可能性は非常に低い。これらの所見
は、ＳＩＰ１がＤＮＡを二量体としては結合しないことを示す。両ジンクフィン
ガークラスターの完全性が、二つのＣＡＣＣＴ配列とのＳＩＰ１の結合に要求さ
れるという所見は、ＳＩＰ１が単量体として結合し、各ジンクフィンガークラス
ターは、一つのＣＡＣＣＴ部位に接触することを示唆する。しかし、ＳＩＰ１は
、その標的部位を二量体として結合するとの仮説を立てることができる。このこ
とは、二量体のＳＩＰ１タンパク質の一方は、そのＮ末端ジンクフィンガークラ
スターを通じて一ＣＡＣＣＴ部位を結合するが、第二のＳＩＰ１分子は、そのＣ
末端ジンクフィンガークラスターを通じてＤＮＡに接触すると思われることを意
味することになる。両ジンクフィンガークラスターが結合に必要であることから
、ＤＮＡと作用し合わないジンクフィンガークラスターは、そうして、二量体形
成に関与すると思われる。結果的に、ＮＺＦとＣＺＦとの突然変異体の何らかの
組合せ（上記を参照されたい）が、ＤＮＡを結合する二量体の立体配置を生じる
ことになる。図５Ａに示したとおり、ＮＺＦとＣＺＦとの突然変異の組合せのう
ち、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブとの結合が検出できたものは皆無であった。これら
の突然変異が潜在的な二量体形成にも影響することを除外することはできないが
、同じ突然変異が、ＤＮＡ結合能とともにタンパク質−タンパク質相互作用にと
もに影響する可能性は非常に低い。その上、異なる二つの突然変異体、すなわち
一クラスター内に異なる突然変異を有するものが、同じに振る舞うことになる可
能性は非常に低い。これらの所見は、ＳＩＰ１がＤＮＡを二量体としては結合し
ないことを示す。

【００９２】 このことを実験的に取り扱うために、異なるタグを有するＳＩＰ１と、ＥＭＳ
Ａでのスーパーシフトの実験との組合せを用いた。初めに、Ｍｙｃタグ付きおよ
び／またはＦＬＡＧタグ付きのＳＩＰ１_FSを、ＣＯＳ細胞内に同等のレベルで別
個に生成し、両タンパク質が、類似の親和性でＤＮＡに結合することを確認した
。Ｍｙｃタグ付きＳＩＰ１で生成されたＳＩＰ１複合体は、ＦＬＡＧタグ付き複
合体より僅かに遅い移動を有する（Ｍｙｃタグは、ＦＬＡＧタグより長い）。類
似の量のＭｙｃタグ付きおよびＦＬＡＧタグ付きＳＩＰ１をともに発現するＣＯ
Ｓ細胞から調製した抽出物を、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブとともに温置し、ＥＭＳ
Ａに用いた。高速で移動するＦＬＡＧタグ付きＳＩＰ１複合体と、低速で移動す
るＭｙｃタグ付きＳＩＰ１複合体との組合せである、幅広いＳＩＰ１複合体の形
成が観察された。抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、ＦＬＡＧタグ付きＳＩＰ１に相当す
る、低い部分の複合体のみが、スーパーシフトされたのに対し、Ｍｙｃタグ付き
ＳＩＰ１複合体内には、約５０％の放射能が残留した。このことは、後者のＳＩ
Ｐ１複合体は、抗ＦＬＡＧ抗体ではスーパーシフトされないことを示す。逆に、
抽出物を抗Ｍｙｃ抗体とともに温置することは、Ｍｙｃタグ付きＳＩＰ１に相当
する、低い部分の複合体のみが、スーパーシフトされたのに対し、放射能の５０
％は、ＦＬＡＧタグ付きＳＩＰ１複合体内に保持された。やはり、このことは、
抗Ｍｙｃ抗体でスーパーシフトされるＦＬＡＧタグ付きＳＩＰ１が皆無であるこ
とを示す。両抗体を用いて、Ｍｙｃタグ付きおよびＦＬＡＧタグ付きスーパーシ
フト複合体に相当する、二つの同じスーパーシフトバンドがゲルの上部に観察さ
れた。ＳＩＰ１二量体が形成されるとすれば、少なくともいくつかのヘテロ二量
体が、Ｍｙｃタグ付きＳＩＰ１およびＦＬＡＧタグ付きＳＩＰ１から組み立てら
れるはずである。しかし、潜在的な二重スーパーシフト、すなわち抗Ｍｙｃ抗体
と抗ＦＬＡＧ抗体との双方でスーパーシフトされたようなその他のスーパーシフ
トバンドは、全く検出できなかった。したがって、この実験は、ＦＬＡＧタグ付
きＳＩＰ１とＭｙｃタグ付きＳＩＰ１との間での検出できる二量体形成は、全く
示さなかった。

【００９３】 最後に、ＣＯＳ細胞抽出物中のＦＬＡＧタグ付きＳＩＰ１を、大過剰量のＤＮ
Ａ結合部位の存在下で免疫沈降させた。しかし、Ｍｙｃタグ付きＳＩＰ１の同時
免疫沈降は、実施できなかった。反対の実験、すなわち抗Ｍｙｃ抗体での免疫沈
降、および抗ＦＬＡＧ抗体での検出は、いかなるＳＩＰ１二量体も示さなかった
。考え併せると、これらの所見は、ＳＩＰ１は、Ｘｂｒａ−ＷＴプローブに単量
体として結合すると結論させる。

【００９４】 −上流または下流いずれかのＣＡＣＣＴにおける突然変異は、トランスジェニッ
クカエル胚におけるＸｂｒａ２プロモーターの異所性の活性へと導く ＳＩＰ１は、ツメガエル属の胚で過剰発現されたとき、Ｘｂｒａ２プロモータ
ーに結合し、内在性Ｘｂｒａ２のｍＲＮＡの発現を抑制する〔Verschueren et a
l., 1999〕。Ｘｂｒａ２プロモーターのin vivoでの調節の際のＣＡＣＣＴ配列
の重要性を解析するために、これらの突然変異が、トランスジェニック胚でのＸ
ｂｒａ２プロモーター活性に影響するか否かを試験した。Ｘｂｒａ２プロモータ
ー配列を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の上流に融合させ、このリポーターカ
セットを、遺伝子導入に用いた。内在性Ｘｂｒａ２のｍＲＮＡ（周辺帯域に存在
）と比較して、２．１kb長のＸｂｒａ２プロモーターフラグメントは、調節性要
素がここで試験したリポーターカセットを欠く可能性がある、オルガナイザー領
域以外の、胚の同じドメインにリポータータンパク質合成を生じるのに充分であ
る（胚の８５％、第１１期、ｎ＝５７）ことが示された。

【００９５】 プロモーターの下流ＣＡＣＣＴ部位内の、ＳＩＰ１の結合を破壊し（Ｘｂｒａ
２−Ｍｕｔ１）、ＸｂｒａＤと同一である、単一の点突然変異は、リポータータ
ンパク質の空間的生成に重大な効果があった。すべての胚（ｎ＞３０）が、内側
の外胚葉性の層での異所性発現を示した。上流ＣＡＣＣＴ配列内の突然変異も、
ＳＩＰ１の結合に影響し：すべてのトランスジェニック胚（ｎ＞３０）で、Ｘｂ
ｒａ２−Ｍｕｔ１突然変異と同じ異所性発現が観察された。下流ＣＡＣＣＴＧの
ＣＡＣＣＴＡへの突然変異（Ｘｂｒａ２−Ｍｕｔ２）も、そのようなプローブと
のＳＩＰ１の結合に影響を及ぼした。この突然変異も、Ｘｂｒａ２の２．１kbの
プロモーターに導入したとき、試験したすべてのトランスジェニック胚でＧＦＰ
ｍＲＮＡの異所性発現へと導いた。二ＣＡＣＣＴ配列間の本来の２４bpの間隔取
りを３bp減少させる、突然変異（Ｘｂｒａ２−Ｍｕｔ３）も試験した。この突然
変異は、ＳＩＰ１とのそのようなプローブの相互作用を弱めた。このことも、対
応するトランスジェニック胚に反映された（ｎ＝３７）が：胚の３５％は、野生
型Ｘｂｒａ２の２．１kbプロモーターフラグメントと同じ発現パターンを示し、
６５％は、内側外胚葉層に継ぎ張り、または弱い連続的発現があった。

【００９６】 こうして、ＥＭＳＡでのＳＩＰ１結合親和性に対するこれらの突然変異の効果
と、表現型（リポーター遺伝子の異所性発現）およびそのin vivoでの浸透度と
の間の見事な相関が得られて、ツメガエル属の発生（第１１期）の際のＸｂｒａ
２発現の正常な調節における、ＳＩＰ１標的部位の重要性を示した。それは、こ
れまで未知であったツメガエル属のＳＩＰ１様リプレッサーが、in vivoでＸｂ
ｒａ２の遺伝子発現を調節することも示唆する。加えて、それは、ＳＩＰ１様因
子は、Ｘｂｒａ２のような標的プロモーターを調節するのに、二つの完全なＣＡ
ＣＣＴ部位を必要とすることを確認する。

【００９７】 ２．ＳＩＰ１は、Ｅ−カドヘリンの下向調節によって浸潤を誘導する 結果 −ＳＩＰ１の結合は、保存された二つのＥボックスへの結合によって、Ｅ−カド
ヘリンのプロモーター活性を抑制する ＳＩＰ１の結合が、ヒトＥ−カドヘリンプロモーター（−３０８／＋４１）の
転写活性に影響するか否かを解明するため、完全長ＳＩＰ１を、Ｅ−カドヘリン
プロモーター駆動のリポーター構成体とともにＥ−カドヘリン陽性細胞系のＮＭ
ｅ（マウス）、ＭＤＣＫ（イヌ）およびＭＣＦ７／ＡＺ（ヒト）で一過的に同時
発現させた。ＳＩＰ１の発現は、ヒトＥ−カドヘリンのプロモーター活性の８０
％の低下へと導いた。保存された二つのＥボックスに対するＳＩＰ１の結合特異
性を取り扱うために、上流Ｅ−ｂｏｘ１（−７５）もしくは下流Ｅ−ｂｏｘ３（
−２５）のいずれかにか、または両Ｅボックスに同時に、突然変異誘発を実施し
た。ＳＩＰ１ｃＤＮＡおよび突然変異Ｅ−カドヘリンプロモーター構成体によっ
て、同時トランスフェクションを実施したとき〔６８〕、ヒトＥ−カドヘリンの
プロモーター活性の脱抑制が一貫して示された。加えて、突然変異させたＳＩＰ
１構成体を、ヒトＥ−カドヘリンプロモーターと同時トランスフェクションした
。Ｎ末端またはＣ末端ジンクフィンガークラスターの突然変異は、Ｅ−カドヘリ
ンのプロモーター活性の僅かな脱抑制のみを招いた。興味深いことに、ヒトＥ−
カドヘリンプロモーターとＳＩＰ１二重突然変異体との同時トランスフェクショ
ンは、両ジンクフィンガークラスターに影響を及ぼして、Ｅ−カドヘリンのプロ
モーター活性のＳＩＰ１介在性抑制の顕著な喪失を招いた。したがって、ＳＩＰ
１は、二つのＥボックスに結合することによってＥ−カドヘリンのプロモーター
活性を抑制し、二つのジンクフィンガークラスターは、実際に、Ｅ−カドヘリン
のプロモーター活性の完全な抑制に必要であると結論することができる。

【００９８】 −ＳＩＰ１の誘導できる発現は、Ｅ−カドヘリンタンパク質およびｍＲＮＡの用
量依存性の喪失を招く ＳＩＰ１は、内在性Ｅ−カドヘリンの発現レベルに影響するか否かを解明する
ため、ｔＴＡトランスアクチベーターの高い発現を有する、Ｅ−カドヘリン陽性
のＭＤＣＫ−Ｔｅｔｏｆｆ細胞を、応答性ｔＴＡ要素の制御下でＭｙｃ₆タグ付
き完全長マウスＳＩＰ１ｃＤＮＡを発現するプラスミドで安定的にトランスフェ
クションした。ＳＩＰ１を誘導するために、細胞を、テトラサイクリンなしで３
日間増殖させた。クローニングした代表的なトランスフェクタントの免疫蛍光法
による、Ｅ−カドヘリンおよびＳＩＰ１の分析は、細胞−細胞接触個所での典型
的な蜂の巣状のＥ−カドヘリン発現パターンの全喪失と同時の、核内に誘導され
たＳＩＰ１を明らかにした。ウエスタンブロット分析は、これらの結果を確認し
た。ＳＩＰ１誘導は、２μg/mlに等しいか、またはそれ以下のテトラサイクリン
濃度で生じた。テトラサイクリン濃度を徐々に低下させるにつれて、Ｅ−カドヘ
リンは、より強く抑制され、これは、ＳＩＰ１の蓄積と逆相関関係があった。さ
らに、Ｅ−カドヘリンをアクチン細胞骨格に結合するカテニンが、ＳＩＰ１発現
によって影響されるかを調べた。ウエスタンブロット分析したところ、αＥ−カ
テニンまたはβ−カテニンは、いずれも、影響されたようには見えず、このこと
は、免疫蛍光法によって確認された。非誘導および誘導細胞の双方の、等量の総
ＲＮＡを、ノーザンブロット分析によって解析した。Ｅ−カドヘリン特異的プロ
ーブとのハイブリダイゼーションの後、ＳＩＰ１発現細胞は、Ｅ−カドヘリンｍ
ＲＮＡをほとんど示さなかったのに対し、非誘導細胞（＋ｔｅｔ）は、正常量の
Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡを発現した。これらの結果は、ＳＩＰ１発現の誘導が、
ｍＲＮＡの下向調節を通じて内在性Ｅ−カドヘリン発現に影響するとおり、リポ
ーターアッセイのそれを確認する。

【００９９】 −ヒト癌腫細胞系におけるＳＩＰ１発現 一連のＥ−カドヘリン陰性および陽性細胞系におけるＳＩＰ１の発現を検査す
るため、ノーザンブロット分析を実施した。δＥＦ１ファミリーの他の成員との
あり得る交差ハイブリダイゼーションを避けるため、適切なマウスおよびヒトＳ
ＩＰ１ｃＤＮＡフラグメントをプローブとして用いた。ＳＩＰ１発現とＥ−カド
ヘリン発現との間の明快な強い逆相関が注目された。ヒト繊維芽細胞で、ＳＩＰ
１の高い発現が見出され、ＳＩＰ１の最も優勢な発現は、メチル化Ｅ−カドヘリ
ンプロモーターを有することが報告されている〔５３〕、Ｅ−カドヘリン陰性癌
腫細胞で見出された。記載された細胞系におけるＳＩＰ１の発現レベルは、Ｅ−
カドヘリン陰性細胞系におけるＳｎａｉｌｍＲＮＡの発現と共通するため〔６６
〕、本発明の条件付きＳＩＰ１発現細胞系のＭＤＣＫ−Ｔｅｔｏｆｆ−ＳＩＰ１
におけるＳｎａｉｌの発現レベルを探索した。Ｓｎａｉｌの発現は、ＳＩＰ１の
誘導後は検出できなかった。Ｅ−カドヘリンの抑制は、本発明者らの細胞系では
Ｓｎａｉｌに関係しない。

【０１００】 −ＳＩＰ１は、細胞−細胞接着の喪失および浸潤を促進することによって、悪性
の表現型を増強する Ｅ−カドヘリンは、周知の浸潤抑制因子の分子であるため〔４７〕、ＳＩＰ１
の誘導が、細胞をより浸潤性の表現型に切り換えるか否かを取り扱った。細胞凝
集アッセイを、非誘導ＭＤＣＫ−Ｔｅｔｏｆｆ−ＳＩＰ１細胞に対して、誘導さ
れたそれと対比して実施した。非誘導ＭＤＣＫ−Ｔｅｔｏｆｆ−ＳＩＰ１細胞は
、３０分後に有意な凝集を示したが、ＳＩＰ１の誘導は、正常な細胞−細胞凝集
を、Ｅ−カドヘリン遮断性抗体のＤＥＣＭＡ−１と同程度まで減殺した。コラー
ゲンＩ型ゲルへの浸潤は、ＳＩＰ１によって、ＤＥＣＭＡ−１抗体によるのと同
様に効率的に誘導された。

【０１０１】 −ＳＩＰ１発現は、一方向性細胞移動の低下を招く 細胞移動に対するＥ−カドヘリンの役割は、遮断性Ｅ−カドヘリンを、一方向
性細胞移動の低下を招く、特異的抗体とともに用いることによって立証された〔
７２〕。Ｅ−カドヘリンの下向調節による、異なる細胞移動に対するＳＩＰ１発
現の効果を、誘導可能なＭＤＣＫ−Ｔｅｔｏｆｆ−ＳＩＰ１発現細胞系における
創傷アッセイで調べた。ＳＩＰ１の誘導は、より低い一方向性細胞移動を招くこ
とを立証することができた。Ｅ−カドヘリン介在細胞−細胞接触の下向調節は、
一方向性移動の撹乱を招く。

【０１０２】 （考察） 浸潤および転移は、腫瘍の進行における最も決定的な段階である。癌腫細胞の
悪性は、細胞−細胞接着および細胞分化の喪失によって特徴付けられ、Ｅ−カド
ヘリンの下向調節と負の相関関係にあることがしばしば報告されている。Ｅ−カ
ドヘリン発現の喪失は、転写の調節不全に帰されている〔５２、７３〕。本明細
書で本発明者らは、ジンクフィンガータンパク質のＳＩＰ１について、それが、
最小Ｅ−カドヘリンプロモーターに存在する保存されたＥボックスに結合するこ
とによって、Ｅ−カドヘリンの発現を転写レベルで抑制することを示す。二つの
Ｅボックスに対するＳＩＰ１の特異的結合は、ＳＩＰ１のジンクフィンガークラ
スター、またはＥ−カドヘリンプロモーター中のＥボックス配列のいずれかの突
然変異誘発によって確認された。実際、そのような突然変異は、ＳＩＰ１による
Ｅ−カドヘリンプロモーター活性の抑制の喪失を招いた。これらの結果は、Ｅボ
ックスの同等の突然変異が、野生型プロモーターが低い活性を示す、Ｅ−カドヘ
リン陰性細胞系におけるＥ−カドヘリンプロモーター活性の上向調節を招いたと
いう所見〔５６、５８〕と両立可能である。転写リプレッサーであるＳＩＰ１の
安定的なトランスフェクションは、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベル双方でのＥ
−カドヘリンの下向調節を誘導する。創傷アッセイは、ＳＩＰ１が、機能性Ｅ−
カドヘリンの細胞−細胞接触が介在する一方向性移動に干渉することを立証する
。より弱い細胞−細胞接触は、より多方向性の上皮細胞の移動を招く。下向調節
されたＥ−カドヘリンと、上向調節されたＳＩＰ１発現との衝撃的な相関関係が
、様々なヒト腫瘍細胞で認められた。最後に、本明細書で、ＳＩＰ１発現による
Ｅ−カドヘリンの下向調節は、浸潤能の顕著な増大も伴うことが立証された。そ
のため、ＳＩＰ１は、Ｅ−カドヘリンプロモーターとのその結合による浸潤誘導
因子と見なすことができる。転写リプレッサーであるＳｎａｉｌも、Ｅボックス
を特異的に結合して、転写Ｅ−カドヘリンの抑制を招くこと〔６６、６７〕は、
本発明者らの研究におけるＥ−カドヘリンの抑制が、Ｓｎａｉｌ介在性であるか
否かという疑問を提起した。ＳｎａｉｌｍＲＮＡの上向調節は、条件付きＳＩＰ
１発現性のＭＤＣＫ−Ｔｅｔｏｆｆ−ＳＩＰ１細胞系で検出することができなか
った。これらのデータは、ＳＩＰ１を、本発明者らの細胞系における転写Ｅ−カ
ドヘリンの抑制のエフェクターと見なすようにさせる。この理念は、Ｅボックス
の突然変異が、ＳＩＰ１と同時トランスフェクションされたとき、Ｅ−カドヘリ
ンプロモーターの抑制の低下に対する、より大規模な効果を有するという事実に
よって裏付けられた。ＳＩＰ１と同時トランスフェクションされたときの、Ｅ−
カドヘリンのプロモーター活性の脱抑制は、Ｅボックスの単一突然変異によって
既に検出された。Ｓｎａｉｌ同時トランスフェクションについては、明確な脱抑
制効果は、より多くのＥボックスをヒトＥ−カドヘリンプロモーター内で突然変
異させたときにのみ認められたにすぎない〔６６〕。乳癌細胞系のＭＤＡ−ＭＢ
４３５ＳおよびＭＤＡ−ＭＢ２３１におけるＳＩＰ１の高い発現は、顕著である
。これらの腫瘍細胞系は、過メチル化されたＥ−カドヘリンプロモーターを有す
ることが記載されている〔５３〕。しかし、このことが、内在性Ｅ−カドヘリン
プロモーターのＳＩＰ１による抑制に対する重要な役割を排除してはならない。
これらの細胞系では、Ｅボックスの突然変異は、内在性Ｅ−カドヘリンのプロモ
ーター活性を強く再活性化する。実際、最近の研究は、多くの転写因子が、染色
体改変活性を有する多タンパク質複合体を、ＤＮＡ上の特定の部位に動員するこ
とによって機能することを明確にした〔７４〕。もう一つのＳｍａｄ相互作用性
転写因子であるＴＧＩＦが、ヒストンデアセチラーゼに付随することは既に示さ
れた〔７５〕。そのため、ＤＮＡメチル化および染色体濃縮は、ヒストン脱アセ
チル化と相乗的に作用して、遺伝子転写を抑制することがあり得る〔７６〕。

【０１０３】 （材料および方法） 細胞培養および試薬 ＭＤＣＫ−Ｔｅｔｏｆｆ細胞系は、Clontech（Palo Alto、米国）から入手し
た。この細胞系は、Madin Darby Canine Kidney（ＭＤＣＫ）II型上皮細胞系に
由来し、Ｔｅｔ−ｏｆｆトランスアクチベーター、すなわちｔＴＡを安定的に発
現する〔７７〕。ＭＣＦ７／ＡＺ細胞系は、ＭＣＦ７、すなわちヒト乳癌細胞系
に由来する細胞系である〔７８〕。ＮＭｅ細胞系は、ＮＭｕＭＧのＥ−カドヘリ
ン発現性サブクローン、すなわち正常マウスの乳腺からの上皮細胞系である〔４
７〕。ＭＤＡ−ＭＢ２３１は、ヒト乳癌細胞系である（ATCC, Manassas, VA）。

【０１０４】 プラスミド 完全な大きさのマウスＳＩＰ１ｃＤＮＡ配列を、ｐＣＳ２に由来する、Ｍｙｃ
タグを有するｐＣＳ３という真核生物発現ベクター〔６９〕にクローニングした
。得られたプラスミドを、ｐＣＳ３−ＳＩＰ１ＦＳと名付けた。ＳＩＰ１のジン
クフィンガークラスターの突然変異誘発は、Remacleら〔６８〕によって記載さ
れている。誘導可能ベクターであるｐＵＨＤ１０．３ＳＩＰ１の構築のため、ｐ
ＣＳ３ＳＩＰ１ＦＳからのClaI／XbaIフラグメントをEcoRI／Xbal切断ｐＵＨＤ
１０．３ベクターにクローニングした〔７９〕。ＳＩＰ１フラグメントのClaI部
位、およびこのベクターのEcoRI部位を、Ｐｆｕポリメラーゼ（Stratagene, La
Jolla, CA）を用いて末端平滑化した。Ｅ−カドヘリンのプロモーター配列（−
３４１／＋４１）を、ヒトＭＣＦ７／ＡＺ細胞系からのゲノムＤＮＡに対するＰ
ＣＲによって得た。用いたＰＣＲプライマーは：5′-ＡＣＡＡＡＡＧＡＡＣＴＣ
ＡＧＣＣＡＡＧＴＧ-3′、および5′-ＣＣＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＡＧＧＴＧＣ-3
′である。効率的な増幅のために、ＧＣ融成物キット（Clontech, Palo Alto, C
A）を用いた。ＰＣＲ生成物を、末端平滑化し、キナーゼ処理し、次いでｐＧＬ
３ｂａｓｉｃベクター（Promega, Madison, WA）にクローニングし、これをSrfI
部位で開裂した。このルシフェラーゼリポーター構成体のKpnI−HindIII部位を
用いることによって、Ｅ−カドヘリンプロモーターもｐＧＬ３エンハンサーベク
ターに移転した。ヒトＥ−カドヘリンプロモーターにおけるＥボックスの突然変
異誘発は、QuickChange Site-Directed Mutagenesisキット（Stratagene）によ
って、下記のプライマーを用いることによって実施した：前進プライマーＥボッ
クス１：5′-gctgtggccggCAGATGaaccctcag-3′；逆進プライマーＥボックス１：
5′-ctgagggttCATCTGccggccacagc-3′；前進プライマーＥボックス３：5′-gctc
cgggctCATCTGgctgcagc-3′；逆進プライマーＥボックス３：5′-gctgcagcCAGATG
agccccggagc-3′。

【０１０５】 細胞の安定的トランスフェクション ＭＤＣＫ−Ｔｅｔｏｆｆ細胞系の安定的トランスフェクションのために、Lipo
fectAMINE PLUS（登録商標）（Gibco BRL, Rochville、米国）の方法を用いた。
２，０００個の細胞を、７５cm²ファルコンで２４時間増殖させ、次いで、ｐＵ
ＨＤ１０．３−ＳＩＰ１プラスミド３０μg、プラスｐＰＨＴプラスミド３μgで
トランスフェクションした。後者は、ｐＰＮＴの誘導体であり、ヒグロマイシン
に対する耐性を与える〔８０〕。安定的なＭＤＣＫ−Ｔｅｔｏｆｆトランスフェ
クタント、すなわちＭＤＣＫ−Ｔｅｔｏｆｆ−ＳＩＰ１は、ヒグロマイシンＢ（
１５０単位／ml）（Duchefa Biochemie, Haarlem、オランダ国）によって２週間
にわたって選別した。ＳＩＰ１の誘導は、テトラサイクリン（１μg/ml）（Sigm
a Chemicals、米国）を加えることによって阻害した。ＳＩＰ１の発現は、サブ
クローニングの時点でテトラサイクリンを洗い落とすことによって実施した。信
頼できる誘導特性を有する安定的なクローンを、抗Ｍｙｃタグ抗体を用いた免疫
蛍光法によって特定した。

【０１０６】 プロモーターリポーターアッセイ FuGENE 6（Roche, Basel、スイス国）を用いることによって、ＭＣＦ７／ＡＺ
細胞を一過的にトランスフェクションした。ＮＭｅおよびＭＤＡ−ＭＢ２３１を
、LIPOFECTAMINE（Gibco BRL, Rochville、米国）の手順でトランスフェクショ
ンし、親ＭＣＤＫ細胞系を、LIPOFECTAMINEPLUS（Gibco BRL, Rochville、米国
）で一過的にトランスフェクションした。一過性トランスフェクションのために
は、ウェル１０cm²あたり約200,000個の細胞を播種した。２４時間温置した後、
各プラスミド型ＤＮＡ６００ngをトランスフェクションした。培地は、トランス
フェクションの２４時間後に更新した。細胞を、３日後にGalacto-Star（登録商
標）キット（Tropix, Bedford, MA）の溶菌液中で溶解させた。トランスフェク
ションの正規化は、同時トランスフェクションしたｐＵＴ６５１プラスミド（Eu
rogentec, Seraing、ベルギー国）がコードしているβ−ガラクトシダーゼの測
定によって実施した。ルシフェラーゼ基質を各サンプルに加えた。β−ガラクト
シダーゼの検出のためには、化学ルミネッセンス基質（Tropix, Bedford, MA）
を供給した。ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性は、Topcount Mic
roplate Scintillation Reader（Packard Instrument Co., Meriden, CT）で検
定した。

【０１０７】 ノーザンブロット分析 総ＲＮＡを、RNeasyキット（Qiagen, Chatsworth, CA）により、製造者のプロ
トコルに従って単離した。総ＲＮＡを、グリオキシル化し、１％アガロースゲル
上でサイズ分画し、Hybond-N⁺膜（Amersham Pharmacia Biotech, Rainhalm、英
国）に移転した。ハイブリダイゼーションは、前記のとおり〔８１〕実施した。
マウスＳＩＰ１プローブ（４５９bp）は、マウスＳＩＰ１ｃＤＮＡのEcoRI消化
によって生成した。ヒトＳＩＰ１プローブ（７０７bp）は、Kiaa 0569クローン
（Kazusa DNA Research Institute）上でBstEII−NotI消化によって生成した。
用いたマウスＥ−カドヘリンプローブは、マウスＥ−カドヘリンｃＤＮＡのSacI
フラグメント（５００bp）であった。二つの縮重プライマー：5′ ＣＴＴＣＣＡ
ＧＣＡＧＣＣＣＴＡＣＧＡＹＣＡＲＧＣＮＣＡ 3′；5′ ＧＧＧＴＧＴＧＧＧＡ
ＣＣＧＧＡＴＲＴＧＣＡＴＹＴＴＮＡＴ 3′を用いて、イヌＳｎａｉｌｃＤＮＡ
のフラグメントを、ＭＤＣＫ細胞系の総ｃＤＮＡ集団から増幅した。増幅された
バンドのクローニングおよび配列決定は、４３２bpのｃＤＮＡフラグメントを明
らかに示した。装荷されるＲＮＡの量を制御するために、ＧＡＰＤＨプローブを
同じブロットで用いた。放射性バンドの定量は、PhosphorImager 425（BioRad,
Richmond, CA）によって実施した。

【０１０８】 免疫蛍光アッセイおよび抗体 問題の細胞を、カバーグラス上で増殖させた。固定は、標準的手順によった〔
８２〕。下記の抗体を用いた：マウスとイヌのＥ−カドヘリンを認識する、ラッ
トモノクローナル抗体ＤＥＣＭＡ−１（Sigma, Irvine、英国）、およびマウス
抗Ｍｙｃタグ抗体（Oncogene, Cambridge, MA）。用いた二次抗体は、Alexa 488
カップリング抗ラットＩｇおよびAlexa 594カップリング抗マウスＩｇであった
。

【０１０９】 細胞凝集アッセイ 単細胞懸濁液は、Ｅ−カドヘリン救済手順〔８３〕に従って調製した。細胞を
、１．２５mMＣａ²⁺を含有する等張緩衝液中で、８０rpmで３０分間の回転振盪
下（New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ）で温置した。粒径は、コ
ールター粒度計ＬＳ２０００（Couter, Lake Placid, NY）で、開始時（Ｎ₀）、
および温置の３０分後（Ｎ₃₀）に測定し、体積分布の百分率に対してプロットし
た。

【０１１０】 コラーゲン浸潤アッセイ ６穴プレートに、１ウェルあたり１．２５mlの中和したＩ型コラーゲン（Upst
ate Biotechnoloty, Lake Placid, NY）を充填した。ゲル化には、３７℃で少な
くとも１時間の温置が必要とされた。単細胞懸濁液を、コラーゲンゲルの上端に
播種し、培養体を３７℃で２４時間温置した。コンピュータプログラムによって
制御される倒立顕微鏡を用いて、浸潤性および表面性の細胞を、０．１５７mm²
の１２視野で計数した。浸潤指数は、ゲルに侵入する細胞の細胞総数に対する百
分率を表す〔８４〕。

【０１１１】 創傷アッセイ 創傷アッセイは、前記のとおり〔８５〕実施した。略述すると、傷ついた単層
を、テトラサイクリンの存在または不在下で、血清除去培地中で２４時間培養し
た。細胞の移動を、創傷の距離を測定することによって査定した。移動の結果は
、創傷の距離の平均値として表される。

【０１１２】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】 Ｚｆｈ−１、ＳＩＰ１およびδＥＦ１、ならびにＳＩＰ１およびδＥＦ１ジン
クフィンガーの整列の模式的表現を示す図である。（Ａ）マウスδＥＦ１（１，
１１７アミノ酸）およびＳＩＰ１（１，２１４アミノ酸）の模式的表現。黒い矩
形は、ＣＣＨＨジンクフィンガーを表し、白い矩形は、ＣＣＨＣジンクフィンガ
ーである。ホメオドメイン様ドメイン（ＨＤ）は、楕円として描かれている。百
分率は、異なるドメイン間の相同性を表す。この研究に用いたＳＩＰ１というポ
リペプチドは、それらの座標とともに描かれている。ＳＢＤ：Ｓｍａｄ結合ドメ
イン〔Verschueren et al., 1999〕。（Ｂ）ＳＩＰ１およびδＥＦ１のジンクフ
ィンガーからのアミノ酸配列の整列。縦の棒は、配列同一性を示す。ジンクフィ
ンガーを形成する、保存されたシステインおよびヒスチジン残基は、太字で印刷
し、星印で示した。ジンクフィンガー内の、ＤＮＡと接触できる残基は、矢印で
示した。（Ｃ）それぞれ、ジンクフィンガーの分子内保存を立証する、ＳＩＰ１ _NZF3+NZF4 とＳＩＰ１_CZF2+CZF3およびδＥＦ１_NZF3+NZF4とδＥＦ１_CZF2+CZF3の
タンパク質配列の整列。

【図２】 ＳＩＰ１の可能なＤＮＡ結合の機序を示す図である。モデル１：ＳＩＰ１は、
単量体としてＤＮＡと結合する。モデル２：ＳＩＰ１は、二量体としてＤＮＡと
結合する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/435 Ｃ１２Ｑ 1/02 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｑ 1/02 1/68 Ａ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 フェルスヒューレン，クリスティン ベルギー国、ベー−3078 エーフェルベル フ、トウェー・レーウウェンストラート 22 (72)発明者 レマクル，ジャック ベルギー国、ベー−4280 アンニュ、アブ ニュ・デ・リラ ７ Ｆターム(参考） 2G045 BB20 DA12 DA13 DA14 DA36 FA16 FB02 FB07 4B024 AA20 BA80 CA01 CA09 DA02 FA02 4B063 QA01 QA08 QA18 QQ08 QQ42 QQ79 QR32 QR48 QR55 QR77 QS34 4C084 AA17 ZB262 4C085 AA14 BB11 DD62 4H045 AA10 AA30 FA74

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アクチベーターおよび／またはリプレッサーのような転写因
   子を同定する方法であって、潜在的転写因子をコードしているライブラリーをス
   クリーニングするためのおとりとして、少なくとも配列ＣＡＣＣＴ、好ましくは
   ＣＡＣＣＴ配列を２回含む核酸配列を細胞に与え、特異性試験を実施して、該因
   子を単離することを含む方法。
2. 【請求項２】 アクチベーターおよび／またはリプレッサーのような転写因
   子を同定する方法であって、おとりとして、配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、
   ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−
   Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎは、スペーサー配列である）のうちの一つを含む核酸配列を
   細胞に与えることを含む方法。
3. 【請求項３】 転写因子が、ジンクフィンガーの分離したクラスターを含む
   ことを特徴とする、請求項１または２記載の方法。
4. 【請求項４】 配列が、プロモーター領域を起源とする、請求項１〜３のい
   ずれか一項に記載の方法。
5. 【請求項５】 プロモーター領域が、ブラキュリ、α４−インテグリン、フ
   ォリスタチンまたはＥ−カドヘリンから選ばれる、請求項４記載の方法。
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によって得られる
   転写因子。
7. 【請求項７】 請求項６に定義された転写因子に対して干渉能を有する化合
   物を同定する方法であって、 （ａ）同定しようとする潜在的化合物を含むサンプルを、（ｉ）おとりとしての
   、配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ
   −Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎは、スペーサー配列で
   ある）のうちの一つを含むヌクレオチド配列、および（ii）該ヌクレオチド配列
   と結合することができるタンパク質を含む試験系に加え、 （ｂ）該サンプルを該系内で、該化合物またはその誘導体もしくはその相対物と
   該タンパク質との相互作用を可能にするのに充分な期間温置し、 （ｃ）該ヌクレオチド配列に結合したタンパク質の量および／または活性を該添
   加の前後で比較し、そして （ｄ）該化合物を同定し、場合により単離かつ／または精製する ことを含む方法。
8. 【請求項８】 タンパク質が、Ｓｍａｄ相互作用性タンパク質である、請求
   項７記載の方法。
9. 【請求項９】 該Ｓｍａｄ相互作用性タンパク質が、ＳＩＰ１である、請求
   項８記載の方法。
10. 【請求項１０】 請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法によって得るこ
    とができる化合物。
11. 【請求項１１】 Ｅ−カドヘリン発現の調節をＳＩＰ１によって変更する、
    請求項１０記載の化合物。
12. 【請求項１２】 医薬として用いるための、請求項１０又は１１に記載の化
    合物。
13. 【請求項１３】 腫瘍の浸潤および／または転移を予防する医薬の製造のた
    めの、請求項１０又は１１に記載の化合物の使用。
14. 【請求項１４】 請求項７記載の方法を実施するための試験キットであって
    、少なくとも（ｉ）配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧ
    ＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎは、
    スペーサー配列である）のうち一つを含むヌクレオチド配列、および（ii）該ヌ
    クレオチド配列と結合することができるタンパク質を含む試験キット。
15. 【請求項１５】 請求項２記載の方法を実施するための試験キットであって
    、少なくとも配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ、
    ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎは、スペー
    サー配列である）のうち一つを含む核酸配列を含む試験キット。
16. 【請求項１６】 第一の相互作用性タンパク質と第二の相互作用性タンパク
    質との相互作用を検出する方法であって、 （ａ）適する宿主細胞に、配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−
    ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（
    Ｎは、スペーサー配列である）のうち一つを含む核酸配列と結合することができ
    るＤＮＡ結合ドメインに融合された、第一の相互作用性タンパク質を含む第一の
    融合タンパク質を与え、 （ｂ）該適する宿主細胞に、配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ
    −ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ
    （Ｎは、スペーサー配列である）のうち一つを含む核酸配列と結合することがで
    きるＤＮＡ結合ドメインに融合された、第二の相互作用性タンパク質を含む第二
    の融合タンパク質を与え、 （ｃ）該宿主細胞を、第一の相互作用性タンパク質と第二の相互作用性タンパク
    質とを密接に接近させる条件に付し、そして該宿主細胞内に存在し、該核酸配列
    に隣接して位置する検出可能な遺伝子が、第一および第二の相互作用性タンパク
    質間の相互作用の不在下で発現された場合より大きい程度に発現されたか否かを
    決定する ことを含む方法。
17. 【請求項１７】 配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＡＧ
    ＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ（Ｎは
    、スペーサー配列である）のうち一つを含む単離された核酸配列。
18. 【請求項１８】 新規の標的遺伝子を特定するための、少なくとも配列ＣＡ
    ＣＣＴを含む核酸配列、好ましくは配列ＣＡＣＣＴ−Ｎ−ＣＡＣＣＴ、ＣＡＣＣ
    Ｔ−Ｎ−ＡＧＧＴＧ、ＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＣＡＣＣＴまたはＡＧＧＴＧ−Ｎ−ＡＧ
    ＧＴＧ（Ｎは、スペーサー配列である）のうち一つを含む核酸配列の使用。