KR20210131910A - Runx3 단백질 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제 병행 투여를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 - Google Patents

Runx3 단백질 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제 병행 투여를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20210131910A
KR20210131910A KR1020210052775A KR20210052775A KR20210131910A KR 20210131910 A KR20210131910 A KR 20210131910A KR 1020210052775 A KR1020210052775 A KR 1020210052775A KR 20210052775 A KR20210052775 A KR 20210052775A KR 20210131910 A KR20210131910 A KR 20210131910A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
runx3
pharmaceutical composition
cancer
cdk4
preventing
Prior art date
Application number
KR1020210052775A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102618932B1 (ko
Inventor
배석철
이정원
이유섭
Original Assignee
런엑스 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 런엑스 주식회사 filed Critical 런엑스 주식회사
Publication of KR20210131910A publication Critical patent/KR20210131910A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102618932B1 publication Critical patent/KR102618932B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

본 발명은 Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포; 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, CDK4 억제제(PD0332991)의 경우 정상세포에 대한 독성이 없다고 알려진 11nM의 농도에서 Runx3와 BRD2의 결합이 8시간까지 유지되는 것을 확인하고, mTOR 억제제(라파마이신)도 정상세포에서 세포독성이 없다고 알려진 100nM의 농도에서 Runx3와 BRD2의 결합이 8시간까지 유지되는 것을 확인하여, Runx3가 결핍된 암세포에 Runx3를 단독으로 도입하였을 때보다 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제를 Runx3 단백질과 동시에 투여하였을 때, 암 세포 사멸 효과가 현저하게 증가하는 것을 확인하였으므로, CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제는 Runx3과 병용으로 투여하여 각종 암의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

Runx3 단백질 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제 병행 투여를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING RUNX3 PROTEIN AND CDK4 INHIBITOR OR mTOR INHIBITOR COTREATMENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF CANCER}
본 발명은 Runx3 단백질 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
표적 암치료법 개발 연구는 암 유전자의 기능을 억제시키거나 또는 암 억제 유전자의 기능을 활성화시켜 암 세포를 제어하는 전략을 중심으로 진행되고 있다. 암 유전자 중 K-Ras의 돌연변이에 의한 K-Ras 기능의 비정상적인 활성화는 인체 암 발병의 주요 원인 중 하나로 알려져 있다. 폐암의 경우에도 K-Ras 돌연변이가 관찰되며 특히 폐선암의 경우 약 35%에서 K-Ras 돌연변이가 발생 되는 것으로 알려져 있다. 이에, K-Ras 기능의 활성화에 의해 발병되는 암을 치료하기 위하여 K-Ras의 기능을 억제하여 암을 치료하는 방법에 대해 연구가 이루어져 왔다. 그러나 K-Ras의 기능을 직접적으로 억제하는 전략은 정상 세포에도 심각한 손상을 입히는 부작용을 초래하므로 성공적인 항암제로 개발되지 못하고 있다. 따라서 암 유전자의 기능을 억제하는 전략 대신 암 억제 유전자의 저해된 기능을 활성화시키는 전략이 각광받고 있다.
암 억제 유전자(Tumor suppressor gene)는 표적 세포 내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포 사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 지금까지 sPD-1, VHL, MMAC1, DCC, p53, NF1, WT1, Rb, BRCA1 및 BRCA2 등 의 암 억제 유전자가 밝혀졌으며, 그 중 p53 또는 Rb 유전자는 K-Ras 돌연변이 암에서 그 기능이 빈번히 억제되어 있음이 보고되면서, 이러한 억제 유전자의 복구를 통하여 K-Ras 돌연변이 암의 치료가 가능한지 여부가 항암제 개발 연구 분야에 있어 큰 관심의 대상이 되었다. 이에 대표적인 암 억제유전자인 p53 유전자의 기능 복구를 통하여 K-Ras 돌연변이 폐선암(lung adenocarcinoma)을 치료하고자 하는 시도가 있었으나, 초기 폐선암(lung adenoma)이 치료되지 않아 성공하지 못하였다(Feldser, D. M. et al., Nature, 468: 572-575, 2010, Junttila, M. R. et al., Nature, 468: 567-571, 2010). 또한, Rb 유전자 기능 복구를 통해서도 K-Ras 돌연변이 폐암을 치료하지 못함이 밝혀졌다(Walter, D.M. et al. Nature 2019). 상기와 같은 결과는 초기 암이 빠르게 악성 암으로 발전하기 때문에 단순히 암 억제 유전자의 기능을 복구한다고 해도 이미 발병한 암의 치료 효과는 나타나지 않는다는 것을 의미하며(Berns A., Nature, 468:519-520, 2010), 아직까지 암 억제 유전자의 활성화를 통하여 K-Ras 돌연변이 폐암의 치료에 성공한 예는 보고된 바 없다.
K-Ras 돌연변이 암에서 Runx3 유전자의 암 억제 유전자로서 기능이 저해되어 있음과(RUNX3 Protects against Oncogenic KRAS. (2013). Cancer Discovery, 4(1), 14-14), 특히 K-Ras 돌연변이에 의해 유발되는 폐선암에서 Runx3 유전자의 활성이 저해되어 있음이 보고된 바 있다(Lee, K.S., Lee, Y.S., Lee, J.M., Ito, K., Cinghu, S., Kim, J.H., Bae, S.C. Oncogene, 29(23): 3349-61, 2010).
DNA에 결합하는 전사 인자인 RUNX3는 lineage determination에서 중추적인 역할을 한다(Ito, Y., Bae, S. C. & Chuang, L. S. The RUNX family: developmental regulators in cancer. Nat. Rev. Cancer 15, 81-95 (2015).). 생쥐의 폐에서 RUNX3의 결실은 폐 선종의 발생을 초래하고, K-Ras에 의해서 유도되는 선암(ADCs)으로의 진행을 가속화한다. 생쥐의 배아 섬유아세포에서, RUNX3의 결실은 R-point을 교란시켜 형질전환을 일으킨다(Chi, X. Z. et al. Runx3 plays a critical role in restriction-point and defense against cellular transformation. Oncogene 36, 6884-6894 (2017).).
이에, 본 발명자들은 CDK4 억제제 및 mTOR 억제제는 Runx3와 BRD2 복합체가 유지되는 시간을 증가시켜 Runx3가 결핍된 암세포에 Runx3를 단독으로 도입하였을 때보다 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제를 Runx3 단백질과 동시에 투여하였을 때, 암 세포 사멸 효과가 현저하게 증가하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포; 및 CDK4 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포; 및 mTOR 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포; 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, CDK4 억제제(PD0332991)의 경우 정상세포에 대한 독성이 없다고 알려진 11nM의 농도에서 Runx3와 BRD2의 결합이 8시간까지 유지되는 것을 확인하고, mTOR 억제제(라파마이신)도 정상세포에서 세포독성이 없다고 알려진 100nM의 농도에서 Runx3와 BRD2의 결합이 8시간까지 유지되는 것을 확인하여, Runx3가 결핍된 암세포에 Runx3를 단독으로 도입하였을 때보다 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제를 Runx3 단백질과 동시에 투여하였을 때, 암 세포 사멸 효과가 현저하게 증가하는 것을 확인하였으므로, CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제는 Runx3과 병용으로 투여하여 각종 암의 예방 또는 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a는 BRD2 구조 및 상호 작용 단백질의 개략도를 나타낸 것으로, BD1은 Lys-94 및 Lys-171에서 아세틸화 된 RUNX3과 상호 작용하고 BD2는 아세틸화 된 히스톤 H4K4-ac, H4K12-ac 및 H3K14-ac와 상호 작용하며, C-말단 영역은 TFIID 및 SWI/SNF 복합체와 상호 작용하는 것을 확인한 도이다.
도 1b 및 도 1c는 HEK293 세포를 24시간 동안 혈청 고갈시킨 후 10% 혈청으로 자극하여 유사분열 자극(mitogenic stimulation)을 유도하고, Runx3와 복합체를 형성하는 단백질의 수준을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 도이다.
도 1d는 HEK293 세포를 대조군 siRNA(si-con) 또는 BRD2-특이적 siRNA(si-BRD2)로 처리하여 BRD2를 녹다운 시킨 경우, 유사분열 자극(mitogenic stimulation)을 유도하여 단백질 간의 시간 의존적 상호 작용을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 도이다.
도 2a는 HEK293 세포를 24시간 동안 혈청 고갈시키고, 10 % 혈청으로 자극하여, BRD2-RUNX3, E2F1-RUNX3, CDK4-RUNX3, Cyclin D1-RUNX3, HDAC4-RUNX3, p16INK4a-CDK4, p21-CDK4, Cyclin D1-CDK4 및 HDAC4-CDK4 복합체의 시간 의존적 형성을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)으로 측정하고, pRB(Ser-795에서) 및 ERK1/2의 시간-의존적 인산화를 면역 블롯팅(IB)으로 측정하여, E2F1이 RUNX3와 결합한 것을 확인한 도이다.
도 2b는 혈청 자극 후 2시간에 근접 결찰 분석(PLA)을 통해서 RUNX3와 CDK4사이의 물리적 결합을 확인한 도이다.
도 2c는 HEK293 세포를 대조군 또는 CDK4-특이적 siRNA(si-con 또는 si-CDK4)로 처리하고, 24시간 동안 혈청이 고갈된 후, 혈청으로 자극한 BRD2-RUNX3, CDK4-RUNX3, HDAC4-RUNX3 및 Cyclin D1-RUNX3 복합체 및 인산화된 RUNX3의 시간 의존적 형성은 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정되었다. ARF의 시간 의존적 발현은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, CDK4의 녹다운을 RUNX3와 Cyclin D1, HDAC4와의 결합을 현저하게 감소시킴을 확인한 도이다.
도 3a는 ERK1/2의 인산화뿐만 아니라 BRD2-RUNX3 및 p300-RUNX3의 시간 의존적 상호 작용을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, MEK1 억제제의 처리는 BRD2-RUNX3 와 p300-RUNX3 결합을 제거함을 확인한 도이다.
도 3b는 Ser-356에서 BRD2-RUNX3 및 CDK4-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성 및 RUNX3의 인산화 및 Ser-795에서 pRB를 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, Cyclin D1의 녹다운은 효과적으로 pRB의 인산화(S795)를 감소시켰지만, RUNX3의 인산화(S356)에는 영향을 주지 않음을 확인한 도이다.
도 3c는 JNK-CDK4 복합체의 시간-의존적 형성 및 Ser-356에서 RUNX3의 인산화 및 Thr-172에서 CDK4의 인산화를 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, JNK가 혈청 자극 후 2시간에서 CDK4의 T172에 인산화를 시킨다는 것을 확인한 도이다.
도 3d는 Ser-356에서 BRD2-RUNX3 및 RUNX3-CDK4 복합체의 시간 의존적 형성 및 RUNX3의 인산화를 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, ARF의 시간 의존적 발현은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, JNK 활성의 약리학적 억제는 RUNX3 ser-356의 인산화를 두드러지게 감소시켰고 Rpa-RX3-AC를 8시간까지 유지시킴을 확인한 도이다.
도 3e는 Ser-356에서 BRD2-RUNX3 및 CDK4-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성 및 RUNX3의 인산화를 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, ARF의 시간 의존적 발현은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, siRNA에 의한 JNK의 녹다운 또한 RUNX3 Ser356의 인산화를 감소시켰고 Rpa-RX3-AC를 유지시킴을 확인한 도이다.
도 3f는 Ser-356에서 BRD2-RUNX3 및 CDK4-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성 및 RUNX3의 인산화는 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, pRB의 시간-의존적 인산화 및 ARF의 발현을 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, 과발현 시킨 CDK4-WT은 혈청 자극 후 2-4시간에 Myc-RUNX3를 인산화 시켰으나, Flag-CDK4-T172A(JNK에 의해 인산화가 일어나지 않게 만든 돌연변이체)는 RUNX3 Ser356에 인산화를 시키는 못한 것을 확인한 도이다.
도 3g는 BRD2-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성을 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, ARF의 시간 의존적 발현은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, PI3K catalytic subunit(PIK3CA, encoding p110α)의 녹다운은 Cyclin D1의 수준을 감소시켰으며 Rpa-RX3-AC를 유지시켰고 ARF의 발현을 8시간까지 연장시킴을 확인한 도이다.
도 3h는 BRD2-RUNX3 복합체의 시간 의존적 형성은 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)에 의해, ARF의 시간 의존적 발현은 면역 블롯팅(IB)에 의해 측정한 것으로, mTOR 신호 전달에 의해 인산화된 리보솜 단백질 S6 키나제 베타-1(S6K1)을 제어에 사용됨을 확인한 도이다.
도 4은 R-point transition을 조절하는데 있어서 RAS 경로의 역할을 나타낸 개략도로, RAS-RAF-MEK 경로는 Rpa-RX3-AC의 형성을 촉진하고 PRC1-Cyclin D1-HDAC4 복합체의 형성을 억제하며, RAS-RAC-JNK 경로는 Rpa-RX3-AC 내에서 CDK4를 활성화하고, RAS-PI3K 경로는 Cyclin D1의 번역에 기여함으로써 Rpa-RX3-TR의 형성을 촉진함을 나타낸 도이다.
도 5는 CDK4 억제제(PD0332991)의 경우 정상세포에 대한 독성이 없다고 알려진 11nM의 농도에서 Runx3와 BRD2의 결합이 8시간까지 유지되는 것을 확인한 도이다.
도 6은 mTOR 억제제(라파마이신)의 경우 정상세포에서 세포독성이 없다고 알려진 100nM의 농도에서 Runx3와 BRD2의 결합이 8시간까지 유지되는 것을 확인한 도이다.
도 7은 CDK4 억제제(PD0332991)의 경우 정상세포에 대한 독성이 없다고 알려진 11nM의 농도에서 Runx3가 결핍된 암세포에 Runx3를 도입하였을 때와 CDK4 억제제를 동시에 도입하였을 때의 암 세포사멸 효과 및 mTOR 억제제(라파마이신)도 정상세포에서 세포독성이 없다고 알려진 100nM의 농도에서 Runx3가 결핍된 암세포에 Runx3를 도입하였을 때와 CDK4 억제제를 동시에 도입하였을 때의 암 세포사멸 효과를 확인한 도이다.
도 8은 H460 폐암 세포주, MKN28 위암 세포주 및 PANC1 췌장암 세포주에서 Runx3 단백질을 발현하는 아데노바이러스 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제를 동시에 투여하였을 때, Runx3 단백질을 발현하는 아데노바이러스를 단독으로 투여하였을 때보다 암 세포 사멸 효과가 현저히 증가하는 것을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포; 및 CDK4 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 CDK4 억제제는 아베마시클립(abemaciclib), 팔보시클립(Palbociclib) 및 리보시클립(ribociclib)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 CDK4 억제제는 하기 화학식 1로 표시된다.
[화학식 1]
Figure pat00001
또한, 본 발명은 Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포; 및 mTOR 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 mTOR 억제제는 라파마이신(rapamycin), 리다포롤리무스(Ridaforolimus), 에버롤리무스(Everolimus) 및 템시롤리무스(Temsirolimus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 mTOR 억제제는 하기 화학식 2로 표시된다.
[화학식 2]
Figure pat00002
상기 암은 고형암이다.
상기 고형암은 폐암, 췌장암, 간암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
Runx3(Runt-related transcription factor 3) 유전자는 Runx1, Runx2 및 Runx3로 구성된 Runt 패밀리 유전자 중 하나이다. Runt 패밀리 유전자들은 정상적인 발달 및 종양화 과정에서 중요한 역할을 담당하는데, TGF-β와 그 신호전달을 중재하는 하위인자인 Smad 패밀리의 전사 조절 인자로 기능한다. Runx1은 포유류의 조혈작용에, Runx2는 골 형성에 주요한 역할을 하며 Runx3은 주로 과립성 위 점막세포에서 발현되고, 위 상피의 세포분화를 저해하는 역할을 한다. 이들 세 유전자는 염색체 1p, 6p 와 21q의 유전자 좌위에 위치하고 있는데, 이중 Runx3 유전자는 1p36. 11-1p36. 13에 위치한다. Runx3 유전자 자리는 다양한 암에서 손실되거나 반접합체 결손 등의 영향을 받는 위치 중 하나이다. 또한, Runx3는 다양한 종류의 암에서 불활성화되어있는 것으로 밝혀져, 항암제 개발의 새로운 타겟으로 각광받고 있다. 이처럼 Runx3는 암의 형성을 억제하는 암 억제 유전자로 작용할 뿐 아니라, 암 전이를 억제한다고도 알려져 있다. Runx3는 세포의 분열과 사멸의 운명을 결정하는 Restriction-point에서 중요한 역할을 하여 상황에 따라 세포분열을 유도하기도 하고 세포사멸을 유도하기도 한다 (Lee et al., Nat Commun. 2019 ;10(1): RUNX3 regulates cell cycle-dependent chromatin dynamics by functioning as a pioneer factor of the restriction-point). 폐 상피 세포에서 K-Ras 암 유전자 돌연변이가 발생하였을 때 Runx3는 Restriction-point에서 세포사멸 운명을 결정하는데 기여함으로써 암세포를 사멸시킨다 (Lee et al., Nat Commun. 2019 ;10(1)).
Runx3 단백질은 상기 Runx3 유전자에 의해 발현되는 Runt 패밀리에 관련된 전사 인자 3(Runt-related transcription factor 3)을 의미한다.
그 중 BRD2(Bromodomain-containing protein 2)는 핵 안에 존재하는 신호전달 매개체 역할을 하는 인자로 포유류 세포에 광범위하게 발현하며, 세포 주기 조절, 전사 조절에 중요한 역할을 한다.
상기 BRD2는 아세틸화된 Runx3에 결합하여 Runx3-Brd2 복합체를 형성한다.
상기 BRD2의 브로모도메인 1(bromodomain 1, BD1)은 Runx3의 라이신(lysine) 잔기 94번과 171번에 결합을 한다.
상기 BRD2의 브로모도메인 2(bromodomain 2, BD2)는 Runx3의 아세틸화한 히스톤4의 라이신 잔기 5번, 히스톤4의 라이신 잔기 12번 및 히스톤3의 라이신 잔기 14번과 결합을 한다.
상기 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제는 Runx3-Brd2 복합체 지속 시간을 증가시킨다.
상기 Runx3-Brd2 복합체는 유사 분열 자극(mitogenic stimulation)을 받은 경우 형성되고, Restriction point(R-point) 결정에 기여한다.
Restriction point(R-point)는 세포가 생명을 지속하거나 사멸하도록 스스로 결정하는 절차로, 세포분열 과정의 한 단계이다. 정상 세포는 삶의 결정을 스스로 내려 분열하지만 암세포와 같은 비정상 세포는 이 R-point에서 스스로 사멸을 결정하여 인체 내에서 스스로 돌연변이 세포를 제거하고 정상 세포를 유지해 나간다.
상기 Runx3 단백질은 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
상기 Runx3 단백질은 인간 또는 동물 유래일 수 있다.
상기 Runx3 단백질은 당업계의 통상적인 화학적 합성 방법(W. H. Freeman and Co., Proteins; structures and molecular principles, 1983)으로 합성될 수 있으며, 통상적인 유전공학적 방법(Maniatis et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 등)에 의해 제조될 수 있다.
상기 Runx3 단백질은 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서, 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환 또는 이들의 조합에 의해서 상이한 서열을 가지는 아미노산의 변이체일 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수 있다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이의 변이체 또는 단편을 포함할 수 있다. 상기 실질적으로 동일한 단백질은 본 발명의 단백질과 80％ 이상, 구체적으로 90％ 이상, 더욱 구체적으로 95％ 이상으로 상동성을 가질 수 있다.
상기 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 인간 또는 동물 유래일 수 있다.
상기 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13 또는 서열번호 14의 염기서열로 구성될 수 있다.
상기 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA일 수 있다.
상기 벡터는 치료대상이 되는 개체에 본 발명의 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 도입시키기 위한 운반 매개체를 의미하며, 치료대상이 되는 개체에서 발현되기 적합한 프로모터, 인핸서, 상기 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 전사종결 부위 등을 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 특정 기관 및 조직 특이적 프로모터가 사용될 수 있으며 해당 기관 및 조직에서 증식할 수 있도록 복제기점을 포함할 수 있다.
상기 벡터에 의해 형질전환되는 바이러스는 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 헤스페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 및 렌티바이러스(Lentivirus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 경우 0.05 내지 500 mg을 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 내지 300 mg을 함유하는 것이 더욱 바람직하며, Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 103 내지 1012 IU(10 내지 1010 PFU)를 함유하는 것이 바람직하고, 105 내지 1010 IU을 함유하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 재조합 바이러스는 아데노 바이러스인 것이 바람직한데, 아데노부속바이러스(AAV)는 아데노바이러스에 비해 유전자 발현율 및 발현 속도가 낮아 암 치료를 위한 전달체로 부적합하다. 아데노바이러스는 아데노부속바이러스에 비해 전달된 유전자가 3주 이상 빨리 발현되어 발현 속도가 빠르고(HUMAN GENE THERAPY 15:405-413.), 면역 반응에 의한 유전자 전달 효율 저하 현상이 적으므로(World J Gastroenterol. 2016 Jan 7;22(1):326-37.), 본 발명에 따른 Runx3 단백질의 인체로의 전달에 적합하다.
치료를 위한 상기 바이러스의 수는 벡터 게놈을 포함한 바이러스 입자 내지는 감염 가능한 바이러스 수로 나타낼 수 있다. 즉, 바이러스 입자의 1% 내외가 실제로 감염 가능한 바이러스의 유효 개수이므로, 이를 나타내기 위하여 IU(infection unit) 또는 PFU(plaque forming unit)를 사용한다.
상기 벡터에 의해 형질전환되는 세포는 박테리아일 수 있다.
상기 박테리아는 비병원성 또는 비독성일 수 있고, 리스테리아(Listeria) 속, 쉬겔라(Shigella)속, 살모넬라속 또는 대장균(E.coli) 등 일 수 있으며, 상기 벡터를 상기 박테리아에 도입시킴으로써 상기 벡터 내에 포함되어 있는 유전자의 DNA를 대량으로 복제하거나 단백질을 대량 생산하게 할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988).
상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 의해 형질전환된 세포의 경우, 103 내지 108개를 함유하는 것이 바람직하고, 104 내지 107개를 함유하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 혈청 자극 후 1 내지 2시간 후에 Runx3-BRD2 복합체가 형성되고, BRD2 내의 BD1은 아세틸화한 Runx3의 라이신 잔기 94번과 171번에 결합하고, BD2는 아세틸화한 히스톤4의 라이신 잔기 5번(H4K5-ac), 히스톤4의 라이신 잔기 12번(H4K12-ac) 및 히스톤3의 라이신 잔기 14번(H3K14-ac)과 결합하며, CDK4 억제제(PD0332991)의 경우 정상세포에 대한 독성이 없다고 알려진 11nM의 농도에서 Runx3와 BRD2의 결합이 8시간까지 유지되는 것을 확인하고, mTOR 억제제(라파마이신)도 정상세포에서 세포독성이 없다고 알려진 100nM의 농도에서 Runx3와 BRD2의 결합이 8시간까지 유지되는 것을 확인하여, Runx3가 결핍된 암세포에 Runx3를 단독으로 도입하였을 때보다 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제를 Runx3 단백질과 동시에 투여하였을 때, 암 세포 사멸 효과가 현저하게 증가하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제는 Runx3 단백질과 병용투여 되어 암의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
1. 세포주 준비
HEK293 세포(ATCC, Manassas, VA, USA)를 10% 소 태아 혈청(Gibco BRL) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)이 보충된 DMEM 배지(Gibco BRL, Thermo Fisher Scientific, MA, USA, MA)에서 유지시켰다.
H460 세포(ATCC, Manassas, VA, USA) 및 H460 안정 세포주는 10% 소 태아 혈청(Gibco BRL) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco BRL)에서 유지되었다. 모든 세포주는 5% CO2와 함께 37℃에서 배양되었다.
2. 항체
RUNX3(5G4)(Cat # ab40278)를 표적으로 하는 항체는 Abcam(Cambridge, UK)에서 얻었고, 항체는 1:3000으로 희석되었다. BRD2(M01; 희석 1:1000; Cat # H00006046-M01, 대만 타이베이시, Abnova) 을 면역 블롯팅 및 면역 침전에 사용하였다.
3. DNA 형질감염, 면역 침전(IP) 및 면역 블롯팅(IB)
리포펙타민 플러스 시약 및 리포펙타민(Invitrogen)을 사용하여 모든 세포주에서 일시적인 형질 감염을 수행하였다. 세포 용해물을 적절한 단클론 또는 다클론 항체(2㎍ 항체/500㎍ 용해물 샘플)와 함께 4℃에서 3시간 동안 배양한 다음 단백질 G-Sepharose beads(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)와 함께 배양하였다. 4℃에서 1시간 내인성 단백질의 검출을 위해, 용해물을 적절한 단클론 또는 다클론 항체(희석 범위 1:1000 내지 1:3000)와 4℃에서 6 내지 12시간 동안 배양한 다음 단백질 G-Sepharose beads(Amersham Pharmacia Biotech)를 4℃에서 3 시간 동안 가열하였다. 면역 침전물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔에서 분해하고 PVDF 막(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 옮겼다. 막을 차단한 후 적절한 항체로 면역 블롯팅하고, ECL 용액(Amersham Pharmacia Biotech)으로 처리한 후 Amersham ™ Imager 600 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA)에서 시각화 하였다.
4. 억제제 및 siRNA
CDK4 억제제(PD0332991), JNK 억제제(JNK-IN-8), MEK1 억제제(U0126), p38 MAPK 억제제(SB203580) 및 라파마이신(R8781)은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. 세포를 CDK4 억제제(500nM), JNK 억제제(1μM), MEK1 억제제(1μM), p38 MAPK 억제제(1μM) 또는 라파마이신(100nM)으로 처리하고, 혈청 자극 후 지정된 시점에 수확하였다. 혈청 고갈(serum starvation) 전에 RNAiMAX(Invitrogen, CA, USA)를 사용하여 50 nM siRNA로 HEK293 세포를 형질 감염시켜 녹다운 분석을 수행하였다. 혈청 자극 후 지시된 시점에 세포를 수확하였다. BRD2, p53, CDK4, RNF2 및 Cyclin D1 siRNA는 Bioneer(대전, 한국)에서 구입하였다. HDAC4 siRNA는 Cell Signaling Technology에서 구입했다. siRNA의 서열은 하기 표 1과 같다.
명칭 서열(5'->3') 서열번호
si-BRD2 센스 CACUUGGCCUGCAUGACUA 서열번호 1
si-BRD2 안티센스 UAGUCAUGCAGGCCAAGUG 서열번호 2
si-p53 센스 CAGUUUGAGGUGCGUGUU 서열번호 3
si-p53 안티센스 AACACGCACCUCAAAGCUG 서열번호 4
si-CDK4 센스 CCAGAAUCUACAGCUACCA 서열번호 5
si-CDK4 안티센스 UGGUAGCUGUAGAUUCCUGG 서열번호 6
si-Cyclin D1 센스 GACCUUCGUUGCCCUCUGU 서열번호 7
si-Cyclin D1 안티센스 ACAGAGGGCAACGAAGGUC 서열번호 8
si-RNF2 센스 UGAUAGGGUAUUGAGUGUA 서열번호 9
si-RNF2 안티센스 UACACUCAAUACCCUAUCA 서열번호 10
5. 유세포 분석
세포는 FITC-Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 및 프로피디움 요오다이드 DNA 염색 프로토콜을 사용하여 수확되고 처리되었다. 세포 자멸사 및 세포주기는 BD FACS 캘리버 머신(BD Biosciences)상에서 유세포 분석에 의해 분석되었다. FlowJo 소프트웨어(https://www.flowjo.com)를 사용하여 모든 데이터를 결정했다.
< 실험예 1> Runx3 - BRD2 뉴클레오좀 복합체가 불러들이는 SWI / SNF와 TFIID 확인
Restriction point의 결정은 혈청 자극 후 3 내지 4시간 후에 이루어진다. 일전에 혈청 자극 후 1 내지 2시간 후에 Runx3-BRD2 복합체가 형성되고, 이 복합체는 수백 개의 유전자를 조절함으로써 R-point 결정에 기여한다는 것이 개시된 바 있다(Chi, X. Z. et al. Runx3 plays a critical role in restriction-point and defense against cellular transformation. Oncogene 36, 6884-6894 (2017).). BRD2는 2개의 bromodomain(BD1과 BD2)을 포함하고 있으며, 이들 각각은 고유한 단백질과 상호 작용을 한다. Runx3 단백질과 다른 단백질의 상호 작용을 유사 분열 자극(mitogenic stimulation) 후 하기와 같이 확인하였다.
도 1a에 나타난 바와 같이, BD1은 아세틸화한 Runx3의 라이신 잔기 94번과 171번에 결합을 하며, BD2는 아세틸화한 히스톤4의 라이신 잔기 5번(H4K5-ac), 히스톤4의 라이신 잔기 12번(H4K12-ac) 그리고 히스톤3의 라이신 잔기 14번(H3K14-ac)과 결합하며, BRD2는 C-말단 부분을 통해서 SWI/SNF 및 TFIID와 결합한다. 또한, RUNX3는 BRD2를 통해서 이러한 복합체들과 결합한다.
특히, 도 1b에 나타난 바와 같이, 유사 분열 자극(mitogenic stimulation) 후 1 내지 2시간 후에 BRD2, RUNX3 그리고 아세틸화 한 히스톤4의 라이신 12번 사이뿐만 아니라 p300, Runx3 그리고 아세틸화 한 히스톤4의 라이신 12번 사이의 상호 작용도 관찰했다. RUNX3와 아세틸화 한 히스톤4의 라이신 잔기 12번 사이의 상호 작용은 BRD2의 녹다운으로 현저히 감소했다.
상기 결과는 R-point 이전에 RUNX3가 p300을 표적 좌위로 가이드하고, 그것은 히스톤들을 아세틸화 시키며, BRD2는 2개의 bromodomain을 통해서 아세틸화 한 RUNX3와 히스톤들 둘 다에 결합한다는 것을 시사한다.
또한, 도 1c에 나타난 바와 같이, 세포 분열 자극 1시간 후에 TAF1(활성화된 TAF1), TAF7(TAF 억제) 그리고 TBP가 BRD2와 RUNX3와 복합체를 형성한다는 것을 발견했다. 그 후에, TAF7은 복합체로부터 분리되고, TFIID는 RUNX3-BRD2 결합 후에 활성화된다. 또한, 세포 분열 자극 후 4시간 후에 TAF1 및 TBP는 RUNX3로부터 분리된다. 이와 유사하게, BRG-1과 BAF155(SWI/SNF 복합체의 구성 요소)도 또한 세포 분열 자극 후 1 내지 2시간 후에 RUNX3와 BRD2에 결합하고, 4시간 후에 분리되었다. RUNX3-BRD2 복합체와 SWI/SNF 및 TFIID 복합체와의 결합은 근접 결찰 분석(PLA)을 통해서 확인되었다.
상기 결과들은 일관되게, R-point에 관련되어 있는 단백질들[p14ARF(이하 ARF), p53과 p21]의 발현은 RUNX3가 BRD2, SWI/SNF 그리고 TFIID와 결합할 때와 같은 시간대에 유도되었음을 제시한다.
도 1d에 나타난 바와 같이, BRD2의 녹다운 실험은 SWI/SNF 및 TFIID 복합체는 BRD2를 통해서 RUNX3와 결합한다는 것을 보여주었다. 상기 결과는 RUNX3-BRD2 복합체의 일시적인 형성이 R-point에 특이적임을 제시한다.
< 실험예 2> CDK4와 cyclin D1의 결합에 의한 Rpa -RX3-TR의 형성 확인
혈청 자극 후 1 내지 2시간에서 E2F1이 RUNX3와 결합하였다(도 2a). pRB의 795번 세린(Serine)이 Cyclin D1-CDK4/6에 의해서 인산화되면 pRB-E2F1 복합체가 RUNX3로부터 방출되었다(도 2a). 이러한 결과들은 CDK4가 pRB를 인산화시키기 위해서 Rpa-RX3-AC에 접근한다는 것을 시사한다. 면역 침전/면역 블롯팅 분석은 CDK4가 RUNX3에 2시간 이후에 결합하고, 그 결합이 그 후에 약해지는 것을 보여주었다(도 2a). RUNX3와 CDK4사이의 이러한 물리적 결합은 혈청자극 후 2시간에 보이는 것을 근접 결찰 분석(PLA) 실험을 통해서 확인되었다(도 2b). 이러한 결과들은 CDK4가 Rpa-RX3-AC의 구성 요소임을 입증한다.
비록 혈청 자극 후 2시간에 pRB와 CDK4는 Rpa-RX3-AC에 결합하지만, CDK4에 의해서 일어나는 pRB의 인산화는 자극 후 4시간에서 발생한다(도 2a). CDK4와 그것의 결합 단백질들 사이의 결합 시간 분석은 CDK4가 자극 후 1시간에 p16과 결합한 후, 2시간에서 p16에서 p21로 바뀌는 것을 보여주었다(도 2a). p21은 Cyclin D1과 CDK4의 결합을 촉진한다. 그러나 2시간부터 발현을 하는 Cyclin D1은 RNF2와 결합을 하지만, 같은 시간대에 p21과 결합하고 있는 CDK4는 없었다(도 2a). 이 cyclin D1-CDK4 결합은 Rpa-RX3-TR이 형성된 이후 (4시간에서) 관찰되었다(도 2a). 특히, CDK4의 녹다운은 RUNX3와 Cyclin D1, HDAC4와의 결합을 현저하게 감소시켰다(도 2c). 따라서, RUNX3-BRD2의 결합과 ARF의 발현은 8시간까지 유지되었다 (도 2c). 이러한 결과들은 Rpa-RX3-AC의 CDK4와 PRC1-Cyclin D1-HDAC4의 Cyclin D1은 Rpa-RX3-TR을 형성할 수 있는 두 복합체의 결합을 위한 도킹 사이트를 제공한다는 것을 시사한다.
< 실험예 3> R-point transition에 기여하는 다양한 경로의 확인
MEK1 억제제의 처리는 BRD2-RUNX3 와 p300-RUNX3 결합을 억제시킨다(도 3a). 상기 결과는 RAS-MEK 신호 경로가 Rpa-RX3-AC의 형성을 자극한다는 것을 보여준다.
Cyclin D1-CDK4의 결합은 혈청 자극 후 4시간에서 발생했고, Cyclin D1-CDK4에 의존적인 pRB의 인산화 또한 같은 시간대에서 발생하였다(도 2a). Cyclin D1의 녹다운은 효과적으로 pRB의 인산화(S795)를 감소시켰지만, RUNX3의 인산화(S356)에는 영향을 주지 않았다(도 3b). 이러한 결과들은 CDK4가 RUNX3의 인산화를 촉진하기 위해서 Cyclin D1에 무관한 방법으로 활성화 되어진다는 것을 제안한다.
CDK4의 활성화는 CDK-활성화 키나아제(CAK)의 활성화에 의존한다. JNK는 CDK4의 T172을 인산화시키는 CAK들 중 하나로 알려져 있다. 우리는 JNK가 혈청 자극 후 2시간에서 CDK4의 T172에 인산화를 시킨다는 것을 발견하였다(도 3c). JNK 활성의 약리학적 억제는 RUNX3의 356번째 세린(serine)의 인산화를 두드러지게 감소시켰고 Rpa-RX3-AC를 8시간까지 유지시켰다(도 3d). 이와 비슷하게, siRNA에 의한 JNK의 녹다운 또한 RUNX3의 356번째 세린의 인산화를 감소시켰고 Rpa-RX3-AC를 유지시켰다(도 3e). 과발현시킨 CDK4-WT은 혈청 자극 후 2 내지 4시간 후에 Myc-RUNX3를 인산화시켰다. 그러나 Flag-CDK4-T172A(JNK에 의해 인산화가 일어나지 않게 만든 돌연변이체)는 RUNX3의 356번째 세린에 인사화를 시키는 것에 실패했다(도 3f). Flag-CDK4-T172A는 혈청 자극 후 심지어 더 일찍 RUNX3와 결합을 하였고, 오랫동안 분리되지 않았다(도 3f). 이와 일관되게, Flag-CDK4-T172A는 Rpa-RX3-AC를 계속 유지하였고 ARF의 발현도 8시간까지 연장시켰다(도 3f). 이러한 결과들은 JNK 경로 또한 CDK4의 활성화를 통해서 R-point 전환에 기여한다는 것을 시사한다.
Rpa-RX3-TR의 형성에 중요한 역할을 하는 Cyclin D1의 전사와 번역은 각각의 RAS-RAF와 RAS-PI3K 경로들을 통해서 자극되어 진다고 알려져 있다. 예상대로, PI3K catalytic subunit(PIK3CA, encoding p110α)의 녹다운은 Cyclin D1의 수준을 감소시켰으며 Rpa-RX3-AC를 유지시켰고 ARF의 발현을 8시간까지 연장시켰다(도 3g). 라파마이신(Rapamycin)을 이용한 RAS-PI3K-AKT 경로의 하류 이펙터인 mTOR의 억제 또한 Rpa-RX3-AC를 유지시켰고 ARF의 발현을 8시간까지 연장시켰다(도 3h). 이러한 결과들은 PI3K 경로 또한 Cyclin D1을 유도하는 것에 의해서 Rpa-RX3-AC에서 Rpa-RX3-TR로의 전환에 기여한다는 것을 시사한다.
상기 결과는 RAS(MEK, JNK, and PI3K)의 하류에서 세 개의 주요한 경로들이 분명한 단계에서 R-point 전환에 기여한다는 것을 시사한다. 이들 경로의 R-point에 대한 각각의 단계에서 기여는 도 4에 요약되어 있다.
<실험예 4> 세포 내에서 CDK4 억제제 및 mTOR 억제제 화합물 처리에 의한 Runx3-Brd2 복합체의 안정성을 향상시키는 효과의 확인
상기 실험예 2 및 실험예 3에서 Rpa-Rx3-AC 복합체에서 Rpa-Rx3-TR 복합체를 형성 후 Rpa-Rx3-RE 복합체로 전환되는 과정은 CDK4에 의한 Runx3의 인산화, 인산화된 Runx3와 cyclinD1의 결합, cyclinD1을 활성화시키는 PI3K-AKT-mTOR 경로, RAS의 또다른 경로인 RAC-JNK 경로가 주요 작용점이고, 따라서 CDK4 억제제, mTOR 억제제를 처리하거나 siRNA를 사용해 주요 작용경로의 단백질 합성을 억제하면 Rpa-Rx3-AC 복합체를 지속시킬 수 있음을 확인하였다.
따라서, CDK4 억제제(PD0332991)를 처리하면 Runx3와 BRD2의 물리적 결합이 지속되는 효과가 상승될 것이라고 예측하고 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, 혈청 자극 후 1 내지 8시간 후에 Runx3와 Brd2의 물리적 결합이 1nM이상의 CDK4 억제제를 처리한 실험에서 확인되었고, CDK4 억제제를 처리하지 않거나 0.1nM을 처리한 실험에서는 혈청 자극 후 8시간 후에 Runx3와 Brd2의 물리적 결합이 나타나지 않았다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, CDK4 억제제(PD0332991)의 경우 정상세포에 대한 독성이 없다고 알려진 11nM의 농도에서 Runx3와 BRD2의 결합이 8시간까지 유지되는 것을 확인하였다.
또한, 도 6에 나타난 바와 같이, mTOR 억제제(라파마이신)도 정상세포에서 세포독성이 없다고 알려진 100nM의 농도에서 Runx3와 BRD2의 결합이 8시간까지 유지되는 것을 확인하였다.
<실험예 5> Runx3 단백질 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제 화합물의 병행 처리에 의한 암 세포 사멸 효과의 확인
상기 실험예 4를 통하여 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제 화합물이 Runx3와 Brd2 복합체 형성 지속 시간을 증가시키는 것을 확인하였다. 이에, Runx3 단백질과 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제 화합물을 병행 처리하였을 때, Runx3 단백질을 단독 처리한 것 보다 뛰어난 암 세포 사멸 효과를 나타냄을 하기와 같이 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험 방법 1. 및 4.에서 준비한 각 세포주는 FITC-Annexin V Apoptosis Detection Kit I(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 및 프로피디움 요오다이드 DNA 염색 프로토콜을 사용하여 수확되고 처리되었다. 세포 자멸사 및 세포주기는 BD FACS 캘리버 머신(BD Biosciences) 상에서 유세포 분석에 의해 분석되었다. FlowJo 소프트웨어(https://www.flowjo.com)를 사용하여 모든 데이터를 결정했다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, CDK4 억제제(PD0332991)의 경우 정상세포에 대한 독성이 없다고 알려진 11nM의 농도에서 Runx3가 결핍된 암세포에 Runx3를 도입하였을 때와 CDK4 억제제를 동시에 도입하였을 때의 암 세포사멸 효과를 확인하였다. 또한, mTOR 억제제(라파마이신)도 정상세포에서 세포독성이 없다고 알려진 100nM의 농도에서 Runx3가 결핍된 암세포에 Runx3를 도입하였을 때와 CDK4 억제제를 동시에 도입하였을 때의 암 세포사멸 효과를 확인하였다.
또한, 도 8에 나타난 바와 같이, H460 폐암 세포주, MKN28 위암 세포주 및 PANC1 췌장암 세포주에서 Runx3 단백질을 발현하는 아데노바이러스 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제를 동시에 투여하였을 때, Runx3 단백질을 발현하는 아데노바이러스를 단독으로 투여하였을 때보다 암 세포 사멸 효과가 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제는 Runx3과 병용으로 투여하여 암 치료 용도로 사용될 수 있음을 제시한다.
<110> Run-x Corporation <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING RUNX3 PROTEIN AND CDK4 INHIBITOR OR mTOR INHIBITOR COTREATMENT FOR PREVENTION OR TREATMENT OF CANCER <130> 2021P-03-042 <150> KR10-2020-0049341 <151> 2019-04-23 <150> KR 10-2020-0184526 <151> 2020-12-28 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-BRD2 sense <400> 1 cacuuggccu gcaugacua 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-BRD2 anti-sense <400> 2 uagucaugca ggccaagug 19 <210> 3 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-p53 sense <400> 3 caguuugagg ugcguguu 18 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-p53 anti-sense <400> 4 aacacgcacc ucaaagcug 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-CDK4 sense <400> 5 ccagaaucua cagcuacca 19 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-CDK4 anti-sense <400> 6 ugguagcugu agauuccugg 20 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-Cyclin D1 sense <400> 7 gaccuucguu gcccucugu 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-Cyclin D1 anti-sense <400> 8 acagagggca acgaagguc 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-RNF2 sense <400> 9 ugauagggua uugagugua 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> si-RNF2 anti-sense <400> 10 uacacucaau acccuauca 19 <210> 11 <211> 429 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx3 isoform1 amino acid <400> 11 Met Ala Ser Asn Ser Ile Phe Asp Ser Phe Pro Thr Tyr Ser Pro Thr 1 5 10 15 Phe Ile Arg Asp Pro Ser Thr Ser Arg Arg Phe Thr Pro Pro Ser Pro 20 25 30 Ala Phe Pro Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Met Gly Glu Asn Ser Gly 35 40 45 Ala Leu Ser Ala Gln Ala Ala Val Gly Pro Gly Gly Arg Ala Arg Pro 50 55 60 Glu Val Arg Ser Met Val Asp Val Leu Ala Asp His Ala Gly Glu Leu 65 70 75 80 Val Arg Thr Asp Ser Pro Asn Phe Leu Cys Ser Val Leu Pro Ser His 85 90 95 Trp Arg Cys Asn Lys Thr Leu Pro Val Ala Phe Lys Val Val Ala Leu 100 105 110 Gly Asp Val Pro Asp Gly Thr Val Val Thr Val Met Ala Gly Asn Asp 115 120 125 Glu Asn Tyr Ser Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Ala Val Met Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ala Arg Phe Asn Asp Leu Arg Phe Val Gly Arg Ser Gly Arg 145 150 155 160 Gly Lys Ser Phe Thr Leu Thr Ile Thr Val Phe Thr Asn Pro Thr Gln 165 170 175 Val Ala Thr Tyr His Arg Ala Ile Lys Val Thr Val Asp Gly Pro Arg 180 185 190 Glu Pro Arg Arg His Arg Gln Lys Leu Glu Asp Gln Thr Lys Pro Phe 195 200 205 Pro Asp Arg Phe Gly Asp Leu Glu Arg Leu Arg Met Arg Val Thr Pro 210 215 220 Ser Thr Pro Ser Pro Arg Gly Ser Leu Ser Thr Thr Ser His Phe Ser 225 230 235 240 Ser Gln Pro Gln Thr Pro Ile Gln Gly Thr Ser Glu Leu Asn Pro Phe 245 250 255 Ser Asp Pro Arg Gln Phe Asp Arg Ser Phe Pro Thr Leu Pro Thr Leu 260 265 270 Thr Glu Ser Arg Phe Pro Asp Pro Arg Met His Tyr Pro Gly Ala Met 275 280 285 Ser Ala Ala Phe Pro Tyr Ser Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser Ile Ser 290 295 300 Ser Leu Ser Val Ala Gly Met Pro Ala Thr Ser Arg Phe His His Thr 305 310 315 320 Tyr Leu Pro Pro Pro Tyr Pro Gly Ala Pro Gln Asn Gln Ser Gly Pro 325 330 335 Phe Gln Ala Asn Pro Ser Pro Tyr His Leu Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser 340 345 350 Gly Ser Tyr Gln Phe Ser Met Val Ala Gly Ser Ser Ser Gly Gly Asp 355 360 365 Arg Ser Pro Thr Arg Met Leu Ala Ser Cys Thr Ser Ser Ala Ala Ser 370 375 380 Val Ala Ala Gly Asn Leu Met Asn Pro Ser Leu Gly Gly Gln Ser Asp 385 390 395 400 Gly Val Glu Ala Asp Gly Ser His Ser Asn Ser Pro Thr Ala Leu Ser 405 410 415 Thr Pro Gly Arg Met Asp Glu Ala Val Trp Arg Pro Tyr 420 425 <210> 12 <211> 415 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx3 isoform2 amino acid <400> 12 Met Arg Ile Pro Val Asp Pro Ser Thr Ser Arg Arg Phe Thr Pro Pro 1 5 10 15 Ser Pro Ala Phe Pro Cys Gly Gly Gly Gly Gly Lys Met Gly Glu Asn 20 25 30 Ser Gly Ala Leu Ser Ala Gln Ala Ala Val Gly Pro Gly Gly Arg Ala 35 40 45 Arg Pro Glu Val Arg Ser Met Val Asp Val Leu Ala Asp His Ala Gly 50 55 60 Glu Leu Val Arg Thr Asp Ser Pro Asn Phe Leu Cys Ser Val Leu Pro 65 70 75 80 Ser His Trp Arg Cys Asn Lys Thr Leu Pro Val Ala Phe Lys Val Val 85 90 95 Ala Leu Gly Asp Val Pro Asp Gly Thr Val Val Thr Val Met Ala Gly 100 105 110 Asn Asp Glu Asn Tyr Ser Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Ala Val Met 115 120 125 Lys Asn Gln Val Ala Arg Phe Asn Asp Leu Arg Phe Val Gly Arg Ser 130 135 140 Gly Arg Gly Lys Ser Phe Thr Leu Thr Ile Thr Val Phe Thr Asn Pro 145 150 155 160 Thr Gln Val Ala Thr Tyr His Arg Ala Ile Lys Val Thr Val Asp Gly 165 170 175 Pro Arg Glu Pro Arg Arg His Arg Gln Lys Leu Glu Asp Gln Thr Lys 180 185 190 Pro Phe Pro Asp Arg Phe Gly Asp Leu Glu Arg Leu Arg Met Arg Val 195 200 205 Thr Pro Ser Thr Pro Ser Pro Arg Gly Ser Leu Ser Thr Thr Ser His 210 215 220 Phe Ser Ser Gln Pro Gln Thr Pro Ile Gln Gly Thr Ser Glu Leu Asn 225 230 235 240 Pro Phe Ser Asp Pro Arg Gln Phe Asp Arg Ser Phe Pro Thr Leu Pro 245 250 255 Thr Leu Thr Glu Ser Arg Phe Pro Asp Pro Arg Met His Tyr Pro Gly 260 265 270 Ala Met Ser Ala Ala Phe Pro Tyr Ser Ala Thr Pro Ser Gly Thr Ser 275 280 285 Ile Ser Ser Leu Ser Val Ala Gly Met Pro Ala Thr Ser Arg Phe His 290 295 300 His Thr Tyr Leu Pro Pro Pro Tyr Pro Gly Ala Pro Gln Asn Gln Ser 305 310 315 320 Gly Pro Phe Gln Ala Asn Pro Ser Pro Tyr His Leu Tyr Tyr Gly Thr 325 330 335 Ser Ser Gly Ser Tyr Gln Phe Ser Met Val Ala Gly Ser Ser Ser Gly 340 345 350 Gly Asp Arg Ser Pro Thr Arg Met Leu Ala Ser Cys Thr Ser Ser Ala 355 360 365 Ala Ser Val Ala Ala Gly Asn Leu Met Asn Pro Ser Leu Gly Gly Gln 370 375 380 Ser Asp Gly Val Glu Ala Asp Gly Ser His Ser Asn Ser Pro Thr Ala 385 390 395 400 Leu Ser Thr Pro Gly Arg Met Asp Glu Ala Val Trp Arg Pro Tyr 405 410 415 <210> 13 <211> 1380 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx3 isoform1 polynucleotide <400> 13 gccttcttca gagcggggca tggcatcgaa cagcatcttc gactccttcc cgacctactc 60 gccgaccttc atccgcgacc caagcaccag ccgccgcttc acacctccct ccccggcctt 120 cccctgcggc ggcggcggcg gcaagatggg cgagaacagc ggcgcgctga gcgcgcaggc 180 ggccgtgggg cccggagggc gcgcccggcc cgaggtgcgc tcgatggtgg acgtgctggc 240 ggaccacgca ggcgagctcg tgcgcaccga cagccccaac ttcctctgct ccgtgctgcc 300 ctcgcactgg cgctgcaaca agacgctgcc cgtcgccttc aaggtggtgg cattggggga 360 cgtgccggat ggtacggtgg tgactgtgat ggcaggcaat gacgagaact actccgctga 420 gctgcgcaat gcctcggccg tcatgaagaa ccaggtggcc aggttcaacg accttcgctt 480 cgtgggccgc agtgggcgag ggaagagttt caccctgacc atcactgtgt tcaccaaccc 540 cacccaagtg gcgacctacc accgagccat caaggtgacc gtggacggac cccgggagcc 600 cagacggcac cggcagaagc tggaggacca gaccaagccg ttccctgacc gctttgggga 660 cctggaacgg ctgcgcatgc gggtgacacc gagcacaccc agcccccgag gctcactcag 720 caccacaagc cacttcagca gccagcccca gaccccaatc caaggcacct cggaactgaa 780 cccattctcc gacccccgcc agtttgaccg ctccttcccc acgctgccaa ccctcacgga 840 gagccgcttc ccagacccca ggatgcatta tcccggggcc atgtcagctg ccttccccta 900 cagcgccacg ccctcgggca cgagcatcag cagcctcagc gtggcgggca tgccggccac 960 cagccgcttc caccatacct acctcccgcc accctacccg ggggccccgc agaaccagag 1020 cgggcccttc caggccaacc cgtcccccta ccacctctac tacgggacat cctctggctc 1080 ctaccagttc tccatggtgg ccggcagcag cagtgggggc gaccgctcac ctacccgcat 1140 gctggcctct tgcaccagca gcgctgcctc tgtcgccgcc ggcaacctca tgaaccccag 1200 cctgggcggc cagagtgatg gcgtggaggc cgacggcagc cacagcaact cacccacggc 1260 cctgagcacg ccaggccgca tggatgaggc cgtgtggcgg ccctactgac cgccctggtg 1320 gactcctccc gctggaggcg gggaccctaa caaccttcaa gaccagtgat gggccggctc 1380 1380 <210> 14 <211> 1320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx3 isoform2 polynucleotide <400> 14 cgggggaagc cgcgccgtct ccgcctgccc ggcgccctga cggccgctgt tatgcgtatt 60 cccgtagacc caagcaccag ccgccgcttc acacctccct ccccggcctt cccctgcggc 120 ggcggcggcg gcaagatggg cgagaacagc ggcgcgctga gcgcgcaggc ggccgtgggg 180 cccggagggc gcgcccggcc cgaggtgcgc tcgatggtgg acgtgctggc ggaccacgca 240 ggcgagctcg tgcgcaccga cagccccaac ttcctctgct ccgtgctgcc ctcgcactgg 300 cgctgcaaca agacgctgcc cgtcgccttc aaggtggtgg cattggggga cgtgccggat 360 ggtacggtgg tgactgtgat ggcaggcaat gacgagaact actccgctga gctgcgcaat 420 gcctcggccg tcatgaagaa ccaggtggcc aggttcaacg accttcgctt cgtgggccgc 480 agtgggcgag ggaagagttt caccctgacc atcactgtgt tcaccaaccc cacccaagtg 540 gcgacctacc accgagccat caaggtgacc gtggacggac cccgggagcc cagacggcac 600 cggcagaagc tggaggacca gaccaagccg ttccctgacc gctttgggga cctggaacgg 660 ctgcgcatgc gggtgacacc gagcacaccc agcccccgag gctcactcag caccacaagc 720 cacttcagca gccagcccca gaccccaatc caaggcacct cggaactgaa cccattctcc 780 gacccccgcc agtttgaccg ctccttcccc acgctgccaa ccctcacgga gagccgcttc 840 ccagacccca ggatgcatta tcccggggcc atgtcagctg ccttccccta cagcgccacg 900 ccctcgggca cgagcatcag cagcctcagc gtggcgggca tgccggccac cagccgcttc 960 caccatacct acctcccgcc accctacccg ggggccccgc agaaccagag cgggcccttc 1020 caggccaacc cgtcccccta ccacctctac tacgggacat cctctggctc ctaccagttc 1080 tccatggtgg ccggcagcag cagtgggggc gaccgctcac ctacccgcat gctggcctct 1140 tgcaccagca gcgctgcctc tgtcgccgcc ggcaacctca tgaaccccag cctgggcggc 1200 cagagtgatg gcgtggaggc cgacggcagc cacagcaact cacccacggc cctgagcacg 1260 ccaggccgca tggatgaggc cgtgtggcgg ccctactgac cgccctggtg gactcctccc 1320 1320

Claims (20)

  1. Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포; 및 CDK4 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. Runx3(Runt-related transcription factor 3) 단백질, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 상기 벡터에 의해 형질전환된 바이러스 또는 세포; 및 mTOR 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CDK4 억제제는 아베마시클립(abemaciclib), 팔보시클립(Palbociclib) 및 리보시클립(ribociclib)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CDK4 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 팔보시클립인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
    [화학식 1]
    Figure pat00003
    .
  5. 제2항에 있어서, 상기 mTOR 억제제는 라파마이신(rapamycin), 리다포롤리무스(Ridaforolimus), 에버롤리무스(Everolimus) 및 템시롤리무스(Temsirolimus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 상기 mTOR 억제제는 하기 화학식 2로 표시되는 라파마이신인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
    [화학식 2]
    Figure pat00004
    .
  7. 제1항에 있어서, 상기 암은 고형암인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 고형암은 폐암, 췌장암, 간암 및 위암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 Runx3은 Brd2와 복합체를 형성하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 CDK4 억제제는 Runx3-Brd2 복합체 지속 시간을 증가시키는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제2항에 있어서, 상기 mTOR 억제제는 Runx3-Brd2 복합체 지속 시간을 증가시키는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 BRD2는 아세틸화된 Runx3에 결합하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 상기 복합체는 유사 분열 자극(mitogenic stimulation)을 받은 경우 형성되는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 상기 복합체는 Restriction point(R-point) 결정에 기여하는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 Runx3 단백질은 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 Runx3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 13 또는 서열번호 14의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스(Retrovirus), 아데노바이러스(Adenovirus), 헤스페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 및 렌티바이러스(Lentivirus)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 세포는 박테리아인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 박테리아는 리스테리아(Listeria) 속, 쉬겔라(Shigella)속, 살모넬라속 또는 대장균(E.coli)인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
KR1020210052775A 2020-04-23 2021-04-23 Runx3 단백질 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제 병행 투여를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물 KR102618932B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200049341 2020-04-23
KR1020200049341 2020-04-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20210131910A true KR20210131910A (ko) 2021-11-03
KR102618932B1 KR102618932B1 (ko) 2023-12-29

Family

ID=76864967

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200166706A KR20210131855A (ko) 2020-04-23 2020-12-02 R-point 조절 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물, 상기 복합체의 형성 여부를 이용한 폐암 치료제 스크리닝 방법 및 폐암 진단 방법
KR1020200184526A KR102273954B1 (ko) 2020-04-23 2020-12-28 R-point 조절 단백질 복합체의 형성 여부를 이용한 폐암 치료제 스크리닝 방법
KR1020210052769A KR102566745B1 (ko) 2020-04-23 2021-04-23 암의 예방 또는 치료를 위한 Runx3 변이 단백질
KR1020210052775A KR102618932B1 (ko) 2020-04-23 2021-04-23 Runx3 단백질 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제 병행 투여를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200166706A KR20210131855A (ko) 2020-04-23 2020-12-02 R-point 조절 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물, 상기 복합체의 형성 여부를 이용한 폐암 치료제 스크리닝 방법 및 폐암 진단 방법
KR1020200184526A KR102273954B1 (ko) 2020-04-23 2020-12-28 R-point 조절 단백질 복합체의 형성 여부를 이용한 폐암 치료제 스크리닝 방법
KR1020210052769A KR102566745B1 (ko) 2020-04-23 2021-04-23 암의 예방 또는 치료를 위한 Runx3 변이 단백질

Country Status (2)

Country Link
US (2) US11931401B2 (ko)
KR (4) KR20210131855A (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009155455A1 (en) * 2008-06-19 2009-12-23 John Wayne Cancer Institute Use of runx3 and mir-532-5p as cancer markers and therapeutic targets
WO2014012147A1 (en) * 2012-07-20 2014-01-23 Latrobe University Method of diagnosis and treatment

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100475649B1 (ko) * 2001-01-29 2005-03-10 배석철 항암활성을 나타내는 ｒｕｎｘ３ 유전자 및 그의 용도
US20110021442A1 (en) * 2007-11-06 2011-01-27 Daewoong Jo Cell preamble runx3 recombinant proteins, polynucleotides encoding the same, and anticancer compositions including the same
WO2011011677A2 (en) 2009-07-23 2011-01-27 Aderans Research Institute, Inc. Potency markers
US8802099B2 (en) * 2010-11-10 2014-08-12 National Jewish Health Methods to treat allergic conditions
US10501513B2 (en) * 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
AU2013243948A1 (en) * 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
GB201223265D0 (en) 2012-12-21 2013-02-06 Selvita Sa Novel benzimidazole derivatives as kinase inhibitors
US20180148793A1 (en) * 2015-05-19 2018-05-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Biomarkers and uses thereof for selecting pancreas cancer intervention
KR101994957B1 (ko) * 2017-11-30 2019-07-01 고려대학교 산학협력단 Runx3 단백질 또는 이를 코딩하는 runx3 유전자를 포함하는 trail의 항암 효과 증진용 약학 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009155455A1 (en) * 2008-06-19 2009-12-23 John Wayne Cancer Institute Use of runx3 and mir-532-5p as cancer markers and therapeutic targets
US20120148561A1 (en) * 2008-06-19 2012-06-14 John Wayne Cancer Institute Use of runx3 and mir-532-5p as cancer markers and therapeutic targets
WO2014012147A1 (en) * 2012-07-20 2014-01-23 Latrobe University Method of diagnosis and treatment

Also Published As

Publication number Publication date
US11931401B2 (en) 2024-03-19
KR20210131909A (ko) 2021-11-03
KR102566745B1 (ko) 2023-08-18
KR102618932B1 (ko) 2023-12-29
KR20210131855A (ko) 2021-11-03
KR102273954B1 (ko) 2021-07-09
US20210330742A1 (en) 2021-10-28
US20210330740A1 (en) 2021-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100575251B1 (ko) ｐ38／ＪＴＶ－1을 유효성분으로 하는 암 치료용 약학적조성물 및 암 치료용 약학적 조성물의 스크리닝 방법
WO2019126524A1 (en) Therapeutic targets for nash-induced hepatocellular carcinoma
AU2016366515A1 (en) Combined preparations of PKM2 modulators and HMGB1
Peng et al. The Smad3-dependent microRNA let-7i-5p promoted renal fibrosis in mice with unilateral ureteral obstruction
KR100739118B1 (ko) Ｍｓｘ1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 신규한 용도
KR102618932B1 (ko) Runx3 단백질 및 CDK4 억제제 또는 mTOR 억제제 병행 투여를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물
Doriguzzi et al. The increased Sprouty4 expression in response to serum is transcriptionally controlled by Specific protein 1
Sadvakassova et al. Regulator of differentiation 1 (ROD1) binds to the amphipathic C‐terminal peptide of thrombospondin‐4 and is involved in its mitogenic activity
CA2506617C (en) Colon cancer metastasis inhibitor
WO2020165570A1 (en) Methods relating to disrupting the binding of af9 partner proteins to af9 and/or enl
US20210393715A1 (en) Anti-cancer-associated non-tumor cell agent comprising virus
WO2013056255A1 (en) Methods and compositions for inhibiting tumor cell proliferation
JPH11506325A (ja) Δｐ６２、その変異体、核酸配列及びこれらの使用
Torres SMAD4 with R361 Hotspot Mutations Retains the Ability to Bind to LEF1 and Boosts WNT Signaling in Colorectal Cancer Cells
WO2024055048A1 (en) Methods of treating neuroendocrine prostate cancer (nepc) by inhibiting nuclear receptor binding set domain protein 2 (nsd2)
KR20230068278A (ko) Upf1 단백질 또는 upf1 단백질 유래 폴리펩티드의 암의 예방 또는 치료 용도
WO2011162419A1 (ja) ガラクトシルセラミド発現因子－１を標的とする腫瘍増殖制御法
Katanasaka et al. Fibroblast-specific PRMT5 deficiency suppresses pressure overload-induced cardiac fibrosis and left ventricular dysfunction
DK2578227T3 (en) METHOD OF CANCER THERAPY
JP4750364B2 (ja) アポトーシスを伴う疾患の予防又は治療剤
KR100733889B1 (ko) 187 트레오닌 변이 ｐ27 단백질을 코딩하는 유전자를포함하는 재조합 아데노바이러스 및 그 제조방법
JP2016023182A (ja) がんを処置するための医薬
CN116925205A (zh) 激活Hippo信号通路的多肽及其用途
CN116769011A (zh) 一种视网膜母细胞瘤蛋白突变体及其制备方法和应用
JP2020528457A (ja) Ｄｎａ−ｐｋｃｓを阻害するための薬物治療

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right