KR20210098147A - 항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 4-1bbl을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 4-1bbl을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20210098147A
KR20210098147A KR1020200011983A KR20200011983A KR20210098147A KR 20210098147 A KR20210098147 A KR 20210098147A KR 1020200011983 A KR1020200011983 A KR 1020200011983A KR 20200011983 A KR20200011983 A KR 20200011983A KR 20210098147 A KR20210098147 A KR 20210098147A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
leu
gly
ser
ala
val
Prior art date
Application number
KR1020200011983A
Other languages
English (en)
Inventor
성영철
윤진원
신은주
Original Assignee
주식회사 제넥신
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 제넥신 filed Critical 주식회사 제넥신
Priority to KR1020200011983A priority Critical patent/KR20210098147A/ko
Publication of KR20210098147A publication Critical patent/KR20210098147A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 항-TAA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 융합단백질은 종양 관련 항원인 CEA와 면역 관문 단백질인 PD-L1과의 결합력이 우수하고, CEA 및/또는 PD-L1를 발현하는 종양세포와 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합단백질은 기존의 4-1BBL 치료제에서 나타나던 독성이 나타나지 않으면서, T세포를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합단백질은 암 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항-TAA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도{FUSION PROTEIN COMPRISING ANTI-TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN ANTIBODY, ANTI-PD-L1 ANTIBODY AND 4-1BBL AND USES THEREOF}
본 발명은 항-TAA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
항암치료제 시장은 전체 의약품 시장에서 가장 비중을 차지하고 있으며, 성장 가능성(CACR)도 11.6%로 가장 높아서 2020년에는 153조원 규모로 확대될 것으로 예상되고 있다. 그 중 면역항암제는 체내 면역시스템을 자극하여 면역시스템이 암세포를 공격하는 기작을 가지며, 최근 들어 항암제 분야에서 2세대 표적항암제보다 전이암에서도 효과가 크고 지속적이라고 알려져 있다.
이와 관련하여, 종양 특이적인 항원을 발현하는 종양세포는 발생 초기 단계에서는 개체의 면역시스템에 의해 제거될 수 있다. 그러나, 활발하게 증식하는 종양 세포들은 면역 감지 시스템(immune surveillance)을 회피하기 위해, PD-L1과 같은 면역관문(immune checkpoint) 단백질을 발현하게 된다. 이러한 면역관문 단백질은 항암 면역감시체계를 방해하여 종양 세포의 면역 반응을 회피하는 기전으로 알려져 있다.
면역관문 단백질 중에는 T세포에 발현되는 PD-1과 암세포에 발현되는 PD-L1이 결합하여 T세포의 기능을 억제하는 메커니즘이 알려져 있다. 이러한 PD-1과 PD-L1의 결합을 저해하는 기전으로 출시된 면역관문 억제제로는 펨브롤리주맙(Keytruda, pembrolizumab, anti-PD-1: Merck), 니볼루맙(Opdivo, nivolumab, anti-PD-1: BMS), 아테졸리주맙(Tecentriq, atezolizumab, anti-PD-L1: Roche) 등이 있다. PD-1과 PD-L1에 대한 면역관문 억제제에 앞서 세계 최초로 FDA 승인을 받은 면역관문 억제제인 이필리무맙(Yervoy, Ipilimumab, anti-CTLA4: BMS)은 T세포 표면의 CTLA-4와 결합하여 T세포가 무력화되는 것을 막아주고, T세포의 증식을 돕는 메커니즘으로 흑색종 환자 치료제로서 최초로 승인 받았다.
이러한 면역항암제는 환자의 전체적인 생존률(overall survival)과 병의 악화가 없는 상태의 생존률(progression free survival, PFS)을 개선시키는 등 단순 생존기간 연장에 그친 기존의 항암제보다 우수한 임상 시험 결과를 보여주었다. 뿐만 아니라, 기존 항암제의 구토, 탈모, 백혈구 감소 등과 같은 부작용과 내성 문제가 적어, 면역항암제는 항암 치료에서 큰 가능성을 보여주었다. 또한, 면역관문 억제제의 임상 결과는 말기암 환자의 거의 완치에 가까운 장기생존을 보여 세상을 놀라게 하였으나, 폐암, 피부암, 유방암 등의 여러 암 종에서 약 20% 내지 40%의 환자만이 반응을 보였다. 나머지 60% 내지 80%의 환자와 특히, 대장암 환자의 경우 치료 효능이 낮거나 없다는 한계점을 가지고 있다.
면역관문 억제제에 낮은 반응도 또는 무 반응도를 보이는 환자 군의 경우, 종양 조직 내 T세포의 수가 현저히 부족하였다. 즉, 환자의 면역 상태는 면역관문 억제제에 대한 반응도를 결정하는 중요한 요소 중 하나이다. 많은 암 환자의 경우 항암제 및 방사선 치료 등에 의해 면역체계에 교란이 생겨 'immune cold 혹은 immune desert' 상태가 되고, 이는 면역관문 억제제에 대한 낮은 반응도의 원인일 것이라고 추측하고 있다. 따라서, 환자의 면역체계를 활성화시키는 물질의 개발과 이를 기존의 면역관문 억제제와 병용하는 새로운 치료법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
한편, 사이토카인은 다양한 면역반응을 조절하는 물질로, 종류 및 특성에 따라 면역세포의 발달 및 증식, 유지, 활성, 사멸 등을 결정하는 중요한 요소이다. 환자의 면역체계 활성화를 목적으로 다양한 사이토카인 치료제가 개발되고 있다. 특히, T세포 및 NK세포의 항상성에 중요한 IL-2 계열 사이토카인(IL-2, IL-7, IL-15, IL-21)의 개발이 활발히 이루어지고 있다. 그러나, 사이토카인 치료제는 짧은 생체 반감기로 인해 뚜렷한 치료 효능을 확인할 수 없다는 한계점을 가지고 있다.
이에 본 발명자들은 면역체계를 활성화시키면서 면역관문 단백질을 억제시킬 수 있는 효과적인 면역항암제를 개발하기 위해 연구한 결과, 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질이 우수한 항암 효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, 하기 구조식 1 또는 구조식 2의 융합단백질을 제공한다.
[구조식 1]
N′-A-L1-B-L2-C-L3-D-C′
[구조식 2]
N′-B-L1-A-L2-C-L3-D-C′
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 융합단백질은 종양 관련 항원인 CEA와 면역 관문 단백질인 PD-L1과의 결합력이 우수하고, CEA 및/또는 PD-L1를 발현하는 종양세포와 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합단백질은 기존의 4-1BBL 치료제에서 나타나던 독성이 나타나지 않으면서, T세포를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합단백질은 암 질환을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체를 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체를 제형화시킨 후, SE-HPLC로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예인 αPDL1-αCEA-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체를 정제한 후 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예인 αPDL1-αCEA-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체를 제형화시킨 후, SE-HPLC로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 4-1BBLM(삼량체)을 포함하는 hyFc-4-1BBLM 융합단백질 이량체, CEA-hyFc-4-1BBLM 융합단백질 이량체와 4-1BBL 변이체의 단편(단량체)를 포함하는 αCEA-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체의 4-1BBL 활성을 우렐주맙과 비교한 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체의 CEA 또는 PD-L1를 발현하는 암세포에서만 특이적으로 T세포가 활성화되는 것을 확인한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예인 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체가 CEA 또는 PD-L1를 발현하는 암세포에서만 특이적으로 T세포가 활성화되는 것을 도식화한 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질
본 발명의 일 측면은, 하기 구조식 1 또는 구조식 2의 융합단백질로서,
[구조식 1]
N′-A-L1-B-L2-C-L3-D-C′
[구조식 2]
N′-B-L1-A-L2-C-L3-D-C′
상기 N′은 융합단백질의 N-말단이고,
상기 C′는 융합단백질의 C-말단이며,
상기 A는 종양 관련 항원(tumor-associated antigen)에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv(Single-chain variable fragment)이고,
상기 B는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv이며,
상기 C는 면역글로불린의 Fc 도메인, 이의 단편 또는 이의 변이체이고,
상기 D는 4-1BBL, 이의 단편 또는 이의 변이체이며,
상기 L1, L2 및 L3는 각각 펩타이드 링커인 융합단백질을 제공한다.
상기 A는 종양 관련 항원(tumor-associated antigen)로서, 상기 종양 관련 항원은 세포암화에 따라 발현하는 항원 중, 암세포특이적이 아니고, 대응하는 정상세포에도 미량으로 존재하는 항원을 의미한다. 구체적으로, 상기 A는 CEA(Carcinoembryonic antigen), AFP(α-fetoprotein) 및 MUC1(Mucin 1) 이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv일 수 있다. 구체적으로, 상기 A는 CEA에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv일 수 있다.
상기 CEA는 대장암을 비롯한 유방암, 폐암, 간암 등의 암종과 비암성 질환 또는 흡연자에서 발견되는 혈액 내 존재하는 종양 관련 항원으로, 암의 치료 경과, 재발 여부를 확인하는데 이용될 수 있다.
상기 AFP는 간암을 비롯한 위암, 난소의 태아성 암 등의 암종과 간염, 간경변 질환 환자에서 발견되는 혈액 내 검출되는 종양 관련 항원이다. 일반적으로, AFP는 태아 혈청 단백으로 태생기에 생성되고 생후 감소하기 시작하여 18개월이 지나면 성인에서 관찰되는 수치까지 감소한다.
상기 MUC1은 특정한 상피세포에서 발견되는 단백질로서, 유방암, 난소암, 폐암, 전립선암 환자에서 정상인보다 높게 측정된다. 혈액에서 MUC1의 발현양을 측정하여 암의 치료, 재발 여부 등을 예측할 수 있다.
상기 A는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 B는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 C는 면역글로불린의 Fc 도메인, 이의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 Fc 도메인의 변이체는 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인 또는 이의 단편일 수 있다. 이때, 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인은 Fc 수용체 및/또는 보체(complement)와의 결합력이 변형되어 항체의존성세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 또는 보체의존성세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)이 약화된 것일 수 있다. 상기 변형된 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 사용하는 용어, "Fc 도메인", "Fc 단편" 또는 "Fc"란 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하나, 이의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역 1(CL1)은 포함하지 않는 단백질을 말한다. 이는 중쇄 불변 영역의 힌지 영역을 더 포함할 수 있다. 또한, 면역글로불린 Fc 도메인 단편은 항체의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CH2 및 CH3 도메인은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD 또는 IgE로부터 유래된 것일 수 있다. 변형된 Fc 또는 변형된 Fc 단편은 본원에서 "hFc" 또는 "hyFc"로 지칭되기도 한다.
본 발명에 사용하는 용어, "Fc 도메인 변이체"는 Fc 도메인 중 일부 아미노산이 치환되거나, 서로 다른 종류의 Fc 도메인을 조합하여 제조된 것을 의미한다. 상기 Fc 도메인 변이체는 힌지 부위에서 절단되는 것을 예방할 수 있다. 구체적으로, 서열번호 9의 144번째 아미노산 및/또는 145번째 아미노산이 변형될 수 있다. 바람직하게는 서열번호 9의 144번째 아미노산인 K를 G 또는 S로 치환하고, 145번째 아미노산인 E를 G 또는 S로 치환한 변이체일 수 있다.
또한, 본 발명의 Fc 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린 Fc 당쇄를 변형시킬 수 있다. Fc 단편으로부터 당쇄의 제거는 1차 보체 구성요소 C1의 C1q에의 결합 친화력을 급격하게 감소시키고, ADCC 또는 CDC의 감소 또는 소실을 가져오며, 그로 인하여 생체 내의 불필요한 면역반응을 유도하지 않는다. 이런 점에서, 당쇄가 제거되거나(deglycosylated) 비당쇄화된(aglycosylated) 형태에서의 면역글로불린 Fc 단편은, 약물의 담체로서 본 발명의 목적에 더 적합할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "당쇄의 제거(deglycosylation)"는 Fc 단편으로부터 효소적으로 당이 제거됨을 의미한다. 또한, 용어 "비당쇄화(aglycosylation)"는 Fc 단편이 원핵 생물, 바람직하게는 E.coli에 의하여 당쇄화 되지 않은(unglycosylated) 형태로 생성됨을 의미한다.
또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인은 서열번호 9(hyFc), 서열번호 5(hyFcM1), 서열번호 12(hyFcM2), 서열번호 13(hyFcM3) 또는 서열번호 14(hyFcM4)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인은 서열번호 5의 아미노산 서열(non-lytic mouse Fc)을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 C는 면역글로불린의 Fc 도메인의 변이체인 변형된 면역글로불린의 Fc 도메인(hyFcM1)을 사용하였으며, 상기 C는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 D는 4-1BBL, 이의 단편 또는 이의 변이체일 수 있다.
상기 4-1BBL의 변이체 또는 이의 단편은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열에서 146/241, 232/244 또는 140/199 위치에 상응하는 아미노산이 시스테인으로 치환된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "4-1BB 리간드"란, 4-1BBL 또는 CD137L로 불리 우는 종양 괴사 인자 수퍼패밀리(superfamily)에 속하는 막단백질을 의미한다. 4-1BBL은 항원 제공 세포(antigen presenting cells)에서 발견된다. 또한, 4-1BBL은 4-1BB와 특이적으로 결합할 수 있다. 이때, 야생형 4-1BBL은 포유동물에서 발견되는 천연의 4-1BBL일 수 있다. 일 구체예로, 상기 4-1BBL은 인간 유래의 4-1BBL인 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
인간 유래의 4-1BBL는 세포내영역(1번째 부터 28번째까지의 아미노산), 막통과단백질(29번째 부터 49번째까지의 아미노산) 및 세포외영역(50번째부터 254번째까지의 아미노산)으로 이루어져 있다. 세포외영역은 총 10개의 베타스트랜드를 이룬 2차 구조로 형성되었다(PDB 2X29). 첫번째 베타스트랜드는 83번째 아미노산부터 시작하며, 마지막 베타스트랜드는 239번째까지 이루어져 있다.　즉, 83 에서 239 번째 아미노산을 포함하는 단편의 경우 2차 구조를 모두 포함하고 있어 활성이 있는 것으로 알려져 있다.
상기 4-1BBL 변이체의 일 구체예는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열에서 146번째 및 241번째 아미노산(146/241)이 시스테인으로 치환된 것일 수 있다. 즉, 4-1BBL 변이체는 Q146C 및 T241C인 것일 수 있다.
상기 4-1BBL 변이체의 다른 구체예는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열에서 232번째 및 244번째 아미노산(232/244)이 시스테인으로 치환된 것일 수 있다. 즉, 4-1BBL 변이체는 A232C 및 I244C인 것일 수 있다.
상기 4-1BBL 변이체의 다른 구체예는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열에서 140번째 및 199번째 아미노산(140/199)이 시스테인으로 치환된 것일 수 있다. 즉, 4-1BBL 변이체는 V140C 및 F199C인 것일 수 있다.
이때, 상기 4-1BBL 변이체의 단편은 변이된 4-1BBL의 세포외영역(extracellular domain, ECD)일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "세포외영역"은 막 단백질의 일부로서 세포 밖에 노출되는 영역을 의미한다. 이때, 막통과영역(transmembrane domain) 및 세포내영역을 제외한 부분을 의미할 수 있다. 4-1BBL의 세포외영역의 일 구체예로는 인간 4-1BBL의 50번째 아미노산부터 254번째 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드(서열번호 17)일 수 있으며, 구체적으로, 83번째 아미노산부터 239번째 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드(서열번호 18)를 의미할 수 있다. 이때, 상기 변이된 4-1BBL의 세포외영역은 서열번호 22 내지 서열번호 27 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한, 상기 4-1BBL 변이체의 단편이란, 상술한 146/241, 232/244 또는 140/199의 변이를 포함하는 4-1BBL의 세포외영역 일부를 의미한다. 구체적으로, 4-1BBL 변이체의 단편은 서열번호 17의 아미노산 서열에서 146/241, 232/244 또는 140/199의 위치가 시스테인으로 치환되며, 상기 서열번호 17의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개 또는 33개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 17의 205번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 아미노산 잔기가 결실된 것일 수 있다.
상기 아미노산 잔기의 결실은, 상기 기술한 "N-말단으로부터 C-말단 방향으로" 및 "C-말단으로부터 N-말단 방향으로" 중 어느 하나 또는 양쪽 모두에서 발생할 수 있다. 구체적으로, 상기 아미노산 잔기가 결실된 4-1BBL의 세포외영역 단편은 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 아미노산 잔기가 결실된 변이된 4-1BBL의 세포외영역 단편은 서열번호 23, 서열번호 25 또는 서열번호 27의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
이러한 4-1BBL 변이체의 단편의 일 구체예는 하기 구조식 3으로 표시되는 폴리펩타이드로 표기될 수 있다:
[구조식 3]
N-말단 확장 도메인-코어 도메인-C 말단 확장 도메인 (I)
상기 식 (I)에서,
코어 도메인은 서열번호 28, 29 또는 30의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이고;
N-말단 확장 도메인은 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 31의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 1개 내지 33개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있으며;
C-말단 확장 도메인은 서열번호 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로서, 서열번호 32의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 1개 내지 15개의 아미노산이 연속적으로 결실될 수 있다.
이때, 상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 31의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 30개의 아미노산이 연속적으로 결실 것일 수 있다. 또한, 상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 31의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 22개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 또한, 상기 N-말단 확장 도메인이 서열번호 31의 1번 위치의 아미노산부터 시작하여 N-말단으로부터 C-말단 방향으로 17개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다. 또한, 상기 C-말단 확장 도메인이 서열번호 32의 16번 위치의 아미노산부터 시작하여 C-말단으로부터 N-말단 방향으로 7개의 아미노산이 연속적으로 결실된 것일 수 있다.
상기 4-1BBL 변이체의 단편의 일 구체예는 서열번호 28 내지 서열번호 30 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 다른 구체예로, 상기 4-1BBL 변이체의 단편은 서열번호 33 내지 서열번호 41의 아미노산 서열 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또 다른 구체예로, 상기 4-1BBL 변이체의 단편은 서열번호 42 내지 서열번호 44 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 또 다른 구체예로 상기 4-1BBL 변이체의 단편은 서열번호 22, 서열번호 24 또는 서열번호 26로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
즉, 상기 D는 서열번호 22 내지 서열번호 44 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 A와 B는 1개 내지 50개의 펩타이드 링커(제1링커, L1)를 통해 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드 링커는 1개 내지 50개의 연속된 아미노산, 5개 내지 45개의 연속된 아미노산, 10개 내지 40개의 연속된 아미노산, 또는 15개 내지 35개의 연속된 아미노산, 또는 20개 내지 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 L1은 20개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 A와 B는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커(제1링커, L1)를 통해 결합될 수 있다.
상기 B와 C는 1개 내지 50개의 펩타이드 링커(제2링커, L2)를 통해 결합될 수 있다. 상기 L1은 1개 내지 50개의 연속된 아미노산, 5개 내지 45개의 연속된 아미노산, 10개 내지 40개의 연속된 아미노산, 또는 15개 내지 35개의 연속된 아미노산, 또는 20개 내지 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 L2는 30개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 L2는 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 L2는 하나, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 L2는 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 일 구체예로서, 상기 L2는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
상기 C와 D는 1개 내지 50개의 펩타이드 링커(제3링커, L3)를 통해 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 펩타이드 링커는 1개 내지 50개의 연속된 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 L3은 5개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 상기 C와 D는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커(제3링커, L3)를 통해 결합될 수 있다.
상기 융합단백질은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다. 상기 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다.
이때, 이량체를 구성하는 융합단백질 간의 결합은 링커 내에 존재하는 시스테인에 의해 이황화 결합에 의해 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이량체를 구성하는 융합단백질은 동일한 것일 수도 있으나, 서로 상이한 융합단백질일 수 있다. 바람직하게는, 상기 이량체는 동형이량체(homodimer)인 것일 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 구체적으로, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 상기 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질은 상술한 바와 같다. 상기 폴리뉴클레오티드는 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 한, 하나 이상의 염기가 치환될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(signal sequence)을 코딩하는 핵산을 추가적으로 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호펩타이드를 의미한다. 상기 신호펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 상기 신호서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열이다.
신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N-말단 영역, 중심의 소수성 영역, 및 보다 극성인(polar) C-말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), 또는 성장 호르몬(growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵 세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다.
융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 벡터는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등)이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
본 명세서에서 사용된 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은, DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터, 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
융합단백질을 발현하는 형질전환된 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 형질전환 세포의 숙주세포로서, 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, CSO 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, HEK 293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 숙주세포로 발현벡터를 도입하는 경우, CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다.
전술한 바와 같이, 융합단백질의 치료제로서의 특성을 최적하거나 기타 다른 목적을 위해 호스트 세포가 갖고 있는 당화(glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려져 있는 방법을 통해 조작하여 융합단백질의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
융합단백질 생산 방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계를 포함하는 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 상기 생산방법은 상기 생산 방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하여 배양물을 수득하는 단계; 및 ii) 상기 배양물로부터 융합단백질을 회수하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch 또는 repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
융합단백질 또는 이의 이량체의 용도
본 발명의 또 다른 측면은 포, 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 항-CEA 항체, 항-PD-L1 항체 및 4-1BBL을 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체는 상술한 바와 같다.
본 발명의 융합단백질 또는 이의 이량체는 CEA에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv를 포함함으로써, 종양 세포에 발현된 종양 관련 항원인 CEA에 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합단백질 또는 이의 이량체는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv를 포함함으로써, 종양세포에 발현된 PD-L1에 결합하여, PD-L1/PD-1 결합을 저해하여 종양세포의 면역회피 기작을 차단시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 융합단백질 또는 이의 이량체는 4-1BBL 또는 이의 단편 또는 이의 변이체를 포함함으로써, 면역세포를 활성화시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 융합단백질 또는 이의 이량체는 종양세포에 특이적으로 결합하고, 종양세포의 면역회피 기작을 차단시킬 수 있으며, 종양세포 주변의 면역세포를 활성화시킬 수 있으므로 암 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 암 또는 감염성 질환 치료용 또는 예방용 약학 조성물에서 그 유효성분은 항암 활성을 나타내거나, 감염성 질환에 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 항암 효과 또는 감염성 질환 치료(treatment) 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 이때, 예방은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 용어 "치료"는 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환 또는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "효능(efficacy)"은 1년, 5년, 또는 10년과 같이 일정 기간에 걸쳐 생존 또는 질병이 없는 상태에서 생존(disease-free survival)과 같은 같은 하나 이상의 파라미터에 의해 결정될 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 파라미터는 개체에서 적어도 하나의 종양의 크기가 억제되는 것을 포함할 수 있다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(Pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능" (예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험 동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 종양 성장을 비교하거나, 생존, 재발율 또는 질병이 없는 상태에서 생존과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
여기서 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구체예에서 치료학적으로 유효한 양은 암을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.01 ug/kg 내지 10 g/kg 범위, 또는 0.01 mg/kg 내지 1 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본원 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본원의 약학 조성물은 유효성분 이외에, 항암 활성의 상승·보강을 위하여 이미 안전성이 검증되고 항암 활성 또는 감염성 질환에 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 융합 단백질 또는 융합단백질 이량체의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 융합 단백질 또는 융합단백질 이량체는 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 유전자 컨스트럭트 제조
항-CEA 항체의 scFv(αCEA), 항-PD-L1 항체의 scFv(αPDL1) 및 4-1BBL 변이체의 단편이 결합된 융합단백질을 제조하기 위해, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 αCEA, 제1링커, αPDL1, 제2링커, Fc 도메인(hyFc), 제3링커 및 4-1BBL 변이체의 단편 순서로 결합된 형태의 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 유전자 컨스트럭트를 제조하였다.
구체적으로, 먼저, 공지된 아미노산 서열(Accession number: DB05097)인 hMN-14의 아미노산 서열을 이용해 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 항-CEA 항체의 scFv를 제작하였다. 또한, 항-PD-L1 항체의 아미노산 서열을 이용해 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 항-PD-L1 항체의 scFv를 제작하였다. 상기 제작한 항-CEA 항체의 scFv와 항-PD-L1 항체의 scFv를 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커(제1링커)로 결합하였으며, 이를 FC 도메인의 N-말단 쪽에 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커(제2링커)로 결합하였다.
또한, 상기 4-1BBL 변이체의 단편은 이황화 결합을 도입하는 변이를 포함하여 단량체가 삼량체를 잘 이루도록 야생형 4-1BBL의 146/241, 232/244 또는 140/199 위치에 상응하는 아미노산이 시스테인으로 치환된 4-1BBL 변이체 의 세포외영역을 단편으로 제조하였으며, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것을 사용하였다. 또한, 4-1BBL 변이체의 단편 3개를 링커로 연결시킨 4-1BBL 변이체의 단편의 삼량체(4-1BBLM)를 제작하였다. 상기 4-1BBL 변이체의 단편 또는 4-1BBLM을 FC 도메인의 C-말단 쪽에 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커(제3링커)로 결합하였다.
그 후, 각각의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 합성하여 서브 벡터(sub-vector)로 제조하였다. 합성된 4개의 유전자를 하나의 유전자 컨스트럭트로 제조하기 위해, Golden GATE way assembly를 진행하여 pBispec vector로 발현벡터를 확보하였다.
상기 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 유전자 컨스트럭트의 제조방법과 동일한 방법으로, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 αPDL1, 제1링커, αCEA, 제2링커, hyFc, 제3링커 및 4-1BBL 순서로 결합된 형태의 αPDL1-αCEA-hyFc-4-1BBL 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하였다.
또한, 상기 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 유전자 컨스트럭트의 제조방법과 동일한 방법으로, 비교예로서, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 hyFc, 제3링커, 4-1BBLM 순서로 결합된 형태의 hyFc-4-1BBLM 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하였다. 또한, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 αCEA, 제2링커, hyFc, 제3링커, 4-1BBLM 순서로 결합된 형태의 αCEA-hyFc-4-1BBLM 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하였다. 나아가, N-말단에서부터 C-말단 방향으로 αCEA, 제2링커, hyFc, 제3링커, 4-1BBL 순서로 결합된 형태의 αCEA-hyFc-4-1BBL 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 제조하였다.
실시예 2. αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체 생산
αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체를 생산하기 위해, suspension-adapted CHO 세포를 6×106 cells/㎖로 접종(seeding)한 후, 실시예 1에서 제작한 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터 200 ㎖ 및 ExpiFectamineTM CHO reagent를 처리하여 형질전환하였다. 많은 양의 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체를 확보하기 위해, 형질전환한 다음날 ExpiFectamineTM CHO 인핸서(enhancer)와 ExpiCHOTM 피드(feed)를 첨가하였고, 배양온도를 32℃ 온도로 시프트(shift)하였다. 7일 후 배양액을 수거하여 3,600 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 수득하였다. 그 후, 0.22 ㎛ 필터를 이용하여 상층액을 여과하였다. 이때, 생산한 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체를"IO-129"로 명명하였다.
상기 상층액으로부터 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체를 정제하기 위해, AKTA Prime(GE Healthcare Life sciences) 및 Protein A resin을 이용해 Fc 도메인을 포함하는 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체를 정제하였다. 용출 버퍼로는 100 mM Glycine-HCL, 50 mM L-Arginine 및 5% Glycerol(pH 3.0)를 사용하였다.
그 결과, Protein A resin을 이용해 정제하는 단계만으로도 순도 90% 이상의 융합단백질 이량체를 확보하였다. 순도가 높은 분획(fraction)만을 분리하여 50 mM hepes, 250 mM sucrose, pH 5.0로 제형화하였다. 제형화시킨 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 비환원 조건(non-reducing condition)에서 약 250 kDa에서 확인되었고, 환원 조건(reducing condition)에서 약 100 kDa에서 확인되었다(도 1, 비환원: 융합단백질 이량체, 환원: 융합단백질 단량체). 또한, SE-HPLC 분석을 통해 순도를 확인한 결과, 99.8%의 순도를 확인하였다(도 2).
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 αPDL1-αCEA-hyFc-4-1BBL 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 이용해 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질의 생산 방법과 동일한 방법으로 αPDL1-αCEA-hyFc-4-1BBL 융합단백질을 생산하였다. 이때, αPDL1-αCEA-hyFc-4-1BBL 융합단백질을 "IO-130"으로 명명하였다.
상기 상층액으로부터 αPDL1-αCEA-hyFc-4-1BBL 융합단백질을 정제하여 순도가 높은 분획(fraction)만을 분리하여 50 mM hepes, 250 mM sucrose, pH 5.0로 제형화하였다. 제형화시킨 αPDL1-αCEA-hyFc-4-1BBL 융합단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과, 비환원 조건에서 약 250 kDa에서 확인되었고, 환원 조건에서 약 100 kDa에서 확인되었다(도 3). 또한, SE-HPLC 분석을 통해 순도를 확인한 결과, 91.4%의 순도를 확인하였다(도 4).
또한, 상기 실시예 1에서 제조한 hyFc-4-1BBLM 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터, αCEA-hyFc-4-1BBLM 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터 및 αCEA-hyFc-4-1BBL 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현벡터를 이용해 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질의 생산 방법과 동일한 방법으로 hyFc-4-1BBLM 융합단백질(서열번호 19) 이량체, αCEA-hyFc-4-1BBLM 융합단백질(서열번호 20) 이량체 및 αCEA-hyFc-4-1BBLM 융합단백질(서열번호 21) 이량체를 생산하였다.
실시예 3. 4-1BBLM(삼량체)와 4-1BBL(단량체)의 활성비교
4-1BBL은 기본적으로 삼량체 구조를 이루며, 단량체보다 삼량체의 활성이 크다. 그러나, 4-1BBL은 삼량체, 육량체 또는 십이량체를 이루면서 활성이 기하급수적으로 증가하게되고, 이로 인해 우렐루맙(urelumab)의 경우와 같이 단일요법으로 사용시 독성이 나타난다는 부작용이 있다.
이에, 4-1BBL 변이체의 단편(단량체) 또는 4-1BBLM(삼량체)를 포함하는 융합단백질 이량체의 활성을 비교하기 위하여 Promega, 4-1BB Bioassay kit을 이용하였다. 재조합 4-1BBL(R&D systems, Cat no. 2295-4L-025/CF)를 anti-His tag Ab(Biolegend, Cat no. 652502, B2223517)로 가교(crosslinking)시킨 대조군과 hyFc-4-1BBLM 융합단백질, αCEA-hyFc-4-1BBLM 융합단백질 이량체, αCEA-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체 및 활성이 높아 임상에서 독성을 보였던 우렐루맙을 활용하여 활성을 측정하였다. 구체적으로, NFκB-Luc2/4-1BB Jurkat cells(Promega, Cat.No. J235A)을 각 플레이트에 분주하고 각각의 융합단백질을 441 ㎍부터 3배씩 희석하여 처리한 후, 37℃ 5% CO2 조건에서 6시간 동안 배양하고 발광도(luminescence)를 측정하였다.
그 결과, 대조군 및 αCEA-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체에 비해 hyFc-4-1BBLM 융합단백질, αCEA-hyFc-4-1BBLM 융합단백질 이량체의 활성은 우렐루맙의 활성을 능가하게 되므로, 4-1BBLM(삼량체)를 포함하는 융합단백질 이량체의 경우 독성이 나타날 가능성이 있다는 것을 확인하였다(도 5).
이를 통해, 4-1BBL 변이체의 단편(단량체)을 포함하는 αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체 및 αPDL1-αCEA-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체을 최종 선별하였다.
실시예 4. αCEA-αPDL1-hyFc-4-1BBL 융합단백질 이량체의 종양항원 특이적 활성화 확인
실시예 3에서 얻은 결과를 토대로 4-1BBL 변이체의 단편(단량체)을 포함하는 융합단백질을 종양항원인 CEA를 발현하는 암세포 또는 면역관문 단백질인 PD-L1을 발현하는 암세포에 특이적으로 결합하게 함으로써 종양조직에서만 4-1BBL의 활성을 나타나게 할 수 있는지 확인하고자 하였다. 구체적으로, CEA를 발현하는 MKN45 암세포(한국세포주은행(KCLB), Cat.No. 80103)와 NFκB-Luc2/4-1BB Jurkat cells을 공동 배양하였다. 또한, PD-L1을 발현하는 MDA-MB-231 암세포(한국세포주은행(KCLB), Cat.No. 30026)와 NFκB-Luc2/4-1BB Jurkat cells을 공동 배양하였다. 상기 공동배양 중인 세포 및 NFκB-Luc2/4-1BB Jurkat cells에 우렐루맙, αCEA-αPDL1-hyFc-h4-1BBL 융합단백질 이량체 또는 αPDL1-αCEA-hyFc-h4-1BBL 융합단백질 이량체를 각각 처리한 후, 융합단백질 이량체에 의해 T세포 활성화가 유도되는지 4-1BB Bioassay kit(Promega, Cat.No. J235A)를 이용하여 확인하였다.
그 결과, 우렐루맙의 경우 CEA 또는 PD-L1을 발현하는 암세포가 존재하지 않아도 T세포가 활성화되는 정도가 높았고, CEA 또는 PD-L1을 발현하는 암세포와 공동배양할 경우 T세포의 활성이 더 높아지는 것을 확인하였다. 반면, αCEA-αPDL1-hyFc-h4-1BBL 융합단백질 이량체 및 αPDL1-αCEA-hyFc-h4-1BBL 융합단백질 이량체의 경우 CEA 또는 PD-L1을 발현하는 암세포와 공동 배양하는 경우에만 T세포가 활성화되고, 그 활성화 정도가 PD-L1을 발현하는 암세포와 공동 배양할 때 T세포의 활성이 더 높게 나타났다(도 6).
이를 통해, 4-1BBL 변이체의 단편(단량체)를 포함하는 융합단백질 이량체가 CEA 또는 PD-L1과 특이적인 결합을 하고, 이에 의해 T세포가 활성화될 수 있으며, CEA 또는 PD-L1를 발현하는 암세포에 4-1BBL 변이체의 단편(단량체)를 축적시켜 종양조직에서만 4-1BBL의 활성을 나타나게 하는 것을 확인하였다(도 7).
<110> Genexine, Inc. <120> FUSION PROTEIN COMPRISING ANTI-TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN ANTIBODY, ANTI-PD-L1 ANTIBODY AND 4-1BBL AND USES THEREOF <130> FPD/201911-0091 <160> 44 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 240 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA antibody of scFv <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 130 135 140 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160 Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val 180 185 190 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 195 200 205 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220 Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 <210> 2 <211> 241 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-PD-L1 antibody of scFv <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Phe Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 130 135 140 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160 Gln Asp Val Thr Pro Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Tyr Thr Gly Val 180 185 190 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 195 200 205 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220 His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 225 230 235 240 Lys <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker 1 (L1) <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 hinge <400> 4 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hyFcM1 <400> 5 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 1 5 10 15 Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 20 25 30 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 35 40 45 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 50 55 60 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 65 70 75 80 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 85 90 95 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 100 105 110 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 115 120 125 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 130 135 140 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 145 150 155 160 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 165 170 175 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 180 185 190 Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 195 200 205 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 210 215 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker (L3) <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 7 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type human 4-1BBL <400> 7 Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro 1 5 10 15 Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe 35 40 45 Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser 50 55 60 Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp 65 70 75 80 Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 85 90 95 Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 100 105 110 Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 115 120 125 Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 130 135 140 Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 145 150 155 160 Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 165 170 175 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 180 185 190 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 195 200 205 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 210 215 220 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 225 230 235 240 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 <210> 8 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> wild type mouse 4-1BBL <400> 8 Met Asp Gln His Thr Leu Asp Val Glu Asp Thr Ala Asp Ala Arg His 1 5 10 15 Pro Ala Gly Thr Ser Cys Pro Ser Asp Ala Ala Leu Leu Arg Asp Thr 20 25 30 Gly Leu Leu Ala Asp Ala Ala Leu Leu Ser Asp Thr Val Arg Pro Thr 35 40 45 Asn Ala Ala Leu Pro Thr Asp Ala Ala Tyr Pro Ala Val Asn Val Arg 50 55 60 Asp Arg Glu Ala Ala Trp Pro Pro Ala Leu Asn Phe Cys Ser Arg His 65 70 75 80 Pro Lys Leu Tyr Gly Leu Val Ala Leu Val Leu Leu Leu Leu Ile Ala 85 90 95 Ala Cys Val Pro Ile Phe Thr Arg Thr Glu Pro Arg Pro Ala Leu Thr 100 105 110 Ile Thr Thr Ser Pro Asn Leu Gly Thr Arg Glu Asn Asn Ala Asp Gln 115 120 125 Val Thr Pro Val Ser His Ile Gly Cys Pro Asn Thr Thr Gln Gln Gly 130 135 140 Ser Pro Val Phe Ala Lys Leu Leu Ala Lys Asn Gln Ala Ser Leu Cys 145 150 155 160 Asn Thr Thr Leu Asn Trp His Ser Gln Asp Gly Ala Gly Ser Ser Tyr 165 170 175 Leu Ser Gln Gly Leu Arg Tyr Glu Glu Asp Lys Lys Glu Leu Val Val 180 185 190 Asp Ser Pro Gly Leu Tyr Tyr Val Phe Leu Glu Leu Lys Leu Ser Pro 195 200 205 Thr Phe Thr Asn Thr Gly His Lys Val Gln Gly Trp Val Ser Leu Val 210 215 220 Leu Gln Ala Lys Pro Gln Val Asp Asp Phe Asp Asn Leu Ala Leu Thr 225 230 235 240 Val Glu Leu Phe Pro Cys Ser Met Glu Asn Lys Leu Val Asp Arg Ser 245 250 255 Trp Ser Gln Leu Leu Leu Leu Lys Ala Gly His Arg Leu Ser Val Gly 260 265 270 Leu Arg Ala Tyr Leu His Gly Ala Gln Asp Ala Tyr Arg Asp Trp Glu 275 280 285 Leu Ser Tyr Pro Asn Thr Thr Ser Phe Gly Leu Phe Leu Val Lys Pro 290 295 300 Asp Asn Pro Trp Glu 305 <210> 9 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hyFc <400> 9 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Lys 245 <210> 10 <211> 384 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgD constant region (Genbank accession No. P01880) <400> 10 Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg 1 5 10 15 His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly 20 25 30 Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser 35 40 45 Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr 50 55 60 Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly 65 70 75 80 Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu 85 90 95 Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro 100 105 110 Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala 115 120 125 Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys 130 135 140 Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu 145 150 155 160 Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala 165 170 175 Val Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val 180 185 190 Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly 195 200 205 Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser 210 215 220 Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu 225 230 235 240 Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu 245 250 255 Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro 260 265 270 Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala 275 280 285 Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile 290 295 300 Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe 305 310 315 320 Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala 325 330 335 Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr 340 345 350 Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala 355 360 365 Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met Lys 370 375 380 <210> 11 <211> 327 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Partial human IgG4 constant region (Genbank accession No. AH25985) <400> 11 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 12 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hyFcM2 <400> 12 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Gly Ser Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Lys 245 <210> 13 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hyFcM3 <400> 13 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Ser Gly Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Lys 245 <210> 14 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hyFcM4 <400> 14 Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Ser Ser Lys Glu Lys 1 5 10 15 Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Lys 245 <210> 15 <211> 926 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA-anti-PDL1-hyFc-4-1BBL fusion protein <400> 15 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser 130 135 140 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser 145 150 155 160 Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 165 170 175 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly Val 180 185 190 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr 195 200 205 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 210 215 220 Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 260 265 270 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 275 280 285 Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ser 290 295 300 Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Asp Ala Gly Gly Tyr Ile Tyr Tyr 305 310 315 320 Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 325 330 335 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 340 345 350 Val Tyr Ile Cys Ala Arg Glu Phe Gly Lys Arg Tyr Ala Leu Asp Tyr 355 360 365 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser 370 375 380 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 385 390 395 400 Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 405 410 415 Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Thr Pro Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln 420 425 430 Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Ser Arg 435 440 445 Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 450 455 460 Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 465 470 475 480 Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr 485 490 495 Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 500 505 510 Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 515 520 525 Pro Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro 530 535 540 Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 545 550 555 560 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 565 570 575 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 580 585 590 Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 595 600 605 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 610 615 620 Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 625 630 635 640 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 645 650 655 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 660 665 670 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 675 680 685 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 690 695 700 Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 705 710 715 720 Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 725 730 735 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp 740 745 750 Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val 755 760 765 Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp 770 775 780 Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu 785 790 795 800 Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe 805 810 815 Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser 820 825 830 Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala 835 840 845 Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala 850 855 860 Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala 865 870 875 880 Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His 885 890 895 Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val 900 905 910 Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 915 920 925 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker (L2) <400> 16 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 20 25 30 <210> 17 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL extracellular domain <400> 17 Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala 35 40 45 Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro 50 55 60 Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp 65 70 75 80 Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe 85 90 95 Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val 100 105 110 Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg 130 135 140 Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly 145 150 155 160 Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala 165 170 175 Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr 180 185 190 Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 195 200 205 <210> 18 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL extracellular core domain <400> 18 Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln 1 5 10 15 Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly 20 25 30 Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr 35 40 45 Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln 50 55 60 Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser 65 70 75 80 Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala 85 90 95 Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn 100 105 110 Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln 115 120 125 Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp 130 135 140 Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 145 150 155 <210> 19 <211> 847 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hyFc-4-1BBLM <400> 19 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 1 5 10 15 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ser His 20 25 30 Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln 35 40 45 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 50 55 60 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 65 70 75 80 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 85 90 95 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 100 105 110 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 115 120 125 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 130 135 140 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 145 150 155 160 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 165 170 175 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 180 185 190 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 195 200 205 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 210 215 220 Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 225 230 235 240 Leu Ser Leu Gly Lys Ser Pro Lys Ala Gln Ala Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ala Lys 260 265 270 Ala Ser Ala Pro Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ala Gly Leu Leu 275 280 285 Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu 290 295 300 Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly 305 310 315 320 Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu 325 330 335 Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Cys Leu Glu Leu 340 345 350 Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu 355 360 365 His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu 370 375 380 Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe 385 390 395 400 Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly 405 410 415 Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr 420 425 430 Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Cys Pro Glu Ile Pro 435 440 445 Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 450 455 460 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Gln Glu Glu Arg Asp Pro Ala 465 470 475 480 Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln 485 490 495 Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly 500 505 510 Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr 515 520 525 Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Cys 530 535 540 Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser 545 550 555 560 Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala 565 570 575 Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn 580 585 590 Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln 595 600 605 Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp 610 615 620 Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Cys Pro 625 630 635 640 Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Ser Gly 645 650 655 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Gln Glu Glu Arg 660 665 670 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 675 680 685 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 690 695 700 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 705 710 715 720 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 725 730 735 Phe Phe Cys Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 740 745 750 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 755 760 765 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 770 775 780 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 785 790 795 800 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 805 810 815 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 820 825 830 Val Cys Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 835 840 845 <210> 20 <211> 1088 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA-hyFc-4-1BBLM <400> 20 Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr 20 25 30 Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala 145 150 155 160 Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 225 230 235 240 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ser 260 265 270 His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 275 280 285 Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 290 295 300 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 305 310 315 320 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 325 330 335 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 340 345 350 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 355 360 365 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 370 375 380 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 385 390 395 400 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 405 410 415 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 420 425 430 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 435 440 445 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 450 455 460 Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 465 470 475 480 Ser Leu Ser Leu Gly Lys Ser Pro Lys Ala Gln Ala Gly Gly Gly Gly 485 490 495 Ser Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Ala 500 505 510 Lys Ala Ser Ala Pro Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ala Gly Leu 515 520 525 Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val 530 535 540 Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala 545 550 555 560 Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu 565 570 575 Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Cys Leu Glu 580 585 590 Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala 595 600 605 Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala 610 615 620 Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala 625 630 635 640 Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu 645 650 655 Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu 660 665 670 Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Cys Pro Glu Ile 675 680 685 Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser 690 695 700 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Gln Glu Glu Arg Asp Pro 705 710 715 720 Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala 725 730 735 Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro 740 745 750 Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp 755 760 765 Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe 770 775 780 Cys Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val 785 790 795 800 Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala 805 810 815 Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg 820 825 830 Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly 835 840 845 Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala 850 855 860 Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Cys 865 870 875 880 Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu Gly Gly Ser 885 890 895 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Glu Gln Glu Glu 900 905 910 Arg Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln 915 920 925 Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr 930 935 940 Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr 945 950 955 960 Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr 965 970 975 Val Phe Phe Cys Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser 980 985 990 Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala 995 1000 1005 Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser 1010 1015 1020 Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu 1025 1030 1035 1040 Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala 1045 1050 1055 Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe 1060 1065 1070 Arg Val Cys Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 1075 1080 1085 <210> 21 <211> 666 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA-hyFc-4-1BBL <400> 21 Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Phe Asp Phe Thr Thr 20 25 30 Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Glu Ile His Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe 85 90 95 Cys Ala Ser Leu Tyr Phe Gly Phe Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala 145 150 155 160 Ser Gln Asp Val Gly Thr Ser Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Thr Ser Thr Arg His Thr Gly 180 185 190 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe 195 200 205 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln Tyr Ser Leu Tyr Arg Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 225 230 235 240 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ser 260 265 270 His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 275 280 285 Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 290 295 300 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 305 310 315 320 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 325 330 335 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 340 345 350 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 355 360 365 Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 370 375 380 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn 385 390 395 400 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 405 410 415 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 420 425 430 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg 435 440 445 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys 450 455 460 Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 465 470 475 480 Ser Leu Ser Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ala Gly Leu 485 490 495 Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val 500 505 510 Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala 515 520 525 Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu 530 535 540 Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu 545 550 555 560 Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala 565 570 575 Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala 580 585 590 Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala 595 600 605 Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu 610 615 620 Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu 625 630 635 640 Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile 645 650 655 Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 660 665 <210> 22 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(Q146C/T241C) extracellular domain <400> 22 Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala 35 40 45 Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro 50 55 60 Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp 65 70 75 80 Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe 85 90 95 Cys Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val 100 105 110 Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg 130 135 140 Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly 145 150 155 160 Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala 165 170 175 Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Cys 180 185 190 Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 195 200 205 <210> 23 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(Q146C/T241C) extracellular core domain <400> 23 Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln 1 5 10 15 Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly 20 25 30 Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr 35 40 45 Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Cys 50 55 60 Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser 65 70 75 80 Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala 85 90 95 Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn 100 105 110 Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln 115 120 125 Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp 130 135 140 Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 145 150 155 <210> 24 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(A232C/I244C) extracellular domain <400> 24 Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala 35 40 45 Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro 50 55 60 Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp 65 70 75 80 Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe 85 90 95 Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val 100 105 110 Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg 130 135 140 Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly 145 150 155 160 Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala 165 170 175 Trp Gln Leu Thr Gln Gly Cys Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr 180 185 190 Pro Glu Cys Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 195 200 205 <210> 25 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(A232C/I244C) extracellular core domain <400> 25 Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln 1 5 10 15 Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly 20 25 30 Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr 35 40 45 Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln 50 55 60 Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser 65 70 75 80 Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala 85 90 95 Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn 100 105 110 Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln 115 120 125 Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp 130 135 140 Gln Leu Thr Gln Gly Cys Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 145 150 155 <210> 26 <211> 205 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(V140C/F199C) extracellular domain <400> 26 Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro 20 25 30 Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala 35 40 45 Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro 50 55 60 Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp 65 70 75 80 Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Cys Tyr Tyr Val Phe Phe 85 90 95 Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val 100 105 110 Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala 115 120 125 Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg 130 135 140 Asn Ser Ala Phe Gly Cys Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly 145 150 155 160 Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala 165 170 175 Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr 180 185 190 Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 195 200 205 <210> 27 <211> 157 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(V140C/F199C) extracellular core domain <400> 27 Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln 1 5 10 15 Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly 20 25 30 Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr 35 40 45 Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Cys Tyr Tyr Val Phe Phe Gln 50 55 60 Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser 65 70 75 80 Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala 85 90 95 Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn 100 105 110 Ser Ala Phe Gly Cys Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln 115 120 125 Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp 130 135 140 Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 145 150 155 <210> 28 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(Q146C/T241C) extracellular core domain(deletion of N,C-terminal amino acid residues) <400> 28 Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn 1 5 10 15 Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu 20 25 30 Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys 35 40 45 Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Cys Leu 50 55 60 Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu 65 70 75 80 Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu 85 90 95 Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser 100 105 110 Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg 115 120 125 Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln 130 135 140 Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe 145 150 155 <210> 29 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(A232C/I244C) extracellular core domain(deletion of N,C-terminal amino acid residues) <400> 29 Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn 1 5 10 15 Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu 20 25 30 Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys 35 40 45 Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu 50 55 60 Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu 65 70 75 80 Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu 85 90 95 Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser 100 105 110 Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg 115 120 125 Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln 130 135 140 Leu Thr Gln Gly Cys Thr Val Leu Gly Leu Phe 145 150 155 <210> 30 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(V140C/F199C) extracellular core domain(deletion of N,C-terminal amino acid residues) <400> 30 Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn 1 5 10 15 Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu 20 25 30 Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys 35 40 45 Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Cys Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu 50 55 60 Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu 65 70 75 80 Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu 85 90 95 Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser 100 105 110 Ala Phe Gly Cys Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg 115 120 125 Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln 130 135 140 Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe 145 150 155 <210> 31 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL N-terminal extension domian <400> 31 Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro 20 25 30 Ala Gly <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL C-terminal extension domian <400> 32 Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 1 5 10 15 <210> 33 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(Q146C/T241C) fragment(deletion of N-termianl amino acid residues) <400> 33 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 1 5 10 15 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 20 25 30 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 35 40 45 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 50 55 60 Phe Phe Cys Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 85 90 95 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 100 105 110 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 115 120 125 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 130 135 140 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 145 150 155 160 Val Cys Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 165 170 175 <210> 34 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(A232C/I244C) fragment(deletion of N-termianl amino acid residues) <400> 34 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 1 5 10 15 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 20 25 30 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 35 40 45 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 50 55 60 Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 85 90 95 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 100 105 110 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 115 120 125 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 130 135 140 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Cys Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 145 150 155 160 Val Thr Pro Glu Cys Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 165 170 175 <210> 35 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(V140C/F199C) fragment(deletion of N-termianl amino acid residues) <400> 35 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 1 5 10 15 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 20 25 30 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 35 40 45 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Cys Tyr Tyr Val 50 55 60 Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 85 90 95 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 100 105 110 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Cys Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 115 120 125 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 130 135 140 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 145 150 155 160 Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 165 170 175 <210> 36 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(Q146C/T241C) fragment(deletion of N-termianl amino acid residues) <400> 36 Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg 1 5 10 15 Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp 20 25 30 Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu 35 40 45 Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala 50 55 60 Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Cys Leu Glu Leu Arg Arg Val 65 70 75 80 Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln 85 90 95 Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp 100 105 110 Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln 115 120 125 Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu 130 135 140 His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala 145 150 155 160 Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Cys Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu 165 170 175 Pro Ser Pro Arg Ser Glu 180 <210> 37 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(A232C/I244C) fragment(deletion of N-termianl amino acid residues) <400> 37 Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg 1 5 10 15 Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp 20 25 30 Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu 35 40 45 Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala 50 55 60 Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val 65 70 75 80 Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln 85 90 95 Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp 100 105 110 Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln 115 120 125 Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu 130 135 140 His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Cys 145 150 155 160 Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Cys Pro Ala Gly Leu 165 170 175 Pro Ser Pro Arg Ser Glu 180 <210> 38 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(V140C/F199C) fragment(deletion of N-termianl amino acid residues) <400> 38 Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg 1 5 10 15 Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp 20 25 30 Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu 35 40 45 Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala 50 55 60 Lys Ala Gly Cys Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val 65 70 75 80 Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln 85 90 95 Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp 100 105 110 Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Cys Gln 115 120 125 Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu 130 135 140 His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala 145 150 155 160 Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu 165 170 175 Pro Ser Pro Arg Ser Glu 180 <210> 39 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(Q146C/T241C) fragment(deletion of N-termianl amino acid residues) <400> 39 Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala 1 5 10 15 Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln 20 25 30 Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly 35 40 45 Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr 50 55 60 Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Cys 65 70 75 80 Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser 85 90 95 Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala 100 105 110 Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn 115 120 125 Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln 130 135 140 Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp 145 150 155 160 Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Cys Pro 165 170 175 Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 180 185 <210> 40 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(A232C/I244C) fragment(deletion of N-termianl amino acid residues) <400> 40 Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala 1 5 10 15 Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln 20 25 30 Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly 35 40 45 Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr 50 55 60 Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln 65 70 75 80 Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser 85 90 95 Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala 100 105 110 Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn 115 120 125 Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln 130 135 140 Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp 145 150 155 160 Gln Leu Thr Gln Gly Cys Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro 165 170 175 Glu Cys Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 180 185 <210> 41 <211> 188 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(V140C/F199C) fragment(deletion of N-termianl amino acid residues) <400> 41 Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala 1 5 10 15 Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln 20 25 30 Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly 35 40 45 Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr 50 55 60 Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Cys Tyr Tyr Val Phe Phe Gln 65 70 75 80 Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser 85 90 95 Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala 100 105 110 Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn 115 120 125 Ser Ala Phe Gly Cys Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln 130 135 140 Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp 145 150 155 160 Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro 165 170 175 Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 180 185 <210> 42 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(Q146C/T241C) fragment(deletion of N,C-termianl amino acid residues) <400> 42 Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp 1 5 10 15 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 20 25 30 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 35 40 45 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 50 55 60 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 65 70 75 80 Phe Phe Cys Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 85 90 95 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 100 105 110 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 115 120 125 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 130 135 140 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 145 150 155 160 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 165 170 175 Val Cys Pro Glu Ile Pro Ala Gly 180 <210> 43 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(A232C/I244C) fragment(deletion of N,C-termianl amino acid residues) <400> 43 Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp 1 5 10 15 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 20 25 30 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 35 40 45 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 50 55 60 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 65 70 75 80 Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 85 90 95 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 100 105 110 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 115 120 125 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 130 135 140 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 145 150 155 160 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Cys Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 165 170 175 Val Thr Pro Glu Cys Pro Ala Gly 180 <210> 44 <211> 184 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> human 4-1BBL mutein(V140C/F199C) fragment(deletion of N,C-termianl amino acid residues) <400> 44 Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp 1 5 10 15 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 20 25 30 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 35 40 45 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 50 55 60 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Cys Tyr Tyr Val 65 70 75 80 Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 85 90 95 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 100 105 110 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 115 120 125 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Cys Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 130 135 140 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 145 150 155 160 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 165 170 175 Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly 180

Claims (17)

  1. 하기 구조식 1 또는 구조식 2의 융합단백질로서,
    [구조식 1]
    N′-A-L1-B-L2-C-L3-D-C′
    [구조식 2]
    N′-B-L1-A-L2-C-L3-D-C′
    상기 N′은 융합단백질의 N-말단이고,
    상기 C′는 융합단백질의 C-말단이며,
    상기 A는 종양 관련 항원(tumor-associated antigen)에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv(Single-chain variable fragment)이고,
    상기 B는 PD-L1(Programmed death-ligand 1)에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv이며,
    상기 C는 면역글로불린의 Fc 도메인, 이의 단편 또는 이의 변이체이고,
    상기 D는 4-1BBL, 이의 단편 또는 이의 변이체이며,
    상기 L1, L2 및 L3는 각각 펩타이드 링커인 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 A는 CEA, AFP 및 MUC1 이들로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 종양 관련 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv인 것인, 융합단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 A는 CEA에 특이적으로 결합하는 항체의 scFv인 것인, 융합단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 A는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 것인, 융합단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 B는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 C는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 4-1BBL의 변이체 또는 이의 단편은 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열에서 146/241, 232/244 또는 140/199 위치에 상응하는 아미노산이 시스테인으로 치환된 것인, 융합단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 4-1BBL 변이체의 단편은 변이된 4-1BBL의 세포외영역인 것인, 융합단백질.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 D는 서열번호 22 내지 44 중 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합단백질.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 L1, L2 및 L3은 각각 1 내지 50개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커인, 융합단백질.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 L1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합단백질.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 L2는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합단백질.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 L3은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합단백질.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합단백질 2개가 결합된 융합단백질 이량체.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 융합단백질 또는 제15항의 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 약학 조성물.
KR1020200011983A 2020-01-31 2020-01-31 항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 4-1bbl을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 KR20210098147A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200011983A KR20210098147A (ko) 2020-01-31 2020-01-31 항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 4-1bbl을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200011983A KR20210098147A (ko) 2020-01-31 2020-01-31 항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 4-1bbl을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210098147A true KR20210098147A (ko) 2021-08-10

Family

ID=77315966

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200011983A KR20210098147A (ko) 2020-01-31 2020-01-31 항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 4-1bbl을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20210098147A (ko)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK3030575T3 (en) IL-15 AND IL-15R-ALFA-SUSHI DOMAIN-BASED MODULOKINES
KR20240027854A (ko) Tgf-β-수용체 엑토도메인 융합 분자 및 그의 용도
KR102038675B1 (ko) IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인, 이를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 제조방법
JP2022528030A (ja) 多機能性融合タンパク質及びその使用
KR102070016B1 (ko) 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 t 세포
WO2019128994A1 (zh) 稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途
KR102216225B1 (ko) 메소텔린 특이적인 키메라 항원 수용체 및 이를 발현하는 t 세포
KR20160016725A (ko) 암 세포에 과발현되는 IL13Rα2에 특이적으로 결합하는 키메라 항원 수용체로 변형된 T 세포
KR102313505B1 (ko) 항-lag-3 항체 및 il-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
KR20210065887A (ko) Il-2 단백질 및 cd80 단백질을 포함하는 융합단백질 및 면역관문 억제제를 포함하는 암 치료용 약학 조성물
KR102559355B1 (ko) 항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 il-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
KR102038672B1 (ko) IgE Fc 수용체의 알파 서브유닛의 세포외 도메인을 포함하는 약학적 조성물
WO2023136518A1 (ko) Cd80 세포외도메인 및 항 lag3 항체 단편을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
KR20170138569A (ko) 용해성 키메라 인터루킨-10 수용체 및 이의 치료학적 용도
KR20210098147A (ko) 항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 4-1bbl을 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
KR20220020229A (ko) Il-12 및 항-cd20 항체를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
KR20210098149A (ko) 항-taa 항체, 항-pd-l1 항체 및 il-15를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
CN114616247A (zh) Ox40/pd-l1双特异性抗体
WO2023011662A1 (zh) 抗Her-2抗体-粒细胞调节因子融合蛋白及其制法和应用
EP4183803A1 (en) Fusion protein comprising ige fc receptor alpha subunit extracellular domain and anti-il-4r antibody, and use thereof
CN110339364B (zh) Lgr4/rspo阻断剂与抗免疫检查点抑制剂联合用于肿瘤的免疫治疗
AU2022350320A1 (en) Fusion protein dimer including pd-1 and il-21, and use thereof
KR20230044131A (ko) Pd-1 및 il-15를 포함하는 융합단백질 이량체 및 이의 용도
EP4122953A1 (en) Fusion protein comprising il-2 protein and cd80 protein fragment or variant thereof, and uses thereof
KR20210150993A (ko) Pa63 도메인 4 변이체를 세포외 결합 도메인으로 포함하는 키메라 항원 수용체 및 이의 용도