KR20170138569A - 용해성 키메라 인터루킨-10 수용체 및 이의 치료학적 용도 - Google Patents

용해성 키메라 인터루킨-10 수용체 및 이의 치료학적 용도 Download PDF

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메디오라늄 파마세우티시 에스.피.에이.
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Abstract

인터루킨 10의 키메라 용해성 수용체 및 전신성 홍반성 루푸스와 같은, 인터루킨 10의 높은 생산을 특징으로 하는 질병의 치료에 및 종양의 치료에서 이의 용도.

Description

용해성 키메라 인터루킨-10 수용체 및 이의 치료학적 용도
본 발명은 인터루킨 10 (IL 10)과 숙주의 세포 상에 위치하는 이의 수용체 사이에 상호작용을 차단할 수 있은 낮은 면역원성 (immunogenicity)을 특징으로 하는 IL 10에 대한 새로운 용해성 키메라 수용체에 관한 것으로, 특히 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)와 같은, 인터루킨 10의 높은 수준의 생산을 특징으로 하는 병리를 치료뿐만 아니라 종양을 치료하는데 유용한 용해성 키메라 수용체에 관한 것이다.
종래의 종양 치료법은:
1) 수술에 의한 종양의 절제,
2) 화학 요법, 방사선 요법 및 면역요법에 의한 종양의 파괴를 포함한다. 지금까지 적용된 면역요법에 대한 접근법은:
1) 다른 메커니즘으로 종양 세포의 용해를 매개할 수 있는 항체의 주사,
2) 항-종양 면역 반응을 잠재적으로 활성화시킬 수 있는 시토카인 (cytokine)의 주입,
3) 잠재적으로 종양을 직접 죽일 수 있는 림프구 (lymphocytes)의 주입;
4) 종양-유도 세포 펩티드, 단백질 또는 용해물 (lysate)을 이용한 면역화 (Immunization);
5) 종양 (TAA)과 관련된 항원을 암호화하는 유전자 (DNA 또는 RNA 형태)로 면역화;
6) 특이적 생물학적 제제 (항-CTLA4, 항 PD1, 항 PD1-리간드 항체)를 통한 면역-조절 기능의 억제를 포함한다.
그럼에도 불구하고, 종래의 치료법은, 조직학적 유형 (histological type) 또는 종양 단계와 관련하여, 다양한 결과를 야기한다. 후속 치료법의 타입과는 관계없이, 면역요법과 관련하여, 불만족스러운 결과는 얻어진다 (B-세포 림프종 및 유방암과 같은, 특정 질병에서 단일클론 항체의 사용과 관련된 유일한 예외로, 다른 임상 프로토콜에서 20-30%의 임상 반응).
전반적으로, 지금까지 종양에 대해 사용된 치료상의 무기 (therapeutic arsenal)는, 건강한 개인이 종양의 출현 또는 진행을 방지하는 면역학적 조절의 정상적인 과정을 가능하게 하지 않는, 암을 파괴할 목적을 갖는 약제의 사용을 통한 공격적인 교묘한 조치로 주로 이루어진다.
종양의 완전한 제거가 생물학적 성질의 여러 이유에 기인하여 거의 달성할 수 없기 때문에, 생존한 종양 세포는, 종양 환자들이 치료를 받고 있음에도, 대부분 종양 환자의 몸에 남아 있다. 사실상 이들 세포는, 종양-의존 생물학적 요인 및 전술된 항-종양 치료법 모두에 의해 여전히 무력화된 면역 시스템을 회피하는 능력 (capacity)을 유지하고: 따라서, 이들은 종양의 재발 및 진행을 유도할 수 있다. 실제로, 만약 종양이 정상 자가조직 세포 (autologous cells)와 관련하여 형태학적, 표현형 및 기능적 관점으로부터 실질적인 변형을 유도하는 비정상 유전자를 갖더라도, 이들은 면역학적 감시 (immunological surveillance)를 피한다. 이 현상은, 종양이 종양-연관 항원 (TAAs)을 발현하고, 종양-특이 T-림프구에 의해 침윤되는 사실을 고려해 볼 때 더욱 놀라운 것이다. 종양에 의한 면역 회피를 확인하는 데 기여하는 다양한 알려진 생물학적 메커니즘 중에서, 조절 T-림프구의 활성은 중요한 역할을 갖는다 - 이들은 종양 부위에서 IL 10을 분비한다. 후자 현상을 중화시키기 위해, 종양 부위에서 조절 T-림프구 (regulatory T-lymphocytes)의 활성을 억제할 수 있는 분자를 제공할 필요가 있다. 이러한 분자의 투여는, 종양의 면역 회피를 제한하고 및 숙주의 면역 시스템이 효과적인 항-종양 반응성을 회복하는 것을 가능하게 할 것이다.
전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE) 치료의 현재 치료법과 관련하여, 이것은, 작용 메커니즘 (action mechanism)에 관련하여 특이성을 갖지 않고, 및 부가적으로 심각한 다양한 부작용을 유발할 수 있는, 약물인, 스테로이드 및 면역억제제 (immunosuppressants)의 투여로 이루어진다. 좀 더 최근의 치료법은, 항 Blys 인간 (human) 항체인, Belimumab, 즉, B-림프구의 활성화를 억제할 수 있는 치료제의 투여를 제공한다.
다른 자가면역 병리와 마찬가지로, SLE는, 전신 염증 과정의 결과적 활성화 (consequent activation)로 자가항체의 과다생산을 유발하는 IL-10의 증가된 분비 및 B-림프구의 비정상적인 면역 반응을 특징으로 한다 (Llorente 등의, "In vivo production of interleukin-10 by non T-cell in rheumatoid arthritis, Sjogren' syndrome and systemic lupus erythematosus: a potential mechanism of B-lymphocyte hyperactivity and autoimmunity" Arthritis Rheum, 1994; 37: 1647-55"). 항-IL-10 단일클론 항체로 SLE에 의해 영향을 받은 환자의 치료가 유익하고 유리한 치료 효과를 갖는 것은 흥미로운 일이다 (Llorente L. 등의, "Clinical and biological effects of antiinterleukin 10 monoclonal antibody administration in systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum.2000; 43: 1790-1800). 따라서, 예를 들어, IL-10의 중화를 통해, 자가항체의 생산을 감소시킬 수 있는 치료제를 제공할 필요가 있다.
항-IL 10 면역접합체 (immunoadhesin), 즉, 면역글로불린 (Ig)의 단백질 Fc 및 IL-10 수용체의 알파 사슬에 의해 구성된 융합 단백질 (fusion protein)의 발생은, 이전에 설명되어 있다 (Terai M. 등의 "Human intertleukin 10 receptor 1/IgG1-Fc fusion proteins for human IL-10 with therapeutic potential" Cancer Immunol. Immunother. 2009 Aug.; 58(8): 1307-17 EPUB.2009 Jan 14).
이 융합 단백질은 이것이 IgG1의 부분 Fc를 함유하는 사실로 인해 유발된 일련의 단점을 갖는다.
실제로, 면역글로불린은, 면역 시스템의 대부분의 세포에 존재하는 이의 수용체에 (항체-의존적 세포내 세포독성-ADCC) 또는 보체에 (보체-의존적 세포독성-CDC) Fc의 결합에 의해 매개되는 면역/염증 반응을 일으킬 수 있다. 이것은 생성물 (product)의 안전성 및 내약성 (tolerability)에 상당한 영향을 미칠 수 있은 부수적인 면역/염증 반응을 초래할 수 있다. (Antibody Fc: Linking Adaptive and Innate Immunity, Margaret Ackerman and Falk Nimmerjahn, Academic Press 2014; Kapur R, Einarsdottir HK, Vidarsson G: IgG-effector functions: "the good, the bad and the ugly". Immunol Lett. 2014 Aug;160(2):139-44; Karsten CM, Kohl J: The immunoglobulin, IgG Fc receptor and complement triangle in autoimmune diseases. Immunobiology. 2012 Nov; 217(11):1067-79; Dijstelbloem HM, van de Winkel JG, Kallenberg CG: Inflammation in autoimmunity: receptors for IgG revisited. Trends Immunol. 2001 Sep;22(9):510-6).
본 발명자가 발명자 중 일부인 US 20090111146호에서, 인간 항체의 불변 영역 (constant region)이 IL-10의 세포외 영역 (extracellular region)과 융합되는 융합 단백질은 기재되어 있다. 인간 항체의 불변 영역에 의해, 이는, 특히, 하기 부류 중에서 선택된 IgG의 의도된 불변 영역이다;
a) Fc 부분,
b) CH2 및 CH3를 포함하는 영역,
c) 힌지부 (hinge part)인, CH2 및 CH3을 포함하는 영역,
d) CH1-CH3가 연결된 영역,
e) 상기 영역 a) 내지 d) 중 하나에서 1 또는 몇 개의 아미노산의 결손, 부가, 치환 또는 삽입되어 불변 영역으로서 기능하는 영역.
또한, 이 융합 폴리펩티드 타입은 상관 IL-10 질환에 사용될 수 있다. 특히, 융합 단백질에서 IL-10 수용체의 세포외 영역은 다음과 융합된다:
a1) 힌지 영역의 결손이 실행된 IgG1의 불변 영역, 또는
a2) 다이머 (dimer) (이들 분자는 세포독성 T 세포의 활성화를 촉진하는데 사용될 수 있음)를 형성하지 않는 방식으로 힌지 영역에 시스테인의 돌연변이에 의해 발생된, 돌연변이된 힌지 영역을 갖는, IgG1의 불변 영역.
이러한 타입의 융합 단백질은 암을 치료하는데 사용될 수 있지만, 이들의 사용은, 단편 Fc 또는 중쇄가 Fc에 함유된 CH1-CH3을 변화시키는 것처럼 (상기 참조), 본질적으로 전-염증성 분자 부분의 존재와 관련된 부작용의 유도의 고위험에 잠재적으로 대상이 된다. 이러한 분자에 의해 잠재적으로 유도되는 부수적인 및 전신 면역/염증 반응은, 생성물의 안전성과 내약성에 상당한 영향을 줄 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, IL-10이 병원성 수가 (pathogenic valence)를 갖고, 및 전술된 알려진 IL-10의 억제제의 단점을 갖지 않는, 모든 타입의 병리에 대해 치료학적으로 효과적인 제제로 특히 사용될 IL-10의 억제제의 발생에 있다.
본 발명의 목적은 또한 종양의 치료에서 이러한 IL-10의 억제제의 사용에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 SLE의 치료에 이러한 IL-10의 억제제를 사용에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 인간 분자에 함유되지 않은 아미노산 서열의 일부 또는 항체의 일부와 같이, 잠재적으로 염증/면역 현상을 유도할 수 있는 분자 부분을 갖지 않는 (그러므로 실질적으로 돌연변이 또는 외인성 분자를 수반하지 않는) IL-10의 억제제를 발생시키는 데 있다. 이는 이의 완전한 내약성을 보장하고 및 부작용의 유발과 관련된 위험을 제거하기 위한 것이다.
본 발명의 전술한 목적은, 세포 표면상에 존재하는 천연 수용체에 IL-10의 결합을 길항시킬 수 있는 키메라 (chimeric) 융합 단백질 알부민-IL 10 수용체의 발생에 의해 달성된다.
융합 폴리펩티드 내에 알부민의 존재는 이 분자에 안정성 및 용해성을 부여한다. 부가적으로, 본 발명의 목적인, 융합 단백질에 대하여 면역 반응을 일으킬 위험을 피하기 위해, 분자는 동질유전자적 개체 (syngeneic individuals)에서 면역원성이 거의 없다.
본 발명의 또 다른 목적은, 전술된 융합 단백질을, 약물, 특히 상관 IL-10 질환을 억제하기 위한 약물로서 사용하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 전술된 용해성 키메라 융합 단백질 알부민-IL 10을 종양의 치료에 사용하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 전술된 융합 단백질을 SLE의 치료에 사용하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 이 융합 단백질을 암호화하는, 폴리뉴클레오티드 구조체 (polynucleotide construct), 바람직하게는 유전자에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 전술된 유전자를, 약물, 특히 IL-10에 의해 매개되는 질병을 억제하기 위한 약물로서 사용하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 전술한 유전자를 종양의 치료에 사용하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 전술한 유전자를 SLE의 치료에 사용하는 데 있다.
도 1은 종양-침윤 림프구 (tumor-infiltrating lymphocytes)의 표현형 및 기능적 분석을 나타낸다. y-축은 22명의 환자로부터 분리된 종양이 침윤된 림프구 모집단에 존재하는 각각의 T 세포의 서브모집단: CD8+, CD8+CD28+, CD8+CD28-, CD4+, CD4+CD25+의 개별적인 퍼센트 농도를 나타낸다. 상기 도면은 또한 평균 퍼센트들 사이에 상당한 차이를 보고한다.
도 2는 항-CD3 단일클론 항체 (mAb)에 의해 유도된 T 세포 증식의 억제 분석에서 시험된, 23명의 환자로부터 분리된 종양이 침윤된 T 세포들 CD8+CD28+, CD8+CD28- (좌측 그래프)에 의해 수행된 면역억제 활성을 보고한다. 데이터는 단일 공배양 (cocultures)에서 분당 카운트 (cpm)로 표시되고 및 베타-카운터 (beta-counter)로 판독하며 및 증식하는 세포에서 3H-티미딘 (3H-Thymidine)의 혼입을 통해 측정된 CD3-유도 증식 활성의 억제의 퍼센트로서 표시된다. 우측 그래프는 5명의 환자에서 유래하는 종양이 침윤된 T 세포 CD4+CD25+의 면역억제 기능을 나타낸다. IL-10의 생물학적 활성을 중화시키는 단일클론 항체 (mAb)에 의한 억제 활성 (suppressive activity)의 억제 (inhibition)는, 림프구 TregCD8+CD28- (좌측 그래프)로 수행된 기능 시험의 경우에만 보고된다.
도 3은, T 세포 CD28+CD28-의 존재 또는 부재하에, 두 환자의 원발성 종양 (primary tumors)으로부터 유래된, 펩티드 p540으로 펄스된 T2 세포와 비교하여 텔로머라아제 (telomerase)의 펩티드 p540에 특이적인 세포주 CTL의 세포독성 활성의 억제를 나타낸다. T 림프구 CD28+CD28-를 함유하는 배양 (cultures)은, T 림프구 CD28+CD28-를 표적 세포 (target cells) (종양주 (tumor line) T2) 및 세포독성 림프구로부터 분리하기 위해 "트랜스웰 (transwell)" 플레이트에서 수행된다. a) CTL + 비-펄스된 T2 세포, b) CTL + 펩티드 p540으로 펄스된 T2 세포, c) CTL + 펩티드 p540으로 펄스된 T2 세포 + CD28+CD28-, d) CTL + 펩티드 p540으로 펄스된 T2 + CD28+CD28- + 항-IL 10mAb; e) CTL + p540으로 펄스된 T2 세포 + CD28+CD28- + 항-IL 10-mAb의 이소타입 대조구 항체 (isotype control antibody).
도 4는 (A) 좌측 그래프: 23명의 환자의 전이성 림프절 또는 6명의 환자의 비-전이성 림프절로부터 정제된 T 세포 CD28+CD28-에 의해 가해진 T 세포의 증식에 대한 면역억제 활성을 나타낸다. (B) 우측 그래프: 6명의 환자의 전이성 림프절 또는 6명의 환자의 비-전이성 림프절로부터 유래된 T 세포 CD24+CD25+.
데이터는 3H-티미딘의 혼입을 통해 측정되고, 공배양에 의해 방출되는 분당 카운트 (cpm)의 베타-카운터를 통해 판독되는, 항-CD3 mAb에 의해 유도된 T 세포 증식의 억제의 퍼센트로서 표시된다.
도 5는, 근육 내 주사 (종양의 투여일로부터 출발하여 7일마다 2x106 DC/mouse x 3회)를 통해 접종된,
Figure pct00001
1x105 B16 흑색종 세포 (대조구 마우스),
Figure pct00002
흑색종의 gp100 항원으로 펄스된 수지상 세포 (dendritic cells: DC)로 처리된 1x105 B16 흑색종 세포,
Figure pct00003
근육 내 주사 (7일마다 2x106 cells/mouse x 3회)를 통해 접종되고 및 시토카인의 생물학적 활성을 차단하는 항-IL-10 mAb로 피하 주사 (종양의 투여일로부터 출발하여 7일마다 150g x 3회)를 통해 주사된, gp100 항원으로 펄스된 DC로 처리된 1x105 B16 흑색종 세포로 마우스에 각각 주사된 흑색종 병변의 평균 면적을 보고한다.
도 6은, 쥐 (murine)의 융합 단백질 IL 10R-알부민을 코딩하는 유전자를 함유하는 pcDNA3.1로 감염된 293T 세포의 용해물 (lysate) (레인 1), 빈 pcDNA3.1 (레인 2) 및 비-감염된 293T 세포의 용해물 (레인 3)의 웨스턴 블롯 (Western Blot)에 의한 분석을 보고한다.
도 7은, 인간 IL 10R-알부민 단백질을 코딩하는 유전자를을 함유하는 pcDNA3.1로 감염된 293T 세포의 용해물 (레인 1); 빈 pcDNA3.1로 감염된 작은 세포 293T의 용해물 (레인 2); 인간 융합 단백질 IL 10R-알부민을 코딩하는 유전자를 함유하는 pcDNA3.1로 감염된 293T 세포의 상층액 (레인 3); 빈 pcDNA3.1로 감염된 세포 293T의 상층액 (레인 4)의 웨스턴 블롯에 의한 분석을 보고한다.
도 8은, 다음으로 각각 주사된 마우스에 관찰된 흑색종 병변의 평균 면적을 보고한다:
Figure pct00004
1x105 B16 흑색종 세포 (대조구 마우스),
Figure pct00005
피내 주사를 통해 주사된 대조구 플라스미드 (plasmid) (pcDNA 3.1)로 처리된 1x105 B16 흑색종 세포 (종양의 투여일로부터 7일마다 100㎍ × 3회);
Figure pct00006
피내 주사된 (종양의 투여일로부터 7일마다 100㎍ x 3회) 본 발명에 따른 키메라 융합 단백질 (pcDNA3.1IL 10R-쥐 혈청 알부민 (MSA))을 코딩하는 플라스미드로 처리된 1x105 B16 흑색종 세포. 상기 도면은 또한 그룹 사이에 상당한 차이를 보고된다.
도 9는 다음으로 주사된 마우스에서 관찰된 흑색종 병변의 평균 면적을 나타낸다:
Figure pct00007
1x105 B16 흑색종 세포 (대조구 마우스),
Figure pct00008
피내 주사된 (종양 투여일로부터 7일마다 100㎍ × 3회) 본 발명에 따른 키메라 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 (pcDNA3.1IL 10R-MSA)로 처리된 1x105 B16 흑색종 세포;
Figure pct00009
근육내 주사를 통해 주입된, 항원 mgp100으로 펄스된 DC로 피내 주사되고 (종양의 투여일로부터 7일마다 2x106 cells/mouse x 3회) 및 피내 주사된 (종양의 투여일로부터 7일마다 100㎍ × 3회) 본 발명에 따른 키메라 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 (pcDNA3.1IL 10R-MSA)로 처리된, 1x105 B16 흑색종 세포;
Figure pct00010
근육 내 주사 (종양의 투여일로부터 7일마다 2x106 cells/mouse x 3회)를 통해 주사된, 항원 mgp100으로 펄스된 DC로 피내 주사된 1x105 B16 흑색종 세포. 상기 도면은 또한 그룹 사이에 상당한 차이를 보고한다.
도 10은,
Figure pct00011
동질유전자적 방광 종양 세포주 MB49 (대조구)의 1x105 세포 (대조구),
Figure pct00012
피내 주사된 (종양의 투여일로부터 시작하여 한 번 투여에서 다음 투여 사이의 7일 간격에서 100㎍ x 3회) 대조구 플라스미드 (pcDNA 3.1)로 처리된 1x105 동질유전자적 방광 종양 MB49,
Figure pct00013
피내 주사된 (종양의 투여일로부터 한 번 투여에서 다음 투여 사이에 간격이 7일로 100㎍ x 3회) 본 발명에 따른 키메라 융합 단백질 (pcDNA3.1IL 10R-MSA)을 코딩하는 플라스미드로 처리된 1x105 동질유전자적 방광 종양 세포 MB49로 주사된 마우스에서 관찰된 병변의 평균 면적을 보고한다. 상기 도면은 또한 그룹 사이의 상당한 차이를 보고한다.
도 11은, DNA (pcDNA3.1IL 10R-MSA)로 백신 접종한 4마리 마우스 및 비-백신 접종된 1마리 마우스 (대조구) 각각의 4x106 비장, 간, 신장 및 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)로부터 추출된 후에 세포 DNA에서 이식유전자-IL 10R-MSA의 검출을 나타낸다:
백신 접종 후 및 및 각각의 상기 DNA의 네스티드 PCR (nested PCR)로 증폭 후, (A) 24시간, (B) 14일, (C) 20일.
도 12a는, 본 발명에 따른 정제된 인간 융합 단백질에 대해 ELISA 시험을 수행하여 얻어진, 도 12b에 보고된 검증 결과를, 설명적인 그래프 형태로 보고한다: 도 12a의 x-축은 IL-10의 농도를 보고하고, y-축은 광학 밀도를 보고한다.
도 13a는, 정제된 쥐 단백질에 대해 수행된 ELISA 시험에 의한 도 13b에 보고된 검증 결과를, 설명적인 형태로 보고하며; 도 13b의 x-축은 IlL-10의 농도를 보고하고, 및 y-축은 광학 밀도를 보고한다.
본 발명의 목적을 위해, 키메라 단백질은, 다수의 다른 단백질의 펩티드 서열의 융합에 유래하는 단백질로 의도된다.
본 발명의 목적을 위해, 폴리뉴클레오티드 구조체는, 서로 다른 다수의 단백질을 코딩하는 다수의 다른 유전자의 융합으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열로 의도된다.
본 발명에 따른 키메라 융합 단백질에서 알부민은, 바람직하게는 포유류 알부민, 좀 더 바람직하게는 인간 및 쥐, 및 더욱 바람직하게는 인간 알부민이다.
본 발명에 따른 융합 단백질 알부민-인터루킨 10 수용체는, 알부민이 IL-10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인에 결합되는 점을 또한 특징으로 하는, 키메라 유전자 생성물이다.
본 발명의 목적인, 융합 단백질이 세포외 도메인 (ECD)만을 함유한다는 사실은 유리한 측면인데, 이는 IL-10 수용체 알파 사슬의 세포질내 부분 (intracytoplasmic portion), 즉, 소수성 아미노산이 풍부한 부분을 함유하지 않기 때문이다. 그러므로, 세포질내 도메인의 부재는, 본 발명의 목적인, 융합 단백질을, IL-10 수용체의 전체 알파 사슬을 함유하는 유사 융합 단백질에 대하여 제한된 크기에 기인하여, 생산 단계 (클로닝) 동안 더 안정되고, 더 용해되며 및 더 높은 수율로 얻을 수 있게 한다. 마지막으로, 세포질내 도메인의 부재는, 단백질의 면역원성을 감소시키고, 따라서 숙주가 본 발명의 융합 단백질에 대하여 면역 반응을 개시하는 위험을 방지한다.
인터루킨 10에 대한 수용체 (IL 10R)는, 두 개의 사슬: IL 10과의 결합을 매개하는 알파 사슬 및 신호를 세포 내부로 전달하는 베타 사슬로 구성된다. 본 발명의 목적이 종양 미세환경 (microenvironment) 내부에서 더 이상 이용 가능하지 않도록 IL-10을 차단하는 것이기 때문에, 알파 서브유닛만이 키메라 구조체에서 클로닝된다.
알부민은, 스페이서 (spacer)에 의해, IL-10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인에 결합되고, 바람직하게는 상기 스페이서는 IgG (면역감마글로불린)의 힌지 영역이다.
IgG는 바람직하게는 포유류 IgG1이고, 좀 더 바람직하게는 인간 및 쥐의 타입, 더욱 바람직하게는 말초 혈액의 림프구에서 유래한다.
IgG, 및 바람직하게는 IgG1의 힌지 영역의 존재는, IL 10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인에 의해 구성된 부분에 유연성을 부여하고, 따라서 이의 상대적인 리간드 (IL-10)와의 결합을 안정화시키고 및 이 상호작용의 친화력/친화성을 증가시킨다.
약물, 특히 상관 IL-10 질병을 억제하기 위한 약물로서 사용을 위한, 본 발명의 목적인, 키메라 융합 단백질 알부민-IL-10 수용체는, 비경구 투여, 바람직하게는 정맥, 또는 심지어 국부적으로, 피내 투여, 피하 투여, 등에 의해 투여될 수 있다.
또한, 전술된 키메라 융합 단백질 알부민-인터루킨 10 수용체를 코딩하는 유전자는, 특히 상관 IL-10 질병을 억제하기 위한 약제로서 사용하기 위해 사용될 수 있으며, 및 이것은 바람직하게는 비경구 투여, 바람직하게는 정맥 내 또는 국소적으로, 바람직하게는 피내 투여, 피하 투여 등에 의해 투여될 수 있다.
키메라 융합 단백질 또는 관련 유전자가 특히 종양 치료에 사용되는 경우, 이들은 전술된 투여 방법에 따라, 비경구, 심지어 국소적으로, 투여될 수 있다.
암 치료법에서, 어떤 경우에, 키메라 융합 단백질 또는 상대 유전자는 사용될 수 있다:
a) 항-암 면역 반응을 증가시키기 위해, 자체적으로 작동. 이는 무엇보다도 질병의 초기 단계에서 권장된다.
b) (다음의 사건: 종양 덩어리의 감소, 사멸 세포에 의한 종양 항원의 대량 방출, 및 괴사성 물질의 축적으로 인한 염증의 재발이 발생하는, 단계 동안에 종양에 대하여 면역 반응을 지원하기 위해) 화학 요법 및/또는 방사선 요법과 조합.
c) 조절/억제 세포의 병행 억제를 통한 내인성 (endogenous) 면역 반응의 유효성을 향상시키기 위한 목적으로, 이들 치료적 접근법의 유효성을 증가시키기 위한 면역요법 프로토콜과 조합.
전신 홍반성 루푸스의 치료에서, 본 발명에 따른 키메라 융합 단백질 알부민-IL 10R은, 그 자체로 또는 통상적인 타입의 치료와 조합하여 전신 정맥내 투여를 통해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 융합 단백질을 암호화하는 유전자의 투여 통해, 종양에 침윤하는 조절 림프구의 면역억제 효과를 감소시키는데 인터루킨 10 억제의 주요 역할 및 생체내 이러한 단백질의 항-종양 유효성을 입증하는, 실험적인 실시 예는 보고된다.
실시 예 1 - 종양-침윤 림프구에 의해 분비된 IL-10의 주요 역할의 입증.
각 환자로부터 사전 동의를 얻은 후, 생검적 샘플 (bioptic samples)은 다양한 기관의 암에 의해 영향을 받는 42명의 환자의 군으로부터 얻어졌고, 이의 특징은 하기의 표 1에 보고되며, 수행된 일련의 실험은 종양-침윤 조절 T-림프구 및 종양 미세환경에서 이에 의해 방출된 IL-10 시토카인의 주요 역할을 입증하기 위해 조정된다.
각 환자로부터 얻은 생물학적 샘플의 임상적 특성 및 정의의 요약
환자 번호 암 임상
상태		 생존
(개월)		 원발성 종양 변병 전이성 림프절* 비-전이성 림프절* PBMC*
1 위 T4 >12 - + - +
2 췌장 T4 >12 - + - +
3 결장-직장 T4 <12 + + - +
4 췌장 T4N2 <12 - + - +
5 결장-직장 T4 >12 - + - +
6 결장-직장 T4N1 >12 + + - -
7 위 T3 >12 + + - +
8 육종 T4 <12 - + - +
9 신장 T4N0 >12 - + + +
10 신장 T1a >12 + + - +
11 결장-직장 T4 <12 + + + +
12 결장-직장 T4 <12 + + - +
13 결장-직장 T4 >12 + - + +
14 결장-직장 T4 >12 + - - +
15 두-경부 T4 <12 - + - +
16 갑상선 T2N2 >12 + + - +
17 결장-직장 T4N0 - - + - +
18 결장-직장 T4N2 <12 + + - +
19 위 T2bN3 >12 + + - +
20 결장-직장 T3N0 <12 + - - +
21 위 T4N3 <12 + + + +
22 결장-직장 T4 >12 + + - +
23 호즈킨 단계 2 >12 - - + +
24 흑색종 T4 <12 - + - +
25 결장-직장 T4N1 <12 + + - +
26 난소 T1N0 >12 + + + +
27 식도 T3N1M1 >12 + - - +
28 난소 T3M1 <12 + - - +
29 결장-직장 T4 <12 + - - +
30 결장-직장 T4 <12 + - - +
31 유방 T4 - + - - +
32 결장-직장 T4 - + + - +
33 폐 T3 - - + - -
34 호즈킨 단계 2 - - + - -
35 전립선 T3 - - + + -
36 호즈킨 단계 3 - - + - -
37 폐 T3 - - + - -
38 두-경부 T4 - - + + -
39 정상피종 T1 - - + - -
40 폐 T2 - - + - -
41 신경-내분비암종 T3 - - + - -
42 비-호즈킨 단계 4 - + - - +
*: 생물학적 물질
+: 이용 가능함
-: 이용 가능하지 않음
실시 예 1A: 종양 환자로부터 유래된 종양-침윤 조절 T-림프구의 개체군의 특성화 (characterization).
표현형 및 기능적인 분석은, 22명의 환자로부터 채취한 생검적 샘플로부터 유래된 종양-침윤 세포에 대해 수행되고, 22명의 환자의 특징은 표 1에 보고된다. 이러한 목적을 위해, 종양 샘플은 적절한 멸균 필터를 사용하여 미세하게 파편화된다. 뒤이어, 얻어진 세포 현탁액은 계층화되고, 피콜 구배 (Ficoll gradient)에서 원심분리된다. 마지막으로, 다른 림프구 서브모집단은, 특이적 항체로 콘쥬게이드된 적절한 자석 볼 (magnetic balls) (Miltenyi Biotech)를 사용하여 면역자기적 "분류 (sorting)" 절차를 통해 정제된다. 침윤 림프구의 면역표현형은 형광색소로 콘쥬게이트된 항 CD4, 항 CD8, 항 CD25, 항 CD28 단일클론 항체로 실행된다. (BD Biosciences)는, 도 1에서 보고된 바와 같이, 종양-침윤 림프구 중에서 2 모집단의 조절 T 림프구 (Treg), 즉 Treg 림프구 CD4+CD25+ 및 CD8+CD28-의 특성화를 가능하게 한다.
실시 예 1B: T 림프구에 대한 종양-침윤 세포의 면역억제 활성의 확인.
종양-침윤 T 세포의 면역억제 활성은, 항-CD3 mAb 항체로 활성화된 말초 혈액 T 림프구의 증식 억제의 분석에서 측정되고, 3H-티미딘 증식 세포의 혼입을 통해 평가되며 및 분당 카운트 (cpm)로 베타-카운터 판독에서 측정된다. 데이터는 항-CD3 mAb의 존재하에 T 세포의 증식의 억제의 퍼센트로서 도 2에 표시된다. 특히, 이 시험은 23명의 환자로부터 얻은, 종양-침윤 T 세포 CD8+CD28+에 의한 것이 아닌, T 세포 CD8+CD28- (도 2, 좌측 그래프)에 의한, 및 5명의 환자로부터 유래된 종양-침윤 T 세포 CD4+CD25+ (도 2, 우측 그래프)에 의한 증식의 억제 활성을 나타낸다. 종양-침윤 Treg 림프구 CD8+CD28-의 이러한 억제 활성은, 항-IL 10mAb 단일클론 항체의 존재하에서 차단된다 (도 2, 좌측 그래프).
실시 예 1C: 종양-특이적 림프구 T의 세포독성 활성에 대한 T 세포 CD8+CD28-의 억제 활성.
종양학적 샘플 (oncological samples)로부터 유래된 세포 모집단 T CD8+CD28-의 조절 기능은 또한 텔로머라아제의 펩티드 p540에 특이적인 인간 세포주 CTL의 세포독성 능력 (cytotoxic capacity)에 관하여 평가된다. 이러한 목적을 위해, 이 세포주 CTL의 세포독성 활성은, HLA-A2-양성 전립선 종양에 의해 발병된 두 명의 환자의 원발성 종양 덩어리로부터 분리된 T reg 세포 CD8+CD28-의 존재 또는 부재하에서 펩티드 p540으로 펄스된 T2 림프모세포 (lymphoblast) 종양주에 속하는 세포에 대하여 시험된다. 종양내 Treg 림프구 CD28+CD28-의 존재하에서 공-배양은, T2 종양주의 표적 세포 및 CTL p540-특이적 림프구로부터 Treg 림프구를 물리적으로 분리하기에 적절한 "트랜스웰" 플레이트에서 수행된다. 하기 공-배양은 그 다음 수행된다:
a) CTL + 비-펄스된 T2 표적 세포, b) CTL + 펩티드 p540으로 펄스된 T2 표적 세포, c) CTL + 펩티드 p540으로 펄스된 T2 표적 세포 + 종양내 Treg CD28+CD28-, d) CTL + 펩티드 p540으로 펄스된 T2 표적 세포 + 종양내 Treg CD28+D28- + 항-IL 10mAb, e) CTL + 펩티드 p540으로 펄스된 T2 표적 세포 + 종양내 Treg CD28+CD28- + 무의미한 특이성을 갖는 이소타입 대조구의 -mAb.
도 3에 보고된 이 실험의 결과는, 세포독성 활성의 억제의 퍼센트로서 표시되며, 및 모집단 Treg CD8+CD28-가 또한 종양-특이적 T 세포의 세포독성 기능에 대하여 억제 활성을 발휘하는 것을 나타낸다.
실시 예 1D: 항 IL-10 mAb 단일클론 항체에 의한 면역억제 활성의 감소.
종양-침윤 Treg 세포의 모집단의 면역억제 활성은, 항-IL 10 단일클론 항체에 의해 저지되며, 따라서 이 시토카인의 분비에 절대적으로 의존한다는 것을 입증한다. Treg CD8+CD28- 및 Treg CD4+CD25+의 축적은, 종양의 침윤이 원발성 종양의 부위 및 전이 부위 모두에 존재하는 곳에서만 확인되기 때문에 절대적으로 종양-의존성인 것으로 보인다. 실제로, 비-전이성 림프절이 아닌, 전이성 림프절만이, 상기 조절 T 세포의 모집단에 의해 침윤된 것으로 확인된다. (도 4 참조)
실시 예 1E: IL-10의 면역억제 활성의 생체내 입증.
1×105 세포의 B15 동질유전자적 흑색종으로 피하 주사된 C57 검정 마우스는, 만약 주사가 복부 지역에서 일어나면, 복부 내장 기관에 인접하여 퍼지는 전이 및 파괴적 국소 침범을 특징으로 하는 매우 공격적 흑색종으로 발달한다. 실질적인 면역요법을 확인할 목적으로, 다음을 포함하는 다양한 전략은 수행된다:
a)
Figure pct00014
흑색종-연관 인간 또는 쥐 항원 gp100를 코딩하는 플라스미드로 유전자 백신 접종;
b)
Figure pct00015
보조제 CpG (시토신-인산염-구아닌)의 존재하에 인간 gp100 (hgp10025 -33) 또는 쥐 (mgp10025-33)로부터 유래된 면역원성 펩티드를 이용한 피하 백신 접종;
c)
Figure pct00016
동일한 면역원성 펩티드 (gp100)로 사전로딩된 수지상 세포 (DC)에 의한 백신 접종.
동질유전자적 및 이종유전자적 상황 모두에서, 펩티드 gp100으로 펄스된 수지상 세포의 백신 접종은, 종양 덩어리의 >50% 감소를 유도하는 가장 방어적인 치료를 결과한다. 후속 실험에서, B16 흑색종 세포로 "공격 (challenge)"에 대상이 된 마우스는, 항 IL-10 mAb의 투여와 연관된 프로토콜 (c)에 따라 면역화되며: 이러한 전략은, 도 5에 보고된 바와 같이, 처리된 마우스의 100%에서 전체 종양 성장을 억제하는데 효과적이다.
선행 연구가 이미 IL-10이, 또 다른 조절 T 세포를 유도할 수 있는, 면역관용성 (tolerogenic) 수지상 세포의 종양내 분화를 일으킨다는 것을 입증했기 때문에 (Guiducci et al., Cancer Res. 2005; 65;3437-3446), 전체적으로, 이 데이터는, IL 10이 면역 감시 (immune surveillance)로부터 종양의 도피 (evasion)를 결정하는데 중요한 역할을 하고, 및 기능적/분자 수준에서 종양내 IL-10의 효과를 차단하는 것을 목표로 하는 전략이 종양의 치료를 위한 효과적인 접근법일 수 있다는 혁신적 발상을 뒤받침한다.
실시 예 2: 융합 단백질의 구조체의 제조:
- 인간 알부민-인간 IgG1의 힌지 영역-인간 IL 10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인.
- 쥐 알부민-쥐 IgG1의 힌지 영역-쥐 IL 10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인.
실시 예 2.1: 플라스미드 구조체 pcDNA 3.1 인간/쥐 알부민-인간/쥐 IgG1의 힌지 영역-인간/쥐 IL 10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인의 제조.
연구용으로 사용되는, 발현 플라스미드 pcDNA-V5-His (Life Technologies)는, 전사 및 번역을 종료하기 위해 요구된 폴리아데닐화 SV40 (polyadenylation SV40)의 분획 및 시토메갈로바이러스 (CMV)의 유전자의 프로모터를 함유하고; 부가적으로, 이것은 또한 유전자 생성물의 발현의 평가 및 정제를 위해 유용한 His 태그 및 에피토프 V5를 함유한다. 진핵 세포에서 클론의 안정한 선택은 G418에 내성이 있는 유전자의 존재에 기인하여 가능하다. 각각 하나의 인간 및 하나의 쥐의, 두 개의 융합 단백질은, ATCC로부터 획득한 각각의 인간 및 쥐 혈청 알부민 cDNA의 클론에, 각각의 인간 및 쥐의, PBMC로부터 유래된 인터루킨 10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인 (ECD)의 cDNA를 결합하여 유전자 조작된다. 두 개의 cDNA는 PBMCs로부터 유래된 각각의 인간 및 쥐 IgG1의 오직 힌지 영역에 의하여 결합된다. 클로닝은 하기의 전략을 사용하여 수행된다: 쥐 인터루킨 10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인 (ECD)의 cDNA는, 삽입된 제한 부위를 갖는 하기의 한 쌍의 프라이머: 5'-TTAGGTACCATGTTGTCGCGTTTGCTCC-3'에 대해 mIL 10R-KpnI 및 5'-GCGGCCGCCTGTACATATGCAAGGCTTACAACC-3'에 대해 mIL 10R NotI rev를 사용하여 PCR에 의해 클론되며, 쥐 혈청 알부민의 cDNA는, 삽입된 제한 부위를 갖는 하기의 한 쌍의 프라이머: 5'-AAGGAAAAAAGCGGCCGCGAAGCACACAAGAG-3'에 대한 MSA-NotI 및 5'-GCTCTAGAGGCTAAGGCGTCTTTG-3'에 대한 MSA-XbaI rev를 사용하여 PCR에 의해 클론된다. 인간 인터루킨 10 수용체의 알파 사슬의 ECD의 cDNA는, 삽입된 제한 부위를 갖는 다음의 한 쌍의 프라이머: 5'-GGTACCATGCTGCCGTGCCTCGTAG-3'에 대한 hIL 10R-KpnI 및 5'-GCGGCCGC TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCACAA-3'에 대한 hIL 10R NotI rev를 사용하여 PCR에 의해 클론되며, 및 인간 혈청 알부민의 cDNA는, 삽입된 제한 부위를 갖는 다음의 한 쌍의 프라이머: 5'-GCGGCCGCGGATGCACACAAGAGTG-3'에 대한 HSA-NotI 및 5'-GGGCCCTTATAAGCCTAAGGCA-3'에 대한 HSA-ApaI rev를 사용하여 PCR에 의해 클론된다. PCR은 Biorad T100 기구상에서 실행된다.
두 유전자의 정확한 정열을 확인하기 위해, 키메라 구조체는 자동 시퀀서 (ABI 3100, Applied Biosystem)로 시퀀싱된다.
실시 예 2.2: 본 발명의 쥐 및 인간 키메라 융합 단백질의 분석 및 특성화
나중에, 유전자 생성물은 다음 작동 모드에 따라 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하고 평가된다: 293T 또는 HEK293 세포는 두 개의 플라스미드인, 각각 쥐 pcDNA3.1 IL 10R-알부민 및 인간 pcDNA3.1 IL 10R-알부민으로 형질감염된다. 전술된 세포 배양으로부터 상대적 용해물 및 상층액은, 환원 상태에서 12.5% SDS-PAGE 겔에 의해 분석되고 및 유전자 생성물에 대한 특이적인 항체 (예를 들어, 쥐 항-CD210 단일클론 항체 및 인간 항-IL 10R 알파 단일클론 항체, 쥐/인간 항 알부민 단일클론 항체)를 사용하여 웨스턴 블롯을 통해 분석된다. (키메라 유전자를 함유하지 않는) "빈" 플라스미드로 형질감염된 및/또는 형질감염되지 않은 세포의 세포 용해물 및 상층액은, 음성 대조구로 동시에 분석된다; 예상된 바와 같이, 키메라 생성물의 존재는 여기에 발견되지 않는다. 이 분석의 결과는 도 6 및 7에 각각 보고된다. 도 6은 쥐 유전자 IL 10R-알부민을 함유하는 플라스미드 pcDNA3.1로 형질감염된 293T 세포의 세포 용해물을 함유하는 레인에서 98 Kd과 동일한 예상된 분자량의 밴드의 존재를 나타내지만, 대조구 용해물이 실행된 레인에서는 존재하지 않는다. 도 7은 인간 유전자 IL 10R-알부민을 함유하는 플라스미드 pcDNA3.1로 형질감염된 293T 세포의 상층액 또는 세포 용해물을 함유하는 레인에서 98 Kd과 동일한 예상된 분자량의 밴드의 존재를 나타내지만, 대조구 용해물 또는 대조구 상층액이 실행된 레인에서는 존재하지 않는다. 종합적으로, 이러한 데이터는 본 발명의 목적인, 각각의 쥐 및 인간의, 키메라 단백질의 존재를, 키메라 유전자 (각각의 인간 및 쥐)를 함유하는 플라스미드로 형질감염된 세포의 용해물 및 상층액에서 확인한다.
실시 예 3: IL 10 수용체의 알파 사슬의 키메라 융합 단백질 알부민-세포외 도메인의 항-종양 활성에 대한 예비 생체내 연구.
실시 예 3.1: 구조체 pcDNA 3.1-쥐 알부민-쥐 IgG1의 힌지 영역-쥐 IL 10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인에 의한 B16 흑색종 종양 세포에 의해 유도된 흑색종에 대한 생체내 항-종양 활성
3 그룹의 C57 검정 마우스는 다음으로 각각 주사된다:
Figure pct00017
1×105 B16 흑색종 세포 (대조구 마우스);
Figure pct00018
피내 주사된 (종양 투여일부터 시작하여 한 번 투여에서 다음 투여 사이의 7일 간격으로 100㎍ × 3회) 대조구 플라스미드 (pcDNA 3.1)로 처리된 1×105 B16 흑색종 세포;
Figure pct00019
피내 주사된 (종양 투여일부터 시작하여 한 번 투여에서 다음 투여 사이의 7일 간격으로 100㎍ × 3회) 본 발명에 따른 키메라 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 (pcDNA3.1IL 10R-MSA)로 처리된 1x105 B16 흑색종 세포.
실험의 과정에서, 종양 병변의 면적은 관찰되고, 동물은, 신생물의 덩어리 (neoplastic mass)의 가장 큰 직경이 2cm 치수에 도달한 경우, 윤리적 규범과 관련하여, 희생된다. 결과는 도 8에 보고된다. 이 도면으로부터 추론되는 바와 같이, 빈 플라스미드의 투여는, 치료되지 않은 대조구 그룹과 관련하여 어떤 의미 있는 차이를 유도하지 못한다 (생존 시간은 2 주 미만). 대조적으로, 본 발명에 따른 키메라 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 구조체로 면역화된 마우스는, 흑색종 성장 곡선의 급격하고 의미 있는 변화를 나타내며, 대조구 마우스의 생존 시간보다 20일 더 긴 생존 시간을 보였다.
실시 예 3.2: 플라스미드 구조체 pcDNA 3.1-쥐 알부민-쥐 IgG1의 힌지 영역-펩티드 mgp100으로 펄스된 수지상 세포로 면역화와 연관된 쥐 IL 10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인의 B16 흑색종 종양 세포의 투여 후, 생체내 항-종양 활성
4 그룹의 C57 검정 마우스는, 다음으로 각각 처리된다:
Figure pct00020
1x105의 B16 흑색종 세포 (대조구 마우스);
Figure pct00021
피내 주사된 (종양 투여일부터 시작하여 한 번 투여에서 다음 투여 사이의 7일 간격으로 100㎍ × 3회) 본 발명에 따른 키메라 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 (pcDNA3.1IL 10R-MSA)의 투여 및 1x105의 B16 흑색종 세포;
Figure pct00022
근육내 주사된 (종양 투여일로 출발하여, 한 번 투여에서 다음 투여 사이의 간격이 7일로 2x106 cells/mouse x 3회) 펩티드 mgp10025 -33으로 펄스된 DC (수지상 세포)의 내피 접종과 연관하여 내피 주사된 (종양의 투여일로부터 출발하여 한 번의 투여에서 다음의 투여 사이의 간격이 7일로 100㎍ x 3회) 본 발명에 따른 키메라 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 (pcDNA3.1IL 10R-MSA)의 투여 및 1x105의 B16 흑색종 세포;
Figure pct00023
근육내 주사된 (종양의 투여일로부터 출발하여, 한 번의 투여에서 다음의 투여 사이의 간격이 7일로 2x106 cells/mouse x 3회) 펩티드 mgp10025 -33으로 펄스된 DC (수지상 세포)의 피내 투여 및 1x105의 B16 흑색종 세포.
실험의 과정에서, 종양 병변의 면적은 관찰되고, 동물은, 신생물의 덩어리의 가장 큰 직경이 2cm 치수에 도달한 경우, 윤리적 규범과 관련하여, 희생된다. 결과는 도 9에 보고된다. 이 데이터로부터, 본 발명의 목적인, 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 구조체로 처리된 마우스가, 펩티드 mgp10025 -33으로 펄스된 수지상 세포로 처리한 후에 얻어진 것에 대해 중첩 가능하게 실행 가능한 종양 성장 곡선을 갖는 것을 결과한다. 이것은 매우 중요한데, 이는 수지상 세포로 백신 접종 프로토콜이 B16 흑색종에 대하여 면역치료 처치법 중 가장 효과적인 것으로 입증되기 때문이며 (20p의 전술된 실시 예 1E, 참조): 따라서, 본 발명의 목적인, 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 구조체로 처리는, 면역치료 처치법 중 최선의 것과 동일한 효과를 나타낸다. 부가적으로, 펩티드 mgp10025 -33으로 펄스된 수지상 세포의 투여와 공동으로, 본 발명의 목적인, 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 구조체로 처리된 마우스는, 주목할만한 병변의 외관이 펩티드 mgp10025 -33으로 펄스된 수지상 세포의 투여만으로 또는 본 발명의 목적인, 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드만으로 처리된 동물에 대해 추가의 주일만큼 지연되기 때문에, 더욱 상당히 느려진 신생물의 성장 곡선을 나타낸다.
Example 3.3: 플라스미드 구조체 pcDNA 3.1-쥐 알부민-쥐 IgG1의 힌지 영역-쥐 IL 10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인의 방광 종양 세포주 M49에 대한 생체내 항-종양 활성.
3개 그룹의 C57 검정 마우스는 각각 다음으로 처리된다:
Figure pct00024
1x105 세포의 동질유전자적 방광 종양 세포주 MB49 (대조구),
Figure pct00025
피내 주사된 (종양 투여일로부터 출발하여 한 번 투여에서 다음 투여 사이의 간격이 7일로 100㎍ × 3회) "빈" 대조구 플라스미드 (pcDNA 3.1)의 투여 및 1x105 동질유전자적 방광 종양 세포주 MB49,
Figure pct00026
피내 주사된 (종양 투여일로부터 출발하여 한 번의 투여에서 다음 투여 사이의 간격이 7일로 100㎍ × 3회) 본 발명에 따른 키메라 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 (pcDNA3.1IL 10R-MSA)의 투여 및 1x105 동질유전자적 방광 종양 세포주 MB49.
실험의 과정에서, 종양 병변의 면적은 관찰되고, 및 동물은, 신생종의 덩어리의 가장 큰 직경이 2cm 치수에 도달한 경우, 윤리적 규범과 관련하여, 희생된다. 결과는 도 10에 보고된다.
이 도면으로부터 추론된 바와 같이, 종양 세포주 M49로 얻은 데이터는 흑색종 세포를 사용하여 얻은 데이터를 재현한다. 실제로, 빈 플라스미드의 투여는, 치료되지 않은 대조구와 관련하여 어떤 의미 있는 차이를 유도하지 않는다 (생존 시간 2주 미만). 대조적으로, 본 발명에 따른 키메라 융합 단백질을 코딩하는 플라스미드 구조체로 면역화된 마우스는, 흑색종 성장 곡선의 급격하고 의미 있는 변화를 나타내며, 대조구 마우스의 생존 시간보다 20일 더 긴 생존 시간을 갖는다.
실시 예 4: 형질전환 B 림프구의 검출.
형질전환 유전자의 지속성 및 조직 분포를 평가할 목적으로, 세포 DNA는, 백신 접종 후 24시간, 14일 및 20일째에, 쥐 알부민-쥐 IgG1의 쥐 힌지 영역-쥐 IL-10 수용체의 알파 사슬의 세포외 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구조체로 정맥 주사하여, 빠른 재관류 (reperfusion) 속도로, 4마리의 백신 접종된 마우스 및 1마리의 백신 접종되지 않은 마우스 (대조구)의 기관 (비장, 신장, 간, 폐)으로부터 및 PBMCs로부터 추출된다. 결과는 도 11에 보고된다. 이러한 도면으로부터 추론된 바와 같이, 접종 후 20일째에, 형질전환 유전자는 더 이상 검출되지 않아, 기관 내에서 이의 반감기는 약 2주임을 입증하였다.
실시 예 5: 본 발명에 따른 인간 키메라 단백질의 정제.
본 발명의 목적인, 두 개의 인간 및 쥐 키메라 단백질은, 인간 및 쥐 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드로 형질감염된, HEK293 및 EXPI-293 세포들의 상층액으로부터 정제된다.
2개의 인간 및 쥐 단백질은, 인간 단백질에 대하여, 2개의 분리된 배치에 대해, 및 쥐 단백질에 대하여 3개의 분리된 배치에 대해, 각각 ELISA 시험을 수행함으로써 확인된다.
인간 키메라 단백질에 대해 수행된 ELISA 시험은, 인간 키메라 단백질이 인간 IL-10을 특이적으로 인식하고, 및 이것이 차례로 HRP (radish peroxidase)로 표지된 항 알부민 인간 항체에 의해 인식된다는 것을 보여준다.
이러한 시험의 결과는 도 12a 및 12b에 각각 보고된다.
이 실험은 형질감염된 세포에 의해 생성된 단백질이 알부민 구조와 관련된 IL-10에 특이적인 수용체 능력을 갖는 키메라 단백질인 것을 보여준다.
유사하게, 도 13a 및 13b에 보고된 쥐 융합 단백질에 대한 ELISA 시험으로 얻어진 결과는, 쥐 단백질이 쥐 인터루킨을 특이적으로 결합시켜, 수용체 유효성을 확인하는 것을 보여준다. 이 경우, 검출은, 쥐 단백질이 히스티딘 코드를 갖기 때문에, HRP로 표지된 항-히스티딘 항체를 통해 수행되었다.
이하, IL 10 인터셉터의 알파 유닛의 ECD 도메인의, 면역감마글로블린의 힌지 영역의, 알부민의 단편, 및 상응하는 폴리뉴클레오티드 구조체의 단편들에 관한 본 발명에 따른 인간 및 쥐 융합 단백질의 서열은 보고된다.
Sequence
--------
<213> OrganismName : human
<400> PreSequenceString :
MLPCLVVLLA ALLSLRLGSD AHGTELPSPP SVWFEAEFFH HILHWTPIPN QSESTCYEVA 60
LLRYGIESWN SISNCSQTLS YDLTAVTLDL YHSNGYRARV RAVDGSRHSN WTVTNTRFSV 120
DEVTLTVGSV NLEIHNGFIL GKIQLPRPKM APANDTYESI FSHFREYEIA IRKVPGNFTF 180
THKKVKHENF SLLTSGEVGE FCVQVKPSVA SRSNKGMWSK EECISLTRQY FTVTNSRV 238
<212> Type : PRT
<211> Length : 238
Sequence Name : human IL 10 R alpha extracellular domain
Sequence
--------
<213> Organism Name : human
<400> Pre Sequence String :
EPKSCDKTHT CPAAA 15
<212> Type : PRT
<211> Length : 12
SequenceName : Human HINGE
Sequence
--------
<213> Organism Name : human
<400> Pre Sequence String :
DAHKSEVAHR FKDLGEENFK ALVLIAFAQY LQQCPFEDHV KLVNEVTEFA KTCVADESAE 60
NCDKSLHTLF GDKLCTVATL RETYGEMADC CAKQEPERNE CFLQHKDDNP NLPRLVRPEV 120
DVMCTAFHDN EETFLKKYLY EIARRHPYFY APELLFFAKR YKAAFTECCQ AADKAACLLP 180
KLDELRDEGK ASSAKQRLKC ASLQKFGERA FKAWAVARLS QRFPKAEFAE VSKLVTDLTK 240
VHTECCHGDL LECADDRADL AKYICENQDS ISSKLKECCE KPLLEKSHCI AEVENDEMPA 300
DLPSLAADFV ESKDVCKNYA EAKDVFLGMF LYEYARRHPD YSVVLLLRLA KTYETTLEKC 360
CAAADPHECY AKVFDEFKPL VEEPQNLIKQ NCELFEQLGE YKFQNALLVR YTKKVPQVST 420
PTLVEVSRNL GKVGSKCCKH PEAKRMPCAE DYLSVVLNQL CVLHEKTPVS DRVTKCCTES 480
LVNRRPCFSA LEVDETYVPK EFNAETFTFH ADICTLSEKE RQIKKQTALV ELVKHKPKAT 540
KEQLKAVMDD FAAFVEKCCK ADDKETCFAE EGKKLVAASQ AALGL 585
<212> Type : PRT
<211> Length : 585
Sequence Name : Human albumin domain
Sequence
--------
<213> Organism Name : human
<400> Pre Sequence String :
atgctgccgt gcctcgtagt gctgctggcg gcgctcctca gcctccgtct tggctcagac 60
gctcatggga cagagctgcc cagccctccg tctgtgtggt ttgaagcaga atttttccac 120
cacatcctcc actggacacc catcccaaat cagtctgaaa gtacctgcta tgaagtggcg 180
ctcctgaggt atggaataga gtcctggaac tccatctcca actgtagcca gaccctgtcc 240
tatgacctta ccgcagtgac cttggacctg taccacagca atggctaccg ggccagagtg 300
cgggctgtgg acggcagccg gcactccaac tggaccgtca ccaacacccg cttctctgtg 360
gatgaagtga ctctgacagt tggcagtgtg aacctagaga tccacaatgg cttcatcctc 420
gggaagattc agctacccag gcccaagatg gcccccgcga atgacacata tgaaagcatc 480
ttcagtcact tccgagagta tgagattgcc attcgcaagg tgccgggaaa cttcacgttc 540
acacacaaga aagtaaaaca tgaaaacttc agcctcctaa cctctggaga agtgggagag 600
ttctgtgtcc aggtgaaacc atctgtcgct tcccgaagta acaaggggat gtggtctaaa 660
gaggagtgca tctccctcac caggcagtat ttcaccgtga ccaactctag agtt 714
<212> Type : DNA
<211> Length : 714
Sequence Name : Nucleotide of human IL 10 R alpha extracellular domain
Sequence
--------
<213> Organism Name : human
<400> Pre SequenceString :
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccagcgg ccgcg 45
<212> Type : DNA
<211> Length : 45
Sequence Name : Nucleotide of human HINGE
Sequence
--------
<213> Organism Name : mouse
<400> Pre Sequence String :
MLSRLLPFLV TISSLSLEFI AYGTELPSPS YVWFEARFFQ HILHWKPIPN QSESTYYEVA 60
LKQYGNSTWN DIHICRKAQA LSCDLTTFTL DLYHRSYGYR ARVRAVDNSQ YSNWTTTETR 120
FTVDEVILTV DSVTLKAMDG IIYGTIHPPR PTITPAGDEY EQVFKDLRVY KISIRKFSEL 180
KNATKRVKQE TFTLTVPIGV RKFCVKVLPR LESRINKAEW SEEQCLLITT EQYFTVTNLS 240
IKLI 244
<212> Type : PRT
<211> Length : 244
Sequence Name : Mouse IL 10 R alpha extracellular domain
Sequence
--------
<213> Organism Name : mouse
<400> Pre Sequence String :
VPRDCGCKPC ICTGGR 16
<212> Type : PRT
<211> Length : 16
Sequence Name : mouse hinge
Sequence
--------
<213> Organism Name : mouse
<400> Pre Sequence String :
EAHKSEIAHR YNDLGEQHFK GLVLIAFSQY LQKCSYDEHA KLVQEVTDFA KTCVADESAA 60
NCDKSLHTLF GDKLCAIPNL RENYGELADC CTKQEPERNE CFLQHKDDNP SLPPFERPEA 120
EAMCTSFKEN PTTFMGHYLH EVARRHPYFY APELLYYAEQ YNEILTQCCA EADKESCLTP 180
KLDGVKEKAL VSSVRQRMKC SSMQKFGERA FKAWAVARLS QTFPNADFAE ITKLATDLTK 240
VNKECCHGDL LECADDRAEL AKYMCENQAT ISSKLQTCCD KPLLKKAHCL SEVEHDTMPA 300
DLPAIAADFV EDQEVCKNYA EAKDVFLGTF LYEYSRRHPD YSVSLLLRLA KKYEATLEKC 360
CAEANPPACY GTVLAEFQPL VEEPKNLVKT NCDLYEKLGE YGFQNAILVR YTQKAPQVST 420
PTLVEAARNL GRVGTKCCTL PEDQRLPCVE DYLSAILNRV CLLHEKTPVS EHVTKCCSGS 480
LVERRPCFSA LTVDETYVPK EFKAETFTFH SDICTLPEKE KQIKKQTALA ELVKHKPKAT 540
AEQLKTVMDD FAQFLDTCCK AADKDTCFST EGPNLVTRCK DALA 584
<212> Type : PRT
<211> Length : 584
Sequence Name : Murine Albumin domain
Sequence Description :
Sequence
--------
<213> Organism Name : mouse
<400> PreSequence String :
atgttgtcgc gtttgctccc attcctcgtc acgatctcca gcctgagcct agaattcatt 60
gcatacggga cagaactgcc aagcccttcc tatgtgtggt ttgaagccag atttttccag 120
cacatcctcc actggaaacc tatcccaaac cagtctgaga gcacctacta tgaagtggcc 180
ctcaaacagt acggaaactc aacctggaat gacatccata tctgtagaaa ggctcaggca 240
ttgtcctgtg atctcacaac gttcaccctg gatctgtatc accgaagcta tggctaccgg 300
gccagagtcc gggcagtgga caacagtcag tactccaact ggaccaccac tgagactcgc 360
ttcacagtgg atgaagtgat tctgacagtg gatagcgtga ctctgaaagc aatggacggc 420
atcatctatg ggacaatcca tccccccagg cccacgataa cccctgcagg ggatgagtac 480
gaacaagtct tcaaggatct ccgagtttac aagatttcca tccggaagtt ctcagaacta 540
aagaatgcaa ccaagagagt gaaacaggaa accttcaccc tcacggtccc cataggggtg 600
agaaagtttt gtgtcaaggt gctgccccgc ttggaatccc gaattaacaa ggcagagtgg 660
tcggaggagc agtgtttact tatcacgacg gagcagtatt tcactgtgac caacctgagc 720
atcaagctta tt 732
<212> Type : DNA
<211> Length : 732
Sequence Name : Nucleotide of mouse IL 10 R alpha extracellular domain
Sequence
--------
<213> OrganismName : mouse
<400> PreSequenceString :
gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtacag gcggccgc 48
<212> Type : DNA
<211> Length : 48
Sequence Name : Nucleotide of mouse hinge
Sequence
--------
<213> OrganismName : mouse
<400> PreSequenceString :
gaagcacaca agagtgagat cgcccatcgg tataatgatt tgggagaaca acatttcaaa 60
ggcctagtcc tgattgcctt ttcccagtat ctccagaaat gctcatacga tgagcatgcc 120
aaattagtgc aggaagtaac agactttgca aagacgtgtg ttgccgatga gtctgccgcc 180
aactgtgaca aatcccttca cactcttttt ggagataagt tgtgtgccat tccaaacctc 240
cgtgaaaact atggtgaact ggctgactgc tgtacaaaac aagagcccga aagaaacgaa 300
tgtttcctgc aacacaaaga tgacaacccc agcctgccac catttgaaag gccagaggct 360
gaggccatgt gcacctcctt taaggaaaac ccaaccacct ttatgggaca ctatttgcat 420
gaagttgcca gaagacatcc ttatttctat gccccagaac ttctttacta tgctgagcag 480
tacaatgaga ttctgaccca gtgttgtgca gaggctgaca aggaaagctg cctgaccccg 540
aagcttgatg gtgtgaagga gaaagcattg gtctcatctg tccgtcagag aatgaagtgc 600
tccagtatgc agaagtttgg agagagagct tttaaagcat gggcagtagc tcgtctgagc 660
cagacattcc ccaatgctga ctttgcagaa atcaccaaat tggcaacaga cctgaccaaa 720
gtcaacaagg agtgctgcca tggtgacctg ctggaatgcg cagatgacag ggcggaactt 780
gccaagtaca tgtgtgaaaa ccaggcgact atctccagca aactgcagac ttgctgcgat 840
aaaccactgt tgaagaaagc ccactgtctt agtgaggtgg agcatgacac catgcctgct 900
gatctgcctg ccattgctgc tgattttgtt gaggaccagg aagtgtgcaa gaactatgct 960
gaggccaagg atgtcttcct gggcacgttc ttgtatgaat attcaagaag acaccctgat 1020
tactctgtat ccctgttgct gagacttgct aagaaatatg aagccactct ggaaaagtgc 1080
tgcgctgaag ccaatcctcc cgcatgctac ggcacagtgc ttgctgaatt tcagcctctt 1140
gtagaagagc ctaagaactt ggtcaaaacc aactgtgatc tttacgagaa gcttggagaa 1200
tatggattcc aaaatgccat tctagttcgc tacacccaga aagcacctca ggtgtcaacc 1260
ccaactctcg tggaggctgc aagaaaccta ggaagagtgg gcaccaagtg ttgtacactt 1320
cctgaagatc agagactgcc ttgtgtggaa gactatctgt ctgcaatcct gaaccgtgtg 1380
tgtctgctgc atgagaagac cccagtgagt gagcatgtta ccaagtgctg tagtggatcc 1440
ctggtggaaa ggcggccatg cttctctgct ctgacagttg atgaaacata tgtccccaaa 1500
gagtttaaag ctgagacctt caccttccac tctgatatct gcacacttcc agagaaggag 1560
aagcagatta agaaacaaac ggctcttgct gagctggtga agcacaagcc caaggctaca 1620
gcggagcaac tgaagactgt catggatgac tttgcacagt tcctggatac atgttgcaag 1680
gctgctgaca aggacacctg cttctcgact gagggtccaa accttgtcac tagatgcaaa 1740
gacgccttag cctaa 1755
<212> Type : DNA
<211> Length : 1755
Sequence Name : Nucleotide of Murine Albumin domain
Sequence
--------
<213> Organism Name : human
<400> Pre Sequence String :
gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60
gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120
aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180
aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240
cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300
tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360
gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420
gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480
tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540
aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600
gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660
cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720
gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780
gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840
aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900
gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960
gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020
tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080
tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140
gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200
tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260
ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320
cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380
tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440
ttggtgaaca ggcgtccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500
gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560
agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620
aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680
gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740
gctgccttag gcttataa 1758
<212> Type : DNA
<211> Length : 1758
Sequence Name: nucleotide of human albumin domain
SEQUENCE LISTING <110> MEDIOLANUM FARAMCEUTICI S.p.A. <120> RECETTORE SOLUBILE DELL'INTERLEUCHINA 10 E RELATIVO IMPIEGO TERAPEUTICO. <130> P05076PCT <140> PCT/IB2016/052359 <141> 2016-04-29 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 238 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Leu Pro Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ser Leu Arg 1 5 10 15 Leu Gly Ser Asp Ala His Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Pro Ser Val 20 25 30 Trp Phe Glu Ala Glu Phe Phe His His Ile Leu His Trp Thr Pro Ile 35 40 45 Pro Asn Gln Ser Glu Ser Thr Cys Tyr Glu Val Ala Leu Leu Arg Tyr 50 55 60 Gly Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Leu Ser 65 70 75 80 Tyr Asp Leu Thr Ala Val Thr Leu Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Tyr 85 90 95 Arg Ala Arg Val Arg Ala Val Asp Gly Ser Arg His Ser Asn Trp Thr 100 105 110 Val Thr Asn Thr Arg Phe Ser Val Asp Glu Val Thr Leu Thr Val Gly 115 120 125 Ser Val Asn Leu Glu Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln 130 135 140 Leu Pro Arg Pro Lys Met Ala Pro Ala Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Ile 145 150 155 160 Phe Ser His Phe Arg Glu Tyr Glu Ile Ala Ile Arg Lys Val Pro Gly 165 170 175 Asn Phe Thr Phe Thr His Lys Lys Val Lys His Glu Asn Phe Ser Leu 180 185 190 Leu Thr Ser Gly Glu Val Gly Glu Phe Cys Val Gln Val Lys Pro Ser 195 200 205 Val Ala Ser Arg Ser Asn Lys Gly Met Trp Ser Lys Glu Glu Cys Ile 210 215 220 Ser Leu Thr Arg Gln Tyr Phe Thr Val Thr Asn Ser Arg Val 225 230 235 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> human <400> 2 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Ala Ala Ala 1 5 10 15 <210> 3 <211> 585 <212> PRT <213> human <400> 3 Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu 65 70 75 80 Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu 100 105 110 Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His 115 120 125 Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg 145 150 155 160 Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala 165 170 175 Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser 180 185 190 Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro 210 215 220 Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His 275 280 285 Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser 290 295 300 Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr 340 345 350 Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu 355 360 365 Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 420 425 430 Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 435 440 445 Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 565 570 575 Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu 580 585 <210> 4 <211> 714 <212> DNA <213> human <400> 4 atgctgccgt gcctcgtagt gctgctggcg gcgctcctca gcctccgtct tggctcagac 60 gctcatggga cagagctgcc cagccctccg tctgtgtggt ttgaagcaga atttttccac 120 cacatcctcc actggacacc catcccaaat cagtctgaaa gtacctgcta tgaagtggcg 180 ctcctgaggt atggaataga gtcctggaac tccatctcca actgtagcca gaccctgtcc 240 tatgacctta ccgcagtgac cttggacctg taccacagca atggctaccg ggccagagtg 300 cgggctgtgg acggcagccg gcactccaac tggaccgtca ccaacacccg cttctctgtg 360 gatgaagtga ctctgacagt tggcagtgtg aacctagaga tccacaatgg cttcatcctc 420 gggaagattc agctacccag gcccaagatg gcccccgcga atgacacata tgaaagcatc 480 ttcagtcact tccgagagta tgagattgcc attcgcaagg tgccgggaaa cttcacgttc 540 acacacaaga aagtaaaaca tgaaaacttc agcctcctaa cctctggaga agtgggagag 600 ttctgtgtcc aggtgaaacc atctgtcgct tcccgaagta acaaggggat gtggtctaaa 660 gaggagtgca tctccctcac caggcagtat ttcaccgtga ccaactctag agtt 714 <210> 5 <211> 45 <212> DNA <213> human <400> 5 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccagcgg ccgcg 45 <210> 6 <211> 244 <212> PRT <213> mouse <400> 6 Met Leu Ser Arg Leu Leu Pro Phe Leu Val Thr Ile Ser Ser Leu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Phe Ile Ala Tyr Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Ser Tyr Val 20 25 30 Trp Phe Glu Ala Arg Phe Phe Gln His Ile Leu His Trp Lys Pro Ile 35 40 45 Pro Asn Gln Ser Glu Ser Thr Tyr Tyr Glu Val Ala Leu Lys Gln Tyr 50 55 60 Gly Asn Ser Thr Trp Asn Asp Ile His Ile Cys Arg Lys Ala Gln Ala 65 70 75 80 Leu Ser Cys Asp Leu Thr Thr Phe Thr Leu Asp Leu Tyr His Arg Ser 85 90 95 Tyr Gly Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Val Asp Asn Ser Gln Tyr Ser 100 105 110 Asn Trp Thr Thr Thr Glu Thr Arg Phe Thr Val Asp Glu Val Ile Leu 115 120 125 Thr Val Asp Ser Val Thr Leu Lys Ala Met Asp Gly Ile Ile Tyr Gly 130 135 140 Thr Ile His Pro Pro Arg Pro Thr Ile Thr Pro Ala Gly Asp Glu Tyr 145 150 155 160 Glu Gln Val Phe Lys Asp Leu Arg Val Tyr Lys Ile Ser Ile Arg Lys 165 170 175 Phe Ser Glu Leu Lys Asn Ala Thr Lys Arg Val Lys Gln Glu Thr Phe 180 185 190 Thr Leu Thr Val Pro Ile Gly Val Arg Lys Phe Cys Val Lys Val Leu 195 200 205 Pro Arg Leu Glu Ser Arg Ile Asn Lys Ala Glu Trp Ser Glu Glu Gln 210 215 220 Cys Leu Leu Ile Thr Thr Glu Gln Tyr Phe Thr Val Thr Asn Leu Ser 225 230 235 240 Ile Lys Leu Ile <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> mouse <400> 7 Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly Gly Arg 1 5 10 15 <210> 8 <211> 584 <212> PRT <213> mouse <400> 8 Glu Ala His Lys Ser Glu Ile Ala His Arg Tyr Asn Asp Leu Gly Glu 1 5 10 15 Gln His Phe Lys Gly Leu Val Leu Ile Ala Phe Ser Gln Tyr Leu Gln 20 25 30 Lys Cys Ser Tyr Asp Glu His Ala Lys Leu Val Gln Glu Val Thr Asp 35 40 45 Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Ala Asn Cys Asp Lys 50 55 60 Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Ala Ile Pro Asn Leu 65 70 75 80 Arg Glu Asn Tyr Gly Glu Leu Ala Asp Cys Cys Thr Lys Gln Glu Pro 85 90 95 Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Ser Leu 100 105 110 Pro Pro Phe Glu Arg Pro Glu Ala Glu Ala Met Cys Thr Ser Phe Lys 115 120 125 Glu Asn Pro Thr Thr Phe Met Gly His Tyr Leu His Glu Val Ala Arg 130 135 140 Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Tyr Tyr Ala Glu Gln 145 150 155 160 Tyr Asn Glu Ile Leu Thr Gln Cys Cys Ala Glu Ala Asp Lys Glu Ser 165 170 175 Cys Leu Thr Pro Lys Leu Asp Gly Val Lys Glu Lys Ala Leu Val Ser 180 185 190 Ser Val Arg Gln Arg Met Lys Cys Ser Ser Met Gln Lys Phe Gly Glu 195 200 205 Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Thr Phe Pro 210 215 220 Asn Ala Asp Phe Ala Glu Ile Thr Lys Leu Ala Thr Asp Leu Thr Lys 225 230 235 240 Val Asn Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp 245 250 255 Arg Ala Glu Leu Ala Lys Tyr Met Cys Glu Asn Gln Ala Thr Ile Ser 260 265 270 Ser Lys Leu Gln Thr Cys Cys Asp Lys Pro Leu Leu Lys Lys Ala His 275 280 285 Cys Leu Ser Glu Val Glu His Asp Thr Met Pro Ala Asp Leu Pro Ala 290 295 300 Ile Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Gln Glu Val Cys Lys Asn Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg 325 330 335 Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Ser Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Lys 340 345 350 Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Glu Ala Asn Pro Pro Ala 355 360 365 Cys Tyr Gly Thr Val Leu Ala Glu Phe Gln Pro Leu Val Glu Glu Pro 370 375 380 Lys Asn Leu Val Lys Thr Asn Cys Asp Leu Tyr Glu Lys Leu Gly Glu 385 390 395 400 Tyr Gly Phe Gln Asn Ala Ile Leu Val Arg Tyr Thr Gln Lys Ala Pro 405 410 415 Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Gly Arg 420 425 430 Val Gly Thr Lys Cys Cys Thr Leu Pro Glu Asp Gln Arg Leu Pro Cys 435 440 445 Val Glu Asp Tyr Leu Ser Ala Ile Leu Asn Arg Val Cys Leu Leu His 450 455 460 Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu His Val Thr Lys Cys Cys Ser Gly Ser 465 470 475 480 Leu Val Glu Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Thr Val Asp Glu Thr 485 490 495 Tyr Val Pro Lys Glu Phe Lys Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ser Asp 500 505 510 Ile Cys Thr Leu Pro Glu Lys Glu Lys Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala 515 520 525 Leu Ala Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Ala Glu Gln Leu 530 535 540 Lys Thr Val Met Asp Asp Phe Ala Gln Phe Leu Asp Thr Cys Cys Lys 545 550 555 560 Ala Ala Asp Lys Asp Thr Cys Phe Ser Thr Glu Gly Pro Asn Leu Val 565 570 575 Thr Arg Cys Lys Asp Ala Leu Ala 580 <210> 9 <211> 732 <212> DNA <213> mouse <400> 9 atgttgtcgc gtttgctccc attcctcgtc acgatctcca gcctgagcct agaattcatt 60 gcatacggga cagaactgcc aagcccttcc tatgtgtggt ttgaagccag atttttccag 120 cacatcctcc actggaaacc tatcccaaac cagtctgaga gcacctacta tgaagtggcc 180 ctcaaacagt acggaaactc aacctggaat gacatccata tctgtagaaa ggctcaggca 240 ttgtcctgtg atctcacaac gttcaccctg gatctgtatc accgaagcta tggctaccgg 300 gccagagtcc gggcagtgga caacagtcag tactccaact ggaccaccac tgagactcgc 360 ttcacagtgg atgaagtgat tctgacagtg gatagcgtga ctctgaaagc aatggacggc 420 atcatctatg ggacaatcca tccccccagg cccacgataa cccctgcagg ggatgagtac 480 gaacaagtct tcaaggatct ccgagtttac aagatttcca tccggaagtt ctcagaacta 540 aagaatgcaa ccaagagagt gaaacaggaa accttcaccc tcacggtccc cataggggtg 600 agaaagtttt gtgtcaaggt gctgccccgc ttggaatccc gaattaacaa ggcagagtgg 660 tcggaggagc agtgtttact tatcacgacg gagcagtatt tcactgtgac caacctgagc 720 atcaagctta tt 732 <210> 10 <211> 48 <212> DNA <213> mouse <400> 10 gtgcccaggg attgtggttg taagccttgc atatgtacag gcggccgc 48 <210> 11 <211> 1755 <212> DNA <213> mouse <400> 11 gaagcacaca agagtgagat cgcccatcgg tataatgatt tgggagaaca acatttcaaa 60 ggcctagtcc tgattgcctt ttcccagtat ctccagaaat gctcatacga tgagcatgcc 120 aaattagtgc aggaagtaac agactttgca aagacgtgtg ttgccgatga gtctgccgcc 180 aactgtgaca aatcccttca cactcttttt ggagataagt tgtgtgccat tccaaacctc 240 cgtgaaaact atggtgaact ggctgactgc tgtacaaaac aagagcccga aagaaacgaa 300 tgtttcctgc aacacaaaga tgacaacccc agcctgccac catttgaaag gccagaggct 360 gaggccatgt gcacctcctt taaggaaaac ccaaccacct ttatgggaca ctatttgcat 420 gaagttgcca gaagacatcc ttatttctat gccccagaac ttctttacta tgctgagcag 480 tacaatgaga ttctgaccca gtgttgtgca gaggctgaca aggaaagctg cctgaccccg 540 aagcttgatg gtgtgaagga gaaagcattg gtctcatctg tccgtcagag aatgaagtgc 600 tccagtatgc agaagtttgg agagagagct tttaaagcat gggcagtagc tcgtctgagc 660 cagacattcc ccaatgctga ctttgcagaa atcaccaaat tggcaacaga cctgaccaaa 720 gtcaacaagg agtgctgcca tggtgacctg ctggaatgcg cagatgacag ggcggaactt 780 gccaagtaca tgtgtgaaaa ccaggcgact atctccagca aactgcagac ttgctgcgat 840 aaaccactgt tgaagaaagc ccactgtctt agtgaggtgg agcatgacac catgcctgct 900 gatctgcctg ccattgctgc tgattttgtt gaggaccagg aagtgtgcaa gaactatgct 960 gaggccaagg atgtcttcct gggcacgttc ttgtatgaat attcaagaag acaccctgat 1020 tactctgtat ccctgttgct gagacttgct aagaaatatg aagccactct ggaaaagtgc 1080 tgcgctgaag ccaatcctcc cgcatgctac ggcacagtgc ttgctgaatt tcagcctctt 1140 gtagaagagc ctaagaactt ggtcaaaacc aactgtgatc tttacgagaa gcttggagaa 1200 tatggattcc aaaatgccat tctagttcgc tacacccaga aagcacctca ggtgtcaacc 1260 ccaactctcg tggaggctgc aagaaaccta ggaagagtgg gcaccaagtg ttgtacactt 1320 cctgaagatc agagactgcc ttgtgtggaa gactatctgt ctgcaatcct gaaccgtgtg 1380 tgtctgctgc atgagaagac cccagtgagt gagcatgtta ccaagtgctg tagtggatcc 1440 ctggtggaaa ggcggccatg cttctctgct ctgacagttg atgaaacata tgtccccaaa 1500 gagtttaaag ctgagacctt caccttccac tctgatatct gcacacttcc agagaaggag 1560 aagcagatta agaaacaaac ggctcttgct gagctggtga agcacaagcc caaggctaca 1620 gcggagcaac tgaagactgt catggatgac tttgcacagt tcctggatac atgttgcaag 1680 gctgctgaca aggacacctg cttctcgact gagggtccaa accttgtcac tagatgcaaa 1740 gacgccttag cctaa 1755 <210> 12 <211> 1758 <212> DNA <213> human <400> 12 gatgcacaca agagtgaggt tgctcatcgg tttaaagatt tgggagaaga aaatttcaaa 60 gccttggtgt tgattgcctt tgctcagtat cttcagcagt gtccatttga agatcatgta 120 aaattagtga atgaagtaac tgaatttgca aaaacatgtg ttgctgatga gtcagctgaa 180 aattgtgaca aatcacttca tacccttttt ggagacaaat tatgcacagt tgcaactctt 240 cgtgaaacct atggtgaaat ggctgactgc tgtgcaaaac aagaacctga gagaaatgaa 300 tgcttcttgc aacacaaaga tgacaaccca aacctccccc gattggtgag accagaggtt 360 gatgtgatgt gcactgcttt tcatgacaat gaagagacat ttttgaaaaa atacttatat 420 gaaattgcca gaagacatcc ttacttttat gccccggaac tccttttctt tgctaaaagg 480 tataaagctg cttttacaga atgttgccaa gctgctgata aagctgcctg cctgttgcca 540 aagctcgatg aacttcggga tgaagggaag gcttcgtctg ccaaacagag actcaagtgt 600 gccagtctcc aaaaatttgg agaaagagct ttcaaagcat gggcagtagc tcgcctgagc 660 cagagatttc ccaaagctga gtttgcagaa gtttccaagt tagtgacaga tcttaccaaa 720 gtccacacgg aatgctgcca tggagatctg cttgaatgtg ctgatgacag ggcggacctt 780 gccaagtata tctgtgaaaa tcaagattcg atctccagta aactgaagga atgctgtgaa 840 aaacctctgt tggaaaaatc ccactgcatt gccgaagtgg aaaatgatga gatgcctgct 900 gacttgcctt cattagctgc tgattttgtt gaaagtaagg atgtttgcaa aaactatgct 960 gaggcaaagg atgtcttcct gggcatgttt ttgtatgaat atgcaagaag gcatcctgat 1020 tactctgtcg tgctgctgct gagacttgcc aagacatatg aaaccactct agagaagtgc 1080 tgtgccgctg cagatcctca tgaatgctat gccaaagtgt tcgatgaatt taaacctctt 1140 gtggaagagc ctcagaattt aatcaaacaa aattgtgagc tttttgagca gcttggagag 1200 tacaaattcc agaatgcgct attagttcgt tacaccaaga aagtacccca agtgtcaact 1260 ccaactcttg tagaggtctc aagaaaccta ggaaaagtgg gcagcaaatg ttgtaaacat 1320 cctgaagcaa aaagaatgcc ctgtgcagaa gactatctat ccgtggtcct gaaccagtta 1380 tgtgtgttgc atgagaaaac gccagtaagt gacagagtca ccaaatgctg cacagaatcc 1440 ttggtgaaca ggcgtccatg cttttcagct ctggaagtcg atgaaacata cgttcccaaa 1500 gagtttaatg ctgaaacatt caccttccat gcagatatat gcacactttc tgagaaggag 1560 agacaaatca agaaacaaac tgcacttgtt gagctcgtga aacacaagcc caaggcaaca 1620 aaagagcaac tgaaagctgt tatggatgat ttcgcagctt ttgtagagaa gtgctgcaag 1680 gctgacgata aggagacctg ctttgccgag gagggtaaaa aacttgttgc tgcaagtcaa 1740 gctgccttag gcttataa 1758

Claims (18)

  1. IL 10 수용체 알파 단위의 세포외 도메인과 알부민의 키메라 융합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 알부민은 포유동물 혈청 알부민인, 키메라 융합 단백질.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 포유동물 혈청은 인간 또는 쥐인, 키메라 융합 단백질.
  4. 청구항 1-3중 어느 한 항에 있어서,
    상기 IL 10 수용체 알파 단위의 세포외 도메인은 포유동물 말초 혈액 세포 (PBMCs)로부터 유래된, 키메라 융합 단백질.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 말초 혈액 세포는 인간 또는 쥐인, 키메라 융합 단백질.
  6. 청구항 1-5중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알부민은 스페이서에 의해 인터루킨 10 수용체 알파 단위의 세포외 도메인에 결합되는, 키메라 융합 단백질.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 스페이서는 면역감마글로불린 G (IgG)의 힌지 영역인, 키메라 융합 단백질.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 면역감마글로불린은 IgG1인, 키메라 융합 단백질.
  9. 청구항 7 또는 8에 있어서,
    상기 면역감마글로불린은 포유동물 말초 혈액 세포로부터 유래된, 키메라 융합 단백질.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 말초 혈액 세포는 인간 또는 쥐인, 키메라 융합 단백질.
  11. 청구항 1-10중 어느 한 항에 따른 키메라 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 구조체.
  12. 청구항 11에 있어서,
    유전자 형태인, 폴리뉴클레오티드 구조체.
  13. 청구항 11에 있어서,
    청구항 12에 따른 유전자를 포함하는 벡터의 형태인, 폴리뉴클레오티드 구조체.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드인, 폴리뉴클레오티드 구조체.
  15. IL 10 연관 병리의 치료에 약물로서 사용하기 위한, 청구항 1-10중 어느 한 항에 따른 키메라 융합 단백질.
  16. 청구항 15에 있어서,
    상기 병리는 암 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)인, 키메라 융합 단백질.
  17. IL 10 연관 병리의 치료에 약물로서 사용하기 위한, 청구항 11-14중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드 구조체.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 병리는 암 및 전신성 홍반성 루푸스 (SLE)인, 폴리뉴클레오티드 구조체.
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