KR20210093232A - 유기용매와 세제가 없는 형질감염 적격 소포를 포함하는 조성물과 시스템 및 관련 방법 - Google Patents

유기용매와 세제가 없는 형질감염 적격 소포를 포함하는 조성물과 시스템 및 관련 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 DNA, RNA, 기타 핵산 및 단백질 카고를 표적세포로 안전하고 효율적으로 전달하도록 구성된 지질기반 소포, 일반적으로 형질감염 적격 소포(TCV)에 관한 것이다. TCV 로딩 프로세스(즉, 카고를 TCV에 삽입), TCV 저장 프로세스 및/또는 TCV 전달과정에서 에탄올과 같은 유기용매 및 나트륨 도데실 설페이트와 같은 세제를 제거함으로써 안전성과 효율성이 확보된다. 카고는 리보핵단백질(RNP)과 같은 단백질과 복합된 핵산을 포함할 수 있다. 본 명세서의 시스템, 조성물, 장치 및 방법 등은 일부 실시예에서 원하는 경우 특수 장비를 사용하지 않고 벤치에 적재할 수 있는 빈 TCV를 제공할 수 있다.

Description

유기용매와 세제가 없는 형질감염 적격 소포를 포함하는 조성물과 시스템 및 관련 방법
본 발명은 유기용매와 세제가 없는 형질감염 적격 소포를 포함하는 조성물과 시스템 및 관련 방법에 관한 것이다.
과학연구와 의료 치료 분야에서는 RNA, DNA, 기타 핵산 및/또는 단백질 카고(protein cargo)를 특정 표적세포와 같은 표적 부위에 선택적이고 효율적으로 전달하는 것이 중요하다. 이것은 유전자치료와 같은 개선된 환자 치료와 암 및 기타 상태의 치료를 포함하여 다양한 이유로 도움이 될 수 있다. 예를 들어, 유전자 요법은 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴병, 전측두엽성 치매, 근위축성 측삭 경화증, 척추 근위축증 등과 같이 인간이 겪을 수 있는 고전적인 끔찍한 신경계 질환을 치료하기 위해 뇌와 중추신경계 전체에 사용될 수 있다. 현재의 유전자치료 접근법은 치료용 핵산을 환자에게 전달하는 포장의 반복적인 투여 및 독성으로 인해 특히 인간 환자에게 널리 적용하기에는 몇 가지 문제가 있다. 본 발명의 조성물, 방법 등은 이런저런 문제 중 적어도 하나를 해결하는데 도움이 된다.
DNA와 기타 핵산을 뇌의 질병 세포와 같은 표적 부위로 전달하기 위한 기존 방법은 지질 나노입자(LNP; lipid nanoparticle)나 리포좀이라고 하는 지질입자를 포함한다. 지질 나노입자나 "LNP"는 핵산을 함유하고 전자 밀집 코어를 갖는 중성 pH의 지질기반 입자를 설명하는데 사용된다. 소포라고도 하는 리포좀은 단일 이중층과 수성 코어를 갖는 지질기반 구조이다. LNP 형성의 일반 확립 과정에서는 초기 소포 형성시에 소포에 특정 카고를 적재한다. 이런 과정은 특수 기기, 유기용매 및/또는 세제를 추가로 사용하고, 많은 양의 재료를 필요로 하며, 처리시간이 며칠 단위이고, 이 모두는 유용성, 접근성 및 치료효용성을 심각하게 해친다.
LNP와 기타 지질 입자는 일반적으로 이온화 양이온 지질, 적어도 하나의 인지질, 콜레스테롤(Chol) 및 폴리에틸렌글리콜-지질(PEG-지질)을 포함한다(Maurer, Wong et al. 2001; Sem㎕e, Klimuk et al. al. 2001; Sem㎕e, Akinc et al. 2010; Belliveau, Huft et al. 2012; Leung, Hafez et al. 2012; Suhr, Coelho et al. 2015). (특정 시스템, 장치, 방법 및 기타 정보를 논의하는 다양한 참고 문헌이 여기에 설명되어 있으며, 이런 모든 참고 문헌은 참고 문헌이 나타날 수 있는 위치에 관계없이 전체적으로 그리고 모든 교시 및 공개에 대해 본원에서 참조한다. 본원의 참고 문헌은 본원의 선행 기술을 구성한다는 것을 인정하지 않는다.) LNP 조성물의 예로 50/10/38.5/1.5 mol% 비율로 이온화 양이온 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질의 조합물이 있다. 이 조성물은 정맥투여 후 강력한 간세포 유전자 침묵(siRNA) 또는 발현(mRNA)을 보이는 것으로 나타났다(Sem㎕e, Akinc et al. 2010; Jayaraman, Ansell et al. 2012; Pardi, Tuyishime et al. 2015; Suhr, Coelho et al. 2015). 배양 및 뇌로의 전달을 위한 1차 신경세포의 siRNA 전달로서 50/10/38.5/1.5 몰%의 비율로 이온화 양이온 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질로 구성된 LNP 조성물도 있다(Rungta, Choi et al. 2013).
LNP 제형은 에탄올에 용해된 지질 성분과 핵산카고로 구성된 산성 수성 상을 급속혼합하여 생성할 수 있다(Jeffs, Palmer et al. 2005; Belliveau, Huft et al. 2012; Leung, Hafez et al. al. 2012). LNP 제조를 위한 급속혼합 프로세스에는 지그재그형 헤링본 미세혼합기(SHM)(Belliveau, Huft et al. 2012; Rungta, Choi et al. 2013; Leung, Tam et al. 2015), 특수펌프에 의한 T-접합 혼합(Jeffs, Palmer et al. 2005), 또는 보다 오래된 사전형성된 소포의 에탄올-/세제-불안정화 로딩(Wheeler, Palmer et al. 1999; Tam, Monck et al. 2000; Maurer, Wong et al. 2001; Sem㎕e, Klimuk et al. 2001)을 통한 미세유체 혼합이 있다. 3 방법 모두, 지질 재구성과 포획에 충분한 막 유동성을 위해 에탄올 용액(또는 세제)이 필요하며, SHM 및 T-접합 기술의 경우 수성 상으로의 에탄올 용액 희석시 입자 형성도 발생한다(Belliveau, Huft et al. 2012; Zhigaltsev, Belliveau et al. 2012; Zhigaltsev, Tam et al. 2016). 그러나, 생성된 현탁액은 유기용매와 산성 pH로 인해 "사용준비" 상태가 아니어서, 상당한 다운스트림 프로세스가 필요하다. 재료비와 시간 측면에서, 이런 방식은 시험관내 적용을 위한 실험실 규모나 직접 투여를 위한 치료 수준에서 형질감염 적격 제형을 달성하는데 상당한 장애가 있다.
배양된 포유류 1차 세포(일반적으로 1차 세포는 표적 조직에서 직접 구해진 형질전환되지 않고, 비고정적인 세포임)를 포함해, 핵산과 단백질카고를 비독성 방식으로 포유류 세포에 효과적으로 전달하는 형질감염 시약이 필요하다. 1차 세포를 사용하는 것의 중요성과 세포주 사용에 비한 장점은 이해하지만, 이런 세포를 형질감염시키는 어려움 때문에 선택적 유전자 녹다운이 필요한 모든 유형의 발견이나 검증 연구에서는 거의 사용되지 않았다. 또, 맞춤형 의학으로의 추세 때문에 기능성 게놈 스크리닝 및 검증이 1차 환자 세포에서 수행되고 있으며, 이런 형질감염이 어려운 세포 유형에 대한 강력하고 무독성의 형질감염 방법에 대한 필요성이 증가하고 있다.
본 발명의 시스템과 방법 등은 종래의 이런 어려움에 대한 해결책은 물론 다른 이점을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본원의 시스템, 조성물, 장치 및 방법 등은 단백질, 리보핵단백질(RNP), RNA, DNA 및 기타 핵산카고 및 기타 선별 카고를 안전하고 효율적으로 표적세포에 전달하도록 구성된 지질기반 소포, 즉 형질감염 적격 소포(transfection competent vesicles, TCV)를 제공한다. TCV 적재 프로세스(즉, 선별 카고를 TCV에 삽입), TCV 저장 프로세스 및/또는 TCV 전달과정에서 에탄올과 같은 유기용제 및 도데실 황산나트륨과 같은 세제와 같은 불안정화제를 제거함으로써 안전성과 효율성이 확보된다. 따라서, TCV는 불안정화제가 없는 용액, 예를 들어 불안정화제가 없는 현탁액에 유지된다.
TCV는 지질기반이고 불안정화제와 선별 카고없이 생성 및/또는 저장되는 리포좀이나 기타 소포의 유형이다. 이런 TCV의 장점은 불안정화제 없이 용액이나 현탁액에 보관할 수 있고, 불안정화제 없이 선별 카고를 포획할 수 있으며, 불안정화없이 표적세포에 선별 카고를 전달할 수 있다는 것이다. 선별 카고는 선별 카고를 함유한 TCV로 형질감염된 표적세포 및/또는 표적 환자에 대해 원하는 효과를 내는 RNP, RNA, DMA, 단백질 등이다. 따라서, 달리 표현하지 않은 한, 본원의 TCV는 궁극적으로 선별 카고가 없고 특정 주변 용액 등을 제외하고는 비어있다. 이런 TCV는 유기용매나 기타 불안정화제를 사용하지 않고 핵산과 단백질 카고 등을 포유류 세포에 안전하고 효율적으로 전달하도록 구성된다.
TCV 전달과정은 선별 카고에 의한 1차 세포와 같은 포유류 세포의 형질감염을 포함할 수 있다. 카고는 리보핵단백질(RNP)과 같은 단백질과 복합된 핵산도 포함할 수 있다. 본원의 시스템, 조성물, 장치 및 방법 등은 빈 TCV나 로드된 TCV를 제공할 수 있다.
본원의 시스템, 조성물, 장치 및 방법 등은 카고를 지질 소포나 리포좀에 포획/적재 및/또는 이런 소포를 저장하는데 전에 필요했던 유기용매와 기타 불안정화제 없이 형질감염-적격 소포(TCV)를 제공한다. 본원의 조성물, 방법 등은 특수기구를 사용하지 않고 사용하거나 수행할 수 있다. 예를 들어, 미리 형성된 TCV는 피펫의 왕복운동을 통해 다양한 유형의 선별 카고와 빈 TCV 함유 현탁액을 부드럽게 혼합하여 적재할 수 있다. 본원의 조성물, 방법 등은"벤치-탑 적재/로딩"에 특히 유용할 수 있으며 소량 또는 다량의 선별 카고 재료와 함께 사용될 수 있다. 또, 빈 TCV 집단을 여러 다른 선별 카고와 함께 병렬로 벤치-탑 적재를 할 수 있다.
또, 본원의 시스템, 조성물, 장치 및 방법 등은 유기용매와 세제가 없는 빈 TCV를 제공한다. 에탄올이나 세제, 기타 불안정화제를 사용해 TCV를 생산한 경우, 투석이나 기타 적절한 방법으로 제거하여 유기 무용매, 무세제 TCV 조성물을 제공한다. TCV는 피펫, SHM, T-접합 혼합/압출법이나 다른 TCV 혼합법으로 TCV 생성 유체를 손으로 반복해 왕복운동시키는 등의 부드러운 혼합을 이용해 로드할 수 있다.
지질기반 TCV는 이온화 양이온 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 PEG-지질의 혼합물로 구성되고, TCV-함유 조성물은 유기용매 및/또는 세제가 없으며, 이는 유기용매와 세제가 본질적으로 존재하지 않거나, 미량이 있어도 유기용매 및/또는 세제에 의해 심각한 해로운 영향이 생기지 않음을 나타낸다.
이온화 양이온 지질이 TCV의 지질성분으리 20~50% 포함할 수 있다. 이런 지질기반 TCV가 20/30/10/39/1 mol%로 DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG-지질의 비율로 지질 성분들을 함유할 수 있다. 또는, 지질기반 TCV가 50/10/39/1 mol%로 DODMA/DSPC/Chol/PEG-지질의 비율로 지질성분들을 함유할 수 있다. 또는, 지질기반 TCV가 50/10/39/1 mol%로 DODMA/DOPE/DSPC/Chol의 비율로 지질성분들을 함유할 수 있다. 필요시 다른 성분 범위를 이용할 수도 있다. 이런 이온화 양이온 지질의 비율이 줄기도 한다. 예컨대, 이온화 양이온 지질의 비율이 약 10mol%, 20mol%, 30mol%, 40mol% 또는 60mol%일 수도 있다.
빈 지질기반 TCV는 예를 들어 원하는대로 5초, 10초, 15초, 20초, 30초, 45초, 1분 또는 2분 동안, 예컨대 10~30초 동안 핵산 선별 카고와 혼합된다. 유기 무용매, 무세제 TCV는 유기 무용매, 무세제 환경에 저장되고 또는 유기 무용매, 무세제 환경에서 포유류 세포와 같은 표적세포에 다시 투여될 수 있다. .
또, 핵산 선별 카고가 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, RNA, 소간섭 RNA, 짧은헤어핀 RNA, 메신저 RNA, 상보적 DNA, 마이크로 RNA, 플라스미드 DNA, 또는 이들의 조합일 수 있다. 핵산 선별 카고가 예를 들어 선별 카고의 안정성을 개선하기 위해 합성/화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 선별 카고가 핵산(PNA)과 복합된 단백질일 수도 있다. 단백질 선별카고는 유전자 편집에 관여하는 단백질 또는 세포 표지를 위한 리포터 기능을 하는 단백질(예:형광 마커 등)일 수도 있다. 핵산과 복합된 단백질 기반의 선별 카고의 일례가 리보핵단백질이다.
본 발명은 선별 카고를 양이온 지질기반 형질감염 적격 소포(TCV)에 캡슐화하는 방법에 있어서:
- 양이온 지질기반 TCV를 포함하고 불안정화제가 없는 수성 용액을 제공하는 단계; 및
- 선별 카고를 양이온 지질기반 TCV에 캡슐화하기에 맞는 조건하에 충분한 시간 동안 선별 카고를 용액에 혼합해 양이온 지질기반 TCV-캡슐화된 선별 카고를 제공하되, 유기용매나 세제 없이 혼합하는 단계를 포함하는 방법도 제공한다.
불안정화제는 유기용매나 세제 중 적어도 하나 일 수 있다. 유기용매는 예를 들어 메탄올, 이소프로필 알코올, 테트라히드로푸란(THF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF) 또는 아세토니트릴(ACN) 일 수 있다. 세제는 예를 들어 나트륨 도데실 설페이트(SDS)일 수 있다. 불안정화제가 온도일 수도 있다. 수성 용액은 25μM ~ 100μM 아세테이트 완충액일 수 있다.
지질기반 TCV가 캡슐화 전에 비어있을 수 있으며, 이 방법은 아래 단계를 더 포함할 수 있다:
-용매와 세제가 없는 수성 용액에서 지질기반 TCV 캡슐화된 선별 카고를 구하는 단계.
지질기반 TCV가 이온성 양이온 지질과 같은 양이온 지질을 포함할 수 있다. 지질기반 TCV가 20 mol% 내지 50 mol% 양이온 지질을 포함할 수 있다. 이온화 양이온 지질은 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노-프로판(DODMA)을 포함할 수 있다. 지질기반 TCV가 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노-프로판(DODMA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)의 혼합물을 포함할 수 있다. 이 혼합물이 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 콜레스테롤 중 적어도 하나를 더 포함할 수 있다.
지질기반 TCV가 약 20/30/10/39/1 mol%로 DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG-지질의 혼합물, 20/30/10/40 mol%로 DODMA/DOPE/DSPC/Chol의 혼합물, 50/10/40 mol%로 DODMA/DSPC/Chol의 혼합물, 50/10/39 /에서 DODMA/DSPC/Chol/PEG-지질의 혼합물, 또는 50/10/39/1 mol%로 DODMA/DSPC/Chol/PEG의 혼합물을 포함할 수도 있다.
선별 카고가 변형 핵산과 같은 핵산일 수 있다. 변형 핵산은 예를 들어 2'-0-메틸화(2'-0-ME), 포스포로티오에이트 또는 모르폴리노(잠금 핵산) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 핵산이 데옥시리보핵산(DNA)일 수 있다. DNA는 이중가닥 DNA, 단일가닥 DNA, 상보성 DNA(cDNA) 또는 플라스미드 DNA를 포함할 수 있다. 핵산은 리보핵산(RNA)을 포함할 수 있다. RNA는 소간섭 RNA(siRNA), 짧은헤어핀 RNA, 메신저 RNA(mRNA), 마이크로 RNA(miRNA)를 포함할 수 있다. 선별 카고는 단백질을 포함할 수 있다. 단백질은 기능성 리보핵단백질일 수 있는 리보핵단백질(RNP)의 일부일 수 있다. RNP는 Cas9 단백질 또는 가이드 RNA 중의 적어도 하나, Cas9 단백질 및 가이드 RNA 둘다, 또는 Cas9 단백질, 가이드 RNA 및 단일가닥 DNA(ssDNA)를 포함할 수 있다.
카고는 효소, 뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 중 적어도 하나, 또는 프라이머를 포함할 수 있다. 카고는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALEN, Cas9, CaslO, Casl 1, Casl2 또는 Cpfl 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 카고는 효소, 뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 중 적어도 하나 또는 프라이머를 포함할 수 있다. 카고는 뉴클레아제 또는 항원을 암호화하는 mRNA를 포함할 수 있다.
이 방법이 지질기반 TCV를 선별 카고와 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 선별 카고는 양이온 지질 μ몰당 선별 카고 약 0.022-0.058 mg의 비율로 존재할 수 있는 핵산일 수 있다. 이 방법은 지질기반 TCV를 선별 카고와 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 선별 카고는 양이온 지질 μ몰당 선별 카고 약 0.029-0.116 mg의 비율로 존재할 수 있는 핵산일 수 있다. 지질기반 TCV와 선별카고는 지질기반 TCV:선별카고의 약 467 몰비로 혼합될 수 있다. 선별 카고가 리보핵단백질(RNP)일 수 있다. 지질기반 TCV와 선별카고는 지질기반 TCV:선별카고의 약 400 ~ 1200 몰비로 혼합될 수 있다. 지질기반 TCV와 선별카고는 지질기반 TCV:선별카고의 약 473 ~ 1173 몰비로 혼합될 수 있다. 지질기반 TCV와 선별카고는 지질기반 TCV:선별카고의 최대 약 3000 ~ 5000 몰 비율로 혼합할 수 있다.
지질기반 TCV 및 선별 카고는 약 10 내지 15초 동안 또는 약 10 내지 30 초 동안 실온에서 혼합될 수 있다. 지그재그형 헤링본 미세혼합이나 T-접합 혼합법으로 혼합될 수 있다. 피펫내 왕복운동으로 혼합될 수도 있다.
본 발명의 시스템, 장치 및 방법 등이 수성 용액에 지질기반 형질감염 적격 소포(TCV)를 포함하는 조성물을 제공하기도 한다. 이 조성물은 불안정화제 유기용매와 세제가 없을 수 있다. 조성물 및/또는 지질기반 TCV는 요약, 도면, 상세한 설명 또는 청구범위에 기재한 바와 같이 구성될 수 있다. 본 시스템, 장치 및 방법 등은 유기용매와 세제와 같은 불안정화제가 없는 수성 용액내 지질기반 형질감염 적격 소포(TCV)-캡슐화된 선별 카고를 포함한 조성물을 제공하기도 한다.
본 시스템, 장치 및 방법 등은 형질감염 방법도 제공하며, 이 방법은 전술한 바와 같이 지질기반 형질감염 적격 소포(TCV)-캡슐화된 선별 카고로 표적세포를 형질감염시키는 것을 포함한다. 표적세포는 포유류 1차 세포, 포유류 1차 신경세포, 배양된 포유류 세포, 또는 포유류 환자의 세포와 같은 포유류 세포일 수 있다.
본 발명의 방법이 예를 들어 벤치-탑 로딩을 위해 실험실에서 수행되거나, 공장에서 수행하여 상업적인 양의 형질감염된 세포를 생산하거나, 생체내 절차, 의료 절차, 치료 절차 또는 유전자치료 절차의 일부로 수행되거나, 알츠하이머 병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 전두측두엽 치매, 근위축성 측삭 경화증 또는 척추 근위축증 치료의 일부로 수행될 수 있다. 이 방법은 지질기반 TCV 캡슐화된 선별 카고를 환자의 뇌에 전달하는 것을 더 포함할 수 있다.
또, 본 발명의 시스템, 장치 및 방법 등은 본원의 조성물을 포함하는 키트를 제공하기도 한다. 조성물은 용기에 있을 수 있고, 키트는 조성물의 사용설명서를 포함할 수 있다. 사용설명서는 본원의 방법에 따른 조성물의 사용을 지시할 수 있다. 용기는 포유류에게 적어도 하나의 용량의 조성물을 투여하도록 구성될 수 있으며, 키트는 투여 지침을 포함하는 적어도 하나의 표지를 더 포함한다.
또, 본 시스템, 장치 및 방법 등이 환자의 질환 또는 상태를 억제, 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 분리정제된 조성물을 제공하기도 하고, 환자는 포유류일 수 있다.
도 1A-1D. 본원의 방법에 따라 생성된 형질감염-적격 소포(TCV)는 불멸화 세포 및 1차 뉴런에서의 녹다운을 나타낸다. (A) 50% 이온화 양이온 지질로 구성된 유기 무용매, 무세제 TCV로 형질감염 후 HEK-Luc 세포내 상대적 루시퍼라제 발현. (B) 대조군(세포만) 웰의 %로 (A)에 제시된 동일한 형질감염 세트로부터의 세포생존력. (C) 뉴런으로의 siRNA 선별 카고의 유기 무용매, 무세제 TCV 매개 형질감염 후 1차 피질 뉴런에서 hdh mRNA의 상대적 발현. siRNA는 hdh를 표적으로했고, TCV는 1(A)에 제시된 이온화 양이온 지질의 동일한 패널을 사용해 생산되었다. (D) 오프 타겟(루시퍼라제) siRNA를 전달하기 위해 유기 무용매, 무세제 TCV를 사용해 1차 피질 뉴런내 동일한 형질감염 세트에 대해 MTT 감소에 의해 측정된 세포생존력. HEK-Luc 세포의 경우 조건당 N=4, 1차 뉴런의 경우 조건당 N=3 웰. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.00l(대조군(세포만) 조건과 비교하여 각 조건에 대한 일원 분산 분석 후 Bonforroni 사후 분석).
도 2A-2D. 유기 무용매, 무세제 TCV의 효능은 빈 TCV를 생성하는데 사용되는 혼합 방법에 의존하지 않는다. (A) 50% 이온화 지질로 구성되고 T-접합 혼합(DODMA-50%) 또는 압출(DODMA-50%-X)에 의해 형성된 TCV로 형질감염 후 HEK-Luc 세포내 상대적 루시퍼라제 발현. (B) 대조군(세포만) 웰의 %로(A)에 제시된 동일한 형질감염 세트로부터의 세포생존력. (C) 2(A)에 제시된 동일한 TCV 패널을 사용해 hdh를 표적으로 하는 siRNA의 유기 무용매, 무세제 TCV 매개 형질감염 후 1차 피질 뉴런내 hdh mRNA의 상대적 발현. (D) 오프-타겟(루시퍼라제) siRNA를 전달하기 위해 유기 무용매, 무세제 TCV를 사용해 1차 피질 뉴런내 동등한 형질감염 세트에 대해 MTT 감소에 의해 측정된 세포생존력. HEK-Luc 세포의 경우 조건당 N=4, 1차 뉴런의 경우 조건당 N=3 웰. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.0l, ***p<0.00l(대조군(세포만) 조건과 비교하여 각 조건에 대한 일원 분산 분석 후 Bonforroni 사후 분석).
도 3A-3D. 감소된 양의 이온화 지질을 포함하는 유기 무용매, 무세제 빈 TCV는 독성이 감소된 강력한 siRNA 전달을 촉진한다. (A) 이온화 지질 1,2-Dioleyloxy-3-dimethylamino-propane(DODMA)의 20% 또는 50%로 구성된 TCV로 형질감염 후 HEK-Luc 세포에서 상대적 루시퍼라제 발현. (B) 대조군(세포만) 웰의 %로(A)에 제시된 동일한 형질감염 세트로부터의 세포생존력. (C) 3(A)에 제시된 TCV의 동일한 패널을 사용해 hdh를 표적으로 하는 siRNA의 유기 무용매, 무세제 TCV 매개 형질감염 후 1차 피질 뉴런에서 hdh mRNA의 상대적 발현. (D) 오프 타겟(루시퍼라제) siRNA를 전달하기 위해 유기 무용매, 무세제 TCV를 사용해 1차 피질 뉴런에서 동등한 형질감염 세트에 대해 MTT 감소에 의해 측정된 세포생존력. HEK-Luc 세포의 경우 조건당 N=4, 1차 뉴런의 경우 조건당 N=3 웰. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. *p<0.05, **p<0.0l, ***p<0.001(대조군(세포만) 조건과 비교하여 각 조건에 대한 일원 ANOVA 후 Bonforroni 사후 분석).
도 4A, 4B. 유기 무용매, 무세제 빈 TCV에 DOPE를 통합해도 TCV 형태가 변경되지 않는다. Cryo-TEM 분석은 (A) DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG-지질의 TCV에서 20/30/10/39/1 mol%(DOPE = 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-포스포에탄올아민; DSPC = 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린; PEG = 폴리에틸렌글리콜) 및 (B) DODMA/DSPC/Chol/PEG-지질(50/10/39/1 mol%)에서 했다. 스케일 바 = 100nm.
도 5. 유기 무용매, 무세제 빈 TCV는 기능성 리보핵단백질(RNP)을 전달하는데 사용될 수 있다. HEK293 세포를 Cas9 RNP 및 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN) 복구 템플릿으로 형질감염 시켰으며, 둘 다 본원의 방법에 따라 생산된 유기 무용매, 무세제 TCV에 의해 전달되었다. Cas9 단백질은 GRN 유전자를 표적으로 하는 가이드에 복합되었다. DNA는 형질감염 48시간 후에 세포로부터 추출되었다. PCR은 야생형(WT) GRN 대립유전자 또는 돌연변이 GRN 대립유전자를 특이 적으로 검출하는데 사용되었으며, 이는 상 동성 지정 복구(HDR)가 전달된 ssODN을 Cas9에 의해 생성된 DNA 이중가닥 파손에 통합할 때만 존재한다. 돌연변이 GRN 대립유전자는 Cas9 RMP의 TCV 매개 전달 후에 검출될 수 있지만 대조군(Ctrl) 세포에는 존재하지 않는다.
도 6. 1차 뉴런 내에 위치한 Cas9의 현미경 사진. 전술한 바와 같이 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 전달된 RNP는 빨간색으로 표시된 Cas9 단백질에 대한 형광 항체를 사용해 검출할 수 있다. 미처리 대조군에는 이런 빨간 형광신호가 없다. 청색 신호 = 핵산(DAPI 염색), 녹색 신호 = 팔로이딘(F-액틴 염색).
도 7. F1EK 세포에서 빈 유기 무용매, 무세제 TCV로 RNP의 벤치-탑 로딩을 통해 전달된 RNP에 의한 전사 녹다운을 보여주는 그래프. HEK293 세포를 루시퍼라제를 표적으로 하는 Cas9 RNP로 형질감염시켰다. 공식(DODMA/DOPE/DSPC/Chol(20/30/10/40))의 TCV를 벤치에 적재했다. HEK 세포에서 루시퍼라제 mRNA의 상대적 수준은 qPCR로 측정했을 때 대조군(그래프에서"ctrl")에 비해 상당한 녹다운을 나타낸다. 그룹당 N=3. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. 스튜던트 t-테스트에 의한 p = 0.00l8.
도 8. HEK 세포에서 RNP의 벤치-탑 로딩을 통해 빈 유기 무용매, 무세제 TCV로 전달된 RNP에 의한 단백질 녹다운을 보여주는 그래프. HEK293 세포를 루시퍼라제를 표적으로 하는 Cas9 RNP로 형질감염시켰다. 공식(DODMA/DOPE/DSPC/Chol(20/30/10/40))의 TCV를 벤치에 적재했다. HEK 세포에서 루시퍼라제 단백질의 상대적 수준은 ONE-Glo로 측정했을 때 대조군(그래프에서"ctrl")에 비해 상당한 녹다운을 나타낸다. 그룹당 N=3. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. 스튜던트 t-테스트에 의한 p = 0.0003.
도 9. 1차 피질 뉴런에서 빈 유기 무용매, 무세제 TCV로 RNP의 벤치-탑 로딩을 통해 전달된 RNP에 의한 전사 녹다운을 보여주는 그래프. 1차 피질 뉴런을 인간 헌팅틴(HTT)을 표적으로 하는 Cas9 RNP로 형질감염시켰다. 공식(DODMA/DOPE/DSPC/Chol(20/30/10/40))의 TCV를 벤치에 적재했다. 1차 뉴런에서 HTT mRNA의 상대적인 수준은 qPCR로 측정했을 때 대조군(그래프에서"gLuc")에 비해 상당한 녹다운을 나타낸다. 그룹당 N=3. 데이터는 평균±SEM을 나타낸다. Student 's t-test에 의한 p = 0.0039.
도 10. HEK 세포에서 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 전달된 mRNA에 대한 mRNA 발현을 보여주는 그래프. 루시퍼라제 mRNA는 유기 무용매, 무세제 TCV(DODMA/DOPE/DSPC/Chol(20/30/10/40))를 통해 HEK 세포에 다양한 비율로 전달되었다 .Low = 0.029mg mRNA/μmol 지질, 중간 = 0.058 mg mRNA/μmol 지질, 높음 = 0.116 mg mRNA/μmol 지질. 모든 비율은 대조군과 비교하여 유의한 발현을 나타내 었으며 최저 비율은 가장 높은 발현을 나타냈다. ONE-Glo+Tox 키트(Promega)로 측정한 mRNA 발현, 조건당 N=3.
도 11. 1차 피질 뉴런에서 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 전달된 mRNA에 대한 mRNA 발현을 보여주는 그래프. 루시퍼라제 mRNA는 유기 무용매, 무세제 TCV(DODMA/DOPE/DSPC/Chol(20/30/10/40))를 통해 다양한 용량으로 1차 피질 뉴런으로 전달되었다. 모든 투여량은 대조군에 비해 상당한 발현을 보였다. ONE-Glo+Tox 키트(Promega)로 측정한 mRNA 발현, 조건당 N=3.
도 12. HEK 세포에서 유기 무용매, 무세제 TCV에서 RNP에 대한 세포생존력을 보여주는 그래프. RNP는 유기 무용매, 무세제 TCV(DODMA/DOPE/DSPC/Chol(20/30/10/40))를 통해 또는 RNAiMax(도면에서 "Rmax"; ThermoFisher Scientific)를 사용해 HEK 세포에 세포독성 평가를 위해 전달되었다. 유기 무용매, 무세제 TCV는 RNAiMax에 비해 독성이 현저히 낮았다(p = 0.0002). ONE-Glo+Tox 키트(Promega)를 사용해 독성을 평가했다. 그룹당 N=3.
도 13. 1차 뉴런에서 빈 유기 무용매, 무세제 TCV로 siRNA의 벤치-탑 로딩에 대한 세포생존력을 보여주는 현미경 사진. 세포독성 평가를 위해 siRNA는 유기 무용매, 무세제 TCV(DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG-lipid(20/30/10/39/1))를 통해 또는 시판되는 Mirus TKO 시스템(Mirus Bio)을 사용해 1차 뉴런에 전달되었다. 빈 유기 무용매, 무세제 TCV에 벤치-탑 로딩에 의해 전달된 siRNA는 현미경 사진에서 볼 수 있듯이 Mirus TKO 시스템에 비해 독성이 훨씬 적었다.
도 14. HEK 세포에서 유기 무용매, 무세제 TCV에 대한 녹다운을 보여주는 그래프. siRNA는 유기 무용매, 무세제 TCV DODMA 수준을 통해 50%("D-50%"), T 접합 혼합에 의해 제조), 50%("D-50% Ex", 압출에 의해 제조) 및 시판되는 Mirus TKO 시스템(Mirus Bio)을 통해 전달되었다. 현재 50% DODMA 공식은 약 50% 녹다운을 보였지만 Mirus TKO 시스템은 성능이 더 나빴다.
본원에서 시스템, 조성물, 장치 및 방법 등은 DNA와 기타 핵산 선별카고를 표적세포로 안전하고 효율적으로 전달하도록 구성된 지질기반 소포, 즉 형질감염 적격 소포(TCV; transfection competent vesicles)를 제공한다. TCV 적재보관 프로세스(즉, 선별 카고를 TCV에 삽입) 및/또는 TCV 전달과정에서 에탄올과 같은 유기용제와 도데실 황산나트륨과 같은 세제와 같은 방해 물질을 제거함으로써 안전성과 효율성 각각이나 둘다를 부분적으로 달성한다. TCV 전달과정은 선별 카고로 1차 세포와 같은 포유류 세포를 형질감염하는 것을 포함할 수 있다. 선별 카고는 리보핵단백질(RNP)처럼 단백질로 복합된 핵산을 포함할 수 있다.
본원의 시스템, 조성물, 장치 및 방법 등은 유기 무용매, 무세제 빈 지질기반 TCV를 제공한다. 로드된 TCV는 피펫, SHM, T-접합 혼합/압출 방법 또는 원하는 다른 TCV 혼합 방법으로 TCV-생성 유체의 반복적 수동 왕복과 같은 부드러운 혼합을 사용해 생성할 수 있다.
지질기반 TCV는 이온화 양이온 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 PEG-지질의 혼합물로 구성되고, TCV-함유 조성물은 유기용매 및/또는 세제가 없다.
유기 무용매, 무세제 TCV는 예를 들어 유전자 요법을 통해 적절한 질병과 상태의 치료에 사용될 수 있다. 유기 무용매, 무세제 TCV는 인간 환자에 대한 RNA, DNA 및 RNP 유전자치료 제품의 전달을 개선한다. 유기 무용매, 무세제 TCV는 유전자치료(mRNA, siRNA 및 RNP를 포함하되 이에 국한되지 않음) 제품을 뇌세포나 기타 표적세포에 효과적으로 전달한다. 많은 인간 장애의 근본 원인은 필요한 단백질의 기능상실이나 돌연변이 단백질의 독성기능획득이다. 이런 원인은 유기 무용매, 무세제 TCV를 사용해 치료내지 반전시킬 수 있다.
이런 치료의 예로 신경계 장애(알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅턴병, 전측두엽 치매, 근위축성 측삭 경화증, 척추 근위축증 등)를 치료하기 위한 중추신경계에서의 유전자 요법을 포함한다.
전술한 무용매, 무세제 TCV는 또한 예를 들어 siRNA나 RNP의 표적화된 안전한 전달, mRNA를 사용한 유전자 대체요법, 또는 RNP-매개 유전자 편집을 이용한 인과적 네이티브 DNA 돌연변이의 교정을 통해 돌연변이 유전자/유전자 생성물을 유전적으로"녹다운"시킬 수 있다. 이런식으로 표적화할 수 있는 인간 질병의 두 가지 예로 헌팅턴병(HD)과 전두측두엽 치매(FTD)가 있다.
헌팅턴병은 지배적인 유전 패턴을 갖는 진행성, 불치성, 신경퇴행성 질환이다. 헌팅틴(HTT) 유전자의 확장된 CAG 뉴클레오티드 반복 서열이 질병의 원인이다. 돌연변이 HTT 유전자로 암호화된 헌팅틴 단백질(HTT)은 유전자 산물에 독성기능획득을 부여하는 확장된 폴리글루타민 반복을 포함한다. 돌연변이 헌팅틴 단백질의 뇌 수준을 낮추는 것은 현재 HD에서 질병 진행을 늦추거나 중지시키도록 추구되고있는 주요 치료 전략이며, 전술한 바와 같이 무용매, 무세제 TCV를 사용해 효과를 보고 개선될 수 있다. HTT 발현을 표적으로 하는 siRNA 또는 헌팅틴 발현이나 독성을 낮추도록 설계된 RNP 선별카고를 탑재한 TCV는 HD 치료에 효과적인 치료법이 될 것이다. 전측두엽성 치매에는 많은 원인이 있지만 단백질 프로그래눌린(잠재적 뇌생존인자)의 손실이 그중 하나이다. 무용매, 무세제 TCV는 프로그래눌린을 발현하거나 프로그래눌린 손실을 유발하는 근본적인 DNA 돌연변이를 수정하도록 설계된 프로그래눌린 mRNA나 RNP를 전달할 수 있으며 프로그래눌린의 뇌수준을 증가시키고 FTD에 대한 효과적인 치료법이 될 것이다. 프로그래눌린 mRNA를 발현하는 TCV로 프로그래눌린을 증가시키는 것은 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 근위축성 측삭 경화증과 같은 많은 일반적인 신경 질환에 대한 신경 보호 전략이 될 수도 있다.
재료 및 방법의 예
재료
1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노-프로판(DODMA)을 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)에서 구입했다. 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판(DODAP), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), l,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)을 Avanti Polar Lipids(Alabaster, AL)에서 구입했다. 콜레스테롤은 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입했다. PEG-DMG는 전술한대로 합성되었다(Akinc, Zumbuehl et al. 2008). 모든 지질은 에탄올 스톡으로 유지되었다. 반딧불이 루시퍼라제(siLuc)를 표적으로 하는 siRNA(Basha, Ordobadi et al. 2016)는 Integrated DNA Technologies(Coralville, IA)에서 구입했다. 뮤린 hdh에 대한 siRNA는 Ambion(Silencer® Select Pre-designed siRNA, Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 구입했다.
형질감염 적격 소포(TCV)의 준비
지질 성분(이온성 양이온 지질, 인지질, 콜레스테롤 및 PEG-지질)을 적절한 비율로 에탄올에 용해시켜 최종 농도의 총 지질 20-35 μM를 구했다. 25μM 아세트산 나트륨 pH4 완충액을 함유한 수성 상을 제조했다. 2가지 나노입자 제조기술인 급속혼합과 압출법을 이용해 2 용액을 결합했다.
급속-혼합:
PEEK 저압 티 어셈블리(1/16", 0.02 in thru hole, Part # P-712)의 사양을 충족하도록 제작된 T-접합 믹서를 통해 1:3 유기:수성(v/v) 비율의 최종 유량 20 mL/min로 지질을 함유한 유기 상을 수성 상과 혼합했다(Jeffs, Palmer et al. 2005; Kulkami, Tam et al. 2017; Kulkami, Darjuan et al. 2018). 생성된 현탁액을 1000배 부피의 25μM 아세트산 나트륨 pH4 완충액에 대해 투석하여 에탄올을 제거했다.
압출:
지질을 에탄올에 용해시켜 최종 농도가 35μM이 되도록 했다. 25μM 아세트산나트륨 pH4를 에탄올 용액에 빠르게 첨가하여 입자를 생성하여 30% 에탄올(v/v)의 최종 농도를 구했다(Maurer, Wong et al. 2001). 생성된 나노입자 현탁액을 주변온도에서 2x 80nm 폴리카보네이트 막을 통해 3회 압출했다. 압출 후, 입자를 완충액 교환하여 에탄올을 제거했다.
형질감염 적격 소포(TCV) 분석
T-콜레스테롤 분석 키트(Wako Chemicals, Mountain View, CA)를 사용해 콜레스테롤 함량을 분석하고 총 지질 농도를 외삽하여 지질농도를 결정했다(Chen, Tam et al. 2014). 핵산 포획은 RiboGreen Assay를 이용해 결정되었다(Chen, Tam et al. 2014; Leung, Tam et al. 2015).
극저온 투과 전자현미경
전술한대로 Cryo-TEM을 했다(Kulkami, Darjuan et al. 2018). 요컨대, Amicon 원심농축기(10kDa NWCO)를 사용해 약 20mg/mL의 총 지질 농도로 TCV를 농축했다. 소량의 재료(3-5 uL)를 글로우 방전 구리격자에 도포하고 FEI Mark IV Vitrobot(Hillsboro, OR)을 사용해 플런지 냉동했다. 이 격자를 촬영 전까지 액체질소에 저장했다. 모든 촬영은 저선량 모드에서 200kV에서 작동하는 FEI Tecnai G2 기기를 사용해 했다. FEI Eagle 4k CCD 하단 장착 감지기를 사용해 이미지를 캡처했다. 모든 샘플 준비와 촬영은 UBC Bioimaging Facility(Vancouver, BC)에서 했다.
세포배양 및 시약:
모든 기본 세포배양 배지와 B27 신경세포 보충제는 Gibco(Thermo Fisher, Waltham, MA)에서 구입했다. Hank의 균형잡힌 소금 용액(HBSS; Hank's balanced salt solution), 페니실린-스트렙토마이신, L-글루타민 및 트립신 용액은 Hyclone(Logan, UT)에서 구했다. HEK293 세포는 Coming(Corning, NY)의 투명 바닥 백색벽 플레이트에 플레이팅되었다. 1차 피질세포를 폴리-D-라이신(Sigma, St. Louis, MO)으로 코팅한 조직 배양-처리 플레이트(Fisher)에 플레이팅했다. 하이그로마이신 B는 Invitrogen(캘리포니아 주 칼스배드)에서 구입했다. 재조합 ApoE4는 Peprotech(Rocky Hill, NJ)에서 구입했다.
HEK293 세포에서 세포생존력과 루시퍼라제 수준을 측정하기 위해, Promega(위스콘신 주 매디슨 소재)의 ONE-Glo + Tox 키트를 사용했다. 1차 뉴런의 세포생존력은 Sigma(미주리 주 세인트루이스)의 MTT 시험관내 독성 키트로 측정했다.
루시퍼라제 리포터 HEK293 세포:
안정적으로 통합된 루시퍼라제 리포터 컨스트럭트(HEK-Luc 세포)를 사용한 HEK293 세포주의 생성은 이전에 설명되었다(De Souza, Islam et al. 2016). 세포는 습도 95% 공기, DMEM 고포도당내 5% CO2에서 37℃로 유지되었고, 10% 우태아 혈청, 2μM L-글루타민 및 125 ㎍/mL 하이그로마이신 B가 보충되었다. 이 세포는 백색벽 96-웰 플레이트에 12,000-20,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅되었다.
1차 세포배양:
배아일 E17.5 C57BL/6I 및 FVB.YACT28 쥐에서 마우스로부터 피질 배양물을 준비했다. 요컨대, 피질을 얼음처럼 차가운 HBSS에서 해부하고, 조직을 37℃에서 10분 동안 0.05% 트립신(Hyclone) 용액을 사용해 소화시켰다. 다음, 피질을 5mL 피펫을 통해 5회 분쇄하고 200㎕ 피펫 팁을 추가하여 추가로 5-7회 분쇄했다. 세포를 800rpm에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화하고 HBSS로 세척한 다음, B27, 2μM L-글루타민(하이클론) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(하이클론)이 보충된 따뜻한 신경기저 배지에 현탁했다. 피질 뉴런 배양물을 1.5 x 105 세포/웰의 밀도로 폴리-D 리신 코팅 24-웰 플레이트에 플레이팅했다. 세포는 95% 공기, 5% CO2의 가습 분위기에서 37℃로 유지되었다.
형질감염:
모든 시약을 벤치-탑에서 혼합했다. 50% 양이온 지질을 함유한 빈 TCV를 μmol 지질 당 0.058 mg siRNA의 비율로 siRNA와 혼합했다. 20% 양이온 지질을 함유한 TCV는 μmol 지질 당 0.022 mg siRNA로 혼합되었다. TCV 현탁액을 피펫으로 siRNA와 간단히 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양했다.
HEK293 세포를 형질감염 24시간 전에 플레이팅했다. 최종 농도가 3.3㎍/mL siRNA가되도록 TCV:siRNA 혼합물에 완전한 DMEM 배지를 첨가하고, 형질감염시 배지를 완전한 바꿨다.
1차 신경세포를 형질감염 전 7일 동안 시험관 내에서 성장시켰다. 2-6 ㎍/mL의 재조합 ApoE4가 포함된 완전한 신경기저 배지를 TCV:siRNA 현탁액에 추가하고, 배지의 절반을 각 웰에서 교체했다.
루시퍼라제 분석:
형질감염 48 내지 72시간 후, HEK293 세포를 제조업체의 지침에 따라 ONE-Glo + Tox 키트(Promega)를 사용해 세포생존력 및 발광에 대해 분석했다. 요컨대, 생세포 시약을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 배양했다. 400nm의 파장으로 플레이트 리더(POLARstar Omega 플레이트 리더, BMG LABTECH)에서 플레이트를 분석했고, 50nm의 방출 파장에서 판독했다. 이어서 ONE-Glo 시약을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 3분 동안 배양했다. 동일한 플레이트 리더의 렌즈를 통해 출력되는 광을 통해 발광을 측정했다. 측정값은 % 대조군으로 표시되며 조건당 N=4 웰을 나타낸다.
MTT 분석:
24-웰 플레이트에서 형질감염 72시간 후 MTT 분석을 통해 1차 피질 뉴런의 세포생존력을 분석했다. MTT 시약(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 또는 MTT)을 HBSS에서 최종 농도 5mg/mL로 재구성하고 각 웰에 10% v/v로 첨가했다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 배양했다. 배지를 제거하고 250㎕ 가용화 용액을 각 웰에 첨가했다. 흡광도는 570nm에서 측정했다. 값은 % 대조군으로 표시되며 조건당 N=3 웰을 나타낸다.
정량적 RT-PCR
부착된 1차 피질세포는 1% 2-머캅토에탄올을 함유한 600㎕ 용해 완충액에서 플레이트를 긁기 전에 멸균 PBS에서 1회 세척하고 바로 -80℃에서 냉동시켰다. 이후, 제조업체의 지침에 따라 수행된 PureLink RNA 미니 키트(Invitrogen)를 사용해 총 RNA를 추출했다. 제조업체의 지침에 따라 Superscript VILO 키트(Invitrogen)를 사용해 모든 샘플의 역전사를 했고, cDNA 합성을 위한 입력으로 250㎍의 총 RNA를, 정량적 PCR 반응을 위해 5 ㎍ 희석된 RNA를 사용했다. 표준 곡선법을 이용해 hdh mRNA 수준의 정량화를 했고, 별도의 웰에서의 표적 mRNA와 대조군 유전자의 증폭은 FastSybr(Ap㎕ied Biosystems)을 사용해 Step-One ABI 시스템(Ap㎕ied Biosystems)에서 했다. 각 샘플은 중복으로 실행되었다. 각 웰에서의 상대적인 mRNA 양은 hdh mRNA와 대조군 유전자 Csnk2a2 사이의 비율로 계산되었다. 값은 % 대조군으로 표시되며 조건당 N=3 웰을 나타낸다.
리보핵단백질(RNP) 복합 물질 및 형성
가이드 RNA(gRNA), tracrRNA, 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오타이드(ssODN) 및 재조합 Cas9 단백질을 포함한 RNP 제형을 위한 모든 재료는 IDT(캘리포니아 주 산호세)에서 구입했다. 루시퍼라제를 표적으로 하는데 사용된 gRNA 서열은 IDT에서 제공했다. 인간 프로그래눌린(GRN)을 표적으로 하는 gRNA 서열은 유전자의 exon5에 결합한다. 상동성재조합(HDR; homology directed repair)에 사용된 ssODN 서열은 GRN의 exon5에 4bp 결실을 도입하도록 설계되었다.
제조자의 사양대로 RNP 조립을 했다. 즉, 1μM tracrRNA와 같은 crRNA:tracrRNA의 등몰 비율을 IμM gRNA와 함께 95℃에서 5분 동안 배양해 가이드 RNA(gRNA) 복합체를 형성했다. 다음, 혼합물을 실온에서 20-30분 동안 냉각시켰다. 이어서, gRNA 듀플렉스와 Cas9 단백질을 등몰 비율로 결합하고 사용 전에 혼합물을 실온에서 5분간 두어 RNP를 형성했다.
핵산으로 포유류 세포의 형질감염:
비교를 위해 시중의 시약뿐만 아니라 전술한 빈 유기 무용매, 무세제 TCV를 벤치-탑에서 선별 카고와 혼합했다. TCV는 μmol 지질 당 0.01-0.2 mg 핵산 비율의 범위로 핵산 선별 카고와 혼합되었다. TCV 현탁액을 피펫으로 siRNA와 간단히 혼합하고 실온에서 10분 동안 배양했다.
HEK293 세포를 형질감염 24시간 전에 플레이팅했다. 최종 농도 0.33-3.3㎍/mL siRNA 또는 0.1-l㎍/mL mRNA에 대해 완전한 DMEM 배지를 TCV:핵산 혼합물에 첨가했고, 형질감염시 완전한 배지 변경이 되었다. 1차 신경세포를 형질감염 전 7일 동안 시험관 내에서 성장시켰다. 2-6 ㎍/mL의 재조합 ApoE4가 포함된 완전한 신경기저 배지를 TCV:핵산 현탁액에 첨가하고 웰마다 배지의 절반을 교체했다.
제조업체의 지침에 따라 세포를 Mirus TransIT-TKO로 처리했다. 즉, Mirus TransIT-TKO를 5㎕ Mirus/100㎕ 무혈청 배지의 농도로 무혈청 배지에 첨가했다. 다음, siRNA를 튜브에 첨가하고 부드럽게 피페팅으로 혼합하고 실온에서 15-30분 동안 배양했다. 다음, 이 용액을 세포에 전사했고, Mirus의 최종 농도는 5㎕/l mL의 완전 배지였다. siRNA의 최종 농도는 25nM였다.
RNP를 사용한 포유류 세포의 형질감염:
0.5-20mM TCV와 0.5-20μM RNP를 467-5000 몰비로 조합하고 실온에서 10분 동안 배양하도록 했다. 별도로, ssODN의 1-10μM 용액을 TCV와 결합하고, 이 혼합물을 실온에서 5-15분 동안 배양했다. 일부 경우에, TCV 첨가 전에 등몰량의 ssODN을 RNP 복합 용액에 첨가했다.
RNP와 ssODN 혼합물을 함유한 TCV를 결합하고, 완전한 배지를 최종 농도 10~200nM의 RNP와 ssODN 각각에 첨가했다. 24시간 전에 플레이팅된 HEK 세포에서 전체 배지를 바꿨다. 1차 신경세포를 형질감염 전 5-7일 동안 시험관 내에서 성장시켰다. 2-6 ㎍/mL의 재조합 ApoE4가 포함된 완전한 신경기저 배지를 TCV:NP 혼합물에 첨가하고 배지의 절반을 각 웰에서 교체했다.
제조업체의 지침에 따라 세포를 Lipofectamine RNAiMAX 시약으로 처리했다. 즉, RNP 복합체를 준비해 무혈청 배지와 RNAiMAX의 혼합물에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 배양한 다음 플레이팅된 세포에 첨가했다.
상동재조합 검출을 위한 PCR
야생(WT)이나 돌연변이 GRN 대립유전자에 특이한 정방향 프라이머와 일반 역방향 프라이머를 사용해 형질감염 HEK293 배양물에서 추출된 게놈 DNA에서 GRN exon 5를 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용해 증폭했다. 제조업체의 지침에 따라 MyTaq(Bioline, USA)을 사용해 PCR을 했다. PCR 산물은 SybrSafe로 염색된 1.5% 아가로스 겔에서 겔 전기영동으로 분리하고 UV광으로 촬영했했다.
면역세포화학
3-4% 파라 포름알데히드 용액으로 세포를 15분 동안 고정시켰다. 0.1% Triton-X(PBST)를 함유한 PBS에서 15분간 세포를 투과했다. anti-Cas9(Invitrogen) 항체의 1:1000 혼합물을 함유한 PBST로 이 세포를 4℃에서 밤새 배양했다. 세포를 PBS로 3회 세척하고 각각의 Alexa Fluor 594 형광 2차 항체(Invitrogen) 및 Phalloidin-iFluor 488 CytoPainter 항체(Abeam)의 1:1000 혼합물로 실온에서 1시간 배양하고, 다시 세척하고, 핵을 보여주기 위해 DAPI를 함유한 용액으로 5분간 배양했다.
통계
Bonferroni post-hoc 분석을 이용한 일원 분산 분석법(ANOVA)으로 전체 통계들을 비교해 개별 평균을 대조-처리된 세포와 비교하고 다중 비교를 수정했다(Prism 6, Graphpad Software Inc.). 두 그룹만 개별 평균을 비교하는데 Student's t-test가 사용되었다. 0.05 미만의 p-값은 중요한 것으로 간주되었다.
결과-관련 실시예
실시예 1: 빈 형질감염 적격 소포(TCV)는 유기용매없이 핵산을 효율적으로 포획한다.
T-접합이나 SHM 혼합으로 생긴 빈 TCV 제제는 약 85% 이상의 포획효율을 보였다. 유기용제나 세제의 도움없이 핵산을 포획하기 위해, 관찰된 생체내 유전자 침묵 효능 범위(DODMA≫DLinDAP> DODAP)("DLinDAP"는 1,2-dilineoyl-3-dimethylammonium-propane임)에 걸친 이온화 양이온 지질로 구성된 TCV의 능력을 먼저 테스트했다. 놀랍게도, 에테르 없이, 이온화 지질/DSPC/Chol/PEG-지질(50/10/39/1 mol%)로 구성된 제형은 0.058 mg siRNA/μmol 지질의 비율로 pH4에서 혼합한 다음 PBS로 중화했을 때 거의 완전한 siRNA 포획(>85%)을 달성한다(표 1 참조). 포획을 결정하기 위한 분석은 지질 성분에 의한 핵산에서 RNA 결합 염료의 배제를 기반으로 한다. 따라서 포획은 일시적인 방식 이상의 방식(즉, 안정적인 포획)으로 외부 배지로부터 RNA를 격리하는 것으로 간주된다. 생산과정에서 유기용매나 세제가 부족해도, 수득된 TCV 제형은 놀랍게도 유기용매를 사용한 신속한 혼합 기술로 생긴 LNP-siRNA에 대해 달리 보고된 것과 비슷한 포획효율을 보였다(Belliveau, Huft et al. 2012; Chen, Tam et al. 2014; Leung, Tam et al. 2015; Chen, Tam et al. 2016).
TCV의 다양한 제형에 대한 핵산의 포획효율.
명칭 지질 제형 제형 과정 포획효율, %
(평균±SEM)
DODMA-50% DODMA/DSPC/Chol/PEG
(50/10/39/1)		 T-접합
혼합		 87.90 ± 3.94
DLinDAP-50% DLinDAP/DSPC/Chol/PEG
(50/10/39/1)		 T-접합
혼합		 4.44 ± 7.18
DODAP-50% DODAP/DSPC/Chol/PEG
(50/10/39/1)		 T-접합
혼합		 71.84 ± 5.76
실시예 2:유기 무용매, 무세제의 빈 TCV내 siRNA는 불멸화 세포와 1차 뉴런에 강력한 녹다운을 나타냄
핵산을 포획해 무독성 방식으로 전달하는 능력은 2가지 장애물을 나타낸다. 전술한 비유기용매/비세제지질 기반 TCV가 핵산을 효율적으로 포획한다고 결정했을 때, 유전자를 침묵시키고 세포생존력에 영향을 주는 능력을 2가지 시나리오로 테스트했다(도 1A~D 참조). 첫째, 빈 유기 무용매, 무세제 TCV를 벤치-탑 로딩을 사용해 siLuc와 결합하고 HEK-Luc 세포를 처리하는데 사용했다. 놀랍게도, DODMA 기반 TCV는 약 50%의 넉다운을 보여주었고 넉다운의 징후를 보이지 않는 DLinDAP과 DODAP보다 좋은 성능을 보였다(도 1A). 미처리 세포와 비교해 세포생존력으로 측정된 어떤 제제도 독성을 나타내지 않았다(도 1B). 둘째, siRNA를 전달하는 TCV의 효능과 독성을 1차 마우스 피질 뉴런의 hdh 유전자에 대해 테스트했다. 다시 한번(도 1C), DODMA-TCV는 약 50%의 유전자 녹다운 효능을 보인 반면, DLinDAP-TCV는 더 적은 녹다운을 보였고, DODAP-TCV는 미처리 세포와 차이가 없었다. 1차 뉴런은 현재 시판중인 것과 같은 유해한 형질감염 시약의 독성 효과에 매우 민감하다는 점에 유의해야한다. 도 13은 생존력에 미치는 영향의 차이점을 강조한다.
실시예 3: 여러 혼합 과정들을 통해 강력한 유기 무용매, 무세제 빈 TCV를 생성할 수 있음
도 1에 도시된 효능을 달성하기 위한 제조공정의 혼합의 역할과 생성된 입자 크기를 결정하기 위한 노력으로, DODMA와 같은 이온화 지질을 함유한 유기 무용매, 무세제 지질기반 빈 TCV를 T-접합 혼합과 압출로 생산했다. 도 2A와 같이, siRNA를 빈 TCV에 벤치-탑 로딩한 후 2 공정을 이용한 HEK-Luc 세포에서 루시퍼라제의 상당한 녹다운이 발생했다. T-접합이나 압출로 생성된 입자로 처리된 세포의 생존력에는 별 차이가 없었다(도 2B). 다음, 1차 피질 뉴런을 동일한 무용매, 무세제 지질기반 TCV 제형으로 처리했고, 2 공정 모두 비슷한 효능(도 2C)과 세포생존력(도 2D)을 갖는 입자를 생성하는 것으로 확인되었다. 반면에, 1차 배양에서 현재 형질감염 방법(도 13)의 독성은 무독성이지만 강력한 제형의 목표를 손상시킨다.
실시예 4: 저량의 이온화 지질을 함유한 유기 무용매, 무세제 빈 TCV는 낮은 독성의 강력한 siRNA 전달을 촉진함
현재 임상 제형에 사용되는 확립된 지질 조성물(Patisiran 참조)은 상당량의 이온화 양이온 지질(50 몰%)을 포함한다(Jayaraman, Ansell et al. 2012; Suhr, Coelho et al. 2015). 이런 많은 양은 생체내 50% 유전자 침묵(ED50)을 달성하기 위한 유효 용량의 개선을 허용하지만(Jayaraman, Ansell et al. 2012), 투여 후 지질 대사의 지속성과 이런 분자와 관련된 독성은 고용량 요법과 반복 투여(또는 민감한 세포 유형)에서 제형을 독성화한다(Maier, Jayaraman et al. 2013; Sabnis, Kumarasinghe et al. 2018). 현재의 조성물, TCV 등은 생분해되거나 제거를 촉진하는 물질로 구성될 수 있다. 현재의 조성물, TCV 등은 형질감염 효능을 유지하는 독성 성분의 양을 감소시킨다.
HEK-Luc 세포에서 루시퍼라제를 침묵시키기 위한 DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG-지질(각각 20/30/10/39/1 mol%)로 구성된 제형의 형질감염 능력을 시험했다. 루시퍼라제 발현의 40% 녹다운이 관찰되었으며(도 3A) 유의한 독성은 없었다(도 3B). 다음, 50 mol%에서 DODMA-TCV와 비교하여 1차 뉴런에 siRNA를 전달하는 20mol%의 이온화 지질을 가진 TCV의 능력을 테스트했다. 모든 제형은 hdh의 60%까지의 녹다운을 보인 반면, T 접합 혼합을 통해 생성된 DODMA 제형은 현저하게 향상된 세포생존력을 보였다(도 3C).
실시예 5: DOPE의 혼입이 유기 무용매, 무세제의 빈 TCV 형태를 변경하지 않음
핵산전달수단내 HII상 형성의 잠재력을 향상시키는 것은 엔도솜의 막 융합을 촉진하는 중요한 요소가 될 수 있다(Hafez, Maurer et al. 2001). 현재 방식에서, HII 상을 채택할 수 있는 2가지 지질은 (단독의) DOPE와 (양성자화되고 음이온 지질과 결합된) DODMA이다. 유기 무용매, 무세제 TCV에 DOPE를 혼입해 조기 HII상이 형성되었는지 확인하기 위해, 20 mol% DODMA-TCV와 50 mol% DODMA로 구성된 등가 제형에 cryo-TEM을 했다. 그 결과 구조들(그림 4A, 4B)은 HII상의 표시가 없는 이중층 구조로 보인다.
다른 사람들의 이전 연구는 siRNA 함량에 관계없이 핵심 LNP 제형내 HII-유사 내부 구조의 존재를 제시했다(Leung, Hafez et al. 2012; Leung, Tam et al. 2015). 이는 LNP-siRNA가 이런 구조를 갖지 않고 오히려 밀접하게 배치된 지질층들 사이에 고정된 siRNA를 가져 다층이나 양파와 같은 형태를 제공하는 것으로 나타났기 때문이다(Kulkarni, Darjuan, 2018). siRNA가 없으면, LNP 제형은 유상 지질을 함유한 전자 밀집 코어를 채택한다. 따라서, 본원의 실시예들은 TCV 형태가 LNP 시스템과 크게 다르지만 여전히 매우 효율적인 형질감염 효능을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 6: 기능성 리보핵단백질(RNP)을 전달하는데 유기 무용매, 무세제 빈 TCV를 사용할 수 있음
도 5와 같이, 핵산과 복합된 단백질 선별카고를 포유류 세포에 전달하는 능력에 대해 유기 무용매, 무세제의 빈 TCV를 시험했다. 즉, 재조합 Cas9 단백질과 프로그래눌린 유전자의 exon 5를 표적으로 하는 가이드 RNA로 구성된 리보핵단백질 복합체를 조립하고, 467:1(TCV:RNP 복합체)의 몰비로 벤치-탑 로딩(DODMA/DOPE/DSPC/Chol/(각각 20/30/l0/40 몰%))을 통해 빈 TCV와 결합했다. 별도로, 프로그래눌린 유전자의 exon 5에 4bp 결실을 도입하도록 설계된 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오티드를 4275:1(TCV:핵산)의 몰비로 TCV와 결합했다. 각각의 선별 카고를 함유한 2가지 TCV 제제를 결합하여 최종 농도 10nM RNP와 10nM ssODN을 구해 HEK 세포에 첨가했다. 48시간 후, 야생형이나 돌연변이 대립유전자에 특이한 순방향 프라이머를 사용해 프로그래눌린 유전자 표적에서 상동재조합이 일어났는지 여부를 PCR을 사용해 판단했다. 도 5와 같이, 각 리보핵단백질 복합체와 ssODN을 포함하는 TCV의 조합에 노출된 세포는 상동재조합를 통한 4bp 결실의 삽입을 일으키지만(도 5의 2번째 레인, 돌연변이 참조), 미처리 대조군 세포는 프로그래눌린 유전자의 exon 5 부위에서 어떤 유전자변형도 일으키지 않았다(도 5의 3~4 레인 참조).
실시예 7:기능성 리보핵단백질(RNP)을 전달하는데 사용되는 유기 무용매, 무세제의 빈 TCV의 다른 예
전술한 방법으로 기능성 리보핵단백질(RNP)을 전달하는데 유기 무용매, 무세제의 빈 TCV를 사용했다.
도 6은 1차 뉴런내에 위치한 Cas9의 현미경 사진이다. 전술한 바와 같이 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 전달된 RNP는 1차 뉴런에서 형광신호로 보이고; 미처리 대조군에는 이런 형광신호가 없다. 구체적으로, 1차 신경세포의 면역세포화학은 쥐의 피질 뉴런의 핵(파란색)의 Cas9 단백질(빨간색)의 국소화를 보여주었다. 이 세포는 세포 형태를 보여주도록 팔로이딘(녹색)으로 염색되었다.
도 7은 HEK 세포에서 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 전달된 RNP에 의한 유전자 녹다운을 보여주는 그래프이다. 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 HEK 세포로 전달된 RNP는 대조군(그래프의 "ctrl")에 비해 루시퍼라제 전사체의 상당한 녹다운을 보인다. 도 8은 HEK 세포에서 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 전달된 RNP에 의한 단백질 녹다운을 보여주는 그래프로, 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 HEK 세포로 전달된 RNP는 대조군(그래프의 "ctrl")에 비해 루시퍼라제 단백질의 현저한 녹다운을 보인다(p=0.0003).
도 9는 1차 뉴런에서 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 전달된 RNP에 의한 유전자 녹다운을 보여주는 그래프이다. 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 1차 피질 뉴런으로 전달된 RNP는 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR) 분석법으로 상당한 mRNA 녹다운을 보인다(p=0.0039)
도 7~8은 빈 TCV의 벤치-탑 로딩을 통해 전달된 RNP가 HEK 세포에서 리포터 유전자, 루시퍼라제의 강력한 녹다운을 보이는 것을 나타낸다. 이것은 qRT-PCR을 통해 루시퍼라제 mRNA의 mRNA 수준뿐만 아니라 루시퍼라제 출력(기능성 단백질)을 측정해 입증되었다. 이와 동일한 RNP 전달 방식을 사용해 FVB.YAC128 마우스에서 파생된 피질 뉴런내 헌팅틴 유전자의 발현을 방해하여 돌연변이 질병을 띠는 전장 인간 헌팅틴 유전자를 발현했다(도 9). TCV:RNP 혼합물로 72시간 배양한 후 qRT-PCR을 사용해 1차 피질 뉴런에서 헌팅틴의 mRNA 수준을 정량화했다.
실시예 8: 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 전달된 mRNA의 예
전술한 방법으로 mRNA를 전달하는데 유기 무용매, 무세제 빈 TCV의 벤치-탑 로딩을 이용했다.
도 10은 HEK 세포에서 유기 무용매, 무세제 TCV를 통해 전달된 mRNA의 발현을 나타낸 그래프다. mRNA는 유기 무용매, 무세제 TCV(DODMA/DOPE/DSPC/Chol(20/30/10/40))를 통해 여러 비율, low=0.029 mg mRNA/μmol 지질, mid=0.058 mg mRNA/μmol 지질, high=0.116 mg mRNA/μmol 지질로 HEK 세포에 전달되었다. 모든 비율은 대조군과 비교하여 유의한 발현을 보였고, 최저 비율이 최고 발현을 보였다.
도 11은 1차 피질 뉴런에서 빈 유기 무용매, 무세제 TCV의 벤치-탑 로딩을 통해 전달된 mRNA의 발현을 보여주는 그래프다. mRNA는 유기 무용매, 무세제 TCV(DODMA/DOPE/DSPC/Chol(20/30/10/40))를 통해 다른 용량으로 1차 피질 뉴런에 전달되었다. 모든 용량이 대조군에 비해 상당한 발현을 보였다.
도 10은 전술한 바와 같이 유기 무용매, 무세제 빈 TCV의 벤치-탑 로딩이 기능성 단백질을 암호화하는 mRNA를 세포로 전달하는데 사용될 수 있음을 입증한다. 요컨대, 유기 무용매, 무세제 TCV를 0.029-0.116 mg 핵산:lμmol 지질의 비율 범위로 반딧불이 루시퍼라제 mRNA를 코딩하는 mRNA와 피펫으로 부드럽게 혼합했다. 이 혼합물을 실온에서 5-20분 동안 배양한 다음, 완전한 배양 배지를 첨가한 뒤, HEK 세포(도 10 참조)나 1차 피질 뉴런(도 11)을 포함한 웰로 옮겼다. 제조업체의 지침에 따라 Promega의 ONE-Glo 루시퍼라제 분석 키트를 사용해 루시퍼라제 출력을 측정했다. 결과는 선별 카고:TCV 농도 및 용량 범위에 걸쳐 이런 세포 유형내의 루시퍼라제 단백질의 생산을 보여준다.
실시예 9: 유기 무용매, 무세제 TCV와 시판 제품의 비교
빈 유기 무용매, 무세제 TCV의 벤치-탑 로딩을 사용해 siRNA나 RNP를 전술한 방법으로 HEK 세포나 1차 뉴런에 전달한 다음, 시중의 시스템을 이용해 동등한 형질감염과 대조했다. 유기 무용매, 무세제 TCV가 시중 시스템을 능가했다.
도 12는 HEK 세포내 유기 무용매, 무세제 TCV에 대한 세포생존력을 보여주는 그래프다. 유기 무용매, 무세제 TCV(DODMA/DOPE/DSPC/Chol(20/30/10/40))를 통해서나 RNAiMax("Rmax"; ThermoFisher Scientific)을 이용해 세포독성 평가를 위해 HEK 세포에 RNP를 전달했다. 유기 무용매, 무세제 TCV는 RNAiMax에 비해 독성이 현저히 낮았다(p = 0.0002).
도 13은 1차 뉴런내 빈 유기 무용매, 무세제 TCV로의 siRNA의 벤치-탑 로딩에 대한 세포생존력을 보여주는 현미경 사진이다. 유기 무용매, 무세제 TCV(DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG-lipid(20/30/10/39/1))를 통해서나 시중의 Mirus TKO 시스템(Mirus Bio)을 이용해 세포독성 평가를 위해 1차 뉴런에 siRNA를 전달했다. 사진에서 보듯이, 유기 무용매, 무세제 TCV가 Mirus TKO 시스템에 비해 독성이 현저히 낮았다.
도 14는 HEK 세포내 유기 무용매, 무세제 TCV에 대한 녹다운을 보여주는 그래프다. 50%(T 접합 혼합에 의한 "D-50%"), 50%(압출에 의한 "D-50% Ex")로 유기 무용매, 무세제 TCV DODMA 수준을 통해서나 시중의 Mirus TKO 시스템(Mirus Bio)을 통해 siRNA가 전달되었다. 현재의 50% DODMA 제제는 약 50% 녹다운을 보인 반면 Mirus TKO 시스템은 현저하게 더 나빴다.
도 12는 전술한 바와 같이 빈 유기 무용매, 무세제 TCV로의 siRNA의 벤치-탑 로딩이 쥐와 HEK 세푸조에서 파생된 1차 신경세포에서 낮은 독성 특성과 효율적인 발현 녹다운을 갖는 것을 보여준다. 1차 피질 뉴런의 치료를 위해, TCV를 약 0.022-0.058 mg 핵산:1μmol 지질의 비율로 siRNA와 혼합하고 1차 뉴런 세포를 포함하는 웰로 옮겼다. 도 13의 현미경 사진은 모두 동일한 배율로 촬영한 것으로, 대조군과 TCV-처리 웰에서는 죽은 세포수가 아주 적어 세포가 건강해 보여준다. Mirus TransIT-TKO-처리 웰에서는, 손상되고 죽은 세포의 양이 많아 세포가 덜 건강해 보인다.
도 12의 경우, HEK 세포를 리포펙타민 RNAiMAX 및 RNP 선별카고를 포함한 TCV로 처리했다. HEK 세포는 최종 농도 5-50nM RNP와 TCV나 RNAiMAX 시약으로 처리되었다. Promega ONE-Glo+Tox 키트를 사용해 세포생존력을 평가하고 미처리 대조군 세포와 비교했다. RNAiMAX로 처리된 HEK 배양은 대조군과 TCV 처리된 웰 모두에 비해 전반적인 건강이 현저하게 나빠진 것으로 나타났다.
도 14는 시중 제품인 Mirus LT-TKO와 비교하여 siRNA 선별 카고를 전달함에있어서 전술한 바와 같이 빈 유기 무용매, 무세제 TCV의 벤치-탑 로딩의 효과를 보여준다. TCV는 약 0.022-0.058 mg 핵산:1μmol 지질의 비율로 실온에서 5-10분 동안 루시퍼라제 유전자를 표적으로 하는 siRNA와 함께 배양되었다. HEK 세포는 제조업체의 지침에 따라 Mirus LT-TKO로 처리되었다. 처리 시점에서, 웰의 배지는 siRNA:TCV나 siRNA:Mirus LT-TKO 혼합물을 포함한 새로운 성장 배지로 완전히 교체되었다. 72시간의 처리 후, Promega ONE-Glo+Tox 키트를 사용해 세포생존력과 루시퍼라제 출력에 대해 HEK 세포가 분석되었고, 모든 세포를 미처리 대조군 웰과 비교했다.
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Claims (126)

  1. 선별 카고를 양이온 지질기반 형질감염 적격 소포(TCV)에 캡슐화하는 방법에 있어서:
    - 양이온 지질기반 TCV를 포함하고 불안정화제가 없는 수성 용액을 제공하는 단계; 및
    - 선별 카고를 양이온 지질기반 TCV에 캡슐화하기에 맞는 조건하에 충분한 시간 동안 선별 카고를 용액에 혼합해 양이온 지질기반 TCV-캡슐화된 선별 카고를 제공하되, 유기용매나 세제 없이 혼합하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 불안정화제가 유기용매나 세제 중의 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 유기용매가 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 유기용매가 메탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 유기용매가 이소프로필 알코올인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 유기용매가 테트라히드로푸란(THF)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 유기용매가 디메틸설폭사이드(DMSO)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 유기용매가 디메틸포름아미드(DMF)인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 유기용매가 아세토니트릴(ACN)인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 세제가 나트륨 도데실 설페이트(SDS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 수성 용액이 25μM 내지 100μM 아세테이트 완충제인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 불안정화제가 온도인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 캡슐화 전에 빈 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 용매와 세제가 없는 수성 용액에서 지질기반 TCV 캡슐화된 선별 카고를 구하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 양이온 지질이 이온화 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 20 mol% 내지 50 mol% 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 이온화 양이온 지질이 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노-프로판(DODMA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노-프로판(DODMA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 혼합물이 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 콜레스테롤 중의 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 20/30/10/39/1 mol%로 DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG-지질의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 20/30/10/40 mol%로 DODMA/DOPE/DSPC/Chol의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 50/10/40 mol%로 DODMA/DSPC/Chol의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 50/10/39/1 mol%로 DODMA/DSPC/Chol/PEG-지질의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 50/10/39/1 mol%로 DODMA/DSPC/Chol/PEG의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 카고가 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 핵산이 변형된 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 변형된 핵산이 2'-0-메틸화(2'-0-ME), 포스포로티오에이트 및 모르폴리노 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 변형된 핵산이 잠금 핵산(LNA; locked nucleic acid)인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제26항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산(DNA)인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, DNA가 이중가닥 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제30항에 있어서, DNA가 단일가닥 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제30항에 있어서, DNA가 플라스미드 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제26항에 있어서, 핵산이 리보핵산(RNA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, RNA가 소간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제34항에 있어서, RNA가 짧은헤어핀 RNA(Short hairpin RNA, shRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제34항에 있어서, RNA가 메신저 RNA(mRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제30항에 있어서, DNA가 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA))를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제34항에 있어서, RNA가 마이크로 RNA(miRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 카고가 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 단백질이 리보핵단백질(RNP)의 일부인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, RNP가 기능성 리보핵단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, RNP가 Cas9 단백질 및 가이드 RNA 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제41항 또는 제42항에 있어서, RNP가 Cas9 단백질과 가이드 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제41항 또는 제42항에 있어서, RNP가 Cas9 단백질, 가이드 RNA 및 단일가닥 DNA(ssDNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 선별 카고가 효소, 뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 중 적어도 하나 또는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제46항에 있어서, 선별 카고가 징크 핑거 뉴클레아제(ZFN), TALEN, Cas9, CaslO, Casl1, Casl2 또는 Cpfl 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제26항에 있어서, 선별 카고가 뉴클레아제나 항원을 코딩하는 mRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV를 선별 카고와 혼합하는 단계를 더 포함하고, 선별 카고는 μmol 양이온 지질당 0.022-0.058 mg 선별 카고의 비율로 존재하는 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV를 선별 카고와 혼합하는 단계를 더 포함하고, 선별 카고는 μmol 양이온 지질당 0.029-0.116 mg 선별 카고의 비율로 존재하는 핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV 및 선별 카고가 지질기반 TCV:선별 카고의 467 몰비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 선별 카고가 리보핵단백질(RNP)인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV 및 선별 카고가 지질기반 TCV:선별 카고의 400 내지 1200 몰비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV 및 선별 카고가 지질기반 TCV:선별 카고의 473 내지 1173 몰비로 혼합되는 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV 및 선별 카고가 지질기반 TCV:선별 카고의 최대 3000 내지 5000 몰비의 비율로 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 카고가 리보핵단백질(RNP)인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV 및 선별 카고가 10 내지 15초 동안 실온에서 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV 및 선별 카고가 10 내지 30 초 동안 실온에서 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 지그재그형 헤링본 미세혼합이나 T-접합 혼합을 이용해 혼합이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 피펫내 왕복으로 혼합이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 수성 용액에 지질기반 형질감염 적격 소포(TCV)를 포함하는 조성물에 있어서:
    상기 조성물에 불안정화제가 없는 것을 특징으로 하는 조성물
  62. 제61항에 있어서, 불안정화제가 유기용매 및 세제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 지질기반 TCV가 선별 카고가 없는 빈 지질기반 TCV인 것을 특징으로 하는 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 지질기반 TCV가 선별 카고를 함유한 것을 특징으로 하는 조성물.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 수성 용액 중의 지질기반 형질감염 적격 소포(TCV)로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  66. 제61항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  67. 제66항에 있어서, 양이온 지질이 이온화 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  68. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 20 mol% 내지 50 mol% 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  69. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 10 mol% 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  70. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 20 mol% 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  71. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 30 몰% 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  72. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 40 mol% 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  73. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 50 mol% 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  74. 제61항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 60 mol% 양이온 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  75. 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 이온화 양이온 지질이 1.2-디올레일옥시-3-디메틸아미노-프로판(DODMA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  76. 제67항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 1,2-디올레일옥시-3-디메틸아미노-프로판(DODMA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE) 및 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC)의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  77. 제67항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물이 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 콜레스테롤 중 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  78. 제61항 내지 제75항 또는 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 20/30/10/39/1 mol%로 DODMA/DOPE/DSPC/Chol/PEG-지질의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  79. 제61항 내지 제75항 또는 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 20/30/10/40 mol%로 DODMA/DOPE/DSPC/Chol의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  80. 제61항 내지 제75항 또는 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 50/10/40 mol%로 DODMA/DSPC/Chol의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  81. 제61항 내지 제75항 또는 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 50/10/39/1 mol%로 DODMA/DSPC/Chol/PEG-지질의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  82. 제61항 내지 제75항 또는 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV가 50/10/39/1 mol%로 DODMA/DSPC/Chol/PEG의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  83. 제61항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 유기용매가 에탄올인 것을 특징으로 하는 조성물.
  84. 제61항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 카고가 핵산인 것을 특징으로 하는 조성물.
  85. 제84항에 있어서, 핵산이 데옥시리보핵산(DNA)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  86. 제85항에 있어서, DNA가 이중가닥 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  87. 제85항에 있어서, DNA가 단일가닥 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  88. 제85항에 있어서, DNA가 플라스미드 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  89. 제84항에 있어서, 핵산이 리보핵산(RNA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  90. 제89항에 있어서, RNA가 소간섭 RNA(siRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  91. 제89항에 있어서, RNA가 짧은헤어핀 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  92. 제89항에 있어서, RNA가 메신저 RNA(mRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  93. 제85항에 있어서, DNA가 상보적 DNA(cDNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  94. 제89항에 있어서, RNA가 마이크로 RNA(miRNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  95. 제61항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 선별 카고가 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  96. 제95항에 있어서, 단백질이 리보핵단백질(RNP)의 일부인 것을 특징으로 하는 조성물.
  97. 제96항에 있어서, RNP가 기능성 리보핵단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  98. 제96항 또는 제97항에 있어서, RNP가 Cas9 단백질 또는 가이드 RNA 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  99. 제96항 또는 제97항에 있어서, RNP가 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  100. 제96항 또는 제97항에 있어서, RNP가 Cas9 단백질, 가이드 RNA 및 단일가닥 DNA(ssDNA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  101. 유기용매와 세제가 없는 수성 용액내 지질기반 형질감염 적격 소포(TCV)-캡슐화된 선별 카고를 포함하는 조성물에 있어서:
    지질기반 TCV-캡슐화된 선별카고가 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 조성물.
  102. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 따라 제조된 지질-기반 형질감염 적격 소포(TCV)-캡슐화된 선별 카고로 표적세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  103. 제61항 내지 제101항 중 어느 한 항에 따른 지질-기반 형질감염 적격 소포(TCV)-캡슐화된 선별 카고로 표적세포를 형질감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  104. 제102항 또는 제103항에 있어서, 표적세포가 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  105. 제102항 또는 제103항에 있어서, 표적세포가 포유류 1차 세포인 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  106. 제102항 또는 제103항에 있어서, 표적세포가 포유류 1차 신경세포인 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  107. 제102항 또는 제103항에 있어서, 표적세포가 배양된 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  108. 제102항 또는 제103항에 있어서, 표적세포가 포유류 환자의 세포인 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  109. 제102항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 실험실에서 수행되는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  110. 제102항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 공장에서 수행되어 상업적 양의 형질감염된 세포를 생산하는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  111. 제102항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 절차의 일부로 수행되는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  112. 제102항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 의료 절차의 일부로 수행되는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  113. 제102항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 절차의 일부로 수행되는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  114. 제112항 또는 제113항에 있어서, 유전자치료 절차의 일부로 수행되는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  115. 제112항 또는 제113항에 있어서, 알츠하이머 병 치료의 일부로 수행되는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  116. 제112항 또는 제113항에 있어서, 파킨슨 병 치료의 일부로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  117. 제112항 또는 제113항에 있어서, 헌팅턴병 치료의 일부로 수행되는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  118. 제112항 또는 제113항에 있어서, 전두측두엽 치매 치료의 일부로 수행되는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  119. 제112항 또는 제113항에 있어서, 근위축성 측삭 경화증 치료의 일부로 수행되는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  120. 제112항 또는 제113항에 있어서, 척추 근위축증 치료의 일부로 수행되는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  121. 제112항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 지질기반 TCV-캡슐화된 선별 카고를 환자의 뇌에 전달하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 형질감염 방법.
  122. 제61항 내지 제101항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트에 있어서:
    상기 조성물이 용기안에 있고 상기 키트는 조성물의 사용설명서를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  123. 제122항에 있어서, 사용설명서가 제103항 내지 제121항 중 어느 한 항의 방법에 따른 조성물의 사용을 지시하는 것을 특징으로 하는 키트.
  124. 제122항 또는 제123항에 있어서, 용기가 포유류에게 적어도 하나의 용량의 조성물을 투여하도록 구성되고, 투여 지침을 포함한 적어도 하나의 표지를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  125. 환자의 질환이나 상태를 억제, 예방 또는 치료하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 제61항 내지 제101항 중 어느 한 항에 따른 분리정제된 조성물.
  126. 제125항에 있어서, 환자가 포유류인 것을 특징으로 하는 조성물.
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