KR20210052389A - 다운스트림 정제에서의 라만 분광법의 사용 - Google Patents

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KR20210052389A
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protein purification
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크리스티나 파스노
크리스토퍼 코완
앤드류 투스티안
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

생산 또는 제조 중에 단백질 정제 중간체 및/또는 최종 농축 풀을 특성화하거나 정량화하기 위한 인시츄 라만 분광 방법 및 시스템이 제공된다. 일 실시예에서, 인시츄 라만 분광법은 다운스트림 공정 동안(즉, 단백질 정제 중간체의 수확 후에) 단백질 정제 중간체의 중요 품질 속성들을 특성화하거나 정량화하는 데 사용된다. 예를 들어, 단백질 정제 중간체가 정제되거나, 축합되거나 그렇지 않으면 판매 또는 투여될 최종 의약품으로 제형화될 때 개시된 인시츄 라만 분광 방법 및 시스템을 사용하여 단백질 정제 중간체를 특성화하고 정량화할 수 있다.

Description

다운스트림 정제에서의 라만 분광법의 사용
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 27일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/723,188호에 대한 이익 및 우선권을 주장하며, 허용가능한 내용이 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함된다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 다운스트림 단백질 정제 공정들에서 하나 이상의 중요 품질 속성(CQA) 또는 파라미터를 모니터링하고 제어하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
치료용으로 승인된 단일클론 항체(mAb)의 수는 지난 10년 동안 크게 증가했다. 이는 부분적으로 대량의 mAb의 생산을 촉진하는 대규모 제조 공정들의 개선에 따른 것이다. 또한 미국 식품의약국(FDA)의 공정 분석 기술(PAT) 프레임워크와 같은 계획들은 공정들을 더 잘 이해하고 제품들의 품질을 제어하기 위해 공정 개발, 공정 분석 및 공정 제어에 대한 혁신적인 해결책들을 이끌어냈다. 세포 배양 배지로부터 mAb를 효율적으로 회수 및 정제하는 것은 생산 공정의 중요한 부분이다. 정제 공정은 사람에게 사용하기에 안전한 mAb를 안정적으로 생성해야 한다. 여기에는 숙주 세포 단백질, DNA, 바이러스, 내독소, 응집체, 농도, 부형제 및 환자의 안전, 효능 또는 유효성에 영향을 미칠 가능성이 있는 기타 종들과 같은 단백질 속성 및 불순물을 포함하는 중요 품질 속성(CQA)의 모니터링이 포함된다. 단백질 농도는 또한 종종 정제된 물질의 CQA이며 공정 중간체의 적절한 단백질 농도는 단위 조작 수행에 중요한 공정 파라미터가 될 수 있다. 이러한 CQA는 생산 공정과 프로그램 수명주기 전반에 걸쳐 모니터링되어야 한다.
mAb의 최종 제형에 결정된 수준 이상의 불순물이 포함되지 않는 것을 보장하기 위해 mAb 제품들은 다운스트림 공정의 다양한 단계들에서 테스트된다. mAb와 같은 생체 물질들의 제조에 있어서의 품질 관리는 일반적으로 각각의 로트 생산에 대해 오프라인 방법으로 정제 중간체 및 제형화된 원료 의약품 샘플들을 분석하여 달성된다. 샘플들은 처리 장비(예컨대, UF/DF 스키드(skid))로부터 제거되고 오프라인 테스트들을 거쳐, 단백질 농도(g/L), 완충액 부형제 및 크기 변형과 같은 제품 CQA를 측정한다. 제조 중에 실시간 모니터링 및 분석을 사용할 수 없으므로 공정 시간이 늘어나고, CQA들을 충족하지 않아 배치(batch) 실패의 위험이 높아진다. 따라서 mAb의 실시간 품질 관리 모니터링을 위한 신속한 인라인(in-line) 방법이 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 다운스트림 정제 공정 동안 중요 품질 속성의 실시간 모니터링을 위한 시스템 및 방법을 제공하는 것이다.
생산 또는 제조 중 단백질 정제 중간체를 특성화하거나 정량화하기 위한 인시츄(in situ) 라만 분광 방법 및 시스템이 제공된다. 일 실시예에서, 인시츄 라만 분광법은 다운스트림 공정 동안(즉, 세포 배양액으로부터 단백질 정제 중간체를 수확한 후) 단백질 약물의 중요 품질 속성을 특성화하거나 정량화하는 데 사용된다. 예를 들어, 개시된 인시츄 라만 분광 방법 및 시스템은 판매 또는 투여될 최종 의약품으로 제형화되기 전에 단백질 정제 중간체가 정제될 때 단백질 정제 중간체 중요 품질 속성들을 특성화하고 정량화하는 데 사용될 수 있다. 중요 품질 속성들에는 단백질 농도, 부형제, 고분자량(HMW) 종, 항체 역가 및 약물-항체 비율이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예는 원료 의약품 제형에 필요한 사전결정된 농도 목표 및 부형제 수준을 획득하기 위해 단백질 정제 중간체를 농축/정용여과하고 농축 단계의 파라미터를 실시간으로 조정하면서 인시츄 라만 분광법을 사용하여 실시간으로 단백질 정제 중간체의 농도를 결정함으로써 농축 단백질 정제 중간체를 생산하는 방법을 제공한다. 단백질 정제 중간체 생성물은 후속 제형 단계들을 위해 5 mg/mL 내지 300 mg/mL, 바람직하게는 50 mg/mL 내지 300 mg/mL의 농도를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 단백질 정제 중간체는 일차 또는 최종 농축 동안 한외여과를 사용하여 원하는 농도 목표로 농축된다. 정용여과는 원하는 최종 제형 성분을 얻기 위한 완충액 교환 수단으로 일차 농축 후 가공 중에 사용된다. 단백질 정제 중간체는 생물 반응기, 유가식 배양 또는 연속 배양으로부터 수확될 수 있다. 다른 실시예에서, 단백질 정제 중간체의 농도를 결정하는 것은 실시간으로 연속적으로 또는 간헐적으로 발생할 수 있다. 단백질 농도의 정량화는 대략적으로 5초에서 10분 간격으로, 매시간 또는 매일 수행될 수 있다. 단백질 정제 중간체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 융합 단백질 또는 재조합 단백질일 수 있다. 스펙트럼 데이터는 977-1027 cm-1, 1408-1485 cm-1, 1621-1711 cm-1, 2823-3046 cm-1 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 파수 범위에서 수집될 수 있다.
또 다른 실시예는 복수의 단백질 정제 중간체 중 임의의 하나를 정량화할 수 있는 범용 모델을 생성하기 위해 복수의 단백질 정제 중간체에 대해 독립적으로 라만 분광 분석을 수행함으로써 단백질 정제 중간체를 생성하는 방법을 제공한다. 단백질 정제 중간체의 농도는 단백질 정제 중간체 농축의 시작부터 끝까지 단백질 정제 중간체의 농축 동안 범용 모델과 함께 인시츄 라만 분광법을 사용하여 결정될 수 있다. 또 다른 실시예는 단백질의 상업적 가능 생산에 사용될 단백질 농도를 정량화할 수 있는 단백질 특이적 모델을 생산하기 위해 단백질 정제 중간체를 생산하는 방법을 제공한다.
모델은 원시 스펙트럼 데이터의 부분 최소 제곱 회귀 분석을 사용하고 오프라인 단백질 농도 데이터에 대한 직교 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 표준 정상 변량(SNV) 및/또는 21 cm-1 평활화를 사용한 1차 도함수일 수 있는 포인트 평활화 기법과 같은 전처리 기법들이 모델 가변성과 예측 오차를 줄이기 위해 라만 분광 데이터에서 수행할 수 있다. 단백질 농도와 같은 CQA 예측과 관련된 스펙트럼 영역을 분리하기 위해 추가 모델 개선을 수행할 수 있다. 일 실시예에서, 모델은 5% 이하의 오차 허용치, 바람직하게 3% 이하의 오차 허용치를 갖는다.
또 다른 실시예는 세포 배양액 또는 단백질 정제 중간체를 정제하는 동안 인시츄 라만 분광법을 사용하여 실시간으로 부형제의 농도를 결정하고, 수확된 세포 배양액 및/또는 단백질 정제 중간체 중의 부형제의 미리결정된 양을 얻거나 유지하기 위해 실시간으로 정제 단계의 파라미터를 조정함으로써 다운스트림 정제 동안 수확된 세포 배양액 및/또는 단백질 정제 중간체 중의 부형제의 수준을 모니터링하고 제어하는 방법을 제공한다. 부형제는 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘, 숙시네이트, 포스페이트, 하이드록시메틸아미노메탄(트리스), 프롤린, 아르기닌, 수크로스 또는 이들의 조합들일 수 있다. 부형제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20, 및 폴록사머 188과 같은 표면 부형제일 수 있다.
도 1은 예시적인 단백질 정제 공정을 도시하는 흐름도이다.
도 2는 인라인 라만 분광법의 초기 모델 개발을 도시하는 대표적인 분광 사진이다. X-축은 라만 이동을 나타낸다. Y-축은 강도를 나타낸다. 우측의 범례는 단백질 농도를 나타낸다. 초기 모델 개발 중에 사용된 스펙트럼 영역에는 좌측에서 우측으로 977-1027 cm-1(링 구조), 1408-1485 cm-1(아르기닌), 1621-1711 cm-1(이차 구조) 및 2823-3046 cm-1(C-H 스트레칭)이 포함된다.
도 3은 표준 한외여과/정용여과 단위 조작 중에 mAb1에 대한 단백질 농도(g/L)를 도시하는 막대 그래프이다. 빈 막대들은 인라인 라만 예측의 목표인 오차 막대가 ± 5%인 SoloVPE 시스템(C-기술)과 함께 UV-Vis 기반 오프라인 방법을 사용하여 결정된 농도들이다. 넓게 해칭된 막대는 본 명세서에서 라만 예측에 포함된 mAb1이 없는 범용 모델로 지칭되는 모델을 나타내고, 좁게 해칭된 막대는 mAb1이 있는 범용 모델을 나타낸다. 교차 해칭된 막대는 0-120 g/L 범위의 초기 범용 모델의 예측에 대응한다. 해칭된 막대는 초기 범용 모델 >120 g/L의 예측에 대응한다.
도 4는 초기 범용 모델 개발에서 다양한 mAb에 대한 절대 라만 모델 오차를 도시하는 막대 그래프이다. 해칭된 막대는 초기 범용 모델 0-120g/L(일차 농축 및 정용여과)를 나타내고, 빈 막대는 초기 범용 모델 >120g/L를 나타낸다. (최종 농축). 수평선은 5% 이하 오차의 라만 모델 목표를 나타낸다.
도 5는 다양한 mAb에 대한 절대 라만 모델 오차를 도시하는 막대 그래프이다. 넓게 해칭된 막대는 0-120 g/L(일차 농축 및 정용여과)를 나타내고 좁게 해칭된 막대는 >120g/L(최종 농축)를 나타낸다. 수평선은 5% 이하 오차의 라만 모델 목표를 나타낸다. 범용 라만 모델의 두 가지 버전들이 도시된다. 해칭된 막대는 초기 범용 모델을 나타내고 교차 해칭된 막대는 업데이트된 범용 모델을 나타낸다.
도 6은 인라인 라만 프로브를 배치하기 위한 위치를 포함한 한외여과/정용여과 시스템의 개략도이다.
도 7은 최종 농축 풀(FCP) 측정을 위한 범용 모델 또는 mAb10 특이적 모델을 사용한 mAb10에 대한 단백질 농도를 도시하는 막대 그래프이다. 인라인 실시간 라만 예측(넓게 해칭된 막대), 업데이트된 모델(좁게 해칭된 막대) 및 SoloVPE(빈 막대)에 대한 단백질 농도가 도시된다. X-축은 실험군을 나타내고 Y-축은 단백질 농도를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 단백질 농도에 대한 벤치 스케일 DoE 모델링에 대한 라만 모델 오차를 도시하는 막대 그래프이다. 도 8a는 UF/DF 공정의 다양한 단계(일차 농축, 정용여과 및 최종 농축 풀)에서 실시간 예측에 대한 라만 모델 오차를 도시한다. 도 8b는 UF/DF 공정의 다양한 단계(일차 농축, 정용여과 및 최종 농축 풀)에서 최종 DoE 모델에 대한 라만 모델 오차를 도시한다.
도 9a는 mAb11에 대한 파일럿 처리 장비로의 모델 확장에 대한 모델 예측 능력 백분율 오차를 도시하는 막대 그래프이다. 벤치 스케일 모델 데이터는 파일럿 스케일 데이터를 통합한 벤치 스케일 모델 날짜와 비교된다. X-축은 실험군을 나타내고 Y-축은 모델 예측 능력 백분율 오차(%)를 나타낸다. 도 9b는 다양한 단일클론 항체에 대한 파일럿 스케일 공정을 위한 모델 예측 능력을 도시하는 막대 그래프이다. X-축은 실험군을 나타내고 Y-축은 모델 예측 능력 백분율 오차(%)를 나타낸다.
도 10a는 라만 피드백을 갖는 예시적인 자동 배치 UF/DF의 개략도이다. 도 10b는 라만 피드백을 갖는 예시적인 자동 단일 패스 TFF의 개략도이다.
도 11은 UF/DF 공정 과정에서 mAb14 농도를 도시하는 그래프이다. X-축은 처리량(L/m2)을 나타내고 Y-축은 mAb 14 농도(g/L)를 나타낸다.
도 12a는 SE-UPLC 또는 라만 모델링에 의해 결정된, 다양한 공정 단계들(일차 농축, 정용여과, 최종 농축) 동안 mAb2에서의 고분자량(HMW) 종들의 백분율을 도시하는 막대 그래프이다. X-축은 실험군을 나타내고 Y-축은 mAb2 HMW 백분율(%)을 나타낸다. 도 12b는 mAb 15에 대한 다양한 스캔 시간(10초, 20초, 30초)을 사용하여 예측된 고분자량(HMW) 종들의 백분율을 도시하는 막대 그래프이다. X-축은 실험군을 나타내고 Y-축은 HMW 백분율(%)을 나타낸다.
도 13은 mAb 14의 단일클론 항체 샘플에 대한 실제 역가(g/L) 대 라만 예측 역가를 도시하는 점 그래프이다. X-축은 라만 예측 역가를 나타내고 Y-축은 실제 역가(g/L)를 나타낸다.
도 14a는 다양한 단일클론 항체에서 라만 히스티딘 예측을 도시하는 산점도이다. X-축은 라만 모델링에 의해 예측된 히스티딘 농도를 나타내고 Y-축은 아미노산 분석에 의해 결정된 실제 히스티딘 농도를 나타낸다. 도 14b는 단일클론 항체 샘플에 대한 실제 히스티딘 농도 대 라만 예측 히스티딘 농도를 도시하는 점 그래프이다. 도 14c는 단일클론 항체 샘플에 대한 실제 아르기닌 농도 대 라만 예측 아르기닌 농도를 도시하는 점 그래프이다.
도 15a는 mAb 3의 단일클론 항체 샘플에 대한 실제 약물-항체 비율(DAR) 대 라만 예측 DAR을 도시하는 산점도이다. X-축은 라만 예측 DAR을 나타내고 Y-축은 UV 분광법에 의해 결정된 실제 DAR을 나타낸다. 도 15b는 mAb 1의 단일클론 항체 샘플에 대한 실제 약물-항체 비율(DAR) 대 라만 예측 DAR을 도시하는 산점도이다. X-축은 라만 예측 DAR을 나타내고 Y-축은 실제 DAR을 나타낸다.
I. 정의
본 개시 내용은 달라질 수 있기 때문에, 본 명세서에 기술된 조성물 및 방법뿐만 아니라 기술된 실험 조건에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 또한 본 개시 내용의 범주는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한될 것이므로, 본 명세서에 사용되는 용어는 단지 소정 실시예를 기술할 목적을 위한 것이며 제한하고자 하는 것이 아님을 또한 이해하여야 한다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 조성물, 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만. 언급된 모든 공개문헌은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다.
현재 청구된 발명을 (특히 청구항들과 관련하여) 설명하는 것과 관련하여 용어들 “한(a), 한(an), 그(the), 그리고 유사한 지시어들(referents)의 사용은, 본 명세서에 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 명확하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 커버하는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에서의 값들의 범위의 열거는, 본 명세서에 달리 지시되지 않는 한, 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 약기 방법(shorthand method)으로서 역할 하도록 의도되며, 각각의 별개의 값은 마치 본 명세서에 개별적으로 열거된 것처럼 본 명세서에 포함된다.
"약"이라는 용어는 언급된 값의 위 또는 아래로 대략 ± 10% 범위에 있는 값임을 설명하도록 의도되며, 다른 실시예들에서, 값들은 언급된 값의 위 또는 아래로 대략 ± 5% 범위 내에서 있을 수 있고, 다른 실시예들에서, 값들은 언급된 값의 위 또는 아래로 대략 ± 2% 범위 내에서 있을 수 있고, 다른 실시예들에서, 값들은 언급된 값의 위 또는 아래로 대략 ± 1% 범위 내에서 있을 수 있다. 상기 범위들은 문맥에 의해 명확하게 되도록 의도되며, 더 이상의 제한은 암시되지 않는다. 본 명세서에 기술된 모든 방법은, 본 명세서에 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 달리 명확하게 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 예 및 모든 예들, 또는 예시 표현(language)(예를 들어, "~와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 보다 명확히 하도록 의도되며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범주에 대한 제한을 부과하지 않는다. 명세서에서의 어떠한 표현도 임의의 비-청구된 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, “단백질"은 펩티드 결합에 의해 서로 연결된 둘 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다. 단백질은 폴리펩티드 및 펩티드를 포함하고, 또한 글리코실화, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마-카르복실화, 알킬화, 히드록실화 및 ADP-리보실화와 같은 변형들을 포함할 수 있다. 단백질은 단백질-기반 약물을 포함하여 과학적 또는 상업적으로 관심을 받을 수 있고, 단백질은 특히 효소, 리간드, 수용체, 항체 및 키메라 또는 융합 단백질을 포함한다. 단백질은 공지된 세포 배양 방법을 사용하여 다양한 유형의 재조합 세포에 의해 생성되고, 일반적으로 유전자 조작 뉴클레오티드 벡터(예를 들어, 키메라 단백질을 코딩하는 서열 또는 코돈-최적화된 서열, 인트론리스 서열 등과 같음)의 형질전환에 의해 세포 내로 도입되며, 벡터는 에피솜으로 존재하거나 세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.
"항체"는 이황화물 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중(H)쇄와 2개의 경(L)쇄인 4개의 폴리펩티드쇄로 구성된 면역글로불린 분자를 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(HCVR 또는 VH) 및 중쇄 불변 영역을 갖는다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 함유한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)이라 명명되는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)이라 명명되는 초가변성 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카르복시 말단으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 용어 "항체"는 임의의 아이소타입 또는 서브클래스의 글리코실화 및 비글리코실화 면역글로불린 둘 모두에 대한 언급을 포함한다. 용어 "항체"는 항체를 발현하기 위해 형질감염된 숙주 세포로부터 단리된 항체와 같은 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 항체 분자를 포함한다. 용어 항체는 또한 1개 초과의 상이한 에피토프에 결합될 수 있는 이종 사량체 면역글로불린을 포함하는 이중특이적 항체를 포함한다. 이중특이적 항체는 일반적으로 미국 특허 출원 공개 제2010/0331527호에 기술되어 있으며, 이 특허 출원 공개는 본 명세서에 참고로 포함된다.
"이차 구조"는 골격의 원자 사이의 상호 작용으로 인해 폴리펩티드 내에서 형성되는 국소적 폴딩된 구조를 의미한다. 가장 일반적인 유형의 이차 구조는 α 나선 및 β 주름 시트이다. 두 구조 모두 한 아미노산의 카르보닐 O와 다른 아미노산의 아미노 H 사이에 형성되는 수소 결합에 의해 형태가 유지된다.
본 명세서에서 사용되는 "부형제"는 제형화된 원료 의약품의 장기 저장을 위한 안정화제로서 사용되는 약리학적 불활성 물질을 지칭한다. 일반적으로 추가 부형제가 최종 농축 풀에 첨가되어 제형화된 원료 의약품을 생성한다. 그러나, UF/DF 공정 중에 부형제 수준을 모니터링하여 이들 수준이 원하는 제형화 전략에 영향을 미치지 않도록 한다. 부형제는 약제학적 제형에 부피를 제공하고 약물 흡수 또는 용해성을 촉진하며 안정성을 제공하고 변성을 방지한다. 일반적인 약제학적 부형제는 아미노산, 충전제, 결합제, 붕해제, 코팅제, 흡착제, 완충화제, 킬레이팅제, 윤활제, 활택제(glidant), 방부제, 항산화제, 향미제, 감미료, 착색제, 용매 및 공용매, 및 점도 부여제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일 실시예에서, 부형제는 PEG-3550을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리에틸렌 글리콜이다.
"폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 식품, 의약품 및 화장품에 일반적으로 사용되는 에틸렌 옥사이드의 폴리에테르 중합체이다. 이는 생체 분자의 용해도를 감소시키는 분자로 유용한 비이온성 고분자이다. PEG는 300 g/mol에서 10,000,000 g/mol 범위의 다양한 분자량으로 상업적으로 이용가능하다. 예시적인 유형의 PEG는 PEG 20000, PEG 8000 및 PEG 3350을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. PEG는 선형, 분지형(중앙 코어에 부착된 3 내지 10개의 사슬), 별 형상(중앙 코어에 부착된 10 내지 100개의 사슬) 및 빗 형상(폴리머 골격에 부착된 다수의 사슬)을 포함하는 다양한 형상으로 이용가능하다.
"라만 분광"은 분자로부터의 비탄성 산란광의 파장과 강도를 측정하는 데 사용되는 분광 기법이다. 이는 물질에 대한 단색 입사 방사선이 특정 방식으로 반사, 흡수 또는 산란되는 원리를 기반으로 하며, 이는 방사선을 수용하는 특정 분자 또는 단백질에 따라 달라진다. 에너지의 대부분은 탄성 또는 레일리 산란이라고 하는 동일한 파장에서 산란된다. 적은 양(0.001% 미만)이 비탄성 또는 라만 산란이라고 하는 상이한 파장에서 산란된다. 라만 산란은 회전, 진동 및 전자 수준 전이와 관련이 있다. 라만 분광법은 샘플의 화학적 및 구조적 구성을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "한외여과"는 재조합 단백질의 정제 동안 단백질 치료제의 다운스트림 공정에서 단백질 농축에 널리 사용되는 막공정을 의미한다 한외여과는 크기 기반 분리로서, 막 기공보다 큰 종들은 보유되고, 작은 종들은 자유롭게 통과한다. 공정 중에 단백질 용액은 반투과성 평행 평판 막의 표면을 가로질러 접선 방향으로 펌핑된다. 막은 완충액 및 완충액 염에는 투과성이지만 일반적으로 단일클론 항체에는 불투과성이다. 투과를 위한 추진력은 막 유동 채널의 출구에서의 유동 제한에 의해 유도된 막관통 압력(TMP)이 적용된다(TMP = (P feed + P retentate )/2 - P permeate.. ).
본 명세서에 사용된 "일차 농축"은 막관통 압력이 물과 염을 투과성 막을 가로지르도록 하여 액체 체적을 감소시키고 이에 따라 단백질 농도를 증가시키는 초기 단계를 의미한다. 일차 농축의 농도 범위는 처리량, 단백질 안정성, 공정 시간 및 완충액 소비의 균형을 맞추기 위해 최적화될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "정용여과"는 반투과성 막을 사용하여 관심 생성물을 하나의 액체 매질에서 다른 것으로 교환하는 기술을 지칭한다. 완충액 교환 및 탈염은 일반적으로 단백질을 안정된 pH와 높은 생성물 농도를 허용하는 부형제 농도로 조절하기 위한 완충액을 지속적으로 추가하여 소량의 불순물과 완충액 성분이 제품에서 효과적으로 세척되는 정용여과 모드를 사용하여 수행된다. 이것은 공정 기술에 기초하여 연속 또는 불연속 모드로 수행될 수 있다.
정용여과는 종종 한외여과와 결합되어 불순물과 염을 또한 제거하면서 원하는 체적 감소를 달성한다. UF/DF는 pH, 부형제 함량 및 장기 저장에 도움이 되는 단백질 농도를 달성하기 위해 mAb를 조절하고, 안정화 부형제를 첨가하여 제형화된 원료 의약품(FDS)을 생성하도록 하는 다운스트림 정제의 최종 단위 조작이다.
본 명세서에 사용된 "최종 농축"은 막관통 압력이 물과 염을 투과성 막을 가로지르도록 하여 액체 체적을 감소시키고 이에 따라 단백질 농도를 저장 및/또는 제형화를 위한 원하는 목표로 증가시키는 최종 단계를 의미한다. 최종 농축 단계로 생성되는 풀이 최종 농축 풀(FCP)이다. 이 최종 농축 단계는 연속 또는 불연속 공정 모드에서 수행될 수 있다.
용어 "생체 물질" 및 "단백질 정제 중간체"는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 임의의 항체, 항체 단편, 변형된 항체, 단백질, 당 단백질 또는 융합 단백질뿐 아니라 생물 반응기 공정에서 정제된 최종 원료 의약품을 의미할 수 있다.
용어 "제어(control)" 및 "제어(controlling)"는 수확된 세포 배양액에서 중요 품질 속성의 양 또는 농도 수준을 미리정의된 설정 점으로 조정하는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "업스트림 공정"은 항체 또는 치료 단백질이 일반적으로 생물 반응기에서 박테리아 또는 포유류 세포주에 의해 생산되는 제1 단계를 의미한다. 업스트림 공정에는 배지 준비, 세포 배양, 세포 분리 및 수확이 포함된다. 세포가 원하는 밀도에 도달하면 수확되어 바이오 공정의 다운스트림 섹션으로 이동된다. 용어 "다운스트림 공정"은 생물 반응기로부터 항체 또는 치료 단백질의 수확 후 발생하는 분리 및 정제를 의미한다. 일반적으로 이것은 여러 가지 다른 양식을 통해 수용액에서 생성물을 회수하는 것을 의미한다. 수확된 생성물은 다운스트림 공정 중에 순도와 중요 품질 속성 요구 사항을 충족하도록 처리된다.
본 명세서에 사용된 용어 "단백질 정제 중간체"는 생물 반응기에서 수확된 단백질을 의미하고 다운스트림 공정 동안의 임의의 중간체를 의미한다.
용어 "농축 단백질 정제 중간체"는 5 mg/mL 초과의 농도를 갖는 단백질 정제 중간체를 의미한다. 보다 바람직하게는 농도는 50 mg/mL 내지 300 mg/mL이다.
용어 "모니터" 및 "모니터링"은 세포 배양 또는 수확된 세포 배양액에서 중요 품질 속성의 양 또는 농도 수준을 정기적으로 확인하는 것을 의미한다.
용어 "수확된 세포 배양액"은 관심 단백질을 분비하도록 조작된 세포를 포함하는 생물 반응기에서 제거된 유체를 의미한다. "수확된 세포 배양액"은 분비된 관심 단백질, 예를 들어 단일클론 항체를 최적으로 함유한다.
본 명세서에 사용된 "중요 품질 속성(CQA)"은 생물학적 치료 의약품의 원하는 제품 품질을 보장하기 위해 적절한 한계, 범위 또는 분포 내에 있어야 하는 물리적, 화학적, 생물학적 또는 미생물학적 속성 또는 특성을 의미한다. 이러한 속성들은 안전성, 효능 및/또는 효력에 영향을 미칠 가능성이 있다. 중요 품질 속성들에는 단백질 농도, 고분자량 종, 완충액 부형제 및 pH가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 "제형화된 원료 의약품"은 약리학적 활성을 제공하기 위한 활성 성분을 의미하지만 이러한 성분의 합성에 사용되는 중간체는 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용된 "범용 모델"은 중요 품질 속성을 예측하는 데 사용되는 상이한 재조합 단백질의 스펙트럼 특성의 수학적 상관 관계를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 "mAb 특이적 모델"은 중요 품질 속성을 예측하는 데 사용되는 하나의 특정 단백질의 스펙트럼 속성의 수학적 상관 관계를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "역가"는 용액 중의 항체 또는 단백질 분자의 양을 의미한다.
II. 다운스트림 단백질 정제 생성물의 특성화를 위한 시스템 및 방법
단백질 제조 중 단백질 농도를 모니터링하고 제어하기 위한 시스템 및 방법이 제공된다. 농축 단백질 용액은 높은 상관 용액 점도(10 cP 초과)로 인해 정확하게 측정하기 어렵다. 정확한 정량화에는 특수 오프라인 장비와 일반적으로 용액 희석이 필요하다. 고농도 UF/DF에서 최종 부형제 수준은 깁스-도난(Gibbs-Donnan) 효과로 인한 단백질 농도의 함수이다. 제조 중 실시간 모니터링 및 분석을 사용할 수 없으므로 CQA를 충족하지 않아 공정 시간과 잠재적인 배치 실패가 증가한다. 본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 단백질 농도 및 기타 중요 품질 속성들의 인라인 모니터링에 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 라만 분광 시스템은 고농축(150g/L 이상)일 수 있는 최종 농축 풀의 생산 동안 사용되는 인라인 또는 인시츄 라만 분광 시스템이다. 일반적으로, 라만 분광 시스템은 단백질 정제 중간체 생산의 다운스트림, 예를 들어 생물 반응기 또는 유가식 배양 시스템으로부터 수확한 후 단백질 정제 중간체를 처리하고 후속 정제하는 동안 사용된다. 도 1은 예시적인 단백질 정제 공정을 도시한다. 일반적으로 단백질 정제 중간체는 세포 배양에서 수확되고(100) 친화성 포획(110), 바이러스 불활성화(120), 연마 크로마토그래피(130 및 140), 바이러스 보유 여과(150) 및 한외여과/정용여과(160)와 같은 다양한 정제 단계들을 통해 처리되어, 최종 농축 풀을 생성하여 원료 의약품으로 제형화한다. 일 실시예에서, 수확된 세포 배양액 중의 단백질 농도의 모니터링은 인시츄 라만 분광법에 의해 수행된다.
A. 라만 분광법
일 실시예에서, 수확된 세포 배양액 중의 단백질 농도를 모니터링하고 제어하는 것은 라만 분광법에 의해 수행된다. 라만 분광법은 샘플 식별 및 중요 품질 속성 정량화에 사용할 수 있는 분자 진동에 대한 정보를 제공하는 진동 분광법의 한 형태이다. 인시츄 라만 분석은 라만 분광기에서 분석하기 위해 샘플의 일부를 추출하지 않고도 원래 위치에서 샘플을 분석하는, 방법이다. 인시츄 라만 분석은 라만 분광 분석기가 비침습적이며 비파괴적이므로 오염 위험과 단백질 품질 손실을 감소시킨다는 점에서 유리하다. 인라인 라만 분석은 수확된 세포 배양액, 단백질 정제 중간체 및/또는 최종 농축 풀의 단백질 농도를 모니터링하면서 연속 공정을 가능하게 하기 위해 구현될 수 있다.
인시츄 라만 분석은 단백질 정제 중간체의 단백질 농도에 대한 실시간 평가를 제공할 수 있다. 예를 들어, 인시츄 라만 분광법에서 제공하는 원시 스펙트럼 데이터를 사용하여 단백질 정제 중간체 중의 현재 단백질 농도를 얻고 모니터링할 수 있다. 이러한 양태에서 원시 스펙트럼 데이터를 지속적으로 최신 상태로 유지하기 위해서는 라만 분광법의 스펙트럼 데이터를 약 5초에서 10시간마다 획득되어야 한다. 다른 실시예에서, 스펙트럼 데이터는 약 15분 내지 1시간마다 획득되어야 한다. 또 다른 실시예에서, 스펙트럼 데이터는 약 20분 내지 30분마다 획득되어야 한다.
단백질 정제 중간체의 단백질 농도 모니터링은 인시츄 라만 분석이 가능한 상용 라만 분광 분석기로 분석할 수 있다. 인시츄 라만 분석기는 단백질 정제 중간체 내에서 원시 스펙트럼 데이터를 얻을 수 있어야 한다. 예를 들어, 라만 분석기에는 유체 회로에 인라인으로 삽입할 수 있는 프로브가 장착되어 있어야 한다. 적합한 라만 분석기는 RamanRXN2 및 RamanRXN4 분석기(Kaiser Optical Systems, Inc. Ann Arbor, MI)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
인시츄 라만 분광법으로 얻은 원시 스펙트럼 데이터는 스펙트럼 데이터 내의 피크를 단백질 농도와 연관시키기 위해 오프라인 단백질 농도 측정과 비교할 수 있다. 오프라인 단백질 농도 측정은 단백질 신호를 나타내는 스펙트럼 영역을 결정하는 데 사용할 수 있다. 오프라인 측정 데이터는 임의의 적절한 분석 방법을 통해 수집할 수 있다. 예를 들어, 단백질 농도의 경우 SoloVPE(C-technologies)를 사용하여 오프라인 측정을 수집할 수 있다. 추가적으로, SIMCA 13(MKS Data Analytic Solutions, Umea, Sweden)과 같은 임의의 유형의 다변량 소프트웨어 패키지를 사용하여 원시 스펙트럼 데이터 내의 피크를 단백질 농도의 오프라인 측정과 연관시킬 수 있다. 그러나, 일부 실시예들에서, 임의의 가변하는 기준선을 제거하기 위해 스펙트럼 필터로 원시 스펙트럼 데이터를 전처리하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 원시 스펙트럼 데이터는 모든 유형의 포인트 평활화 기술 또는 정규화 기술로 전처리될 수 있다. 라만 분석기의 프로브, 광학, 레이저 출력 변동 및 노출 시간을 수정하려면 정규화가 필요할 수 있다. 일 실시예에서, 원시 스펙트럼 데이터는 21 cm-1 포인트 평활화를 사용한 1차 도함수와 같은 포인트 평활화 및 표준 정규 변량(SNV) 정규화와 같은 정규화로 처리될 수 있다. 이러한 전처리 기술은 모델 예측을 개선하기 위해 특정 스펙트럼 영역에 대해 결합될 수 있다.
또한, 획득한 스펙트럼 데이터에 대해 화학계량학적 모델링을 수행할 수 있다. 이러한 양태에서, 부분 최소 제곱(PLS), 주성분 분석(PCA), 직교 부분 최소 제곱(OPLS), 다변량 회귀, 정준 상관, 요인 분석, 클러스터 분석, 그래픽 절차 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 다변량 방법이 스펙트럼 데이터에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 획득된 스펙트럼 데이터는 PLS 회귀 모델을 생성하는 데 사용된다. PLS 회귀 모델은 예측 변수와 관측 변수를 새 공간에 투영하여 생성할 수 있다. 이러한 양태에서, 라만 분석에서 얻은 측정 값과 오프라인 측정 값을 이용하여 PLS 회귀 모델을 생성할 수 있다. PLS 회귀 모델은 예측된 공정 값, 예를 들어, 예측된 단백질 농도 값을 제공한다. 일 실시예에서, 모델은 오프라인 단백질 농도 값과 비교하여 5% 이하의 오차로 예측된 단백질 농도 값을 제공한다. 바람직한 실시예에서, 모델은 오프라인 단백질 농도 값과 비교하여 3% 이하의 오차로 예측된 단백질 농도 값을 제공한다.
화학계량학적 모델링 후, 신호 처리 기술이 예측된 단백질 농도 값에 적용될 수 있다. 일 실시예에서, 신호 처리 기술은 모델 가변성 및 예측 오차를 완화할 것이다. 이러한 양태에서, 하나 이상의 전처리 기술이 예측된 단백질 농도 값에 적용될 수 있다. 당업자에게 알려진 임의의 전처리 기술이 이용될 수 있다. 예를 들어, 노이즈 감소 기술은 데이터 평활화 및/또는 신호 거부를 포함할 수 있다. 평활화는 일련의 평활화 알고리즘 및 필터를 통해 달성되는 한편, 신호 거부는 신호 특성을 사용하여 분석된 스펙트럼 데이터에 포함되지 않아야 하는 데이터를 식별한다. 일 실시예에서, 예측된 단백질 농도 값은 노이즈 감소 필터에 의해 완화된 노이즈이다. 노이즈 감소 필터는 최종 예측 단백질 농도 값을 제공한다. 이러한 양태에서 노이즈 감소 기술은 원시 측정을 모델에 따라 측정이 산출해야 하는 것에 대한 모델 기반 추정과 결합한다. 일 실시예에서, 노이즈 감소 기술은 현재 예측된 단백질 농도 값을 그것의 불확실성과 결합한다. 불확실성은 예측된 단백질 농도 값과 현재 단백질 농도 값의 반복성에 의해 결정될 수 있다. 그 다음으로 예측된 단백질 농도 값이 관찰되면 예측된 단백질 농도 값의 추정치는 더 높은 확실성으로 추정치에 더 많은 가중치가 부여되는 가중 평균을 사용하여 업데이트된다. 반복적인 접근 방식을 사용하여 최종 단백질 농도 값은 이전 측정 및 현재 측정을 기반으로 업데이트될 수 있다. 이러한 양태에서 알고리즘은 현재 예측된 단백질 농도 값, 이전 값 및 실험적으로 결정된 상수를 활용하기 위해 재귀적이고 실시간으로 실시될 수 있어야 한다. 노이즈 감소 기술은 자동화된 피드백 제어기가 작동하여 노이즈를 감소시킴으로써 라만 분석 및 PLS 예측에서 받은 측정의 견고성을 향상시킨다.
B. 사용 방법
개시된 방법은 다운스트림 단백질 정제 공정 동안 수확된 세포 배양 및/또는 단백질 정제 중간체 유체 중의 단백질 농도를 모니터링하고 제어하는 데 사용될 수 있다. 일반적인 다운스트림 정제 공정에는 원심 분리, 직접 심층 여과, 단백질 A 친화성 정제, 바이러스 불활성화 단계들, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 한외여과/정용여과, 바이러스 보유 여과 및 이들의 조합이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이러한 단위 조작은 정의된 순차적 조합으로 사용되어 관심 단백질을 분리하고 제형화된 원료 의약품을 생산하기 전에 불순물 및/또는 중요 품질 속성들을 모니터링하도록 한다. 일 실시예에서, 개시된 방법은 유체 회로의 인라인 라만 프로브를 포함한다. 다른 실시예에서, 개시된 방법은 농축 단백질 정제 중간체 또는 최종 농축 풀을 생성하는 데 사용될 수 있다.
1. 항체 역가 및 단백질 농도
항체 역가와 단백질 농도는 둘 모두 생체 물질의 정제에 중요한 요소이다. 세포 배양액의 초기 수확 후 측정된 항체 역가는 컬럼 로딩을 결정하고 불순물 제거를 위한 강력한 정제 공정을 보장하는 데 중요한다. 정제 단계들 전반에 걸쳐 단백질 농도를 모니터링하는 것은 최종 생성물의 적절한 농도와 수행된 정제 단위 조작의 적절한 성능을 보장하는 데 중요하다. 단백질 농도가 부적절하면 의약품 또는 제형화된 원료 의약품의 생산이 비효과적이 될 수 있다.
일 실시예에서, 수확된 세포 배양액은 수확된 직후, 그러나 추가의 정제가 시작되기 전에 라만 스펙트럼 분석을 받는다. 라만 스펙트럼 데이터는 수확 후 수확된 세포 배양액 중의 항체 역가를 정량화하는 데 사용될 수 있다. 단백질 농도는 단백질 정제 공정 동안, 예를 들어 친화성 포획 동안, 연마 크로마토그래피 동안, 바이러스 보유 여과 동안 또는 한외여과/정용여과 동안 여러 단계들에서 개시된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 인라인 라만 프로브는 일반적으로 오프라인 방식으로 결정되는 분석 특성화를 제공하는 시스템에서 샘플을 제거하지 않고도 수확된 세포 배양액 및/또는 유체 회로 내의 단백질 정제 중간체에서 라만 산란을 감지할 수 있다.
일 실시예에서, 단백질 농도가 한외여과/정용여과 동안 미리결정된 농도 내에 있지 않으면, 시스템에 통지되고 그에 따라 단백질 정제 중간체가 변경된다. 예를 들어, 단백질 정제 중간체의 단백질 농도가 미리결정된 단백질 농도 미만이면, 한외여과/정용여과를 수행하여 단백질 정제 중간체를 더 농축할 수 있다.
일 실시예에서, 농축 단계는 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 수행된다.
2. 약물 대 항체 비율
또 다른 실시예에서, 개시된 방법은 약물 대 항체 비율(DAR)을 모니터링하고 제어하는 데 사용될 수 있다. DAR은 일관된 생성물 품질을 보장하고 페이로드로 후속 라벨링을 용이하게 하기 위해 항체-약물 접합체(ADC), 항체-방사성 핵화물 접합체(ARC) 및 일반 단백질 접합체(강력한 스테로이드, 비세포 독성 페이로드 등)의 개발 중에 모니터링되는 품질 속성이다. DAR은 항체에 접합된 약물 또는 기타 치료 분자의 평균 수이며 치료 접합체 생산에서 중요한 품질 속성이다. DAR 값은 낮은 약물 로딩이 약물 효능을 감소시키는 한편 높은 로딩은 약동학 및 안전성에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 접합 약물의 효능에 영향을 미친다.
일 실시예에서, 항체-방사성 핵화물 접합체는 접합된 직후, 그러나 임의의 추가 정제가 발생하기 전에 라만 스펙트럼 분석을 받는다. 라만 스펙트럼 데이터는 접합 후 DAR을 결정하는 데 사용할 수 있다.
일 실시예에서, DAR이 공정 동안 미리결정된 농도 내에 있지 않으면, 시스템에 통지되고 그에 따라 ADC 중간체가 변경된다. 예를 들어, ADC 중간체의 DAR이 미리결정된 DAR 미만이면 접합 반응 성분이 변경될 수 있는데, 예를 들어 반응물 농도가 최적화될 수 있고, 링커 유형을 변경하거나 온도 또는 기타 제조 변수들이 최적화될 수 있다.
3. 완충액 부형제
개시된 방법은 다운스트림 정제 동안 수확된 세포 배양액 및/또는 단백질 정제 중간체 중의 완충액 부형제의 수준을 모니터링하고 제어하는 데 사용될 수 있다. 단일클론 항체 생산에 일반적으로 사용되는 완충액 부형제는 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘, 숙시네이트, 포스페이트 및 하이드록시메틸아미노메탄(트리스), 프롤린 및 아르기닌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 계면 활성제 부형제는 폴리소르베이트 80(트윈(Tween) 80), 폴리소르베이트 20(트윈 20) 및 폴록사머 188을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 폴리올/이당류/다당류 부형제는 만니톨, 소르비톨, 수크로스 및 덱스트란 40을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항산화 부형제는 아스코르브산, 메티오닌 및 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일반적으로 사용되는 두 가지 아미노산 부형제는 히스티딘과 아르기닌이다. 바람직한 실시예에서, 모니터링되고 제어되는 부형제는 히스티딘 및 아르기닌이다.
최종 농축 풀 부형제 농도는 제외된 체적 및 도난 효과의 조합으로 인해 정용여과 완충액의 조성과 상이하다. 도난 효과는 UF/DF 동안 순-양으로 하전된 단백질이 막에 의해 잔류하는 것과, 잔류물과 투과물 모두에서 전하 중성이 요구되는 것의 결합으로 인해 발생하는 현상이다. 양으로 하전된 단백질의 균형을 맞추기 위해, 음으로 하전된 완충액 성분이 정용여과 완충액에 비해 잔류물에서 풍부하게 되고, 양으로 하전된 완충액 성분은 배출된다. 이 효과로 인해 FCP pH 및 완충액 부형제 농도는 정용여과 완충제 조성물과 실질적으로 상이하게 될 수 있다(Stoner, et al., J Pharm Sci, 93:2332-2342 (2004)).
체적 배제는 단백질이 용액 체적의 상당 부분을 차지하는 고농축 샘플의 거동을 보여준다. 완충액은 단백질이 차지하는 체적에서 배제되고 용액 체적당 용질의 몰(또는 질량)로 표현되는 단백질 농도가 증가함에 따라 완충액 농도가 감소한다. 완충액은 단백질이 차지하는 체적에서 배제되고 용액 체적당 용질의 몰(또는 질량)로 표현되는 단백질 농도가 증가함에 따라 완충액 농도가 감소한다.
이러한 원칙과 중요 품질 속성인 완충액 부형제 수준 둘 모두에 기초하여, 인라인 라만 프로브는 오프라인 분석 특성화를 최소화하고, 제형화 전에 부형제 수준이 충분하도록 보장하기 위한 추가 공정 이해를 제공한다.
4. 고분자량 불순물
단일클론 항체 생산 시, 광범위한 정제 단계들 후에도 낮은 수준의 생성물 관련 불순물이 종종 존재한다. 고분자량(HMW) 종들(예컨대, 항체 이량체 종들)은 mAb 생성물의 크기 이질성에 기여하는 생성물 관련 불순물이다. 단백질 응집의 결과로 인한 치료용 mAb 약물 생성물 내의 HMW 종들의 형성은 잠재적으로 약물 효능과 안전성을 모두 손상시킬 수 있다. HMW 종들은 의약품 개발 공정에서 그리고 제조 공정에서 정제된 단백질 의약품의 방출 테스트의 일부로 정기적으로 모니터링되는 CQA로 간주된다.
일 실시예에서, 개시된 방법을 사용하여 HMW 종들을 함유하는 단백질 의약품을 식별할 수 있다. HMW 종들은 친화성 포획 동안, 바이러스 불활성화 동안, 연마 크로마토그래피 동안, 바이러스 보유 여과 동안, 한외여과/정용여과 동안, 또는 이들의 조합 동안을 포함하지만 이에 제한되지 않는 정제 공정 동안 다양한 단계들에서 라만 분광법에 의해 검출될 수 있다.
일 실시예에서, 개시된 방법은 수확된 세포 배양액 중의 HMW 종들을 검출하고, 유체는 HMW 종들을 제거하기 위해 추가로 처리된다. 세포 배양액에 대해 HMW 종들을 제거하는 방법은 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피를 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가 연마 단계들을 포함한다.
C. UF/DF 시스템
도 6은 인라인 라만 프로브(원숫자 1 내지 4)의 다양한 위치를 포함한 한외여과/정용여과 공정 시스템을 도시한다. 단백질 정제 중간체는 연동식, 로터리 로브, 압력 전달 또는 다이어프램 펌프일 수 있는 정용여과 필터 펌프(200)에 의해 잔류물 용기(205)로 펌핑된다. 잔류물 용기(205)의 유체는 로터리 로브, 연동식 또는 다이어프램 펌프일 수 있는 공급 펌프(210)로 흐르고 공급 압력 밸브(215)를 지나 접선 유동 여과 모듈(TFFM)(220)로 흐른다. TFFM(220)에서 단백질 정제 중간체는 막을 통해 한외여과된다. 관심 생체 물질은 유체 중에 보유되고(잔류물), 물과 완충액 부형제를 포함한 저분자량 용질은 투과물(여과물)로 막을 통과하고, 이는 투과물 압력 밸브(225)를 통해 폐기 탱크(230)로 통과함으로써 시스템을 빠져나간다. 잔류물은 TFFM(220)을 빠져나가고 잔류물 압력 밸브(235), 막관통 압력 제어 밸브(240), 및 잔류물 반환 채널(245)을 통과하여 잔류물 용기(205)로 다시 흐른다. 이 공정은 필요에 따라 반복되어 생체 물질을 농축하고 불순물을 제거하며 CQA가 허용가능한 한도 내에 있도록 보장할 수 있다. 정용여과 동안, 위에 설명한 동일한 유동 경로를 따르며, 새로운 완충액이 생성물 스트림으로 세척됨에 따라 투과성 용질이 새로운 완충액으로 교체된다. 시스템에서 투과물이 제거되는 것과 동일한 속도로 새로운 완충액이 추가되면, 잔류물 탱크와 스키드 유지 체적의 합이 시스템 체적을 정의한다. 하나의 전환 체적(TOV; turn-over volume)은 시스템 체적과 동일하게 UF/DF 공정에 추가되는 정용여과 완충액의 양으로 정의된다. 일반적으로 8회 시스템 체적(8 TOV)을 교체하면 99.9% 초과의 완충액 교환이 보장된다(Schwarts, L., Scientific and Technical Report, PN 33289)
추가적으로, UF/DF 공정 중에 잔류물 용기(205)에서 단백질 용액을 혼합하는 것이 필요하다. 정용여과 중에 정용여과 완충액, 잔류물 반환 및 벌크 잔류물 사이의 밀도 차이로 인해 탱크의 교반은 적절한 완충액 교환을 보장하기에 충분해야 하지만, 전단을 피하도록 충분히 적당해야 하는데, 이는 특정 생성물에서 단백질 응집 및 육안으로 보이지 않는 입자(SVP; subvisible particle) 생성을 유발하는 것으로 관찰되었기 때문이다. 추가적으로, 농축 단계에서 잔류물 반환을 적절히 혼합하여 잔류물 탱크에서 단백질 농도 분극을 방지하여 더 높은 단백질 농도가 UF/DF 막으로 전달되도록 하는 것이 중요하다.
일 실시예에서 라만 프로브는 잔류물 용기(205)에서 정용여과 펌프(200)의 다운스트림인 위치 1에 배치된다. 대안적으로, 라만 프로브는 공급 펌프(210) 전에 인라인으로 잔류물 용기(205)의 다운스트림의 위치 2에 배치될 수 있다. 다른 실시예에서, 라만 프로브는 공급 압력 펌프(215)와 접선 유동 여과 모듈(220) 사이의 위치 3에 인라인으로 배치된다. 또 다른 실시예에서, 라만 프로브는 잔류물 반환(245)에 인라인으로 배치된다. 라만 프로브의 위치는 엔지니어링 및 공정 제약이 있는 복잡한 시스템에서 정확한 인라인 측정을 보장하는 데 중요하다.
D. 세포 배양
수확된 세포 배양액은 단일클론 항체를 생산하도록 조작된 세포를 포함하는 생물 반응기으로부터 수확될 수 있다. 용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기에 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 박테리아 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 비인간 동물 세포, 조류 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 또는 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마와 같은 세포융합과 같은 원핵 생물 및 진핵 생물의 세포를 포함한다. 특정 실시예들에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트 또는 마우스 세포이다. 다른 실시예들에서, 세포는 하기 세포로부터 선택된다: 중국 햄스터 난소(CHO)(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, 림프구, 예를 들어, Jurkat(T 림프구) 또는 Daudi(B 림프구), A431(표피), U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 줄기 세포, 종양 세포 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주. 일부 실시예들에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자를 포함하며, 예를 들어 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6® 세포)를 포함한다. 일부 실시예들에서, 세포는 CHO 세포이다. 다른 실시예들에서, 세포는 CHO K1 세포이다.
단백질 생산에서, "유가식 세포 배양" 또는 "유가식 배양"은 세포 및 배양 배지가 초기에 배양 용기에 공급되고, 추가 배양 영양소가 배양이 종료되기 전에 주기적인 세포 및/또는 생성물 수확의 유무에 관계없이 배양하는 동안 비연속적 증분으로 배양물에 천천히 공급되는 회분식 배양을 지칭한다. 유가식 배양은 주기적으로 전체 배양(세포 및 배지를 포함할 수 있음)이 제거되고 새로운 배지로 대체되는 "반-연속적 유가식 배양"을 포함한다. 유가식 배양은 단순한 "회분식 배양"과 구별되는 반면, 세포 배양을 위한 모든 성분(동물 세포 및 모든 배양 영양소를 포함)은 회분식 배양에서 배양 공정의 시작시에 배양 용기에 공급된다. 표준 유가식 공정 동안 상청액이 배양 용기에서 제거되지 않는 반면, 관류 배양에서, 세포는 예를 들어 여과에 의해 배양에서 억제되고, 배양 배지는 배양 용기로부터 연속적으로 또는 간헐적으로 도입되고 제거된다는 점에서 유가식 배양은 "관류 배양"과 상이할 수 있다. 그러나, 유가식 세포 배양 동안 시험 목적으로 샘플을 제거하는 것이 고려된다. 유가식 공정은 최대 작업 체적 및/또는 단백질 생성에 도달할 때까지 계속되고, 이후로 단백질이 수확된다.
어구 "연속 세포 배양"은 일반적으로 특정 성장 단계에서 세포를 연속적으로 성장시키는 데 사용되는 기술과 관련된다. 예를 들어, 일정한 세포 공급이 요구되거나 특정 관심 단백질의 생성이 요구되는 경우, 세포 배양은 특정 성장 단계에서의 유지를 필요로 할 수 있다. 따라서, 그러한 특정 단계에 세포를 유지하기 위해 조건을 지속적으로 모니터링하고 조정해야 한다.
용어 "세포 배양 배지" 및 "배양 배지"는 전형적으로 탄수화물 에너지원, 필수(예를 들어, 페닐알라닌, 발린, 트레오닌, 트립토판, 메티오닌, 류신, 이소류신, 리신 및 히스티딘) 및 비필수(예를 들어, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 프롤린, 세린 및 티로신) 아미노산, 미량 원소, 에너지원, 지질, 비타민 등과 같은 세포의 성장을 향상시키는 데 필요한 영양소를 제공하는 포유류 세포 성장에 사용되는 배양액을 의미한다. 세포 배양 배지는 세포 성장을 지지하는 원료를 공급하는 추출물, 예를 들어 혈청 또는 펩톤(가수분해물)을 함유할 수 있다. 배지는 동물 유래 추출물 대신에 효모 유래 또는 대두 추출물을 함유할 수 있다. 화학적으로 정의된 배지는 모든 화학 성분이 알려져 있는(즉, 알려진 화학 구조를 갖는) 세포 배양 배지를 지칭한다. 화학적으로 정의된 배지에는 혈청 또는 동물 유래 펩톤과 같은 동물 유래 성분이 전혀 없다. 일 실시예에서, 배지는 화학적으로 정의된 배지이다.
용액은 또한 호르몬 및 성장 인자를 포함한, 최소 속도 이상으로 성장 및/또는 생존을 향상시키는 성분을 함유할 수 있다. 용액은 배양되는 특정 세포의 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제형화될 수 있다.
E. 관심 단백질
개시된 방법을 사용하여 원핵 또는 진핵 세포에서의 발현에 적합한 임의의 관심 단백질을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 관심 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 항원 결합 단편, ScFv 또는 이의 단편, Fc-융합 단백질 또는 이의 단편, 성장 인자 또는 이의 단편, 사이토카인 또는 이의 단편, 또는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인 또는 이의 단편을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 관심 단백질은 단일 서브 유닛으로 구성된 단순한 폴리펩티드, 또는 2개 이상의 서브 유닛을 포함하는 복합 다중 서브 유닛 단백질일 수 있다. 관심 단백질은 생물약학적 제품, 식품 첨가물 또는 보존제, 또는 정제 및 품질 표준에 따른 임의의 단백질 제품일 수 있다.
일부 실시예들에서, 항체는 항-프로그래밍된 세포 사멸 1 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,987,500호에 기술된 항-PD1 항체), 항-프로그래밍된 세포 사멸 리간드-1(예를 들어, 미국 특허 제9,938,345호에 기술된 항-PD-L1 항체), 항-Dll4 항체, 항-안지오포이에틴-2 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,402,898호에 기술된 항-ANG2 항체), 항-안지오포신-유사 3 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,018,356호에 기술된 항-AngPtl3 항체), 항 혈소판 유래 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,265,827호에 기술된 항-PDGFR 항체), 항-Erb3 항체, 항-프로락틴 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,302,015에 기술된 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,795,121호에 기술된 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항 표피 성장 인자 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,132,192호에 기술된 항-EGFR 항체 또는 미국 특허 제9,475,875호에 기술된 항-EGFRvIII 항체), 항-프로단백질 컨버타제 서브틸리신 켁신(Subtilisin Kexin)-9 항체(예를 들어, 미국 특허 제8,062,640호 또는 미국 특허 제9,540,449호에 기술된 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체(예를 들어, 미국 특허 제8,871,209호 또는 제9,260,515호에 기술된 항-미오스타틴 항체로도 알려진 항-GDF8 항체), 항-글루카곤 수용체(예를 들어, 미국 특허 제9,587,029호 또는 제9,657,099호에 기술된 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터류킨 4 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2014/0271681A1 또는 미국 특허 제8,735,095호 또는 제8,945,559호에 기술된 항-IL4R 항체), 항-인터류킨 6 수용체 항체(예를 들어, 미국 특허 제7,582,298호, 제8,043,617호 또는 제9,173,880호에 기술된 항-IL6R 항체), 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-인터류킨 33(예를 들어, 미국 특허 제9,453,072호 또는 제9,637,535호에 기술된 항-IL33 항체), 항 호흡기 세포 융합 바이러스 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제9,447,173호에 기술된 항-RSV 항체), 분화 3의 항-클러스터(예를 들어, 미국 특허 제9,447,173호 및 제9,447,173호 및 미국 출원 제62/222,605호에 기술된 항-CD3 항체), 분화 20의 항-클러스터(예를 들어, 미국 특허 제9,657,102호 및 제US20150266966A1호 및 미국 특허 제7,879,984호에 기술된 항-CD20 항체), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 분화-48의 항-클러스터(예를 들어, 미국 특허 제9,228,014호에 기술된 항-CD48 항체), 항-Fel d1 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,079,948호에 기술된 바와 같음), 항-중동 호흡기 증후군 바이러스(예를 들어, 미국 특허 제9,718,872호에 기술된 항-MERS 항체), 항-에볼라 바이러스 항체(예를 들어, 미국 특허 제9,771,414호에 기술된 바와 같음), 항-지카 바이러스 항체, 항-림프구 활성화 유전자 3 항체(예를 들어, 항-LAG3 항체 또는 항-CD223 항체), 항-신경 성장 인자 항체(예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US2016/0017029호 및 미국 특허 제8,309,088호 및 제9,353,176호에 기술된 항-NGF 항체) 및 항-액티빈 A 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시예들에서, 이중특이적 항체는 항-CD3 x 항-CD20 이중특이적 항체(미국 특허 제9,657,102호 및 미국 특허 출원 공개 제US20150266966A1호에 기술된 바와 같음), 항-CD3 x 항-뮤신 16 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3 x 항-Muc16 이중특이적 항체), 및 항-CD3 x 항-전립선-특이적 막 항원 이중특이적 항체(예를 들어, 항-CD3 x 항-PSMA 이중특이적 항체)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 관심 단백질은 압식시맙(abciximab), 아달리무맙(adalimumab), 아달리무맙-아토(adalimumab-atto), 아도-트라스투주맙(ado-trastuzumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 알리로쿠맙(alirocumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 아벨루맙(avelumab), 바실리시맙(basiliximab), 벨리무맙(belimumab), 벤랄리주맙(benralizumab), 베바시주맙(bevacizumab), 베즐로톡수맙(bezlotoxumab), 블리나투모맙(blinatumomab), 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin), 브로달루맙(brodalumab), 카나키누맙(canakinumab), 카프로맙 펜데티드(capromab pendetide), 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 세미플리맙(cemiplimab), 세툭시맙(cetuximab), 데노수맙(denosumab), 디누툭시맙(dinutuximab), 두필루맙(dupilumab), 두르발루맙(durvalumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 엘로투주맙(elotuzumab), 에미시주맙-kxwh(emicizumab-kxwh), 엠탄신알리로쿠맙(emtansinealirocumab), 에비나쿠맙(evinacumab), 에볼로쿠맙(evolocumab), 파시누맙(fasinumab), 골리무맙(golimumab), 구셀쿠맙(guselkumab), 이브리투모맙 티우세탄(ibritumomab tiuxetan), 이다루시주맙(idarucizumab), 인플릭시맙(infliximab), 인플릭시맙-abda, 인플릭시맙-dyyb, 이필리무맙(ipilimumab), 익세키주맙(ixekizumab), 메폴리주맙(mepolizumab), 네시투무맙(necitumumab), 네스바쿠맙(nesvacumab), 니볼루맙(nivolumab), 오빌톡사시맙(obiltoxaximab), 오비누투주맙(obinutuzumab), 오크렐리주맙(ocrelizumab), 오파투무맙(ofatumumab), 올라라투맙(olaratumab), 오말리주맙(omalizumab), 파니투무맙(panitumumab), 펨브롤리주맙(pembrolizumab), 페르투주맙(pertuzumab), 라무시루맙(ramucirumab), 라니비주맙(ranibizumab), 락시바쿠맙(raxibacumab), 레즐리주맙(reslizumab), 리누쿠맙(rinucumab), 리툭시맙(rituximab), 사릴루맙(sarilumab), 세쿠키누맙(secukinumab), 실툭시맙(siltuximab), 토실리주맙(tocilizumab), 토실리주맙, 트라스투주맙(trastuzumab), 트레보그루맙(trevogrumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 및 베돌리주맙(vedolizumab)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시예
실시예 1: UF/DF 적용을 위한 범용 인라인 단백질 농도 모델
재료 및 방법
모델의 데이터 수집에는 MR-Probe-785 및 RamanRxn Probehead-758(Kaiser Optical Systems, Inc. Ann Arbor, MI)을 활용하는 Raman Rxn2 및 Rxn 4 분석기(Kaiser Optical Systems, Inc. Ann Arbor, MI)의 스펙트럼 데이터가 포함되었다. 추가적으로, 가용성에 따라 개발 전반에 걸쳐 여러 가지 광학 장치가 사용되었다. 라만 분석기 작동 파라미터들은 6회 누적에 대해 10초 스캔 시간으로 설정되었으며 5회 반복되었다. SIMCA 13(MKS Data Analytic Solutions, Umea, Sweden)은 스펙트럼 데이터 내의 피크를 오프라인 단백질 농도 측정과 연관시키는 데 사용되었다. 일차 농축, 정용여과 및 최종 농축을 포함하여 UF/DF 단위 조작의 여러 지점에서 인라인 측정이 이루어졌다. 오프라인 단백질 농도는 SoloVPE(C Technologies, Inc.)를 사용하여 결정되었다. SoloVPE 측정은 삼중으로 이루어졌다.
도 2는 화학계량학적 모델을 만드는 데 사용된 스펙트럼 영역을 도시한다. 영역은 영역 1-977-1027 cm-1(링 구조), 영역 2-1408-1485 cm-1(아르기닌), 영역 3-1621-1711 cm-1(이차 구조) 및 영역 4-2823-3046 cm-1(C-H 스트레칭)를 포함한다. 원시 스펙트럼 데이터에서 다음의 스펙트럼 필터링을 수행하였다: 가변하는 기준선을 제거하기 위한 21 cm-1 포인트 평활화를 사용한 1차 도함수
결과
한외여과/정용여과(UF/DF) 적용을 위한 범용 인라인 단백질 농도 모델의 타당성을 결정하기 위해 mAb1을 라만 분광법을 사용하여 분석했다. 단백질 농도는 정용여과 전(일차 농축), 정용여과 중(정용여과) 및 정용여과 후(최종 농축)에 측정했다. 모델에서 계산된 농도는 SoloVPE에 의해 결정된 단백질 농도와 비교되었다(도 3). 0-120 g/L(일차 농축 및 정용여과)에 대한 모델 오차는 3.1%이었고 120 g/L(최종 농축) 초과에 대한 모델 오차는 훈련 세트 데이터가 포함되었을 때(mAb 1 스펙트럼이 PLS 모델에 통합됨) 1.8%였다.
공정 오차는 라만 분광법으로 감지할 수 있다. 도 3은 UF/DF 시스템을 통한 최종 재순환 동안 시스템의 공기 혼입이 라만 스펙트럼 데이터에 의해 감지되었음을 도시한다. 직사각형으로 둘러싸인 막대들은 SoloVPE에 의해 예측된 mAb1의 농도가 200 g/L 초과인 한편 라만 예측은 약 65 g/L임을 도시한다.
도 4는 10개의 대표적인 mAb에 대한 절대 라만 모델 오차를 도시한다. 이 데이터는 상이한 mAb 아이소타입(IgG1 및 IgG4) 및 이중특이적 분자를 포함하는 mAb에 대한 모델의 성공적인 개발을 나타내었다. 17개 모델 예측 중 14개가 5% 이하의 오차를 충족했다. 그러나, 프로브 대 프로브 가변성이 PLS 모델에 의해 예측된 오차를 부풀리기 때문에 개발 중에 사용된 각 프로브에 대해 특이적 모델(0-120 g/L 및 >120 g/L)이 생성되었다.
모델을 최적화하기 위해 여러 mAb에 맞춰 다양한 프로브와 레이저를 테스트했다. 업데이트된 범용 모델에서 단지 하나의 스펙트럼 영역: 2823-3046 cm-1(C-H 스트레칭)만을 포커싱하여, 표준 정상 변량(SNV)의 스펙트럼 필터링을 사용하여 레이저 전력 변동과 프로브 가변성을 기준선 보정으로 수정하도록 모델 미세 조정을 수행하였다. 개발된 두 모델 성분의 비교는 표 1에 요약되어 있다. 부분 최소 제곱(PLS) 회귀 모델은 해당 오프라인 SoloVPE 측정을 3회 수행하여 생성되었다. 부분 최소 제곱 회귀 모델 세부 정보는 표 2에 나타내었다. 최적화된 레이저/프로브 범용 모델로 예측된 업데이트된 데이터세트는 이전 17개 중 14개에 비해 5% 이하 오차를 충족하는 17개 모델 예측 중 15개를 나타내었다(도 5).
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 2: 단백질 농도 모델의 스케일-업(scale-up) 성능
재료 및 방법
최적화된 범용 모델(v.2)(표 1 참조)은 mAb10을 사용한 스케일-업 ½” Single Use Tangential Flow Filtration System (Pall Corporation) 실험으로 테스트되었다. mAb10 로드 재료는 일반적인 공정 로드 재료가 아닌 제형화된 원료 의약품이었다. FDS 물질은 단백질 농도 및 완충액 부형제를 포함하는 대표적인 UF/DF 로드 소스로 희석되었다. 그러나 범용 모델 개발 중에 테스트되지 않은 추가 부형제가 로드 소스에 존재함으로 인해 mAb 10 특이적 모델이 생성되었다. 라만 데이터 수집 방법 및 스캔 길이 정보는 실시예 1을 참조한다. >120 g/L에 대한 mAb 특이적 모델은 범용 모델(v. 2)과 동일한 스펙트럼 영역 및 전처리 기술을 사용했다. 그러나 0-120 g/L mAb 특이적 모델은 표준 정상 변량 전처리와 함께 도 2에 나타낸 바와 같은 4개의 스펙트럼 영역들을 사용했다. 0-120 g/L 모델의 차이는 로드 소스의 추가 부형제에 기인할 수 있다.
결과
표 3에 나타낸 바와 같이 훈련 세트가 모델 예측에 포함되었을 때 업데이트된 2/4 모델에 대해 5% 이하의 오차라는 모델 목표가 충족되었다. IOPS에서 예비 실험 중에 로드 소스, 레이저 및 스케일(벤치 스케일 대 스케일-업)과 같은 주목할만한 차이를 기반으로 제2 실시가 수행되었다. 제2 실험에 앞서 0-120 g/L mAb 10 특이적 모델이 변경되었다. 4개 영역 모두 SNV 전처리를 사용하여 포함되었지만 3개 영역들 즉, 977-1027 cm-1, 1408-1485 cm-1 및 1621-1711 cm-1은 21 cm-1 포인트 평활화를 사용한 1차 도함수를 추가적으로 사용했다. 컴파일링된 실험 결과의 요약은 표 3에 요약되어 있다. 제2 실험에서, 표 3에 나타낸 바와 같이 훈련 세트가 모델 예측에 포함되었을 때 업데이트된 3/4 모델에 대해 5% 이하의 오차라는 모델 목표가 충족되었다. 데이터 분석 중에 추가로 관찰한 사항은 로드 소스가 오차 증가의 주요 원인이라는 것이다. 로드 샘플을 제거하면 범용 모델 오차가 8.6%에서 5.7%로 감소한다. 도 7에서는 최종 농축 풀에 대한 인라인 예측(실시간, 넓게 해칭된 막대) 및 업데이트된 모델(좁게 해칭된 막대)에 대한 결과가 단백질 농도를 SoloVPE의 오프라인 측정(빈 막대)과 비교하여 도시한다. 범용 모델 인라인 및 업데이트된 모델은 2.7%의 오차가 있는 반면 mAb 10 모델 인라인 및 업데이트된 모델은 최종 농축 풀에 대해 각각 12.0% 및 4.2%였다. mAb 10 모델에서 관찰된 증가된 오차는 약 250 g/L 범위의 제한된 데이터에 기인할 수 있지만 범용 모델은 더 큰 데이터 세트를 가지고 있다. 오차 증가에 기여하는 또 다른 요인은 모델이 규정된 범위를 벗어나(즉, mAb 10 모델에서 >250 g/L) 외삽될 수 없다는 것이다.
Figure pct00003
실시예 3: 단백질 농도 모델의 파일럿 공정 장비로의 스케일-업.
재료 및 방법
상업적으로 활성화된 공정들의 공정 개발 중, UF/DF는 중요한 공정 파라미터들과 중요 품질 속성들을 이해하기 위해 설계기반 품질고도화(Quality by Design) 원칙을 따르는 단위 조작으로 특성화된다. 라만 및 모델 개발은 mAb 11 개발 중에 포함되어 공정 이해를 향상시키고 모델 개발에 대한 간소화된 접근 방식을 제안했다. 10초에서 5초로 조정된 스캔 시간 길이를 제외하고 라만 데이터 수집에 대한 방법 정보는 실시예 1을 참조한다. 개발된 mAb 11 모델은 4개 스펙트럼 영역 모두에 대해 SNV 전처리를 사용하되, 3개 영역, 즉 977-1027 cm-1, 1408-1485 cm-1 및 1621-1711 cm-1은 추가적으로 21 cm-1 포인트 평활화를 사용한 1차 도함수를 사용했다.
결과:
벤치 스케일 모델은 4개의 DoE 실험과 4개의 스펙트럼 영역을 사용하여 생성되었다. 도 8a는 4개의 DoE 실험의 실시간 예측에 대한 라만 모델 오차를 도시한다. 도 8b는 벤치 스케일 모델을 사용한 15개의 추가 실험에 대한 라만 모델 오차를 도시한다. mAb 특정 단백질 농도 모델은 5% 이하 오차로 0-120 g/L 및 >120 g/L에 대해 생성되었다.
벤치 스케일 모델(n = 15)을 사용하여, 파일럿 스케일 실시(n = 3)는 mAb11에 대해 0.6% 내지 10.6%의 예측 오차를 가진다(도 9a). 파일럿 스케일 데이터가 벤치 스케일 모델(n = 18)에 통합되면 파일럿 스케일 예측 오차는 0.6 내지 2.2%로 감소했다. 벤치 스케일 모델 오차의 증가는 스케일-업 장비와 연관된 열 소산으로 기인한 라만 스펙트럼 이동에 대한 온도 영향의 결과일 수 있다. 온도는 향후 라만 개발 및 모델 검증 주장에서 고려되는 요소가 될 것이다.
세 가지 상이한 단일클론 항체(mAb J, mAb K 및 mAb L)를 사용한 7개의 파일럿 스케일 실험에서 최종 모델 예측 오차는 0.6 내지 2.2%로 5% 목표 이내였다(도 9b).
실시예 4: 공정 결정을 가능하게 하는 실시간 농도 결정을 위한 라만 모델의 사용.
재료 및 방법
라만 스펙트럼 수집 및 모델링을 위한 동일한 프로토콜이 라만 자동화에 사용되었으므로 자세한 내용은 실시예3을 참조한다. 최종 단백질 농도 목표들을 달성하기 위해 라만 스펙트럼 데이터를 사용하기 위한 자동화된 제어 전략이 개발되었다. 생성된 예측 모델을 사용하여, 데이터를 필터링하고, 단백질 농도 목표를 달성함에 따라 단위 조작을 종료하기 위해 UF/DF의 계측에 입력을 제공하는 데 사용되었다. SoloVPE 측정은 삼중으로 이루어졌다.
결과:
도 10a 및 도 10b는 배치 UF/DF 및 단일 통과 TFF 단백질 농도의 자동 모니터링을 위한 예시적인 스크린 설정을 도시한다. 도 11은 예측 모델링을 사용하여 다양한 공정 단계들에서 mAb14의 실시간 농도를 모니터링하고 원하는 농도 목표가 충족되면 농도 단위 조작이 중지되도록 트리거할 수 있음을 도시한다. 최종 농축 풀은 오프라인 SoloVPE 측정 값인 262 g/L에 비해 260 g/L로 라만에 의해 예측되었으며 결과적으로 5% 이하의 오차 목표를 충족하는 0.8% 오차가 발생했다. 라만은 원하는 단백질 농도 목표가 충족되는지 확인하는 자동화된 공정 결정을 내리는 데 사용하기에 적합한 응용 프로그램이다.
실시예 5: UF/DF에서 고분자량(HMW) 종 모델링에 대한 개념 증명.
재료 및 방법
HMW 종 모델에 대한 데이터 수집에는 Raman Rxn2 분석기(Kaiser Optical Systems, Inc. Ann Arbor, MI) RamanRxn Probehead-758(Kaiser Optical Systems, Inc. Ann Arbor, MI)의 스펙트럼 데이터가 포함되었다. 추가적으로, 가용성에 따라 개발 전반에 걸쳐 여러 가지 광학 장치가 사용되었다. 라만 분석기 작동 파라미터들은 1회 누적에 대해 72초 스캔 시간으로 설정되었으며 25회 반복되었다. 일차 농축, 정용여과 및 최종 농축을 포함하여 UF/DF 단위 조작의 여러 지점에서 인라인 측정이 이루어졌다. 스펙트럼 범위는 110-3415 cm-1이다. 원시 스펙트럼 데이터는 SNV를 사용하여 사전 처리되었으며 추가적으로 21 cm-1 평활화를 사용한 1차 도함수를 사용하여 필터링되었다. 오프라인 HMW 종 측정은 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정되었다.
결과:
HMW 종들은 단백질 정제에서 예비 중요 품질 속성으로 간주되는 또 다른 속성이다. 현재 기술은 공정 중에 HMW 종들을 실시간으로 모니터링할 수 없다. 도 12a는 개시된 라만 모델링 방법이 단백질 정제 동안 HMW 종들을 모니터링하는 데 사용될 수 있음을 도시한다. 라만 모델링에 의한 HMW 종 예측은 정제(일차 농축, 정용여과 및 최종 농축) 전반에 걸쳐 SE-UPLC를 사용하여 수집된 측정 값과 비교되었다. 라만 모델링은 단백질 공정 중에 실시간으로 고분자 종들의 비율을 효과적으로 예측했다. 모델은 3.4%의 평균 오차로 생성되었다.
실시예 6. 연마 크로마토그래피에서 고분자량(HMW) 종 모델링에 대한 개념 증명.
재료 및 방법
HMW 종 모델에 대한 데이터 수집에는 MR-Probe-785를 사용하는 Raman Rxn2 분석기(Kaiser Optical Systems, Inc. Ann Arbor, MI)의 스펙트럼 데이터가 포함되었다. 라만 분석기 작동 파라미터들은 5회 반복 측정으로 1회 누적에 대해 10, 30 또는 60초 스캔 시간으로 설정되었다. 총 HMW가 6.2% 내지 76.2%인 음이온 교환 크로마토그래피(AEX) 풀을 사용하여 오프라인 측정을 수행했다. 사용된 모델링 및 전처리 기술에 사용되는 스펙트럼 범위는 표 4에 설명되어 있다. 오프라인 HMW 종 측정은 크기 배제 초고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 결정되었다.
결과:
개시된 라만 모델링 방법은 연마 크로마토그래피 단백질 정제 동안 HMW 종들을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 라만 모델링에 의한 HMW 종 예측은 생성된 AEX 풀에서 SE-UPLC를 사용하여 수집된 측정 값과 비교되었다. 표 4에 요약된 바와 같이, 평가된 방법의 RMSEP는 3.2 내지 7.6% 범위였다. 도 12b에서 6.2% 내지 19.7% HMW의 압축 데이터 세트는 350 내지 3100 cm-1의 스펙트럼 영역과 SNV 전처리 기술로 생성된 모델을 평가하는 데 사용되었다. HMW 범위를 줄임으로써 RMSEP는 각각 10초, 30초 및 60초 동안 1.2%, 1.4% 및 2.1%로 감소했다. 이러한 결과를 기반으로 HMW 함량은 AEX 풀에서 라만으로 결정할 수 있다.
Figure pct00004
실시예 7. 역가 모델링을 위한 개념 증명.
재료 및 방법
훈련 세트 모델은 0.36 내지 9.8 g/L 범위의 역가를 달성하기 위해 FCP(265 g/L)로 스파이크된 샘플을 통한 35개의 단백질 A 흐름이었다. 모델은 1.3 내지 8.8 g/L 범위의 역가를 가진 희석된 심층 여과물 샘플에서 평가되었다. 역가 모델에 대한 데이터 수집에는 MR-Probe-785를 사용하는 Raman Rxn2(Kaiser Optical Systems, Inc. Ann Arbor, MI)의 스펙트럼 데이터가 포함되었다. 침지 프로브를 오프라인 방식으로 사용하여 작동 매개 변수를 1회 누적에 대해 20초 스캔 시간으로 설정하고 5회 반복하여 스펙트럼 데이터를 생성했다. 스펙트럼 범위는 977-1027, 1408-1485, 1621-1711 및 2823-3046 cm-1이다. 원시 스펙트럼 데이터는 SNV를 사용하여 사전 처리되었으며 추가적으로 21 cm-1 평활화를 사용한 1차 도함수를 사용하여 필터링되었다. 모델 특성은 표 5에 기술되어 있다.
Figure pct00005
결과:
항체 역가는 친화성 컬럼 로딩, 생산 일관성 및 공정 중 중간 체적 제약을 포함한 후속 다운스트림 정제 단위 조작을 알리는 데 필요한 단백질 정제의 공정 속성이다. 부정확한 컬럼 로딩은 후속 예비 중요 품질 속성들에 영향을 미칠 수 있으므로 라만 분광과 같은 모니터링 기술에 대한 요구가 있다. 도 13은 단일클론 항체에 대한 실제 항체 역가 대 라만 예측 항체 역가를 도시한다. 이 실험에서 모델 오차는 26%로 원하는 목표인 5% 이하 보다 높다. 희석 및 비희석 심층 여과물을 사용하여 모델을 개발하고 스캔 길이를 늘리면 모델 오차가 감소한다.
실시예 8: 약 10%의 현재 직교 분석 오차를 충족하는 완충액 부형제 측정을 위한 라만 모델.
재료 및 방법
다양한 항체에 대한 이전 농도 모델 개발 실시에서 데이터를 수집하였다. 라만 데이터 수집에 대한 방법 정보는 실시예 1을 참조한다. 표 6은 샘플에서 히스티딘과 아르기닌을 검출하기 위한 모델 성분을 보여준다. 스펙트럼 영역은 알려진 히스티딘/아르기닌 피크를 기반으로 했다(Zhu, et al., Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 78(3):1187-1195 (2011)). 히스티딘 및 아르기닌의 초기 모델 개발 후, mAb 14로 추가 모델 특성화를 수행했다. 비접촉식 광학 프로브를 사용하여 라만 분석기 작동 파라미터들을 5회 누적에 대해 20초 스캔 시간으로 설정하였다. 히스티딘의 스펙트럼 범위는 1200 - 1480 cm-1이고 아르기닌의 경우 860 - 1470 cm-1가 사용되었다. 두 완충액 부형제 모두에 대해 원시 스펙트럼 데이터는 SNV를 사용하여 사전 처리되었으며 추가적으로 21 cm-1 평활화를 사용한 1차 도함수를 사용하여 필터링되었다. 오프라인 히스티딘 및 아르기닌 종 측정은 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 아미노산 정량 기반 방법을 사용하여 결정되었다.
결과:
개시된 라만 모델링 방법 및 시스템을 사용하여 처리된 항체 샘플에서 완충액 부형제를 측정하는 데 사용될 수 있는지 확인하기 위해 이전 농도 모델 개발 실시에서 수집된 데이터를 히스티딘 및 아르기닌에 대해 분석했다. 라만 모델링을 사용하여 예측된 값은 도 14a에서 볼 수 있는 UPLC 기반 아미노산 방법을 기반으로 계산된 값과 비교되었다. 예비 히스티딘/아르기닌 라만 모델링에 대한 예측 값 및 평균 모델 오차는 표 6에 제시되어 있다. 도 14b에서, 예측된 히스티딘 대 실제 히스티딘 모델에 대한 점 그래프가 mAb 14에 대해 표시되며, 8.2%의 평균 모델 오차는 완충액 부형제에 대한 10% 이하 목표를 충족한다. 10% 이하의 목표는 현재 UPLC 직교 방법 분석 가변성을 기반으로 한다. 도 14c에서 예측된 아르기닌 대 실제 아르기닌 모델에 대한 점 그래프가 mAb 14에 대해 표시되며 평균 모델 오차 2.9%는 10% 이하의 목표를 충족한다.
이 데이터는 라만 모델링을 사용하여 공정 중 UF/DF 및 FCP 재료에서 완충액 부형제의 수준을 예측할 수 있음을 나타낸다. 이러한 부형제의 성공적인 정량화는 UF/DF가 후속 제형을 가능하게 하는 최종 농축 풀을 제공하도록 보장한다.
Figure pct00006
실시예 9: 약물 대 항체 비율 측정을 위한 라만 모델.
재료 및 방법
DAR은 일관된 생성물 품질을 보장하고 페이로드로 후속 라벨링을 용이하게 하기 위해 항체-약물 접합체(ADC), 항체-방사성 핵화물 접합체(ARC) 및 일반 단백질 접합체(강력한 스테로이드, 비세포 독성 페이로드 등)의 개발 중에 모니터링되는 품질 속성이다. 라만은 DAR 수준을 모니터링하는 기술로 평가되어 반응에 대한 제어 전략으로 사용될 수 있다. 개발중인 두개의 다른 mAb(mAb 1 및 mAb 3)를 라만을 사용하여 DAR 결정 타당성에 대해 평가했다. 비접촉식 광학 프로브를 사용하여 라만 분석기 작동 파라미터들을 10회 누적에 대해 10초 스캔 시간으로 설정하였다. 350 - 3100 cm-1의 스펙트럼 범위는 SNV를 사용하여 전처리된 원시 스펙트럼 데이터와 함께 사용되었으며 추가적으로 21 cm-1 평활화를 사용한 2차 도함수를 사용하여 필터링되었다. 표 7은 샘플에서 DAR을 결정하기 위한 모델 성분을 도시한다. 오프라인 DAR 측정은 UV 분광법 기반 방법을 사용하여 결정되었다.
Figure pct00007
결과:
도 15a 내지 도 15b는 mAb 1 및 mAb 3에 대한 iPET 약물 접합체에 대한 약물 대 항체 비율을 측정하는 데 라만 모델링을 사용할 수 있음을 나타낸다. 두 모델 모두 교차 검증의 제곱 평균 제곱근 오차는 0.6 DAR이다. 현재 직교 UV 기반 분석은 0.3 DAR(1 표준 편차)과 연관된 가변성을 갖는다. 초기 라만 예측은 두 표준 편차 내에 있으며 추가 모델 개선을 통해 DAR을 라만으로 성공적으로 예측할 수 있음을 시사한다.
전술한 명세서에서 본 발명은 그의 특정 실시예들과 관련하여 설명되고, 예시의 목적으로 많은 세부 사항이 제시되었지만, 본 발명은 추가의 실시예들이 가능하고, 본 명세서에 기술된 특정 세부 사항들은 본 발명의 기본 원리를 벗어나지 않으면서 상당히 변경될 수 있음이 명백할 것이다.
본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 본 발명은 이들의 사상 또는 본질적인 속성들로부터 벗어남이 없이 다른 구체적인 실시 형태로 구현될 수 있으므로, 본 발명의 범주를 나타내면서, 전술한 상세한 설명보다는 첨부된 청구항을 참조해야 할 것이다.

Claims (35)

  1. 농축 단백질 정제 중간체를 생산하는 방법으로서,
    단백질 정제 중간체를 농축하면서 인시츄 라만 분광법을 사용하여 실시간으로 상기 단백질 정제 중간체의 농도를 결정하는 단계; 및
    상기 농축 단계의 파라미터를 실시간으로 조정하여 상기 농축 단백질 정제 중간체 및/또는 최종 농축 풀을 얻는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 농축 단백질 생성물의 농도가 5 mg/mL 내지 300 mg/mL인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질 정제 중간체의 농도가 적어도 50 mg/mL인, 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단백질 정제 중간체의 농도가 적어도 150 mg/mL인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 정제 중간체는 한외여과, 완충액 교환, 또는 둘 모두를 사용하여 농축되는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 정제 중간체는 생물 반응기, 유가식 배양 또는 연속 배양으로부터 수확되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 정제 중간체의 농도를 결정하는 단계는 실시간으로, 연속적 또는 간헐적으로 발생하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 농도의 정량화는 30초 내지 10분 간격, 매시간 또는 매일 수행되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 정제 중간체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 융합 단백질 또는 재조합 단백질인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 스펙트럼 데이터가 977-1027 cm-1, 1408-1485 cm-1, 1621-1711 cm-1, 2823-3046 cm-1, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 파수 범위에서 수집되는, 방법.
  11. 단백질 정제 중간체를 생산하는 방법으로서,
    복수의 단백질 정제 중간체 중 어느 하나를 정량화할 수 있는 범용 모델을 생성하기 위해 상기 복수의 단백질 정제 중간체에 대해 독립적으로 라만 분광 분석을 수행하는 단계;
    상기 단백질 정제 중간체의 농축 동안 상기 범용 모델과 함께 인시츄 라만 분광법을 사용하여 상기 단백질 정제 중간체의 농도를 결정하는 단계; 및
    상기 농축 단백질 정제 중간체가 미리 결정된 농도 또는 최종 농축 풀 목표에 도달하면 상기 농축 단백질 정제 중간체를 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 모델은 원시 스펙트럼 데이터 및 오프라인 단백질 농도 데이터의 부분 최소 제곱 회귀 분석을 사용하여 생성되는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 라만 분광 데이터에 대해 정규화 기술 또는 포인트 평활화를 수행하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 정규화 기술은 표준 정규 변량을 포함하는, 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 포인트 평활화는 21 cm-1 평활화를 사용한 1차 도함수를 포함하는, 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모델은 오프라인 단백질 농도 값과 비교하여 5% 이하의 오차로 예측된 단백질 농도 값을 제공하는, 방법.
  17. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 모델은 오프라인 단백질 농도 값과 비교하여 3% 이하의 오차로 예측된 단백질 농도 값을 제공하는, 방법.
  18. 제11항에 있어서, 상기 농축 단백질 정제 중간체는 5 mg/mL 내지 300 mg/mL의 농도를 갖는, 방법.
  19. 제11항에 있어서, 상기 농축 단백질 정제 중간체의 농도는 적어도 100 mg/mL인, 방법.
  20. 제11항에 있어서, 상기 농축 단백질 정제 중간체의 농도는 적어도 150 mg/mL인, 방법.
  21. 제11항에 있어서, 상기 농축 단백질 정제 중간체는 한외여과, 정용여과 또는 둘 모두를 사용하여 농축되는, 방법.
  22. 제11항에 있어서, 상기 농축 단백질 정제 중간체는 생물 반응기, 유가식 배양 또는 연속 배양으로부터 수확되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 정제 중간체의 농도를 결정하는 단계는 실시간으로, 연속적 또는 간헐적으로 발생하는, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 농도의 정량화는 30초 내지 10분 간격, 매시간 또는 매일 수행되는, 방법.
  25. 제11항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 정제 중간체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 융합 단백질 또는 재조합 단백질인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따라 제조된 단백질 정제 중간체.
  27. 다운스트림 단백질 정제 공정 동안 단백질 정제 중간체에서 중요 품질 속성을 모니터링하고 제어하는 방법으로서,
    인시츄 라만 분광법을 사용하여 상기 단백질 정제 중간체에서 하나 이상의 중요 품질 속성들을 정량화하는 단계; 및
    상기 단백질 정제 중간체에서의 상기 하나 이상의 중요 품질 속성들을 미리결정된 중요 품질 속성 수준과 일치하도록 조정하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 중요 품질 속성은 항체 역가, 단백질 농도, 고분자량 종들, 약물-항체 비율 및 완충액 부형제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 다운스트림 단백질 정제 공정은 한외여과/정용여과인, 방법.
  30. 다운스트림 정제 동안 수확된 세포 배양액 및/또는 단백질 정제 중간체 중의 부형제의 수준을 모니터링하고 제어하는 방법으로서,
    상기 세포 배양액 또는 단백질 정제 중간체를 정제하는 동안 인시츄 라만 분광법을 사용하여 실시간으로 상기 부형제의 농도를 결정하는 단계; 및
    상기 수확된 세포 배양액 및/또는 단백질 정제 중간체 중의 상기 부형제의 미리결정된 양을 얻거나 유지하기 위해 실시간으로 상기 정제 단계의 파라미터를 조정하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 부형제는 완충액 부형제를 포함하는, 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 부형제는 아세테이트, 시트레이트, 히스티딘, 숙시네이트, 포스페이트, 하이드록시 메틸아미노메탄(트리스), 프롤린, 아르기닌, 수크로스 또는 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제30항에 있어서, 상기 부형제는 계면 활성제 부형제를 포함하는, 방법.
  34. 제30항 또는 제33항에 있어서, 상기 계면 활성제 부형제는 폴리소르베이트 80, 폴리소르베이트 20 및 폴록사머 188로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제11항에 있어서, 상기 부형제는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는, 방법.
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