KR20210011394A

KR20210011394A - Crispr/cas9 시스템을 이용하여 플라보노이드 생합성 유전체를 편집하기 위한 조성물 및 이의 이용

Info

Publication number: KR20210011394A
Application number: KR1020207035219A
Authority: KR
Inventors: 이긍주; 도옥화; 사미나단
Original assignee: 주식회사 툴젠
Priority date: 2018-06-08
Filing date: 2019-06-10
Publication date: 2021-02-01
Also published as: KR20190139756A; US20210254086A1

Abstract

본 출원은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 플라보노이드 생합성 유전체 편집세포를 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

CRISPR/CAS9 시스템을 이용하여 플라보노이드 생합성 유전체를 편집하기 위한 조성물 및 이의 이용

본 출원은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 플라보노이드 생합성 유전체를 편집하기 위한 조성물 및 이의 이용에 관한 것이다.

유전자가위 기술은 1세대 ZFN(Zinc-finger nuclease)과 2세대 TALEN 을 거쳐, 2013년에는 세균이나 고세균에서 작동하는 CRISPR/Cas 시스템을 이용하여 동물뿐만 아니라, 식물의 세포에서 원하는 유전자만 타겟할 수 있는 3세대 유전자 가위 기술인 RNP(ribonucleoproteins complex)가 보고되었다. RNP은 기존의 ZFN, TALEN과 달리 절단하고자 하는 DNA에 따라 단백질을 매번 만들 필요가 없고, 하나의 단백질만 이용하여 가이드 RNA(guide RNA)만 바꿔줌으로써 원하는 유전자를 편집할 수 있다는 큰 장점이 있고, 기존 GMO 기술과 달리 DNA가 없는 non-GMO(DNAfree non-GMO) 품종육성 기술로 최근 미국 USDA에서는 CRISPR 등 유전자편집을 통한 식물육종을 허용하고, 기존 GMO와 달리 규제하지 않는다고 발표했고, 호주, 뉴질랜드 식품 표준청에서는 간단한 유전자 삭제가 일어난 신기술 작물은 GMO로 간주되지 않는다고 발표했다.

유전자가위(engineered nucleases, EN)를 이용한 타겟 게놈 편집(targeted genome editing, TGE)은 밀, 옥수수, 쌀, 콩 등 다양한 식량 작물의 특성을 수정하는 것으로 증명되었다. 보다 최근에는 CRISPR/Cas9 기술과 같은 유전자가위 중 하나가 토마토와 감자를 포함한 가지과(Solanaceae) 작물에도 성공적으로 적용되었다. CRISPR/Cas9를 이용한 원형질체 일시 발현 시스템은 다양한 식물의 게놈 편집을 위한 다목적 방법으로 채택되어 왔다.

본 발명자는 Petunia×hybrida에 대한 CRISPR/Cas9 RNP의 일과성 발현 시스템을 위한 효율적인 프로토콜을 개발하고 표준화했다. 본 출원에서는 관상식물에서 DNA-free 유전자 편집 플라보노이드 생합성 관여 유전자 변이체를 생산하기 위해 페튜니아 원형질체에서 CRISPR/Cas9 기반 F3H (Flavone 3-hydroxylase) 유전자의 돌연변이 유발을 수행하여 화색이 변경됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.

본 출원은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 출원자들은 페튜니아의 원형질체를 분리 및 추출한 후, F3H (Flavone 3-hydroxylase) 유전자의 염기서열을 표적으로 하는 가이드 RNA와 Cas9 단백질의 복합체(ribonucleoprotein, RNP)를 상기 추출한 원형질체에 형질도입 하였다. 그 후, 야생형과 형질도입 원형질체를 이용하여 F3H 위치를 HRM(high resolution melting) 및 targeted deep sequencing 분석한 결과, F3H 유전자의 표적 염기서열 위치에서 삽입결실(InDel) 돌연변이가 발생하였음을 관찰할 수 있었으며, 상기 돌연변이가 유도된 원형질체로 부터 분화한 식물체에서 화색의 변이가 발생하였음을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 출원은 식물체 내의 게놈 DNA상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 핵산 서열 내 표적서열에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및 상기 가이드 RNA와 복합체를 형성하여 상기 핵산 서열을 절단시키는 Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 을 포함하는 조성물로서,

상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 상기 Cas단백질이 인식하는 PAM 서열에 인접해 있는 표적서열과 동일하거나 상보적인 서열이고, 이 때, 상기 조성물은 식물체 내의 게놈 DNA상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 핵산 서열 내 인위적인 돌연변이를 도입시키며, 상기 조성물은 식물의 꽃, 종자, 과실, 잎 중 선택되는 1 이상의 색깔 특성을 변경시키는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.

또한, 상기 과제를 해결하기 위하여, 본 출원은 식물체 내의 게놈 DNA상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 핵산 서열 내 표적서열에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및 상기 가이드 RNA와 복합체를 형성하여 상기 핵산 서열을 절단시키는 Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 조성물을 식물세포에 도입함; 및 상기 식물세포를 재분화함;

을 포함하는 식물체 제조방법으로,

이 때, 상기 재분화된 식물세포는 게놈 DNA상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 핵산 서열 내 인위적인 돌연변이를 포함하고,

상기 안토시아닌계 플라보노이드 합성과 관련된 인자는 F3H, F3′H, F3′5′H 중 선택되는 1 이상인 유전자이며,

상기 식물체는 야생형과 비교하여 색깔 특성이 변경된 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체 제조방법을 제공한다.

본 출원의 유전자 편집 방법은 외부 유전자가 삽입되어 있지 않고 자연적 변이와 구별할 수 없는 작은 변이만 가지고 있어, 안전성과 환경 유해성 여부를 평가하기 위해 막대한 비용과 시간이 소모되는 GMO 작물과 달리 비용과 시간을 절약할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 출원의 방법은 향상된 일시발현시스템(transient expression system)으로, 고전적인 transgenic 방법을 사용하지 않고 작물의 화색은 물론 종자, 과일 및 식물체 여러 기관의 색을 효과적으로 변화시킬 수 있어 원예 분야에서 관상적 및 기능적 목적의 색 교정에 유용하게 사용 될 수 있을 것이다.

도 1은 페튜니아 원형질체 추출 및 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 유전체 편집 세포의 유도 과정을 나타낸다.
도 2는 CRISPR RGEN Tools을 사용하여 결정된 5개의 F3H (Flavanone 3-hydroxylase) 타겟 sgRNA 부위를 나타낸다. 네모박스 부분은 PAM 모티프의 3bp 염기를 나타낸다.
도 3은 리포터 유전자 GFP를 포함하는 벡터(PBI221:GFP)로 형질도입된 페튜니아 원형질체의 형광 사진이다. 삼각형 부분은 GFP가 발현되는 부분을 나타낸다.
도 4 내지 8은 야생형과 유전체 편집 원형질체로부터 분리된 게노믹 DNA의 HRM(high resolution melting) 분석 결과이다.
도 9는 sgRNA 1 내지 5를 이용하여 유전체 편집을 유도한 세포의 targeted deep sequencing을 통한 F3H 좌의 대표적인 염기 돌연변이 정보이다. 밑줄 및 굵은 글씨는 핵산분해효소의 표적 서열이고, 네모박스 부분은 PAM 모티프의 3bp 염기를 나타내며, 음영 부분은 삽입 돌연변이를 의미한다. 돌연변이 염기서열 옆 별표(*)는 sgRNA 별로 많은 빈도의 변이형태 유형을 표시하고 있다.
도 10은 RNP 매개 형질전환된 재분화된 T0 페튜니아에서의 돌연변이 확인을 위한 HRM(high resolution melting) 분석 결과이다.
도 11은 페튜니아에서 야생형의 F3H(WT F3H로 명명)와 돌연변이형 F3H (#2 F3H로 명명)의 아미노산 분석 결과이다.
도 12 내지 13은 야생형의 F3Ha 및 F3Hb(각각 F3H-A_wt 및 F3H-B_wt로 명명)를 RNP 매개 형질전환한 페튜니아의 시퀀싱 분석 및 indel 결과이다.
도 14 내지 19는 돌연변이형의 F3Ha 및 F3Hb(각각 F3H-A_1226P1C7, F3H-B_1226P1C7, F3H-A_1226P3C5, F3H-B_1226P3C5, F3H-A_1226P4C4, F3H-B_1226P4C4로 명명)를 RNP 매개 형질전환한 페튜니아의 시퀀싱 분석 및 indel 결과이다.
도 20은 야생형 F3H(WT으로 명명)와 돌연변이형 F3H(Allele #2로 명명)가 RNP 매개 형질전환된 페튜니아 식물체의 화색을 나타낸 도면이다.
도 21은 야생형 F3H(WT으로 명명)와 돌연변이형 F3H(Allele #2로 명명)가 RNP 매개 형질전환된 페튜니아 식물체의 0-DPA 및 1-DPA 화색의 시각적 평가를 위해 토양에 식재한 결과이다.
도 22는 야생형 F3H(WT으로 명명)와 돌연변이형 F3H(Allele #2로 명명)가 RNP 매개 형질전환된 페튜니아 식물체의 0-DPA 및 1-DPA 꽃잎의 안토시아닌 함량의 흡광도 측정 결과이다.
도 23은 P. hybrida Cv midnight의 3주된 어린잎(A), 아그로박테리움법 매개 CRISRP/Cas9 형질전환을 위해 약 0.5 × 0.5 cm의 작은 조각으로 절단(B), Explants된 상태(C)를 나타낸 도면이다.
도 24는 CRISPR RGEN Tools을 사용하여 결정된 F3Ha 및 F3Hb의 sgRNA 타겟 부위(sg2 target site로 명명)를 나타낸 도면이다.
도 25는 P. hybrida Cv midnight에서 F3Ha 및 F3Hb의 야생형(F3H_a WT, F3H_b WT) 및 돌연변이형(F3H_a Mutant, F3H_b Mutant)의 아미노산 분석 결과이다.
도 26 내지 31은 돌연변이형의 F3Ha 및 F3Hb(각각 F3H-A_0324L4-1, F3H-B_0324L4-1, F3H-A_0324L9-1, F3H-B_0324L9-1, F3H-A_0324L9-2, F3H-B_0324L9-2로 명명)를 아그로박테리움법 매개 형질전환한 페튜니아의 시퀀싱 분석 및 indel 결과이다.
도 32는 야생형 F3H(Plant 1로 명명)와 돌연변이형 F3H(Plant 2로 명명)가 아그로박테리움법 매개 형질전환된 페튜니아 식물체의 화색을 나타낸 도면이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

본 출원은 식물체 내에서 F3H 유전자의 발현을 조절하는 방법 및 이에 이용되는 조성물에 관한 것이다.

상기 F3H 유전자는 식물에서 다양한 안토시아닌 색소 형성에 영향을 끼친다. F3H 유전자는 Naringenin, Leucoanthocyanidins, anthocyanidins 등을 합성하기 위한 주요 유전자로, 나린제닌(naringenin)이 디히드로플라보놀(dihydroflavonols)로의 전환에 의해 안토시아닌 색소 생성에 관여한다.

상기 조성물은 식물의 종자, 과실, 꽃, 줄기, 잎 등의 다양한 부위에서 안토시아닌 색소 형성에 영향을 끼칠 수 있다.

예를 들어, 상기 조성물은 식물의 종자, 과실, 꽃, 줄기, 잎 중에서 선택되는 1 이상의 부위에서 안토시아닌 색소 형성에 영향을 끼칠 수 있다.

임의의 구체예로, 상기 조성물은 식물체 내에서 F3H 유전자의 발현을 조절하여 식물의 종자, 과실, 꽃, 줄기, 잎 중에서 선택되는 1 이상의 부위의 색깔을 변화시킬 수 있다.

본원에서 상기 F3H 유전자는 F3'H 유전자와 F3'5'H 유전자를 모두 포함하는 용어이다.

F3H 유전자를 가지는 식물은 가지과(Solanaceae), 장미과(Rosaceae), 국화과(Asteraceae)에 속하는 식물일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

가지과에 속하는 식물은 예를 들어, 가지, 맨드레이크, 감자, 담배, 토마토, 페튜니아 등일 수 있으나 이에 제한하지 않는다.

장미과에 속하는 식물은 장미, 백매, 황매화, 벚나무 등일 수 있으나 이에 제한하지 않는다.

국화과에 속하는 식물은 국화, 금불초, 개망초, 민들레 등일 수 있으나 이에 제한하지 않는다.

구체적인 예를 들어, 상기 식물은 페튜니아, 장미, 국화 등일 수 있으나 이에 제한하지 않는다.

본원 명세서는 일 양태로 식물체 내에서 F3H 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공한다.

상기 F3H 유전자의 발현을 조절하는 방법을 이용하여 식물의 색깔 특성을 변경시키는 방법을 제공한다.

일 예로서,

F3H (Flavone 3-hydroxylase) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 또는 이를 코딩하는 핵산서열, 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 조성물을 대상 식물세포에 도입하여 유전체를 인위적으로 편집하는 단계; 및

상기 유전체가 편집된 대상 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 화색 변이 형질을 가지는 식물체의 제조방법을 제공한다.

예를 들어, F3H (Flavone 3-hydroxylase) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)와 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질의 복합체 형태로 실시할 수 있다.

다른 예로, F3H (Flavone 3-hydroxylase) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA를 코딩하는 핵산서열 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 벡터의 형태로 실시할 수 있다.

구체적인 일 예로서,

페튜니아(Petunia×hybrida) 유래 F3H (Flavone 3-hydroxylase) 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA) 또는 이를 코딩하는 핵산서열, 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질 또는 이를 코딩하는 핵산서열을 포함하는 조성물을 페튜니아 식물세포에 도입하여 유전체를 인위적으로 편집하는 단계; 및

상기 유전체가 편집된 페튜니아 식물세포로부터 페튜니아 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 화색 변이 형질을 가지는 페튜니아 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어 "유전체 편집(genome editing)"은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입 또는 유도할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knockin)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 출원의 목적상 상기 유전체 편집은 특히 Cas9 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다. 유전자 편집(gene editing)이라는 용어와 혼용하여 사용될 수 있다.

또한, 용어 "표적 유전자" 또는 "표적 유전체"는 본 출원을 통해 편집하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미한다. 즉, 원칙적으로 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩(non-coding) 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 편집 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.

상기 표적 유전자는 안토시아닌계 플라보노이드 합성과 관련된 유전자일 수 있다.

상기 안토시아닌계 플라보노이드 합성과 관련된 유전자는 F3H(Flavone 3-hydroxylase), F3′H(Flavone 3-hydroxylase), F3′5′H(flavonoid 3′,5′-hydroxylase) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 상기 F3H, F3'H, F3'5'H 등은 꽃, 과실 등의 색소 형성과 관련이 있을 수 있다.

본 출원의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 표적 유전자는 페튜니아(Petunia×hybrida) 유래 F3H (Flavone 3-hydroxylase) 유전자일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 36의 염기서열로 이루어진 유전자일 수 있으나, 이에 제한 되지 않는다.

본 출원의 일 실시예에 있어서, 식물체의 게놈은 F3H 유전자를 가지고 있을 수 있다.

상기 F3H 유전자는 야생형 또는 돌연변이형 중 선택되는 1 이상일 수 있다.

예를 들어, 상기 돌연변이형은 SNP(Single nucleotide polymorphism)를 가지고 있을 수 있다.

구체예에 있어서, 본 출원에서 식물체의 게놈은 F3H 야생형 유전자를 가지고 있을 수 있다.

구체예에 있어서, 본 출원에서 식물체의 게놈은 F3H SNP를 가진 돌연변이형 유전자를 가지고 있을 수 있다.

예를 들어, 상기 F3H SNP를 가진 돌연변이형 유전자는 서열번호 52 내지 53 중 선택되는 1 이상일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "가이드 RNA(guide RNA)"는 표적 유전자의 염기서열을 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 염기서열과 전부 또는 일부가 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 염기서열로 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다. 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 DNA 내 염기서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 염기서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 출원의 범위에 포함될 수 있다. 본 출원에 따른 가이드 RNA는 바람직하게는, 단일 가닥 가이드 RNA 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 엔도뉴클레아제의 유래 미생물 등에 당업계의 공지된 기술에 따라서 적절히 선택할 수 있다.

또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것 또는 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 가이드 RNA(guide RNA)는 F3H 유전자의 표적 염기서열에 특이적으로 고안된 것으로, 상기 F3H 유전자의 표적 염기서열은 예를 들어, 서열번호 1 내지 5의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 일 실시예로서, 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 다른 예로, 서열번호 37 내지 41의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한 다른 예로, 서열번호 49 내지 50의 염기서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

표적 염기서열 1 내지 5의 염기서열에 대하여, 상기 가이드 RNA는 서열번호 42 내지 46 중 선택되는 1 이상일 수 있다.

표적 염기서열 37 내지 41의 염기서열에 대하여, 상기 가이드 RNA는 서열번호 47 내지 51 중 선택되는 1 이상일 수 있다

표적 염기서열 54 내지 55의 염기서열에 대하여, 상기 가이드 RNA는 서열번호 56 내지 57 중 선택되는 1 이상일 수 있다.

표적 염기서열 58 내지 59의 염기서열에 대하여, 상기 가이드 RNA는 서열번호 60 내지 61 중 선택되는 1 이상일 수 있다.

본 출원의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9(CRISPR associated protein 9), Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 또는 스트

렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 예컨대 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적DNA의 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 DNA의 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기쌍 사이를 추정하여 절단한다.

본 출원의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동한다.

본 방명의 제조방법으로 만들어진 식물은 F3H 유전자의 발현을 일시적으로 조절하는 것이 아닌, F3H 유전자의 지노믹 DNA의 발현을 조절한 것이기 때문에, F3H 유전자의 발현의 조절이 영구적인 점에서 이점이 있다.

본 출원에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 편집하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전체 편집 방법이다.

본 출원의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질(ribonucleoprotein) 복합체 형태로 직접 숙주세포 내로 형질도입될 수 있거나, 또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터의 형태로 제조되어 숙주세포 내로 형질도입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 출원에 따른 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 식물세포에 형질도입하는 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al.,1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al.,1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다.

상기 "식물세포"는 어떤 식물세포도 된다. 식물세포는 식물체의 어떤 부위 예를 들어 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 종자 등에서 유래된 식물세포를 포함할 수 있다. 또한, 식물세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또한, 식물세포는 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되지는 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. “식물체”는 상기 식물세포를 포함하고 있는 전체식물을 의미한다.

예를 들어, 본 출원의 식물세포는 원형질체일 수 있다.

또 다른 예를 들어, 본 출원의 식물세포는 잎 유래 식물세포일 수 있다.

본 출원의 제조방법에 있어서, 유전체가 편집된 식물세포로부터 유전체가 편집된 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 유전체가 편집된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 출원의 다른 양태는 식물의 색깔을 변경시키는 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 식물의 부위 예를 들어, 종자, 과일, 꽃, 잎, 줄기 등의 색깔을 변경시키는 용도에 사용될 수 있다.

상기 조성물은 안토시아닌계 플라보노이드 합성과 관련된 인자의 발현을 조절할 수 있는 발현 조절용 조성물일 수 있다.

상기 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자는 F3H(Flavone 3-hydroxylase), F3′H(flavonoid 3′-hydroxylase), F3′5′H(flavonoid 3′,5′-hydroxylase)등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

특히, 본 조성물은 F3H 유전자의 발현과 관련된 안토시아닌계 플라보노이드의 합성을 조절함으로써 식물의 화색을 변경시킨다.

상기 조성물은 식물체 내에 존재하는 게놈 DNA 상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 DNA 서열을 편집함으로써 해당 인자의 발현을 조절한다.

이러한 유전자 편집은 식물체 게놈 DNA 내에 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자를 코딩하는 서열 내 인위적 돌연변이를 도입하는 것을 의미한다. 상기 인위적 돌연변이는 야생 형태(wildtype) 유전자의 게놈 서열 중 일부 또는 전부 영역에, 하나 이상의 핵산을 삽입, 결실, 치환, 또는 역위 등을 시키는 돌연변이를 포함한다.

예를 들어, 본 출원에서 상기 조성물은 식물체 내에 존재하는 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 DNA 서열의 일부를 결실시킴으로써 해당 인자의 발현을 감소 또는 증가시킬 수 있다.

예를 들어, 본 출원에서 상기 조성물은 식물체 내에 존재하는 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자에 외래(exogenous) DNA 서열을 삽입함으로써 해당 인자의 발현을 감소 또는 증가시킬 수 있다.

예를 들어, 본 출원에서 상기 조성물은 식물체 내에 존재하는 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 DNA 서열에 인델(indel)을 형성함으로써 해당 인자의 발현을 감소 또는 증가시킬 수 있다.

예를 들어, 본 출원에서 상기 조성물은 식물체 내에 존재하는 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 DNA 서열의 일부를 치환시킴으로써 해당 인자의 발현을 감소 또는 증가시킬 수 있다.

예를 들어, 본 출원에서 상기 조성물은 식물체 내에 존재하는 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 DNA 서열의 일부를 역위시킴으로써 해당 인자의 발현을 감소 또는 증가시킬 수 있다.

상기 인위적 돌연변이는 인위적 뉴클레아제(engineered nuclease)를 이용하여 식물체 게놈 상에 도입될 수 있다.

예를 들어, 상기 인위적 뉴클레아제는 ZFN(Zinc-finger nucleases), TALEN(transcription activator-like effector nucleases), CRISPR/Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR-associated sequences)의 등을 포함할 수 있으나, 특정 DNA부위를 자르는데 사용하는 인공 효소를 이용하여 유전자의 표적 부위를 편집할 수 있는 기술이라면 이에 제한하지 않는다.

구체적인 예를 들어, 본 출원의 상기 발현 조절용 조성물은 CRISPR/Cas을 이용하는 조성물일 수 있다.

본원 명세서의 일 실시예에서, 상기 발현 조절용 조성물은,

안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 핵산 서열 내 표적서열에 상보적인 결합을 형성할수 있는 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산서열 중 선택되는 1 이상; 및

상기 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 핵산 서열 중 표적하는 부위를 절단 또는 변형시키는 Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열 중 선택되는 1 이상;

을 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 출원에서 상기 발현 조절용 조성물은,

F3H, F3′H, F3′5′H 중 선택되는 1 이상의 핵산 서열 내 표적서열에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산 서열 중 선택되는 1 이상; 및

상기 F3H, F3′H, F3′5′H 중 선택되는 1 이상의 핵산 서열 중 표적하는 부위를 절단 또는 변형시키는 Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열 중 선택되는 1 이상;

을 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 발현 조절용 조성물은,

F3H, F3′H, F3′5′H 중 선택되는 1 이상의 핵산 서열 내 표적서열에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 RNA 및 상기 가이드 RNA와 복합체를 형성하여 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 핵산 서열 중 표적하는 부위를 절단 또는 변형시키는 Cas단백질을 포함할 수 있다. 즉, RNP(ribonucleoprotein)형태의 조성물일 수 있다.

상기 가이드RNA는 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 표적서열에 상보적인 결합을 할 수 있다.

상기 표적서열은 표적 유전자 또는 핵산 내에 존재하는 염기서열로, 가이드RNA의 서열과 상보성을 가진다. 또한, 상기 표적 유전자 또는 핵산의 이중가닥을 가지기 때문에 표적서열은 이중가닥의 일부 또는 전체일 수 있다.

상기 표적 서열은 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 엑손, 인트론 또는 이의 조합의 핵산 서열일 수 있다.

예를 들어, 상기 가이드 RNA는 F3H의 엑손에 상보적인 결합을 할 수 있다.

예를 들어, 상기 가이드 RNA는 F3'H의 엑손에 상보적인 결합을 할 수 있다.

예를 들어, 상기 가이드 RNA는 F3'5'H의 엑손에 상보적인 결합을 할 수 있다.

상기 표적서열은 가이드핵산 설계 단계에서 PAM서열을 기준으로 다양하게 선택될 수 있다.

예를 들어, 유전자의 표적 영역에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 핵산은 표적 핵산 또는 유전자의 염기서열을 데이터베이스(예를 들어, NCBI 등)를 사용하여 유전자의 염기서열 데이터를 수집하여, 상기 염기서열 중 PAM 서열(예를 들어, 5'-NGG-3')이 있는 부위를 찾고, 그 PAM 서열로부터 ~20bp의 염기서열을 선정하여 설계할 수 있다.

상기 “PAM(proto-spacer-adjacent Motif)서열”은 Cas단백질이 인식할 수 있는 뉴클레오타이드 서열이다. Cas의 유래마다 PAM 서열은 다를 수 있다.

예를 들어, 상기 PAM 서열은 하기의 서열 중 1 이상일 수 있다(5'에서 3'방향으로 기재함).

NGG(N은 A, T, C 또는 G임);

NNNNRYAC(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A또는 G이고, Y는 C또는 T임);

NNAGAAW(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, W는 A 또는 T임);

NNNNGATT(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G임);

NNGRR(T)(N은 각각 독립적으로 A, T, C 또는 G이고, R은 A 또는 G임); 및

TTN(N은 A, T, C 또는 G임).

상기 가이드 RNA는 crRNA(CRISPR RNA) 또는/및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 각각을 포함하는 듀얼(dual) 가이드 RNA일 수 있고, 또는 상기 crRNA와 상기 tracrRNA의 특정 부위가 융합된 형태를 sgRNA(sinlge-chain guide RNA)일 수 있다.

본원 명세서에서, 상기 Cas단백질은 Cas9 또는 Cpf1일 수 있다.

상기 Cas9은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 노카르디옵시스 다손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바클루스 아시도칼다리우스(AlicyclobacHlus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 미크로스 킬라 마리나(Microscilla marina), 부르크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니이(Crocosphaera watsonii), 시아노테세 속(Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라바티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽토 베시이(Caldicelulosiruptor bescii), 칸디다투스 데술포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 아시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 아시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로 모나스 할로플란크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박테르 라세미페르(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 맥시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아속(Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 써모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus) 또는 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina) 등 다양한 미생물 유래의 Cas9일 수 있다. 일 실시예에서 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질을 이용할 수 있다.

또한, 상기 Cpf1은 Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium 또는 Acidaminococcus 유래의 Cpf1일 수 있다.

본 출원의 일 실시예에서 상기 Cas9은 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래 의 spCas9일 수 있다.

상기 spCas9을 이용할 때,

일 구체예로, 상기 표적서열은 서열번호 1 내지 5 중 선택되는 1 이상일 수 있다. 이 때, 가이드 RNA는 서열번호 42 내지 46 중 선택되는 1 이상일 수 있다.

다른 구체예로, 상기 표적서열은 서열번호 37 내지 41 중 선택되는 1 이상일 수 있다. 이 때, 가이드 RNA는 서열번호 47 내지 51 중 선택되는 1 이상일 수 있다

또 다른 구체예로, 상기 표적서열은 서열번호 54 내지 55 중 선택되는 1 이상일 수 있다. 이 때, 가이드 RNA는 서열번호 56 내지 57 중 선택되는 1 이상일 수 있다.

또 다른 구체예로, 상기 표적서열은 서열번호 58 내지 59 중 선택되는 1 이상일 수 있다. 이 때, 가이드 RNA는 서열번호 60 내지 61 중 선택되는 1 이상일 수 있다.

본원 명세서에서, 상기 발현 조절용 조성물은 벡터의 형태로 제공될 수 있다.

상기 벡터는 비바이러스 벡터 및 바이러스 벡터를 포함한다.

상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 바이너리 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 백시니아바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 단순포진바이러스 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다. 상기 비바이러스 벡터는 플라스미드(Plasmid), 네이키드 DNA(naked DNA), 리포좀(Liposome) 등일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.

또한, 상기 발현 조절용 조성물은 통상적으로 유전자를 운반할 수 있는 다양한 방법으로 식물세포에 제공될 수 있다.

예를 들어, 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법, PEG(Polyethylene glycol), 아그로박테리움법(Agrobacterium), 일시적인 세포의 압축 또는 스퀴징, 지질-매개 형질감염, 나노입자, 실리카 등의 방법을 포함할 수 있다.

상기 발현 조절용 조성물은 식물체 내의 지노믹 DNA 상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자를 편집하여 이러한 인자들의 발현을 조절하는데 사용될 수 있다.

상기 편집은 넉아웃(Knock-out), 넉인(Knock-in), 넉다운(Knock-down) 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 예를 들어, 플라보노이드 합성과 관련된 인자의 발현을 억제(또는 감소 또는 비활성화), 또는 촉진(또는 증진 또는 활성화)시킴으로써 식물의 색깔, 예를 들어 화색을 변경시킬 수 있다.

이러한 본 출원의 조성물 및 이를 이용하는 방법은 하기와 같은 장점을 가진다.

종래 RNAi를 이용하여 화색을 변경하는 기술과 비교하면, 상기 RNAi는 전사 후(post transcription) 유전자 발현을 조절하는 수단으로 이용되는 것이고, 실질적으로 유전체의 서열을 변경시키지 않는다. 그러므로, 환경 등의 영향으로 식물체 내 상기 인자들의 전사량이 달라지는 경우 색깔 표현의 일관성이 유지되기 어려운 단점이 있고, 지속적인 표적이탈효과 (off-target effect) 발생으로 의도치 않은 표현형이 생길 가능성이 높다. 특히, 꽃의 색깔 변경과 관련하여, 외래 유전자 삽입이 필수적이므로 GMO로 분류되어 상용화에 제한이 있다.

반면, 본 출원의 조성물을 사용하는 경우는, 식물체의 지노믹 DNA 상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자, 예를 들어 F3H(Flavone 3-hydroxylase), F3′3-hydroxylase), F3′5′H(flavonoid 3′′를 코딩하는 서열에 인위적 돌연변이를 직접적으로 형성시키기 때문에, 영구적으로 이러한 인자들의 발현을 조절할 수 있다. 그러므로 식물체의 색깔 특성이 변경된 표현형이 일관적으로 나타나게 된다.

본 출원의 일 실시예에서는 페튜니아의 화색을 변경시키기 위한 조성물 및 페튜니아 화색을 변경시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 출원의 제조방법에 의해 제조된 화색 변이 형질을 가지는 유전체 편집 페튜니아 식물체 및 상기 식물체의 유전체가 편집된 종자를 제공한다.

본 출원에 따른 화색 변이 형질을 가지는 유전체 편집 페튜니아 식물체는 안토시아닌 색소에 영향을 미치는 플라보노이드 생합성 경로의 F3H 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 편집한 것으로, 페튜니아 유래 F3H 유전자가 녹-아웃된 유전체 편집 식물체이다.

본 출원의 일 구현 예에 따른 유전체 편집 페튜니아 식물체는 야생형 페튜니아에 비해 꽃잎의 안토시아닌 함량이 현저히 감소되어, 야생형 페튜니아의 꽃잎이 짙은 보라색인 반면 유전체 편집 페튜니아의 꽃잎은 옅은 분홍색인 것이 특징이다.

본 출원은 또한, 페튜니아 유래 F3H 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 유효성분으로 함유하는, 페튜니아 식물체의 화색을 변이시키기 위한 유전체 편집용 조성물을 제공한다. 본 출원의 유전체 편집용 조성물은 F3H 유전자의 표적 염기서열에 특이적인 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체를 포함하고 있어, 상기 조성물을 페튜니아 식물체에 처리할 경우, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질의 복합체가 RNA 유전자 가위로 작동하여 표적 유전자를 편집할 수 있다.

발명의 실시를 위한 형태

재료 및 방법

I. RNP 매개 형질전환

1. 페튜니아 원형질체 준비 및 추출

기내에서 종자를 발아시켜 얻은 페튜니아 '미드나이트'('midnight': PanAmerican Seed, USA)의 배양묘를 3주간 생육시킨 후 어린 잎을 취하여 13% 만니톨 CPW(cell protoplast washing)에 전처리 후 효소 분해를 위해 각각 VCP 효소(Viscozyme + Pectinex + Celluclast)와 MC 효소(Macrozyme +

Cellulase)에 침지처리하였다. 원형질체 수집을 위하여 암상태 25℃에서 40rpm으로 3시간동안 진탕배양 후 600rpm에서 5분동안 원심분리를 수행하였으며, 25% 수크로스가 포함된 CPW (w/v) 용액에 재부유 및 원심분리를 통하여 정제를 추가 진행하였다. 실험은 원형질체에 효소처리와 수율을 최적화하기 위하여 생물학적 및 기술적으로 3 반복 수행하였다.

2. GFP 형광 유전자를 이용한 형질전환 효율의 결정

본 출원에서는 페튜니아의 원형질체에 형질도입율을 높이기 위하여 다른 PEG(polyethylene glycol) 농도와 배양기간을 처리하였고 GFP(green fluorescent protein) 발현을 통하여 이를 확인하여 최적화하고자 하였다. 정제된 원형질체를 CPW 9%(w/v) 만니톨 용액에 재현탁시킨 후 4℃에서 1시간 동안 안정화 시켰다. 이후 600rpm에서 5분간 원심분리를 통하여 원형질체를 수집하였으며, 300㎕ MaMg 용액(0.5mM MES, 0.4M 만니톨, 15mM MgCl2)을 사용하여 세포 밀도를 10⁶cells/㎖로 조정하였다. 250㎕의 원형질 세포 (2.5×10⁵ cells/㎖)를 GFP 코딩 유전자(PBI221::GFP)를 포함하는 플라스미드 벡터 PBI221 50㎍과 혼합하였다. 그리고 미리 준비된 PEG 용액[40% (w/v) PEG4000 (시그마 알드리치), 0.4M 만니톨, 0.1MCa(NO3)2] 270㎕를 첨가하여 잘 섞어준 후 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 이후 PEG 용액을 씻어내기 위하여 세척 용액(CPW 9%(w/v) 만니톨) 250㎕를 첨가하여 잘 혼합한 후 10 분간 실온에서 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 500㎕, 1㎖, 2㎖ 및 3㎖의 세척 용액을 차례로 첨가한 후 10분 간격으로 인큐베이션 하여 추가세척을 하였고, 최종적으로 600rpm에서 5분간 원심분리하여 얻어진 원형질체 펠렛은 1㎖의 콜로니 유도 배지로 옮겨 25℃에서 암배양시켰다. 형질전환율은 24시간 후 녹색형광현미경을 통하여 GFP로 형질전환된 세포의 수에 기초하여 계산되었다 (도 1 및 도 3).

3. Cas9 단백질 재조합과 가이드 RNA 설계 및 RNP 형질 도입

실험에 사용된 재조합 Cas9 단백질(160kD)은 툴젠(Korea)으로부터 구매하여 사용하였고, 페튜니아 '미드나이트'의 F3H 유전자좌는 유전자 정보(GenBank accession no. AF022142.1)를 기반으로 하여 증폭 및 시퀀싱되었다. 그 후 CRISPR RGEN Tools (http://rgenome.net/)를 사용하여 F3H 유전자의 첫 번째 및 두 번째 엑손을 표적으로, high out-of-frame scores로 5개의 다른 F3H sgRNA의 타겟 부위를 결정했다(도 2, 표 1).

Target	sgRNA	Sequence (5' -3') (서열번호)	Strnad Direction	Position (bp)
F3H1	F3H1-RGEN	TTGGGATCTCATTGCTGAATTGG(1)	-	158-180
F3H2	F3H2-RGEN	GTTAAGGCATGTGAAGATTGGGG(2)	+	428-450
F3H3	F3H3-RGEN	CTGCGGTTTGACATGTCTGGTGG(3)	+	586-608
F3H4	F3H4-RGEN	GGCCAGACAAACCAGAAGGATGG(4)	+	765-787
F3H5	F3H5-RGEN	TTCAGTCCAAGGGT AAGGTCAGG(5)	-	1431-1453

세포내 sgRNA 표적부위의 증폭은 표 2에 개시된 프라이머로 수행되었다. 페튜니아 원형질체를 이용한 유전자가위 복합체는 Cas9:sgRNA=1.5:3의 분자비로 만들었다. 준비된 복합체를 원형질체 세포로 도입하기 위해서 Cas9 단백질 완충액 2㎕, Cas9 단백질 27㎍, sgRNA 80㎍ 및 탈이온수(deionized water)로 구성된 반응액 20㎕를 준비하였다. 이 반응액을 300㎕ MaMg 용액(0.5mM MES, 0.4M 만니톨, 15mM MgCl2)에 현탁해 놓은 원형질체와 균일하게 혼합한 뒤에 준비해 둔 PEG용액과 상온에서 20분 동안 반응시켰다. 이후의 세척 과정은 PEG를 기반으로 한 GFP 플라스미드 형질전환과 동일하다.

4. F3H 유전자좌에서 돌연변이 빈도의 검출과 예측

게놈 DNA는 i-게놈 식물 DNA 추출 미니 키트(Intronbio, Seoul, Korea)를 사용하여 형질전환된 원형질체에서 추출하였다. F3H 유전자좌에서 RNP에 의해 유도된 부위 특이적 돌연변이(site-directed mutations)를 검출하기 위해, 고해상도 용해 곡선(high resolution melt curve) 분석을 수행하였다. 이를 위해 제조사의 프로토콜에 따라 Phusion®High-Fidelity PCR Kit (NEB, USA)와 nested PCR 프라이머(표 3)를 사용하여 야생형(WT)과 sgRNA 형질전환체로부터 F3H 좌위의 타겟 게놈 영역을 증폭시켰다. HRM 분석은 2.5mM MgCl2 및 Eva Green dye (PhileKorea, Daejeon, Korea)가 첨가된 2 x HRM Master mix, 미리 증폭된 주형 100 ng, 그리고 각각의 정방향 및 역방향 프라이머 0.2μM 포함한 총 반응 부피 10㎕를 사용하여 Illumina Eco Real-Time PCR System (Illumina, CA, USA)에서 수행되었다. PCR 증폭은 초기 변성 단계(95℃2분)에 이어 95℃에서 10초간 40 사이클, 60℃에서 30초간 어닐링 및 신장 단계를 조합하여 수행하였다. Eco Real-Time 장비의 프리세트파라미터를 사용하여 PCR 산물의 올리고뉴클레오티드 어닐링의 특이성과 해리상수(dissociation kinetics)를 확인하기 위해 95℃에서 15초, 55℃에서 15초 및 95℃에서 15초로 최종 사이클의 온도를 구배(55-95℃조건에서 해리시켰다. 사용된 모든 시료의 실험은 3 반복으로 수행되었으며, WT와 sgRNA 샘플 간의 용해 곡선 프로파일을 비교하여 유전형을 지정했다. 형질전환된 원형질체에서 RGENs에 의해 생성된 InDel(Insertion/Deletion)의 돌연변이 빈도를 확인하고 평가하기 위해 F3H 유전자 타겟부위를 nested PCR 프라이머(표 2)로 증폭시키고 Illumina MiSeq 플랫폼에 따라 염기서열을 결정하였다. 그 결과 RGEN 절단 부위 주변의 InDel 돌연변이가 관찰되었고 돌연변이 빈도는 각각의 F3H-RGEN 형질 도입체로 계산되었다.

실시예 1. 페튜니아에서의 향상된 일시발현 시스템

페튜니아의 원형질체 분리 및 일시적 발현 시스템은 이전의 연구에 의해 충분히 조사되지 않았고, 이용 가능한 방법 중 일부는 30년 동안 개선되지 않았다. 수율, 생존력 및 효율적인 형질 도입은 먼저 원형질체의 성공적인 분리가 선행되어야 한다. 원형질체의 분리는 외식편의 종류와 효소의 농도, 배양 시간 및 완충액 조성 등 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 본 출원에서는 페튜니아의 원형질체 분리 방법과 일시적 발현 시스템을 추가 및 개선했다. 이전 페튜니아 원형질체 기반 실험(Subburaj et al. 2016 Plant Cell Rep. 35:1535)과 거의 유사한 세포효소 1.5%와 마세로자임(Macerozyme) 0.25%를 사용한 효소 조합(MC)에서 1.52±0.23×10⁶ cell/g의 신선한 무게의 최대 원형질 수율이 관찰되었다. 그러나 셀루클래스트(Celluclast, 0.6%), 펙티넥스(Pectinex, 0.6%) 및 비스코자임(Viscozyme, 1.2%)을 포함하는 수정된 효소 조합(VCP)을 사용했을 때, 3 시간 배양으로 최고 6.90±0.18×10⁶ cells의 높은 원형질체 분리 수율을 확인했다. 또한 VCP로 얻은 원형질체는 형광 염료인 FDA(fluorescein diacetate) 검사에서 원형질체의 생존율이 94%에 이르러, MC 효소 조합보다 높은 것으로 확인되었다(표 3). 이를 통해, 본 출원의 결과는 페튜니아의 일시적 유전자 발현 연구에서 손상되지 않고 살아있는 원형질체의 분리와 수율을 크게 향상시킬 것이라 사료된다.

형질 도입의 확인을 위하여 추출된 페튜니아의 원형질체(2.5×10⁵ cells)에 40% PEG4000를 사용하여 리포터 유전자 GFP를 포함하는 벡터 (PBI221) 50㎍으로 형질 도입시켰다. 도 3과 같이 24시간 후 GFP 발현을 확인하였고, 이전의 연구에서 50%의 발현을 보인 반면 본 출원에서는 더 높은 55%의 발현을 확인했다. 본 출원에서는 이전의 연구와 비교하여 PEG4000을 사용하였으며 배양 시간을 20분으로 단축하여 높은 재현성과 함께 페튜니아 원형질체의 생존력과 활력을 높였을 것이라 사료된다. 이 연구결과로 향상된 일시발현시스템(Transient expression system)은 추후 페튜니아와 다른 가지과 식물에서의 연구 및 타겟 유전자 돌연변이 연구에 도움이 될 것이라 사료된다.

실시예 2. 페튜니아 원형질체 연구에서 F3H 유전자의 타겟 돌연변이 유발을 위한 RGEN RNP의 Direct delivery

페튜니아 F3H에서 타겟 부위 돌연변이를 일으키기 위해, F3H 유전자 좌위의 상응하는 타겟 부위에 sgRNA(F3H1, F3H2, F3H3, F3H4 및 F3H5)를 설계하였다(도 2). 설계된 sgRNA는 23개의 뉴클레오티드(3bp의 PAM 포함)를 가지고 있고, CRSPR/Cas9가 부위 특이적 DSB(double strand break)를 만드는 것을 돕기 위해 F3H 유전자좌의 타겟 부위에서 상응하는 20 개의 뉴클레오타이드와 쌍을 이룬다.

다른 게놈 편집 도구(ZFN 또는 TALENS)와 비교하여 CRISPR/Cas9 시스템은 타겟 특정 돌연변이를 일으키는데 준비, 전달 및 생성 측면에서 보다 효과적이라고 여겨 왔다. RNP 복합체(Cas9-sgRNA)와 같은 DNA-free 단백질을 살아있는 세포에 직접 전달하는 것은 GMO 규칙에 의해 제한되지 않고 오프 타겟(off-target)효과를 줄인다. 따라서 본 출원에서는 이전 연구(Subburaj 등, 2016 Plant Cell Rep. 35:1535)에서 설명한 것과 같이 내생 F3H 유전자를 돌연변이시키기 위해 페튜니아 원형질체에서 RNP 복합체(정제된 Cas9 단백질 + in vitro에서 합성된 sgRNA)의 직접 도입을 시도했다(도 1).

원형질체에서 CRISPR/Cas9 유도 돌연변이 중 F3H에 Indel 변이가 있는지를 찾기 위해 고해상도 용해(high resolution melting, HRM) 곡선 분석을 사용했다. 이를 위해 RNP가 도입되지 않은 대조구와 RNP로 형질전환된 원형질체에서 DNA 샘플의 HRM 커브를 비교했다. 원형질체에서 F3H 유전자좌의 RGEN 타겟 부위는 부위 특이적 중첩 PCR 프라이머(site specific nested PCR primers)를 사용하여 증폭되었다. 도 4 내지 8에서 볼 수 있듯이 HRM 분석은 미분 곡선의 모양에 따라 F3H의 5개 표적 부위 모두에서 WT 및 sgRNA에 의한 돌연변이체(삼각형으로 표시) 사이의 구분을 명확히 할 수 있어, 원형질 세포에서 CRISPR/Cas9 유도 돌연변이를 간단하고 효율적인 방식으로 확인할 수 있었다(도 4 내지 8).

실시예 3. Targeted Deep Sequencing에 의한 페튜니아 F3H 유전자에서의 RGEN RNPs 유도성 형질전환 세포 및 변이형태 확인

RNP가 도입된 원형질체에서 타겟 유전자 F3H의 형질전환 세포와 변이형태를 확인하기 위하여 targeted deep sequencing을 실시하였다. F3H1~F3H5 5개의 sgRNA를 이용한 RNP 조합으로 형질전환된 원형질체 세포들로부터 DNA를 추출한 후 표 2에 개시된 프라이머를 이용하여 우선 증폭하였다. 대조구(WT)과 Cas9 단백질만으로 형질전환된 원형질체 세포에서는 변이가 일어나지 않은 반면에, F3H 유전자를 타겟으로 제작된 5개의 RNP 결합부위에서는 삽입 및 결실 등의 변이형태가 일어나고 있음을 확인할 수 있었다. 제작된 guide RNA 결합부위에 따라 변이율은 0.8~49.3%로 발생하였고, F3H 유전자좌의 평균 변이율은 약 20.8%가 유도되었다(표 4).

표 4 내에 a는 변이율 중 삽입된 염기서열의 개수를 의미하며, b는 삭제된 염기서열의 개수를 의미하고, c는 F3H1 내지 F3H5에 대해서만 계산된 평균 및 표준편차 오류값을 의미한다.

이는 본 출원자가 동일한 페튜니아 품종과 원형질체를 이용한 기존NR(nitrate reductase) 유전자를 타겟으로 CRISPR/Cas9를 적용하여 편집을 시도한 예와 비교해 볼 때(Subburaj et al., 2016), 평균 변이유도율(NR 14.9% vs. F3H 20.8%) 및 최대 변이율(NR 34.7% vs. F3H 49.3%) 면에서 높은 변이효율을 가져온 기술적 발전이라고 할 수 있다.

F3H 유전자좌에서 발생한 변이형태는 제작된 5개의 RNP를 평균해서 조사해 본 결과 결실과 삽입 변이체의 비율이 45.4:54.6으로 타겟부위에 새로운 염기가 첨가되는 형태의 변이가 약간 높게 나타남을 알 수 있었다. 제작된 RNP에 따라 차이가 있기는 하지만 염기 결실크기는 1~7 bp였고, 염기삽입의 크기는 2 bp까지 유도된 세포가 발생하는 것을 알 수 있었다(도 9).

실시예 4. 재분화된 T0 페튜니아 식물체에서 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이 및 유전형 분석

RNP로 형질도입한 원형질체의 세포 군집을 캘러스 유도 배지에서 배양한 후 약 2주차에 녹색의 캘러스가 나타나기 시작하였다. 캘러스의 islet를 절개하여 서브배양하여 신초형성을 유도하였다. 동일한 캘러스 islet으로부터 생장한 묘목을 독립적인 T0 식물체로 간주하였다. F3H1~F3H5 5개의 sgRNA를 이용한 F3HRGEN으로부터 각각 39, 48, 62, 57 및 35개의 T0 식물체를 획득하였다. CRISPR/Cas9에 의해 유도된 돌연변이를 확인하기 위해서, 각 식물체로부터 DNA 시료를 준비하고 표적 자리에서 HRM 분석을 수행하였다(도 10). 그 결과는 도 6에 도시하였고, 삼각형으로 표시된 곡선은 돌연변이형을 지칭한다. F3H2의 표적 위치에서 48개의 식물체 중 8개의 식물체 DNA 시료에서 구별되는 HRM 곡선을 보여주어 돌연변이가 유발되었음을 알 수 있었으나, F3H1, F3H3~F3H5의 표적 위치에서는 야생형과 구별되는 특별한 HRM 곡선이 확인되지 않았다. 상기 돌연변이를 정확하게 검증하기 위해서, 상기 별개의 HRM 곡선을 보여준 8개 식물체의 F3H2 표적 위치를 증폭하여 direct Sanger 시퀀싱으로 분석하였다. DNA 크로마토그램 결과, 8개의 식물체 중 1개의 식물체에서 야생형의 F3H(allele #1)의 CDS(coding sequences)에서 200번째 위치에 T 염기가 삽입된 돌연변이 F3H 대립유전자(allele #2)가 확인되었다. 돌연변이 F3H allele #2는 프레임시프트(frameshift)를 야기하여, 78번째 위치의 아미노산에서 인프레임 비성숙 종결코돈을 유발하였고, mRNA의 번역 동안에 절단체 단백질이 많이 생성되어, morphine synthesis N-말단의 non-haemdioxygenase (DIOX_N)의 활성 파괴에 따라 궁극적으로 F3H의 기능을 전적으로 혹은 일부 상실시키는 것으로 예측되었다(도 11).

또한, 페튜니아에 SNP를 가진 유전자 염기서열인 F3Ha 및 F3Hb를 RNP 매개 형질전환하여 시퀀싱 분석 결과 및 indel 결과는 도 14 내지 19에 도시화하였다(각 taget gene 명칭은 1226 P1C7, 1226 P3C5, 1226 P4C4로 명명). SNP를 가진 F3Ha 또는 F3Hb에서도 T 염기가 삽입된 돌연변이가 확인됨을 알 수 있었고, 도 12 내지 13의 야생형 F3Ha 및 F3Hb에 비해, 도 14 내지 19의 돌연변이형 F3Ha 및 F3Hb에서 indel이 95% 이상임을 확인하였다.

화색 표현형의 시각적 평가를 위해, 재분화된 식물체를 토양에 식재 하였다. 개화는 약 4주후에 시작되었으며, 야생형의 페튜니아가 violet-blue의 화색을 가진 것에 반해, 돌연변이 F3H allele #2를 가진 식물체는 명확하게 변형된 화색을 보여주었다(도 20, 21). 상기 결과는 CRISPR/Cas9에 의해 F3H의 단일 유전자 카피가 돌연변이될 수 있음을 시사하였다. 본 출원자는 야생형과 돌연변이 F3H allele #2를 가진 식물체의 0 및 1 DPA 꽃잎에서 상대적인 안토시아닌 함량을 측정하였다(도 22). 도 18에서 볼 수 있듯이, 돌연변이 F3H allele #2를 가진 식물체의 꽃잎 추출물의 흡광도 값이 야생형 식물체의 꽃잎 추출물의 흡광도에 비해 현저히 낮은 값을 보여주었고, F3H의 녹아웃이 안토시아닌의 생성을 억제하여 꽃잎 색의 변화를 초래하였음을 알 수 있었다. T0 식물체에서 F3H2의 표적 자리에 유전형 및 돌연변이율을 확인하기 위해, deep target sequencing을 수행하였다. 테스트한 8개의 식물체 중에서 F3H 좌의 F3H2 표적 자리에 1bp의 염기가 삽입된 putative 동형접합인 단일 돌연변이 (2.1%)가 발견되었고, 나머지 식물체에서는 야생형과 비교하여 특별한 InDel 돌연변이율이 확인되지 않았다.

II. 아그로박테리움법 매개 형질전환

P. axillaris와 P. integrifolia의 잡종에서 유래 한 Petunia (Petunia x hybrida)는 F3H의 싱글 카피(single copy)를 가지고 있다 (AF022142, Houwelingen et al. 1997).

최근에 본 출원자들은 P. hybrida Cv "midnight"에서 SNP와 코딩 서열의 결실에 의한 F3H 상동성 유전자의 여분의 복사본을 발견했다(NCBI: AF022142).

본 실시예에서는 이들 유전자를 F3Ha 및 F3Hb로 명명하여 본 실험에 사용하였다.

1. 페튜니아 준비

3주 된 P. hybrida cv. 'midnight' (PanAmerican Seed, IL)의 어린잎을 사용(도 23의 A) 배양하여 실험을 진행하였다.

2. sgRNA 설계 및 벡터 구축

gRNA는 CRISPR RGEN Tools 웹 사이트 (http://rgenome.net/)를 통해 F3Ha 및 F3Hb 유전자의 첫 번째(도 24) 엑손이 보존되는 단일 표적 특정 부위를 설계하였다(Bae et al. 2014). 그리고 high-throughput binary vector인 pBAtC (Kim et al., 2016)는 Toolgen Inc.으로부터 수득하였다. pBAtc::PhF3H-sgRNA를 제작하기 위해 합성된 sgRNA 올리고를 어닐링하고 pBAtC 벡터의 AarI 사이트에 삽입하였다.

3. 형질전환 및 배양

아그로박테리움 매개 형질전환을 위한 프로토콜은 Kim et al. 2016의 방법을 참고하여 수행하였다. 간단하게 설명하자면, 페튜니아를 약 0.5 × 0.5 cm의 작은 조각으로 절단(도 23의 B)하여 아그로박테리움과 공배양(co-culture) 방법으로 형질전환하여 사용하였다.

절단한 절편(Explant)은 형질전환 때까지 basta와 선택적으로 배양하여 explant로부터 수득하였다.아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)은 고체 YEP 배지[스펙티노마이신 75 ㎎/L, 리팜피신 25 ㎎/L, 펩톤 10 g/L, NaCl 5g/L, 효모 추출물 5 g/L, 1.5%(w/v) 아가 (pH 7.0)]에 긁은 후 28℃에서 배양하여 생성된 단일 콜로니를 같은 항생제가 들어있는 액체 YEP 배지 10 mL에 넣고 OD650이 0.6 ~ 0.8이 될 때까지 28℃에서 220 rpm으로 교반하였다.

다 자란 배양균에 30% 글리세롤 스톡 10 mL을 넣고 섞은 뒤, 1.5 mL 튜브에 1 mL씩 분주하여 액체 질소로 급속 냉각하여 -70℃에서 보관하였다. 접종 하루 전에 항생제가 들어있는 액체 YEP 배지 200 mL에 -70℃에서 보관해 놓은 아그로박테리움 튜머파시엔스 스톡을 1 mL 넣고 OD650이 0.6~0.8이 될 때까지 25℃에서 250 rpm으로 배양기에서 흔들어 주었다. 접종 당일에 액체 YEP 배지 200 mL를 50 mL씩 나눠서 20℃3,270 g에서 10분 동안 원심분리하였다. 각각의 튜브에 있는 아그로박테리움 튜머파시엔스 펠렛을 액체 CCM (co-cultivation medium; B5 염 0.32 g/L, BA 1.67 ㎎/L, MES 20 mM, GA3 0.25 ㎎/L, 아세토시린콘 0.2 mM, L-Cysteine 3.3 mM, 소듐 티오설페이트 1.0mM, DTT 1.0 mM, 수크로스 3%, pH 5.4) 15 mL을 넣어 준비하였다. 대략 50개 정도의 절편체를 15 mL 공배양/아그로박테리움 튜머파시엔스에 넣고 초음파 분해 처리(sonication)를 20초 처리를 한 뒤 30분 동안 접종시켰다. 각각의 절편체를 튜브에서 꺼내 멸균한 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤, 고체 CCM (액체 CCM과 동일, 아가(0.7%)에도 여과지를 한 장 깔고 10개체를 올려두었다.

그 후, 형질 전환된 재생 식물을 16 시간 (25 ± 1 ℃/ 8 시간 (20 ± 1 ℃의 광주기를 가진 성장 실에 이식하고 표현형 분석을 수행 하였다(도 23의 C).

4. 유전자형 및 돌연변이 검출 확인

형질전환 된 식물체의 지노믹 DNA는 i-genomic plant DNA extraction kit (Intronbio, Seoul, Korea)로 추출하였다. 인델(indel) 돌연변이가 있는 F3H 표적부위는 프라이머(서열번호 53 내지 59)를 이용하여 PCR 증폭 및 Illumina MiSeq platform을 이용한 표적 deep 시퀀싱에 의해서 검출하였다.

T0 독립 재생 식물에서 F3Ha 및 F3Hb 좌위의 FT2 표적 부위의 표적 심층 DNA 시퀀싱을 하였다.그 결과는 [표 4]에 기재하였다. 이 때, 야생형(plant 1로 명명)과 돌연변이형(plant 2로 명명)으로 표시하였다. 두 대립 유전자 모두 99 % 이상 인델이 형성되었음을 확인하였다 (표 5).

또한, 형질 전환된 돌연변이는 양쪽 대립 형질이 F3a 및 F3Hb 유전자좌 모두 동형 접합체로 돌연 변이된 양성 돌연변이 인 것으로 확인하였다.

추가로, 상기 핵산의 돌연변이에 의해 아미노산 레벨에서의 변경이 일어났는지를 확인하기 위해서, WT(F3H_a WT, F3H_b WT로 각각 명명) 및 F3Ha 및 F3Hb인 돌연변이(F3H_a Mutant, F3H_b Mutant로 각각 명명)에서 유래된 sgRNA2의 표적 부위의 아미노산 서열을 정렬한 결과를 도 25에 도시하였다.

이러한 결과로부터, morphine synthesis N-말단의 non-haem dioxygenase (DIOX_N) 도메인 영역에서, WT과 비교하여 돌연변이 타입에서 많은 아미노산의 변경이 이루어졌음을 알 수 있었다. 따라서, 상기 영역의 변경에 의해 효소 활성의 감소에 따라, 궁극적으로 F3H의 기능을 전적으로 혹은 일부 상실시키는 것으로 예측할 수 있었다.

Plant	plant 1
(T0)	Total count	Insertion	Deletion	InDel	Indelratio	Mutation Pattern	Genotype
allele_a	7612	0	6	6	0.08%	-	Homozygous
allele_b	5008	4	3	7	0.14%	-	Homozygous
Flower color	Purple violet (WT)

Plant	plant 2
(T0)	Total count	Insertion	Deletion	InDel	Indel ratio	MutationPattern	Genotype
allele_a	8770	8574	151	8725	99.49%	1 bp ins	Homozygous
allele_b	8003	14	7984	7998	99.94%	2 bp del	Homozygous
Flower color	Purple spotted White (Mutant)

또한, 페튜니아에 SNP를 가진 유전자 염기서열인 F3Ha 및 F3Hb를 아그로박테리움 매개 형질전환하여 시퀀싱 분석 결과 및 indel 결과는 도 26 내지 31에 도시화 하였다(각 taget gene 명칭은 0324 L4-1, 0324 L9-1, 0324 L9-2로 명명).

그 결과, SNP를 가진 F3Ha 및 F3Hb에서도 본 출원의 조성물에 의해 높은 비율로 indel 돌연변이가 생성되었음을 확인할 수 있었다.

이러한 결과를 통해, 앞서 실시했던 RNP 매개 형질전환 방법뿐만 아니라 아그로박테리움을 이용한 형질전환 방법도 효과적임을 알 수 있었다.

한편, 본 실시예에서 사용한 야생형과 돌연변이형의 페튜니아의 화색을 비교하여 도 32에 나타냈다. 상기 도 32에서 알 수 있듯이, 야생형(Plant 1로 명명)에서는 보라색을 가지지만, 돌연변이형(Plant 2로 명명)에서는 Purple spotted White를 가져 명백하게 페튜니아의 화색이 변경되었음을 알 수 있다.

상기 결과들은 본 출원의 CRISPR/Cas9 조성물에 의해 F3H 유전자에 돌연변이가 효과적으로 도입 될 수 있음을 보여주었으며, 그 결과 F3H 유전자가 KO(Knock-out)되어 발현이 감소됨으로써, 페튜니아의 화색을 변경시킬 수 있음을 보여주었다.

본 출원은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 플라보노이드 생합성 유전자를 편집하기 위한 조성물 및 이의 이용방법을 제공할 수 있다.

플라보노이드 생합성 유전자를 편집하기 위한 표적서열, 가이드RNA 서열, 프라미어 서열에 관한 것이다.

<110> The Industry & Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Method for regenerating modified plant from cell having modified gene involved in flavonoid biosynthesis using CRISPR/Cas9 system in Petunia protoplast <130> PN18266 <160> 69 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Petunia x hybrida <400> 1 ttgggatctc attgctgaat tgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Petunia x hybrida <400> 2 gttaaggcat gtgaagattg ggg 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Petunia x hybrida <400> 3 ctgcggtttg acatgtctgg tgg 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Petunia x hybrida <400> 4 ggccagacaa accagaagga tgg 23 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Petunia x hybrida <400> 5 ttcagtccaa gggtaaggtc agg 23 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggcaccttca acattaacag c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aacgccccaa tcttcacatg 20 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Sequence <220> <223> primer <400> 16 ccaattcagc aatgagatcc ca 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 acatgtcaaa ccgcagcttt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 aaggcatgtg aagattgggg 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gtcacttcac atttgtcttc cg 22 <210> 20 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgttgtgg atcatggggt tga 53 <210> 21 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcatgt tgaatactac ttggtcg 57 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 gttgtggatc atggggttga 20 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gcatgttgaa tactacttgg tcg 23 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ggaacggtaa 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54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctggctga acagtgatcc aagt 54 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 ggcatgtgtg gatatggacc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 ggctgaacag tgatccaagt 20 <210> 36 <211> 2320 <212> DNA <213> Petunia x hybrida <400> 36 tctagaagga aagcacgtgc agtgttagtt gccacgagag gttgttagag ttccacgctt 60 acatgcaact cttactcctt tataaatctc agccccttac ttcccctaac tcctcactac 120 tttccaattt ccgcatatat atcaacccat acttgtccag taaaaagttc gtgtcactct 180 tactatttac atctttattt ttttcacaag aaggcttctc aaacaaagaa ggaaggttgt 240 aaatggcacc ttcaacatta acagcattag cagaagaaaa gacccttcaa acaagtttca 300 ttagggatga agatgaacgt ccaaaagtgg cttacaacca attcagcaat gagatcccaa 360 ttatctcgtt agagggcatt gatgatgaaa ctggtaaaag agctgaaata tgtgacaaga 420 ttgttaaggc atgtgaagat tggggcgttt ttcaagttgt ggatcatggg gttgatgctg 480 aacttatttc ccaaatgaca acttttgcta aagaattctt tgctttgcct cctgaggaaa 540 agctgcggtt tgacatgtct ggtggcaaga aaggtggatt tattgtctct agccatctac 600 aggtaaatta accaatgcat gttgaatact acttggtcgt agcctaccgt ctcaaaaacc 660 gtaacgtgtc acttcacatt tgtcttccga gttaaagaca atttaagttg tgagattttt 720 tcacattatc atgttaagtt tcccgcaaac acgtaataaa gttatactat aatctgtaac 780 agcttaaata aaattaattt tgtggtacta tctctgtata ttagtcttaa atccttggaa 840 tatgtccaaa attaacgact ttaagctaat taaggatcgg caatgtaaaa aaaataacac 900 gatttgggta cttataaggt aattgcatgt atttgcatgt tattttcatg ataagcatta 960 ataaaaacat gacacaaata atactgtcgt aactaacctg gtatcacatg gacataattt 1020 gagtccttaa tagtaatatt tatgagttgt aaatttaact ctctaggaaa ctctcatgta 1080 gatttagatt tcaggtattt cgcacaacaa tttagtaaat caatttgact tttagtatgt 1140 agaaggctat cagaaatatg gaacggtaat ggaagagcat taaattgaca tgtactctgc 1200 taattattgt tcatgaatgc ctctgttttt aagggtgaag tggtccaaga ttggcgtgaa 1260 attgtgacct acttttcgta cccaacaagg gcaagagact actctagatg gccagacaaa 1320 ccagaaggat ggatagctgt gactcagaaa tatagtgaaa agttaatgga gttagcttgc 1380 aagttattgg atgtcctatc agaggctatg ggcttggaga aggaggcctt aaccaaggca 1440 tgtgtggata tggaccaaaa agtggttgtc aatttttacc caaagtgtcc tgagcctgac 1500 cttacccttg gactgaaaag acacactgat ccaggaacca tcactctctt gttacaagac 1560 caagttggtg ggcttcaagc tactaaagat aatggcaaaa cttggatcac tgttcagcct 1620 gttgaaggtg cttttgttgt caatcttggt gaccacggtc atgtaagttt cacaggtttt 1680 tacattgaag gattttttga aactaaattc ctggctatcc gtcatgattc tgatgattag 1740 cttttctgca aagggttttt aagggagtca aaagttatac aatggcactg gaatgtctta 1800 tttctcaaat caccctaagt tctattatga ccctacaatt gttttgtata ctatatttat 1860 gaacttagaa attgtcattc aattatgtga ttttggacag tttttgagca atggacggtt 1920 caagaatgct gatcatcaag cagtggtgaa ctcaaatagc agcaggttat cgatagccac 1980 gtttcagaat ccggcaccag aggcgatagt gtatccattg aaaattaggg aaggagagaa 2040 gtcaataatg gatgagccca taacatttgc agaaatgtac agaaggaaaa tgagcaagga 2100 tttagaactt gctaggctca agaagcaggc caaggagcag cagttacaag ctgaagttgc 2160 tgctgagaag gctaagttgg agtccaagcc cattgaggaa attcttgctt aaattttaca 2220 ttttttagca tatttattat attatatgat gaaaaatgat cctcctacct actgttgtaa 2280 tatctgaatc ggtaataaag ttcccacacc tatatgtttg 2320 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 1 target site(2) <400> 37 aaccctagag taacgactta acc 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 2 target site(2) <400> 38 caattccgta cacttctaac ccc 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 3 target site(2) <400> 39 gacgccaaac tgtacagacc acc 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 4 target site(2) <400> 40 ccggtctgtt tggtcttcct acc 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 5 target site(2) <400> 41 aagtcaggtt cccattccag tcc 23 <210> 42 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 1 sgRNA(1) <400> 42 uugggaucuc auugcugaau 20 <210> 43 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 2 sgRNA(1) <400> 43 guuaaggcau gugaagauug 20 <210> 44 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 3 sgRNA(1) <400> 44 cugcgguuug acaugucugg 20 <210> 45 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 4 sgRNA(1) <400> 45 ggccagacaa accagaagga 20 <210> 46 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 5 sgRNA(1) <400> 46 uucaguccaa ggguaagguc 20 <210> 47 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 1 sgRNA(2) <400> 47 aacccuagag uaacgacuua 20 <210> 48 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 2 sgRNA(2) <400> 48 caauuccgua cacuucuaac 20 <210> 49 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 3 sgRNA(2) <400> 49 gacgccaaac uguacagacc 20 <210> 50 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 4 sgRNA(2) <400> 50 ccggucuguu uggucuuccu 20 <210> 51 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H 5 sgRNA(2) <400> 51 aagucagguu cccauuccag 20 <210> 52 <211> 248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-A <400> 52 ggcttacaac caattcagca atgagatccc aattatctcg ttagagggca ttgatgatga 60 aactggtaaa agagctgaaa tatgtgacaa gattgttaag gcatgtgaag attggggcgt 120 ttttcaagtt gtggatcatg gggttgatgc tgaacttatt tcccaaatga caacttttgc 180 taaagaattc tttgctttgc ctcctgagga aaagctgcgg tttgacatgt ctggtggcaa 240 gaaaggtg 248 <210> 53 <211> 248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-B <400> 53 tgcttacaac caattcagca atgagatacc aattatctcg ttagagggta ttgatgatga 60 aactggtaaa agagctgaaa tatgtgacaa gattgttaag gcatgtgaag attggggcgt 120 ttttcaagtt gttgatcatg gggttgatgc tgaacttatt tcccaaatga caactcttgc 180 taaagaattc tttgctttgc ctcctgagga aaagctacgg tttgacatgt ctggtggcaa 240 gaaaggtg 248 <210> 54 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-A target site(1) <400> 54 gttaaggcat gtgaagattg ggg 23 <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-B target site(1) <400> 55 gttaaggcat gtgaagattg ggg 23 <210> 56 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-A sgRNA (1) <400> 56 guuaaggcau gugaagauug 20 <210> 57 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-B sgRNA (1) <400> 57 guuaaggcau gugaagauug 20 <210> 58 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-A target site(2) <400> 58 caattccgta cacttctaac ccc 23 <210> 59 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-B target site(2) <400> 59 caattccgta cacttctaac ccc 23 <210> 60 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-A sgRNA (2) <400> 60 caauuccgua cacuucuaac 20 <210> 61 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-B sgRNA (2) <400> 61 caauuccgua cacuucuaac 20 <210> 62 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-A PCR primer(F) <400> 62 ggcttacaac caattcagca atg 23 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-A PCR primer(R) <400> 63 ggcttacaac caattcagca atg 23 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-A Adapt PCR primer(F) <400> 64 ccaattcagc aatgagatcc ca 22 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-A Adapt PCR primer(R) <400> 65 acatgtcaaa ccgcagcttt 20 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-B PCR primer(F) <400> 66 ggcttacaac caattcagca atg 23 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-B PCR primer(R) <400> 67 cacctttctt gccaccagac 20 <210> 68 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-B Adapt PCR primer(F) <400> 68 ccaattcagc aatgagatcc ca 22 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3H-B Adapt PCR primer(R) <400> 69 acatgtcaaa ccgcagcttt 20

Claims

식물체 내의 게놈 DNA상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 핵산 서열 내 표적서열에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및
상기 가이드 RNA와 복합체를 형성하여 상기 핵산 서열을 절단시키는 Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열;
을 포함하는 조성물로서,
상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 상기 Cas단백질이 인식하는 PAM 서열에 인접해 있는 표적서열과 동일하거나 상보적인 서열이고,
이 때, 상기 조성물은 식물체 내의 게놈 DNA상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 핵산 서열 내 인위적인 돌연변이를 도입시키며,
상기 조성물은 식물의 꽃, 종자, 과실, 잎 중 선택되는 1 이상의 색깔 특성을 변경시키는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 안토시아닌계 플라보노이드 합성과 관련된 인자는 F3H, F3′H 및 F3′5′H 중 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 안토시아닌계 플라보노이드 합성과 관련된 인자는 F3H 인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 인위적인 돌연변이는 하나 이상의 핵산이 삽입, 결실, 치환, 또는 역위 중 선택되는 1 인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 Cas단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophilus) 유래의 Cas9 단백질, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 유래의 Cas9 단백질, 네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis)유래의 Cas9 단백질, 및 Cpf1 단백질로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열 중 선택되는 1이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 Cas단백질은 스트렙토코커스 피요게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 표적서열은 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 엑손, 인트론 또는 이의 조합의 서열 중 1 이상의 서열의 일부인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 표적서열은 서열번호 1 내지 5; 서열번호 37 내지 41; 서열번호 54 내지 55; 및 서열번호 58 내지 59; 중 선택되는 1 이상의 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 가이드RNA는 서열번호 42 내지 46; 서열번호 47 내지 51; 서열번호 56 내지 57; 및 서열번호 60 내지 61; 중 선택되는 1 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 식물은 가지과 식물, 장미과 식물, 국화과 식물, 선인장과 식물 중 선택되는 1이상의 식물인 것을 특징으로 하는 식물의 특성을 변경시키는 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 가지과 식물은 가지, 맨드레이크, 감자, 담배, 토마토, 페튜니아 중 선택되는 1이상인 것을 특징으로 하는 식물의 특성을 변경시키는 조성물.
식물체 내의 게놈 DNA상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 핵산 서열 내 표적서열에 상보적인 결합을 형성할 수 있는 가이드 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산서열; 및
상기 가이드 RNA와 복합체를 형성하여 상기 핵산 서열을 절단시키는 Cas단백질 또는 이를 암호화하는 핵산서열을 포함하는 조성물을 식물세포에 도입함; 및
상기 식물세포를 재분화함;
을 포함하는 식물체 제조방법으로,
이 때, 상기 재분화된 식물세포는 게놈 DNA상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자의 핵산 서열 내 인위적인 돌연변이를 포함하고,
상기 안토시아닌계 플라보노이드 합성과 관련된 인자는 F3H, F3′H, F3′5′H 중 선택되는 1 이상인 유전자이며,
상기 식물체는 야생형과 비교하여 색깔 특성이 변경된 것을 특징으로 하는, 형질전환 식물체 제조방법.
제 12항에 있어서,
상기 도입은 전기천공법, 유전자총, 초음파천공법, 자기주입법, PEG(Polyethylene glycol), 아그로박테리움법(Agrobacterium), 일시적인 세포의 압축 또는 스퀴징, 지질-매개 형질감염, 나노입자법 중 선택되는 1 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서,
상기 식물세포는 뿌리, 줄기, 잎, 꽃 또는 종자 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서,
상기 식물세포는 원형질체 형태인 것을 특징으로 하는 식물체 제조방법.
제 12항에 있어서,
상기 식물체는 가지과 식물, 장미과 식물, 국화과 식물, 선인장과 식물 중 선택되는 1이상의 식물체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서,
상기 가지과 식물은 가지, 맨드레이크, 감자, 담배, 토마토, 페튜니아 중 선택되는 1이상인 것을 특징으로 하는 식물체 제조방법.
제 12항에 있어서,
상기 재분화는 상기 조성물이 도입된 식물세포를 배양하여 캘러스를 형성시키고, 상기 캘러스를 추가적으로 더 배양하여 식물체를 형성시키는 것을 포함하는 방법.
제 12항 내지 18항 중 어느 한 항의 제조방법에 의해 제조된,
게놈 DNA상에서 안토시아닌계 플라보노이드의 합성과 관련된 인자인 F3H, F3′H, F3′5H′중 선택되는 1 이상인 유전자의 핵산 서열 내 인위적인 돌연변이를 포함하고,야생형과 비교하여 안토시아닌 함량이 감소되고 색깔 특성이 변경된 식물체.