KR20240103069A - 유전자 편집기술을 이용한 만추성 상추 식물체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 FT(Flowering locus T) 유전자를 편집하여 만추성 형질을 가지는 유전체 편집 상추 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것이다.

Description

유전자 편집기술을 이용한 만추성 상추 식물체 및 이의 제조 방법 {Developing of late-bolting lettuce and method using genome editing}
본 발명은 FT(Flowering locus T) 유전자를 편집하여 만추성 형질을 가지는 유전체 편집 상추 식물체의 제조방법 및 그에 따른 식물체에 관한 것이다.
CRISPR/Cas9(유전자 편집기술)은 GMO 규제를 회피할 대안 기술로 최근 부상되고 있다. 유전자 편집기술은 Agrobacterium를 이용하여 식물체 조직(explant)에 도입하는 방법과 RNP(sgRNA와 Cas9 단백질 복합체)를 식물 원형질체에 도입하는 방법이 있다. Agrobacterium를 매개로 한 유전자 편집의 경우 외래유전자를 삽입시키는 기술이나, 원형질체와 RNP를 이용한 경우는 DNA-free 유전자 편집기술로 인정되고 있는 현황이다.
상추는 국내에는 엽형 및 작형에 따라 다양한 상추 품종이 유통되고 있다. 국내 소비자들은 봄, 가을, 겨울에 흔하게 먹을 수 있는 상추를 선호하는 편이다. 생산자 입장에서는 여름철 재배 품종의 선택이 가장 어렵다. 여름재배의 가장 큰 문제는 고온에 의한 추대 발생이고 이에 따라 품질 저하 및 생산량 감소가 발생하므로, 추대가 늦은 품종을 선택해야 한다. 하지만 현재 시판되는 상추 품종 중에서는 농가가 만족할만한 수준의 만추대성을 가진 품종을 거의 발견하지 못하는 상황이다.
이에 본 발명자들은 하절기 상추재배 시 고온 장일조건 하에서 조기개화에 따른 상추 품질 저하와 생산량 감소 문제점을 해결하기 위해 연구한 결과, 상추의 FT (Flowering locus T) 유전자 염기서열을 바탕으로 가이드 RNA(sgRNA)를 설계하여, FT 유전자를 편집한 식물 세포로부터 식물을 재분화한 결과, 상추의 개화가 억제하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
(특허 문헌 001) 대한민국 등록특허 공보 10-2113500
본 발명의 목적은, 본 발명자들은 상추에 만추 특성을 도입하기 위해서, FT(Flowering locus T) 유전자를 타깃으로 유전자 가위 시스템을 식물세포에 도입한 결과, 유전체를 편집하지 않은 대조군에 비해 FT 유전자가 편집된 식물체는 개화시기가 현저히 지연되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상추 유래 FT(Flowering locus T) 유전자 중 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 식물세포에 도입하여 유전체를 편집하는 단계 및 상기 유전체가 편집된 식품 세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 편집 상추 식물체의 제조 방법을 제공한다.
용어 '유전체/유전자 편집(genome/gene editing)'은, 인간 세포를 비롯한 동·식물 세포의 유전체 염기서열에 표적지향형 변이를 도입할 수 있는 기술로서, DNA 절단에 의한 하나 이상의 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 특정 유전자를 녹-아웃(knock-out) 또는 녹-인(knock-in)하거나, 단백질을 생성하지 않는 비-코딩 DNA 서열에도 변이를 도입할 수 있는 기술을 말한다. 본 발명의 목적상 상기 유전체 편집은 특히 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 이용하여 식물체에 변이를 도입하는 것일 수 있다.
용어 "표적 유전자"는 본 발명을 통해 편집하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미한다. 즉, 원칙적으로 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 비-코딩(non-coding) 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 편집 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있다.
상기 표적 유전자는 상추 유래 FT(Flowering locus T)유전자일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 유전자 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
용어 '가이드 RNA(guide RNA)'는 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 DNA 서열과 전부 또는 일부 상보적으로 결합하여 해당 표적 DNA 서열로 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 이끄는 역할을 하는 리보핵산을 의미한다.
상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA(dual RNA); 또는 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일 사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 가이드 RNA는 바람직하게는, 단일 가닥 가이드 RNA 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 사용된 엔도뉴클레아제의 종류 또는 그 유래 미생물 등에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 상기 단일 가이드 RNA (sgRNA)은 실시예 2에 개시되어 있는 염기서열 (5′-CACCTCCAATATCAACCCT-3)을 포함하는 유전자 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 가이드 RNA는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것 또는 생체 외(in vitro)에서 전사된(transcribed) 것(예컨대, 올리고뉴클레오티드 이중가닥)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 편집 상추 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제 단백질은 Cas9(CRISPR associated protein 9), Cpf1(CRISPR from Prevotella and Francisella 1), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), ZFN(Zinc Finger Nuclease) 또는 이의 기능적 유사체로 이루어진 군으로 부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 Cas9 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 피요제네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 유래의 Cas9 단백질, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 또는 스트렙토코커스 아우레우스(Streptocuccus aureus) 유래의Cas9 단백질, 네이쎄리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 유래의 Cas9 단백질, 파스투렐라 물토시다(Pasteurella multocida) 유래의 Cas9 단백질, 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida) 유래의 예컨대 Cas9 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Cas9 단백질은 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 아미노산 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
Cas9 단백질은 RNA-guided DNA 엔도뉴클레아제 효소로, 이중 가닥 DNA 절단(double stranded DNA break)을 유도한다. Cas9 단백질이 정확하게 표적 DNA의 염기서열에 결합하여 DNA 가닥을 잘라내기 위해서는 PAM(Protospacer Adjacent Motif)이라 알려진 3개의 염기로 이루어진 짧은 염기서열이 표적 DNA의 염기서열 옆에 존재해야 하며, Cas9 단백질은 PAM 서열(NGG)로부터 3번째와 4번째 염기 쌍 사이를 추정하여 절단한다 (도 1 참고).
본 발명의 일 구현 예에 따른 유전체 편집 상추 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 가이드 RNA와 엔도뉴클레아제 단백질은 리보핵산-단백질 복합체를 형성하여 RNA 유전자 가위(RNA-Guided Engineered Nuclease, RGEN)로 작동한다.
본 발명에서 사용된 CRISPR/Cas9 시스템은 편집하고자 하는 특정 유전자의 특정위치에 이중나선 절단을 도입하여 DNA 수선 과정에서 유도되는 불완전 수선에 의한 삽입-결실(insertion-deletion, InDel) 돌연변이를 유도시키는 NHEJ(non-homologous end joining) 기작에 의한 유전자 편집 방법이다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질 암호화하는 핵산 서열을 식물세포에 도입하는 것은 형질전환 방법을 의미한다. 식물종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 재조합 벡터를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiuet al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol.3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al.,1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법을 포함한다.
식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물이다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 편집 상추 식물체 및 상기 식물체의 유전체가 편집된 종자를 제공한다.
본 발명에 따른 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 편집 상추 식물체는 개화와 관련된 주요 유전자인 FT 유전자를 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 편집한 것으로, 상추 FT 유전자가 녹-아웃된 유전체 편집 식물체이다.
본 발명은 또한, 상추 유래 FT(Flowering locus T) 유전자 중 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 상추 식물체의 추대를 지연시키기 위한 유전체 편집용 조성물을 제공한다.
본 발명의 유전체 편집용 조성물은, 표적 유전자의 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하고 있어, 상기 조성물을 상추 식물체에 처리할 경우, 상기 가이드 RNA와 RNA-가이드 뉴클레아제 단백질의 복합체가 RNA 유전자 가위로 작동하여 표적 유전자를 편집할 수 있다.
본 발명의 유전체 편집용 조성물은 바람직하게는 상추 FT 유전자의 표적 DNA(서열번호 1)에 특이적인 가이드 RNA와 Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질을 포함하고 있어, 상기 FT 유전자를 녹-아웃시킬 수 있고, FT 유전자의 녹-아웃을 통해 식물체의 추대를 지연시킬 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 편집 상추 식물체를 교배모본으로 하여 도입하고자 하는 웅성 가임 상추와 교배하는 단계를 포함하는, 추대가 지연된 형질을 가지는 상추 계통의 잡종 종자를 생산하는 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 추대가 지연된 형질을 가지는 상추 계통의 잡종 종자를 제공한다.
본 발명의 웅성 가임 상추는 정상적인 자연 교배가 가능한 상추를 의미한다.
본 발명의 FT 유전자를 편집한 상추는 야생형 식물체보다 개화 시기가 억제되는 효과가 있다. 하절기 고온 장일 재배조건에서 안정적인 상추 생산이 가능해지고, 수확 횟수의 증가와 고품질 상추 생산으로 농가소득 향상되는 효과가 있다.
도 1은 상추 FT 유전자에서 본 발명의 유전자 가위가 표적하는 위치(유전자 편집의 위치)를 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명의 상추 FT 유전자를 편집한 식물체와 유전자를 편집하지 않은 야생형 식물체의 FT 유전자를 서로 비교한 결과이다.
도 3은 재분화된 유전자 편집 상추 식물체인 실시예 1, 2, 3, 및 4와 유전자가 편집되지 않은 야생형 식물체와의 개화시기를 비교한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험예 1. 유전자 가위의 표적 서열 디자인
상추 FT 유전자 (LsFT) 염기서열은 애기장대 FT 유전자 (AtFT)로 알려진 유전자의 단백질 서열을 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 상동성 검색을 이용하여 상추 FT 유전자 (LOC111907824, 서열번호 1)의 염기서열을 확보 하였다. 확보된 상추 FT 유전자의 염기서열 정보를 바탕으로 하여 실제 시판 중인 상추품종에서 total RNA를 추출 및 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA와 Forward (5′-ATGATGCCTAGGGAGAGGG-3′) 및 Reverse (5′-TTATCTTCTTCGCCCACCAAACC-3′) 프라이며 세트를 이용하여 PCR (polymerase chain reaction) 하여, 상추의 FT 유전자의 염기서열 (서열번호 1)을 확인 및 확보하였다. 확보된 상추 FT 유전자 염기서열 5′부근의 Cas9 nuclease 인식 염기서열인 PAM (protospacer adjacent motiff) site을 기준으로 하여 sgRNA를 설계하였고, Cas-Designer (http://www.rgenome.net/cas-designer)를 이용하여 sgRNA (single guide RNA)를 디자인 하였다 (도 1).
실험예 2. 유전자 편집 방법
상추 FT 유전자의 sgRNA (5′-CACCTCCAATATCAACCCT-3)와 Cas9 단백질 (서열번호 2)을 상추 원형질체 polyethylene glycol (PEG) 처리하여 도입하였다. sgRNA (25 μg)과 Cas9 (25 μg)과 함께 상추 원형질체 (5×105)에 PEG 용액 (20% PEG, 0.2 M mannitol, 0.1 M CaCl2)를 혼합하였다. 혼합액과 동량의 배양액 (2 mM morpholineethanesulfonic acid, 154 mM NaCl2, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, pH 5.7) 첨가하여 sgRNA와 Cas9 단백질을 도입시켰다.
실험예 3. 유전자 편집된 식물체 생산
sgRNA와 Cas9 protein이 도입된 상추 원형질체(5×105)에 1차 배지 (1×B5 culture medium, 70g/L D-mannitol, 20 g/L glucose, 0.1 g/L MES, 0.2 mg/L 2,4-D, 0.1 mg/L NAA, 0.5 mg/L BAP, pH5.7)를 1ml 처리한 후 7일간 25℃, 암조건에서 배양하였다. 그 후에 2차 배지 (1×B5 culture medium, 40 g/L D-mannitol, 20 g/L sucrose, 0.1 g/L MES, 0.2 mg/L 2,4-D, 0.1 mg/L NAA, 0.5 mg/L BAP, pH5.7)를 2ml 처리한 후 1주에서 2주 동안 배양하였다. 그 후 3차 배지 (1×B5 culture medium, 40 g/L D-mannitol, 20 g/L sucrose, 0.1 g/L MES, 8 g/L phyto agar, 0.2 mg/L 2,4-D, 0.1 mg/L NAA, 0.5 mg/L BAP, pH 5.7)로 옮긴 후 4주에서 5주간 배양하였다. 4차 배지 (1×B5 culture medium, 10 g/L sucrose, 8g/L phyto agar, 0.1 mg/L NAA, 0.5 mg/L BAP, pH 5.7)에서 2에서 4달간 배양, 5차 배지 (0.5× MS culture medium, 30 g/L sucrose, 8 g/L phyto agar, pH 5.7) 순으로 배지조성을 교체시켜 개체를 생산하였다.
실험예 4. 유전자 편집 식물체의 서열 분석
CRISPR/Cas9 유전자편집기술을 이용 유전자 편집 후 생산된 식물체들로부터 추출한 DNA와 Froward (5′-ATGATGCCTAGGGAGAGGGA-3′) 및 Reverse (5′-AGGAGCAATCCATTGTCTATCAC-3′) 프라이머 세트를 이용하여 FT 유전자염기서열을 확보 한 후, 외부 기관 (BIO CORE CENTOR, 카이스트)에 NGS 분석을 진행하였다. CRISPR/Cas9 유전자편집기술을 이용하여 상추 FT 유전자를 편집한 식물체와 유전자가 편집되지 않은 야생형 식물체의 FT 유전자를 서로 비교하여 sgRNA의 표적이 된 DNA 서열 부근에 돌연변이가 발생된 유전자 편집 식물체를 확보 하였고, 그 결과는 도 2과 같다. 유전자 편집된 4 개체에서 각각 다른 형태의 서열 변이가 발생하였고, 야생형 서열과 비교할 때 염색체 두 쪽에 모두 변이가 발생한 것을 확인하였다. 실시예 1은 7bp와 4bp의 다른 형태의 결실 (deletion)이 각기 다른 상동 염색체 (도 2의 실시예 1_염색체 1 및 실시예 1_염색체 2 참조)에서 발생하였다. 실시예 2은 7bp와 4bp 결실이 각기 다른 상동 염색체 (도 2의 실시예 2_염색체 1 및 실시예 2_염색체 2 참조)에서 발생하였다. 실시예 3은 3bp와 1bp 결실이 각시 다른 상동 염색체 (도 2의 실시예 3_염색체 1 및 실시예 3_염색체 2 참조)에서 발생하였다. 실시예 4은 3bp와 1bp 결실이 각시 다른 상동 염색체 (도 2의 실시예 4_염색체 1 및 실시예 4_염색체 2 참조)에서 발생하였다. 그 결과, 실시예 1과 2에서의 결손 돌연변이 발생으로 해독틀 이동 (frame shift)이 발생한 것을 알 수 있었으며, 유전자의 중간에 종결 코돈이 생성되어 정상적인 FT 단백질이 생성되지 않음을 알 수 있었다. 실시예 3과 4에서의 한쪽 염색체의 1bp 결손 돌연변이 발생으로 해독틀 이동 (frame shift)이 발생으로 종결 코돈이 생성되었고, 다른 한쪽 염색체에서 3bp 결손은 in frame으로 1개의 아미노산 (valline)이 결손된 형태의 FT 단백질이 생성 될 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 5. 유전자 편집 식물체의 만추성 형질 분석
재분화된 유전자 편집 상추 식물체인 실시예 1, 2, 3, 및 4와 유전자가 편집되지 않은 야생형 식물체와의 개화시기를 비교확인 하였다. 야생형의 경유 평균 20일만에 개화하는 것으로 확인 되었으나, FT 유전자가 편집된 식물체는 3개월 이상이 지나도 개화하지 않는 것을 관찰할 수 있었다 (도 3). 이를 통해, 본 발명의 FT 유전자 편집 상추 식물체는 추대가 지연되는 특성을 보유하게 되었음을 알 수 있었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

  1. 상추 유래 FT(Flowering locus T) 유전자 중 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 식물세포에 도입하여 유전체를 편집하는 단계; 및
    상기 유전체가 편집된 식물 세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 편집 상추 식물체의 제조방법.
  2. 제1항의 방법에 의해 제조된 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 편집 상추 식물체.
  3. 제 2항에 따른 식물체의 유전체가 편집된 종자.
  4. 상추 유래 FT(Flowering locus T) 유전자 중 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA(guide RNA)를 암호화하는 DNA 및 엔도뉴클레아제(endonuclease) 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 상추 식물체의 추대를 지연시키기 위한 유전체 편집용 조성물.
  5. 제 2항의 추대가 지연된 형질을 가지는 유전체 편집 상추 식물체를 교배모본으로 하여 도입하고자 하는 웅성 가임 상추와 교배하는 단계를 포함하는, 추대가 지연된 형질을 가지는 상추 계통의 잡종 종자를 생산하는 방법.
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