WO2024122794A1 - 원형질체 유래 배추 재분화 및 rnp 이용 변이체 - Google Patents

원형질체 유래 배추 재분화 및 rnp 이용 변이체 Download PDF

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WO2024122794A1
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WO
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brassica rapa
protoplast
pekinensis
culture medium
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PCT/KR2023/011777
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김진아
이기종
박소영
김란선
이은영
김향숙
장주나
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대한민국(농촌진흥청장)
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    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Definitions

  • the present invention relates to protoplast-derived Chinese cabbage redifferentiation and RNP-using mutants, specifically (a) isolating protoplasts from Chinese cabbage ( Brassica rapa spp. pekinensis); (b) correcting the genome by introducing the Cas9 protein and guide RNA complex into the isolated protoplast; and (c) producing a genome-corrected redifferentiated plant by regenerating the genome-corrected protoplast.
  • Gene editing is an artificial restriction enzyme that is created to recognize and cut the desired base sequence. It precisely cuts the desired genome base sequence within an animal or plant cell, thereby recovering genetic information on the genome with higher efficiency than existing technologies. It is a molecular tool for correction. In fact, it has been proven that the gene editing method can successfully induce highly efficient manipulation of genetic information in plants such as Arabidopsis, tobacco, rice, and corn, as well as various animals for gene knock-out in fruit flies in 2002. It has been done. In order for such gene editing to be successful, a gene editing method is required that has high efficiency in specifically targeting the target gene and does not change non-specific regions.
  • CRISPR gene scissors (RNA-guided engineered nuclease; RGEN) has developed rapidly since it was first developed in 2013 and is widely used for various species, including human cells, livestock, insects, plant cells such as rice and wheat, and pathogens. .
  • This method uses the CRISPR immune system formed by bacteria to prevent invasion of foreign DNA using genetic scissors.
  • the paired CRISPR system attaches to the target DNA base sequence and cuts it.
  • CRISPR gene scissors were confirmed to be not only the easiest and cheapest to manufacture among the scissors developed to date, but also highly accurate and efficient.
  • a method of introducing CRISPR gene scissors into cells using a DNA-free guide RNA and protein complex (Ribonucleoprotein, RNP) has been developed.
  • cabbage is the main ingredient of kimchi, one of the four major vegetables in Korea, and is included in the genus Brassica.
  • Brassica contains crops with excellent industrial economics, such as rapeseed and mustard, and is an important crop in foreign countries as well.
  • crops with excellent industrial economics such as rapeseed and mustard, and is an important crop in foreign countries as well.
  • rapeseed and mustard crops with excellent industrial economics, such as rapeseed and mustard
  • Chinese cabbage one of the crops in which re-differentiation from protoplasts is difficult, there is a need for a method of producing transformed Chinese cabbage plants from Chinese cabbage protoplasts.
  • the present invention aims to solve the above-described problems and other problems associated therewith.
  • the object of the present invention is to (a) isolate protoplasts from Chinese cabbage (Brassica rapa spp. pekinensis); (b) correcting the genome by introducing the Cas9 protein and guide RNA complex into the isolated protoplast; and (c) producing a genome-corrected redifferentiated plant by regenerating the genome-corrected protoplast.
  • Another object of the present invention is to provide plants redifferentiated from cabbage protoplasts prepared by the above method.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for producing redifferentiated plants from Chinese cabbage protoplasts, comprising a guide RNA specific for DNA encoding a target gene and a Cas9 protein complex.
  • the present invention provides protoplast-derived cabbage redifferentiation and RNP-using mutants. Specifically, the present invention confirms that it is possible to study the unique physiological mechanisms of crops through the development of mutants of crops for which artificial mutations have been difficult, and produces cabbage plants transformed from protoplasts of Chinese cabbage, a crop in which re-differentiation from protoplasts is difficult.
  • a production method a method for producing a redifferentiated plant from cabbage protoplasts and a redifferentiated plant produced by the method are provided.
  • 'Brassica rapa spp. pekinensis' in step (a) is a biennial plant of the dicotyledonous plant Brassica family, Brassica family, and has roots that are shabby compared to radish, and leaves in the form of a huge flower on top of them. This is a plant that has a lumpy shape.
  • 'protoplast' in step (a) refers to a plant cell from which the cell wall has been removed, and the protoplast may be derived from a cotyledon or hypocotyl of Chinese cabbage, but is not limited thereto, and specifically, It may be derived from the cotyledons of cabbage grown for 5 to 7 days.
  • the CPW enzyme solution is added, the protoplasts are cut into small pieces, shaken at 60 rpm in the dark at 25 to 28°C, and then 3 to 5 hours later. It may include an extraction process.
  • the 'Cas9 protein' in step (b) is a major protein component of the CRISPR/Cas system, a protein that can act as an activated endonuclease, and is named RGEN (RNA-guided engineered nuclease). It corresponds to genetic scissors.
  • the Cas9 protein can exhibit its activity by forming a complex with crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA).
  • CRISPR RNA crRNA
  • tracrRNA trans-activating crRNA
  • the Cas9 protein recognizes a specific base sequence in the genome and causes a double strand break (DSB).
  • the double helix cutting involves cutting the double helix of DNA to create blunt ends or cohesive ends.
  • DSBs are efficiently repaired within cells by homologous recombination or non-homologous end-joining (NHEJ) mechanisms, and during this process, mutations desired by researchers can be introduced into the target site.
  • NHEJ non-hom
  • the 'Cas9 protein' may be derived from the genus Streptococcus, preferably from Streptococcus Pyogenes, but is not limited thereto.
  • the 'guide RNA' in step (b) refers to a DNA-specific RNA encoding a target gene, and binds completely or partially complementary to the target sequence, allowing the Cas protein to encode the target sequence. It can be cut.
  • the guide RNA is a dual RNA containing two RNAs as components: crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA); or a single-chain guide RNA (sgRNA) form comprising a first region comprising a sequence that is fully or partially complementary to a sequence in the target DNA and a second region comprising a sequence that interacts with the RNA-guide nuclease.
  • RNA-guide nuclease can be included in the scope of the present invention without limitation as long as it is in a form capable of being active on the target sequence.
  • it when applying the guide RNA to Cas9, it can be used in the form of a double RNA containing crRNA and tracrRNA as components, or a single-chain guide RNA (sgRNA) in the form of a fusion of the main parts of crRNA and tracrRNA. ) may be in the form.
  • the sgRNA may include a portion having a sequence complementary to the sequence in the target DNA (also called spacer region, target DNA recognition sequence, base pairing region, etc.) and a hairpin structure for Cas protein binding.
  • it may include a portion having a sequence that is fully or partially complementary to the sequence in the target DNA, a hairpin structure for Cas protein binding, and a terminator sequence.
  • the structures described above may exist sequentially from 5' to 3'. However, it is not limited thereto, and any type of guide RNA may be used in the present invention as long as the guide RNA includes the main part of crRNA or all or part of the complementary part of the target DNA.
  • the guide RNA is not limited thereto, but may be in the form of isolated RNA (naked RNA).
  • the guide RNA can be prepared using any in vitro transcription system known in the art.
  • the Cas protein and guide RNA can be directly introduced into protoplasts. This can minimize the introduction of foreign DNA into plants, preventing concerns about GMOs.
  • the vector DNA is inserted into the chromosome, and the vector sequence remains in the chromosome even after gene correction, resulting in the difficulty of having to remove it separately through mating.
  • direct injection of RNA and protein complex using protoplasts In this case, RNA and proteins lose their activity and degenerate after a certain period of time after gene correction, and the corrected plant becomes a transgene-free plant, thereby avoiding GMO issues.
  • the Cas protein and guide RNA may be manufactured in the form of an RNP (Ribonucleoprotein) complex and introduced into protoplasts, but the present invention is not limited thereto.
  • the 'RNP (ribonucleoprotein)' is a ribonucleic acid protein and refers to a complex of RNA and protein.
  • the 'target gene' refers to some DNA within the genome of the plant to be corrected through the present invention. That is, in principle, it is not limited to the type of gene and can include both coding regions and non-coding regions.
  • a person skilled in the art may select the target gene according to the desired mutation for the genome editing plant to be manufactured, depending on the purpose.
  • the target gene in the present invention is BrGI (Brassica rapa GIGANTEA)-g1 or BrGI (Brassica rapa It may be GIGANTEA)-g3.
  • the GIGANTEA gene is a biorhythm gene and is involved in resistance mechanisms to environmental stresses such as salt or dry stress.
  • the step of introducing the Cas9 protein and guide RNA into the protoplasts isolated in step (b) includes microinjection, electroporation, DEAE-dextran treatment, lipofection, and nanotechnology. It can be delivered to cells by various methods such as particle-mediated transfection, protein transduction domain-mediated introduction, and PEG-mediated transfection, but is not limited thereto. Specifically, in the present invention, electroporation or PEG- It may be delivered by an intermediate transfection method.
  • PEG-mediated transfection may include mixing protoplasts with a PEG4000 solution at a concentration of 30 to 40% (w/v) and then culturing them in the dark at 25°C for 5 to 20 minutes. Preferably, it may include dark culturing at 25°C for 10 minutes. Afterwards, 400 ⁇ l, 800 ⁇ l, 1500 ⁇ l, 3000 ⁇ l, and 5000 ⁇ l of CPW 9M were added in the order of 400 ⁇ l, 800 ⁇ l, 1500 ⁇ l, 3000 ⁇ l, and 5000 ⁇ l at 4 to 6°C and centrifuged.
  • the culture medium contains glucose, D-mannitol, NAA (1-naphthalene acetic acid), BA (benzyladenine), and 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy) in K3 medium.
  • cyacetic acid in an appropriate amount, and specifically may contain 20 g of glucose, 70 g of D-mannitol, 1 mg of NAA, 1 mg of BA, and 0.25 mg of 2,4-D, but is not limited thereto.
  • transfection through electroporation may include mixing protoplasts with Cas9 protein and guide RNA complex, and then applying an electric shock.
  • the electric shock can be performed at 200V for 2.5, 5, 7.5 or 10 seconds, and then stabilized at 4 to 6°C for 40 to 60 minutes, centrifuged to remove the supernatant, and culture medium added to 1 It may include culturing cancer for one to two days.
  • the voltage can be set to 0, 500, 750, or 1000 V and electroporated for 2 to 10 seconds, and then the cells after electroporation can be electroporated. It may include the step of diluting in a culture medium and culturing the cancer.
  • the culture medium contains glucose, D-mannitol, NAA (1-naphthalene acetic acid), BA (benzyladenine), and 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy) in K3 medium.
  • Cyacetic acid in an appropriate amount, specifically, 20 g of glucose, 70 g of D-mannitol, 0.2 to 1 mg of NAA, 1 to 3 mg of BA, and 0.25 mg of 2,4-D, but it is limited thereto.
  • it may contain 20g of glucose, 70g of D-mannitol, 1mg of NAA, 1mg of BA, and 0.25mg of 2,4-D.
  • the genome editing in step (b) may be performed through gene knock-out or gene knock-in.
  • the redifferentiation step (c) includes culturing in a primary culture medium; Culturing in a secondary culture medium; and culturing in a tertiary culture medium.
  • the steps of culturing in the primary, secondary and tertiary culture media may be for culturing the gene-corrected protoplasts to form callus.
  • 'callus' of the present invention refers to a cell or cell mass that has become undifferentiated through a dedifferentiation process and may include stem cells.
  • the primary culture medium, secondary culture medium, or tertiary culture medium may be a liquid or solid medium, and in the case of a solid medium, low-melting agarose can be used.
  • the primary culture medium, secondary culture medium, or tertiary culture medium may be a liquid culture medium.
  • the primary culture medium is K3 medium containing glucose, D-mannitol, NAA (1-naphthalene acetic acid), BA (benzyladenine), and 2,4-D (2,4- dichlorophenoxyacetic acid) in an appropriate amount, specifically, 20 g of glucose, 70 g of D-mannitol, 1 mg of NAA, 1 mg of BA, and 0.25 mg of 2,4-D, but is not limited thereto. .
  • the secondary culture medium may be a K3 medium containing sucrose, D-mannitol, NAA (1-naphthalene acetic acid), and BA (benzyladenine) in appropriate amounts, Specifically, it may contain 20 g of sucrose, 40 g of D-mannitol, 0.2 to 1 mg of NAA, and 1 to 3 mg of BA, but is not limited thereto, and preferably contains 20 g of sucrose, 40 g of D-mannitol, 1 mg of NAA, and 1 mg of BA. You can.
  • the tertiary culture medium may be a K3 medium containing sucrose, NAA (1-naphthalene acetic acid), BA (benzyladenine), and adenine in appropriate amounts, and specifically, sucrose.
  • 20 g may contain 0.2 to 1 mg of NAA, 0.5 to 3 mg of BA, and 30 mg of adenine, but is not limited thereto, and preferably may contain 20 g of sucrose, 1 mg of NAA, 0.5 mg of BA, and 30 mg of adenine.
  • Cultivation in the primary culture medium may be carried out for 2 to 3 weeks, preferably for 2 weeks. Additionally, culture in the primary medium may proceed as dark culture at 25°C. In addition, the culture in the secondary culture medium may be carried out for 2 to 3 weeks and may be carried out as a cancer culture. Cultivation in the tertiary culture medium may be carried out as a dark culture for 2 to 3 weeks, preferably for 2 weeks, and every 2 to 3 weeks until the callus grows. Third culture medium can be added.
  • the step of transferring to a shoot inducing medium and culturing may be further included.
  • the 'shoot' refers to a green differentiated tissue derived from callus that has the ability to grow into a mature plant. Specifically, callus grown to 1 mm or more in a tertiary culture medium is called a shoot. It can be transferred to medium and cultured.
  • the suit inducing medium may contain sucrose, NAA, BA, and AgNO 3 in MS medium, and specifically may contain 30 g of sucrose, 1 mg of NAA, 1 to 3 mg of BA, and 2 to 10 mg of AgNO 3 . It is not limited thereto, and preferably contains 30g of sucrose, 1mg of NAA, 3mg of BA, and 2mg of AgNO 3 .
  • the method may further include transferring the induced shoots to a rooting medium and culturing them.
  • the rooting medium may be MS medium or Hyponex medium containing sucrose, and may contain 20 g of sucrose, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a redifferentiated plant produced by the method for producing a redifferentiated plant from cabbage protoplasts of the present invention.
  • Plants redifferentiated from the protoplast of the present invention may have improved productivity, increased metabolite content, and improved resistance to high temperature, salt, or drying compared to plants that have not been redifferentiated.
  • the present invention provides a composition for producing redifferentiated plants from cabbage protoplasts, including a guide RNA specific to DNA encoding a target gene and a Cas9 protein complex.
  • target gene ‘target gene’, ‘guide RNA’, ‘Cas9 protein’, ‘Chinese cabbage’ and ‘protoplast’ are as described above.
  • the redifferentiated plant has mutations caused by targeted mutations based on the composition of the present invention.
  • the mutation may be any one of deletion, insertion, translocation, and inversion, and the location of the mutation may depend on the sequence of the guide RNA of the composition.
  • the target gene may be BrGI (Brassica rapa GIGANTEA)-g1 or BrGI (Brassica rapa GIGANTEA)-g3, but is not limited thereto.
  • the method and composition for producing a redifferentiated plant from a Chinese cabbage protoplast according to the present invention is to isolate the Chinese cabbage protoplast, cause a mutation in the gene sequence, and then redifferentiate it into a complete plant, thereby improving the transformed cabbage plant, especially productivity, and the content of metabolites. This improves, it is possible to obtain cabbage plants with improved resistance to high temperature, salt, or drying, and it has the effect of making it possible to study the unique physiological mechanisms of crops through the development of mutants of crops in which artificial mutations are difficult.
  • Figures 1 and 2 are photographs showing the overall process of creating regenerated plants from cabbage protoplasts of the present invention.
  • Figure 3 shows the results of confirming activity and testing the mutation rate by introducing a GFP vector into isolated protoplasts.
  • Figure 4 shows the results showing the difference in genetic mutation rate according to PEG conditions.
  • Figure 5 shows the results of confirming mutations in the gene sequence of Zezanthia (GI) by guide RNA in the present invention.
  • Figure 6 shows the results of confirming sequence variation in branch cabbage varieties redifferentiated in the present invention.
  • Figure 7 shows the results of confirming sequence variation in Asian cabbage varieties redifferentiated in the present invention.
  • the separated protoplast mixture was filtered using a 50ml tube and 70 ⁇ m mesh, and then centrifuged at 100g, 10 minutes, 4°C. The supernatant was removed with a pasteur pipette and dissolved by adding 1ml of CPW 9M. After adding 5ml of CPW 21S to a 15ml tube, the solution suspended in CPM 9M was carefully placed on the upper layer using a pasteur pipette. Centrifugation was performed at 100 g, 10 minutes, 4°C, and the protoplast layer was separated using a pasteur pipette and transferred to a 50 ml tube.
  • CPW 9M was added to the separated protoplasts to make 30 ml and stabilized at 4°C for 1 hour, then centrifuged at 100 g, 10 minutes, 4°C, and the supernatant was removed with a pasteur pipette, and then 1 ml of CPW 9M was added. . Afterwards, the cell density was adjusted to CPW 9M to 1 ⁇ 10 6 /ml using a hemacytometer.
  • BrGI_g1 TCATCTGAGAGGTGGACCGATGG One BrGI_g2 CAGTTGAGGGATACTGATTACGG 2 BrGI_g3 ATTATCTCATGTCTCATCGATGG 3 BrGI_g4 GAATGACTATTCAGAGCAATGGG 4 BrGI_g5 GGTTTCCTTTCATGCTGTCCTGG 5
  • the GFP vector was inoculated into the isolated protoplasts using a PEG4000 (30% or 40%) solution, and the inoculation rate was confirmed by counting the number of cells showing GFP activity. The results showed an average inoculation rate of 22.59%. Confirmed ( Figure 3).
  • Example 2 In order to redifferentiate the Chinese cabbage protoplasts genetically corrected in Example 2 into transformed Chinese cabbage plants, they were cultured in the dark for 2 weeks in liquid culture medium 1.
  • the composition of liquid culture medium 1 is shown in Table 2 above. Afterwards, liquid culture medium 2 was added and cultured in the dark for 2 to 3 weeks.
  • the composition of liquid culture medium 2 is shown in Table 4 below.
  • liquid culture medium 3 After dark culture, liquid culture medium 3 was added, and after dark culture for 2 weeks, liquid culture medium 3 was replaced and cultured every two weeks until the callus grew.
  • the composition of liquid culture medium 3 is shown in Table 5 below.
  • Rooting medium The composition of the rooting medium is shown in Table 7 below.

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Abstract

본 발명은 원형질체 유래 배추 재분화 및 RNP 이용 변이체에 관한 것으로, 구체적으로 (a) 배추(Brassica rapa spp. pekinensis)로부터 원형질체를 분리하는 단계; (b) 분리된 원형질체에 Cas9 단백질과 가이드 RNA를 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (c) 상기 유전체가 교정된 원형질체를 재분화시켜 유전체 교정 재분화 식물체를 제조하는 단계;를 포함하는, 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하는 방법 및 조성물은 배추의 원형질체를 분리하여 유전자의 서열에 변이를 일으킨 후 완전한 식물체로 재분화시킴으로써 형질전환된 배추 식물체, 특히 생산성이 증진되고 대사산물의 함량이 증진되며, 고온, 염 또는 건조 저항성이 증진된 배추 식물체를 얻을 수 있으며, 인위 돌연변이가 어려운 작물의 돌연변이체 개발을 통해 작물 고유의 생리 기작 연구가 가능해질 수 있는 효과가 있다.

Description

원형질체 유래 배추 재분화 및 RNP 이용 변이체
본 발명은 원형질체 유래 배추 재분화 및 RNP 이용 변이체에 관한 것으로, 구체적으로 (a) 배추(Brassica rapa spp. pekinensis)로부터 원형질체를 분리하는 단계; (b) 분리된 원형질체에 Cas9 단백질과 가이드 RNA 복합체를 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (c) 상기 유전체가 교정된 원형질체를 재분화시켜 유전체 교정 재분화 식물체를 제조하는 단계;를 포함하는, 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
유전자 교정(gene editing)은 원하는 염기서열을 인식하여 절단하도록 만들어지는 인공제한효소로 동물 또는 식물 세포 내에서 정확히 원하는 유전체 염기서열을 정확히 절단하여 기존의 기술들에 비해 높은 효율로 유전체 상의 유전정보를 교정하는 분자도구이다. 실제로 유전자 교정 방법은 2002년 초파리에서 유전자 녹아웃(knock-out)을 위하였던 다양한 동물뿐만 아니라, 애기장대, 담배, 벼, 옥수수 등의 식물에서 매우 효율적인 유전정보 조작을 성공적으로 유도할 수 있음이 증명되었다. 이러한 유전자 교정이 성공적으로 이루어지기 위해서 목적 유전자를 특이적으로 목적하는 효율이 높으면서, 비특이적인 지역을 변화시키지 않는 유전자 교정 방법이 요구되고 있다.
크리스퍼 유전자 가위(RNA-guided engineered nuclease; RGEN)는 2013년 처음 개발된 이래, 비약적으로 발전하여 인간세포는 물론 가축, 곤충, 벼, 밀과 같은 식물세포, 병원균 등 다양한 종에 대하여 폭넓게 이용되고 있다. 이 방법은 박테리아가 외부 DNA의 침입을 막고자 형성한 크리스퍼 면역시스템을 유전자 가위로 차용한 것이다. 즉, 특정 유전자의 염기서열을 찾아가는 염기서열 조각을 제작해 절단 효소인 카스9(Cas9)과 짝을 이루게 되면, 짝을 이룬 크리스퍼 시스템은 표적이 되는 DNA 염기서열에 달라붙어 절단한다. 크리스퍼 유전자 가위는 현재까지 개발된 가위 중에서 가장 제작이 용이하고 저렴할 뿐 아니라 정확성과 효율성도 높은 것으로 확인되었다. 최근, 이러한 크리스퍼 유전자 가위를 세포에 도입하는데 있어 외부 DNA 삽입 없는(DNA-free) 가이드 RNA와 단백질 복합체(Ribonucleoprotein, RNP)로 전달하는 방법이 개발되었다.
한편, 배추는 김치의 주재료로서 한국의 4대 채소 가운데 하나이며 배추 속(Brassica)에 포함되어 있다. 배추 속(Brassica)에는 유채, 겨자 등 산업적 경제성이 우수한 작물이 포함되어 있어 외국에서도 중요한 작물이다. 그러나, 배추의 경우 원형질체 유래의 재분화가 어려운 작물 중에 하나로, 배추 원형질체로부터 형질전환된 배추 식물체를 제조하는 방법이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 (a) 배추(Brassica rapa spp. pekinensis)로부터 원형질체를 분리하는 단계; (b) 분리된 원형질체에 Cas9 단백질과 가이드 RNA 복합체를 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (c) 상기 유전체가 교정된 원형질체를 재분화시켜 유전체 교정 재분화 식물체를 제조하는 단계;를 포함하는, 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 배추 원형질체로부터 재분화된 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas9 단백질 복합체를 포함하는, 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 원형질체 유래 배추 재분화 및 RNP 이용 변이체를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 인위 돌연변이가 어려웠던 작물의 돌연변이체 개발을 통해 작물 고유의 생리 기작 연구가 가능해질 수 있음을 확인하고, 원형질체 유래의 재분화가 어려운 작물인 배추의 원형질체로부터 형질전환된 배추 식물체를 제조하는 방법을 개발함으로써, 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 재분화 식물체를 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, (a) 배추(Brassica rapa spp. pekinensis)로부터 원형질체를 분리하는 단계; (b) 분리된 원형질체에 Cas9 단백질과 가이드 RNA 복합체를 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및 (c) 상기 유전체가 교정된 원형질체를 재분화시켜 유전체 교정 재분화 식물체를 제조하는 단계;를 포함하는, 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 '배추(Brassica rapa spp. pekinensis)'는 쌍떡잎식물 십자화목 배추과 배추속의 두해살이풀로, 무에 비해 초라한 뿌리가 있고, 그 위로 거대한 꽃과 같은 형태로 잎이 뭉쳐진 형상을 띠고 있는 식물이다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 '원형질체(protoplast)'는 식물 세포에서 세포벽이 제거된 것을 의미하며, 상기 원형질체는 배추의 떡잎 또는 하배축 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 구체적으로는 5 내지 7일 자란 배추의 떡잎에서 유래된 것 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 배추로부터 원형질체를 분리하는 단계는 CPW 효소 용액을 첨가하여 작게 자르고, 25 내지 28℃ 암상태에서 60rpm으로 쉐이킹(shaking)한 후 3 내지 5시간 후에 원형질체를 추출하는 과정을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 'Cas9 단백질'은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제로 작용할 수 있는 단백질로서, RGEN(RNA-guided engineered nuclease)으로 명명되는 유전자 가위에 해당된다. 상기 Cas9 단백질은 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 이의 활성을 나타낼 수 있다. 상기 Cas9 단백질은 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 이중나선절단(double strand break, DSB)을 일으킨다. 상기 이중나선절단은 DNA의 이중 나선을 잘라 둔단(blunt end) 또는 점착종단(cohesive end)을 만드는 것을 모두 포함한다. DSB는 세포 내에서 상동재조합(homologous recombination) 또는 비상동재접합(non-homologous end-joining, NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선되는데 이 과정에 연구자가 원하는 변이를 표적 장소에 도입할 수 있다.
상기 'Cas9 단백질'은 스트렙토코커스 속(genus Streptococcus) 유래인 것일 수 있으며, 바람직하게는 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus Pyogenes) 유래인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 '가이드 RNA(guide RNA)'는 표적 유전자를 암호화하는 DNA 특이적인 RNA를 의미하며, 표적 서열과 전부 또는 일부 상보적으로 결합하여 Cas 단백질이 표적 서열을 절단할 수 있다. 통상적으로 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 포함하는 제1 부위 및 RNA-가이드 뉴클레아제와 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 단일-사슬 가이드 RNA(sgRNA) 형태를 말하나, RNA-가이드 뉴클레아제가 표적 서열에서 활성을 가질 수 있는 형태라면 제한 없이 본 발명의 범위에 포함될 수 있다. 일례로, 상기 가이드 RNA를 Cas9에 적용할 경우에는 crRNA 및 tracrRNA를 구성 요소로 포함하는 이중 RNA 형태 또는 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분이 융합된 형태인 단일-사슬 가이드 RNA(single-chain guide RNA; sgRNA) 형태일 수 있다. 상기 sgRNA는 표적 DNA 내 서열과 상보적인 서열을 가지는 부분 (이를 Spacer region, Target DNA recognition sequence, base pairing region 등으로도 명명함) 및 Cas 단백질 결합을 위한 헤어핀 (hairpin) 구조를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 DNA 내 서열과 전부 또는 일부 상보적인 서열을 가지는 부분, Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조 및 Terminator 서열을 포함할 수 있다. 상기 기술된 구조는 5'에서 3' 순으로 순차적으로 존재하는 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니며, 상기 가이드 RNA가 crRNA의 주요 부분 또는 표적 DNA의 전부 또는 일부 상보적인 부분을 포함하는 경우라면 어떠한 형태의 가이드 RNA도 본 발명에서 사용될 수 있다.
상기 가이드 RNA는 이에 제한되지 않으나, 분리된 RNA (naked RNA)의 형태일 수 있다. 가이드 RNA가 분리된 RNA의 형태로 세포 또는 유기체에 형질주입될 때, 당업계에 알려진 임의의 시험관 내 전사 시스템을 사용하여 가이드 RNA를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Cas 단백질 및 가이드 RNA를 직접 원형질체에 도입할 수 있다. 이를 통해 외래 DNA가 식물체 내에 도입되는 것을 최소화할 수 있어, GMO에 대한 우려를 막을 수 있다. 또한, 벡터를 사용하여 도입하는 경우 염색체에 벡터 DNA가 삽입되어 유전자 교정 이후에도 벡터 서열이 염색체에 남아 있어, 교배를 통해 따로 제거해 주어야 하는 어려움이 따르는 반면에, 원형질체를 이용한 RNA와 단백질 복합체를 직접 주입하는 경우 유전자 교정 이후 일정 시간이 지나 RNA와 단백질이 활성을 잃고 퇴화하게 되며, 교정된 식물체가 transgene-free 식물체가 되어 GMO 이슈 등을 피할 수 있다. 상기 Cas 단백질 및 가이드 RNA는 RNP(Ribonucleoprotein) 복합체 형태로 제조되어 원형질체에 도입될 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 'RNP(ribonucleoprotein)'는 리보핵산 단백질로, RNA와 단백질의 복합체를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 '표적 유전자'는 본 발명을 통해 교정하고자 하는 식물체의 유전체 내에 있는 일부 DNA를 의미한다. 즉, 원칙적으로 그 유전자의 종류에 제한되지 않으며, 코딩 영역 및 논코딩(non-coding) 영역을 모두 포함할 수 있다. 당업자는 그 목적에 따라, 제조하고자 하는 유전체 교정 식물체에 대하여 원하는 변이에 따라 상기 표적 유전자를 선별할 수 있으나, 구체적으로 본 발명에서의 표적 유전자는 BrGI(Brassica rapa GIGANTEA)-g1 또는 BrGI(Brassica rapa GIGANTEA)-g3일 수 있다. 상기 GIGANTEA(지잔티아) 유전자는 생체 리듬 유전자이며, 염 또는 건조 스트레스와 같은 환경 스트레스에 대한 저항성 기작에 관여한다.
본 발명에 있어서, (b) 단계에서 분리된 원형질체에 Cas9 단백질과 가이드 RNA를 도입하는 단계는 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), DEAE-덱스트란 처리, 리포펙션(lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입 및 PEG-매개 형질 주입 등과 같은 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로 본 발명에서는, 전기천공법(electroporation) 또는 PEG-매개 형질 주입 방법에 의해 전달되는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 PEG-매개 형질 주입은 원형질체를 30 내지 40%(w/v) 농도의 PEG4000 용액과 섞어준 후,25℃에서 5 내지 20분간 암배양하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 25℃에서 10분간 암배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이후, 4 내지 6℃에서 10 내지 20분동안 CPW 9M을 400μl, 800μl, 1500μl, 3000μl, 5000μl 순서대로 첨가하여 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 배양 배지를 첨가하여 20 내지 28℃에서 1 내지 2일간 암배양하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다. 상기 배양 배지는 K3 배지(medium)에 글루코오스(glucose), D-만니톨(D-mannitol), NAA(1-나프탈렌아세트산), BA(벤질아데닌) 및 2,4-D(2,4-디클로로페녹시아세트산)를 적절한 양으로 포함하고 있는 것일 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 20g, D-만니톨 70g, NAA 1mg, BA 1mg 및 2,4-D 0.25mg 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 전기천공법을 통한 형질 주입은 원형질체와 Cas9 단백질 및 가이드 RNA 복합체를 넣어 섞어준 후, 전기 충격을 주는 단계를 포함할 수 있다. 상기 전기 충격은 200V에서 2.5, 5, 7.5 또는 10초간 수행할 수 있으며, 이후 4 내지 6℃에서 40 내지 60분동안 안정화시키는 과정을 거친 후, 원심분리하여 상등액을 제거하고 배양배지를 첨가하여 1일 내지 2일간 암배양하는 단계를 포함할 수 있다. 또는, 전기천공 튜브(electroporation tube)에 섞어 준 원형질체와 RNP 복합체를 넣어 준 후, 전압을 0, 500, 750 또는 1000V로 설정하고 2 내지 10초동안 전기 천공할 수 있으며, 이후 전기천공 후의 세포를 배양배지에 희석하여 암배양하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 배양배지는 K3 배지(medium)에 글루코오스(glucose), D-만니톨(D-mannitol), NAA(1-나프탈렌아세트산), BA(벤질아데닌) 및 2,4-D(2,4-디클로로페녹시아세트산)를 적절한 양으로 포함하고 있는 것일 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 20g, D-만니톨 70g, NAA 0.2 내지 1mg, BA 1 내지 3mg 및 2,4-D 0.25mg 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 글루코오스 20g, D-만니톨 70g, NAA 1mg, BA 1mg 및 2,4-D 0.25mg 포함된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 유전체 교정은 유전자 제거(knock-out) 또는 유전자 낙인(knock-in)을 통해 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 재분화시키는 단계는, 1차 배양 배지에서 배양하는 단계; 2차 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 3차 배양 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 것일 수 있다. 상기 1차, 2차 및 3차 배양 배지에서 배양하는 단계는 유전자 교정된 원형질체를 배양하여 캘러스(callus)를 형성시키기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 용어 '캘러스(callus)'란, 탈분화 과정을 통하여 분화하지 않은 상태로 된 세포 또는 세포덩어리를 말하며, 줄기세포를 포함할 수 있다.
상기 1차 배양 배지, 2차 배양 배지 또는 3차 배양 배지는 액체 또는 고체 배지일 수 있으며, 고체 배지의 경우 Low-melting agarose를 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 상기 1차 배양 배지, 2차 배양 배지 또는 3차 배양 배지는 액체 배양 배지일 수 있다.
상기 1차 배양 배지는 K3 배지(medium)에 글루코오스(glucose), D-만니톨(D-mannitol), NAA(1-나프탈렌아세트산), BA(벤질아데닌) 및 2,4-D(2,4-디클로로페녹시아세트산)를 적절한 양으로 포함하고 있는 것일 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 20g, D-만니톨 70g, NAA 1mg, BA 1mg 및 2,4-D 0.25mg 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 2차 배양 배지는 K3 배지(medium)에 수크로오스(sucrose), D-만니톨(D-mannitol), NAA(1-나프탈렌아세트산) 및 BA(벤질아데닌)를 적절한 양으로 포함하고 있는 것일 수 있으며, 구체적으로는 수크로오스 20g, D-만니톨 40g, NAA 0.2 내지 1mg 및 BA 1 내지 3mg 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 수크로오스 20g, D-만니톨 40g, NAA 1mg 및 BA 1mg 포함된 것일 수 있다.
상기 3차 배양 배지는 K3 배지(medium)에 수크로오스(sucrose), NAA(1-나프탈렌아세트산), BA(벤질아데닌) 및 아데닌(Adenine)을 적절한 양으로 포함하고 있는 것일 수 있으며, 구체적으로는 수크로오스 20g, NAA 0.2 내지 1mg, BA 0.5 내지 3mg 및 아데닌 30mg 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 수크로오스 20g, NAA 1mg, BA 0.5mg 및 아데닌 30mg 포함된 것일 수 있다.
상기 1차 배양 배지에서의 배양은 2 주 내지 3주동안 진행되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 2주동안 진행되는 것일 수 있다. 또한, 1차 배지에서의 배양은 25℃에서 암배양으로 진행되는 것일 수 있다. 또한, 상기 2차 배양 배지에서의 배양은 2주 내지 3주동안 진행되는 것일 수 있으며, 암배양으로 진행되는 것일 수 있다. 상기 3차 배양 배지에서의 배양은 2주 내지 3주동안 암배양으로 진행되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 2주동안 진행되는 것일 수 있고, 캘러스(callus)가 커질 때까지 2주 내지 3주마다 3차 배양 배지를 첨가할 수 있다.
상기 (c) 단계의 3차 배양 배지에서 배양하는 단계 이후에, 슈트(shoot) 유도 배지로 옮겨 배양하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 '슈트'는 성숙한 식물체로 생장할 수 있는 능력을 지닌 캘러스로부터 유도된 초록색을 지닌 분화된 조직을 의미하며, 구체적으로, 3차 배양 배지에서 1mm 이상으로 자란 캘러스를 슈트 유도 배지로 옮겨 배양할 수 있다. 상기 슈트 유도 배지는 MS 배지(medium)에 수크로오스, NAA, BA 및 AgNO3를 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 수크로오스 30g, NAA 1mg, BA 1 내지 3mg 및 AgNO3 2 내지 10mg 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 수크로오스 30g, NAA 1mg, BA 3mg 및 AgNO3 2mg 포함된 것일 수 있다.
상기 슈트 유도 배지에서 배양하는 단계 이후에, 유도된 슈트(shoot)를 루팅(rooting) 배지로 옮겨 배양하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 루팅 배지는 MS 배지 또는 하이포넥스 배지에 수크로오스를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 수크로오스는 20g 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 본 발명의 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하는 방법에 의해 제조된 재분화된 식물체를 제공한다.
상기 '배추' 및 '원형질체'는 전술한 바와 같다.
본 발명의 원형질체로부터 재분화된 식물체는, 재분화되지 않은 식물체에 비교하여 생산성이 증진되고 대사산물의 함량이 증진된 것일 수 있으며, 고온, 염 또는 건조 저항성이 증진된 것일 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas9 단백질 복합체를 포함하는, 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 '표적 유전자', '가이드 RNA', 'Cas9 단백질', '배추' 및 '원형질체'는 전술한 바와 같다.
상기 재분화 식물체는 본 발명의 조성물에 기반한 표적화된 돌연변이에 의해 야기된 돌연변이를 갖는다. 상기 돌연변이는 결실, 삽입, 전좌, 역위 중 어느 하나일 수 있으며, 돌연변이의 위치는 상기 조성물의 가이드 RNA의 서열에 의존하는 것일 수 있다.
상기 표적 유전자는 BrGI(Brassica rapa GIGANTEA)-g1 또는 BrGI(Brassica rapa GIGANTEA)-g3인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하는 방법 및 조성물은 배추의 원형질체를 분리하여 유전자의 서열에 변이를 일으킨 후 완전한 식물체로 재분화시킴으로써 형질전환된 배추 식물체, 특히 생산성이 증진되고 대사산물의 함량이 증진되며, 고온, 염 또는 건조 저항성이 증진된 배추 식물체를 얻을 수 있으며, 인위 돌연변이가 어려운 작물의 돌연변이체 개발을 통해 작물 고유의 생리 기작 연구가 가능해질 수 있는 효과가 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 만드는 전체적인 과정을 나타낸 사진이다.
도 3은 분리된 원형질체에 GFP 벡터를 도입하여 활성을 확인하고 변이율을 검정한 결과이다.
도 4는 PEG 조건에 따른 유전자 변이율의 차이를 나타낸 결과이다.
도 5는 본 발명에서 가이드 RNA에 의한 지잔티아(GI) 유전자 서열의 변이를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 재분화된 지부 배추 품종의 서열 변이를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에서 재분화된 아시아종묘 배추 품종의 서열 변이를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 배추 원형질체의 분리
플레이트(plate) 당 25개의 배추 종자를 파종 후, 5 내지 7일 정도 자란 배추의 떡잎을 사용하였다. CPW 효소 용액 4ml에 떡잎을 2 플레이트 정도를 넣고 작게 잘랐다. 작게 자른 플레이트를 28℃ 암상태에서, 60rpm으로 쉐이킹(shaking)하고, 4시간 후에 원형질체(protoplast)를 추출하였다.
분리된 원형질체 혼합물을 50ml 튜브(tube)와 70μm 메쉬(mesh)를 사용하여 여과한 후, 100g, 10분, 4℃의 조건에서 원심분리(centrifuge) 하였다. 상등액을 파스츄어 피펫(pasteur pipette)으로 제거 후 CPW 9M 1ml을 첨가하여 풀어주었다. 15ml 튜브에 CPW 21S를 5ml 첨가한 후 상층에 CPM 9M으로 현탁한 용액을 파스츄어 피펫(pasteur pipette)으로 조심스럽게 올려주었다. 100g, 10분, 4℃의 조건에서 원심분리하고, 파스츄어 피펫으로 원형질체 층을 분리하여 50ml 튜브에 옮겼다.
분리한 원형질체에 CPW 9M을 30ml이 되도록 첨가하여 4℃에서 1시간동안 안정화시킨 후, 100g, 10분, 4℃의 조건에서 원심분리하고, 상등액을 파스츄어 피펫으로 제거 후 CPW 9M 1ml을 첨가하였다. 이후, 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 세포 밀도를 1Х106/ml이 되도록 CPW 9M으로 조정하였다.
실시예 2. 원형질체의 유전자 교정
2.1. PEG-매개 형질 주입
2ml 튜브에 1Х106/ml 농도의 원형질체 400μl를 넣고 Cas9 단백질 + 가이드 RNA 복합체(RNP) 30μg과 430μl PEG4000(30% 또는 40%) 용액(solution)을 넣은 후 섞어주고, 25℃에서 10분간 암배양하였다. 사용한 가이드 RNA의 서열은 하기 표 1의 서열에 나타난 바와 같다.
Target Sequence 서열번호
BrGI_g1 TCATCTGAGAGGTGGACCGATGG 1
BrGI_g2 CAGTTGAGGGATACTGATTACGG 2
BrGI_g3 ATTATCTCATGTCTCATCGATGG 3
BrGI_g4 GAATGACTATTCAGAGCAATGGG 4
BrGI_g5 GGTTTCCTTTCATGCTGTCCTGG 5
15ml 튜브로 옮겨준 후 4℃에서 20분동안 CPW 9M을 400μl, 800μl, 1500μl, 3000μl, 5000μl을 순서대로 넣어주었다. 이후, 100g, 10분, 4℃의 조건에서 원심분리하고, 상등액 제거 후 배양 배지 1을 2ml 넣고 25℃에서 1일간 암배양하였다. 배양 배지 1의 조성은 아래 표 2와 같다.
조성 첨가량
K3 배지 -
글루코오스 20g
D-만니톨 70g
NAA 1mg
BA 1mg
2,4-D 0.25mg
2.2. 전기천공법(Electroporation) 사용 - 1
1Х106/ml 농도의 원형질체 500μl와 Cas9 단백질 + 가이드 RNA 복합체를 30μl 넣어 섞어 준 후 큐벳(cuvette)에 넣어주었다. 전기 충격의 조건은 200V에서 각각 2.5, 5, 7.5, 10초간 수행하였고, 이후 4℃에서 30 내지 40분동안 안정화시켰다.
100g, 5분, 4℃의 조건에서 원심분리(centrifuge)한 후, 상등액을 제거하고 상기 표 2의 배양배지를 2ml를 넣어 1일간 암배양하였다.
2.3. 전기천공법(Electroporation) 사용 - 2
1Х106/ml 농도의 원형질체 500μl와 Cas9 단백질 + 가이드 RNA 복합체를 30μl 넣어 섞어주었다. 전기천공(electroporation) 기계에 전기천공 튜브(electroporation tube)를 끼워주고, 전기천공 버퍼(electroporation buffer)를 3ml 넣어주었다. 이후, 전기천공 피펫(electroporation pipette)에 전기천공 팁(electroporation tip)을 끼워주었다.
전기천공 피펫을 누른 상태에서 처음에 섞어 놓은 원형질체 100μl를 들어 올려 전기천공 튜브(electroporation tube)에 장착하였다. 전압(voltage)를 0, 500, 750, 1000V로 각각 설정하고 전기천공을 시작하였다. 전기천공 후 세포를 표 2의 배양 배지 1 2ml에 희석해서 암배양하였다.
실시예 3. 표적화 딥 시퀀싱(Targeted Deep Sequencing)
먼저, 분리된 원형질체에 PEG4000(30% 또는 40%) 용액을 이용하여 GFP 벡터를 접종하여, GFP 활성을 보이는 세포의 개수를 세어 접종율을 확인하였고, 그 결과 평균 22.59%의 접종율을 나타냄을 확인하였다(도 3).
이후, 제조한 각 gRNA의 서열변이 유도율을 확인하고자, 배추 원형질체에 PEG 조건별로 gRNA와 Cas9 단백질 복합체를 접종하여, 배추 원형질체에서 지잔티아(GIGANTEA, GI) 유전자를 교정하였고, 딥 시퀀싱(Deep Sequencing)을 통해 변이율(Indel ratio)을 검정하였다(도 4). 지잔티아 유전자의 변이율은 하기 표 3에 나타난 바와 같다.
　 Sample Total count Insertion Deletion Indel count Indel ratio(%)
BrGI_g1 control 38070 44 6 50 0.13%
g1_PEG30 36334 13432 776 14208 39.10%
g1_PEG40 36182 14108 628 14736 40.73%
BrGI_g3 control 34423 28 5 33 0.10%
g3_PEG30 37578 6349 1433 7782 20.71%
g3_PEG40 37983 8209 1482 9691 25.51%
5개의 gRNA 중 변이율이 가장 높은 2개(BrGI-g1과 BrGI-g3)를 선별하여 변이 서열을 분석하였다. 각각의 gRNA에 의한 GI 유전자 서열의 변이는 도 5에 나타난 바와 같다. g1의 gRNA를 처리한 배추 원형질체에서 지잔티아(GIGANTEA) 유전자의 32번째와 33번째 염기서열 사이에 T 또는 A가 삽입되는 것을 확인하였고, g3의 gRNA를 처리한 배추 원형질체에서 지잔티아(GIGANTEA) 유전자(서열번호 6)의 531번째와 532번째 염기 서열 사이에 T 또는 A가 삽입되었음을 확인하였다.
실시예 4. 원형질체 재분화
실시예 2에서 유전자 교정된 배추의 원형질체를 형질전환된 배추 식물체로 재분화하기 위해, 액체배양 배지 1에서 2주간 암배양하였다. 액체 배양 배지 1의 조성은 상기 표 2와 같다. 이후, 액체 배양 배지 2를 첨가한 후 2 내지 3주간 암배양하였다. 액체 배양 배지 2의 조성은 아래의 표 4와 같다.
조성 첨가량
K3 배지 -
수크로오스 20g
D-만니톨 40g
NAA 1mg
BA 1mg
암배양 후, 액체 배양 배지 3을 첨가 후 2주간 암배양 후, 캘러스가 커질 때까지 2주마다 액체 배양 배지 3을 교체 첨가하여 배양하였다. 액체 배양 배지 3의 조성은 아래 표 5와 같다.
조성 첨가량
K3 배지 -
수크로오스(Sucrose) 20g
NAA 1mg
BA 0.5mg
아데닌(Adenine) 30mg
1mm 이상 자란 캘러스를 슈트(shoot) 유도 배지로 옮겨 배양하였다. 슈트(shoot) 유도 배지의 조성은 하기 표 6과 같다.
조성 첨가량
MS 배지 -
수크로오스(Sucrose) 30g
NAA 1mg
BA 3mg
AgNO3 2-10mg
잘 자란 슈트(Shoot)는 루팅(Rooting) 배지로 옮겨 배양하였고, 이후 순화하였다. 루팅 배지의 조성은 하기 표 7과 같다.
조성 첨가량
하이포넥스 배지 -
수크로오스(Sucrose) 20g
실시예 5. 원형질체 유래 형질전환 식물체의 유전자 서열 변이 확인
실시예 4에 따라 재분화된 원형질체 유래 T0 배추의 서열의 변이를 확인하였다. 각각 지부배추, 아시아종묘 배추에서의 서열의 변이를 확인하였으며, 그 결과는 도 6 및 도 7에 나타난 바와 같다. 구체적으로, 배추에서 분리한 원형질체에서 BrGI-g1 및 BrGI-g3 유전자를 표적으로 RNP를 도입한 뒤 상기 유전체 교정된 원형질체를 재생시킨 결과, 완전히 재생된 식물체에서는 원형질체에서의 교정 빈도와 대비하여 더 높은 빈도로 교정 효율을 보이는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (15)

  1. (a) 배추(Brassica rapa spp. pekinensis)로부터 원형질체를 분리하는 단계;
    (b) 분리된 원형질체에 Cas9 단백질과 가이드 RNA 복합체를 도입하여 유전체를 교정하는 단계; 및
    (c) 상기 유전체가 교정된 원형질체를 재분화시켜 유전체 교정 재분화 식물체를 제조하는 단계;
    를 포함하는, 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 가이드 RNA는 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 것인, 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 표적 유전자는 BrGI(Brassica rapa GIGANTEA)-g1 또는 BrGI(Brassica rapa GIGANTEA)-g3인 것인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 유전체 교정은 유전자 제거(knock-out) 또는 유전자 낙인(knock-in)을 통해 수행되는 것인, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 Cas9 단백질은 스트렙토코커스 속(genus Streptococcus) 유래인 것인, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계의 재분화시켜 유전체 교정 재분화 식물체를 제조하는 단계는,
    1차 배양 배지에서 배양하는 단계;
    2차 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    3차 배양 배지에서 배양하는 단계;를 포함하는 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 1차 배양 배지는 글루코오스, D-만니톨, 나프탈렌아세트산(NAA), 벤질아데닌(BA) 및 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 2차 배양 배지는 수크로오스, D-만니톨, 나프탈렌아세트산(NAA) 및 벤질아데닌(BA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 3차 배양 배지는 수크로오스, 나프탈렌아세트산(NAA), 벤질아데닌(BA) 및 아데닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 3차 배양 배지에서 배양하는 단계 이후에, 슈트(shoot) 유도 배지로 옮겨 배양하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 슈트(shoot) 유도 배지는 수크로오스, NAA, BA 및 AgNO3로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 슈트(shoot) 유도 배지로 옮겨 배양하는 단계 이후에, 유도된 슈트(shoot)를 루팅(rooting) 배지로 옮겨 배양하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 배추 원형질체로부터 재분화된 식물체.
  14. 표적 유전자를 암호화하는 DNA에 특이적인 가이드 RNA 및 Cas9 단백질 복합체를 포함하는, 배추 원형질체로부터 재분화 식물체를 제조하기 위한 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 표적 유전자는 BrGI(Brassica rapa GIGANTEA)-g1 또는 BrGI(Brassica rapa GIGANTEA)-g3인 것인, 조성물.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190139756A (ko) * 2018-06-08 2019-12-18 충남대학교산학협력단 페튜니아 원형질체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 플라보노이드 생합성 유전자 교정세포를 배양하여 형질교정 재분화체를 유도하는 방법
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Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3001232C (en) 2015-10-06 2020-07-07 Institute For Basic Science Method for producing genome-engineered plants from plant protoplasts at high efficiency

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190139756A (ko) * 2018-06-08 2019-12-18 충남대학교산학협력단 페튜니아 원형질체에서 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 플라보노이드 생합성 유전자 교정세포를 배양하여 형질교정 재분화체를 유도하는 방법
KR20210152264A (ko) * 2020-06-08 2021-12-15 대한민국(농촌진흥청장) 지잔티아 유전자 교정용 가이드 rna 및 이의 용도

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAN JEUNG-SUL, MOO-KYEONG YOON. MIHYE JEONG: "Effects of a variety of treatments affecting Chinese cabbage protoplast culture, and plant regeneration from protoplast-derived callus", JOURNAL OF PLANT BIOTECHNOLOGY, KOREA SOCIETY OF PLANT TISSUE CULTURE, DAEJON, KR, vol. 35, no. 3, 1 January 2008 (2008-01-01), KR , pages 235 - 243, XP093179204, ISSN: 1229-2818 *
JEONG SO YOUNG; AHN HYOMIN; RYU JAHEE; OH YOUNGBIN; SIVANANDHAN GANESHAN; WON KANG-HEE; PARK YOUNG DOO; KIM JIN-SOO; KIM HYERAN; L: "Generation of early-flowering Chinese cabbage (spp.) through CRISPR/Cas9-mediated genome editing", PLANT BIOTECHNOLOGY REPORTS, SPRINGER JAPAN, JP, vol. 13, no. 5, 25 September 2019 (2019-09-25), JP , pages 491 - 499, XP036921898, ISSN: 1863-5466, DOI: 10.1007/s11816-019-00566-9 *
PARK SUNG-CHUL; PARK SUHYUN; JEONG YU JEONG; LEE SAET BUYL; PYUN JANG WON; KIM SOYOUNG; KIM TAE HEE; KIM SUK WEON; JEONG JAE CHEOL: "DNA-free mutagenesis ofinvar.using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes", PLANT BIOTECHNOLOGY REPORTS, SPRINGER JAPAN, JP, vol. 13, no. 5, 1 October 2019 (2019-10-01), JP , pages 483 - 489, XP036921918, ISSN: 1863-5466, DOI: 10.1007/s11816-019-00585-6 *

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