KR20200138762A - 항-cd27 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

항-cd27 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 의학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이의 의학적 용도를 제시한다. 구체적으로, 본 발명은 항-CD27 항체의 CDR 영역을 포함하는 인간 항체, 상기 인간 항-CD27 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물, 및 항암 약물로서 이의 용도를 제시한다. 특히, 본 발명은 인간 항-CD27 항체, 및 이의 CD27-매개 질환 또는 장애의 치료를 위한 약물의 제조에서의 용도를 제시한다.

Description

항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 의학적 용도
본원은 2018년 3월 28일자로 출원된 중국 특허 출원 제201810267050.4호를 우선권 주장하고, 이는 그 전체가 본원에 참조로 혼입된다.
본 발명은 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD27 항체의 CDR 영역을 포함하는 키메라성 항체 및 인간화된 항체, 및 인간 항-CD27 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물, 및 항암 약물로서의 이의 용도에 관한 것이다.
종양 면역치료는 항암 약물 분야의 오랜 관심사이다. 이는 종양 환자의 살해 T 세포가 종양을 사살하고 파괴하는데 완전하게 이용될 수 있게 하고 이를 촉발한다. 인체의 T 세포의 활성화는 2개의 신호 경로에 의한 시스템이다. T 세포에 전달되는 제1 신호로서 항원 제시 세포에 의해 제시된 NHC 항원 펩티 이외에도, 이는 제2 신호를 전달하는 일련의 공동자극성 분자도 요한다. 상기 경로 둘다는 통상적인 면역 반응이 촉발되게 할 수 있다.
T 세포와 항원 제시 세포간의 상호작용은 면역 반응을 촉발하도록 이끄는 다양한 보조 분자로 이루어지고, CD27이 이러한 분자 중 하나이다. CD27은 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 상과에 속하고 T 세포 표면의 CD70에 결합한다. CD27은 글리코실화된 I형 막통과 단백질이고, 통상적으로 다이설파이드 가교에 의해 연결된 동종이량체이다. 다이설파이드 가교는 세포외 도메인의 세포막 근처에 위치한다(문헌[Camerini et al., J Immunol. 147: 3165-69, 1991]). T 세포에서, 가교연결된 CD27 항원은 상승효과적인 자극 신호를 제공할 수 있고, T 세포 수용체와 가교연결될 때, T 세포 증식 및 세포 면역 활성화를 유도할 수 있다.
CD27은 성숙한 흉선세포, 대부분의 CD4+ 및 CD8+ 외부 혈액 T 세포, 자연 살해 세포 및 B 세포에 발현되고, B 세포 비호지킨 림프종 및 B 세포 만성 림프구성 백혈병에도 발현되는데, 기생충 및 거대세포바이러스(CMV) 등의 감염, 다발성 경화증, 사르코이드증 및 B 세포 만성 림프구성 백혈병에서, 증가된 수준의 CD27 가용성 CD27 단백질이 혈청 또는 질환의 활성 부위에서도 관찰되었다(문헌[Kobata T et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 (24): 11249-53]; 및 문헌[Ranheim EA et al., Blood. 1995 85 (12): 3556-65; Loenen WA et al., Eur. J. Immunol. 1992 22: 447]).
항-CD27 단클론 항체 작용제가 T 세포 반응을 촉진하고 유망한 항암 치료제로서 사용될 수 있음이 최근 연구에서 밝혀졌다(WO 2008/051424, WO 2011/130434 및 PCT/CN2017/103842 참고). 지금까지의 연구 결과는 CD27이 면역치료에 유용한 표적임을 확인하였지만, 치료에 특히 유익한 항-CD27 단클론 항체의 특이성 특징은 밝혀져야 할 것으로 남아있다. 당업계에서, 항-CD27 단클론 항체의 어느 특이적 기능성이 치료 효과가 있는지를 더욱 이해함으로써 질환을 예방 및 치료하는데 더 효과적인 유망하고 향상된 항-CD27 항체를 수득할 필요성이 여전히 존재한다.
현재, 다수의 다국적 기업들이 CD27 표정에 대한 종양 항체 약물을 개발해 왔다. 미국의 셀덱스(Celldex)로부터의 항-CD27 항체는 이미 II상 임상 시험 중이고, 메르크(Merck), 아듀로(Aduro) 및 아포제닉스(Apogenix)와 같은 기업들로부터의 관련 제품은 여전이 전임상 개발 중에 있다.
따라서, 당업계에서, 높은 친화도, 높은 선택성, 높은 생물학적 활성 및 높은 안정성, 및 목적하는 유익한 치료 효과와 상호연관될 수 있는 특이적 기능성을 갖는 항-CD27 항체를 제공할 필요가 있다.
본 발명의 일부 양태는 경쇄 가변부 및 중쇄 가변부를 포함하는 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하되, 상기 항체의 경쇄 가변부는 서열번호 6에 제시된 LCDR1, 서열번호 7에 제시된 LCDR2 및/또는 서열번호 8에 제시된 LCDR3의 아미노산 서열을 포함하고/거나; 상기 항체의 중쇄 가변부는 서열번호 3에 제시된 HCDR1, 서열번호 4에 제시된 HCDR2 및/또는 서열번호 5에 제시된 HCDR3의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 양태는 경쇄 가변부 및 중쇄 가변부를 포함하는 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하되, 상기 항체의 경쇄 가변부는 서열번호 6에 제시된 LCDR1, 서열번호 7에 제시된 LCDR2 및 서열번호 8에 제시된 LCDR3의 아미노산 서열을 포함하고/거나; 상기 항체의 중쇄 가변부는 서열번호 3에 제시된 HCDR1, 서열번호 4에 제시된 HCDR2 및 서열번호 5에 제시된 HCDR3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양태에서, 상기 정의된 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 쥐(murine) 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 또는 이의 단편이다.
일부 양태에서, 상기 정의된 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 생식세포계열 경쇄 가변부의 Vκ1 서열의 골격체부(framework region) 또는 이의 유도체 서열을 포함하고, 하나 이상의 양태에서, 경쇄 가변부의 골격체부는 Vκ1-12 서열로부터 유도되고/거나, 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 생식세포계열 중쇄 가변부의 VH3 서열의 골격체부 또는 이의 유도체 서열을 포함하고, 하나 이상의 양태에서, 중쇄 가변부 서열의 골격체부는 VH3-74 서열로부터 유도된다.
일부 양태에서, 상기 정의된 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 가변부의 VH3 서열의 골격체부 서열에서 카밧(Kabat)에 따른 위치 73에서의 아스파라긴은 트레오닌으로 치환된다.
일부 양태에서, 상기 정의된 인간화된 항체는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변부를 포함하고, 항원 결합 단편은 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및/또는 (Fab')2 단편이다. 하나 이상의 양태에서, 인간화된 항체의 중쇄는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄 불변부를 포함한다.
일부 양태에서, 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 2에 제시되어 있거나, 서열번호 2와 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 일치성을 갖고/거나, 중쇄 가변부의 아미노산 서열은 서열번호 1 또는 11에 제시되어 있거나, 서열번호 1 또는 11과 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 일치성을 갖는다. 하나 이상의 양태에서, 상기 정의된 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄의 아미노산 서열은 서열번호 9에 제시되어 있거나, 서열번호 9와 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 일치성을 갖고/거나, 상기 정의된 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 10 또는 12에 제시되어 있거나, 서열번호 10 또는 12와 적어도 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 일치성을 갖는다.
일부 양태에서, 본 발명은 경쇄 가변부 및 중쇄 가변부를 포함하는 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제시하되, 상기 항체의 경쇄 가변부는 서열번호 6에 제시된 LCDR1, 서열번호 7에 제시된 LCDR2 및 서열번호 8에 제시된 LCDR3을 포함한다. 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 생식세포계열 경쇄 가변부의 Vκ1 서열의 골격체부를 포함하되, 상기 항체의 중쇄 가변부는 서열번호 3에 제시된 HCDR1, 서열번호 4에 제시된 HCDR2 및 서열번호 5에 제시된 HCDR3, 및 인간 생식세포계열 중쇄 가변부의 VH3의 골격체부를 포함한다.
하나 이상의 양태에서, 항-CD27 항체의 경쇄 가변부의 골격체부는 Vκ1-12 서열로부터 유도되는 골격체부로부터 선택되고, 중쇄 가변부의 골격체부는 VH3-74 서열로부터 유도되는 골격체부로부터 선택된다.
인간 생식세포계열 VH3-74(IMGT접근번호 IGHV3-74*01을 가짐)의 서열은 하기와 같이 제시된다:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLVWVSRINSDGSSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열번호 13).
인간 생식세포계열 Vκ1-12(IMGT접근번호 IGKV1-12*01을 가짐)의 서열은 하기와 같이 제시된다:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP(서열번호 14).
하나 이상의 양태에서, 항체의 중쇄 가변부의 VH3 서열의 골격체부 서열에서 카밧에 따른 위치 73에서 아스파라긴(Asn)은 트레오닌(Thr)으로 치환된다.
하나 이상의 양태에서, 항체-CD27 항체의 경쇄 가변부의 서열은 서열번호 1이고, 중쇄 가변부의 서열은 서열번호 11이다.
하나 이상의 양태에서, 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 항체 또는 이의 단편이다.
하나 이상의 양태에서, 항-CD27 항체의 경쇄 서열은 서열번호 9이고, 항체의 중쇄 서열은 서열번호 12이다.
일부 양태에서, 본 발명은 경쇄 가변부 및 중쇄 가변부를 포함하는 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제시하되, 상기 항체의 경쇄 가변부의 서열은 서열번호 1이고, 상기 항체의 중쇄 가변부의 서열은 서열번호 11이다.
하나 이상의 양태에서, 항-CD27 항체의 경쇄 서열은 서열번호 9이고, 항체 중쇄 서열은 서열번호 11이다.
일부 양태에서, CD27에 대해 상기 정의된 단클론 항체 또는 항원 결합 단편과 경쟁할 수 있는 단리된 단클론 항체 또는 항원 결합 단편이 제시된다.
일부 양태에서, 상기 정의된 경쇄 가변부 및 중쇄 가변부를 포함하는 다중 특이성 항체가 제시된다.
일부 양태에서, 상기 정의된 경쇄 가변부 및 중쇄 가변부를 포함하는 단일쇄 항체가 제시된다.
일부 양태에서, 상기 정의된 경쇄 가변부 및 중쇄 가변부를 포함하는 항체-약물 접합체가 제시된다. 항-약물 접합체는 당업게에 주지되어 있고, 항체-링커(linker)-약물(독소)의 상호연결에 의해 형성된다. 기지의 링커는 절단 링커 및 비절단 링커를 포함한다. 예컨대, 링커는 비한정적으로 SMCC 및 SPDP 등을 포함하고, 독소는 당업계에 주지되어 있는 것, 예컨대 DM1, DM4, MMAE 및 MMAF 등이다.
일부 양태에서, 상기 정의된 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 핵산이 제시된다.
일부 양태에서, 상기 정의된 핵산을 함유하는 발현 벡터가 제시된다.
일부 양태에서, 상기 정의된 발현 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포가 제시된다.
하나 이상의 양태에서, 상기 정의된 숙주 세포는 박테리아, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다.
하나 이상의 양태에서, 상기 정의된 숙주 세포는 효모, 바람직하게는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)이다.
하나 이상의 양태에서, 상기 정의된 숙주 세포는 포유동물 세포, 바람직하게는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 인간 배아 신장(HEK) 293 세포이다.
일부 양태에서, 상기 정의된 숙주 세포에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계 및 상기 숙주 세포로부터 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리하는 단계를 포함하는, 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법이 제시된다.
일부 양태에서, 상기 정의된 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 단편을 포함하는 약학 조성물이 제시된다.
일부 양태에서, CD27-매개 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 상기 정의된 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 이를 포함하는 약학 조성물의 용도가 제시되되, 정의된 질환은 바람직하게는 암 또는 자가면역 질환, 보다 바람직하게는 CD27 발현을 갖는 암 또는 자가면역 질환이고, 암은 가장 바람직하게는 직장암, 뇌암, 신장암, 폐암, 간암, 다발성 육종 및 흑색종이고, 자가면역 질환은 가장 바람직하게는 자가면역성 뇌척수염, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증 및 류마티스성 관절염이다.
일부 양태에서, CD27-매개 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방 방법이 제시되되, 상기 방법은 치료학적 효과량의 상기 정의된 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 정의된 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물을 필요 환자에게 투여하는 단계를 포함하고, 상기 질환은 가장 바람직하게는 직장암, 뇌암, 신장암, 폐암, 간암, 다발성 육종 및 흑색종이고, 자가면역 질환은 가장 바람직하게는 자가면역성 뇌척수염, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증 및 류마티스성 관절염이다.
도 1은 mAb077의 산성 성분 및 주요 피크(peak) 성분의 탈아미드화가 크로마토그래피-질량 스펙트럼분석에 의해 확인됨을 도시한 것이다. 경과는 산성 성분이 74번째 아미노산 아스파라긴(Asn)을 주로 탈아미드화하였고 반응 비가 59.6%에 도달했음을 나타냈다.
도 2는 돌연변이 전 mAb077 및 돌연변이 후 077N74T의 산-염기 피크 분포 상태가 SEC-HPLC 방법에 의해 확인됨을 도시한 것이다. mAb077에서 산성 피크는 주요 피크 전 29분에 용리하였다.
도 3은 40℃의 열 처리로 1개월 후, 077N74T 산-염기 등전점 성분의 분포 및 이의 초기 상태에 대한 전하를 ICE를 사용하여 측정함을 도시한 것이다.
도 4는 상이한 농도의 항-CD27 항체(돌연변이 전/후 분자) 또는 헤르셉틴(Herceptin, 참조로서 사용)을 사용하여 인간 혈액 PBMC 증식의 기능적 강도를 자극함을 도시한 것이다.
도 5는 종양 접종 후 일수에 대해 대조군(control) 인간 IgG1 항체 또는 다양한 항-CD27 항체로 처리된 마우스(mouse)에서 인간 라지(Raji) 이식 림프종의 종양 크기(mm3으로서 표시됨)를 도시한 것이다. 오차는 표준 오차를 표시한다.
도 6은 대조군 인간 IgG1 항체 또는 다양한 항-CD27 항체로 처리된 마우스의 체중 변화(g으로 표시됨)를 도시한 것이다. 오차는 표준 오차를 표시한다.
1. 정의
일부 기술적 및 과학적 용어는 구체적으로 하기에 정의된다. 본 문서에 달리 명확히 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 3문자 아미노산 코드 및 단일-문자 코드는 문헌[J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968)]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 면역글로불린을 지칭하고, 이는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄를 쇄간 디설파이드 결합에 의해 연결시킴으로써 형성되는 테트라펩티드 쇄 구조물이다. 면역글로불린의 중쇄 불변부가 아미노산의 상이한 조성 및 순서를 가지므로, 상이한 면역글로불린의 항원성은 상이하다. 따라서, 면역글로불린은 5가지 부류로 분류되거나, 면역글로불린의 이소타입, 즉 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로서 지칭되고, 이의 상응하는 중쇄는 각각 μ 쇄, δ 쇄, γ 쇄, α 쇄 및 ε 쇄이다. 동일한 타입의 Ig는 힌지 영역의 아미노산 조성 및 중쇄 디설파이드 결합의 수 및 위치에 따라 상이한 하위부류로 나눠질 수 있다. 예를 들면, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 분류될 수 있다. 경쇄는 불변부에서의 차이에 따라 κ 쇄 또는 λ 쇄로서 분류될 수 있다. Ig의 5가지 각각의 부류는 κ 쇄 또는 λ 쇄를 가질 수 있다.
항체 경쇄는 인간 또는 뮤린 κ, λ 쇄 또는 이의 변형체를 포함하는 경쇄 불변부를 추가로 포함할 수 있다.
항체 중쇄는 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변형체를 포함하는 중쇄 불변부를 추가로 포함할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 근접한 아미노산으로 구성된 가변부(V 영역)는 그의 아미노산 서열에 있어서 상당히 다르다. 항체의 C-말단에 근접한 나머지 아미노산 서열로 구성된 불변부(C 영역)은 상대적으로 안정하다. 경쇄 및 중쇄의 가변부는 약 110개의 아미노산으로 구성되고, 일부 영역, 예컨대 경쇄의 위치 24-34, 50-56, 89-97 및 중쇄의 위치 31-35, 50-65, 95-102에서 아미노산 잔기의 변화는 가변부의 다른 부분보다 빈번하다. 이러한 영역은 초가변부(HVR)로 지칭된다. 초가변부는 항체 및 에피토프가 직접적으로 접촉하는 부분임에 기인하여, 상보성부(CDR)로도 지칭된다. 가변부의 비초가변부는 아미노산 조성 및 서열에 있어서 비교적 더 적은 변화를 갖고, 이러한 아미노산 잔기는 가변부의 안정한 3차원 구조, 즉 골격체 구조 또는 골격체부(FR)를 이룬다. 가변부는 3개의 초가변부(HVR) 및 비교적 보존적인 서열을 갖는 4개의 골격체부(FR)를 갖는다. 각각의 경쇄 가변부(VL) 및 중쇄 가변부(VH)는 3개의 CDR부 및 4개의 FR부로 구성된다. 아미노 말단으로부터 카복시 말단에 이르는 상기 영역들의 순서는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4이다. 경쇄의 3개의 CDR부는 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고, 중쇄의 3개의 CDR부는 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다. 카밧 데이터베이스에 따라, 항체 분자의 각가의 영역의 아미노산 개수는 하기 표 A와 같다.
[표 A]
Figure pct00001
본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편의 VL 및 VH의 CDR 아미노산 잔기의 개수 및 위치는 공지된 카밧 번호부여 기준에 의해 함축된다.
본 개시에서, 시험관내 파지미드 디스플레이 시스템을 인간 CD27 항원을 표적화하는 인간 항체 단편을 선별하는데 사용하였고, 일련의 항-CD27 항체를 상기 선별을 통해 동정하되, 서열번호 1의 중쇄 가변부 및 서열번호 2의 경쇄 가변부를 심화 연구를 위해 선택하였다. 이 중, 서열번호 1의 서열은 VH3-74 생식세포계열 서열에 가장 유사한 VH3 과로부터 유도한 것이다. 서열번호 2의 서열은 Vκ1-12 생식세포계열 서열에 가장 유사한 Vκ1 과로부터 유도한 것이다.
VH3 과는 인간 VH 생식세포계열의 성분의 일부이다. VH 생식세포계열의 성분은 뉴클레오티드 서열의 상동성을 기준으로 7개의 과, 즉 VH1 내지 VH7로 구분될 수 있다(문헌[Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798] 및 문헌[Cook et al. (1995) Immunology Today, 16, 237-242]). 임의의 인간 VH3 생식세포계열 항체 서열에 있어서, 아미노산 서열 동일성은 전체 VH3 과에서 가장 높다(예컨대 문헌[Tomlinson et al. (1992) J. Mol. Biol., 227, 776-798] 및 문헌[Cook et al. (1995) lmmunology Today, 16, 237-242)] 참고). 임의의 2개의 VH3 과 생식세포계열 VH 서열간의 아미노산 서열 동일성은 100개의 VH 잔기 중 69 내지 98개 잔기로 상이하다(즉 임의의 2개의 생식세포계열 VH 서열간의 상동성이 69 내지 98%임). 대부분의 생식세포계열 서열 쌍의 경우, 100개의 아미노산 잔기 중 80% 이상 동일한 아미노산 잔기가 존재한다(즉 80% 이상의 아미노산 서열 상동성).
Vκ1 과는 인간 Vκ 생식세포계열의 모든 성분의 일부이다. Vκ 생식세포계열의 모든 성분은 뉴클레오티드 서열의 상동성을 기준으로 7개의 과, 즉 Vκ1 내지 Vκ7로 구분될 수 있다(문헌[Enrique et al. (1997) Int Immunol. Dec;9 (12):1801-15]). 대부분의 생식세포계열 서열 쌍의 경우, Vκ1 과 생식세포계열의 Vκ 서열간 80% 이상의 아미노산 서열 상동성이 존재한다.
VH3 과 서열간의 높은 아미노산 서열 유사성 및 구조적 유사성을 기준으로, 당업자는 쇄 셔플링(chain shuffling) 기술(문헌[Winter et al. (1994) Annual Rev. lmmunol., 12, 433-55])을 사용하거나 설치류 항체 또는 기타 인간 항체의 CDR(본 발명의 항체의 CDR 포함)을 VH3 과의 골격체부에 이식하고 이와 짝이 되기에 적합한 VL을 선택할 수 있다. 유사하게, Vκ1 과 서열도 높은 아미노산 서열 유사성 및 구조적 유사서을 공유하고, 당업자는 쇄 셔플링 기술(문헌[Winter et al. (1994) Annual Rev. lmmunol., 12, 433-55])을 사용하거나 설치류 항체 또는 기타 인간 항체의 CDR(본 발명의 항체의 CDR 포함)을 Vκ 과의 골격체부에 이식하고 이와 짝이 되기에 적합한 VH를 선택할 수 있다
용어 "항원 제시 세포" 또는 "APC"는 그의 표면 상에서 MHC와 복합체화되는 외래 항원을 나타내는 세포이다. T 세포는 T 세포 수용체(TCR)를 통해 이러한 복합체를 인식한다. APC의 예로는, 수지상 세포(DC), 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell), 단핵구, B 림프아구, 및 단핵구-유래된 수지상 세포(DC)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 용어 "항원 제시"는, APC가 항원을 포획하여, 이를, 예를 들면 MHC-I/MHC-II 접합체(conjugate)의 성분으로서 T 세포에 의해 인식될 수 있도록 하는 과정을 지칭한다.
용어 "CD27"은 TNF 수용체 상과의 구성원인 세포 표면 수용체를 지칭한다. CD27은 T 세포 면역력의 생산 및 장기적 유지를 위해 필요한 분자이고, B 세포 활성화 및 면역글로불린 합성을 조절하는데 주요한 역할을 한다. 용어 "CD27"은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 CD27의 임의의 변형체 또는 이소형(isoform)(예컨대 진뱅크(GENBANK)에 접근번호 AAH12160.1로 등록된 인간 CD27)을 포함한다. 본 발명의 항체는 인간 이외의 종들로부터의 CD27과 교차-반응성일 수 있다. 다르게는, 항체는 인간 CD27-특이적일 수 있고, 다른 종들과 교차-반응성을 나타내지 않을 수 있다. CD27, 또는 이의 변형체 또는 이소형은, 이들이 자연적으로 발현되는 세포 또는 조직으로부터 단리되거나, 또는 당분야에 통상적이고 본원에 기재된 기법을 사용하는 재조합 기법에 의해 생산될 수 있다. 바람직하게는 항-CD27 항체는 정상적 글리코실화 패턴을 갖는 인간 CD27을 표적화한다.
용어 "인간 항체"는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열의 가변성 및 불변부를 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 자리-특이적 돌연변이생성 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 그러나, 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 생식세포계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격체 서열 상으로 그래프팅되어진 항체(즉, "인간화된 항체")를 포함하지 않는다.
CDR-그래프팅된 항체로도 공지된, 용어 "인간화된 항체"는 뮤린의 CDR 서열을 인간 항체 가변부의 골격체내로 그래프팅함으로써 생산된 항체를 지칭한다. 이는 다량의 마우스 단백질 성분을 운반하는 키메라성 항체에 의해 유도된 강한 면역 반응을 극복할 수 있다. 면역원성을 감소시킴으로써 야기된 활성의 감소를 방지하기 위해, 인간 항체 가변부는 최소한으로 역 돌연변이되어 활성을 유지할 수 있다.
용어 "키메라성 항체"는 뮤린 항체의 가변부를 인간 항체의 불변부과 융합시킴으로써 형성되는 항체이고, 이는 뮤린 항체에 의해 유도되는 면역 반응을 완화시킬 수 있다. 키메라성 항체를 작성하기 위해, 우선 뮤린-특이적 단일클론성 항체를 분비하는 하이브리도마가 작성되어 분비되고, 이어서 가변부 유전자가 뮤린 하이브리도마 세포로부터 클로닝된다. 후속적으로, 필요할 경우 인간 항체의 불변부 유전자가 클로닝된다. 뮤린 가변부 유전자 및 인간 불변부 유전자는 키메라성 유전자에 결찰되고, 이어서 인간 벡터내로 삽입되며, 최종적으로 키메라성 항체 분자가 진핵 또는 원핵의 산업용 시스템에서 발현된다. 인간 항체의 불변부는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 또는 이의 변형체의 중쇄 불변부으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 인간 IgG1 또는 IgG2를 포함하거나, 아미노산 돌연변이 후 ADCC(항체 의존적 세포 매개 세포독성) 독성이 없는 IgG1의 중쇄 불변부로부터 선택된다.
"항원 결합 단편"은 서열번호 3 내지 8로부터 선택되는 본 발명의 항체의 하나 이상의 CDR을 포함하고 항원 결합 활성을 갖는, 인간 CD27에 결합하는 Fv 단편의 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편 및 sFv 단편을 지칭한다. Fv 단편은 항체의 중쇄 가변부 및 경쇄 가변부를 포함하는 가장 최소의 항체 단편이고, 불변부를 갖지 않고, 모든 항원 결합 부위를 갖는다. 일반적으로, Fv 항체는 VH와 VL 도메인들간의 폴리펩티드 링커을 포함하고, 항원 결합에 요하는 구조로부터 형성될 수 있다. 상이한 링커는 항체(단일쇄 항체 또는 단일쇄 Fv(sFv)로 지칭됨)의 2개의 가변부를 폴리펩티드 쇄로 연결하는데 사용될 수 있다. 본원에서 용어 "CD27에 결합하는"은 인간 CD27과 상호작용하는 능력을 지칭한다. 본 발명의 용어 "항원 결합 부위"는 본 발명의 항체 도는 항원 결합 단편에 의해 인식되는 항원 상의 차별화된 3차원적 부위를 지칭한다.
용어 "다중특이성 항체"는 가장 넓은 의미로 사용되어 다중-에피토프 특이성을 갖는 항체를 포괄한다. 이들 다중특이성 항체로는, 중쇄 가변부(VH) 및 경쇄 가변부(VL)를 포함하는 항체(여기서 VH-VL 유닛은 다중-에피토프 특이성을 가짐); 2개 이상의 VL 및 VH 영역을 갖고, 각각의 VH-VL 유닛이 상이한 표적 또는 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합하는 항체; 2개 이상의 가변부를 갖고, 각각의 단일 가변부가 상이한 표적 또는 동일한 표적의 상이한 에피토프에 결합하는 항체; 전장 항체, 항체 단편, 다이아바디(diabody), 이중특이성 다이아바디 및 트라이아바디(tirabody), 공유적으로 또는 비-공유적으로 함께 연결된 항체 단편 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "항체-약물 접합체(ADC)"는 1개 이상의 이종성의 화학적으로 합성된 분자에 접합된 항체 또는 항체 단편을 지칭하고, 세포독성제에 접합된 항체 또는 항체 단편이 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "단일 쇄 항체"는 항체의 중쇄 가변부(VH) 및 경쇄 가변부(VL)를 연결기 펩티드를 통해 연결시킴으로써 형성되는 단일 쇄 재조합 단백질이고, 이는 완전한 항원 결합 자리를 갖는 가장 작은 항체 단편이다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체에 특이적으로 결합하는 항원 상에서의 자리를 지칭한다. 에피토프는 인접한 아미노산, 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비-인접한 아미노산에 의해 형성될 수 있다. 인접한 아미노산에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출된 후 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리 이후 손실된다. 에피토프는 전형적으로 특유의 공간적 입체배열에서 적어도 3 내지 15개의 아미노산을 포함한다. 주어진 항체에 의해 어떤 에피토프가 결합되는지를 결정하는 방법은 당분야에 주지되어 있고, 면역블로팅(immunoblotting) 및 면역침전 검정 등이 포함된다. 에피토프의 공간적 입체배좌를 결정하는 방법은 당분야의 기법 및 본원에 기재된 기법을 포함하고, 예컨대 X-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명이다.
용어 "특이적으로 결합하는" 또는 "선택적으로 결합하는"은 예정된 항원 상의 에피토프로의 항체의 결합을 지칭한다. 전형적으로, 재조합 인간 CD27이 피분석물로서 사용되고 항체가 리간드로서 사용되는 경우, 항체는 기기에서 표면 플라스몬 공명(SPR: surface plasmon resonance) 기법으로 측정될 경우 약 10-7 M 이하의 평형 해리 상수(KD)에 의해 예정된 항원에 결합하고, 예정된 항원으로의 결합에 대한 그의 친화도는 예정된 항원 또는 가깝게 관련된 항원 이외의 비-특이적 항원(예컨대 BSA 등)으로의 결합에 대한 그의 친화도의 적어도 2배이다. 용어 "항원을 인식하는 항체"는 본원에서 용어 "특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
용어 "경쟁적 결합"은 인간 CD27의 세포외 영역에서 본 발명의 단클론 항체와 동일한 에피토프(항원 결정인자로도 지칭됨) 또는 동일한 에피토프의 부분을 인식하고 항원에 결합하는 항체를 지칭한다. 본 발명의 단클론 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 본 발명의 단클론 항체에 의해 인식되는 인간 CD27의 아미노산 서열을 인식하고 이에 결합하는 항체를 지칭한다.
용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 지칭한다. 헥산 분자는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있되, 바람직하게는 이중가닥 DNA이다. 핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적인 관계에 놓일 때 "작용적으로 연결"된다. 예컨대, 프로모터 또는 인핸서가 암호화 서열의 전사에 영향을 주는 경우, 상기 프로모터 또는 인핸서는 상기 암호화 서열에 작용적으로 연결된 것이다.
용어 "교차-반응"은 상이한 종들로부터의 CD27에 결합하는 본 발명의 항체의 능력을 지칭한다. 예를 들면, 인간 CD27에 결합하는 본 발명의 항체는 또 다른 종들의 CD27에도 결합할 수 있다. 교차-반응성은 결합 검정(예를 들어, SPR 및 ELISA)에서 항체와 정제된 항원의 특이적 반응성, 또는 CD27을 생리학적으로 발현하는 세포와 항체의 결합 또는 기능적 상호작용을 검출함으로써 측정된다. 교차-반응성을 결정하기 위한 방법은, 본원에 기재된 바와 같은 표준 결합 검정, 예컨대 표면 플라스몬 공명(SPR) 검정, 또는 유세포 분석을 포함한다.
용어 "저해" 또는 "차단"은 상호교환적으로 사용되고, 부분적 및 완전한 저해/차단을 포괄한다. CD70의 저해/차단은 바람직하게는 저해 또는 차단없는 CD70 결합의 활성의 정상적 수준 또는 유형을 감소시키거나 변경시킨다. 또한 저해 및 차단은, 항-CD27 항체와 접촉되지 않은 CD70과 비교하여, 항-CD27 항체와 접촉될 경우 리간드 결합 친화도에 있어서 임의의 측정가능한 감소를 포함하고자 한다.
용어 "성장의 저해"(예를 들어, 세포 포함)는 세포 성장에 있어서 임의의 측정가능한 감소를 포함하고자 한다.
용어 "면역 반응을 유도하는" 및 "면역 반응을 증진시키는"은 상호교환적으로 사용될 수 있고, 특별한 항원에 대한 면역 반응의 자극(즉, 수동적 또는 순응적자극)을 지칭한다. CDC 또는 ADCC를 유도하는데 특정적인 용어 "유도하는"은 특이적인 직접 세포 살해 기작을 자극함을 지칭한다.
"ADCC", 즉 항체-의존성 세포-매개된 세포독성은, Fc 수용체를 발현하는 세포가 항체의 Fc 단편을 인식함으로써 항체에 의해 코팅된 표적 세포를 직접 살해함을 의미한다. 항체의 ADCC 효과자 작용은 IgG 상의 Fc 단편의 변형에 의해 감소되거나 제거될 수 있다. 이러한 변형은 항체의 중쇄 불변부에서의 돌연변이, 예컨대 IgG1의 N297A, L234A, L235A; IgG2/4 키메라, IgG4의 F235E, 및 L234A/E235A 돌연변이로 구성된 군에서 선택된 돌연변이를 포함한다.
항체 및 항원 결합 단편을 생산하고 정제하는 방법은 주지되어 있고, 선행 기술, 예컨대 문헌[Using Antibodies: A Laboratory Manual, Chapters 5-8 and 15, Cold Spring Harbor]에서 찾아볼 수 있다. 예를 들면, 마우스는 인간 CD40 또는 이의 단편에 의해 면역화되고, 생성된 항체는 통상적인 방법에 의해 재생되고, 정제되며, 아미노산 서열분석될 수 있다. 항원 결합 단편은 또한 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편은 유전자 조작되어 하나 이상의 인간 FR 영역을 인간 이외의 CDR 영역에 도입할 수 있다. 인간 생식계열 FR 서열은 다음과 같은 이뮤노제네틱스(IMGT: ImMunoGeneTics)의 웹사이트: http://imgt.cines.fr, 또는 문헌[The Immunoglobulin FactsBook, 2001 ISBN 014441351]으로부터 이용가능하다.
조작된 항체 또는 항원 결합 단편은 통상적인 방법에 의해 제조되고 정제될 수 있다. 상응하는 항체의 cDNA 서열은 클로닝되고 GS 발현 벡터내로 재조합될 수 있다. CHO 세포는 재조합 면역글로불린 발현 벡터에 의해 안정하게 형질감염될 수 있다. 당분야에 주지된 더욱 권고되는 방법으로서, 포유동물 발현 시스템은, 특별히 FC 영역의 고도로 보존된 N-말단에서 항체의 글리코실화를 일으킬 것이다. 안정한 클론은 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현시킴으로써 수득된다. 양성 클론을 생물반응기에서 무혈청 배지중에서 팽창시켜 항체를 생산한다. 항체가 분비되는 배양 배지는 통상적인 기법에 의해 정제되고 수집될 수 있다. 항체는 통상적인 방식으로 여과에 의해 농축될 수 있다. 가용성 혼합물 및 다량체가 또한 통상적인 방법, 예컨대 분자체, 이온 교환에 의해 제거될 수 있다. 생성된 생성물은 즉시, 예컨대 -70℃로 동결되거나, 동결건조될 필요가 있다.
항체는 단일클론성 항체를 지칭한다. 단일클론성 항체(mAb)는 단일한 클론 세포주로부터 수득된 항체를 지칭하고, 세포주는 진핵, 원핵 또는 파아지 클론 세포주로 제한되지 않는다. 단일클론성 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들면, 하이브리도마 기술, 재조합 기법, 파아지 디스플레이 기술, 합성 기법(예를 들어, CDR-그래프팅), 또는 다른 선행 기술 기법을 사용하여 재조합적으로 수득될 수 있다.
동물, 인간, 실험 피험체, 세포, 조직, 기관 또는 생물 유체에 적용하는 경우, "투여" 및 "치료"는, 외인성 약물, 치료제, 진단제, 또는 조성물을 동물, 인간, 피험체, 세포, 조직, 기관 또는 생물 유체와 접촉시킴을 지칭한다. "투여" 및 "치료"는, 예를 들면, 치료학적, 약물동력학적, 진단학적, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 시약과 세포의 접촉, 뿐만 아니라 시약과 체액의 접촉을 포함하고, 여기서 체액은 세포와 접촉된다. "투여" 및 "치료"는 또한 예를 들면, 시험관내 및 생체외 세포를 시약, 진단약, 결합 조성물에 의해, 또는 또 다른 세포에 의해 치료함을 의미한다. 인간, 동물 또는 연구 피험체에게 적용될 경우 "치료"는 치료학적 치료, 예방학적 또는 예방적 측정, 연구 및 진단학적 적용을 지칭한다.
"치료법"은, 내부적 또는 외부적 사용을 위한 치료제, 예컨대 본 발명의 임의의 결합 화합물을 포함하는 조성물을, 이러한 치료제가 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 질환의 하나 이상의 증후를 갖는 환자에게 투여함을 의미한다. 일반적으로, 치료제는 하나 이상의 질환의 증후를, 이러한 증후의 퇴행을 유도함으로써인지 또는 이러한 증후의 진행을 임의의 임상적으로 측정가능한 정도로 저해함으로써인지와 무관하게, 치료되는 피험체 또는 모집단에서 효과적으로 완화시키는 양으로 투여된다. 임의의 특별한 질환의 증후를 완화시키는데 있어서 효과적인 치료제의 양(또한 "치료학적 효과량"으로서 지칭됨)은, 예컨대 질환 상태, 환자의 연령 및 체중, 및 환자에서 원하는 효과를 유발하는 약물의 능력과 같은 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 질환의 증후가 경감되는지의 여부는 흔히 사용되는 임의의 임상적 시험 방법에 의해 주치의 또는 다른 건강 관리 전문가에 의해 평가되어, 증상의 위중성 또는 진행을 평가한다. 본 발명의 양태(예를 들어, 치료 방법 또는 제제)이 각각의 환자에게 공통적인 표적 질환의 증후를 개선시키는데 효과적이지 않을 수 있지만, 표적 질환의 증후는 당분야에 공지된 임의의 통계적 검정법, 예컨대 스튜던트(Student) t-검정, 카이-스퀘어(chi-square) 검정, 만(Mann) 및 휘트니(Whitney)에 기초한 U 검정, 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정(H 검정), 존크히레-터프스트라(Jonckheere-Terpstra) 검정, 및 윌콕슨(Wilcoxon) 검정에 따라 통계적으로 유의적인 수의 환자에서 완화되어야 한다.
용어 "본질적으로 구성되는" 또는 이의 변형어는, 명세서 및 청구범위를 통해 사용되는 경우, 모든 이러한 요소 또는 요소의 그룹을 포함하고, 임의적으로 상기 요소와 성질이 유사하거나 상이한 다른 요소를 포함하고, 나머지 요소는 주어진 투여량 섭생, 방법 또는 조성물의 본질적이거나 신규한 특성을 크게 변경시키지 않는다. 비제한적인 예로서, 언급된 아미노산 서열로 본질적으로 구성된 결합 화합물은 결합 화합물의 특성에 큰 영향을 주지 않는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
용어 "자연적으로 발생하는"은 그 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들면, 자연 공급원으로부터 단리될 수 있고 고의적으로 인공적으로 실험실에서 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연적으로 발생한다.
"효과량"은 의학적 증상의 증후 또는 징후를 완화시키거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 효과량은 또한 진단을 허용하거나 용이하게 하기에 충분한 양을 의미한다. 특별한 환자 또는 수의학적 피험체를 위한 효과량은 치료되는 증상, 환자의 전체 건강, 투여 방법의 경로 및 투여량, 및 부작용의 위중성과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 효과량은 상당한 부작용 또는 독성 영향을 방지하는 최대 용량 또는 투약 섭생일 수 있다.
"외인성"은 배경에 따라 살아있는 유기체, 세포, 또는 인체의 바깥쪽에서 생산되는 물질을 지칭한다. "내생성"은 배경에 따라 세포, 유기체 또는 인체 안에서 생산되는 물질을 지칭한다.
"세포", "세포주" 및 "세포 배양액"이라는 표현은 본원에 사용될 경우, 상호교환적으로 사용될 수 있고, 모든 이러한 명칭은 이들의 후손을 포함한다. 이와 같이, "형질전환체(transformant)" 및 "형질전환 세포"라는 단어는, 전이의 수와 무관하게, 1차 시험 세포 및 이로부터 유래된 배양액을 포함한다. 또한 모든 후손은 고의적 또는 비고의적 돌연변이에 기인하여 DNA 함량에 있어서 정확히 동일하지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 고유적으로 형질전환된 세포에서 선별된 경우와 동일한 작용 또는 생물 활성을 갖는 돌연변이체 후손이 포함된다. 상이한 명칭으로 여겨질 경우, 이들은 문맥상 명확히 구별가능하다.
"임의적" 또는 "임의적으로"는 후속적으로 설명되는 사건 또는 환경이 필수적으로 발생하지 않을 수 있음을 의미하고, 사건 또는 환경이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들면, "임의적으로 1 내지 3개의 항체 중쇄 가변부를 포함하는"은 특별한 서열의 항체 중쇄 가변부가 필수적인 것은 아니지만 존재할 수 있음을 의미한다.
"약학 조성물"은 본원에 기재된 하나 이상의 화합물, 또는 이의 생리학적으로/약학적으로 허용가능한 염 또는 전구약물, 및 다른 화학적 성분, 뿐만 아니라 다른 성분, 예컨대 생리학적으로/약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 포함하는 혼합물을 의미한다. 약학 조성물의 목적은 유기체의 투여를 촉진시키는 것이고, 이는 활성 구성성분의 흡수를 용이하게 하고, 이로써 생물 활성을 부가한다.
바람직한 양태에 대한 상세한 설명
하기 실시예는 본 발명을 추가로 예시하는 것으로서, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 양태에서 구체적인 조건을 지시하지 않는 실험 방법은 대체적으로 통상적인 조건, 예컨대 문헌[Using Antibodies: A Laboratory Manual], 또는 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory], 또는 원료 물질 또는 상품의 제조업체에 의해 권고된 조건에 따라 실행된다. 구체적인 구입처가 없는 시약은 시판 구입한 일반적인 시약이다.
실시예 1: 인간 CD27 항원 결합 항체 단편(Fab)의 선별 및 발견
생체외 파지미드 디스플레이 시스템을 CD27-HisFc(시노 바이올로지컬(Sino Biological) #10039-H03H), CD27-Fc(시노 바이올로지컬 #10039-H31H) 및 CD27-His(시노 바이올로지컬 #10039-H08B1)를 포함한 항 인간 CD27 항체에 대한 인간화된 항체 단편의 선별에 사용하였다. 항원을 맥시소르프(Maxisorp) 96 웰 선별 플레이트(써모 사이언티픽(Thermo Scientific) 446469) 상에 직접 흡착 부동화시키거나, 비오틴일화하여 다이나비즈(Dynabeads) 마이크로입자(M280, 스트렙타비딘, 인비트로젠(Invitrogen) #60210)에 흡착시키고, 킹피셔(KingFisher)(써모 사이언티픽) 자동 선별 작업대(workstation)를 표준 파지 디스플레이 선별 절차에 사용하였다. 3 내지 4회 초과의 선별을 각각의 항원에 대해 수행하고, 인간 항체 Fc 단편을 각각의 회차에 사용하여 바탕값(background)을 제거하였다. 최종 회차의 선별 후, 단일 집락을 취하여 클로닝 및 항온배양한 후, 상청액을 취하고, 인간 CD27에 결합하는 항체 단편을 ELISA 방법에 의해 미리 동정하였다. 1차 선택의 기준은 ELISA 판독이 바탕값 신호의 2배 이상인 것으로 하였다.
실시예 2: 인간 CD27에 대한 항체 단편의 친화도의 생물막 층 간섭(BL1) 측정
C 말단에 히스티딘 태그의 부가를 갖는 각각의 고유한 서열의 항체 Fab 단편을 E. coli 발현 시스템을 사용하여 과발현시킨 후, Ni-NTA 친화도 수지에 의해 정제하였다. 인간 CD27에 대한 Fab의 친화도를 하기 방법에 의해 포르테바이오 옥텟 레드96(ForteBio Octet RED96 ) 시스템을 사용하여 검출하였다: 먼저 BLI 시스템의 AHC(인간 IgG 항체 Fc 단편에 특이적) 센서를 사용하여 인간 CD27-HisFc 융합 단백질을 포획한 후, 이를 5 내지 10 μg/mL의 농도의 각각의 정화된 Fab 단백질을 갖는 측정 완충액 중 액침하였다. 수집된 데이트를 데이터 어퀴지션 7.1(Data Acquisition 7.1) 소프트웨어에 의해 처리하고 1:1 랭뮤어 모델 곡선(1:1 Langmuir model curve)으로 근사하였다. 가장 우수한 결합 능력을 갖는 항체 mAb077를 심화 분석 및 개발 연구를 위한 선별에 의해 수득하였다. 항체의 결합 상수 및 동역학 상수를 하기 표 1에 나타냈다.
항체 항원 친화도
KD(M)		 회합 속도
ka(1/Ms)		 해리 속도
kd(1/s)
mAb077-Fab 인간 CD27-HisFc 4.08E-09 2.96E+05 1.21E-03
mAb077-IgG 인간 CD27-HisFc 1.37E-10 1.58E+05 2.17E-05
1F5-IgG 인간 CD27-His 1.39E-09 6.58E+04 9.15E-05
mAb077-IgG 쥐 CD27-HisFc 3.04E-11 4.38E+05 1.33E-05
1F5-IgG 쥐 CD27-HisFc 결합 없음 결합 없음 결합 없음
mAb077-IgG 마카카(Macaca)
CD27-Fc		 5.62E-10 7.58E+04 4.26E-05
1F5-IgG 마카카 CD27-Fc 2.13E-09 1.14E+05 2.43E-04
1F5-IgG는 항체 바를릴루맙(Varlilumab)이다.
인가 단클론 항체 mAb077의 중쇄 가변부 서열 및 경쇄 가변부 서열은 하기와 같다:
mAb077 VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGWINPNRGSTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARDPGYTWYFDVWGQGTLVTVSS(서열번호 1)
mAb077 VL
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSDLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRDAWPPTFGQGTKVEIK(서열번호 2)
이는 하기 표 B의 CDR 서열을 포함한다.
[표 B]
Figure pct00002
선택된 항체 경쇄 가변부 서열 및 중쇄 가변부 서열을 데이터베이스에 대해 정렬하였다. 서열번호 1의 서열을 상기 데이터베이스의 중쇄 생식세포계열에 대해 정렬하였고, 이는 생식세포계열 서열의 VH3 과에 속하는 VH3-74 생식세포계열 서열에 대한 유사성을 나타낸다. 서열번호 2의 서열을 상기 데이터베이스의 경쇄 생식세포계열에 대해 정렬하였고, 이는 생식세포계열 서열의 Vκ1 과에 속하는 Vκ1-12 생식세포계열 서열에 대한 유사성을 나타낸다.
VH3-74 생식세포계열 서열
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLVWVSRINSDGSSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(서열번호13)
Vκ1-12 생식세포계열 서열
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP(서열번호 14)
실시예 3: 항체 Fab 단편의 IgG로의 전환, 및 IgG의 발현 및 정제
각각의 항체 단편을 포유동물 세포의 발현 벡터에 클로닝하여 경쇄 및 중쇄 IgG1 아형 항체를 발현하게 하였다. HEK293 세포를 표준 절차에 따른 전이(transient) 방식으로 부합하는 벡터로 형질감염시켰다. 발현 후, 상청액을 원심분리 여과에 의해 채집한 후, IgG를 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 용리된 단백질을 이온 교환을 통해 PB 완충액(20 mM 나트륨 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 7.0)으로 옮겼다. 단백질 농도를 자외선 스펙트럼계에 의해 측정하고, 이의 순도 및 특성을 변성, 환원성 또는 비환원성 조건하에 측정하였다.
경쇄의 전장 서열
mAb077 LC
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSDLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRDAWPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열번호 9)
중쇄의 전장 서열
mAb077 HC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGWINPNRGSTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARDPGYTWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 10)
실시예 4: 질량 스펙트럼을 사용한 mAb077 분자의 펩티드 맵(map) 분석
분취 규모 IEC를 사용하여 후속 시험을 위한 mAb077의 산성 피크 및 주요 피크의 성분을 분리하는데 사용하였다. 500 μg의 각각의 항체 샘플에 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 400 μL의 0.25 M 트리스-HCl 완충액을 첨가하고 잘 혼합하고, 1 M DTT를 최종 농도가 20 mM이 되게 상기 샘플에 첨가하고 잘 혼합하고 37℃에서 1시간 동안 수욕(water bath) 중 항온배양하였다. 샘플을 실온으로 평형조절하고, IAM을 50 mM의 최종 농도가 되도록 첨가하고, 샘플을 30분 동안 암실에서 항온배양한 후, 10 kDa 초미세여과 관으로 옮기고 13000 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 이어서, 샘플에 2 M 우레아를 함유하는 400 μL의 50 mM 트리스-HCl(pH 7.4) 용액을 첨가하여 초미세여과하여 원래 완충액을 대체하고, 상기 완충액의 대체를 1회 반복하였다. 초미세여과된 샘플을 단백질 농도에 대해 시험하고, 샘플의 농도를 2 M 우레아를 함유하는 트리스-HCl 용액에 의해 0.5 mg/mL로 조정하였다. 4 μL의 트립신 효소를 샘플 대 효소 25:1로 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 4시간 동안 수욕 중 항온배양하였다. 제조한 샘플을 어퀴티(Acquity) UPLC_Q-TOF 컬러-질량 스펙트럼계(어퀴티 UPLC BEH C18 컬럼이 장착됨)를 사용하여 LC-MS 데이터를 수집하였다. 크로마토그래피 이동상 A는 0.1% 포름산 수였고, 이동상 B는 0.1% 포름산 아세토니트릴이었다. 물의 UNIJI를 사용하여 각각의 펩티드의 질량 스펙트럼 정보를 추출하고, 서열 비교를 수행하여 항체의 펩티드 적용범위(peptide coverage)를 측정하였다. 변형 설정은 하기와 같았다: G0F(+1444.53387) 및 기타 당화 설정을 동역학 변형에 맞추고; 카바미도메틸 C(+57.02146)를 고정 변형에 맞추고; 산화 M 및 탈아미드화 N은 동역학 변형이고; 표적 부합 관용도를 20 ppm으로 맞추고; 단편 부합 관용도를 50 ppm으로 맞추었다.
[수학식 1]
Figure pct00003
분석 결과를 도 1에 도시하였다. mAb077의 분리 후 중쇄의 74번째 아미노산 아스파라긴(카밧 위치 번호는 73임)의 산성 피크의 성분의 탈아미드화 비는 59.6%였고, 주요 피크의 성분의 탈아미드화 비는 단지 12.2%였는데, 이는 mAb077 샘플의 중쇄 가변부가 상당히 탈아미드화되었고, 상기 부위에서의 탈아미드화가 IEC에서 산성 피크의 자유 성분을 야기하였음을 확증한다. 따라서, 본 발명자들은 중쇄 가변부의 74번째 아미노산 아스파라긴(Asn)(카밧 위치 번호는 73임)을 트레오닌(Thr)으로 치환하였다. 돌연변이 후, 분자 077N74T의 가변부의 서열은 하기와 같았다(경쇄는 원래 mAb077과 동일함):
077N74T VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGWINPNRGSTKYAQKFQGRVTISRDTSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARDPGYTWYFDVWGQGTLVTVSS(서열번호 11)
돌연변이 후 077N74T 항체의 중쇄의 전장 서열
077N74T HC
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGIHWVRQAPGKGLEWIGWINPNRGSTKYAQKFQGRVTISRDNSKNTLYLQLNSLRAEDTAVYYCARDPGYTWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열번호 12)
실시예 5: 항-CD27 항체 및 이의 돌연변이 분자와 인간 CD27 항원의 친화도 비아코어(Biacore) 비교
단백질 A 바이오센서 칩을 사용하여 시험할 항체 분자를 포획한 후, 다양한 구배 농도의 인간 CD27-his 항원(이치아오 섄저우(Yiqiao Shenzhou) # 10039-H08H)을 비아코어 T200 계기에 의해 실시간 검출하여 회합 및 해리 곡선을 얻었다. 각각의 실험 사이클의 해리를 완료한 후, 바이오센서 침을 세척하고 글리신-염산 재생 용액(pH 1.5)에 의해 재생시켰다. 비아이벌루에이션(BIAevaluation) 버전 4.1 및 GE 소프트웨어를 사용하여 데이트를 (1:1) 랭뮤어 모델로 근사시키고, 하기 표 2에 제시된 친화도 값을 얻었다. 돌연변이 분자 077N74T의 친화도는 원래 mAb077보다 약간 더 높았지만 유의한 차이는 없었다.
고정상 이동상 회합 속도
(1/Ms)		 해리 속도
(1/s)		 친화도
(M)
077N74T huCD27-his
(시노 바이올로지컬)		 2.59E5 6.75E-5 2.61E-10
mAb077 2.49E5 8.34E-5 3.35E-10
실시예 6: 항-CD27 항체 및 이의 돌연변이 분자의 이온 교환 산-염기 피크의 분석
어질런트(Agilent)-1260 고성능 액상 크로마토그래피를 이동상 A(20 mM HEPES(pH 7.50)) 및 이동상 B(20 mM HEPES + 500 mM NaCl(pH 7.50))에 의해 사용하였다. 시험할 항체 단백질 샘플을 탈염하고, 이동상 A를 사용하여 시험 생성물을 약 5.0 mg/mL의 최종 농도로 희석하고, 주입 부피를 0.8 mL의 유속으로 50 μg으로 하였다. 미처리 완충액 및 시험 생성물을 샘플 병 또는 라이닝(lining)된 관에 넣고, 시스템을 96.0% 이동상 A + 4.0% 이동상 B로, 0.8 mL/분의 유속으로 기준치가 안정화될 때까지 균형조절하였다. 이어서, 샘플을 주입하고, 크로마토그램을 기록하였다. 샘플 검출을 완료한 후, 1 M NaCl을 사용하여 0.2 내지 0.5 mL/분의 유속으로 컬럼을 세척하였다. 분석 결과를 도 2에 도시하였다. 항-CD27 항체 mAb077은 IEC 액상 다이어그램에서 약 29분에 유의한 피크 성분을 생성하였고, 돌연변이 077N74T의 이러한 산성 피크의 성분은 분자가 탈아미드화되지 않음에 기인하여 소실되었다.
실시예 7: 항-CD27 항체 077N74T 가속화 열 안정성 시험
077N74T 항체 용액을 열 안정화 시험을 위해 40℃로 항온배양기에 두었다. 샘플을 15일차 및 30일차의 시점에 취하고, iCIEF-완전-컬럼 영상화 모세관 집속(focusing) 전기영동(프로틴심플(ProteinSimple) E5063 완전-컬럼 영상화 모세관 등전 집속 분석기, 집속 시간 1: 1분 동안 1500 V; 집속 시간 2: 8분 동안 3000 V)을 사용하여 시험할 항체 단백질의 등전점(pI) 비균질성 및 가열 전후 상이한 시점에서 이의 산-염기 성분 분포의 변화 경향성을 분석하였다. 결과를 도 3 및 표 3에 나타냈다. 077N74T를 40℃로 15일 동안 둔 후, 성분의 비율에는 유의한 변화가 없었고, 단백질을 1개월 동안 둔 후에는, pI 9.0의 산성 성분은 10.4%까지 증가하였고, pI 9.1의 중성군의 백분율은 12.3%까지 떨어졌다. 종합적으로, 이는 돌연변이 항체가 우수한 안정성을 가지고, 탈아미드화에 기인하는 가파른 상선 피크를 더욱 증가시키지 않을 것임을 나타낸다.
샘플링
시간		 ICE% 주요 피크
산성 피크 주요 피크 염기성 피크
0일차 40.4 56.0 3.6 /
40℃, 15일차 40.6 55.4 4.0 0.6
40℃, 30일차 51.0 43.7 5.2 12.3
실시예 8: 항-CD27 항체 및 이의 돌연변이 분자의 시험관내 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 활성화 기능
피콜(Ficoll) 밀도 구배 원심분리에 의해, 인간 혈액 PBMC를 신선한 헤파린 항응고처리된 혈액으로부터 분리하였다. 시험할 3 μg/mL 항-CD3 항체 및 상이한 농도의 각각의 항체(IgG1 아형 대조군으로서 헤르셉틴)를 ELISA 플레이트에서 코팅하고 밤새 4℃에서 항온처리하였다. 플레이트 세척 후 다음날, 2x105/웰의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 첨가하고, 플레이트를 5% CO2로 37℃에서 7일 동안 항온배양기에서 항온배양하였다. 항온배양 후, CCK-8 키트를 사용하여 PBMC의 증식을 검출하고, EC50을 OD450 값을 기준으로 계산하였다. 결과를 도 4에 나타냈고, PBMC 증식 활성에 대한 돌연변이 분자 077N74T의 자극은 원래 mAb077 분자의 것보다 약간 더 강했다.
실시예 9: 항-CD27 항체 및 이의 돌연변이 분자의 생체내 효능의 비교
베이징 웨이텅리후아(Weitonglihua)로부터 구입한 18 내지 20 g, 5 내지 6주령의 54개체의 CB17-SCID 암컷 마우스를 각 군 당 9개체 마우스로 하여 6개의 군으로 나누었다. 라지(Raji) 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 RPMI-1640 중 시험관내 배양하였다. 지수 성장률 상태의 라지 세포를 채집하고 무균 조건하에 CB17-SCID 마우스에 피하 이식하였다. 참조 항체 바를릴루맙은 셀덱스에 의해 개발된 항-CD27 항체이다(자세한 것은 CN 103154034 B 참고). 종양 접종일을 0일차로 정하였다. 제1 투여를 예방접종의 제3 일에 수행한 후, 하기와 같이 진행하였다:
군 1: IgG1 30mg/kg, i.p.(복강내), N=9, Q2D, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 days;
군 2: 077N74T 3mg/kg, i.p., N=9, Q2D, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 일;
군 3: 077N74T 10mg/kg, i.p., N=9, Q2D, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 일;
군 4: 077N74T 30mg/kg, i.p., N=9, Q2D, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 일;
군 5: mAb077 30mg/kg, i.p., N=9, Q2D, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 일; 및
군 6: 바를릴루맙 30mg/kg, i.p., N=9, Q2D, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 일.
상기 동물의 일상적인 거동을 투여 후 18일 동안 매일 감시하였다. 버니어 캘리퍼스로 종양의 장직경 및 단직경을 측정한 후, 총양 부피를 길이x너비2/2로 계산하였다. 종양 성장 억제 값에는 식 TGI%=(1-T/C)x100%을 사용하였다. T 및 C 각각은 특정 시점에서 처리군 및 대조군의 종양 부피(TV)이다. 체중 변화에는 식 RCBW%=(BWi-BW0)/BW0x100%를 사용하되, BWi는 마우스의 현재 체중이고, BW0은 군을 구분한 날 마우스의 체중이다. 모든 실험 결과는 평균 종양 부피±표준 오차(SEM)로서 표시하였다. T-검정법을 사용하여 처리군과 대조군간의 종양 중량을 비교하여 유의한 차이가 있는지 여부를 확인하였다. 모든 데이터는 그래프패드(Graphpad)에 의해 분석하였고, p<0.05는 유의한 차이를 표시한다.
도 5 및 6에 나타낸 바와 같이, 라지로 이식된 종양 모델에서, 077N74T은 투여 용량-의존적으로 항-종양 효과를 나타냈다. 저, 중 및 고 투여 용량 군의 종양 성장 억제 값(TGi)은 각각 62%, 67% 및 73%였다. 가장 고 투여-용량(30 mg/kg) 군에서 077N74T의 항-종양 효과는 돌연변이 전 mAb077(59%) 또는 동일 투여 용량의 참조 항체 바를릴루맙(61%)보다 약건 더 강했다. 각각의 투여 군에서 마우스의 유의한 체중 손실은 없었고, 이는 마우스가 상이한 투여 용량의 각각의 항체도 잘 관용하였음을 나타낸다.
본 발명의 특정 양태들을 전술하였지만, 당업자는 상기 양태들이 단지 예시적이고, 다양한 변화 또는 변형이 본 발명의 원리 및 사상을 벗어남 없이 수행될 수 있고, 이러한 등가 형태들 역시 본원에 첨부된 청구범위로 한정되는 범주내에 속함을 이해하여야 한다.
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1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asp Ala Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Tyr Gly Ile His 1 5 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Trp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Pro Gly Tyr Thr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Gln Arg Asp Ala Trp Pro Pro Thr 1 5 <210> 9 <211> 214 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Asp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asp Ala Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 10 <211> 449 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Gly Tyr Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 11 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 077N74T VH <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Gly Tyr Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 077N74T HC <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Pro Asn Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Gly Tyr Thr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 13 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 14 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro 85 90 95

Claims (15)

  1. 경쇄 가변부 및 중쇄 가변부를 포함하는 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 항체의 경쇄 가변부가 서열번호 6에 제시된 LCDR1, 서열번호 7에 제시된 LCDR2 및 서열번호 8에 제시된 LCDR3의 아미노산 서열을 포함하고/거나;
    상기 항체의 중쇄 가변부가 서열번호 3에 제시된 HCDR1, 서열번호 4에 제시된 HCDR2 및 서열번호 5에 제시된 HCDR3의 아미노산 서열을 포함하는,
    항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    인간 생식세포계열 경쇄 가변부의 Vκ1 서열의 골격체부(framework region) 또는 이의 유도체 서열 및/또는 인간 생식세포계열 중쇄 가변부의 VH3 서열의 골격체부 또는 이의 유도체 서열을 포함하되,
    바람직하게는 상기 경쇄 가변부의 골격체부는 Vκ1-12 서열로부터 유도되고, 바람직하게는 상기 중쇄 가변부 서열의 골격체부는 VH3-74 서열로부터 유도되는,
    항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    중쇄 가변부의 VH3 서열의 골격체부 서열에서 카밧(Kabat)에 따른 위치 73에서의 아스파라긴이 트레오닌으로 치환된, 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄 가변부의 아미노산 서열이 서열번호 2에 제시되어 있거나 서열번호 2와 적어도 90%의 일치성을 갖고/거나;
    중쇄 가변부의 아미노산 서열이 서열번호 1 또는 11에 제시되어 있거나 서열번호 1 또는 11과 적어도 90%의 일치성을 갖는,
    항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 항체 또는 이의 단편인, 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 항체의 중쇄가 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체의 중쇄 불변부, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 중쇄 불변부를 포함하고;
    항원 결합 단편이 Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 및/또는 (Fab')2 단편인,
    항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    경쇄의 아미노산 서열이 서열번호 9에 제시되어 있거나 서열번호 9와 적어도 90%의 일치성을 갖고/거나;
    중쇄의 아미노산 서열이 서열번호 10 또는 12에 제시되어 있거나 서열번호 10 또는 12와 적어도 90%의 일치성을 갖는,
    항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  9. 제8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서, 진핵 세포 발현 벡터, 원핵 세포 발현 벡터 또는 바이러스 벡터인 벡터.
  10. 제9항의 벡터에 의한 형질전환에 의해 수득되는 숙주 세포로서, 바람직하게는 박테리아, 효모 또는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 중국 햄스터 난소 세포 또는 인간 배아 신장 293 세포인 숙주 세포.
  11. 제10항의 숙주 세포에 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 발현시키는 단계; 및
    상기 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 단리시키는 단계
    를 포함하는 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  12. 항체가 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 항체-약물 접합체.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및
    약학적으로 허용되는 부형제, 희석액 또는 담체
    를 포함하는 약학 조성물.
  14. CD27-매개 질환 또는 장애, 바람직하게는 암 또는 자가면역 질환, 보다 바람직하게는 CD27 발현을 갖는 암 또는 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제12항의 항체-약물 접합체, 또는 제13항의 약학 조성물의 용도로서,
    보다 바람직하게는 상기 암은 직장암, 뇌암, 신장암, 폐암, 간암, 다발성 육종 및 흑색종이고, 상기 자가면역 질환은 자가면역성 뇌척수염, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증 및 류마티스성 관절염인, 용도.
  15. 치료학적 효과량의 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항-CD27 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제12항의 항체-약물 접합체, 또는 제13항의 약학 조성물을 필요 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, CD27-매개 질환 또는 장애, 바람직하게는 암 또는 자가면역 질환, 보다 바람직하게는 CD27 발현을 갖는 암 또는 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방 방법으로서,
    보다 바람직하게는 상기 암은 직장암, 뇌암, 신장암, 폐암, 간암, 다발성 육종 및 흑색종이고, 상기 자가면역 질환은 자가면역성 뇌척수염, 전신성 홍반성 루푸스, 다발성 경화증 및 류마티스성 관절염인, 방법.
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