CN110267989B - 抗cd40抗体、其抗原结合片段及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

提供了抗CD40抗体、其抗原结合片段及其医药用途。进一步地，提供了包含所述抗CD40抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，以及包含人抗CD40抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为抗癌药物的用途。尤其地，提供了一种人源化的抗CD40抗体，在制备用于治疗CD40介导的疾病或病症的药物中的用途。

Description

抗CD40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
本申请要求申请日为2017年6月1日的中国专利申请CN201710402559.0的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本发明涉及一种抗CD40抗体，抗CD40的抗原结合片段，包含所述抗CD40抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，以及包含人抗CD40抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为抗癌药物的用途。
背景技术
癌症是当今人类社会长期面临的最大健康挑战。传统的疗法如手术、化疗和放疗在治疗播散的实体肿瘤中收效甚微。肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域一个热点，其中T细胞的肿瘤免疫治疗又处于其核心位置。肿瘤免疫治疗是充分利用、调动肿瘤患者体内的杀伤性T细胞，对肿瘤进行杀伤作用，它可能是最有效的也是最安全的***的途径。肿瘤免疫疗法目前对治疗几种不同类型的癌症，包括播散的转移性肿瘤已具有很好的前景。
人体内T细胞的活化采取了两条信号通路的***，除了需要通过抗原呈递细胞(APC)递呈MHC-抗原肽给T细胞提供第一信号外，还需要一系列协同刺激分子提供第二信号，进而才能使T细胞产生正常的免疫应答。这个双信号通路***对体内免疫***的平衡起到着至关重要的作用，它严格调控者机体对自身和非自身抗原产生不同的免疫应答。如果缺少协同刺激分子提供的第二信号，将会导致T细胞的无应答或持续特异性免疫应答，从而产生耐受。因此，第二信号通路在机体免疫应答的整个过程中起着非常关键的调节作用。
CD40是细胞表面表达的糖蛋白之一，为分子量48kDa的I型膜内在糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，并在免疫***中起重要作用。其表达在多种免疫细胞中，如B细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞等。当通过CD40发生信号传导时，专门的抗原呈递细胞会被激活。CD40的天然配体被命名为CD154或CD40L，已知主要表达在成熟T淋巴细胞中。CD40L介导信号的传导会触发一些细胞生物事件，包括免疫细胞激活、增殖，以及细胞因子和趋化因子的产生。CD40信号传导对于T细胞依赖性免疫应答是非常重要的，尤其在肿瘤环境背景中，CD40刺激的树突细胞能够激活肿瘤特异性效应T细胞，该类T细胞具有根除肿瘤细胞的潜力。
CD40表达发生在包括B淋巴细胞在内的许多正常细胞和肿瘤细胞中。例如黑色素瘤即属于具有CD40表达的肿瘤，而30％至70％的实体肿瘤也具有CD40表达。目前已知CD40的激活可有效触发抗肿瘤反应(Tong等，Cancer Gene Therapy，2003，10：1-13)，包括肿瘤特异性T细胞反应的免疫激活、对CD40阳性肿瘤直接的细胞凋亡作用，以及剌激导致ADCC的体液反应，且观察到的肿瘤根除与肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的出现强烈相关。同时也不应被忽视的是，全身施用CD40抗体与副作用相关，如休克综合征和细胞因子释放综合征(van Mierlo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99：5561-5566)。
目前有多家国际制药公司在研发如上述针对CD40的单克隆抗体，它通过特异性刺激免疫激活，最大限度提高患者自身对肿瘤的免疫***反应，从而达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。相关专利如CN1198647、CN1369015、CN1582165、CN100430419、CN101014386、CN101237882、CN101289510、CN101490086、CN103842382、CN104918957、WO2002028904、WO2011123489、WO2012149356、WO2013034904、WO2015091853、WO2016196314、WO2017040932、WO2017004006等。迄今为止，辉瑞(相关产品已许可给罗氏)、Alligator等公司的抗CD40抗体均在临床前动物模型中观测到了良好的肿瘤杀伤效果，并已推进入I期临床试验阶段当中。
本发明旨在提供有着高亲和力，高选择性，高生物活性的抗CD40抗体，用于通过刺激CD40及其通路导致免疫激活的癌症治疗药物/组合物和方法。
发明内容
本发明提供一种CD40抗体或其抗原结合片段，其包含：
抗体轻链可变区，所述的抗体轻链可变区包含至少1个选自如以下序列所示的LCDR：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：16；SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：44；SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：51，SEQ IDNO：52；SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：59或SEQ ID NO：60；和/或
抗体重链可变区，所述的抗体重链可变区包含至少1个选自如以下序列所述的HCDR：SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：13；SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：48，SEQ IDNO：49；SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56或SEQ ID NO：57。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO.42、SEQ IDNO.50或者SEQ ID NO.58所示的LCDR1。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO.43、SEQ IDNO.51或者SEQ ID NO.59所示的LCDR2。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO.44、SEQ IDNO.52或者SEQ ID NO.60所示的LCDR3区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO.39、SEQ IDNO.47或者SEQ ID NO.55所示的HCDR1。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO.40、SEQ IDNO.48或者SEQ ID NO.56所示的HCDR2。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体重链可变区包含如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO.41、SEQ IDNO.49或者SEQ ID NO.57所示的HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体重链可变区包含分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体重链可变区包含分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体重链可变区包含分别如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体重链可变区包含分别如SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其所述的抗体重链可变区包含分别如SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体轻链可变区包含分别如：
SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
且其中所述的抗体重链可变区包含分别如：
SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或
SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或
SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或
SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49所示的HCDR1、HCDR2和HCDR；或
SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
特别优选的抗CD40抗体或其抗原结合片段可选自下述任一种：
(1)抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(2)抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
(3)抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含序列分别如：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
(4)抗体轻链可变区包含序列分别如：SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48和SEQ ID NO：49所示的HCDR1、HCDR2和HCDR。
(5)抗体轻链可变区包含序列分别如：SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：60所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56和SEQ ID NO：57所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明一个优选的实施方案中，所述的抗体轻链可变区序列选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10；重链可变区序列选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9。
上述的抗CD40抗体或其抗原结合片段可为鼠源抗体或者嵌合抗体。
较佳地：
其中所述鼠源抗体或者所述嵌合抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；或者，所述鼠源抗体或者所述嵌合抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.10所示；或者，所述抗体或抗原片段的轻链可变区LCVR为序列SEQ ID NO：38，重链可变区HCVR为序列SEQ ID NO：37；或者，所述抗体或抗原片段的轻链可变区LCVR为序列SEQ IDNO：46，重链可变区HCVR为序列SEQ ID NO：45；或者，所述抗体或抗原片段的轻链可变区LCVR为序列SEQ ID NO：54，重链可变区HCVR为序列SEQ ID NO：53。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为鼠源抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的鼠源抗体或其片段，其抗体轻链可变区进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的鼠源抗体或其片段，其进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的鼠源抗体或其片段，其抗体重链可变区进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的鼠源抗体或其片段，其进一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或其变体的重链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为嵌合抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40嵌合抗体或其片段，其中所述的嵌合抗体轻链可变区序列为：SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40嵌合抗体或其片段，其中所述的嵌合抗体重链可变区序列为：SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：9。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40嵌合抗体或其片段，其进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40嵌合抗体或其片段，其进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为人抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为人源化抗体或其片段。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人抗体或其抗原结合片段，其中所述的人抗体轻链序列为：SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20或其变体；所述的变体优选在轻链有0-10的氨基酸变化，更优选为氨基酸位点在2和3的突变，位点2和位点3突变后的氨基酸均优选为I、V或L。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人抗体或其抗原结合片段，其中所述的人抗体重链序列为：SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19或其变体；所述的变体优选在重链有0-10的氨基酸变化，更优选为氨基酸位点在6和8的突变，两个位点突变后的氨基酸均优选为I、A或L。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人抗体或其抗原结合片段，其进一步包含人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的恒定区，优选包含人IgG1、IgG2或IgG4恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人源化抗体或其抗原结合片段，其人源化抗体轻链可变区进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，来源于如SEQ ID NO：22所示的人种系轻链IGkV1-33序列；或来源于如SEQ ID NO：24所示的人种系轻链IGkV2-28序列。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体轻链可变区序列为如SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34所示的序列，或其变体。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体轻链序列为如SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：20所示的序列，或其变体。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体轻链可变区变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为氨基酸位点在2和3的突变，突变后的氨基酸均优选为I、V或L。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人源化抗体或其片段，其进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人源化抗体或其片段，其人源化抗体重链可变区进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于如SEQ ID NO：21所示的人种系重链IGHV 1-69序列；或来源于如SEQ ID NO：23所示的人种系重链IGHV1-2序列。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体重链可变区序列为如SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：30所示的序列，或其变体。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人源化抗体或其片段，其中所述人源化抗体重链序列为如SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19所示的序列，或其变体；所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为氨基酸位点在6和8的突变，突变后的氨基酸均优选为I、A或L。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40人源化抗体或其片段，其进一步包含人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链FR区，更优选包含人源IgG1或IgG2重链FR区。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗原结合片段为Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、线性抗体、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。
本发明进一步提供一种编码如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或者单链抗体的DNA序列。
本发明进一步提供一种含有如上所述的DNA序列的表达载体。
本发明进一步提供一种用如上所述的表达载体转化的宿主细胞。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为细菌，优选为大肠杆菌。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的宿主细胞为酵母菌，优选为毕赤酵母。
在本发明一个优选的实施方案中，一种如上所述的宿主细胞为哺乳动物细胞，优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)293细胞。
本发明进一步提供一种单链抗体，其含有如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段。
本发明进一步提供一种多特异性抗体，其含有如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段。
本发明进一步提供一种抗体-药物偶联物，含有如前所述的抗CD40抗体轻链可变区和/或重链可变区。所述的抗体-药物偶联物是本领域公知的，其由抗体-接头-药物(毒素)相互连接形成，已知的接头包括裂解接头、***解接头，例如接头包括但不限于SMCC、SPDP等等；毒素也是本领域公知的，例如DM1、DM4、MMAE、MMAF等。
本发明进一步提供一种药物组合物，其含有如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或者单链抗体，以及可药用的赋形剂、稀释或载体。
本发明进一步提供一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、单链抗体或包含其的药物组合物，在制备用于治疗CD40或CD40L介导的疾病或病症的药物中的用途；其中所述的疾病优选为癌症；所述的癌症最优选为淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤、食管癌、***、多发性骨髓瘤、白血病、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
本发明进一步提供一种治疗和预防CD40或CD40L介导的疾病或病症的方法，该方法包括给予所需患者治疗有效量的如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、单链抗体或包含其的药物组合物；其中所述的疾病优选为癌症；所述的癌症最优选为淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤、食管癌、***、多发性骨髓瘤、白血病、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。
本发明进一步提供一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、单链抗体或包含其的药物组合物，在制备用于改善自身免疫疾病患者的症状的药物的用途。
本发明进一步提供一种如上所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体、单链抗体或包含其的药物组合物，在制备用于改善炎性疾病患者的症状的药物的用途。
附图说明
图1为鼠源抗人CD40抗体基于CD80活化分子对DC细胞的激活作用。
图2为鼠源抗人CD40抗体基于CD86活化分子对DC细胞的激活作用。
图3为与人PBMC和DC细胞共移植的Raji移植淋巴瘤的肿瘤生长曲线。
图4为与人PBMC和DC细胞共移植的Raji移植淋巴瘤的NOG小鼠的体重变化曲线。
发明详述
一、术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
本发明所述的术语“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM，IgD，IgG，IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链，δ链，γ链，α链和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1，IgG2，IgG3，IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中第每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本发明中，本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、2、3、4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序依次为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1，HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的VL区和VH区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的IMGT编号规则。
术语“抗原呈递细胞”或“APC”是在其表面上展示与MHC复合的外来抗原的细胞。T细胞利用T细胞受体(TCR)识别这种复合物。APC的实例包括但不限于树突细胞(DC)、外用血单个核细胞(PBMC)、单核细胞、B淋巴母细胞和单核细胞衍生的树突细胞(DC)。术语“抗原呈递”是指APC捕获抗原和使它们能够被T细胞识别的过程，例如作为MHC-I/MHC-II偶联物的组分。
术语“CD40”是指为TNF受体超家族成员的细胞表面受体，又称为TNFRSF5。CD40普遍表达于树突细胞、B细胞和巨噬细胞表面，是产生和维持T细胞免疫所需的分子。术语“CD40”包括由细胞天然表达的CD40的任何变体或同种型。本发明的抗体可与得自非人物种的CD40交叉反应。作为另一种选择，该抗体也可以是人CD40特异性的，可不表现出与其他物种的交叉反应性。CD40或其任何变体或同种型可从天然表达它们的细胞或组织中分离而得，或使用本领域通用以及本文所述的那些技术通过重组技术产生。优选地，抗CD40抗体靶向具有正常糖基化模式的人源CD40。
术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、创建或分离的人抗体，所涉及的技术和方法在本领域中是熟知的，诸如(1)从人免疫球蛋白基因的转基因、转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体；(2)从经转化以表达抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体；(3)从重组组合人抗体文库中分离的抗体；以及(4)通过将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法制备、表达、创建或分离的抗体。此类重组人抗体包含可变区和恒定区，这些区域利用特定的由种系基因编码的人种系免疫球蛋白序列，但也包括随后诸如在抗体成熟过程中发生的重排和突变。
术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人CD40的单克隆抗体。制备时用CD40抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源CD40抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
术语“人抗体”包括具有人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变所引入的突变)。然而，术语“人抗体”不包括这样的抗体，即其中已将衍生自另一种哺乳动物物种(诸如小鼠)种系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗体”)。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的免疫应答反应。为避免在免疫原性下降的同时引起活性的下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要选建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再要据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后***人载体中，最后在真核工业***或原核工业***中表达嵌合抗体分子。人抗体的恒定区可选自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1或IgG2重链恒定区。
术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗体片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，抗体片段保留至少10％的母体结合活性。优选地，抗体片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。抗原结合片段实例包括但不限于：Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、线性抗体(linear antibody)、单链抗体、纳米抗体、结构域抗体和多特异性抗体。工程改造的抗体变体综述于Holliger和Hudson(2005)Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fc”区含有包含抗体的CH1和CH2结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分，由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
术语“多特异性抗体”按其最广义使用，涵盖具有多表位特异性的抗体。这些多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体，其中该VH-VL单元具有多表位特异性；具有两个或多个VL和VH区的抗体，每个VH-VL单元与不同的靶点或同一个靶点的不同表位结合；具有两个或更多个单可变区的抗体，每个单可变区与不同的靶点或同一个靶点的不同的表位结合；全长抗体、抗体片段、双抗体(diabodies)、双特异性双抗体和三抗体(triabodies)、己共价或非共价连接在一起的抗体片段等。
术语“抗体-药物偶联物”(ADC)指与一种或多种异源的化学合成分子，包括但不限于细胞毒剂偶联的抗体或抗体片段。
术语“单链抗体”是由抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段连接肽连接而成的单链重组蛋白，它是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段。
术语“结构域抗体片段”是仅含有重链可变区或轻链可变区链的具有免疫学功能的免疫球蛋白片段。在某些情况下，两个或多个VH区与肽接头共价连接以形成二价结构域抗体片段。二价结构域抗体片段的两个VH区可靶向相同或不同抗原。
本发明的术语“与CD40结合”，指能与人CD40相互作用。本发明的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本发明抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
术语“表位”是指抗原上与免疫球蛋白或抗体特异性结合的位点。表位可以由相邻的氨基酸、或通过蛋白质的三级折叠而并列的不相邻的氨基酸形成。由相邻的氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂后保持，而通过三级折叠形成的表位通常在变性溶剂处理后丧失。表位通常以独特的空间构象包括至少3-15个氨基酸。确定什么表位由给定的抗体结合的方法在本领域中是熟知的，包括免疫印迹和免疫沉淀检测分析等。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术和本文所述的技术，例如X射线晶体分析法和二维核磁共振等。
本发明所用的术语“特异性结合”、“选择性结合”是指抗体与预定的抗原上的表位结合。通常，当使用重组人CD40作为分析物并使用抗体作为配体，在仪器中通过表面等离子体共振(SPR)技术测定时，抗体以大约低于10-7M或甚至更小的平衡解离常数(KD)与预定的抗原结合，并且其与预定抗原结合的亲和力是其与预定抗原或紧密相关的抗原之外的非特异性抗原(如BSA等)结合的亲和力的至少两倍。术语“识别抗原的抗体”在本文中可以与术语“特异性结合的抗体”互换使用。
术语“交叉反应”是指本发明的抗体与来自不同物种的CD40结合的能力。例如，结合人CD40的本发明的抗体也可以结合另一物种的CD40。交叉反应性是通过在结合测定(例如SPR和ELISA)中检测与纯化抗原的特异性反应性，或与生理表达CD40的细胞的结合或功能性相互作用来测量。确定交叉反应性的方法包括如本文所述的标准结合测定，例如表面等离子体共振(SPR)分析，或流式细胞术。
术语“抑制”或“阻断”可互换使用，并涵盖部分和完全抑制/阻断这两者。配体的抑制/阻断优选地降低或改变无抑制或阻断的情况下发生配体结合时出现活性的正常水平或类型。抑制和阻断也旨在包括与抗CD40抗体接触时，与未与抗CD40抗体接触的配体相比，任何可测量的配体结合亲和力降低。
术语“抑制生长”(例如涉及细胞)旨在包括细胞生长任何可测量的降低。
术语“诱导免疫应答”和“增强免疫应答”可互换使用，并指免疫应答对特定抗原的剌激(即，被动或适应性的)。针对诱导CDC或ADCC的术语“诱导”是指剌激特定的直接细胞杀伤机制。
本发明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。可通过对IgG上Fc段的修饰，降低或消除抗体的ADCC效应功能。所述的修饰指在抗体的重链恒定区进行突变，如选自IgG1的N297A，L234A，L235A：IgG2/4chimera，IgG4的F235E，或L234A/E235A突变。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。如，老鼠可以用人CD40或其片段免疫，所得到的抗体能被复性，纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。相应抗体的cDNA序列可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达***会导致抗体的糖基化，特别是在FC区的高度保守N端。通过表达与人源抗原特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化、收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛，离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
本发明的抗体指单克隆抗体。本发明所述的单克隆抗体(mAb)，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床不可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个患都有的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecμlar Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。氨基酸常见的保守取代如下：
Figure GPA0000270007200000161
Figure GPA0000270007200000171
整个说明书和权利要求书中使用的术语“基本上由......组成”或其变形表示包括所有所述元件或元件组，并且任选包括与所述元件类似或不同性质的其它元件，所述其它元件非显著改变指定给药方案、方法或组合物的基本性质或新性质。作为非限制性例子，基本上由所提及的氨基酸序列组成的结合化合物还可以包括一种或多种氨基酸，其不显著影响结合化合物的性质。
本发明所述的应用于某个对象的术语“天然存在的”是指这样的事实，即该对象可在自然界中发现。例如存在于可从自然界来源分离得到的生物体(包括病毒)、且未经人工在实验室中有意修饰的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
“有效量”包含足以改善或预防医字病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指要据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100％的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括其后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1免疫抗原、筛选抗原的序列及制备
带his标签的人CD40(h-CD40-his)重组蛋白、带Fc标签的人CD40(h-CD40-Fc)重组蛋白、带his标签的小鼠CD40(m-CD40-his)重组蛋白和带his标签的恒河猴CD40(rhesus-CD40-his)重组蛋白(#CD0-C52H7)均为购买自Acrobiosystems公司的纯化商业蛋白实际，其各自的序列来源见表1。蛋白可用于下述各实施例实验中。
表1.重组蛋白氨基酸序列来源
名称 氨基酸序列起止 Genbank登录号
h-CD40-his Glu21-Arg193 AAH12419.1
h-CD40-Fc Glu21-Arg193 NP_001241.1
m-CD40-his Val24-Arg193 P27512
rhesus-CD40-his Glu21-Arg193 NP_001252791.1
实施例2抗体杂交瘤的制备
抗人CD40单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用C57BL/6小鼠，雌性，6～8周龄[昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，动物生产许可证号：201503259]。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠分成2笼，每笼5只。
免疫抗原为带Fc标签的人修饰过的CD40重组蛋白(h-CD40-Fc，用磷酸盐缓冲液配制成1μg/μl)。用弗氏佐剂(Sigma，LotNo.：F5881/F5506)乳化：首次用弗氏完全佐剂(CFA)，其余加强免疫用核酸类佐剂(CpG，Sangon Biotech)和注射用铝(Imject Alum，Thermo，LotNo.：PH203866)。免疫注射时间为第0、14、28、42、56、70天。于第21，35，49，63，77天采血进行血检，用ELISA方法检测小鼠血清，确定小鼠血清中的抗体滴度。
在第4次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射10μg/只的磷酸盐缓冲液配制的抗原溶液。采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
Figure GPA0000270007200000192
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞，选出体外活性好的五株单克隆杂交瘤细胞株。
实施例3 ELISA结合实验
ELISA实验被用来检测抗CD40抗体的结合特性。用直接包被带his标签的CD40重组蛋白，抗体加入后，通过加入二抗(HRP偶联的抗一抗Fc的抗体)和HRP底物TMB检测抗体与抗原结合的活性。
人或恒河猴CD40-his蛋白包被96孔酶标板，按0.5μg/ml浓度每孔100μl，4℃孵育过夜。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗涤震荡10秒以保证充分清洗。加入200μl/孔封闭液室温孵育2小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗涤震荡10秒以保证充分清洗。每孔加100μl用稀释液稀释好的抗CD40待测抗体。室温孵育1小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl用稀释液按1∶20000倍稀释的HRP标记的山羊抗人IgG二抗。室温孵育1小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl TMB，避光反应15分钟。加入50μl每孔的0.16M硫酸。Thermo MμltiSkanFc酶标仪读取450nm OD值，计算CD40抗体对CD40的结合EC50值。
表2.鼠源杂交瘤抗体对不同种系CD40的ELISA结合实验结果
Figure GPA0000270007200000191
实施例4抗CD40抗体阻断CD40和CD40L结合实验
本实验中，通过体外阻断实验，检测所筛选出来的抗人CD40抗体阻断人CD40和人CD40L结合。具体方法是将带Fc标签的CD40重组蛋白(h-CD40-Fc)包被到96孔酶标板上，加入抗CD40抗体充分结合占据表位后，再加入带his标签的CD40L，通过检测his标签，来计算CD40与CD40L的结合量，计算CD40抗体对CD40活性位点阻断的IC50值。
人CD40-Fc蛋白包被96孔酶标板，按1μg/ml浓度每孔100μl，4℃孵育过夜。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗涤震荡10秒以保证充分清洗。加入200μl/孔封闭液室温孵育2小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每次洗涤震荡10秒以保证充分清洗。每孔加100μl用稀释液稀释好的抗CD40待测抗体，室温孵育1小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl稀释好的CD40L-his，室温孵育1小时，洗液洗三遍。每孔加入100μl用稀释液按1∶2000倍稀释的HRP标记的抗his标签的二抗。室温孵育1小时。洗液洗三遍，每孔250μl。每孔加入100μl TMB，避光反应15分钟。加入50μl每孔的0.16M硫酸。ThermoMμltiSkanFc酶标仪读取450nm OD值，计算CD40抗体对CD40与CD40L结合阻断的IC50值。
表3.人hCD40/hCD40L ELISA阻断实验结果
Figure GPA0000270007200000201
实施例5Biacore亲和力测定
按照人抗捕获试剂盒(Cat.#BR-1008-39，GE)说明书中的方法将人抗捕获抗体共价偶联于Biacore仪器(Biacore X100，GE)的生物传感芯片CM5上，从而亲和捕获一定量的待测嵌合或人源化抗体，然后于芯片表面流经一系列浓度梯度下的CD40抗原(CD40抗原均购自Acrobiosystems)，利用Biacore仪器(Biacore X100，GE)实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线。在每个循环解离完成后，用人抗捕获试剂盒里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。实验中用到的氨基偶联试剂盒购自GE公司(Cat.#BR-1000-50，GE)，缓冲液为HBS-EP+10×缓冲溶液(Cat.#BR-1006-69，GE)用D.I.Water稀释至1×(pH 7.4)。实验得到的数据用BiacoreX100 evaluation software2.0GE软件以(1∶1)Binding模型进行拟合，得出亲和力数值，见表10和表11。
实施例6抗CD40抗体报告基因细胞活性实验
HEK-Blue CD40L细胞购自Invivogen(Cat#hkb-cd40)，该细胞稳定转染了人CD40基因和NF-kB介导的SEAP基因组，可以通过SEAP底物QUANTI-Blue检测上清中分泌的SEAP来表征CD40信号通路的活化水平。本实验通过检测细胞HEK-Blue CD40L的活化，根据EC50大小评价CD40抗体的体外细胞活性。细胞HEK-Blue CD40L培养在含10％FBS，100μg/mlZeocin和30μg/ml Blasticidin的DMEM培养基中，一周传代2～3次，传代比例1∶5或1∶10。传代时，吸掉培养基，用5ml 0.25％的胰酶冲洗细胞层，然后吸掉胰酶，将细胞放在培养箱中消化3～5分钟，加入新鲜培养基重悬细胞。在96孔细胞培养板中加入100μL的细胞悬液，密度为5×10^5细胞/ml，培养基为含10％FBS，100μg/ml Zeocin和30μg/ml Blasticidin的DMEM，96孔板***只加入100μl无菌水。将培养板在培养箱培养24小时(37℃，5％CO2)。细胞贴壁后，每孔加入100μl梯度稀释的待测抗体。将培养板在培养箱孵育20-24小时(37℃，5％CO2)。每孔取40μl细胞上清到一个新的96孔平底板中，加入160μl QUANTI-Blue底物溶液，将培养板在培养箱内避光孵育1-3小时。用酶标仪(Thermo MμltiSkanFc)测定在620nm处的吸光度，计算EC50值评价CD40抗体的体外细胞活性。
表4抗CD40抗体报告基因细胞活性实验结果
Figure GPA0000270007200000211
实施例7抗CD40抗体激活DC细胞实验
从正常人外周血中分离PBMC，然后用CD14 MACS beads分选单核细胞。加入含10ng/ml IL4和100ng/ml GM-CSF的RPMI 1640培液培养6天，进行MoDC细胞(单一核细胞来源的树突细胞)的诱导培养。6天后收集细胞，取1×105个细胞，CD209-PE，CD1a-PerCP/Cy5.5和CD14-PE/Cy7染色，FACS分析是否成功诱导MoDC(上述操作均为本领域的常规操作)。收集成功诱导的DC，加入各待测抗体及参照抗体抗体，分别设置相应梯度浓度稀释(抗体的梯度浓度详见图1)。培养48小时后，收集细胞，进行CD80，CD86和HLA-DR染色，FACS检测收集数据。根据数据通过激活原代DC细胞实验，五个鼠源抗体均显示了明显的活性，激活了DC细胞表面的活化分子CD80和CD86，并呈剂量依赖效应，总体效果与两株参照抗体(分别为Pfizer的CP-870，893和Alligator Bioscience的ADC-1013)相当或略优。见图1和图2。
实施例8抗CD40抗体的克隆与定序
取以上筛选鉴定出的5株抗体的杂交瘤亚克隆，收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen，15596-018)提取RNA(按照试剂盒说明书步骤)，反转录(PrimeScriptTMReverse Transcriptase，Takara，cat#2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-PrimerSet(Novagen，TB326Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序公司测序。最终得到5株鼠源抗体的序列。
鼠单抗2H6的重链和轻链可变区序列如下：
2H6HCVR
Figure GPA0000270007200000221
2H6LCVR
Figure GPA0000270007200000222
其含有下表5中的CDR序列：
表5
名称 序列 编号
HCDR1 GYAFSDYLIE SEQ ID NO：3
HCDR2 VINPGSGGSNYNEKIKD SEQ ID NO：4
HCDR3 GGGGFTY SEQ ID NO：5
LCDR1 RASQDISNYLN SEQ ID NO：6
LCDR2 FASRLHS SEQ ID NO：7
LCDR3 QQGSTLPWT SEQ ID NO：8
9E5的重链和轻链可变区序列如下：
9E5 HCVR
Figure GPA0000270007200000223
9E5 LCVR
Figure GPA0000270007200000224
Figure GPA0000270007200000231
其含有下表6中的CDR序列：
表6
名称 序列 编号
HCDR1 GYILTTYWIT SEQ ID NO：11
HCDR2 DIHPGSGSTKYNEKFKS SEQ ID NO：12
HCDR3 RDY SEQ ID NO：13
LCDR1 RSSQNIVNSQGNTYLE SEQ ID NO：14
LCDR2 KVTNRFS SEQ ID NO：15
LCDR3 FQASLVPWT SEQ ID NO：16
1D9的重链和轻链可变区序列如下：
1D9 HCVR
Figure GPA0000270007200000232
1D9 LCVR
Figure GPA0000270007200000233
其含有下表7中的CDR序列：
表7
名称 序列 编号
HCDR1 GYAFTNYLIN SEQ ID NO：39
HCDR2 ILNPGSGGTNYNENFKD SEQ ID NO：40
HCDR3 GSPGFAY SEQ ID NO：41
LCDR1 RASQDINIYLN SEQ ID NO：42
LCDR2 STSGLHS SEQ ID NO：43
LCDR3 QQGYTLPYT SEQ ID NO：44
14C10的重链和轻链可变区序列如下：
14C10 HCVR
Figure GPA0000270007200000234
Figure GPA0000270007200000241
14C10 LCVR
Figure GPA0000270007200000242
其含有下表8中的CDR序列：
表8
名称 序列 编号
HCDR1 GYAFTNYLIE SEQ ID NO：47
HCDR2 VINPEFGGTNYNEKFKG SEQ ID NO：48
HCDR3 GGGGFTY SEQ ID NO：49
LCDR1 RASQDISSHLN SEQ ID NO：50
LCDR2 YTSRLHS SEQ ID NO：51
LCDR3 QQGNTLPWT SEQ ID NO：52
38B4的重链和轻链可变区序列如下：
38B4 HCVR
Figure GPA0000270007200000243
38B4 LCVR
Figure GPA0000270007200000244
其含有下表9中的CDR序列：
表9
Figure GPA0000270007200000245
Figure GPA0000270007200000251
其中最优两株抗体2H6和9E5进入后续开发。将获得的可变区序列分别接上人的抗体IgG1恒定区序列，得到人-鼠嵌合的抗体序列，利用分子克隆技术，把嵌合抗体的序列***到pCP表达载体中(购自迈博斯生物公司)中，经过PCR后测序鉴定(该部分的分子克隆等分子生物学操作方法按常规操作条件进行，具体可以参照《分子克隆：实验室手册》)，利用HEK293细胞表达***，即可获得人-鼠嵌合抗体2H6-C和9E5-C。对经过MabSelect SuRe(GELifesciences)亲和力层析纯化后的嵌合抗体进行各项体外活性检测，数据见表10。
表10.嵌合抗体的体外活性
Figure GPA0000270007200000252
实施例9小鼠抗体人源化实验
在所获得的鼠源抗体2H6和9E5的VH/VLCDR典型结构的基础上，将重、轻链可变区序列与抗体Germline数据库比较，获得同源性高的人种系模板。其中人类种系轻链框架区来自人κ轻链基因，本发明抗体优选人种系轻链模版Vk1-33/JK4(2H6)或Vk2-28/JK4(9E5)。人类种系重链框架区来自人重链，本发明抗体优选人种系重链模版VH1-69/JH6(2H6)或VH1-2/JH6(9E5)，如下所示：
2H6优选人种系重链模版IGHV1-69(SEQ ID NO：21)：
Figure GPA0000270007200000253
2H6优选人种系轻链模板IGkV1-33(SEQ ID NO：22)：
Figure GPA0000270007200000254
9E5优选人种系重链模版IGHV1-2(SEQ ID NO：23)：
Figure GPA0000270007200000255
9E5优选人种系轻链模板IGkV2-28(SEQ ID NO：24)：
Figure GPA0000270007200000261
将鼠源抗体的CDR区移植到选择的人源化模板上，替换人源化可变区，再与相应的人源IgG恒定区(优选重链为IgG1，轻链为κ)重组。然后以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化，得到最终的人源化分子。其重链可变区序列如SEQ ID NO：25—30所示；轻链可变区序列如SEQ ID NO：31-36所示。
hu2H6-H1a(SEQ ID NO：25)：
Figure GPA0000270007200000262
hu2H6-H1b(SEQ ID NO：26)：
Figure GPA0000270007200000263
hu2H6-H1c(SEQ ID NO：27)：
Figure GPA0000270007200000264
hu9E5-H1a(SEQ ID NO：28)：
Figure GPA0000270007200000265
hu9E5-H1b(SEQ ID NO：29)：
Figure GPA0000270007200000266
hu9E5-H1c(SEQ ID NO：30)：
Figure GPA0000270007200000271
hu2H6-L1a(SEQ ID NO：31)：
Figure GPA0000270007200000272
hu2H6-L1b(SEQ ID NO：32)：
Figure GPA0000270007200000273
hu2H6-L1c(SEQ ID NO：33)：
Figure GPA0000270007200000274
hu9E5-L1a(SEQ ID NO：34)：
Figure GPA0000270007200000275
hu9E5-L1b(SEQ ID NO：35)：
Figure GPA0000270007200000276
hu9E5-L1c(SEQ ID NO：36)：
Figure GPA0000270007200000277
经由以上轻重链组合的表达测试和回复突变数量对比，选择出最终的人源化hu2H6(使用H1b重链和L1c轻链)和hu9E5抗体分子(使用H1c重链和L1a轻链)，其各自的完整轻重链序列如SEQ ID NO：17-20所示。
hu2H6 HC
Figure GPA0000270007200000278
Figure GPA0000270007200000281
hu2H6 LC
Figure GPA0000270007200000282
hu9E5 HC
Figure GPA0000270007200000283
hu9E5 LC
Figure GPA0000270007200000284
实施例10人源化抗体测试数据
本发明人源化抗体hu2H6和hu9E5与人，恒河猴CD40的结合活性、阻断活性等，见表11。结果表明，本发明人源化抗人CD40抗体的ELISA结合、阻断活性与阳性抗体pfizer/alligator相当，尤其是，hu9E5和人CD40的Biacore测量亲和力是阳性抗体Alligator参照的10倍以上、Pfizer参照的4倍以上。
表11人源化hu2H6和hu9E5抗体的体外活性
Figure GPA0000270007200000291
实施例11抗CD40抗体对小鼠肿瘤生长的抑制
取正常人外周血，用密度梯度离心法分离健康人PBMC。用CD14+microbeads试剂盒分选单核细胞，按照试剂盒所提供的protocol进行CD14+单核细胞的分离，即每107个细胞加入20μl Anti-CD14 microbeads，4℃孵育15分钟。然后，将细胞加入磁柱中，洗三次后，收集磁柱中的细胞，即CD14+单核细胞。CD14+单核细胞中加入含10ng/ml IL4和100ng/ml GM-CSF的RPMI 1640培养液培养6天(培养方法为本领域常规方法)，进行MoDC细胞的诱导培养，剩余的细胞加入含IL-2的RPMI 1640，培养后收集悬浮的细胞(培养方法以及收集细胞的方法均为本领域的常规方法)，使用CD3+microbeads试剂盒分选T细胞。六天后收集并分取MoDC细胞和CD3+T细胞，将他们与Raji细胞(上海生科院细胞库，培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中)按1∶5∶20的比例混合，接种于每只NOG小鼠(南京银河生物，适应性饲养5天)皮下。实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度18.0-26.0℃，湿度40-70％，10-20次/小时换气，昼夜明暗交替时间12h/12h。
实验分为人IgG1抗体对照组，hu2H6，、hu9E5和参照抗体G12，给药剂量均为3mg/kg。每组5只小鼠，每周一次，六周注射给药，连续给药3次。整个实验过程中，用游标卡尺每周测量2次肿瘤长径和宽径，肿瘤体积(mm3)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径2)计算。相对肿瘤抑制率TGI(％)：TGI％＝(1-T/C)×100％。T/C％为相对肿瘤增殖率，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。T和C分别为治疗组和IgG1对照组在某一特定时间点的肿瘤体积(TV)或瘤重(TW)。
结果显示，人源化的抗CD40抗体hu2H6和hu9E5相对IgG1对照均有非常显著的抑瘤作用，给药21天后肿瘤接近完全消除；对比参照抗体G12的抑瘤作用总体相当或稍好，如图3和图4所示。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司；上海恒瑞医药有限公司
<120> 抗CD40抗体、其抗原结合片段及其医药用途
<130> P184014334C
<150> CN201710402559.0
<151> 2017-06-01
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Leu Ile Glu Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ala
        115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 2
Glu Ile Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Leu
        35                  40                  45
Asn Phe Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Phe Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 3
Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr Leu Ile Glu
1               5                   10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 4
Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile Lys
1               5                   10                  15
Asp
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr
1               5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 7
Phe Ala Ser Arg Leu His Ser
1               5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 8
Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr
1               5
<210> 9
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Thr Arg Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 10
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser
            20                  25                  30
Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Glu Ser
        35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
                85                  90                  95
Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 11
Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr Trp Ile Thr
1               5                   10
<210> 12
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 12
Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Ser
<210> 13
<211> 3
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 13
Arg Asp Tyr
1
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 14
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1               5                   10                  15
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 15
Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser
1               5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 16
Phe Gln Ala Ser Leu Val Pro Trp Thr
1               5
<210> 17
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人种系化抗体
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
        115                 120                 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
    130                 135                 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
                165                 170                 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
            180                 185                 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
        195                 200                 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
    210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
                245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
            260                 265                 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
        275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
    290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
                325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
            340                 345                 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
        355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
    370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
                405                 410                 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
            420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440                 445
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人种系化抗体
<400> 18
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Ile Lys Leu Leu Leu
        35                  40                  45
Asn Phe Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210> 19
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人种系化抗体
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
        115                 120                 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
    130                 135                 140
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
                165                 170                 175
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
            180                 185                 190
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
        195                 200                 205
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
    210                 215                 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225                 230                 235                 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
                245                 250                 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
            260                 265                 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
        275                 280                 285
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
    290                 295                 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305                 310                 315                 320
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
                325                 330                 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
            340                 345                 350
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
        355                 360                 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
    370                 375                 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385                 390                 395                 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
                405                 410                 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
            420                 425                 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
        435                 440
<210> 20
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人种系化抗体
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser
            20                  25                  30
Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
                85                  90                  95
Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
        115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
    130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
                165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
            180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
        195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210                 215
<210> 21
<211> 98
<212> PRT
<213> 人种系
<400> 21
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210> 22
<211> 95
<212> PRT
<213> 人种系
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro
                85                  90                  95
<210> 23
<211> 98
<212> PRT
<213> 人种系
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
            20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg
<210> 24
<211> 100
<212> PRT
<213> 人种系
<400> 24
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
            20                  25                  30
Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Thr Pro
            100
<210> 25
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210> 26
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
        115
<210> 27
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr
            20                  25                  30
Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile
    50                  55                  60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
        115                 120                 125
<210> 28
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210> 29
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210> 30
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体重链可变区
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
            100                 105                 110
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
        35                  40                  45
Asn Phe Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区
<400> 32
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu
        35                  40                  45
Asn Phe Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区
<400> 33
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Ile Lys Leu Leu Leu
        35                  40                  45
Asn Phe Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 34
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区
<400> 34
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser
            20                  25                  30
Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
                85                  90                  95
Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 35
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区
<400> 35
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser
            20                  25                  30
Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
                85                  90                  95
Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 36
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化抗体轻链可变区
<400> 36
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser
            20                  25                  30
Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala
                85                  90                  95
Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210> 37
<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 37
Gln Val Arg Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Met Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Ile Leu Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe
    50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ile Arg Gly Ser Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ala
        115
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Thr Ser Gly Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Asn Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 39
Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Asn
1               5                   10
<210> 40
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 40
Ile Leu Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1               5                   10                  15
Asp
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 41
Gly Ser Pro Gly Phe Ala Tyr
1               5
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 42
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 43
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 43
Ser Thr Ser Gly Leu His Ser
1               5
<210> 44
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 44
Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr Thr
1               5
<210> 45
<211> 116
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 45
Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Val Ile Asn Pro Glu Phe Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
            100                 105                 110
Thr Val Ser Ala
        115
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 46
His Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser His
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Ser Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 47
Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Glu
1               5                   10
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 48
Val Ile Asn Pro Glu Phe Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 49
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 49
Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr
1               5
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 50
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser His Leu Asn
1               5                   10
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 51
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1               5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 52
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr
1               5
<210> 53
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 53
Gln Val Arg Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Ala Gly Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
                85                  90                  95
Thr Arg Arg Gly Leu Pro Ser Leu Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 54
Asp Phe Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 55
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn
1               5                   10
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 56
Gly Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 57
Arg Gly Leu Pro Ser Leu Cys Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210> 58
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 58
Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210> 59
<211> 7
<212> PRT
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<400> 59
Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser
1               5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 60
Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Pro Thr
1               5

Claims (28)

1.一种抗CD40抗体或其抗原结合片段，其包含：抗体轻链可变区，和抗体重链可变区；其中所述的抗体轻链可变区包含分别如：SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；抗体重链可变区包含分别如：SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
2.如权利要求1所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为鼠源抗体或者嵌合抗体。
3.如权利要求2所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述鼠源抗体或者所述嵌合抗体包含：氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示的重链可变区，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示的轻链可变区。
4.如权利要求1所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的抗体为人源化抗体或者人抗体。
5.如权利要求4所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含：来源于如SEQ ID NO:22所示的人种系轻链IGkV1-33的轻链FR；或来源于如SEQ ID NO:24所示的人种系轻链IGkV2-28序列的轻链FR。
6.如权利要求4所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含轻链，所述轻链具有如SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的序列或其变体，其中所述的变体在轻链可变区有0-10个氨基酸变化。
7.如权利要求6所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的氨基酸变化为氨基酸位点在2和3的突变。
8.如权利要求7所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的变体中突变后的氨基酸为I、V或L。
9.如权利要求4～8任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体进一步包含来自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链恒定区。
10.如权利要求9所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含来源于如SEQ ID NO:21所示的人种系重链IGHV1-69的重链FR；或来源于如SEQ ID NO:23所示的人种系重链IGHV1-2的重链FR。
11.如权利要求4所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含重链，所述重链具有如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19所示的序列或其变体，其中所述的变体在重链可变区有0-10个氨基酸变化。
12.如权利要求11所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的变体为重链可变区氨基酸位点在6和8的突变。
13.如权利要求12所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述的变体中突变后的氨基酸为I、A或L。
14.如权利要求4所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体为人源化抗体hu9E5，其中所述的人源化抗体hu9E5包含序列为SEQ ID NO：30的重链可变区，和序列为SEQ ID NO：34的轻链可变区。
15.如权利要求9所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体为人源化抗体hu9E5，其中所述的人源化抗体hu9E5包含序列为SEQ ID NO：30的重链可变区，和序列为SEQ ID NO：34的轻链可变区。
16.如权利要求14所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体hu9E5包含序列如SEQ ID NO:19所示的重链，和序列如SEQ ID NO:20所示的轻链。
17.一种多特异性抗体，含有如权利要求1-16任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区。
18.一种单链抗体，含有如权利要求1-16任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和重链可变区。
19.一种抗体-药物偶联物，其中所述的抗体含有如权利要求1-16任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段。
20.一种编码如权利要求1-16任一项所述的抗CD40抗体或抗原结合片段、权利要求17所述的多特异性抗体或者权利要求18所述的单链抗体的DNA序列。
21.一种含有如权利要求20所述的DNA序列的表达载体。
22.一种用如权利要求21所述的表达载体转化的宿主细胞。
23.如权利要求22所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞为细菌；或者为酵母菌；或者为哺乳动物细胞。
24.如权利要求23所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细菌为大肠杆菌；或者所述的酵母菌为毕赤酵母；或者所述的哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)293细胞。
25.一种药物组合物，其含有如权利要求1-16任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段、权利要求17所述的多特异性抗体、权利要求18所述的单链抗体或者权利要求19所述的抗体-药物偶联物，以及可药用的赋形剂、稀释剂或载体。
26.如权利要求1-16任一项所述的抗CD40抗体或其抗原结合片段、权利要求17所述的多特异性抗体、权利要求18所述的单链抗体、权利要求19所述的抗体-药物偶联物或者权利要求25所述的药物组合物，在制备用于治疗或预防CD40或CD40L介导的疾病或病症的药物中的用途。
27.如权利要求26所述的用途，其中所述的疾病为癌症。
28.如权利要求27所述的用途，其中所述的癌症为淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤、食管癌、***、多发性骨髓瘤、白血病、胆囊癌、胶质母细胞瘤或黑色素瘤。
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