TWI685504B - 抗gitr抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於抗GITR抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地,本發明係關於包含所述抗GITR抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體,以及包含人類抗GITR抗體及其抗原結合片段的藥物組合物,以及其作為抗癌藥物的用途。尤其地,本發明係關於一種人源化的抗GITR抗體,在製備用於治療GITR媒介的疾病或病症的藥物中的用途。
Description
本申請要求申請日為2017年06月30日的中國專利申請CN201710522742.4的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明係關於一種抗GITR抗體,GITR的抗原結合片段,包含所述抗GITR抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體,以及包含人類抗GITR抗體及其抗原結合片段的藥物組合物,以及其作為抗癌藥物的用途。
腫瘤作為最大的健康殺手之一,是人類社會長期將要面臨的嚴峻挑戰。傳統的手術、化療及放療等療法往往在治療擴散的實體腫瘤時收效甚微。腫瘤免疫治療是當今腫瘤治療領域一個持續熱點,而T細胞的腫瘤免疫治療又處於其中的核心位置。腫瘤免疫治療充分利用、調動了腫瘤患者體內的細胞毒性T細胞,對腫瘤進行殺傷作用,它有可能是最有效的也是最安全的治療腫瘤的途徑。此類療法目前對治療幾種不同類型的癌症,包括擴散的轉移性腫瘤已顯現出良好的應用前景。
人體內T細胞的活化採取了兩條訊息路徑的系統,除了需要藉由抗原呈現細胞(APC)呈現MHC-抗原肽給T細胞提供第一訊息外,還需要一系列協同刺激分子提供第二訊息,進而才能使T細胞產生正常免疫反應。這個雙訊息路徑系統對體內免疫系統的平衡起到至關重要的作用,它嚴格調控著身體對自體及非自體抗原產生不同的免疫反應。如果缺少協同刺激分子提供的第二訊息,將會導致T細胞的無反應或失去持續特異性免疫反應,從而產生耐受。因此,這種第二訊息路徑在自體免疫反應的整個過程中起著非常關鍵的調節作用。
GITR(糖皮質激素誘導的TNFR相關蛋白,又稱TNFRSF18)是由228個胺基酸組成的跨膜蛋白,具有19個胺基酸的訊息序列、134個胺基酸的具有3個富含半胱胺酸的單元的胞外區域、23個胺基酸的跨膜區段及52個胺基酸的胞內區域,其中胞內區域與小鼠及人TNFR、4-1BB以及CD27的胞內區域同源性很高。GITR屬於腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族,在先天性及適應性免疫系統的許多組分中表現,並在多種正常組織包括乳腺、***、腦、心、腎、肝、唾液腺、脾、胃、胸腺及子宮中僅具有最低限度的表現。
GITR組成型地存在於未激活的T細胞上,結合另一個稱作GITR配體(GITRL)的跨膜蛋白。在T細胞活化後,GITR的表現會增加,觸發會共活化效應T細胞(effector T cells ,Teff),並調節調節性T 細胞(regulatory T cells,Treg)的活性。GITR會被主要在APC上表現的GITRL活化,通過它的胞內區域來傳遞訊息,由TRAF2/NIK途徑引發 NF-kB激活。這一活化過程能夠增加對腫瘤及病毒感染的抗性,參與自身免疫過程及炎症性過程,包括藉由NK細胞共激活的機制加強對感染及腫瘤的反應。
目前有多家國際公司正在研發針對GITR標靶目標的單株抗體,它通過特異性刺激免疫激活,提高患者自身對腫瘤的免疫系統反應,達到對腫瘤細胞進行殺傷之目的。相關專利如WO2006105021、WO2011028683、WO2011028683、WO2013039954、WO2015184099、WO2015187835、WO2015031667、WO2016054638、WO2017087678、WO2017068186等。截至目前,Incyte、BMS等公司開發的抗GITR腫瘤治療抗體已進入第I/IIa期臨床試驗階段,而諾華、默克等跨國製藥公司擁有的相關產品也已處在第I期臨床試驗之中。 本發明旨在提供有著高親和力、高選擇性、高生物活性的抗GITR抗體,用於藉由刺激GITR及其路徑而導致免疫激活的癌症治療藥物/組合物及方法。
本發明提供一種抗GITR抗體或其抗原結合片段,其包含: 抗體輕鏈可變區,所述的抗體輕鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所示的LCDR:SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO: 8;SEQ ID NO:57,SEQ ID NO. 14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO: 16;SEQ ID NO: 42,SEQ ID NO: 43,SEQ ID NO: 44;SEQ ID NO: 50,SEQ ID NO: 51及SEQ ID NO: 52;及/或 抗體重鏈可變區,所述的抗體重鏈可變區包含至少1個選自如以下序列所述的HCDR:SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:56 ,SEQ ID NO:13;SEQ ID NO: 39,SEQ ID NO: 40,SEQ ID NO: 41;SEQ ID NO: 47,SEQ ID NO: 48及SEQ ID NO: 49。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO: 42或者SEQ ID NO: 50所示的LCDR1。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO: 43或者SEQ ID NO: 51所示的LCDR2。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體輕鏈可變區包含如SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 44或者SEQ ID NO: 52所示的LCDR3區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 39或者SEQ ID NO: 47所示的HCDR1。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO: 40或者SEQ ID NO: 48所示的HCDR2。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體重鏈可變區包含如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO: 41或者SEQ ID NO: 49所示的HCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其所述的抗體輕鏈可變區包分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其所述的抗體輕鏈可變區包分別如SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其所述的抗體輕鏈可變區包分別如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其所述的抗體輕鏈可變區包分別如SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43及SEQ ID NO: 44所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其所述的抗體輕鏈可變區包分別如SEQ ID NO:50、SEQ ID NO: 51及SEQ ID NO: 52所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其所述的抗體輕鏈可變區包分別如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO: 13所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及SEQ ID NO:41所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其所述的抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48及SEQ ID NO:49所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體輕鏈可變區包含分別如: SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3;或 SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3;或 SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3;或 SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43及SEQ ID NO: 44所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3;或 SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51及SEQ ID NO: 52所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3。
且其中所述的抗體重鏈可變區包含分別如: SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3;或 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:56及SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3;或 SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO:13所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3;或 SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及SEQ ID NO: 41所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3;或 SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48及SEQ ID NO: 49所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3。
特佳的抗GITR抗體或其抗原結合片段可選自下述任一種: (1)抗體輕鏈可變區包含分別如:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO: 8所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3;抗體重鏈可變區包含分別如:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3。 (2)抗體輕鏈可變區包含分別如:SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3;抗體重鏈可變區包含分別如:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:56及SEQ ID NO: 13所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3。 (3)抗體輕鏈可變區包含分別如:SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO: 16所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3;抗體重鏈可變區包含分別如:SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12及SEQ ID NO: 13所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3。 (4)抗體輕鏈可變區包含分別如:SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43及SEQ ID NO: 44所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3;抗體重鏈可變區包含分別如:SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40及SEQ ID NO: 41所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3。 (5)抗體輕鏈可變區包含分別如:SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51及SEQ ID NO: 52所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3;抗體重鏈可變區包含分別如:SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48及SEQ ID NO: 49所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3。
在本發明一個較佳的實施方案中,所述的抗體輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:10;重鏈可變區序列選自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:9。
本發明還提供一種抗GITR抗體或抗原結合片段,其中所述抗體或抗原片段的輕鏈可變區LCVR為序列SEQ ID NO:38,重鏈可變區HCVR為序列SEQ ID NO:37。
本發明還提供一種抗GITR抗體或抗原結合片段,其中所述抗體或抗原片段的輕鏈可變區LCVR為序列SEQ ID NO:46,重鏈可變區HCVR為序列SEQ ID NO:45。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體為鼠源抗體或其片段。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的鼠源抗體或其片段,其抗體輕鏈可變區進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈FR區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的鼠源抗體或其片段,其進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的鼠源抗體或其片段,其抗體重鏈可變區進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈FR區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的鼠源抗體或其片段,其進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體為嵌合抗體或其片段。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的鼠源抗體或者所述的嵌合抗體的抗體輕鏈可變區LCVR序列為:SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 10。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的鼠源抗體或者所述的嵌合抗體的重鏈可變區序列為HCVR序列為:SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:9。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的嵌合抗體或其片段,其進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的嵌合抗體或其片段,其進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體為人類抗體或其片段。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體為人源化抗體或人類抗體。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的人源化抗體,其抗體輕鏈序列為:SEQ ID NO: 18或SEQ ID NO: 20或其變體;所述的變體較佳在輕鏈有0~10的胺基酸變化,更佳為胺基酸位點在46、49、52及57的突變;其中SEQ ID NO: 18較佳的胺基酸突變位點為49位,突變方式較佳S49P;SEQ ID NO: 20較佳的胺基酸突變位點為46位、52位及57位,突變方式較佳W46L、D52N及F57I。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的人源化抗體,其抗體重鏈序列為:SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19或其變體;所述的變體較佳在輕鏈有0~10的胺基酸變化。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗人類抗體或其片段,其進一步包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的恆定區,較佳包含人IgG1、IgG2或IgG4恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體為人源化抗體或其片段。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的人源化抗體或其片段,其人源化抗體輕鏈可變區進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈FR區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的人源化抗體或其片段,其中所述人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列,來源於如SEQ ID NO: 22所示的人種系輕鏈IGkV4-1序列;或來源於如SEQ ID NO: 24所示的人種系輕鏈IGkV3-11序列。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的人源化抗體或其片段,其中所述人源化抗體輕鏈可變區序列為如SEQ ID NO:29或SEQ ID NO:36所示的序列,或其變體。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的人源化抗體或其片段,其進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的人源化抗體或其片段,其人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈FR區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的人源化抗體或其片段,其中所述人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列,來源於如SEQ ID NO: 21所示的人種系重鏈IGHV3-38序列;或來源於如SEQ ID NO: 23所示的人種系重鏈IGHV1-2序列。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的人源化抗體或其片段,其中所述人源化抗體重鏈可變區序列為如SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:33所示的序列,或其變體。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的人源化抗體或其片段,其中所述人源化抗體重鏈序列為如SEQ ID NO:17或SEQ ID NO: 19所示的序列,或其變體;所述變體較佳在重鏈可變區有0~10的胺基酸變化;更佳為胺基酸位點在49、61及76的突變;其中SEQ ID NO: 17較佳的胺基酸突變位點為49位,突變方式較佳A49S;SEQ ID NO: 19較佳的胺基酸突變位點為61位及76位,突變方式較佳N61A及S76I。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的人源化抗體或其片段,其進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區,較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈FR區,更佳包含人源IgG1或IgG2重鏈FR區。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗原結合片段為Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、奈米抗體、結構域抗體(domain antibody)及多特異性抗體。
本發明進一步提供一種分離的單株抗體或其抗原結合片段,能與上述的單株抗體或其抗原結合片段競爭結合GITR。
本發明進一步提供一種編碼如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段的核酸。
本發明進一步提供一種含有如上所述的核酸的表現載體。
本發明進一步提供一種用如上所述的表現載體轉化的宿主細胞。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的宿主細胞,所述的宿主細胞為細菌,較佳為大腸桿菌。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的宿主細胞為酵母菌,較佳為畢赤酵母。
在本發明一個較佳的實施方案中,一種如上所述的宿主細胞為哺乳動物細胞,較佳為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚胎腎(HEK)293細胞。
本發明更提供了一種多特異性抗體,含有如前所述的輕鏈可變區及重鏈可變區。
本發明更提供了一種單鏈抗體,含有如前所述的輕鏈可變區及重鏈可變區。
本發明更提供了一種抗體-藥物偶聯物(antibody-drug conjugates),含有如前所述的輕鏈可變區及/或重鏈可變區。所述的抗體-藥物偶聯物是本領域所周知的,其由抗體-連接子-藥物(毒素)相互連接形成,已知的連接子(linker)包括裂解連接子、***解連接子,例如連接子包括但不限於SMCC、SPDP等;毒素也是本領域所周知的,例如DM1、DM4、MMAE、MMAF等。
本發明更提供了一種用於製備抗GITR抗體及其抗原結合片段的方法,包括如前所述的宿主細胞中表現該抗體或其抗原結合片段,並自該宿主細胞中分離該抗體或其抗原結合片段。
本發明進一步提供一種藥物組合物,其含有如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段、上述分離的單株抗體或其抗原結合片段、上述多特異性抗體或者上述單鏈抗體,以及可藥用的賦形劑、稀釋或載體。
本發明進一步提供一種如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段、上述分離的單株抗體或其抗原結合片段、上述多特異性抗體、上述單鏈抗體或者上述藥物組合物,在製備用於治療GITR或GITRL媒介的疾病或病症的藥物中的用途;其中所述的疾病較佳為癌症;所述的癌症尤佳為黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、膽囊癌及膠質母細胞瘤。
本發明進一步提供一種治療及預防GITR或GITRL媒介的疾病或病症的方法,該方法包括給予所需患者治療有效量的如上所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段、上述多特異性抗體、上述單鏈抗體或上述藥物組合物;其中所述的疾病較佳為癌症;所述的癌症尤佳為黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、膽囊癌及膠質母細胞瘤。
一、術語
為了更容易理解本發明,以下具體定義了某些技術及科學術語。除顯而易見在本文件中的它處另有明確定義,否則本文使用的所有其它技術及科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本發明所用胺基酸三字母代碼及單字母代碼如J. Biol. Chem, 243, p3558(1968)中所述。
本發明所述的術語「抗體」指免疫球蛋白,是由兩條相同的重鏈及兩條相同的輕鏈藉由鏈間雙硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成及排列順序不同,故其抗原性也不同。據此,可將免疫球蛋白分為五型,或稱為免疫球蛋白的同型,即IgM,IgD,IgG,IgA及IgE,其相應的重鏈分別為µ鏈,δ鏈,γ鏈,α鏈及ε鏈。同一型Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成及重鏈雙硫鍵的數目及位置的差別,又可分為不同的亞型,如IgG 可分為IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同而分為κ鏈或λ鏈。五型Ig中每一型Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中,本發明所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區,所述的輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本發明中,本發明所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區,所述的重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、2、3、4或其變體。
抗體重鏈及輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大,為可變區(V區);靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定,為恆定區(C區)。可變區包括3個高度變異區(hypervariable region,HVR)及4個序列相對保守的構架區(framework region,FR)。3個高度變異區決定抗體的特異性,又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(VL)及重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成,從胺基端到羧基端依次排列的順序為:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3以及FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2及LCDR3;重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2及HCDR3。發明所述的抗體或抗原結合片段的VL區及VH區的CDR胺基酸殘基在數量及位置符合已知的IMGT編號規則。
術語「重組人類抗體」包括藉由重組方法製備、表現、創建或分離的人類抗體,所關於的技術及方法在本領域中是熟知的,諸如(1)從人類免疫球蛋白基因的基因轉殖、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的雜交瘤中分離的抗體; (2)從經轉化以表現抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體;(3) 從重組組合人類抗體庫中分離的抗體;以及(4)藉由將人類免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表現、創建或分離的抗體。此類重組人類抗體包含可變區及恆定區,這些區域利用特定的由種系基因(germ line gene)編碼的人種系免疫球蛋白序列,但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排及突變。
術語「鼠源抗體」在本發明中為根據本領域知識及技能製備的對人GITR的單株抗體。製備時用GITR抗原注射試驗對象,然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的雜交瘤。在本發明一個較佳的實施方案中,所述的鼠源GITR抗體或其抗原結合片段,可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區,或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、 IgG3或 IgG4或其變體的重鏈恆定區。
術語「人類抗體」包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變及恆定區的抗體。本發明的人類抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如通過體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變) 。然而,術語「人類抗體」不包括這樣的抗體,即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR 序列移植到人類骨架序列上(即「人源化抗體」)。
術語「人源化抗體(humanized antibody)」,也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody),是指將小鼠的CDR序列移植到人類的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分,從而誘導的強烈的免疫反應反應。為了避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降,可對所述的人類抗體可變區可進行最少回復突變,以保持活性。
術語「嵌合抗體(chimeric antibody)」,是將鼠源性抗體的可變區與人類抗體的恆定區融合而成的抗體,可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫反應反應。建立嵌合抗體,要選建立分泌鼠源性特異性單抗的雜交瘤,然後從小鼠雜交瘤細胞中選殖可變區基因,再依據需要選殖人類抗體的恆定區基因,將小鼠可變區基因與人類恆定區基因連接成嵌合基因後***人類載體中,最後在真核產業系統或原核產業系統中表現嵌合抗體分子。人類抗體的恆定區可選自人源IgG1、 IgG2、 IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區,較佳包含人源IgG2或 IgG4重鏈恆定區,或者使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性作用)毒性的IgG1。
本發明中所述的「抗原結合片段」,指具有抗原結合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段,以及與人GITR結合的Fv片段sFv片段;包含本發明所述抗體中的一個或多個CDR區。Fv片段含有抗體重鏈可變區及輕鏈可變區,但沒有恆定區,並具有全部抗原結合位點的最小抗體片段。一般地,Fv抗體還包含在VH及VL區域之間的多肽接頭,且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈,稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(sFv)。本發明的術語「與GITR結合」,指能與人GITR相互作用。本發明的術語「抗原結合位點」指抗原上不連續的,由本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語「表位」是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級摺疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持,而藉由三級摺疊所形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3~15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的,包括免疫印漬及免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術及本文所述的技術,例如X射線晶體分析法及二維核磁共振等。
本發明所用的術語「特異性結合」、「選擇性結合」是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常,當使用重組人類GITR作為分析物並使用抗體作為配體,在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時,抗體以大約低於10-7
M或甚至更小的平衡解離常數(KD
)與預定的抗原結合,並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語「識別抗原的抗體」在本文中可以與術語「特異性結合的抗體」互換使用。
術語「競爭結合」是指與本發明的單株抗體辨識人類GITR的胞外區上的相同表位(也稱為抗原決定位)或相同表位的一部分並與所述抗原結合的抗體。與本發明的單株抗體結合相同表位的抗體是指辨識並結合於本發明的單株抗體所辨識的人類GITR 的胺基酸序列的抗體。術語「核酸分子」是指DNA 分子及RNA 分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的,但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時,核酸是「有效連接的」。例如,如果啟動子或強化子影響編碼序列的轉錄,那麼啟動子或強化子有效地連接至所述編碼序列。
術語「交叉反應」是指本發明的抗體與來自不同物種的GITR結合的能力。例如,結合人類GITR的本發明的抗體也可以結合另一物種的GITR。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR及ELISA) 中檢測與純化抗原的特異性反應性,或與生理表現GITR的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定,例如表面等離子體共振(SPR)分析,或流式細胞術。
術語「抑制」或「阻斷」可互換使用,並涵蓋部分及完全抑制/阻斷這兩者。CD70的抑制/阻斷較佳為降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生CD70結合時出現活性的正常水平或類型。抑制及阻斷也旨在包括與抗GITR抗體接觸時,與未與抗GITR抗體接觸的CD70相比,任何可測量的CD70結合親和力降低。
術語「抑制生長」(例如關於細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
術語「誘導免疫反應」及「增強免疫反應」可互換使用,並指免疫反應對特定抗原的刺激(即,被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語「誘導」是指刺激特定的直接細胞殺傷機制。
本發明中所述的「ADCC」,即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,抗體依賴性細胞媒介的細胞毒性作用,是指表現Fc受體的細胞藉由辨識抗體的Fc段直接殺傷被抗體被覆的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾,而降低或消除抗體的ADCC效應功能。所述的修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變,如選自IgG1 的N297A、L234A、L235A;IgG2/4chimera、IgG4的F235E、或L234A/E235A 突變。
本發明中所述的融合蛋白是一種藉由DNA重組,得到的兩個基因共表現的蛋白產物。重組GITR胞外區域Fc融合蛋白藉由DNA重組,把GITR胞外區域及人類抗體Fc片段共表現的融合蛋白。所述的GITR胞外區域,是指GITR蛋白表現在細胞膜以外的部分。
生產及純化抗體及抗原結合片段的方法在現有技術中熟知且能找到,如冷泉港的抗體實驗技術指南,5~8章及15章。如,老鼠可以用人類GITR或其片段免疫,所得到的抗體能被覆性,純化,並且可以用例行的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用例行方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人類FR區。人類FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http://imgt.cines.fr得到,或者從免疫球蛋白雜誌,(2001)ISBN:012441351上獲得。具體的,本發明所述的抗體或抗原結合片段所用的輕鏈FR種系包括Vk3-11及Vk4-1。本發明所述的抗體或抗原結合片段所用的具體的重鏈FR種系包括VH3-48及VH1-2。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用例行方法製備及純化。比如,編碼重鏈(SEQID NO:9)及輕鏈(SEQID NO:10)的cDNA序列,可以選殖並重組至GS表現載體。重組的免疫球蛋白表現載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術,哺乳動物類表現系統會導致抗體的醣基化,特別是在FC區的高度保守N端。藉由表現與人源抗原特異性結合的抗體而得到穩定的殖株。陽性的殖株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用例行技術純化、收集。抗體可用例行方法進行過濾濃縮。可溶的混合物及多聚體,也可以用例行方法去除,比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍,如-70℃,或者冷凍乾燥。
本發明的抗體指單株抗體。本發明所述的單株抗體(mAb),指由單一的選殖細胞株得到的抗體,所述的細胞株不限於真核的,原核的或噬菌體的選殖細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如雜交瘤技術、重組技術、噬菌體顯示技術、合成技術(如CDR-grafting)、或其它現有技術進行重組得到。
「給予」及「處理」當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時,是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。「給予」及「處理」可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究及實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸,以及試劑與流體的接觸,其中所述流體與細胞接觸。「給予」及「處理」還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外及離體處理例如細胞。「處理」當應用於人、獸醫學或研究受試者時,是指治療處理、預防或預防性措施,研究及診斷應用。
「治療」意指給予患者內用或外用治療劑,諸如包含本發明的任一種結合化合物的組合物,所述患者具有一種或多種疾病症狀,而已知所述治療劑對這些症狀具有治療作用。通常,在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑,無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀而發展到任何臨床不可測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作「治療有效量」)可根據多種因素變化,例如患者的疾病狀態、年齡及體重,以及藥物在患者產生需要療效的能力。通過醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法,可評價疾病症狀是否已被減輕。雖本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患者都有的目標疾病症狀方面可能無效,但是根據本領域已知的任何統計學檢定方法如Student t檢定、卡方檢定、依據Mann及Whitney的U檢定、Kruskal-Wallis檢定(H檢定)、Jonckheere-Terpstra檢定及Wilcoxon檢定確定,其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
整個說明書及申請專利範圍中使用的術語「基本上由……組成」或其變形表示包括所有所述元件或元件組,並且任選包括與所述元件類似或不同性質的其它元件,所述其它元件非顯著改變指定給藥方案、方法或組合物的基本性質或新性質。作為非限制性例子,基本上由所提及的胺基酸序列組成的結合化合物還可以包括一種或多種胺基酸,其不顯著影響結合化合物的性質。
本發明所述的應用於某個對象的術語「天然存在的」是指這樣的事實,即該對象可在自然界中發現。例如存在於可從自然界來源分離得到的生物體(包括病毒)、且未經人工在實驗室中有意修飾的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
「有效量」包含足以改善或預防醫字病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化:如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑及劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
「外源性」指依據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。「內源性」指根據背景在細胞、生物或人體內產生的物質。
「同源性」是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置皆被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時,例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時,那麼所述分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如,在序列最佳比對時,如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源,那麼兩個序列為60%同源。一般而言,當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
本文使用的表述「細胞」、「細胞系」及「細胞培養物」可互換使用,並且所有這類名稱都包括其後代。因此,單詞「轉化體」及「轉化細胞」包括初代受試細胞及由其衍生的培養物,而不考慮轉移數目。還應當理解的是,由於故意或非有意的突變,所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下,其由上下文清楚可見。
「任選」或「任選地」意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生,該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如,「任選包含1~3個抗體重鏈可變區」意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
「藥物組合物」表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物,以及其他組分例如生理學/可藥用的載體及賦形劑。藥物組合物的目的是促進對生物體的給藥,利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
具體實施方式
以下結合實施例用於進一步描述本發明,但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常按照例行條件,如冷泉港的抗體技術實驗手冊,分子選殖手冊;或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑,為市場購買的例行試劑。
實施例1 免疫抗原、篩選抗原的序列及製備
編碼帶mFc標記的人類GITR(huGITR-mFc) 序列、編碼帶hFc標記的人類GITR(huGITR-hFc) 序列及帶HisX6標記的人類GITRL(huGITRL-His6)序列進行基因最佳化後合成序列(以上GITR重組蛋白皆由本發明設計模版序列),分別選殖到pCDNA3.1載體上(購自Invitrogen)。
huGITR-mFc序列 MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPKLENLYFQGPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK SEQID NO:53
huGITR-hFc序列 MAQHGAMGAFRALCGLALLCALSLGQRPTGGPGCGPGRLLLGTGTDARCCRVHTTRCCRDYPGEECCSEWDCMCVQPEFHCGDPCCTTCRHHPCPPGQGVQSQGKFSFGFQCIDCASGTFSGGHEGHCKPWTDCTQFGFLTVFPGNKTHNAVCVPGSPPAEPKLENLYFQGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQID NO:54
huGITRL-His6序列 MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMQLETAKEPCMAKFGPLPSKWQMASSEPPCVNKVSDWKLEILQNGLYLIYGQVAPNANYNDVAPFEVRLYKNKDMIQTLTNKSKIQNVGGTYELHVGDTIDLIFNSEHQVLKNNTYWGIILLANPQFISHHHHHH SEQID NO:55
將構築的重組質體分別轉染293F細胞7天後,將293細胞表現上清樣品高速離心後0.45μm濾膜過濾去除雜質,用PBS溶液平衡Protein A管柱,沖洗2~5倍管柱體積。將上清樣品注入管柱。 用PBS溶液沖洗管柱,至A280讀數降至基線。用0.1M Citric(pH3.2)溶液溶析目的蛋白,並用1M Tris-HCl(pH9.0)中及收集的溶析峰(eluting peak)。中和好的溶析液置換到PBS溶液,所得到的蛋白經電泳鑒定後分裝備用。得到帶mFc及hFc標記的huGITR。
將構築的重組質體轉染293F細胞7天後,將293細胞表現上清樣品高速離心後0.45μm濾膜過濾去除雜質,加入咪唑至最終濃度為5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡鎳管柱,沖洗2~5倍管柱體積。將上清樣品注入管柱。 用含有5mM咪唑的PBS溶液沖洗管柱,至A280讀數降至基線。用PBS+10mM咪唑沖洗層析管柱,去除非特異結合的雜蛋白,並收集流出液。再用含有500mM咪唑的PBS溶液溶析目的蛋白,並收集溶析峰。收集的溶析液置換到PBS溶液,所得到的蛋白經電泳鑒定後分裝備用。得到帶His標記的huGITRL。
實施例2 抗人類GITR單株抗體產生
抗人類GITR單株抗體藉由免疫小鼠而產生。實驗用BALB/c白小鼠,雌性,6周齡 (廣東省醫學實驗動物中心,動物生產許可證號:44007200025291) 。飼養環境:SPF級。小鼠購入後,實驗室環境飼養1周,12/12小時光/暗週期調節,溫度20~25℃;濕度40~60 %,5隻一組。免疫抗原為帶mFc標記的人GITR重組蛋白(GITR-mFc)。 組用弗氏佐劑(Freund's adjuvant)(sigma Lot Num:F5881/F5506)乳化:首次免疫用弗氏完全佐劑(CFA),其餘加強免疫用弗氏不完全佐劑 (IFA)。抗原與佐劑體積比例為1:1,250μl/50μg/隻(首次免疫),250μl/50μg/隻(加強免疫)。抗原乳化後進行接種,時間為第0、14、28、42天。第0天皮下(sc)多點注射50μg/隻的乳化後抗原。第14、28、42天根據背部結塊及腹部腫脹情況,選擇背部或腹膜內注射抗原。在進行脾細胞融合前3天加強免疫。
分別於第24、38、52天進行血液檢查,用測試例1的ELISA方法檢測小鼠血清,確定小鼠血清中的抗體效價。選擇血清中抗體效價高的小鼠進行脾細胞融合,採用最佳化的PEG媒介的融合步驟將脾淋巴細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0細胞(ATCC® CRL-1581™)進行融合得到雜交瘤細胞。並藉由實施例3的ELISA方法、實施例4阻斷GITRL的結合試驗檢測及實施例5與小鼠GITR(mouse-GITR)、食蟹獼猴GITR(cyno-GITR)的交叉結合活性檢測,結果見表1。
挑選出體外活性好的單選殖雜交瘤細胞株,收集對數生長期雜交瘤細胞,用RNAprep培養細胞/細菌總RNA提取套組(Tiangen,貨號:DP430)提取RNA(按照套組說明書步驟),反轉錄 (PrimeScript™ Reverse Transcriptase, Takara, cat # 2680A)。將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen, TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後送測序公司測序,剔除重複或具有相同CDR的高度相似序列後,得到鼠源單抗序列8A11、18F10、7D9及16G9。
鼠單抗8A11的重鏈及輕鏈可變區序列如下: 8A11 HCVR EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVAYISSGGSTYYPDSVKGRFTISRENARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCAREGYGTYGDYWGQGTTLTVSS SEQID NO:1 8A11 LCVR DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYLRTFGGGTKLEIK SEQID NO:2
鼠單抗18F10的重鏈及輕鏈可變區序列如下: 18F10 HCVR QVQLQQSGAELVRPGVSVKISCKCSGYTFTGYDLHWVKQSHAKSLDWIGVISTYYGDANYNQKFKGKATMTVDKSSSTAYMELARLTSEDSAIYYCTRLAESYFFDYWGQGTTLTVSS SEQID NO:9 18F10 LCVR QILLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWYQQKPGSSPKPWIYDTSDLASGFPARFSGTGSGTSYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSSYPFTFGSGTKLEIK SEQID NO:10
鼠單抗7D9的重鏈及輕鏈可變區序列如下: 7D9 HCVR DVQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITSDYAWNWIRQFPGNKLEWLGYISYSGSTYYNPSLKSRISLTRDTSKNQFFLQLNSVTSEDTATYYCARWDYRYDGRGFDYWGQGTTLTVSS SEQID NO:37 7D9 LCVR DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQDIGSGLNWLQQEPDGTIKRLIYATSSLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFVDYNCLQYTSTPWTFGGGTKLEIK SEQID NO:38
鼠單抗16G9的重鏈及輕鏈可變區序列如下: 16G9 HCVR QVQLQQSGAELAKPGASVKMSCKASGYTFTTYWIHWIKQRPGQGLEWIGYINPSTGYTDYNQNFKDKATLTADQYSSTAYMQLSSLTFEDSAVYYCANYYGSTPYYWGRGTTLTVSS SEQID NO:45 16G9 LCVR QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVTYVHWYQQKSGASPERWIFDASKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMETEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK SEQID NO:46
實施例3 ELISA結合實驗
GITR抗體藉由與GITR結合而阻斷GITR與細胞膜上的GITR相關受體結合,從而阻斷GITR下游訊息路徑。ELISA實驗被用來檢測GITR抗體的結合特性。被覆huGITR-mFc到ELISA微量盤中,抗體加入後訊息的強弱被用於判斷抗體及GITR的結合活性。
用pH9.5的CBS緩衝液將huGITR-mFc稀釋至1μg/ml濃度,以50μl/孔的體積加入96孔ELISA微量盤中,於4℃培養過夜。棄去液體後,加入用PBS稀釋的1%BSA封閉液300μl/孔,37℃培養箱培養2.5小時進行封閉。封閉結束後,棄去封閉液,並用PBST緩衝液(pH7.4PBS含0.05%tweeen-20)洗盤3次後,加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的不同濃度待測抗體,放於37℃培養箱培養30分鐘。培養結束後用PBST洗盤3次,加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗人二抗(Jackson Immuno Research,115-035-088),37℃培養30分鐘。用PBST洗盤3次後,加入50µl/孔TMB呈色基質,於室溫培養5min,加入50µl/孔1M H2
SO4
終止反應,用MD plus 384酵素免疫分析測讀儀(ELISA reader)在450nm處讀取吸收值,用SoftMax Pro6.2.1對數據進行分析而得出GITR抗體對GITR的結合EC50值,見表1。
實施例4 抗GITR抗體阻斷GITR及GITRL結合實驗
GITR可與細胞表面訊息路徑的共受體結合來抑制路徑活性。本實驗中,藉由體外阻斷實驗,而檢測所篩選出來的抗人類GITR抗體阻斷人類GITR及人類 GITRL結合。具體方法是將huGITR-hFc被覆到96孔ELISA微量盤後,加入抗GITR蛋白的抗體預培養,隨後將GITRL-his蛋白加入共培養30分鐘。洗盤後,檢測GITRL與GITR的結合訊息,用SoftMax Pro6.2.1對數據進行分析GITR抗體對GITR活性位點阻斷的EC50值。
用pH9.5的CBS緩衝液將huGITR-mFc稀釋為2μg/ml,以每孔50μl體積加入96孔ELISA微量盤中,於4℃培養過夜。棄去液體後,加入用PBS稀釋的1%BSA封閉液300μl/孔,37℃培養箱培養2.5小時進行封閉。封閉結束後,棄去封閉液,並用PBST緩衝液(PH7.4PBS含0.05% tweeen-20)洗盤3次後,加入50μl用樣品稀釋液(pH7.4 PBS)稀釋梯度濃度抗GITR抗體進行預培養,然後以50μl/孔的體積加入濃度為0.15μg/ml的人GITRL-his蛋白,混勻後置37℃培養箱培養30分鐘。培養結束後,棄去ELISA微量盤中的反應液,用PBST洗盤3次後,加入50μl/ 孔用樣品稀釋液以1:4000濃度稀釋的HRP標記的鼠抗his二抗於37℃培養30分鐘。用PBST洗盤3次後,加入50µl/孔TMB呈色基質,於室溫培養5min,加入50µl/孔2M H2
SO4
終止反應,MD plus 384酵素免疫分析測讀儀在450nm處讀取吸收值,用SoftMax Pro6.2.1對數據進行分析得出GITR抗體對GITR與GITRL結合阻斷的EC50值,見表1。
實施例5 抗GITR抗體與不同種屬GITR的交叉結合實驗
為了檢測篩選到的抗GITR抗體對於不同種屬來源的GITR的體外結合能力,小鼠GITR及食蟹獼猴GITR被用於進行體外結合檢測。
用pH9.5的PBS緩衝液將不同種屬GITR蛋白(mouse/cyno GITR)稀釋至1μg/ml,以50μl/孔的體積加入96孔ELISA微量盤中,於4℃放置過夜(16~18小時)。棄去盤中緩衝液,加入用PBS稀釋的1%BSA封閉液300μl/孔,37℃培養箱培養2.5小時進行封閉。封閉結束後,棄去封閉液,並用PBST緩衝液(PH7.4PBS含0.05%tweeen-20)洗盤3次後,加入50μl用樣品稀釋液(PH7.4 PBS)稀釋至不同濃度的GITR待測抗體,置37℃培養箱培養30分鐘。培養結束後,棄去ELISA微量盤中的反應液,用PBST洗盤3次後,加入50μl/孔用樣品稀釋液稀釋的HRP標記的羊抗鼠二抗(JacksonImmunoResearch, 109-035-088),37℃培養1小時。用PBST洗盤6次後,加入50µl/孔TMB呈色基質(NEOGEN,308177),於室溫培養5min,加入50µl/孔2M H2
SO4
終止反應,用MD plus 384酵素免疫分析測讀儀在450nm處讀取吸收值,計算GITR抗體對GITR的結合EC50值,見表1。
實施例6 體外結合親和力及動力學實驗
用Biacore,GE儀器測定待測人源化抗GITR抗體及人類GITR親和力。
使用Biacore儀器(Biacore T200,GE)的生物感測晶片Protein A (Cat. # 29-1275-56,GE) ,從而親和捕獲一定量的待測抗體,然後於晶片表面流經一系列濃度梯度下的GITR抗原 (人源h-GITR-his抗原選自SinoBiological公司(Cat. # 13643-H08H)),利用Biacore儀器(Biacore T200,GE)實時檢測反應訊息從而獲得結合及解離曲線。在每個循環解離完成後,用10mM甘胺酸,pH1.5將生物晶片洗淨再生。緩衝液為PBST,pH7.4。實驗得到的數據用Biacore T200 Evaluation 2.0,GE軟件以(1:1)Langmuir模型進行擬合,得出親和力數值,見表2。
實施例7 抗GITR抗體細胞活性實驗
本實驗藉由檢測細胞活性,而根據刺激IL-2分泌水平評價GITR抗體的體外細胞活性。配製Anti-CD3(2.0μg/mL),50μL/孔被覆,4℃被覆過夜;第二天用預冷PBS 300μL/孔洗滌一次,用PBS按照實驗設計濃度稀釋anti-GITR抗體,50μL/孔被覆在96孔盤中(在Anti-CD3 control孔中加入50 μL PBS),37℃,5% CO2
,3h(96孔盤外圍只加入300μL PBS);用預冷PBS 300μL/孔洗滌一次(Anti-CD28孔不用洗),細胞(PBMC)新鮮分離或復甦在含10%的RPMI 1640 Medium培養基中(復甦的細胞需要放在37℃培養2~3h才可以用),在96孔細胞培養盤中加入200μL的細胞懸浮液,密度為6*105
細胞/ml,培養基為10%的RPMI 1640 Medium(採用anti-CD28共刺激的孔中加入2.0 μg/mL的anti-CD28抗體:被覆有anti-CD3,但未被覆anti-GITR抗體的孔),將培養盤在培養箱培養48小時(37℃,5% CO2
);離心收集110μL/孔細胞上清,用IL-2 ELISA套組檢測IL-2的含量。各鼠源抗體的體外細胞活性實驗數據結果如圖1所示,其中8A11、18F10及20H11的功能活性較強且優於參照抗體BMAB(Merck的MK-4166抗體)(18F10及20H11具有完全相同的CDR序列,因此歸併為同一株抗體)。
實施例8 小鼠抗體人源化實驗
本實施例對所得鼠源抗體中功能活性最強的兩株(8A11及18F10)進行人源化。在所獲得的鼠源抗體VH/VLCDR典型結構的基礎上,將重、輕鏈可變區序列與抗體Germline數據庫比較,獲得同源性高的人種系模板。其中人類種系輕鏈框架區來自人κ輕鏈基因,本發明抗體較佳人種系輕鏈模版IGKV4-1*01(8A11)及IGKV3-11*01(18F10)。人類種系重鏈框架區來自人重鏈,本發明抗體較佳人種系重鏈模版IGHV3-48*03(8A11)及IGHV1-2*02(18F10)。
人種系重鏈模版IGHV3-48*03 (SEQ ID NO:21): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYEMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
人種系輕鏈模板IGKV4-1*01 (SEQ ID NO:22): DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTP
人種系重鏈模版IGHV1-2*02 (SEQ ID NO:23): QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR
人種系輕鏈模板IGKV3-11*01 (SEQ ID NO:24): EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP
將鼠源抗體的CDR區移植到選擇的人源化模板上,替換人源化可變區,再與IgG恆定區重組。然後,以鼠源抗體的三維結構為基礎,對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基,以及對VL及VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變,並對CDR區胺基酸殘基調整最佳化,其中鼠抗體18F10的HCDR2:VISTYYGDANYNQKFKG(SEQ ID NO:12)中胺基酸K最佳化為Q, LCDR1:RASSSVSYIH(SEQ ID NO:14 )中胺基酸I最佳化為L, 得到一系列人源化分子。其重鏈可變區序列如SEQ ID NO: 25~30所示;輕鏈可變區序列如SEQ ID NO: 31~36所示,最佳化後的CDR序列如SEQ ID NO:56~57所示。
hu8A11-VH-a(SEQ ID NO: 25): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPGKRLEWVAYISSGGSTYYPDSVKGRFTISRENAKNILYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYGTYGDYWGQGTTLTVSS
hu8A11-VH-b(SEQ ID NO: 26): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYGTYGDYWGQGTTLTVSS
hu8A11-VH-c(SEQ ID NO: 27): EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSYISSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYGTYGDYWGQGTTLTVSS
hu8A11-VL-a(SEQ ID NO: 28): DIVMTQSPSSLAVSVGERVTMSCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQQYYSYLRTFGGGTKLEIK
hu8A11-VL-b(SEQ ID NO: 29): DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYLRTFGGGTKLEIK
hu8A11-VL-c(SEQ ID NO: 30): DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYLRTFGGGTKLEIK
hu18F10-VH-a(SEQ ID NO: 31): QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYTFTGYDLHWVKQAHGQGLDWIGVISTYYGDATYNQKFQGRATMTVDTSSSTAYMELSRLTSEDTAVYYCTRLAESYFFDYWGQGTTLTVSS
hu18F10-VH-b(SEQ ID NO: 32): QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTGYDLHWVRQAPGQGLEWIGVISTYYGDANYNQKFQGRVTMTVDTSSSTAYMELSRLRSEDTAVYYCTRLAESYFFDYWGQGTTLTVSS
hu18F10-VH-c(SEQ ID NO: 33): QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTGYDLHWVRQAPGQGLEWIGVISTYYGDANYNQKFQGRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCTRLAESYFFDYWGQGTTLTVSS
hu18F10-VL-a(SEQ ID NO: 34): QIVLTQSPATLSASPGERVTMTCRASSSVSYIHWYQQKPGQAPKPWIYDTSNLASGFPARFSGDGSGTDYSLIISSMEAEDAATYYCHQRSSYPFTFGSGTKLEIK
hu18F10-VL-b(SEQ ID NO: 35): EIVLTQSPATLSASPGERVTLTCRASSSVSYLHWYQQKPGQAPKPWIYDTSDLASGFPARFSGDGSGTDYTLTISSLEAEDAAVYYCHQRSSYPFTFGSGTKLEIK
hu18F10-VL-c(SEQ ID NO: 36): EIVLTQSPATLSASPGERVTLTCRASSSVSYLHWYQQKPGQAPKPLIYDTSDLASGIPARFSGDGSGTDYTLTISSLEAEDAAVYYCHQRSSYPFTFGSGTKLEIK
經由以上各輕重鏈組合的抗體小規模表現測試及回復突變數量比較,綜合評判並選擇出最終的人源化hu8A11(使用VH-b重鏈及VL-b輕鏈)及hu18F10抗體分子(使用VH-b重鏈及VL-b輕鏈),其各自的完整輕重鏈序列如SEQ ID NO: 17~20所示。
hu8A11 HC EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVAYISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGYGTYGDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQID NO:17
hu8A11 LC DIVMTQSPSSLAVSVGERVTISCKSSQSLLYSTNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSYLRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQID NO:18
hu18F10 HC QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTFTGYDLHWVRQAPGQGLEWIGVISTYYGDANYNQKFQGRVTMTVDTSSSTAYMELSRLRSEDTAVYYCTRLAESYFFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQID NO:19
hu18F10 LC EIVLTQSPATLSASPGERVTLTCRASSSVSYLHWYQQKPGQAPKPWIYDTSDLASGFPARFSGDGSGTDYTLTISSLEAEDAAVYYCHQRSSYPFTFGSGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQID NO:20
實施例9 人源化抗體活性測試數據
將構築的人源化重組重鏈輕鏈質體組合(莫耳比1:1),分別轉染HEK293F細胞7天後,將293細胞表現上清樣品高速離心後0.45μm濾膜過濾去除雜質,用PBS溶液平衡Protein A管柱,沖洗2~5倍管柱體積。將上清樣品注入管柱。 用PBS溶液沖洗管柱,至A280讀數降至基線。用0.1M Citric(pH3.2)溶液溶析目的蛋白,並用1M Tris-HCl(pH9.0)中及收集的溶析峰。中和好的溶析液置換到PBS溶液,所得到的蛋白經SEC-HPLC鑒定後分裝並備用。
藉由實施例6的體外結合親和力及動力學實驗及實施例7的細胞活性實驗,測試最終的人源化版本抗體分子hu8A11及hu18F10,並與Merck公司的參照抗體BMAB相比較,結果分別如表2及圖2所示。
以上結果顯示,本發明人源化抗人類GITR抗體保留了人源化之前的結合活性、具備與BMAB參照相當或更強的細胞功能活性,且有很強的體外結合親和力。
實施例10 抗GITR抗體hu8A11對腫瘤細胞生長的抑制
取正常人外周血,用密度梯度離心法分離健康人PBMC。用CD14+ microbeads套組分選單核細胞,將他們與A375黑色素瘤細胞(上海生科院細胞庫,培養於含10% 胎牛血清的DMEM培養液中)混合,接種於每隻NCG小鼠(南京大學-南京生物醫藥研究院,適應性飼養5天)皮下。實驗動物均飼養於恆溫恆濕的獨立通風盒內,飼養室溫度18.0~至26.0℃,濕度40~70%,10~20次/小時換氣,晝夜明暗交替時間12h/12h。
實驗分為人類IgG1抗體對照組,三種恆定劑量的hu8A11組(250 μg,500 μg,1000 μg)及參照抗體BMAB組(1000 μg)。每組8隻小鼠,皮下注射給藥。整個實驗過程中,用遊標卡尺每週測量2次腫瘤長徑及寬徑,腫瘤體積(mm3
) = 0.5 ×(腫瘤長徑 × 腫瘤短徑2
)計算。相對腫瘤抑制率TGI(%):TGI%=(1-T/C)× 100%。T/C % 為相對腫瘤增殖率,即在某一時間點,治療組及對照組相對腫瘤體積或瘤重的百分比值。T及C分別為治療組及IgG1對照組在某一特定時間點的腫瘤體積(TV)或瘤重(TW)。
結果如表3、圖3及圖4顯示,人源化的抗GITR抗體hu8A11相對IgG1對照有顯著的抑瘤作用,且其抑瘤效果顯著強於相同劑量的參照抗體BMAB。
雖然以上描述了本發明的具體實施方式,但是本領域的技術人員應當理解,這些僅是舉例說明,在不背離本發明的原理及實質的前提下,可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此,本發明的保護範圍由所附申請專利範圍限定。
無
圖1為鼠源抗GITR抗體的體外細胞活性測試,顯示待測各抗體可有效刺激其細胞因子IL-2的分泌。各抗體功能強度藉由刺激IL-2分泌濃度而進行評價; 圖2為人源化抗GITR抗體的體外細胞活性測試,顯示待測抗體hu18F10及hu8A11皆可有效刺激其細胞因子IL-2的分泌,其功能強度與參照抗體BMAB相當或更強; 圖3為與人PBMC共移植之A375移植黑色素瘤的NCG小鼠荷瘤生長曲線; 圖4為與人PBMC共移植之A375移植黑色素瘤的NCG小鼠體重變化曲線。
Claims (28)
- 一種抗GITR抗體或其抗原結合片段,其包含:抗體輕鏈可變區,所述的抗體輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8所示的LCDR1、LCDR2及LCDR3;及抗體重鏈可變區,所述抗體重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2及HCDR3。
- 如申請專利範圍第1項中任一項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述的抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體、嵌合抗體、人類抗體或者人源化抗體。
- 如申請專利範圍第2項所述的抗GITR抗體或抗原結合片段,其中所述鼠源抗體或者所述嵌合抗體的輕鏈可變區LCVR為序列SEQ ID NO:2所示,重鏈可變區HCVR為序列SEQ ID NO:1所示。
- 如申請專利範圍第2項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述人源化抗體輕鏈可變區上的輕鏈FR區序列來源於如SEQ ID NO:22所示的人種系輕鏈IGkV4-1序列;及/或所述人源化抗體重鏈可變區上的重鏈FR區序列來源於如SEQ ID NO:21所示的人種系重鏈IGHV3-48序列。
- 如申請專利範圍第2項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中:所述人源化抗體輕鏈序列為如SEQ ID NO:18所示的序列或其變體;及/或所述人源化抗體重鏈序列為如SEQ ID NO:17所示的序列或其變體。
- 如申請專利範圍第5項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,所述的變體在輕鏈可變區有0~10的胺基酸變化,及/或在重鏈可變區有0~10的胺基酸變化。
- 如申請專利範圍第6項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中SEQ ID NO:18的胺基酸突變位點為49位,及/或SEQ ID NO:17的胺基酸突變位點為49位。
- 如申請專利範圍第7項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中SEQ ID NO:18的突變方式为S49P,及/或SEQ ID NO:17的突變方式为A49S。
- 如申請專利範圍第2、4、5項中任一項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈FR區。
- 如申請專利範圍第9項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述人源化抗體重鏈可變區進一步包含人源IgG1或IgG2的重鏈FR區。
- 根據申請專利範圍第2、4、5項中任一項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述人源化抗體或其抗原結合片段的可變區序列如下:重鏈可變區序列為SEQ ID NO:25-27之一所示,輕鏈可變區序列為SEQ ID NO:28-30之一所示。
- 根據申請專利範圍第11項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,其中所述抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區序列為SEQ ID NO:26所示,輕鏈可變區序列為SEQ ID NO:29所示。
- 一種多特異性抗體,含有如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段。
- 一種單鏈抗體,含有如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段。
- 一種抗體-藥物偶聯物(antibody-drug conjugates),其中所述的抗體含有如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段。
- 一種編碼如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段、如申請專利範圍第13項所述的多特異性抗體、如申請專利範圍第14項所述的單鏈抗體的核酸。
- 一種含有如申請專利範圍第16項所述的核酸的表現載體。
- 一種用如申請專利範圍第17項所述的表現載體轉化的宿主細胞。
- 如申請專利範圍第18項所述的宿主細胞,其為細菌、酵母菌或哺乳動物細胞。
- 如申請專利範圍第19項所述的宿主細胞,其為大腸桿菌,或者為畢赤酵母,或者為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚胎腎(HEK)293細胞。
- 一種用於製備如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GITR抗體及其抗原結合片段的方法,包括在如申請專利範圍第19項所述的宿主細胞中表現所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段,並自所述的宿主細胞中分離所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段。
- 一種藥物組合物,其含有如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段、如申請專利範圍第13項所述的多特異性抗體或者如申請專利範圍第14項所述的單鏈抗體,以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
- 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的抗GITR抗體或其抗原結合片段在製備用於治療GITR或GITRL媒介的疾病或病症的藥物中的用途。
- 如申請專利範圍第13項所述的多特異性抗體在製備用於治療GITR或GITRL媒介的疾病或病症的藥物中的用途。
- 如申請專利範圍第14項所述的單鏈抗體在製備用於治療GITR或GITRL媒介的疾病或病症的藥物中的用途。
- 如申請專利範圍第22項所述的藥物組合物在製備用於治療GITR或GITRL媒介的疾病或病症的藥物中的用途。
- 如申請專利範圍第23至26項中任一項所述的製藥用途,其中所述的疾病為癌症。
- 如申請專利範圍第27項所述的製藥用途,所述的癌症為黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、***癌、胰腺癌、腎癌、肺癌、肝癌、胃癌、結腸直腸癌、膀胱癌、食道癌、子宮頸癌、多發性骨髓瘤、白血病、淋巴癌、膽囊癌或膠質母細胞瘤。
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