KR20200131290A - 종양 전이의 약물 치료를 위한 표적 및 이의 응용 - Google Patents

종양 전이의 약물 치료를 위한 표적 및 이의 응용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 종양세포 전이를 억제 또는 예방하기 위한 약물의 선별에 있어서, PRAK의 약물 표적으로서의 응용에 관한 것이다. PRAK가 종양세포 전이 표적으로 사용될 수 있다는 발견을 바탕으로, 종양세포 전이를 억제 또는 예방할 수 있는 약물을 추가로 제공하며, 상기 약물의 활성성분은 PRAK 발현 수준을 감소시키거나 PRAK 생물학적 활성을 억제할 수 있고, 세포 이동, HIF1α, MMP2 및/또는 EMT 계열 분자의 발현 및/또는 기능을 조절함으로써, 종양세포 전이에 대한 억제 또는 예방을 실현한다.

Description

종양 전이의 약물 치료를 위한 표적 및 이의 응용
관련출원의 상호 참조
본 출원은 2018년 3월 27일자로 제출한 특허명칭이 '종양 전이의 약물 치료를 위한 표적 및 이의 응용'인 제201810259369.2호의 중국특허출원의 우선권을 주장하며, 그 모든 내용은 참고문헌으로 본 특허출원에 병합된다.
기술분야
본 발명은 생물공학 및 의약 분야에 관한 것이며, 구체적으로, 종양세포 전이를 억제 또는 예방하기 위한 약물의 선별에 있어서, PRAK의 약물 표적으로서의 응용에 관한 것이다.
악성종양은 쉽게 전이되며, 그 방식에는 네가지가 있다: 1. 인접 부위로 직접 확산되며; 2. 림프성 전이: 원발성 암 세포가 림프 흐름을 따라 각 레벨 림프절 및 폐, 간, 뼈, 뇌 등과 같은 멀리 떨어진 부위로 전이되어, 이차 종양을 형성하며; 3. 혈행성 전이: 암세포가 혈관에 진입하여, 혈관 내에서 또는 혈류를 따라 폐, 간, 뼈, 뇌 등과 같은 멀리 떨어진 부위로 전이되어, 이차 종양을 형성하며; 4. 파종: 종양세포가 탈락한 후 다른 부위에 파종되며, 예를 들면 내장의 암이 복막 또는 흉막에 파종된다. 악성종양 전이는 질환의 예후에 중대한 영향을 미친다.
종양 환자 사망의 90%는 전이로 인한 것으로 추정된다. 따라서, 사람들은 종양세포 전이의 억제/예방에 관한 연구를 지속적으로 진행하여 왔다.
P38-조절/활성화 단백질 키나아제(PRAK, MK5라고도 함)는 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 패밀리 구성원의 하나이다. 상기 PRAK는 p38 MAPK의 하류 기질로서, 그 자체도 키나아제이고, HSP27, ERK3/4, 14-3-3ε, p53, FOXO3, Rheb 등의 인산화와 같은 다양한 기질에 대해 촉매 작용을 할 수 있으며, 세포 스트레스, 대사, 운동, 성장, 노화 등과 같은 생명 과정의 조절에 참여한다. 예를 들면, 에너지가 소진된 등의 상태에서, p38이 활성화되고, 나아가 PRAK를 활성화시키며, 후자는 Rheb 인산화에 대해 촉매 작용을 하여, mTORC1의 활성이 억제되도록 함으로써, 세포 대사를 조절한다. 종양 형성에 있어서의 상기 PRAK의 작용에 관하여, 기존 연구에 따르면, PRAK는 한편으로 세포 노화를 촉진하여 종양의 발생을 억제하고, 다른 한편으로 혈관 형성을 유도하여 이미 형성된 종양의 발전을 가속화한다. 그러나, 종양 전이에 있어서의 상기 PRAK의 작용은 아직 알려지지 않았다.
종래 기술에 존재하는 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 종양 전이의 약물 치료를 위한 표적 및 이의 응용을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 기술방안은 다음과 같다:
먼저, 본 발명은 종양세포 전이를 억제 또는 예방하기 위한 약물의 선별에 있어서, PRAK의 약물 표적으로서의 응용을 제공한다.
또한, 본 발명은 종양세포 전이를 억제 또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서, PRAK 억제제의 응용을 제공한다.
상기 억제제는 PRAK 발현 수준을 감소시키거나 PRAK 생물학적 활성을 억제하는 것으로 나타난다. 여기서, 상기 억제제는 특이적 또는 비특이적으로 PRAK의 발현 수준을 감소시키거나 PRAK 생물학적 활성을 불활성화시키는 억제제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 즉, PRAK의 발현을 감소시키거나 PRAK 생물학적 활성을 감소시켜 종양세포 전이의 억제 또는 예방을 실현한 약물이라면 모두 본 발명의 보호범위에 속한다.
선택적으로, 상기 억제제는 화학 약물, 생물학적 거대분자, 폴리펩티드, 단일사슬항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 짧은 헤어핀 RNA, 작은 간섭 RNA, 유전자 편집 시스템으로부터 선택될 수 있다.
여기서, 상기 화학 약물은 PRAK 발현 수준을 감소시키거나 PRAK 생물학적 활성을 억제할 수 있는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
본 발명은 연구과정에서 종래 기술의 퇴행성 및 염증성 질환을 치료하기 위한 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피라진 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 전구약물 및 이의 입체 이성질체, 동위원소 변이체 및 호변 이성질체(공개번호가 CN101454326A인 특허출원에 기재됨), 및 퇴행성 및 염증성 질환을 치료하기 위한 이미다조[1,2-a]피라진 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 전구약물 및 이의 입체 이성질체, 동위원소 변이체 및 호변 이성질체(공개번호가 CN102036997A인 특허출원에 기재됨)가 PRAK 억제제로 사용될 수 있고, PRAK의 생물학적 활성을 억제하고, 종양세포의 이동 능력을 감소시키고, HIF1α, MMP2및 EMT 계열 분자의 발현 및 기능을 조절함으로써, 종양세포 전이의 억제 또는 예방을 실현할 수 있음을 발견하였다. 즉, 본 발명은 해당 화합물 및 이의 약학 조성물의 새로운 용도를 제공하며, 이를 종양세포 전이의 억제 또는 예방에 사용한다.
또한, 본 발명은 수많은 객관적 시험을 통해 메커니즘을 탐구하여, 상기 억제제가 PRAK 생물학적 활성을 억제하여, 종양세포 이동 능력을 감소시키고, HIF1α, MMP2 및/또는 EMT 계열 분자의 발현 및/또는 기능을 조절함으로써, 종양세포 전이의 억제 또는 예방을 실현하는 것을 발견하였다.
또한, 상기 억제제는 PRAK 생물학적 활성을 억제하여, mTOR의 단백질 번역을 촉진하는 능력을 조절함으로써, HIF1α 단백질의 발현을 감소시킨다.
PRAK는 다양한 종양세포에서 발현되고, HIF1α 단백질은 종양 전이의 주요 조절인자이므로, 본 발명의 상기 종양세포는 흑색종 세포, 유방암 세포 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시형태에서 제공한 예시적인 설명에 따라, 당업자는 통상적인 지식에 근거하여 상기 종양은 뇌종양, 폐암, 방광암, 위암, 난소암, 복막암, 췌장암, 두경부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 결장직장암, 간암, 신장암, 식도암, 담낭암, 비호지킨림프종, 전립선암, 갑상선암, 여성 생식기암, 림프종, 골암, 피부암, 결장암, 고환암 등을 포함할 수 있는 것을 추론할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상술한 연구 결과를 바탕으로, 종양세포 전이를 억제 또는 예방할 수 있는 약물을 제공하며, 상기 약물의 활성성분은 PRAK 생물학적 활성을 억제할 수 있다.
또한, 상기 메커니즘을 바탕으로, 본 발명은 종양세포 이동 능력을 감소시키고 HIF1α, MMP2 및/또는 EMT 계열 분자의 발현 및/또는 기능을 조절하는 약물, 및 mTOR 활성을 조절하는 약물을 제공하며, 상기 약물의 활성성분은 PRAK 생물학적 활성을 억제할 수 있다.
설명하여야 할 것은, 본 발명은 연구를 통해 PRAK 생물학적 활성과 'mTOR 활성', 및 'HIF1α, MMP2 및/또는 EMT 계열 분자의 발현 및/또는 기능' 간의 관계를 발견하였으므로, PRAK를 표적으로 하는 억제제를 사용하여 mTOR의 활성을 조절하거나, HIF1α, MMP2 및/또는 EMT 계열 분자의 발현 및/또는 기능을 조절함으로써 실현한 파생 응용도 본 발명의 보호범위에 속한다.
본 발명에서 사용한 실험수단은 (1) 저분자 화합물 억제제; (2) 유전자 수준의 개입, 구체적으로 PRAK 유전자 녹아웃 마우스(PRAK 녹아웃); B16(마우스 흑색종) 세포주는 Cas9를 통해 PRAK를 녹아웃시키고(PRAK 녹아웃); A375(인간 흑색종)/MDA-MB-231(인간 유방암 세포주) 세포주는 shRNA 형질주입을 통해 PRAK를 녹다운시키는 것을 포함한다.
PRAK 억제제, PRAK 녹다운 마우스 및 다양한 녹아웃/녹다운 세포주를 제조한 후, 흑색종 및 유방암 세포주의 생체 외 기능 및 종양 보유 마우스와 자발성 유방암 마우스의 개입에 사용되며, 실험 결과는 다음과 같다:
(1) 생체 외 실험:
B16(마우스 흑색종), A375(인간 흑색종) 및 MDA-MB-231(인간 유방암 세포주)의 transwell 챔버 실험 결과와 스크래치 실험 결과는 PRAK 분자 결실 또는 발현 수준의 감소는 종양세포의 생체 외 이동능력을 크게 감소시키지만, 종양세포의 증식(MTS 테스트)과 사멸(annexin V-7-AAD 조합 염색)에 영향을 미치지 않음을 입증한다.
(2) 생체 내 실험:
A) B16 피하주사 모델(s.c.)의 결과는 PRAK 녹아웃/녹다운 또는 억제제의 사용은 원위치(in situ) 종양세포의 성장에 영향을 미치지 않고, 그 종양 성장 곡선 및 최종 종양 크기/중량은 야생형 군 또는 억제제를 사용하지 않은 군과 유의한 차이가 없음을 나타낸다.
B) B16 꼬리 정맥주사 모델(i.v.)의 결과는 PRAK 녹아웃/녹다운 또는 억제제의 사용은 해당 모델의 폐 전이율을 크게 감소시키고, 투여량 의존적 효과가 있음을 나타낸다. 또한, 이러한 개입은 종양세포 전이 초기에 더 큰 의미가 있으며, 종양세포 주사 후 처음 5일 동안 PRAK 억제물질을 사용하면 종양세포의 원격전이에 대한 억제 작용을 실현할 수 있으며, 그 작용 효과는 전체 과정에서 억제제를 주사한 효과와 거의 동일하다. 이 시간대를 놓친 후 억제제를 사용하면, 거의 효과가 없다. A375 인간 흑색종에 shPRAK 및 PRAK 억제물질을 사용할 경우 유사한 효과를 나타낸다.
C) MDA-MB-231 생체 내 영상 모델: 생체 내 형광 검출 방법을 사용하여, B16 꼬리 정맥주사 모델과 유사한 결과를 얻었다. 즉, shPRAK/PRAK 억제물질의 사용은 종양세포의 폐 부위의 집락화를 강력하게 억제하며, 14일/21일(마지막으로 결과를 얻고 마우스를 희생시킨 시간)의 모니터링 결과는 모두 억제제 군의 폐 부위 형광 강도가 억제제를 사용하지 않은 군보다 훨씬 낮음을 나타낸다.
D) MMTV-PyMT 마우스 자발성 유방암 모델: MMTV-PyMT 자발성 유방암 마우스(거의 100% 발병하고, 발병 시간은 8 내지 12주이고, 시판되는 것을 구입할 수 있으며, 예를 들면 Jackson Lab(JAX)에서 구입할 수 있음)를 PRAK 녹아웃 마우스와 교배시켜 MMTV-PyMT 배경 하의 야생형 및 PRAK 녹아웃 마우스를 얻었다. 그 결과, PRAK 녹아웃을 사용하면 PyMT 마우스의 자발성 폐 전이율을 크게 감소시킬 수 있고, PRAK 녹아웃 PyMT 마우스에서 1마리(1/19)만 폐 부위에서 1개의 전이병소를 발견하였으며, 이로부터 PRAK 녹아웃은 암세포의 전이 억제율을 현저하게 향상시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한, 해당 마우스의 원위치 종양세포의 생물학적 특성(원위치 종양세포를 직접 그라인딩 및 소화시킨 후 테스트를 진행함)은 생체 외 실험 결과와 유사하며, 즉, PRAK의 결실은 종양세포의 원격전이 효과에만 영향을 미치고, 이의 증식 및 사멸은 영향을 받지 않는다. PRAK 억제제를 사용하는 경우에도 유사한 전이 억제 효과가 있다.
(3) PRAK가 종양 전이를 조절하는 잠재적 메커니즘:
A) RNA-seq 빅데이터 분석에 따르면, PRAK의 발현은 저산소증 및 산화 환원 관련 경로와 밀접한 관련이 있으며;
B) PRAK는 HIF1α, MMP2 및 EMT 계열 분자의 발현과 기능을 조절할 수 있으며;
C) PRAK는 mTOR 활성을 조절함으로써 HIF1α 단백질의 합성을 조절할 수 있다.
(4) PRAK발현과 폐선암/편평상피세포암 환자 전이의 상관관계: 종양 전이가 발생한 환자와 종양 전이가 발생하지 않은 환자의 원위치 종양 표본를 비교하면, 종양 전이가 발생한 환자에서 더 높은 수준의 PRAK가 발현된다(p<0.005). 또한, PRAK의 발현은 MMP2와 양의 상관관계를 가진다(r (Spearman)=0.5050238 (p=3.651e-05)).
(5) PRAK의 RNA 수준과 폐암 환자의 생존율에 대한 빅데이터 스크리닝은 PRAK 발현의 높고 낮음이 환자의 생존율과 유의한 음의 상관관계가 있음을 나타낸다.
당업계의 상식에 부합되는 것을 기반으로, 상술한 각 바람직한 조건을 서로 조합하여 구체적인 실시형태를 얻을 수 있다.
본 발명의 유익한 효과는 다음과 같다:
본 발명은 종양세포 전이를 효과적으로 억제할 수 있는 표적 PRAK를 제공하고, 이의 작용 메커니즘을 탐구하였으며, PRAK의 효소 활성을 감소시키거나 PRAK 발현 수준을 감소시켜, 종양세포의 이동 능력을 감소시킬 수 있고, mTOR 활성, HIF1α, MMP2 및/또는 EMT 계열 분자의 발현 및/또는 기능을 조절함으로써, 종양세포 전이의 억제 또는 예방을 실현할 수 있음을 발견하였다.
한편, 본 발명은 실험 연구를 통해 기존의 종양 화학요법 약물과 다른 PRAK 억제제의 특성을 입증하였다. 화학요법 약물은 일반적으로 종양세포의 성장 및 생존에 영향을 미침으로써 항종양 효과를 발휘하며, 정상 조직에 대한 독성 및 내약성은 거의 불가피하다. PRAK의 녹아웃/녹다운 또는 억제제의 사용은 원위치 종양세포의 성장 및 생존에 영향을 미치지 않고, 전이 단계에만 작용하여 원격전이의 발생을 방지한다. 이러한 개입은 종양세포 전이 초기에 더 큰 의미가 있으며, 종양세포 정맥주사 후 처음 5일 동안 PRAK 억제물질을 사용하면 종양세포의 원격전이에 대한 억제 작용을 실현할 수 있고, 종양세포의 폐 부위 집락화를 강력하게 억제할 수 있다.
도 1은 B16-F10의 증식에 대한 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 2는 B16-F10의 사멸에 대한 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 3은 B16-F10의 이동에 대한 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 4는 B16-F10의 침입에 대한 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 B16-F10 종양 원위치 성장에 대한 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 6은 B16-F10의 폐 집락화 능력에 대한 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 7은 B16-F10 종양세포 원격전이에 대한 시간별 및 3가지 상이한 PRAK 억제제 처리의 영향을 나타낸 것이다.
도 8은 A375의 침입 능력에 대한 PRAK 녹다운 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 9는 A375의 폐 집락화 능력에 대한 PRAK 녹다운 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 10은 MDA-MB-231의 침입 능력에 대한 PRAK 녹다운 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 11은 MDA-MB-231의 폐 집락화 능력에 대한 PRAK 녹다운 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 12는 MMTV-PyMT 마우스 자발성 유방종양의 발생에 대한 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 13은 MMTV-PyMT 마우스 자발성 유방종양의 폐 전이에 대한 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제의 영향을 나타낸 것이다.
도 14는 MMTV-PyMT 마우스 종양세포의 생체 외 증식에 대한 PRAK 녹아웃의 영향을 나타낸 것이다.
도 15는 MMTV-PyMT 마우스 종양세포의 생체 외 사멸에 대한 PRAK 녹아웃의 영향을 나타낸 것이다.
도 16은 야생형 및 PRAK 녹아웃 B16-F10 세포의 RNA Seq 결과 차별적으로 발현된 유전자의 분포를 나타낸 것이다.
도 17은 야생형 및 PRAK 녹아웃 B16-F10 세포에서 차별적으로 발현된 유전자의 GO 경로 농화를 나타낸 것이다.
도 18은 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제가 B16-F10 세포주에서 HIF-1α 및 MMP2의 단백질 발현 수준을 현저하게 감소시키는 것을 나타낸 것이다.
도 19는 B16-F10 세포주에서 EMT 관련 분자의 발현에 대한 PRAK 녹아웃의 영향을 나타낸 것이다.
도 20은 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제에 의해 유도된 mTOR 경로 관련 분자의 인산화 수준의 변화를 나타낸 것이다.
도 21은 원격전이가 발생하지 않은 폐암 환자와 원격전이가 발생한 폐암 환자의 종양 샘플에서 PRAK의 mRNA 수준의 측정을 나타낸 것이다.
도 22는 폐암 환자의 종양 샘플에서 PRAK 및 MMP2의 mRNA 발현 수준의 상관관계 분석을 나타낸 것이다.
도 23은 GEPIA 데이터베이스에서 PRAK의 높은 발현 및 낮은 발현을 보이는 폐암 환자의 생존기간 분석을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 결합하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위해 제공된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아님을 이해하여야 한다. 당업자는 본 발명의 취지와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있다.
하기 실시예에서 사용된 실험방법은 특별한 언급이 없는 한 모두 통상적인 방법이다.
하기 실시예에서 사용된 재료, 시약 등은 특별한 언급이 없는 한 모두 상업적으로 구입할 수 있다.
본 발명의 하기 실시예에서 사용된 PRAK 억제제는 하기 화합물로부터 선택된다:
Figure pct00001
실시예 1
본 실시예는 마우스 흑색종을 예로 들어 B16-F10의 생체 외 증식, 생체 외 생존, 침입 능력, 종양 원위치 성장 및 초기 폐 집락화에 대한 PRAK의 영향을 설명한다.
I. 실험방법:
1. 생체 외 증식 및 생존에 대한 영향
실험 단계:
MTS: 동일한 개수의 PRAK WT 및 KO 세포를 96웰 플레이트에 넣고, 벽에 부착된 후 시간별로 Cell Titer 96 Aqueous 세포 증식 측정용액을 첨가하고, 37℃에서 1 내지 4시간 동안 배양한 후, 490nm에서 흡광도 값을 측정하고, 세포 증식 곡선을 제작하였다.
Annexin V/7-AAD 염색: 세포를 24웰 플레이트에 넣고, 벽에 부착된 후 PRAK 억제제 0.1μM 및 1μM를 첨가하여 처리하고, 24시간 후 세포를 수집하여 Annexin V/7-AAD 염색을 진행하고, 유세포 분석을 통해 세포 사멸 정황을 분석하였다.
2. 이동 및 침입 능력에 대한 영향
실험 단계:
스크래치 실험: 동일한 개수의 PRAK WT 및 KO 세포를 12웰 플레이트에 넣고, 벽에 부착된 후 웰 플레이트 중심에 피펫팁으로 스크래치를 만들고, 0.1% FBS의 배지로 교체하여 배양하고, 24시간 후 스크래치 상처 치유 정황을 비교하였다. 이와 유사하게, 농도별 PRAK 억제제가 스크래치 상처 치유에 미치는 영향도 비교할 수 있다.
침입 실험: Matrigel로 코팅된 Transwell 챔버를 37℃에서 미리 재수화하고, 2시간 후 0.5×105 내지 2×105의 세포를 무혈청배지에 재현탁시켜 상부 챔버에 방치하고, 하부 챔버에 10% FBS 배지를 첨가하고, 12 내지 20시간 후 상부 챔버를 꺼내어 액체를 흡입하여 제거하고, 미리 냉각시킨 메탄올에 넣어 4℃에서 15분 동안 고정시켰다. 메탄올을 흡입하여 제거하고, 면봉으로 챔버 내의 막 표면을 닦아 건조시키고, 차광 상태에서 챔버를 크리스탈 바이올렛으로 20분 동안 염색하였다. PBS로 5분씩 3회 세척하였다. 챔버 내의 막 표면을 닦아 건조시키고, 챔버를 밀봉하고, 현미경을 이용하여 계수하였다.
3. 종양 원위치 성장에 대한 영향
실험 단계: 6 내지 8주령의 C57BL/6 암컷 마우스(시판되는 것을 구입할 수 있으며, 예를 들면 Charles River에서 구입할 수 있음)를 선택하여 실험을 진행하며, 대수성장기의 B16-F10 세포를 소화시키고, PBS로 2회 세척하고 계수한 후, PBS에 재현탁시켜 세포 현탁액 농도를 1.5×106/ml로 조절하였다. 종양세포를 마우스 옆구리 늑골 부위에 피하 접종하며, 한마리당 3×105개의 세포를 함유하는 세포 현탁액 200μL를 접종하였다. 투여군은 2mg/kg/d로 PRAK 억제제를 복강 주사하였다.
매 2일마다 버니어 캘리퍼스로 종양의 장경(L) 및 단경(S)을 측정하고, 식 L×S×S×0.5에 의해 종양의 크기를 계산하고, 종양 성장 곡선을 제작하였다.
4. 초기 폐 집락화에 대한 영향
실험 단계: 6 내지 8주령의 C57BL/6 암컷 마우스를 선택하여 실험을 진행하며, 대수성장기의 B16-F10 세포를 소화시키고, PBS로 2회 세척하고 계수한 후, PBS에 재현탁시켜 세포 현탁액 농도를 5×105/ml로 조절하였다. 종양세포를 꼬리 정맥주사를 통해 마우스 체내에 주입하고, 한마리당 1×105개의 세포를 함유하는 세포 현탁액 200μL를 주입하였다. 15일 후, 마우스를 희생시키고, 폐를 적출하여 폐 표면의 종양 결절의 개수를 계수하였다. 투여군은 0 내지 4일에 투여 또는 5 내지 15일에 투여한 군으로 나누며, 투여 방식은 2mg/kg/d로 PRAK 억제제를 복강 주사하였다.
II. 실험 결과:
1. 도 1에서와 같이, PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제는 B16-F10의 증식에 유의한 영향을 미치지 않는다.
2. 도 2에서와 같이, PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제는 B16-F10의 사멸에 유의한 영향을 미치지 않는다.
3. 도 3에서와 같이, PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제는 B16-F10의 이동 능력을 유의하게 억제하였다.
4. 도 4에서와 같이, PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제는 B16-F10의 침입 능력을 유의하게 억제하였다.
5. 도 5에서와 같이, PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제는 피하 접종된 B16-F10 종양의 원위치 성장에 유의한 영향을 미치지 않는다.
6. 도 6에서와 같이, PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제는 정맥주사된 B16-F10 세포의 폐 집락화 능력을 유의하게 억제하였다.
7. 도 7에서와 같이, 세포를 정맥주사한 후 0 내지 4일째에 PRAK 억제제를 사용하면 B16-F10 종양세포의 원격전이를 유의하게 억제할 수 있다. 5 내지 15일째에 PRAK 억제제를 사용하면 유의한 억제효과가 없다. 그뿐만 아니라, 상기 실험 결과는 3가지 상이한 PRAK 억제제가 모두 유사한 억제 효과를 가지고 있음을 나타낼 수 있다.
이로부터 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제는 B16-F10의 증식 및 원위치 성장에는 유의한 영향을 미치지 않으나, B16-F10의 침입 능력과 폐 집락화 능력을 현저하게 억제할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 2
본 실시예는 인간 흑색종을 예로 들어 A375의 침입 능력 및 폐 집락화 능력에 대한 PRAK의 영향을 설명한다.
I. 실험방법:
B16-F10을 A375로 대체하고, PRAK 녹다운은 shRNA 형질주입을 사용하고, 생체 내에 접종된 수용체 마우스가 Scid-Beige(시판되는 것을 구입할 수 있으며, 예를 들면 Charles River에서 구입할 수 있음)인 것을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 진행하였다.
II. 실험 결과:
1. 도 8에서와 같이, PRAK 녹다운 및 PRAK 억제제는 A375의 침입 능력을 유의하게 억제하였다.
2. 도 9에서와 같이, PRAK 녹다운 및 PRAK 억제제는 A375의 폐 집락화 능력을 유의하게 억제하였다.
이로부터 PRAK 녹다운 및 PRAK 억제제는 A375의 침입 능력 및 폐 집락화 능력을 현저하게 억제할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 3
본 실시예는 인간 유방암 세포주를 예로 들어 MDA-MB-231의 침입 능력 및 폐 집락화 능력에 대한 PRAK의 영향을 설명한다.
I. 실험방법:
실험 단계: 6 내지 8주령의 SCID Beige 암컷 마우스를 선택하여 실험을 진행하며, 대수성장기의 야생형 또는 PRAK shRNA로 형질주입된 MDA-MB-231 세포를 소화시키고, PBS로 2회 세척하고 계수한 후, PBS에 재현탁시켜 세포 현탁액 농도를 2.5×106/ml로 조절하였다. 종양세포를 꼬리 정맥주사를 통해 마우스 체내에 주입하고, 한마리당 5×105개의 세포를 함유하는 세포 현탁액 200μL를 주입하였다. IVIS Spectrum 소동물 생체 내 영상 시스템을 사용하여 마우스 폐 부위의 종양세포 성장 정황을 모니터링하고, 21일 후, 마우스를 희생시키고, 폐를 적출하여 폐 표면의 종양 결절의 개수를 계수하였다. 투여군은 처음 5일 동안 2mg/kg/d로 PRAK 억제제를 복강 주사하였다.
II. 실험 결과:
1. 도 10에서와 같이, PRAK 녹다운 및 PRAK 억제제는 MDA-MB-231의 침입 능력을 유의하게 억제하였다.
2. 도 11에서와 같이, PRAK 녹다운 및 PRAK 억제제는 MDA-MB-231의 폐 집락화 능력을 유의하게 억제하였다.
이로부터 PRAK 녹다운 및 PRAK 억제제는 MDA-MB-231의 침입 능력 및 폐 집락화 능력을 현저하게 억제할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 4
본 실시예는 MMTV-PyMT 자발성 유방암 마우스를 예로 들어 자발성 유방암의 폐 전이에 대한 PRAK의 영향을 설명한다.
I. 실험방법:
1. 마우스의 원발성 유방종양의 발생 및 성장에 대한 영향
MMTV-PyMT 마우스를 PRAK 마우스와 교배시켜 MMTV-PRAK WT 및 MMTV-PRAK 녹아웃 마우스를 얻고, 8 내지 10주째부터 유방 부위의 종양 발생 정황을 관찰하고, 다른 한 군의 MMTV-PRAK WT 마우스에게 12주째부터 격일로 PRAK 억제제(1mg/kg)를 투여하였다. 15주까지 투여하고, 마우스를 희생시키고, 유방종양 결절을 계수하고, 무게를 칭량하고, 이와 동시에 폐 부위의 종양 결절을 계수하였다.
2. 마우스의 원발성 종양의 생체 외 증식 및 사멸에 대한 영향
실험 단계: 마우스의 유방 원위치 종양을 적출하여 조각으로 자르고, DNA 효소 및 콜라겐 분해효소에 의한 소화 처리, 밀도 구배 원심분리의 방식으로 종양세포를 분리하고, MTS 분석 및 Annexin V/7-AAD 염색을 진행하였다.
II. 실험 결과:
1. 도 12에서와 같이, PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제는 유방 자발성 종양 발생율 및 성장에 유의한 영향을 미치지 않는다.
2. 도 13에서와 같이, PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제는 마우스의 유방 자발성 종양의 폐 전이를 유의하게 억제하였다.
3. 도 14에서와 같이, PRAK 녹아웃은 마우스의 자발성 유방종양에서 분리된 종양세포의 생체 외 증식 능력에 유의한 영향을 미치지 않는다.
4. 도 15에서와 같이, PRAK 녹아웃은 마우스의 자발성 유방종양에서 분리된 종양세포의 생체 외 사멸 수준에 유의한 영향을 미치지 않는다.
실시예 5
본 실시예는 B16-F10 세포주 유전자 전사 프로파일에 대한 PRAK 녹아웃의 영향을 설명한다.
I. 실험방법:
1. PRAK WT 및 PRAK 녹아웃 B16-F10 세포의 RNA를 각각 추출하여 RNA Seq를 수행하고, 얻어진 차별적으로 발현된 유전자에 대해 GO 농화를 진행하였다.
II. 실험 결과:
1. 도 16에서와 같이, 야생형과 비교하여, PRAK 유전자 녹아웃 후 나타나는 차별적으로 발현된 유전자의 대부분은 하향 조절되고, 작은 일부분의 발현은 상향 조절되었다.
2. 도 17에서와 같이, PRAK WT 및 PRAK 녹아웃 경우의 차별적으로 발현된 유전자의 기능적 농화는 PRAK 녹아웃 후 하향 조절된 많은 유전자가 저산소 반응과 관련이 있음을 나타낸다.
실시예 6
본 실시예는 HIF1α, MMP2 및/또는 EMT 계열 분자의 발현 및 기능에 대한 PRAK의 영향을 설명한다.
I. 실험방법:
Western Blot 방법으로 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제 처리 후 각 분자의 단백질 수준의 변화를 측정하였다.
II. 실험 결과:
1. 도 18에서와 같이, PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제는 B16-F10 세포주에서 HIF-1α 및 MMP2의 발현 수준을 현저하게 감소시켰다.
2. 도 19에서와 같이, PRAK 녹아웃은 B16-F10 세포주에서 N-cadherin의 발현을 현저하게 감소시킴과 동시에 E-cadherin의 발현을 촉진하였다.
실시예 7
본 실시예는 mTOR 관련 분자의 발현에 대한 PRAK의 영향을 설명한다.
I. 실험방법:
Western Blot 방법으로 PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제 처리 후 각 분자의 단백질 인산화 수준의 변화를 측정하였다.
II. 실험 결과:
도 20에서와 같이, PRAK 녹아웃 및 PRAK 억제제 처리 후, mTOR 경로 관련 분자의 인산화 수준은 하향 조절되었다.
실시예 8
본 실시예는 PRAK와 폐암 환자의 종양 전이 능력의 상관관계를 설명한다.
I. 실험방법:
1. 폐선암 및 폐편평상피세포암 환자의 종양 표본을 수집하고, PRAK 발현에 대해 mRNA 수준 측정을 진행하고, 수술 후의 후속 관찰에 따라 원격전이가 발생하지 않은 군(N)과 원격전이가 발생한 군(T)으로 나누고, 결과에 대해 통계분석을 진행하였다.
2. 상기 환자 샘플의 PRAK 및 MMP2에 대해 mRNA 수준 측정을 진행하고, 결과에 대해 상관관계 분석을 진행하였다.
3. GEPIA 웹사이트 데이터베이스를 이용하여, 폐암 환자의 생존기간에 대한 PRAK 발현 수준의 영향을 분석하였다.
II. 실험 결과:
1. 도 21에서와 같이, 전이가 발생한 환자는 원격전이가 발생하지 않은 환자에 비해 종양 샘플에서 PRAK 발현이 비교적 높다.
2. 도 22에서와 같이, 종양 환자 샘플에서 PRAK와 MMP2의 발현 수준은 양의 상관관계를 가진다.
3. 도 23에서와 같이, 폐암 환자의 생존기간과 PRAK 유전자는 유의한 상관관계를 가지고 있고, PRAK 발현이 높은 환자는 PRAK 발현이 낮은 환자에 비해 생존기간이 짧다.
상술한 바를 종합하면, 실시예 2 내지 9는 모두 PRAK 억제제-23을 PRAK 억제제로 사용하여 실험을 진행한 후, PRAK 억제제-22, PRAK 억제제-29로 대체하여 반복 실험을 진행하고, 실험을 통해 3가지 억제제의 기능이 동일하다는 것을 입증하였다(모두 동일한 억제 효과를 실현할 수 있음).
이상에서 일반적인 설명 및 구체적인 실시형태로 본 발명을 상세하게 설명하였지만, 본 발명에 기초하여 일부 수정 또는 개선이 이루어질 수 있음은 당업자에게 있어서 자명한 것이다. 따라서, 본 발명의 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 이루어진 이러한 수정 또는 개선은 모두 본 발명의 보호범위에 속한다.
[산업상 이용가능성]
본 발명은 종양세포 전이를 억제 또는 예방하기 위한 약물의 선별에 있어서, PRAK의 약물 표적으로서의 응용을 개시한다. 본 발명은 PRAK가 종양세포 전이 표적으로 사용될 수 있다는 발견을 바탕으로, 종양세포 전이를 억제 또는 예방할 수 있는 약물을 추가로 제공하며, 상기 약물의 활성성분은 PRAK 발현 수준을 감소시키거나 PRAK 생물학적 활성을 억제할 수 있고, 세포 이동, HIF1α, MMP2 및/또는 EMT 계열 분자의 발현 및/또는 기능을 조절함으로써, 종양세포 전이의 억제 또는 예방을 실현하며, 우수한 경제적 가치와 응용 전망을 가지고 있다.

Claims (10)

  1. 종양세포 전이를 억제 또는 예방하기 위한 약물의 선별에 있어서, PRAK의 약물 표적으로서의 응용.
  2. 종양세포 전이를 억제 또는 예방하기 위한 약물의 제조에 있어서, PRAK 억제제의 응용.
  3. 제2항에 있어서, 상기 억제제는 PRAK 발현 수준을 감소시키거나 PRAK 생물학적 활성을 억제하여, 세포 이동, HIF1α, MMP2 및/또는 EMT 계열 분자의 발현 및/또는 기능을 조절함으로써, 종양세포 전이에 대한 억제 또는 예방을 실현하는 것을 특징으로 하는 응용.
  4. 제3항에 있어서, 상기 억제제는 PRAK 발현 수준을 감소시키거나 PRAK 생물학적 활성을 억제하여, mTOR 및 이의 기질의 발현을 조절하고, HIF1α 단백질의 발현을 추가로 조절하는 것을 특징으로 하는 응용.
  5. 종양세포 전이를 억제 또는 예방하기 위한 약물로서, 상기 약물의 활성성분은 PRAK 발현 수준을 감소시키거나 PRAK 생물학적 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 약물은 화학 약물, 생물학적 거대분자, 폴리펩티드, 단일사슬항체, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 짧은 헤어핀 RNA, 작은 간섭 RNA, 유전자 편집 시스템인 것을 특징으로 하는 약물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 약물은 [1,2,4]트리아졸로[1,5-a]피라진 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 전구약물 및 이의 입체 이성질체, 동위원소 변이체 및 호변 이성질체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 약물은 이미다조[1,2-a]피라진 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 용매화물 또는 전구약물 및 이의 입체 이성질체, 동위원소 변이체 및 호변 이성질체를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물.
  9. HIF1α, MMP2 및/또는 EMT 계열 분자의 발현 및/또는 기능을 조절하기 위한 약물로서, 상기 약물의 활성성분은 PRAK 발현 수준을 감소시키거나 PRAK 생물학적 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약물.
  10. mTOR 활성을 조절하기 위한 약물로서, 상기 약물의 활성성분은 PRAK 발현 수준을 감소시키거나 PRAK 생물학적 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 약물.
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