CN103540655A - Mk5基因在筛选抗肝癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,涉及人基因MK5在筛选和制备抑制肝癌细胞生长药物中的应用。肝癌是目前世界范围内常见肿瘤之一,每年因肝癌死亡的病人数量位居因肿瘤死亡病人数量的第三位。本发明的MK5有促进肝癌细胞抵抗阿霉素诱导的细胞凋亡的作用,可以作为新的抑制肝癌细胞生长的药靶进行开发。MK5的siRNA能够促进阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的作用,可以与阿霉素联用抑制肝癌细胞生长增殖;或者与阿霉素组合,作为促进肝癌细胞凋亡的药物。本发明的MK5及其拮抗剂用于制备抗抑制肝癌细胞生长药物,将为治疗和检测肝癌提供了一种新的途径和手段。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及一种人MK5基因在制备抑制肝癌细胞生长药物中的新用途。本发明还涉及人MK5基因的抑制剂及其增强阿霉素的促凋亡作用的用途。
背景技术
MK5(MAPKAPK5)蛋白激酶又名PRAK(p38-regulated/activated protein kinase),由Jiahuai Han等人于1998年首先克隆得到。MK5与MK2、MK3为同家族成员,其中MK2及MK3为p38的主要下游目标,而MK5为非典型MAPK激酶ERK3及ERK4的下游分子,同时也p38的下游目标之一。
研究表明,p38通路在肿瘤发生发展过程中同时表现出了抑制及促进的双重作用。在皮肤癌小鼠模型中,MK5通过介导致癌基因诱导的衰老从而抑制肿瘤的发生及发展过程。进一步的研究发现,在同一小鼠模型中,当肿瘤形成后,MK5则发挥了促进皮肤癌生长的作用。实验结果显示,MK5也是肿瘤血管形成的重要因素之一。p38通过VEGFR2(vascularendothelial growth factor receptor2)依赖性途径激活MK5,由此促进宿主内皮细胞向肿瘤的迁移并将此类细胞包裹入肿瘤脉管***。
另有研究表明,原癌基因c-myc能够直接激活MK5,并与之形成负反馈通路。在结肠癌中,MK5表达量下调,MK5与c-myc之间的负反馈通路中断从而促进了结肠癌的发生发展。
然而,到目前为止,尚未有人报道MK5与肝癌的相互关系以及其在肝癌发生发展中发挥的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种降低肝癌细胞耐药性,增强肝癌细胞对阿霉素敏感性的药物和方法。
本发明的实验数据表明,通过RNA干扰抑制人MK5基因表达,可以有效地增加肝癌细胞对阿霉素的敏感性。在同时使用MK5基因的siRNA和阿霉素的情况下,肝癌细胞的凋亡比例明显增加,肝癌细胞的增殖明显减慢,肝癌细胞的生长受到抑制。过表达MK5基因的情况下,使用阿霉素,肝癌细胞的凋亡比例明显下降。本发明的MK5有促进肝癌细胞抵抗阿霉素诱导的细胞凋亡的作用,可以作为新的抑制肝癌细胞生长的药靶进行开发。MK5基因的siRNA可以作为阿霉素的增敏剂。此外,MK5基因在肝癌细胞和组织中的表达量要明显高于癌旁组织,因此,使用MK5基因的siRNA将大大增强阿霉素对肝癌细胞的促凋亡作用,而不对癌旁细胞或者组织造成类似作用。本发明在此基础上完成。
本发明提供了MK5基因在制备抑制肝癌细胞生长药物中的应用,即作为筛选和制备抑制肝癌细胞生长药物的药靶。
本发明的人MK5基因,在NCBI(美国国立生物技术信息中心)网站中核苷酸的序列号为AF032437.1,蛋白质的序列号为AAC39863.1。
本发明的MK5有加强肝癌细胞抵抗阿霉素诱导的细胞凋亡的作用,可以作为新的抑制肝癌细胞生长的药靶进行开发。
本发明的MK5可以根据NCBI登录号为AF032437.1设计引物,扩增获得MK5的DNA序列,然后根据常规基因工程方法获得MK5蛋白。也可以通过人工合成的方法获得MK5的基因序列和蛋白。
MK5可以用于筛选其抑制剂,从而与阿霉素联用作为促进肝癌细胞凋亡的药物。
MK5在肝癌细胞及肝癌组织中的表达量比其在癌旁细胞或者组织的表达量要高许多,利用MK5的siRNA作为促凋亡的药物成分,将主要对肝癌细胞或者肝癌组织发生作用,这大大提高了药物的特异性,降低了对正常细胞的损伤。
例如,本发明的一个实施例中筛选到MK5的siRNA。所述的MK5的siRNA的序列如SEQ ID NO 2所示。
本发明的MK5的siRNA可以根据SEQ ID NO 2所示的序列人工合成。
MK5基因的siRNA可以用于增加肝癌细胞对阿霉素的敏感性,能够增加阿霉素促进肝癌细胞凋亡的作用。
本发明提供了一种抑制肝癌细胞生长的药物组合物,该药物组合物含有MK5基因的siRNA和阿霉素。该药物组合物能够促进肝癌细胞的凋亡。
其中,MK5基因的siRNA和阿霉素的比例为(1:1-1000,摩尔比)。例如,敲减MK5基因的siRNA和阿霉素的物质的量比例为1:5,1:10,1:50,1:100,1:200,1:300,1:500,1:1000,等等。
实验结果显示,加阿霉素处理后,当阿霉素用量不变的情况下,凋亡效果随着抑制MK5的siRNA用量增加而加强。在抑制MK5的siRNA的用量固定的情况下,增加阿霉素的用量,凋亡效果随着阿霉素的用量增加而逐步加强。
在本发明中,术语“人MK5基因”指编码具有人MK5蛋白活性的核苷酸序列,如AF032437.1所示核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指该核酸序列开放阅读框中,有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性,所以与该核酸序列开放阅读框序列同源性低至约70%的简并序列也能编码出人MK5的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下,更佳地在高度严紧条件下,与AF032437.1开放阅读框序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与AF032437.1开放阅读框序列的同源性至少70%,较佳地至少80%,更佳地至少90%的核苷酸序列。
在本发明中,术语“MK5蛋白”指具有MK5蛋白活性的AAC39863.1序列的蛋白质。该术语还包括具有与MK5蛋白质相同功能的、AF032437.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代,以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内,较佳地为10个以内,更佳地为5个以内)氨基酸。例如,在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时,通常不会改变蛋白质的功能。又比如,在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人MK5蛋白的活性片段和活性衍生物。
本发明的MK5蛋白可以通过常规的基因工程方法表达并分离纯化。
在本发明中,所述的基因工程载体可选用本领域已知的各种载体,如市售的载体,包括质粒,粘粒,噬菌体,病毒等。
在本发明中,术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地,该宿主细胞是真核细胞,如CHO细胞、COS细胞等。
本发明提供了一种人MK5基因的核酸序列可以作为筛选和制备抑制肝癌细胞生长药物的药靶。从而为寻找有效的抗肝癌药物提供一种新的方法和途径。
本发明的人MK5基因,通过RNA干扰实验使其表达下调后,能促进化疗药物阿霉素的促凋亡效果,该实验结果表明人MK5基因为防治癌症,尤其是肝癌,提供了新的治疗靶点和有效新药。
本发明的MK5可以作为靶标,筛选抑制MK5活力的物质或者方法。筛选方法包括以下步骤:A选择候选化合物;B提供检测MK5表达或者活性的体系;C用MK5的检测体系选择候选化合物;D确定MK5表达量或者活性在候选化合物的影响下的改变。
所述候选化合物可以是核酸、氨基酸或者小分子化合物。
作为靶标的除了MK5蛋白,还可以是MK5基因、MK5的mRNA、MK5的表达产物及其前述三者的特异性片断。所述“特异性片断”是指可以区别本发明的MK5与其它基因的片断。
利用本发明的MK5,通过各种常规筛选方法,可筛选出与其发生相互作用的物质,如受体、抑制剂或拮抗剂等。这些与MK5发生相互作用或者抑制其活性的物质可以是核酸、氨基酸、化合物等。
本发明的MK5及其抑制剂、拮抗剂等,当在治疗上进行施用(给药)时,可提供不同的效果。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。
以本发明的人MK5蛋白的siRNA为例,可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人MK5可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物,可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的MK5还可与其他治疗剂一起使用。
当本发明的人MK5的siRNA被用作药物时,可将治疗有效剂量的该抑制剂施用于哺乳动物,其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明中,所述的抑制肝癌药物是由含有效治疗量的MK5抑制剂和药学上的载体或者赋形剂组成的药物组合物。所述药物组合物可以是针剂或者片剂。其有效治疗量可以为每天1微克/千克至5毫克/千克体重。
本发明还提供了一种抑制体外肝癌细胞生长的方法,即在肝癌细胞的培养基中加入有效治疗量的MK5基因的siRNA和阿霉素。
本发明中,加入的MK5基因的siRNA可以是发夹形式,也可以将MK5基因的siRNA相应的序列装入常规载体,甚至是市售的病毒工具载体,然后转染肝癌细胞。
上述方法可以用于体外培养的肝癌细胞,例如实施例中所述的HepG2,Hep3B,SK-Hep-1,SMMC-7721,BEL-7402或者QGY-7703。
本发明提供了MK5在制备抑制肝癌细胞生长药物中的应用,尤其是MK5的siRNA用于增强阿霉素对肝癌细胞的促凋亡作用。肝癌是目前世界范围内常见肿瘤之一,每年因肝癌死亡的病人数量位居因肿瘤死亡病人数量的第三位。本发明的MK5有促进肝癌细胞抵抗阿霉素诱导的细胞凋亡的作用,可以作为新的抑制肝癌细胞生长的药靶进行开发。
MK5的siRNA能够促进阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的作用,可以与阿霉素联用抑制肝癌细胞生长增殖;或者与阿霉素组合,作为促进肝癌细胞凋亡的药物。
尤其重要的是,MK5在肝癌细胞及肝癌组织中的表达量比癌旁细胞或者组织的表达量要高许多,利用MK5的siRNA作为促凋亡的药物成分,将主要对肝癌细胞或者肝癌组织发生作用,这大大提高了药物的特异性,降低了对正常细胞的损伤。本发明的MK5及其拮抗剂用于制备抗抑制肝癌细胞生长药物,将为治疗和检测肝癌提供了一种新的途径和手段。
附图说明
图1显示MK5在肝癌细胞系中表达量上调。
图2为图1标准化后的结果。
图3显示MK5在肝癌样本中表达量上调。
图4为图3标准化后的结果。
图5显示MK5敲减表达对阿霉素诱导的细胞凋亡有促进作用。
该图中,从左到右的柱状图依次为,阿霉素对HepG2细胞系中MK5正常表达及MK5敲减表达细胞株的诱导凋亡能力,阿霉素对Hep3B细胞系中MK5正常表达及MK5敲减表达细胞株的诱导凋亡能力。
图6显示MK5过量表达对阿霉素诱导的细胞凋亡有抑制作用。
该图中,从左到右的柱状图依次为,阿霉素对HepG2细胞系中MK5正常表达及MK5过量表达细胞株的诱导凋亡能力,阿霉素对Hep3B细胞系中MK5正常表达及MK5过量表达细胞株的诱导凋亡能力。
具体实施方式
实施例1 MK5在肝癌细胞系中表达量检测
1.1肝癌细胞株蛋白样品准备
(1)正常肝细胞系L02及肝癌细胞系HepG2,Hep3B,SK-Hep-1,SMMC-7721,BEL-7402,QGY-7703(以上细胞株均来自American Type Culture Collection)用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养。培养条件为37℃,5%CO2。
(2)培养后的细胞样用0.02%EDTA及0.25%胰酶消化,用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养中和,以1000转每分钟离心3分钟收集细胞。
(3)收集的细胞用1×PBS漂洗一次,1000转每分钟离心3分钟收集细胞。
(4)收集到的细胞以1×蛋白裂解缓冲液裂解。
1.2Western检测各个肝癌细胞株中MK5的内源表达
(1)配制SDS-PAGE分离胶和积层胶。
(2)凝胶的灌注(流程如下)
灌注分离胶-→加无水乙醇去气泡-→室温放置等待聚合-→倒去无水乙醇-→用蒸馏水洗干净凝胶顶部,吸干-→灌注积层胶-→马上在积层胶溶液中***梳子-→等待聚合完全,拔出梳子-→将凝胶固定于电泳装置上,上下电极中加入电泳缓冲液。
(3)将准备好的样品上样。
(4)室温100V电压下进行电泳,至蛋白Marker内的染料前沿到达凝胶底部。
(5)卸胶,用转移缓冲液平衡凝胶和硝酸纤维素膜20分钟。
(6)在4℃下用湿式电转移仪恒压100V,1小时,每块凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。
(7)硝酸纤维素膜在37℃下浸在5%脱脂奶粉溶液中缓慢摇动,封闭1小时。
(8)加入一抗,37℃温育1-2小时。
(9)将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中轻轻摇动,洗涤10分钟,这样再重复两次。
(10)加入二抗,37℃温育1小时。
(11)同步骤9洗膜三次。
(12)用ECL***进行发光。
(13)暗室压片、显影、定影。
如图1结果显示,以正常肝细胞(L02)为对照,MK5在肝癌细胞株(HepG2,Hep3B,SK-Hep-1,SMMC-7721,BEL-7402,QGY-7703)中的表达量高于正常肝细胞中的表达量2倍及其以上。这提示,MK5对肝癌细胞发生发展具有促进作用。
实施例2 MK5在肝癌组织样本中表达量检测
2.1肝癌样本的制备
(1)新鲜的人肝癌及癌旁组织样本(样本使用得到样本提供者了解并同意)在手术后迅速冷冻于液氮中,之后于-80℃保存。
(2)冷冻保存的肝癌及癌旁组织样本冷冻切片,用1×蛋白裂解缓冲液裂解,沸水煮样10分钟备用。
2.2Western检测各个肝癌及癌旁组织样本中MK5的内源表达
步骤同1.2中所示。
结果如图3和图4所示,与实施例1的结果一致,MK5在肝癌组织中的表达量上调,尤其在6对肝癌样本中MK5上调4倍以上。
实施例3 为MK5敲减表达对阿霉素诱导的细胞凋亡有促进作用
(1)将HepG2或Hep3B细胞以1×105个/孔的密度接种在12孔板上,将细胞放入CO2培养箱中37℃培养18-24小时,使细胞丰度达到70-80%。
(2)用Invitrogen lipofectamine2000真核转染试剂盒进行转染。分别转染以下干扰片段:
siCtrl 3μl(siRNA干扰阴性对照,5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’,SEQ ID NO.1);
siRNA(5’-GCAGGAGGCUUGGAAGUAUdTdT-3’,SEQ ID NO.2)3μl(每μl的浓度为20μM)。
(3)转染后4小时,换成完全培养基(DMEM高糖培养基+10%胎牛血清)继续培养24小时。
(4)重新更换含有阿霉素(终浓度为2μM)的培养基,继续培养24小时收集细胞。
(5)收集的细胞用含有0.1%的Triton-X100、50μg/ml碘化丙啶以及100μg/ml RNA酶处理15分钟。
(6)处理后的样品用流式细胞仪检测,以sub-G1区作为细胞凋亡指标。
(7)处理分析数据。
结果如图5所示,用siRNA的方法干扰肝癌细胞株HepG2及Hep3B中内源MK5,并加阿霉素处理,相比HepG2细胞中加入对照siRNA(siCtrl),干扰细胞凋亡数量增加了50%,而Hep3B中则增加25%。
当抑制MK5的siRNA用量下降到1μl的情况下,加阿霉素处理后,细胞凋亡数量与对照相比分别增加15%以上。凋亡效果随着抑制MK5的siRNA用量增加而加强。
在抑制MK5的siRNA用量固定在3μl的情况下,增加阿霉素的用量(例如,增加到10μM),细胞凋亡数量也有增加,凋亡效果随着阿霉素的用量增加而逐步加强。而且,即使阿霉素的用量降低到0.1μM,细胞凋亡数量相比较于加入对照siRNA(siCtrl)也有增加。
上述结果证明,抑制MK5的siRNA能够增加肝癌细胞对阿霉素的敏感性,增强阿霉素对肝癌细胞的促凋亡作用,乃至抑制肝癌细胞的生长增殖。
实施例4为MK5过量表达对阿霉素诱导的细胞凋亡有抑制作用
(1)将HepG2或Hep3B细胞以1×105个/孔的密度接种在12孔板上,将细胞放入CO2培养箱中37℃培养18-24小时,使细胞丰度达到70-80%。
(2)用Invitrogen lipofectamine2000真核转染试剂盒进行转染。分别转染pcDNA3.1-A(-)空表达载体5μl(MK5的过表达载体的阴性对照),含有MK5的表达载体(含有AF032437.1基因序列的pcDNA3.1-A(-)表达载体)3μl(每μl的浓度为100ng)。
(3)转染后4小时,换成完全培养基(DMEM高糖培养基+10%胎牛血清)继续培养24小时。
(4)重新更换含有阿霉素(2μM)的培养基,继续培养24小时收集细胞。
(5)收集的细胞用含有0.1%的Triton-X100、50μg/ml碘化丙啶以及100μg/ml RNA酶处理15分钟。
(6)处理后的样品用流式细胞仪检测,以sub-G1区作为细胞凋亡指标。
(8)处理分析数据。
结果如图6所示,肝癌细胞株HepG2及Hep3B中MK5过量表达,并加阿霉素处理,相比HepG2细胞中转染pcDNA3.1-A(-)空表达载体5μl(MK5的过表达载体的阴性对照),过表达细胞的凋亡数量下降30%,而Hep3B中下降25%。
当表达MK5的质粒用量下降到1μl的情况下,加阿霉素处理后,与转染MK5的过表达载体的阴性对照,细胞凋亡数量分别下降17.5%。凋亡效果随着表达MK5的质粒用量增加而迅速减弱。
在表达MK5的质粒用量固定在3μl的情况下,降低阿霉素的用量(1μM、0.5μM及0.1μM),细胞凋亡数量也下降,凋亡效果随着阿霉素的用量降低而逐步减弱。
上述结果说明,MK5有促进肝癌细胞抵抗阿霉素诱导的细胞凋亡的作用。增加MK5的表达量及活性能够抑制肝癌细胞对阿霉素的敏感性,即增加耐药性。
上述结果从反面证明,抑制MK5的siRNA能够增强阿霉素对肝癌细胞的促凋亡作用,乃至抑制肝癌细胞的生长增殖。
SEQUENCE LISTING
<110> 复旦大学
<120> MK5基因在筛选抗肝癌药物中的应用
<130> 201269
<160> 2
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 1
uucuccgaac gugucacgu 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工合成
<400> 2
gcaggaggcu uggaaguau 19
Claims (10)
1.MK5基因在制备抑制肝癌的药物中的应用,其特征在于,MK5是筛选抑制肝癌的药物的药靶。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的抑制肝癌的药物是促进肝癌细胞凋亡的药物。
3.MK5基因的siRNA,其特征在于,所述的siRNA的序列如SEQ ID NO 2所示。
4.MK5基因的siRNA在制备抑制肝癌细胞生长药物中的应用,其特征在于,MK5基因的siRNA能够增加肝癌细胞对阿霉素的敏感性。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,MK5基因的siRNA能够增强阿霉素促进肝癌细胞凋亡的作用。
6.一种抑制肝癌细胞生长的药物组合物,其特征在于,该药物组合物含有MK5基因的siRNA和阿霉素。
7.如权利要求6所述的药物组合物,其特征在于,MK5基因的siRNA和阿霉素的比例为1:1-1:1000,摩尔比。
8.权利要求6所述的药物组合物的应用,其特征在于,该药物组合物能够促进肝癌细胞的凋亡。
9.一种抑制体外肝癌细胞生长的方法,其特征在于,在肝癌细胞的培养基中加入有效治疗量的权利要求6所述的药物组合物。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述的肝癌细胞是HepG2、Hep3B、SK-Hep-1、SMMC-7721、BEL-7402或者QGY-7703细胞。
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---|---|---|---|
CN201210246482.XA CN103540655A (zh) | 2012-07-16 | 2012-07-16 | Mk5基因在筛选抗肝癌药物中的应用 |
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Cited By (2)
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---|---|---|---|---|
CN109381701A (zh) * | 2017-08-11 | 2019-02-26 | 复旦大学 | 促癌基因jcad及其作为靶点在制备治疗肝癌的药物中的用途 |
WO2019184306A1 (zh) * | 2018-03-27 | 2019-10-03 | 北京大学 | 一种肿瘤转移药物治疗的靶标及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050245475A1 (en) * | 2002-11-14 | 2005-11-03 | Dharmacon, Inc. | Functional and hyperfunctional siRNA directed against Bcl-2 |
CN1796557A (zh) * | 2004-12-28 | 2006-07-05 | 湖州市中心医院 | 中期因子基因为靶的反义寡核苷酸的结构和用途 |
WO2007131991A1 (en) * | 2006-05-15 | 2007-11-22 | Galapagos N.V. | Imidazolopyrazine compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases |
CN102076853A (zh) * | 2008-05-07 | 2011-05-25 | 阿布拉西斯生物科学有限责任公司 | 通过miRNA增强药物疗法 |
-
2012
- 2012-07-16 CN CN201210246482.XA patent/CN103540655A/zh active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050245475A1 (en) * | 2002-11-14 | 2005-11-03 | Dharmacon, Inc. | Functional and hyperfunctional siRNA directed against Bcl-2 |
CN1796557A (zh) * | 2004-12-28 | 2006-07-05 | 湖州市中心医院 | 中期因子基因为靶的反义寡核苷酸的结构和用途 |
WO2007131991A1 (en) * | 2006-05-15 | 2007-11-22 | Galapagos N.V. | Imidazolopyrazine compounds useful for the treatment of degenerative and inflammatory diseases |
CN102076853A (zh) * | 2008-05-07 | 2011-05-25 | 阿布拉西斯生物科学有限责任公司 | 通过miRNA增强药物疗法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ANH TUAN NGUYEN ET AL.: "A high level of liver-specific expression of oncogenic KrasV12 zebrafish", 《DISEASE MODELS & MECHANISMS》, 31 December 2011 (2011-12-31), pages 1 - 13 * |
MIN ZHENG: "Inactivation of Rheb byPRAK-mediated phosphorylation is essential for energy-depletion-induced suppression of mTORC1", 《NATURE CELL BIOLOGY》, vol. 13, no. 3, 31 March 2011 (2011-03-31) * |
邱建武等: "P38MAPK在肝细胞癌中的研究进展", 《世界华人消化杂志》, vol. 16, no. 5, 18 February 2008 (2008-02-18), pages 03 - 509 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109381701A (zh) * | 2017-08-11 | 2019-02-26 | 复旦大学 | 促癌基因jcad及其作为靶点在制备治疗肝癌的药物中的用途 |
WO2019184306A1 (zh) * | 2018-03-27 | 2019-10-03 | 北京大学 | 一种肿瘤转移药物治疗的靶标及其应用 |
US20210132041A1 (en) * | 2018-03-27 | 2021-05-06 | Peking University | Target for drug treatment of tumor metastasis and use thereof |
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