CN110777204B - 敲除mafg-as1的试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用 - Google Patents

敲除mafg-as1的试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明研究表明，原发性BUC组织中lncRNA MAFG‑AS1显著过表达，上调或下调MAFG‑AS1的表达分别增强或抑制体外和体内BUC细胞的增殖转移与侵袭能力。因此，MAFG‑AS1可在制备治疗膀胱癌药物中作为靶位点。机制研究表明，MAFG‑AS1可以直接结合HuR，并正向调控HuR/PTBP1轴来促进BUC细胞的增殖转移与侵袭能力。因此，MAFG‑AS1可以在制备靶向负向调控HuR/PTBP1轴表达制剂中应用。

Description

敲除MAFG-AS1的试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及敲除MAFG-AS1的试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用。
背景技术
膀胱尿路上皮癌（BUC）是泌尿***中最常见的恶性肿瘤，近年来发病率和病死率均逐年增高，全球每年约新增43万例新诊断病例，每年导致165000例患者死亡。膀胱癌分为非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌肉浸润性膀胱癌(MIBC)，其中NMIBC 占膀胱癌病例的70％～80％，其主要特点为进展快且容易转移，将近75％的高级别NMIBC 在诊断后5 年内复发、进展或死亡；MIBC则通常需要根治性膀胱切除，结合新辅助化疗或者放疗，但即使MIBC接受根治性膀胱切除术治疗，其死亡率也会在5年内从18.6％增加到77.6％。尽管近年来膀胱癌的治疗取得了重大进展，但膀胱癌容易转移复发的难题仍有待进一步解决。因此，进一步研究膀胱癌的发病尤其远处转移机制具有重要的临床意义。
长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是含有超过200个核苷酸并缺乏或表现出有限的编码蛋白质能力的RNA。已有研究表明lncRNA可通过多种作用方式来调控肿瘤细胞增殖，侵袭迁移等来影响肿瘤的发生发展，如可作为海绵吸附体miRNA从而调控相关mRNA的表达，协同转录因子激活相关基因的表达，也可以结合蛋白防止蛋白降解从而稳定蛋白的功能。近年来越来越多的研究表明了lncRNA与蛋白互作在恶性肿瘤的发生发展中起着重要作用，如BLACAT2通过直接与WDR5结合来上调VEGF-C表达从而促进膀胱癌的淋巴转移；Wang Z等学者则证实乳腺癌中lncRNA EPIC1可与Myc蛋白直接结合并形成正反馈环来行使促癌作用，因此，深入研究膀胱癌中失调的lncRNAs与蛋白互作之间的具体分子机制对于阐明膀胱癌的发病尤其远处转移机制具有十分重要的作用。
发明内容
本发明旨在提供一种可以用于制备治疗膀胱癌药物的新靶点的检测试剂。我们发现MAFG-AS1在膀胱癌中显著高表达，且其高表达与患者预后及TNM分期相关；进一步的研究结果表明MAFG-AS1能与HuR蛋白直接结合，并通过招募去泛素化酶USP5来稳定HuR的表达；MAFG-AS1结合HuR后可上调PTBP1 mRNA的翻译表达，从而促进肿瘤细胞的增殖、EMT及转移侵袭。我们的发现极有可能成为膀胱癌的治疗提供新靶点的检测试剂。
本发明研究表明，相比正常组织，原发性BUC组织中MAFG-AS1的表达显著上调，MAFG-AS1的高表达与膀胱癌患者的总生存期（OS）及无病生存期（DFS）显著负相关，且相对临床分期为II期膀胱癌患者，III-IV期膀胱癌患者中MAFG-AS1的表达量更高。上调或下调MAFG-AS1的表达分别增强或抑制体外和体内BUC细胞的增殖转移与侵袭能力。此外，MAFG-AS1促进了BUC细胞的上皮间质转化（EMT）。机制研究表明，MAFG-AS1可以直接与HuR蛋白结合，并能稳定HuR的表达，且MAFG-AS1可以正向调控HuR/PTBP1轴来促进BUC增殖转移与侵袭。总的来说，我们的数据表明高表达的MAFG-AS1与BUC患者的复发转移和低生存率有关。此外，以MAFG-AS1为靶点可能是一种新的改善BUC患者治疗和生存的策略。
为了探索lncRNAs在膀胱癌发生发展中的重要及其分子机制，我们首次发现MAFG-AS1在膀胱癌组织中高表达，体内体外实验发现MAFG-AS1发挥着促进膀胱癌增殖、侵袭转移及EMT的作用，提示MAFG-AS1极有可能在膀胱癌中演绎致癌基因的角色。进一步分析发现MAFG-AS1的高表达与膀胱癌患者预后呈显著负相关，且MAFG-AS1的表达与膀胱癌患者的TNM分期密切相关。因此，本研究可能为膀胱癌预后提供新的分子靶标。
HuR是Hu / ELAV（人/胚胎致死异常视觉）RBP家族中普遍存在的成员，可调节mRNA稳定性，翻译及miRNA的产生等过程来发挥作用，其活性主要受到核转位、磷酸化、泛素化等影响。最近，有研究表明lncRNA也可以参与调控HuR的功能，如lincRNA-UFC1可直接与HuR蛋白结合并且稳定其表达，而lncRNA OCC-1则可通过在翻译后水平促进其泛素化降解来调节HuR蛋白的水平，且在膀胱癌中lncRNA HCG22可以促进HuR蛋白降解。我们通过CHIRP、PRM以及RIP等实验手段发现MAFG-AS1可以直接与HuR蛋白结合。为探寻MAFG-AS1与HuR之间的分子机制，我们过表达MAFG-AS1后，发现HuR蛋白的表达水平显著上升，这表明MAFG-AS1与HuR蛋白结合后极有可能稳定了HuR蛋白的表达。而蛋白的稳定性往往跟其泛素化水平相关，蛋白泛素化水平的增加会导致蛋白泛素化降解。USP5是去泛素化酶家族中的重要成员，已被报道在多个癌种中行使癌基因的功能。接下来我们通过COIP等实验证实了USP5可以直接结合HuR，过表达MAFG-AS1后HuR蛋白的泛素化水平下调，而过表达MAFG-AS1的同时敲除USP5后HuR蛋白明显回落。因此，本发明证实了在膀胱癌中MAFG-AS1可直接结合HuR蛋白，并通过招募去泛素化酶USP5来稳定HuR的表达。
在细胞内，HuR可与mRNA 3'非翻译区的ARE结合赋予转录本稳定性，并促进翻译，因此我们考虑HuR是否可以通过影响膀胱癌中的某个关键mRNA分子来发挥其作用。我们通过RIP及RNA稳定性试验发现HuR可以结合并稳定PTBP1 mRNA，从而促进PTBP1的翻译表达，进一步体内外功能恢复试验发现过表达MAFG-AS1的同时敲除HuR或PTBP1后，肿瘤的增殖及转移能力下调，同时抑制了EMT进程。这些结果提示：在膀胱癌中MAFG-AS1可以结合并稳定HuR蛋白，来上调PTBP1 表达，从而促进膀胱癌的增殖、侵袭转移能力及EMT进程。因此，我们的研究表明靶向MAFG-AS1/HuR/PTBP1途径可能是BUC患者改善疗效和预后的一种新策略，可以研究出新的药剂或者抑制剂。
附图说明
图1: MAFG-AS1在膀胱癌中高表达并与患者预后呈负相关。（A）筛选出MAFG-AS1的工作流程示意图。（B）MAFG-AS1在BUC组织和非肿瘤组织中的表达。（C）MAFG-AS1的高表达和较短的总生存期及无病生存期相关。（D）进一步验证了MAFG-AS1表达与膀胱癌患者晚期疾病分期之间的关系（临床分期，T分期，N分期和M分期）。Bars表示标准差，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图2：MAFG-AS1可以促进BUC细胞的增殖、转移侵袭及EMT。（A）qTR-PCR法检测了不同膀胱癌细胞株（BIU87,5637，T24，EJ和RT4）中MAFG-AS1的表达水平。（B,C） qTR-PCR法检测了用不同MAFG-AS1靶向si-RNA（si-1,si-2,si-3）转染T24细胞后和MAFG-AS1过表达质粒转染RT4细胞后，MAFG-AS1的表达量。（D,E）使用MTT法及克隆形成实验在T24和RT4细胞中测定细胞增殖情况。（F,G）划痕实验及Transwell实验在T24及RT4中测定细胞的转移侵袭能力。（H）WB实验检测了MAFG-AS1对EMT进程的影响。（I）：小鼠皮下成瘤的肿瘤代表性图像.（J）：免疫组织化学检测各组中ki67的表达量。（K）各组中肺转移体内动物模型HE染色后代表性图像及转移结节数目 。各组柱状图数据均为三次独立重复试验的平均值；Bars表示标准差，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图3：MAFG-AS1可直接与HuR蛋白结合。（A）FISH测定用于检测MAFG-AS1在T24和RT4细胞中的亚细胞定位。（B）CHIRP实验的流程图。（C）CHIRP-MS检测MAFG-AS1可能结合的蛋白。（D）MAFG-AS1可能与HuR蛋白结合。（E）PRM实验验证MAFG-AS1可能结合的蛋白。（F）RIP实验反向验证HuR蛋白可结合MAFG-AS1。
图4：MAFG-AS1可通过招募去泛素化酶USP5来稳定HuR蛋白的表达。（A）WB实验检测了HuR蛋白在膀胱癌细胞株中的表达量（BIU87,5637，T24，EJ和RT4）。（B）WB实验检测了6对膀胱癌患者肿瘤组织及癌旁组织中HuR蛋白的表达量。（C）免疫组织化学检测6对膀胱癌患者肿瘤组织及癌旁组织中HuR蛋白的表达量。（D）WB检测MAFG-AS1对HuR蛋白水平的影响。（E）MAFG-AS1对HuR蛋白稳定性的影响，在T24/RT4细胞中转染空白质粒或sh-MAFG-AS1质粒经MG132（10 μM）处理0，3，6，12，24，48小时后，用WB分别检测HuR不同时间段的表达量。（F）在T24及RT4细胞株中敲低去泛素化酶后，WB检测HuR蛋白的表达。（G）过表达MAFG-AS1和过表达MAFG-AS1的同时敲低USP5后，WB检测HuR蛋白水平。（H）HuR蛋白可能与USP5结合。（I）以HuR为沉淀抗体后，使用COIP检测USP5表达水平。（J）MAFG-AS1对HuR蛋白泛素化降解的影响，在T24/RT4细胞中过表达MAFG-AS1和过表达MAFG-AS1的同时敲低USP5后，co-IP检测HuR的泛素化水平。Bars表示标准差，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图5：MAFG-AS1可以通过稳定HuR蛋白来促进PTBP1的翻译。 （A）WB实验检测了PTBP1蛋白在膀胱癌细胞株中的表达量（BIU87,5637，T24，EJ和RT4）。（B）WB实验检测了6对膀胱癌患者肿瘤组织及癌旁组织中HuR蛋白的表达量。 （C）免疫组织化学检测6对膀胱癌患者肿瘤组织及癌旁组织中PTBP1蛋白的表达量。（D）RIP实验检测示HuR蛋白可以直接结合PTBP1 mRNA。（E） qTR-PCR法检测MAFG-AS1和HuR对PTBP1 mRNA水平的影响。（F，G）WB实验检测了MAFG-AS1和HuR对PTBP1蛋白水平的影响，结果显示MAFG-AS1可以通过稳定HuR表达来上调PTBP1的蛋白水平。（H）通过向T24/RT4细胞中转染过表达MAFG-AS1 质粒或si-MAFG-AS1质粒，检测MAFG-AS1 对PTBP1 mRNA稳定性的影响，结果显示MAFG-AS1可以稳定PTBP1mRNA水平。Bars表示标准差，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图6：MAFG-AS1/HuR/PTBP1可以在细胞水平促进BUC的增殖转移和EMT。（A,B）MTT法及克隆形成实验检测MAFG-AS1/HuR/PTBP1轴对细胞增值能力的影响。（C,D）划痕实验及Transwell实验检测了MAFG-AS1/HuR/PTBP1轴对细胞转移侵袭能力的影响。（E）通过WB实验检测了HuR、PTBP1、E-Cadherin及Vimentin的表达。Bars表示标准差，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图7: MAFG-AS1/HuR/PTBP1可以在动物水平促进BUC的增殖转移和EMT。 （A）小鼠异种移植瘤模型及各组瘤体体积大小。（B）WB检测小鼠移植瘤组织中EMT 分子标志物的表达量。（C）免疫组织化学检测各组中ki67的表达量。Bars表示标准差，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
实施方式
下面结合附图和实验数据对本发明做进一步的解释和说明
细胞培养及转染，qRT-PCR分析，蛋白质印迹分析，免疫组化测定，MTT测定，免疫沉淀，免疫荧光，细胞划痕修复实验，集落形成测定，以上方法均是现有方法，在此不再累述。
本研究采用来自中南大学湘雅三医院和中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院2016〜2018年的30例病理组织学诊断为膀胱癌（BUC）并行根治性膀胱切除术（RC）患者的石蜡包埋标本（表1）。将6个根治性膀胱切除术（RC）的BUC组织标本和相应的相邻非肿瘤组织标本立即储存在-80℃，并用于qRT-PCR和/蛋白质印迹。
我们通过GEO数据库（GSE31189）与TCGA数据库取交集后发现，MAFG-AS1是唯一一个在两个数据库中均显著差异表达的长链非编码RNA（图1A）。相比正常组织，MAFG-AS1在癌组织中显著高表达（图1B），且MAFG-AS1的高表达与膀胱癌患者的OS及DFS显著负相关（图1C），我们进一步验证了MAFG-AS1在不同阶段的膀胱癌患者中的相对表达。如图1D，从临床分期（III-IV，N=292），T分期（T3-4，N=269），N分期（N1-2，N=174），M分期（M1-2，N=219）的患者获得的膀胱癌组织中，MAFG-AS1表达显著上升。以上结果表明MAFG-AS1在膀胱癌中高表达，且与膀胱癌患者的预后、临床分期及TNM分期有关。
由于MAFG-AS1在BUC中高表达，其表达与患者的预后密切相关，我们进一步探讨了MAFG-AS1在膀胱中的功能。我们通过qRT-PCR检测了5株BUC细胞系（BIU87,5637，T24，EJ和RT4）中的MAFG-AS1的表达结果。结果显示MAFG-AS1在T24细胞中表达相对较高，而在RT4细胞表达量相对较低（图2A）。我们在T24/RT4两株细胞中分别对MAFG-AS1敲除及过表达干预（图2B,C）。行克隆形成及MTT实验发现敲低MAFG-AS1后肿瘤细胞的增殖能力显著下降，划痕及Transwell小室实验发现敲低MAFG-AS1后肿瘤细胞的转移侵袭能力减弱，而过表达MAFG-AS1后则与之相反（图2D-G）。我们进一步行WB实验发现敲除MAFG-AS1可以促进上皮分子标志物E-cadherin的表达，而过表达MAFG-AS1后则促进了间质标志物Vimentin的表达，这提示膀胱癌中MAFG-AS1可以促进膀胱癌的EMT进程（图2H）。为了验证MAFG-AS1的功能，我们进一步行体内实验检测了MAFG-AS1对膀胱癌细胞皮下成瘤以及远处肺转移的影响。我们发现与对照组相比，sh-MAFG-AS1组中肿瘤体积显著减少（图2I），肿瘤增殖相关指标Ki67阳性率明显降低（图2J）， 肺转移结节的数量显著减少，而过表达组则与之相反（图2K）。以上结果证明MAFG-AS1无论在体内还是体外均能够增加膀胱癌的增殖转移，侵袭能力与EMT进程。
通过FISH发现MAFG-AS1在细胞核与胞质中均有表达（图3A）。因为lncRNA往往可以通过与蛋白互做来发挥作用，我们随后行CHIRP-MS实验对MAFG-AS1的结合蛋白行高通量筛选（图3B），结果显示MAFG-AS1特异性探针组共拉到26个蛋白（图3C），HuR蛋白是其中之一。HuR蛋白是ELAVL家族的成员的一种RNA结合蛋白，该基因涉及多种生物过程，并与许多疾病有关，包括癌症。我们发现MAFG-AS1与HuR存在结合位点（图3D）。进一步行PRM验证CHIRP-MS的结果，可以发现MAFG-AS1特异性探针下拉的蛋白质中检测到HuR的强信号（图3E）。 为了进一步证实这种相互作用，我们通过RNA免疫沉淀（RNA-IP）验证了MAFG-AS1和HuR之间的这种相互作用。结果显示与非特异性IgG对照组相比，MAFG-AS1与HuR的结合显着富集（图3F）。总之，这些结果提示MAFG-AS1可以直接结合HuR，但两者之间的特定关系有待进一步阐明。
3.4 MAFG-AS1可通过招募去泛素化酶USP5来稳定HuR蛋白的表达
为了探讨MAFG-AS1与HuR蛋白之间的特定关系，我们先检测HuR蛋白在膀胱癌细胞及组织中的表达量，如图所示，HuR在T24细胞中表达相对较高，而在RT4细胞表达量相对较低（图4A），且癌组织中的HuR蛋白水平显著高于正常组织（图4B），这一结果我们进一步通过免疫组织化学方法进行了验证（图4C）。我们通过WB实验发现敲低MAFG-AS1后，HuR蛋白的表达水平显著下调，而过表达MAFG-AS1后HuR蛋白水平显著上升（图4D）。这提示我们，MAFG-AS1可能影响HuR蛋白的稳定性。我们在T24和RT4细胞中敲低MAFG-AS1，然后先加入环己酰亚胺（CHX）处理以抑制从头蛋白质合成，同时加入蛋白酶体抑制剂MG132延缓蛋白降解,与对照组相比，sh-MAFG-AS1组降低了T24和RT4细胞中HuR蛋白的稳定性（图4E）。为进一步探讨MAFG-AS1增加HuR稳定性的机制，我们通过phosphosite网站发现HuR存在多个泛素化位点，且已有研究报道lncRNA可以影响HuR蛋白的泛素化降解，我们猜想MAFG-AS1是否是通过影响HuR蛋白的泛素化降解来稳定其表达。通过WB实验发现敲低去泛素化酶USP5后，HuR的蛋白表达水平下降最为显著（图4F），且过表达MAFG-AS1同时敲低USP5后，相对过表达MAFG-AS1组HuR的水平出现了下调（图4G）。令我们惊喜的是，我们发现HuR与USP5蛋白能直接结合，且MAFG-AS1也跟USP5存在结合位点（图4H），以HuR为沉淀抗体，用COIP方法检测USP5表达，结果表明HuR能与USP5蛋白直接结合（图4I），且过表达MAFG-AS1后，HuR的泛素化水平下降，而过表达MAFG-AS1的同时敲低去泛素化酶USP5后，HuR蛋白的泛素化水平得到了回升（图4J）。这些结果提示MAFG-AS1可招募去泛素化酶USP5来防止HuR的泛素化降解，从而稳定HuR蛋白的表达。
我们通过WB检测发现PTBP1在高转移侵袭的T24细胞中表达相对较高，而在低转移侵袭的RT4细胞表达量相对较低（图5A），且其在膀胱癌组织中相对高表达（图5B,C）。我们进一步通过RIP实验验证了HuR蛋白可与PTBP1 mRNA结合（图5D）。为了验证MAFG-AS1是否可以通过稳定HuR来促进PTBP1的表达，我们过表达MAFG-AS1后，PTBP1 mRNA表达水平显著上升，而过表达MAFG-AS1的同时敲低HuR时，PTBP1 mRNA水平有明显的回落（图5E）。我们进一步行WB实验发现，过表达MAFG-AS1后，PTBP1蛋白水平表达上升（图5F），而过表达MAFG-AS1的同时敲低去泛素化酶USP5或敲低HuR后，PTBP1的蛋白水平显著下降（图5G）。为了测试PTBP1mRNA稳定性是否可被MAFG-AS1增强，我们使用α-amanitin，RNA聚合酶II（SigmaAldrich，StLouis，MO，USA）的抑制剂，在24小时内阻断T24及RT4细胞中的新RNA合成，然后测量随后的PTBP1 mRNA水平，18S核糖体RNA用作内部对照（18S核糖体RNA，RNA聚合酶I的产物，不受α-amanitin处理的影响），我们发现与空白对照组相比，在过量表达MAFG-AS1后PTBP1 mRNA的稳定性增加，而敲低MAFG-AS1后PTBP1 mRNA的稳定性降低（图5H）。以上结果提示MAFG-AS1可以通过促进HuR蛋白表达来稳定PTBP1 mRNA来促进其翻译表达。
为验证MAFG-AS1/HuR/PTBP1信号轴对膀胱癌增殖转移侵袭能力的作用，我们行细胞实验发现过表达MAFG-A1后，细胞的存活率和克隆形成率显著上升（图6A，B），转移侵袭能力显著增强（图6C,D），但过表达MAFG-AS1的同时敲低HuR或者PTBP1后，相对过表达MAFG-AS1组，细胞的存活率及克隆形成率下降，细胞的侵袭转移能力也明显下降，进一步WB发现过表达MAFG-AS1时E-Cadherin蛋白显著下降，而Vimentin蛋白显著上升，而在过表达MAFG-AS1的同时敲低HuR或者PTBP1后，E-Cadherin蛋白的表达回升，而Vimentin蛋白表达下降（图6E），这提示我们MAFG-AS1/HuR/PTBP1信号轴可以促进膀胱癌增殖转移侵袭能力及EMT进程。我们进一步行体内实验验证了这一结果，如图7A,B所示，敲低MAFG-AS1后，细胞的成瘤瘤能力下降，EMT进程收到了抑制，而过表达MAFG-AS1后增加细胞的致瘤能力，并促进了EMT进程（图7A,B）。此外，我们在过表达MAFG-AS1的同时敲低了HuR或PTBP1的表达，结果发现细胞的致瘤能力相对过表达MAFG-AS1组有所下降，且抑制了EMT进程（图7A,B）。免疫组织化学检测肿瘤增殖相关指标Ki67也证实了这一结果（图7C）。所以综合上诉结果，MAFG-AS1/HuR/PTBP1信号轴可以增加BUC细胞增殖与转移侵袭能力，同时可以促进膀胱癌的EMT过程。

Claims (2)

1.敲除MAFG-AS1的试剂在制备治疗膀胱癌药物中的应用，所述膀胱癌是指BUC。
2.检测MAFG-AS1表达量的试剂在制备膀胱癌预后检测试剂中的应用，所述膀胱癌是指BUC。
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Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007089911A2 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 The Scripps Research Institute Methods for detection of circulating tumor cells and methods of diagnosis of cancer in a mammalian subject
WO2010107960A1 (en) * 2009-03-17 2010-09-23 Brody Jonathan R Methods for assessing the efficacy of gemcitabine or ara-c treatment of cancer using human antigen r levels
WO2013120018A1 (en) * 2012-02-09 2013-08-15 Population Diagnostics, Inc. Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
CN108245680A (zh) * 2018-02-12 2018-07-06 中南大学湘雅三医院 Ripk4作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用
CN108478797A (zh) * 2018-05-11 2018-09-04 中南大学湘雅三医院 Atf3作为靶位点在制备治疗鼻咽癌紫杉醇化疗增敏药物中的应用
CN108728549A (zh) * 2018-08-06 2018-11-02 江阴市人民医院 长链非编码rna duxap8作为生物标志物在膀胱癌预后中的应用
CN109371131A (zh) * 2018-07-25 2019-02-22 中山大学孙逸仙纪念医院 一种诊断和治疗膀胱癌的分子标志物LncRNA DANCR及其用途
WO2019178217A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Baylor Research Institute Methods and compositions for treating, diagnosing, and prognosing cancer

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007089911A2 (en) * 2006-01-30 2007-08-09 The Scripps Research Institute Methods for detection of circulating tumor cells and methods of diagnosis of cancer in a mammalian subject
WO2010107960A1 (en) * 2009-03-17 2010-09-23 Brody Jonathan R Methods for assessing the efficacy of gemcitabine or ara-c treatment of cancer using human antigen r levels
WO2013120018A1 (en) * 2012-02-09 2013-08-15 Population Diagnostics, Inc. Methods and compositions for screening and treating developmental disorders
CN108245680A (zh) * 2018-02-12 2018-07-06 中南大学湘雅三医院 Ripk4作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用
WO2019178217A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Baylor Research Institute Methods and compositions for treating, diagnosing, and prognosing cancer
CN108478797A (zh) * 2018-05-11 2018-09-04 中南大学湘雅三医院 Atf3作为靶位点在制备治疗鼻咽癌紫杉醇化疗增敏药物中的应用
CN109371131A (zh) * 2018-07-25 2019-02-22 中山大学孙逸仙纪念医院 一种诊断和治疗膀胱癌的分子标志物LncRNA DANCR及其用途
CN108728549A (zh) * 2018-08-06 2018-11-02 江阴市人民医院 长链非编码rna duxap8作为生物标志物在膀胱癌预后中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mengqing Xiao等.MAFG-AS1 promotes tumor progression via regulation of the HuR/PTBP1 axis in bladder urothelial carcinoma.Clin. Transl. Med..2020,第10卷e241. *
Xiao Mengqing等.MAFG-AS1 Promotes Tumor Progression via Regulating HuR/PTBP1 Axis in Bladder Cancer.2019年中国肿瘤标志物学术大会暨第十三届肿瘤标志物青年科学家论坛论文集.2019,41. *

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