KR20200115546A - IL-22 Fc 융합 단백질 및 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질, 이를 포함하는 조성물, 이를 제조 및/또는 정제하는 방법, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 이의 조성물의 배치를 선택하는 방법, 및 질환(예를 들어, IBD)의 치료를 위한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

IL-22 Fc 융합 단백질 및 사용 방법
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.　 2019년 1월 24일에 작성된 상기 ASCII 사본의 명칭은 50474-180WO2_Sequence_Listing_1.24.19_ST25이며 크기는 121,827 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질, 이를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물), 및 이를 제조, 정제, 및 사용하는 방법에 관한 것이다.
인터류킨(IL)-22는 예를 들어, Th22 세포, NK 세포, 림프 조직 유도인자(LTi) 세포, 수지상 세포, 및 Th17 세포에 의해 생성된 시토카인의 IL-10 패밀리의 구성원이다. IL-22는 IL-22R1/IL-10R2 수용체 복합체에 결합하며, 선천적 세포(예를 들어, 상피 세포, 간세포, 및 각질세포) 및 여러 기관(예를 들어, 진피, 췌장, 장내, 및 호흡기계)의 장벽 상피 조직에서 발현된다.
IL-22는 점막 면역에 중요한 역할을 하며, 박테리아 병원체의 부착 및 소멸에 대한 초기 숙주 방어를 매개한다. IL-22는 상피 세포로부터 항균성 펩티드 및 전염증성 시토카인의 생산을 촉진하고 장에서 결장 상피 세포의 증식 및 이동을 자극한다. 박테리아 감염시, IL-22 녹아웃(knock-out) 마우스는 손상된 장 상피 재생, 높은 박테리아 로드, 및 증가된 사망률을 나타내었다. 유사하게, 인플루엔자 바이러스로 IL-22 녹아웃 마우스의 감염은 심한 체중 감소 및 기관 및 기관지 상피 세포의 손상된 재생을 초래하였다. 따라서, IL-22는 세균 감염을 억제하는데 있어서 전염증성 역할 뿐만 아니라 염증 반응 시 상피 재생에서 항-염증성 보호 역할을 한다.
궤양성 대장염 및 크론병을 포함한 염증성 장 질환(IBD), 뿐만 아니라 세균 감염, 급성 신부전, 급성 췌장염, 상처, 심혈관 병태, 대사 증후군, 급성 내독소혈증, 이식 대 숙주병(GVHD), 및 패혈증을 포함한 다른 장애의 치료를 위한 개선된 치료제 및 방법에 대한 요구가 남아 있다. 또한 이러한 치료제를 제조 및 정제하는 개선된 방법에 대한 요구도 남아 있다.
본 발명은, 특히, 인터류킨(IL)-22 Fc 융합 단백질, 이를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물), 및 예를 들어, IBD, 세균 감염, 급성 신부전, 급성 췌장염, 상처, 심혈관 병태, 대사 증후군, 급성 내독소혈증, GVHD, 및 패혈증을 포함한 장애의 치료를 위한 이를 제조, 정제, 및 사용하는 방법, 뿐만 아니라 방출을 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 배치를 선택하는 방법을 제공한다. 또한 본원에는 IL-22 Fc 융합 단백질의 시알산 함량을 제어하는 방법 및 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 이의 조성물의 시알산 함량을 조정함으로써 생체내 클리어런스를 감소시키고/시키거나 반감기를 증가시키는 방법이 제공된다.
일 측면에서, 본 발명은 인터류킨-22(IL-22) Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 특징으로 하며, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 글리코실화된 IL-22 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 N-글리코실화된다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및/또는 Asn143에 상응하는 하나 이상의 위치에서 글리코실화된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 특징으로 하며, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 글리코실화된 IL-22 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및/또는 Asn143에 상응하는 하나 이상의 위치에서 글리코실화되고, 여기서 (a) 잔기 Asn21에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 70 내지 90 범위이고/이거나; (b) 잔기 Asn35에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 90 내지 100 범위이고/이거나; (c) 잔기 Asn64에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 90 내지 100 범위이고/이거나; (d) 잔기 Asn143에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 25 내지 35 범위이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 또는 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는다. 다른 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 시알산 글리코실화는 N-아세틸뉴라민산(NANA)을 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 1 몰 미만의 N-글리콜릴뉴라민산(NGNA)의 평균 NGNA 함량을 갖는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 조성물은 액체 조성물이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서 (i) IL-22 Fc 융합 단백질은 약 8,000 ng/mL 내지 약 19,000 ng의 최대 관찰 농도(Cmax)를 갖고/갖거나; (ii) IL-22 Fc 융합 단백질은 약 7,000 일·ng/mL 내지 약 25,000 일·ng/mL의 시간 0에서 최종 측정가능한 시점까지 혈청 농도-시간 곡선하 면적(AUClast)을 갖고/갖거나; (iii) IL-22 Fc 융합 단백질은 약 40 mL/kg/일 내지 약 140 mL/kg/일의 클리어런스(CL)를 갖는다. 일부 구현예에서, Cmax, AUClast, 및/또는 CL은 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 1-안테나리, 2-안테나리, 3-안테나리, 및/또는 4-안테나리 구조를 갖는 N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 2%는 1-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (ii) N-글리칸의 약 10% 내지 약 25%는 2-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (iii) N-글리칸의 약 25% 내지 약 40%는 3-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (iv) N-글리칸의 약 30% 내지 약 51%는 4-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 0.1% 내지 2%는 1-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (ii) N-글리칸의 10% 내지 25%는 2-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (iii) N-글리칸의 25% 내지 40%는 3-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (iv) N-글리칸의 30% 내지 51%는 4-안테나리 구조를 갖는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 약 9% 내지 약 32%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 약 10% 내지 약 20%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 약 8% 내지 약 25%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 약 12% 내지 약 25%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (v) N-글리칸의 약 12% 내지 약 30%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 9% 내지 32%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 10% 내지 20%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 8% 내지 25%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 12% 내지 25%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (v) N-글리칸의 12% 내지 30%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 시알산 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 약 12% 내지 약 35%는 0개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 1개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 2개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 3개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (v) N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 12% 내지 35%는 0개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 10% 내지 30%는 1개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 10% 내지 30%는 2개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 10% 내지 30%는 3개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (v) N-글리칸의 1% 내지 20%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, (i) IL-22 폴리펩티드는 말단 만노스 모이어티를 포함하는 약 0% 내지 약 10% N-글리칸을 포함하고/하거나; (ii) IL-22 폴리펩티드는 말단 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 모이어티를 포함하는 약 30% 내지 약 55% N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, (i) IL-22 폴리펩티드는 말단 만노스 모이어티를 포함하는 0% 내지 10% N-글리칸을 포함하고/하거나; (ii) IL-22 폴리펩티드는 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는 30% 내지 55% N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 말단 만노스 모이어티를 포함하는 0% 내지 10% N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는 30% 내지 55% N-글리칸을 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, N-글리칸은 1, 2, 3, 또는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 약 5% 내지 약 25%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 약 0% 내지 약 15%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 1% 내지 20%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 1% 내지 20%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 5% 내지 25%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 0% 내지 15%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, (i) IL-22 폴리펩티드는 말단 갈락토스(Gal) 모이어티를 포함하는 약 20% 내지 약 45% N-글리칸을 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸은 1, 2, 또는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, (i) IL-22 폴리펩티드는 말단 Gal 모이어티를 포함하는 20% 내지 45% N-글리칸을 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸은 1, 2, 또는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 약 15% 내지 약 30%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 약 1% 내지 약 15%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 6%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 15% 내지 30%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 1% 내지 15%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 0.1% 내지 6%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서 (i) IL-22 폴리펩티드는 갈락토스 N-아세틸글루코사민(LacNAc) 반복부를 포함하는 N-글리칸을 포함하고/하거나; (ii) IL-22 폴리펩티드는 푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함하고/하거나; (iii) IL-22 폴리펩티드는 비푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표 12 또는 13에 제시된 N-글리칸 분포를 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 5 mg/mL이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 농도는 약 1 mg/mL이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 농도는 약 8 mg/mL 내지 약 12 mg/mL이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 농도는 약 10 mg/mL이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 적어도 약 500 L의 부피를 갖는 생산 배양물로부터 생성되었다. 임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 약 500 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는 생산 배양물로부터 생성되었다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 약 1,000 L 내지 약 3,000 L의 부피를 갖는 생산 배양물로부터 생성되었다. 일부 구현예에서 IL-22 Fc 융합 단백질은 약 1,500 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는 생산 배양물로부터 생성되었다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 약 2000 L의 부피를 갖는 생산 배양물로부터 생성되었다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 일부 구현예에서 (i) Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 Gly 또는 Ala이고/이거나; (ii) Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 299에서 아미노산 잔기는 Ala, Gly, 또는 Val이다. 일부 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 Gly 또는 Ala이다. 일부 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 Gly이다. 다른 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 Ala이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 95%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 인간 IL-22 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 RVESKYGPP(서열번호: 44)를 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, IL-22 수용체는 인간 IL-22 수용체이다. 일부 구현예에서, 인간 IL-22 수용체는 IL-22R1 폴리펩티드 및 IL-10R2 폴리펩티드로 이루어진 이종이량체를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22R1 폴리펩티드는 서열번호: 82의 아미노산 서열을 포함하고 IL-10R2 폴리펩티드는 서열번호: 84의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 2개의 쇄간 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 단일-쇄 단위로 이루어지며, 여기서 각각의 단일 쇄 단위는 인간 면역글로불린 IgG4의 Fc 영역과 융합된 IL-22를 포함하는 인간 IL-22 융합 단백질로 이루어진다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 조성물은 약제학적 조성물이다. 일부 구현예에서, 조성물은 수성 및/또는 멸균된다. 일부 구현예에서, 조성물은 추가적인 치료제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 겔화제를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염증성 장 질환(IBD)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 염증성 장 질환(IBD)을 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, IBD는 궤양성 대장염 또는 크론병이다. 일부 구현예에서, IBD는 궤양성 대장염이다. 일부 구현예에서, 궤양성 대장염은 중등증 내지 중증 궤양성 대장염이다. 일부 구현예에서, IBD는 크론병이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 임의의 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 염증성 장 질환(IBD)을 치료하거나, (ii) 장내 세균 감염을 억제하고, 세균 감염 동안 장내 배상 세포를 보존하고, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유를 향상시키거나, (iii) 급성 신부전 또는 급성 췌장염을 치료하거나, (iv) 상처 치유의 가속화 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유를 가속화 또는 개선시키거나, (v) 심혈관 질환 예컨대 관상 동맥 질환, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 또는 만성 신장 질환을 예방 또는 치료하거나, (vi) 대사 증후군을 치료하거나, (vii) 급성 내독소혈증 또는 패혈증을 치료하거나, 또는 (viii) GVHD를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 임의의 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 염증성 장 질환(IBD)을 치료하거나, (ii) 장내 세균 감염을 억제하고, 세균 감염 동안 장내 배상 세포를 보존하고, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유를 향상시키거나, (iii) 급성 신부전 또는 급성 췌장염을 치료하거나, (iv) 상처 치유의 가속화 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유를 가속화 또는 개선시키거나, (v) 심혈관 질환 예컨대 관상 동맥 질환, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 또는 만성 신장 질환을 예방 또는 치료하거나, (vi) 대사 증후군을 치료하거나, (vii) 급성 내독소혈증 또는 패혈증을 치료하거나, 또는 (viii) GVHD를 치료하는데 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기재된 임의의 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 장내 세균 감염의 억제, 세균 감염 동안 장내 배상 세포의 보존, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유의 향상을 필요로 하는 대상체에서 장내 세균 감염을 억제하고, 세균 감염 동안 장내 배상 세포를 보존하고, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유를 향상시키는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 급성 신부전 또는 급성 췌장염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 급성 신부전 또는 급성 취장염을 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상처 치유의 가속화 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유를 가속화 또는 개선시키는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 죽상경화 플라크 형성의 병리를 포함하는 심혈관 병태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 심혈관 병태를 예방 또는 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대사 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에서 대사 증후군을 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다의 치료를 필요로 하는 대상체에서 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다를 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 GVHD의 치료를 필요로 하는 대상체에서 GVHD를 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 조성물은 정맥내로, 피하로, 복강내로, 또는 국소로 투여된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 대상체는 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공동 투여받는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하며: (a) 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 숙주 세포를 시드 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 시드 트레인 배지에서 배양하는 단계; (c) 상기 시드 트레인을 접종물 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 접종물 배지 내에 접종하는 단계; 및 (d) 상기 접종물 트레인을 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 생산 배지에서 배양하며, 여기서 생산 배양물의 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 여기서 단계 (d)의 지속기간은 적어도 10 일이고, 이에 의해 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 단계, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 지속기간은 적어도 11 일, 적어도 12 일, 또는 적어도 13 일이다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 지속기간은 12 일이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (e) 생산 배양물로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (e)는 (i) 생산 배양물을 냉각시키는 단계; (ii) 원심분리에 의해 생산 배지로부터 숙주 세포를 제거하여 세포 배양액을 형성하는 단계; 및/또는 (iii) 세포 배양액을 여과하는 단계를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다: (f) 세포 배양액에서 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (f)는 하기 하위단계를 포함한다: (i) 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계; (ii) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및 (iii) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (f)는 하기 하위단계 중 하나 이상을 추가로 포함한다: (iv) 정제된 생성물 풀을 농축시켜 농축된 생성물 풀을 형성하는 단계; (v) 상기 정제된 생성물 풀을 한외여과하는 단계; (vi) 상기 농축된 생성물 풀의 완충액을 교환하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 한외여과 및 투석여과(UFDF) 풀을 형성하는 단계; 및/또는 (vii) 상기 UFDF 풀을 제형 완충액으로 조건화하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조건화된 UFDF 풀을 형성하는 단계. 일부 구현예에서, 하위단계 (i)은 세포 배양액을 친화성 칼럼에 접촉시키기 전에 세포 배양액에 세제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 적어도 약 10 일 동안 생산 배지에서 복수의 숙주 세포를 포함하는 접종물 트레인 배양물을 배양하며, 여기서 숙주 세포는 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고, 여기서 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 이에 의해 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하며, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 지속기간은 적어도 11 일, 적어도 12 일, 또는 적어도 13 일이다. 일부 구현예에서, 배양 지속기간은 12 일이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 상기 방법은 생산 배지에서 접종물 트레인 배양물을 배양하기 전에 시드 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 시드 트레인 배지에서 배양함으로써 시드 트레인 배양물을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생산 배지에서 접종물 트레인 배양물을 배양하기 전에 접종물 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 시드 트레인 배양물을 접종물 배지 내에 접종하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 진핵생물 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 일부 구현예에서, 세포 배양액을 수확하는 단계는 (i) 생산 배양물을 냉각시키는 단계; (ii) 원심분리에 의해 생산 배지로부터 숙주 세포를 제거하여 세포 배양액을 형성하는 단계; 및/또는 (iii) 세포 배양액을 여과하는 단계를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 배양액에서 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계는 하기 하위단계를 포함한다: (i) 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계; (ii) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및 (iii) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계는 하기 하위단계 중 하나 이상을 추가로 포함한다: (iv) 정제된 생성물 풀을 농축시켜 농축된 생성물 풀을 형성하는 단계; (v) 상기 정제된 생성물 풀을 한외여과하는 단계; (vi) 상기 농축된 생성물 풀의 완충액을 교환하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 한외여과 및 투석여과(UFDF) 풀을 형성하는 단계; 및/또는 (vii) 상기 UFDF 풀을 제형 완충액으로 조건화하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조건화된 UFDF 풀을 형성하는 단계. 일부 구현예에서, 하위단계 (i)은 세포 배양액을 친화성 칼럼에 접촉시키기 전에 세포 배양액에 세제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 상기 방법은 조성물의 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 내지 8 몰의 시알산 범위의 초기 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6, 7, 또는 8 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위로 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위로 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 지지체는 단백질 A 수지, 단백질 G 수지, 또는 IL-22 수용체 수지를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 A 수지는 MABSELECT SURE® 수지이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 음이온-교환 크로마토그래피 지지체는 다중모드 기능성 수지를 갖는 강한 음이온 교환기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음이온-교환 크로마토그래피 지지체는 CAPTO™ 부착 수지를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 또는 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 방법에 의해 생성된 조성물을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 조성물은 약제학적 조성물이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 2개의 쇄간 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 단일-쇄 단위로 이루어지며, 여기서 각각의 단일 쇄 단위는 인간 면역글로불린 IgG4의 Fc 영역과 융합된 IL-22를 포함하는 인간 IL-22 융합 단백질로 이루어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 방출을 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 배치를 선택하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 배치를 제공하는 단계; (b) 상기 배치에서 시알산의 수준을 평가하는 단계; 및 (c) 배치가 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는 경우 방출을 위한 배치를 선택하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 배치가 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 경우 방출을 위한 배치를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 배치가 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 경우 방출을 위한 배치를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 배치가 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 경우 방출을 위한 배치를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 배치에서 시알산의 수준을 평가하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC), 모세관 전기영동, 또는 비색 분석법을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 HPLC을 사용하여 시알산의 수준을 평가하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 링커에 의해 항체 Fc 영역에 연결된 글리코실화된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물의 시알산 함량을 제어하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 적어도 약 10 일 동안 생산 배지에서 복수의 숙주 세포를 포함하는 접종물 트레인 배양물을 배양하며, 여기서 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고 여기서 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는, 단계; 및 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위로 조성물의 평균 시알산 함량을 풍부화하여, 이에 의해 조성물의 시알산 함량을 제어하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위로 조성물의 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 링커에 의해 항체 Fc 영역에 연결된 글리코실화된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물의 시알산 함량을 제어하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 적어도 약 10 일 동안 생산 배지에서 복수의 숙주 세포를 포함하는 접종물 트레인 배양물을 배양하며, 여기서 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 여기서 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는, 단계; 및 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위로 조성물의 평균 시알산 함량을 풍부화하여, 이에 의해 조성물의 시알산 함량을 제어하는 단계를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위로 조성물의 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계는 생산 배양물로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양액을 수확하는 단계는 (i) 생산 배양물을 냉각시키는 단계; (ii) 원심분리에 의해 생산 배지로부터 숙주 세포를 제거하여 세포 배양액을 형성하는 단계; 및/또는 (iii) 세포 배양액을 여과하는 단계를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 조성물의 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계는 세포 배양액에서 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계는 하기 하위단계를 포함한다: (i) 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계; (ii) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및 (iii) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계는 하기 하위단계 중 하나 이상을 추가로 포함한다: (iv) 정제된 생성물 풀을 농축시켜 농축된 생성물 풀을 형성하는 단계; (v) 상기 정제된 생성물 풀을 한외여과하는 단계; (vi) 상기 농축된 생성물 풀의 완충액을 교환하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 한외여과 및 투석여과(UFDF) 풀을 형성하는 단계; 및/또는 (vii) 상기 UFDF 풀을 제형 완충액으로 조건화하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조건화된 UFDF 풀을 형성하는 단계. 일부 구현예에서, 하위단계 (i)은 세포 배양액을 친화성 칼럼에 접촉시키기 전에 세포 배양액에 세제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 지지체는 단백질 A 수지, 단백질 G 수지, 또는 IL-22 수용체 수지를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 A 수지는 MABSELECT SURE® 수지이다. 일부 구현예에서, 음이온-교환 크로마토그래피 지지체는 다중모드 기능성 수지를 갖는 강한 음이온 교환기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음이온-교환 크로마토그래피 지지체는 CAPTO™ 부착 수지를 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 특징으로 하며, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는다. 특정 측면에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산은 8 내지 12개의 시알산 모이어티가 IL-22 융합 단백질의 1 몰에 포함되어 있음을 의미한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 특징으로 하며, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해 약 40% 내지 약 130%의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해 약 80% 내지 약 120%의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해 약 60% 내지 약 110%의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해 약 80% 내지 약 100%의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, 효능은 수용체 결합 검정 또는 세포-기반 결합 검정에서 평가된다. 일부 구현예에서, 참조 IL-22 Fc 융합 단백질은 표 12 및/또는 표 13에 제시된 N-글리칸 분포를 갖는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산의 시알삼 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 11 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 10 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 9 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 시알산은 N-아세틸뉴라민산(NANA)이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 약 9,000 ng/mL 내지 약 18,000 ng/ml의 최대 관찰 농도(Cmax)를 갖는다. 일부 구현예에서, Cmax는 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가된다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 약 7,000 일·ng/mL 내지 약 25,000 일·ng/mL의 시간 0에서 최종 측정가능한 시점까지 혈청 농도-시간 곡선하 면적(AUClast)을 갖는다. 일부 구현예에서, AUClast은 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가된다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 약 40 mL/kg/일 내지 약 140 mL/kg/일의 클리어런스(CL)를 갖는다. 일부 구현예에서, CL은 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 N-글리코실화된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 1-안테나리, 2-안테나리, 3-안테나리, 및/또는 4-안테나리 구조를 갖는 N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 2%는 1-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.5% 내지 약 1.5%는 1-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1%는 1-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 25%는 2-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 12% 내지 약 21%는 2-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 17%는 2-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 25% 내지 약 40%는 3-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 28% 내지 약 35%는 3-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 31%는 3-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 30% 내지 약 51%는 4-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 35% 내지 약 48%는 4-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 42%는 4-안테나리 구조를 갖는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 9% 내지 약 32%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 21%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 20%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 12% 내지 약 16%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 14%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 8% 내지 약 25%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 16%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 13%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 12% 내지 약 25%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 22%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 19%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 12% 내지 약 30%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 24%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 시알산 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 12% 내지 약 35%는 0개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 20% 내지 약 30%는 0개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 24%는 0개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 1개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%는 1개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 20%는 1개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 2개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%는 2개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 21%는 2개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 3개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 12% 내지 약 24%는 3개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 17%는 3개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 15%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 9%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 말단 만노스 모이어티를 포함하는 약 0% 내지 약 10% N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 4%는 말단 만노스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 2%는 말단 만노스 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 말단 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 모이어티를 포함하는 약 30% 내지 약 55% N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 35% 내지 약 50%는 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 42%는 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, N-글리칸은 1, 2, 3, 또는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 15%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 15%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 25%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 20%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 14%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0% 내지 약 15%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 4% 내지 약 12%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 7%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 말단 갈락토스(Gal) 모이어티를 포함하는 약 20% 내지 약 45% N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 25% 내지 약 35%는 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 32%는 말단 Gal 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, N-글리칸은 1, 2, 또는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 30%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 20% 내지 약 25%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 23%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 15%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 2% 내지 약 12%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 7%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 6%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 3%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 2%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 갈락토스 N-아세틸글루코사민(LacNAc) 반복부를 포함하는 N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 10%는 LacNAc 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 3% 내지 약 6%는 LacNAc 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5%는 LacNAc 반복부를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 60% 내지 약 80%는 푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 65% 내지 약 75%는 푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 70%는 푸코실화된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 비푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 비푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%는 비푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 20%는 비푸코실화된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및/또는 Asn143 상에서 글리코실화된다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및 Asn143 상에서 글리코실화된다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유 약 70% 내지 약 90%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유는 약 75% 내지 약 85%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유는 약 81% 내지 약 84%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유는 약 82%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유는 약 90% 내지 약 100%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유는 약 95% 내지 약 100%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유는 약 100%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유는 약 90% 내지 약 100%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유는 약 95% 내지 약 100%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유는 약 100%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유는 약 15% 내지 약 45%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유는 약 25% 내지 약 35%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유는 약 32% 내지 약 35%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유는 약 33%이다.
일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및 Asn143 상에서 글리코실화되며, 여기서 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유는 약 81% 내지 약 84%이고, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유는 약 100%이고, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유는 약 100%이고 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유는 약 32% 내지 약 35%이다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및 Asn143 상에서 글리코실화되며, 여기서 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유는 81% 내지 84%이고, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유는 100%이고, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유는 100%이고 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유는 32% 내지 35%이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표 12 또는 13에 제시된 N-글리칸 분포를 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 일부 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 글리신(Gly)이다. 일부 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 알라닌(Ala)이다. 일부 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 299에서 아미노산 잔기는 Ala, Gly, 또는 발린(Val)이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 10의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 16의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 N-글리코실화되지 않는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질이다. 임의의 상기 측면의 다른 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 인간 IL-22 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 RVESKYGPP(서열번호: 44)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 RVESKYGPP(서열번호: 44)로 이루어진다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, IL-22 수용체는 인간 IL-22 수용체이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22RA1 및/또는 IL-10R2에 결합한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22RA1에 결합한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 몰 미만의 NGNA의 -글리콜릴뉴라민산(또한 Neu5Gc 또는 NGNA로도 알려짐) 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 1 몰 미만의 NGNA의 NGNA 함량을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 10 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 9 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 시알산은 N-아세틸뉴라민산(NANA)이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 추가적인 치료제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 겔화제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 겔화제는 폴리사카라이드이다. 일부 구현예에서, 겔화제는 셀룰로스제이다. 일부 구현예에서, 겔화제는 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, POE-POP 블록 공중합체, 알기네이트, 히알루론산, 폴리아크릴산, 하이드록시에틸 메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스이다. 일부 구현예에서, 겔화제는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스이다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 국소 투여를 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 염증성 장 질환(IBD)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 염증성 장 질환(IBD)을 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, IBD는 궤양성 대장염 또는 크론병이다. 일부 구현예에서, IBD는 궤양성 대장염이다. 일부 구현예에서, 궤양성 대장염은 중등증 내지 중증 궤양성 대장염이다. 일부 구현예에서, IBD는 크론병이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 장내 세균 감염의 억제, 세균 감염 동안 장내 배상 세포의 보존, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유의 향상을 필요로 하는 대상체에서 장내 세균 감염을 억제하고, 세균 감염 동안 장내 배상 세포를 보존하고, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유를 향상시키는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상피 세포는 장의 상피 세포이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 급성 신부전 또는 급성 췌장염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 급성 신부전 또는 급성 췌장염을 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상처 치유의 가속화 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유를 가속화 또는 개선시키는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상처는 만성 상처 또는 감염된 상처이다. 일부 구현예에서, 대상체는 당뇨병성이다. 일부 구현예에서, 당뇨병성 대상체는 II형 당뇨병을 갖는다. 일부 구현예에서, 상처는 당뇨병성 족부 궤양이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물은 상처 봉합이 완료될 때까지 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 죽상경화 플라크 형성의 병리를 포함하는 심혈관 병태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 심혈관 병태를 예방 또는 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 심혈관 질환은 관상 동맥 질환, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 또는 만성 신장 질환이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 죽상경화 플라크 형성의 진행을 둔화시키거나 또는 죽상동맥경화증의 징후를 예방하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 죽상동맥경화증의 징후는 플라크 축적 및/또는 혈관 염증을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대사 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에서 대사 증후군을 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 복부 비만, 고혈당증, 이상지질혈증, 및 고혈압 중 하나 이상을 포함하는 대사 증후군과 연관된 하나 이상의 위험 요인을 감소시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체에서 박테리아 리포폴리사카라이드의 수준을 감소시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다의 치료를 필요로 하는 대상체에서 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다를 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 HDL/LDL 지질 프로파일의 변화를 필요로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 GVHD의 치료를 필요로 하는 대상체에서 GVHD를 치료하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 측면에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 염증성 장 질환(IBD)을 치료하거나, (ii) 장내 세균 감염을 억제하고, 세균 감염 동안 장내 배상 세포를 보존하고, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유를 향상시키거나, (iii) 급성 신부전 또는 급성 췌장염을 치료하거나, (iv) 상처 치유의 가속화 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유를 가속화 또는 개선시키거나, (v) 심혈관 질환 예컨대 관상 동맥 질환, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 또는 만성 신장 질환을 예방 또는 치료하거나, (vi) 대사 증후군을 치료하거나, (vii) 급성 내독소혈증 또는 패혈증을 치료하거나, 또는 (viii) GVHD를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물을 포함하는 조성물을 특징으로 한다.
또한 또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 염증성 장 질환(IBD)을 치료하거나, (ii) 장내 세균 감염을 억제하고, 세균 감염 동안 장내 배상 세포를 보존하고, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유를 향상시키거나, (iii) 급성 신부전 또는 급성 췌장염을 치료하거나, (iv) 상처 치유의 가속화 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유를 가속화 또는 개선시키거나, (v) 심혈관 질환 예컨대 관상 동맥 질환, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 또는 만성 신장 질환을 예방 또는 치료하거나, (vi) 대사 증후군을 치료하거나, (vii) 급성 내독소혈증 또는 패혈증을 치료하거나, 또는 (viii) GVHD를 치료하는데 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 약제학적 조성물을 포함하는 조성물의 용도를 특징으로 한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 10 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 시알산은 N-아세틸뉴라민산(NANA)이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물은 정맥내로, 피하로, 복강내로, 또는 국소로 투여된다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물은 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물은 피하로 투여된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 대상체는 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공동 투여받는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 숙주 세포를 시드 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 시드 트레인 배지에서 배양하는 단계; (c) 상기 시드 트레인을 접종물 배지 내에 접종하고 접종물 트레인을 형성하기에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및 (d) 상기 접종물 트레인을 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 생산 배지에서 배양하며, 여기서 생산 배양물의 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 이에 의해 IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 단계.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 하기 단계를 포함하며: (a) 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 숙주 세포를 시드 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 시드 트레인 배지에서 배양하는 단계; (c) 상기 시드 트레인을 접종물 트레인을 형성하기에 적합한 조건 하에 접종물 배지 내에 접종하는 단계; 및 (d) 상기 접종물 트레인을 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 생산 배지에서 배양하며, 여기서 생산 배양물의 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 이에 의해 IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 단계, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 숙주 세포는 동결된 숙주 세포이고, 단계 (a)는 시드 트레인 배지에서 동결된 숙주 세포를 해동시키는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (d) 전에 접종물 트레인을 약 1 내지 약 10회 계대하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인은 단계 (d) 전에 약 2 내지 약 6회 계대된다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인은 단계 (d) 전에 약 5회 계대된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지는 숙주 세포를 선택할 수 있는 선택제를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택제는 메티오닌 술폭시민, 메토트렉세이트, 또는 항생제이다. 일부 구현예에서, 선택제는 메티오닌 술폭시민이다. 일부 구현예에서, 선택제는 항생제이다. 일부 구현예에서, 항생제는 블라스티시딘, 게네티신, 하이그로마이신 B, 퓨로마이신, 마이코페놀산, 또는 제오신으로부터 선택된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지, 접종물 배지, 및/또는 생산 배지는 소포제를 포함한다. 일부 구현예에서, 소포제는 시메티콘 에멀젼, 소포제 204, 소포제 A, 소포제 B, 소포제 C, 소포제 Y-30, 또는 소포제 SE-15이다. 일부 구현예에서, 소포제는 시메티콘 에멀젼이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지, 접종물 배지, 및/또는 생산 배지는 완충제, 세포 보호제, 폴리사카라이드, 및/또는 삼투압 조절제를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 35℃ 내지 약 39℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 37℃의 온도에서 수행된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 단계 (b)는 스피너, 스핀 튜브, 진탕 플라스크, 1회용 생물 반응기(예를 들어, WAVE BIOREACTOR™ 또는 AMBR® 생물 반응기(예를 들어, AMBR® 15 생물 반응기)), 또는 시드 트레인 생물 반응기에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 시드 트레인 스피너 또는 진탕 플라스크에서 수행된다. 다른 구현예에서, 단계 (b)는 1회용 생물 반응기(예를 들어, WAVE BIOREACTOR™ 또는 AMBR® 생물 반응기(예를 들어, AMBR® 15 생물 반응기 또는 AMBR® 250 생물 반응기))에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 계대 당 약 1 일 내지 약 12 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 계대 당 약 2 일 내지 약 7 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 시드 트레인 생물 반응기에서 수행된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지의 pH는 약 6 내지 약 8이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지의 pH는 약 6.5 내지 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지의 pH는 약 7.15이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지의 용존 산소는 약 15% 내지 약 50%이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지의 용존 산소는 약 20% 내지 약 40%이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지의 용존 산소는 약 30%이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 1 일 내지 약 10 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 2 일 내지 약 5 일의 지속기간을 갖는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 35℃ 내지 약 39℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 37℃의 온도에서 수행된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 단계 (c)는 하나 이상의 생물 반응기에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 3 또는 4개의 생물 반응기에서 수행된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 접종물 배지의 pH는 약 6 내지 약 8이다. 일부 구현예에서, 접종물 배지의 pH는 약 6.5 내지 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 접종물 배지의 pH는 약 7.1이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 접종물 배지의 용존 산소는 약 15% 내지 약 50%이다. 일부 구현예에서, 접종물 배지의 용존 산소는 약 20% 내지 약 40%이다. 일부 구현예에서, 접종물 배지의 용존 산소는 약 30%이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 1 일 내지 약 5 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 2 일 내지 약 3 일의 지속기간을 갖는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 단계 (d)는 초기 온도에서 이동후 온도까지 온도 이동을 포함한다. 일부 구현예에서, 초기 온도는 약 25℃ 내지 약 40℃이다. 일부 구현예에서, 초기 온도는 약 35℃ 내지 약 39℃이다. 일부 구현예에서, 초기 온도는 약 37℃이다. 일부 구현예에서, 이동후 온도는 약 25℃ 내지 약 40℃이다. 일부 구현예에서, 이동후 온도는 약 30℃ 내지 약 35℃이다. 일부 구현예에서, 이동후 온도는 약 33℃이다. 일부 구현예에서, 온도 이동은 약 12 시간 내지 약 120 시간의 기간에 걸쳐 발생한다. 일부 구현예에서, 온도 이동은 약 48 시간 내지 약 96 시간의 기간에 걸쳐 발생한다. 일부 구현예에서, 온도 이동은 약 72 시간의 기간에 걸쳐 발생한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 생산 배지의 pH는 약 6 내지 약 8이다. 일부 구현예에서, 생산 배지의 pH는 약 6.5 내지 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 생산 배지의 pH는 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 생산 생물 반응기에서 수행된다. 일부 구현예에서, 생산 배지의 용존 산소는 약 15% 내지 약 50%이다. 일부 구현예에서, 생산 배지의 용존 산소는 약 20% 내지 약 40%이다. 일부 구현예에서, 생산 배지의 용존 산소는 약 30%이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 단계 (d) 약 5 일 내지 약 25 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 7 일 내지 약 16 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 8 일 내지 약 16 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 12 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 영양소 공급물에 의해 생산 배지에 영양소를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 일부 구현예에서, 진핵생물 세포는 포유동물 세포이다. 일부 구현예에서, 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 일부 구현예에서, CHO 세포는 현탁-적합한 CHO 세포이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (e) 생산 배양물로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (e)는 생산 배양물을 냉각시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (e)는 생산 배양물을 약 2℃ 내지 약 8℃로 냉각시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (e)는 원심분리에 의해 생산 배지로부터 숙주 세포를 제거하여 세포 배양액을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (e)는 세포 배양액을 여과하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (f) 세포 배양액에서 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (f)는 하기 하위단계를 포함한다: (i) 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계; (ii) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및 (iii) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (f)는 하기 하위단계를 추가로 포함한다: (iv) 정제된 생성물 풀을 농축시켜 농축된 생성물 풀을 형성하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (f)는 하기 하위단계를 추가로 포함한다: (v) 상기 정제된 생성물 풀을 한외여과하는 단계. 일부 구현예에서, 한외여과하는 것은 정제된 생성물 풀을 10-kDa 복합 재생 셀룰로스 한외여과 막으로 여과하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (f)는 하기 하위단계를 추가로 포함한다: (vi) 상기 농축된 생성물 풀의 완충액을 교환하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 한외여과 및 투석여과(UFDF) 풀을 형성하는 단계. 일부 구현예에서, 농축된 생성물 풀의 완충액은 0.01 M 나트륨 포스페이트, pH 7.2, 최종 농도를 포함하는 투석여과 완충액과 교환된다. 일부 구현예에서, 단계 (f)는 하기 하위단계를 추가로 포함한다: (vii) 상기 UFDF 풀을 제형 완충액으로 조건화하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조건화된 UFDF 풀을 형성하는 단계. 일부 구현예에서, 하위단계 (i)은 세포 배양액을 친화성 칼럼에 접촉시키기 전에 세포 배양액에 세제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하위단계 (i)은 친화성 풀에 세제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세제는 TRITON® X-100 또는 TRITON® CG110이다. 일부 구현예에서, 세제의 최종 농도는 약 0.01% 내지 약 2%(v/v)이다. 일부 구현예에서, 세제의 최종 농도는 약 0.1% 내지 약 1%(v/v)이다. 일부 구현예에서, 세제의 최종 농도는 약 0.3% 내지 약 0.5%(v/v)이다. 일부 구현예에서, 세제의 최종 농도는 약 0.5%이다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화는 약 12° 내지 약 25℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, 바이러스를 불활시키는 것은 약 0.5 시간 초과의 지속기간을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 방법을 특징으로 하며, 상기 방법은 (a) IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 제공하고 임의적으로 상기 세포 배양액에서 바이러스를 불활성화시키는 단계; (b) 상기 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계; (c) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및 (d) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 지지체는 단백질 A 수지, 단백질 G 수지, 또는 IL-22 수용체 수지를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 A 수지는 MABSELECT SURE® 수지이다. 일부 구현예에서, 세척 완충액은 0.4 M 칼륨 포스페이트, pH 7.0, 최종 농도를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 제1 용리 완충액은 0.3 M L-아르기닌 하이드로클로라이드, 0.013 M 나트륨 포스페이트, pH 3.8, 최종 농도를 포함한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 음이온-교환 크로마토그래피 지지체는 다중모드 기능성 수지를 갖는 강한 음이온 교환기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음이온-교환 크로마토그래피 지지체는 CAPTO™ 부착 수지를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 평형 완충액은 0.04 M 나트륨 아세테이트, pH 5.8, 최종 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 용리 완충액은 구배 용리 완충액이다. 일부 구현예에서, 구배 용리 완충액은 구배 용리 완충액의 완충액 A로서 0.04 M 나트륨 아세테이트, pH 5.8 및 구배의 완충액 B로서 0.04 M 나트륨 아세테이트, 0.3M 나트륨 술페이트 pH 5.8을 포함하며, 여기서 구배는 완충액 B의 10%에서 시작한다. 일부 구현예에서, 제2 평형 완충액은 0.025 M MOPS, 0.3 M 나트륨 술페이트, pH 7.0, 최종 농도를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물은 IBD의 치료를 필요로 하는 대상체에서 IBD를 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, IBD는 궤양성 대장염(UC) 또는 크론병이다. 일부 구현예에서, IBD는 궤양성 대장염(UC)이다. 일부 구현예에서, 궤양성 대장염은 중등증 내지 중증 궤양성 대장염이다. 일부 구현예에서, IBD는 크론병이다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물은 장내 세균 감염의 억제, 세균 감염 동안 장내 배상 세포의 보존, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유의 향상을 필요로 하는 대상체에서 장내 세균 감염을 억제하고, 세균 감염 동안 장내 배상 세포를 보존하고, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유를 향상시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상피 세포는 장의 상피 세포이다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물은 급성 신부전 또는 급성 췌장염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 급성 신부전 또는 급성 췌장염을 치료하는 방법에 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물은 상처 치유의 가속화 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유를 가속화 또는 개선시키는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상처는 만성 상처 또는 감염된 상처이다. 일부 구현예에서, 대상체는 당뇨병성이다. 일부 구현예에서, 당뇨병성 대상체는 II형 당뇨병을 갖는다. 일부 구현예에서, 상처는 당뇨병성 족부 궤양이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물은 상처 봉합이 완료될 때까지 투여된다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물은 죽상경화 플라크 형성의 병리를 포함하는 심혈관 병태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 심혈관 병태를 예방 또는 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 심혈관 질환은 관상 동맥 질환, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 또는 만성 신장 질환이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 죽상경화 플라크 형성의 진행을 둔화시키거나 또는 죽상동맥경화증의 징후를 예방하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 죽상동맥경화증의 징후는 플라크 축적 및/또는 혈관 염증을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물은 대사 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에서 대사 증후군을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 복부 비만, 고혈당증, 이상지질혈증, 및 고혈압 중 하나 이상을 포함하는 대사 증후군과 연관된 하나 이상의 위험 요인을 감소시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대상체에서 박테리아 리포폴리사카라이드의 수준을 감소시키는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 본원에 기재된 임의의 약제학적 조성물은 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다의 치료를 필요로 하는 대상체에서 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다를 치료하는 방법에 사용된다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 대상체는 HDL/LDL 지질 프로파일의 교환을 필요로 한다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물은 정맥내로, 피하로, 복강내로, 또는 국소로 투여된다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물은 정맥내로 투여되는 것이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물은 피하로 투여되는 것이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 대상체는 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공동 투여받는다. 임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다.
각각 및 모든 구현예는 문맥상 달리 분명하게 시사되지 않는 한 조합될 수 있다. 각각 및 모든 구현예는 문맥상 달리 분명하게 시사되지 않는 한 본 발명의 각각 및 모든 측면에 적용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 구현예는 특정 바람직한 구현예 및 청구범위의 하기 보다 상세한 설명으로부터 자명할 것이다.
도 1a는 인간 면역글로불린 G4(IgG4) Fc 영역에 각각 융합된 2개의 인간 인터류킨-22(IL-22) 폴리펩티드를 갖는 예시적인 이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질의 개략적인 설계 구성을 제시하는 개략도이다. 2개의 Fc 영역은 2개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결된다. 또한 각각의 IL-22 폴리펩티드 상의 4개의 N-글리칸의 존재가 도시된다.
도 1b는 IL-22 Fc 융합 단백질의 인간 인터류킨-22(IL-22) 시토카인 영역의 주석이 달린 아미노산 서열이다. IL-22 수용체 결합 영역은 굵게 표시되어 있다. Asn21, Asn35, Asn64, 및 Asn143에서 글리코실화 부위는 N으로 표시되어 있다.
도 1c는 IL-22 Fc 융합 단백질의 인간 면역글로불린 G4(IgG4) Fc 영역의 주석이 달린 아미노산 서열이다. Fc 이펙터 기능에 대한 가능성을 최소화하면서 N-글리칸을 제거하기 위한 N81G의 Fc 돌연변이는 G로 표시되어 있다.
도 2a는 온전한, 탈글리코실화된 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치의 질량 분석법 프로파일을 제시하는 크로마토그램이며, 온전한 분자에 대해 예측된 분자 질량을 확인한다. 85,265　Da 및 85,393　Da에서의 종은 각각 1개의 C-말단 리신 잔기 및 2개의 C-말단 리신 잔기를 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질이다.
도 2b는 환원된, 탈글리코실화된 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치의 질량 분석법 프로파일을 제시하는 크로마토그램이며, 환원된 분자에 대해 예측된 분자 질량을 확인한다. 42,706　Da에서의 종은 1개의 C-말단 리신 잔기를 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질이다.
도 3a-3b는 0 내지 50 분(3a) 및 50-110 분(3b) 사이의 트립신 분해된 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치의 크로마토그래피 프로파일의 확대도를 제시하는 일련의 크로마토그램이다.
도 3c-3d는 0 내지 50 분(3c) 및 50-110 분(3d) 사이의 트립신 분해된 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 및 3의 크로마토그래피 프로파일을 비교하는 확대도를 제시하는 일련의 크로마토그램이며, 1차 구조를 확인하고 펩티드 패턴의 배치-대-배치 일관성을 입증한다.
도 4a-4b는 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 및 3의 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC) 프로파일의 실치도(4a) 및 확대도(4b)를 제시하는 일련의 크로마토그램이며 IL-22 Fc 융합 단백질의 분자 크기 이질성에 대한 정량적 정보를 제공한다. 주요 피크의 정점에서 관찰된 차이는 글리코실화에 기인한다.
도 5a-5b는 비환원된, 형광으로 표지된 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 및 3의 모세관 전기영동 나트륨 도데실 술페이트, 비-겔 체질(CE-SDS-NGS) 분석의 실치도(5a) 및 확대도(5b)를 제시하는 일련의 크로마토그램이며, 일치하는 피크 패턴 및 퍼센트 보정 피크 면적(CPA)을 갖는 하나의 주요 피크의 존재를 입증한다. 주요 피크의 형상 차이는 글리코실화에 기인한다.
도 5c-5d는 환원된, 형광으로 표지된 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 및 3의 CE-SDS-NGS 분석의 실치도(5c) 및 확대도(5d)를 제시하는 일련의 크로마토그램이며, 일치하는 피크 패턴 및 퍼센트 보정 피크 면적(CPA)을 갖는 하나의 주요 피크의 존재를 입증한다. 주요 피크의 형상 차이는 글리코실화에 기인한다. IRS = 불완전하게 환원된 종.
도 6a-6b는 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 및 3의 환원된(6a) 및 비환원된(6b) 샘플의 SYPRO® Ruby-염색된 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 제시하며, 모든 배치에 걸쳐 일치하는 결합 패턴을 입증한다. 레인 1: 프리시전 플러스(Precision plus) 염색되지 않은 단백질 표준(Biorad), 레인 2: 8 ng 소 혈청 알부민(BSA), 레인 3: 2 ng BSA, 레인 4: IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치, 레인 5: IL-22 Fc 융합 단백질 임상 배치 1, 레인 6: IL-22 Fc 융합 단백질 임상 배치 2, 및 레인 7: IL-22 Fc 융합 단백질 임상 배치 3.
도 7a-7b는 천연 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 및 3의 영상화 모세관 등전점 전기영동(ICIEF)의 실치도(7a) 및 확대도(7b)를 제시하는 일련의 크로마토그램이다.
도 7c-7d는 C-말단 리신의 제거 후 카르복시펩티다제 B(CpB)-처리된 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 및 3 이질성의 ICIEF의 실치도(7c) 및 확대도(7d)를 제시하는 일련의 크로마토그램이다. 프로파일의 pI에서 사소한 차이는 기기 관련된 것이며 퍼센트 피크 면적에 영향을 미치지 않는다.
도 7e는 천연 및 CpB-처리된 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치의 ICIEF 프로파일을 제시하는 크로마토그램이다.
도 8a-8b는 0-40 분(8a) 및 40-75 분(8b)에서 2-아미노벤조산 친수성 상호작용 액체 크로마토그래피-초고성능 액체 크로마토그래피(2-AA HILIC-UHPLC)에 의한 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 및 3의 상대적 N-글리칸 분포를 제시하는 일련의 크로마토그램이다.
도 8c-8d는 2-AA HILIC-UHPLC에 의해 피크 면적 백분율(%)로서 나타낸 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 및 3(8c) 및 참조 표준 배치 및 임상 배치 2, 3, 4, 5, 및 6(8d)의 상대적 N-글리칸 분포를 제시하는 일련의 그래프이다.
도 9는 Lys-C 펩티드 맵핑 및 LC-MS에 의해 피크 면적 %로서 나타낸 위치 Asn21에서 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 및 3의 상대적 N-글리칸 분포를 제시하는 그래프이다.
도 10은 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 및 3의 원평관 이색성(CD) 스펙트럼이며, 배치 사이의 고차 구조적 특성에서 확인가능한 차이가 없음을 제시한다.
도 11은 IL-22 수용체를 내인성으로 발현하고 STAT3 루시퍼라제 리포터 유전자를 안정되게 발현하는 인간 결장암 세포주 Colo 205를 사용한 세포-기반 IL-22 Fc 융합 단백질 결합 효능 검정의 개략적 개요이다.
도 12a는 세포-기반 IL-22 Fc 융합 단백질 결합 효능 검정과 비교하여 시험관내 검정에서 시알산 함량과 효능 사이의 관계를 입증하는 그래프이다.
도 12b는 시알리다제로 탈시알릴화 전 및 후에 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 2, 4, 5, 및 6의 효능을 비교하는 그래프이다. 모든 탈시알릴화된 샘플 및 참조 표준 배치에 대해, 오차 막대는 n　=　2의 % 차이를 나타낸다. 방출 값에서의 효능에 대해, 오차 막대는 n　=　3의 표준 편차이다. 별표(*)는 효능의 추정치, 검증된 검정 범위를 벗어난 결과를 나타낸다.
도 13은 PNGase F 효소로 탈글리코실화 후 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 2, 4, 5, 및 6의 효능을 검사하는 일련의 그래프이다. 공정 제어는 샘플과 동일한 인큐베이션에 노출되었지만, PNGase　F는 첨가되지 않았다.
도 14는 단일 정맥내(IV) 투여 후 IL-22 Fc 융합 단백질의 시알산 변이체에 대해 마우스에서 시간 경과에 따른 혈청 IL-22 Fc 융합 단백질 농도를 비교하는 그래프이다.
도 15는 지시된 IL-22 Fc 융합 단백질 시알산 변이체의 단일 IV 투여 후 마우스에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 시험관내 효능 및 노출에 대한 시알산 수준의 영향의 반대 효과를 제시하는 그래프이다.
도 16a는 시간 경과에 따른 혈청 REG3β 농도(ng/mL)로 나타낸 마우스에서 단일 IV 투여 후 IL-22 Fc 융합 단백질의 시알산 변이체에 대한 REG3β 반응의 영향을 제시하는 그래프이다.
도 16b는 REG3β AUC(일 x ng/mL) 대 IL-22Fc 융합 단백질 AUC(일 x ng/mL)로 나타낸 마우스에서 단일 IV 투여 후 IL-22 Fc 융합 단백질 노출과 IL-22 Fc 융합 단백질 시알산 변이체에 대한 혈청 REG3β 반응 사이의 관계를 제시하는 그래프이다.
도 17은 IL-22 Fc 융합 단백질의 생산을 위한 공정중 제어, 공정 단계, 및 배지를 제시하는 세포 배양 공정 흐름도이다.
도 18은 IL-22 Fc 융합 단백질의 정제를 위한 공정 단계 및 공정중 제어를 제시하는 정제 공정 흐름도이다.
도 19는 상이한 포유동물 종으로부터 성숙 IL-22의 아미노산 서열 정렬을 제시한다: 인간(GenBank 수탁 번호 Q9GZX6, 서열번호: 4, 침팬지(GenBank 수탁 번호 XP_003313906, 서열번호: 48), 오랑우탄(GenBank 수탁 번호 XP_002823544, 서열번호: 49), 마우스(GenBank 수탁 번호 Q9JJY9, 서열번호: 50) 및 개(GenBank 수탁 번호 XP_538274, 서열번호: 51).
도 20은 세포 배양 과정에 걸친 시알산 수준의 변화를 제시하는 그래프이다. 각각의 라인 플롯은 상이한 생산 실시를 제시한다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 검정을 사용하여 시알산 수준을 결정하였다. IL-22 Fc 단백질의 몰 당 시알산 수준(y-축에 제시됨)은 세포 배양 지속기간(x-축에 제시됨)이 증가함에 따라 감소한다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성 및/또는 즉시 참조를 위해 본원에 정의되고, 본원에서 이러한 정의의 포함은 당업계에서 일반적으로 이해되는 것에 대하여 실질적인 차이를 나타내기 위한 것으로 반드시 해석되지 않아야 한다.
본원에 사용된 용어 "약"은 이 기술 분야에서 당업자에게 용이하게 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 관련된 구현예를 포함한다(기재한다).
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 달리 명백하게 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 예를 들어, "단리된 펩티드"에 대한 언급은 하나 이상의 단리된 펩티드를 의미한다.
본 명세서 및 청구범위 전체에 걸쳐, 단어 "포함하다", 또는 변이형 예컨대 "포함한다" 또는 "포함하는"은 언급된 정수 또는 정수의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 정수의 그룹을 배제하지 않음을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본원에 사용된 용어 "IL-22 Fc 융합 단백질" 또는 "IL-22 융합 단백질" 또는 "IL-22 Ig 융합 단백질"은 IL-22 단백질 또는 폴리펩티드가 직접적으로 또는 간접적으로 IgG Fc 영역에 연결된 융합 단백질을 지칭한다. 일부 구현예에서, IL-22 단백질 또는 폴리펩티드는 글리코실화된다. 특정 구현예에서, IL-22 단백질 또는 폴리펩티드는 시알릴화된다. 특정 바람직한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 인간 IgG Fc 영역에 연결된 인간 IL-22 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 인간 면역글로불린 G4(IgG4) Fc 영역에 각각 융합된 2개의 인간 인터류킨-22(IL-22) 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 2개의 Fc 영역은 2개의 쇄간 디술피드 결합에 의해 연결된다. 특정한 구현예에서, 인간 IL-22 단백질은 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, IL-22 또는 IL-22 Fc 융합 단백질의 기능 및/또는 활성에 영향을 미치지 않는 IL-22 또는 Fc의 삽입, 결실, 치환, 특히 보존적 아미노산 치환과 같은 사소한 서열 변이가 또한 본 발명에 의해 고려됨이 이해된다. 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 수용체에 결합할 수 있으며, IL-22 수용체 하류 신호전달을 유도할 수 있다. 특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 수용체에 결합할 수 있고/있거나, IL-22 수용체 하류 신호전달을 유도할 수 있다. IL-22 Fc 융합 단백질의 기능 및/또는 활성은 비제한적으로, ELISA, 리간드-수용체 결합 검정 및 Stat3 루시퍼라제 검정을 포함하는 당업계에 알려진 방법에 의해 검정될 수 있다. 특정한 구현예에서, 본 발명은 IL-22 수용체에 결합하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 결합은 IL-22 수용체 하류 신호전달을 유도할 수 있으며, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 12, 서열번호: 14, 및 서열번호: 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 특정한 특정 구현예에서, IL-22 융합 단백질의 Fc 영역은 이펙터 활성을 보유하지 않거나 (예를 들어, FcγIIIR에 결합하지 않음) 또는 전체(예를 들어, 야생형) IgG 항체보다 실질적으로 더 낮은 이펙터 활성을 나타낸다. 특정한 다른 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 항체-의존적 세포 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존적 세포독성(CDC)과 같은 세포독성을 촉발하지 않는다. 달리 명시되지 않는 한, "IL-22 융합 단백질", "IL-22 Fc 융합", "IL-22 Ig 융합 단백질", "IL-22 Fc 융합 단백질", 또는 "IL-22 Fc"는 본 출원 전체에 걸쳐 상호교환가능하게 사용된다.
본원에 사용된 용어 "IL-22" 또는 "IL-22 폴리펩티드" 또는 "IL-22 단백질"은, 달리 지시되지 않는 한, 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 포유동물 공급원으로부터의 임의의 천연 IL-22를 광범위하게 지칭한다. 상기 용어는 "전장", 처리되지 않은 IL-22 뿐만 아니라 세포에서의 처리에 기인한 임의의 형태의 IL-22를 포함한다. 예를 들어, N-말단 리더 서열을 함유하는 전장 IL-22 및 성숙 형태 IL-22 둘 다는 본 발명에 포함된다. 리더 서열(또는 신호 펩티드)은 내인성 IL-22 리더 서열 또는 또 다른 포유동물 비서 단백질의 외인성 리더 서열일 수 있다. 특정한 구현예에서, 리더 서열은 진핵생물 또는 원핵생물 비서 단백질로부터의 것일 수 있다. 용어는 또한 IL-22의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다. 예시적인 인간 IL-22의 아미노산 서열은 서열번호: 4(신호 펩티드가 없는 성숙 형태)에 제시되어 있다. 특정한 구현예에서, 내인성 리더 서열을 갖는 전장 IL-22 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 71에 제공되어 있는 반면; 다른 구현예에서, 외인성 리더 서열을 갖는 성숙 IL-22 단백질의 아미노산 서열은 서열번호: 2에 제공되어 있다. IL-22의 기능 및/또는 활성(예를 들어, IL-22 수용체에 대한 결합)에 영향을 미치지 않는 IL-22의 사소한 서열 변이, 특히 보존적 아미노산 치환이 또한 본 발명에 의해 고려된다. 도 19는 여러 예시적인 포유동물 종으로부터의 성숙 IL-22의 아미노산 서열 정렬을 제시한다. 별표는 IL-22의 기능 및/또는 활성에 중요할 수 있는 종에 걸쳐 고도로 보존된 아미노산 잔기를 나타낸다. 따라서, 특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 4와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 폴리펩티드를 포함한다. 특정한 다른 구현예에서, IL-22 단백질은 서열번호: 71과 95% 이상 서열 동일성, 서열번호: 71과 96% 이상 서열 동일성, 서열번호: 71과 97% 이상 서열 동일성; 서열번호: 71과 98% 이상 서열 동일성; 또는 서열번호: 71과 99% 이상 서열 동일성을 갖는다. 본원에 기재된 IL-22 폴리펩티드는 다양한 공급원, 예컨대 인간 조직 또는 또 다른 공급원으로부터 단리될 수 있거나, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "IL-22 수용체" 또는 "IL-22R"는 IL-22R1 및 IL-10R2 또는 이의 자연 발생 대립유전자 변이체로 이루어진 이종이량체를 지칭한다. 예를 들어, Ouyang et al., 2011, Annu. Rev. Immunol. 29:159-63 참조. IL-10R2는 많은 세포 유형에 의해 보편적으로 발현되고, IL-22R1은 상피 세포, 간세포 및 각질세포와 같은 선천적 세포에서만 발현된다. IL-22R1은 또한 IL-22Ra1 또는 IL-22Rα1로도 알려져 있다. IL-22R1은 다른 폴리펩티드와 쌍을 이루어 다른 IL-10 패밀리 구성원, 예를 들어 IL-20 또는 IL-24에 대한 이종이량체성 수용체를 형성할 수 있다. 예를 들어, 상기 Ouyang et al., 2011 참조. 예시적인 IL-22R1 폴리펩티드의 전장 아미노산 서열은 서열번호: 81에 제시되어 있다. IL-22R1의 이 전장 서열은 최종 기능성 분자에서 절단되는 N-말단 신호 서열(아미노산 1-15)(서열번호: 82에 제시되어 있는 예시적인 아미노산 서열)을 포함한다. 예시적인 IL10R2 폴리펩티드의 전장 아미노산 서열은 서열번호: 83에 제시되어 있다. IL10R2의 이 전장 서열은 최종 기능성 분자에서 절단되는 N-말단 신호 서열(아미노산 1-19)(서열번호: 84에 제시되어 있는 예시적인 아미노산 서열)을 포함한다.
"천연 서열 IL-22 폴리펩티드" 또는 "천연 서열 IL-22R 폴리펩티드"는 자연으로부터 유래되는 상응하는 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 천연 서열 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드는 자연으로부터 단리될 수 있거나 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수 있다. 용어는 구체적으로 특이적 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드의 자연-발생 절두 또는 분비된 형태(예를 들어, 연관된 신호 펩티드가 없는 IL-22), 자연-발생 변이체 형태(예를 들어, 대안적으로 스플라이싱된 형태), 및 폴리펩티드의 자연-발생 대립유전자 변이체를 포함한다. 본 발명의 다양한 구현예에서, 본원에 개시된 천연 서열 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 예시적인 전장 천연 인간 IL-22는 서열번호: 70(DNA) 및 서열번호: 71(단백질)에 제시되어 있다. IL-22 및 IL-22R 폴리펩티드 서열은 아미노산 위치 1로서 지정된 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 본원에 제시되어 있지만, 아미노산 위치 1로부터 상류 또는 하류에 위치한 다른 메티오닌 잔기가 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드에 대한 시작 아미노산 잔기로서 이용될 수 있다는 것을 상상할 수 있고 가능하다.
"IL-22 변이체", "IL-22R 변이체", "IL-22 변이체 폴리펩티드", 또는 "IL-22R 변이체 폴리펩티드"는 전장 천연 서열 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 상기 정의된 바와 같은 활성 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드 변이체는 전장 또는 성숙 천연 서열 IL-22 또는 IL-22R 폴리펩티드 서열과 적어도 약 80% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 81% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 82% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 83% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 84% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 85% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 86% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 87% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 88% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 89% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 90% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 91% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 92% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 93% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 94% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 95% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 96% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 97% 아미노산 서열 동일성, 대안적으로 적어도 약 98% 아미노산 서열 동일성, 및 대안적으로 적어도 약 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.
용어 "Fc 영역", "Fc 도메인", 또는 "Fc"는 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 비-항원 결합 영역을 지칭한다. 상기 용어는 천연 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다.　 특정한 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226에서 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다.　　그러나, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447)은 Fc 영역의 구조 또는 안정성에 영향을 미치지 않으면서 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에 달리 명시되지 않는 한, IgG 또는 Fc 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에 기재된 바와 같이, EU 지수로도 불리는 항체에 대한 EU 넘버링 시스템에 따른다.
특정한 구현예에서, Fc 영역은 힌지 영역(Cys226에서 시작), IgG CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 IgG 중쇄 불변 영역을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "힌지 영역" 또는 "힌지 서열"은 링커 및 CH2 도메인 사이에 위치한 아미노산 서열을 지칭한다. 특정한 구현예에서, 힌지 영역은 아미노산 서열 CPPCP(서열번호: 31)를 포함한다. 특정한 구현예에서, IL-22 IgG4 Fc 융합 단백질에 대한 힌지 영역은 이량체화를 용이하게 하기 위해 천연 IgG1 힌지 영역에서 발견되는 서열인 CPPCP 서열(서열번호: 31)을 포함한다. 특정한 다른 구현예에서, Fc 영역은 힌지 영역에서 출발하고 IgG 중쇄의 C-말단까지 연장된다. 특정한 특정 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc 영역을 포함한다. 특정한 특정 구현예에서, Fc 영역은 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정 다른 특정한 구현예에서, Fc 영역은 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
특정한 구현예에서, IgG CH2 도메인은 Ala 231에서 시작한다. 특정한 다른 구현예에서, CH3 도메인은 Gly 341에서 시작한다. 인간 IgG의 C-말단 Lys 잔기는 임의적으로 부재할 수 있는 것으로 이해된다. 또한 Fc 영역의 보존적 아미노산 치환은 Fc의 바람직한 구조 및/또는 안정성에 영향을 미치지 않으면서 본 발명의 범위 내에서 고려되는 것으로 이해된다.
특정한 구현예에서, IL-22는 링커를 통해 Fc 영역에 연결된다. 특정한 특정 구현예에서, 링커는 본원에 기재된 바와 같이 IL-22의 C-말단을 Fc 영역에 연결하는 펩티드이다. 특정한 구현예에서, 천연 IgG 서열은 링커 및/또는 힌지 영역에 존재하여 면역원성의 위험을 최소화하고/하거나 피한다. 다른 구현예에서, 사소한 서열 변이는 제조를 용이하게 하기 위해 천연 서열에 도입될 수 있다. 높은 활성을 나타내는(예를 들어, 루시퍼라제 검정에 의해 측정시) 외인성 링커 또는 힌지 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 작제물이 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 특정한 구현예에서, 링커는 8-20개 아미노산, 8-16, 8-15, 8-14, 8-13, 8-12, 8-11, 8-10, 8-9, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 11-16, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 또는 16개 아미노산 길이인 아미노산 서열을 포함한다. 특정한 다른 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 DKTHT(서열번호: 32)를 포함한다. 특정한 특정 구현예에서, 링커는 서열 Gly-Gly-Ser(서열번호: 45), Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호: 46), 또는 Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(서열번호: 47)을 포함하지 않는다.
특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "에 연결된" 또는 "에 융합된"은 2개의 모이어티 사이에 형성된 공유 결합, 예를 들어, 펩티드 결합을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "글리코실화" 및 "글리코실화된"은 생물학적 분자(예를 들어, 단백질 또는 지질)에 부착된 탄수화물(예를 들어, 올리고사카라이드 또는 폴리사카라이드, 또한 "글리칸"으로도 지칭됨)의 존재를 지칭한다. 특정 구현예에서, 글리코실화는 단백질(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질) 또는 관심 단백질의 일부(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 IL-22 폴리펩티드 모이어티)에 부착된 글리칸(예를 들어, N-글리칸)의 존재를 지칭한다. N-연결된 글리코실화는 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 모이어티의 부착을 지칭한다. X가 프롤린을 제외한 임의의 아미노산인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌인 트리펩티드 서열은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 모이어티의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 O-연결된 글리코실화에 수반될 수 있지만, O-연결된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 가장 흔히 세린 또는 트레오닌에 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스, 또는 크실로스 중 하나의 부착을 지칭한다. 글리코실화의 검토를 위해, 예를 들어, Varki et al., Essentials of Glycobiology, 3 rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2015-2017 참조.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "비글리코실화된" 및 "글리코실화되지 않은"은 글리코실화되지 않은(예를 들어, N-글리코실화되지 않은) 단백질 또는 관심 단백질의 일부(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역)를 지칭한다. 일부 구현예에서, 관심 단백질의 일부(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질)는 글리코실화되지만(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 IL-22 폴리펩티드 부분), 관심 단백질의 또다른 부분은 글리코실화되지 않은 것(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역)으로 이해되어야 한다.
일부 구현예에서, 본원에는 Fc 영역 또는 CH2 도메인이 글리코실화되지 않은 IL-22 Fc 융합 단백질이 제공된다. 특정한 구현예에서, CH2 도메인 내 N-글리코실화 부위는 글리코실화를 방지하기 위해 돌연변이된다. 예를 들어, 비글리코실화된 Fc 영역을 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질은 Fc 영역의 CH2 도메인 내 EU 지수(예를 들어, N297)에서와 같이 위치 297에서 아미노산 잔기를 돌연변이화함으로써 제조될 수 있다(또한 잔기 N81로도 지칭됨, 예를 들어, 도 1c 참조). 특정한 구현예에서, Fc 영역의 CH2 도메인 내 글리코실화는 글리코실화 공통 부위, 즉, 위치 297에서 Asn 이어서 임의의 아미노산 잔기(인간 IgG의 경우, Ser) 및 Thr을 변경시킴으로써 제거될 수 있다. 글리코실화 부위는 아미노산 삽입, 결실, 및/또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기는 Asn 및 Ser 사이 또는 Ser 및 Thr 사이에 삽입되어 원래의 글리코실화 부위를 변경시킬 수 있으며, 여기서 삽입은 N-글리코실화 부위를 재생하지 않는다. 특정한 특정 구현예에서, 인간 IgG Fc의 CH2 도메인 내에서 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기(예를 들어, Fc에서 N-글리코실화된 부위)는 돌연변이되어 글리코실화 부위를 파괴한다. 특정한 특정 구현예에서, EU 지수(예를 들어, N297)에서와 같이 위치 297에서 아미노산 잔기는 Gly, Ala, Gln, Asp, 또는 Glu로 변경된다. 일부 특정 구현예에서, EU 지수(예를 들어, N297)에서와 같이 위치 297에서 아미노산 잔기는 Gly 또는 Ala로 변경된다. 다른 특정 구현예에서, EU 지수(예를 들어, N297)에서와 같이 위치 297에서 아미노산 잔기는 Gly로 변경된다. 특정한 다른 구현예에서, EU 지수와 같이 위치 299에서 아미노산 잔기는 또 다른 아미노산, 예를 들어, Ala, Val, 또는 Gly으로 치환될 수 있다. 특정한 특정 구현예에서, 비글리코실화된 Fc를 초래하는 돌연변이는 IL-22 Fc 융합 단백질의 구조 및/또는 안정성에 영향을 미치지 않는다.
특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 CH2 도메인 내 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기가 돌연변이된 Fc 영역을 포함한다. 특정한 구현예에서, EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 Gly 또는 Ala, 바람직하게는 Gly로 변경된다. 특정한 다른 구현예에서, EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 결실된다. 특정한 구현예에서, EU 지수에서의 위치 297에서의 아미노산 잔기에서 아미노산 치환을 갖는 Fc를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질은 비글리코실화되거나 또는 글리코실화되지 않는다.
다른 구현예에서, EU 지수(예를 들어, N297)에서의 위치 297에서 야생형 아미노산 잔기에 부착된 N-글리칸은 효소적으로, 예를 들어, 탈글리코실화에 의해 제거될 수 있다. 적합한 글리콜 효소는 비제한적으로, 펩티드-N-글리코시다제(PNGase)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "글리코실화 점유"는 단백질이 특정한 글리코실화 부위(예를 들어, 공통 글리코실화 부위의 Asn 잔기)에서 글리코실화될 확률 또는 특정한 글리코실화 부위에서 글리코실화된 단백질 집단에서 단백질의 백분율을 지칭한다. 예를 들어, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및/또는 Asn143 상에서 글리코실화될 수 있다. 추가의 구체적 예에서, (a) 잔기 Asn21에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 70 내지 90 범위일 수 있고/있거나; (b) 잔기 Asn35에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 90 내지 100 범위일 수 있고/있거나; (c) 잔기 Asn64에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 90 내지 100 범위일 수 있고/있거나; (d) 잔기 Asn143에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 25 내지 35 범위일 수 있다.
용어 "시알릴화" 및 "시알릴화된"은 특히 단백질에 부착된 글리칸(예를 들어, N-글리칸) 쇄의 성분으로서, 단백질 또는 관심 단백질의 일부 상에서 시알산의 존재를 지칭한다. 시알산(또한 본원에서 "시알산 모이어티"로도 지칭됨)은 일반적으로 뉴라민산의 N- 또는 O-치환된 유도체를 지칭한다. N-아세틸뉴라민산(5-아세트아미도-2-케토-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-갈락토논산; 또한 NANA 또는 Neu5Ac로도 알려짐)은 포유동물에서 가장 흔한 시알산이다. 다른 예시적인 시알산은, 비제한적으로, 2-케토-3-데옥시-D-글리세로-D-갈락토논산(또한 Kdn으로도 알려짐), N-글리콜릴뉴라민산(또한 Neu5Gc 또는 NGNA로도 알려짐), 뉴라민산(또한 Neu로도 알려짐), 및 2-데옥시-2,3-디데하이드로-Neu5Ac(또한 Neu2en5Ac)로도 알려짐)를 포함한다. 유리 시알산(Sia)은 뉴클레오티드 공여체 CMP-Sia 상에서 활성화 후 글리칸 합성에 사용될 수 있다. 진핵생물의 골지 시스템에서 새로이 합성된 글리코접합체(예를 들어, 당단백질) 위에 CMP-Sia에서 Sia의 이동은 결합-특이적 시알릴-트랜스퍼라제(ST)의 패밀리에 의해 촉매화된다. 시알산은 전형적으로 글리칸(예를 들어, N-글리칸) 분지의 종결 잔기이다. 일부 구현예에서, 시알산은 가장 흔히 1개의 시알산 잔기가 또 다른 시알산 잔기에 부착될 때, 글리칸 내에서 내부 위치를 점유할 수 있다. 시알릴화 및 시알산의 검토를 위해, 예를 들어, Varki et al., Essentials of Glycobiology, 3 rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2015-2017의 챕터 15 참조.
용어 "시알산 함량"은 글리코실화된 단백질(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질) 또는 관심 단백질의 일부의 시알릴화 수준 또는 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 4 내지 약 16 몰(예를 들어, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 또는 약 16 몰)의 시알산의 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8, 9, 10, 11, 또는 12 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는다.
본 발명에 따른 IL-22 Fc 융합 단백질을 함유하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물 또는 배치)에 대해 용어 "평균 시알산 함량"은 조성물 중 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 조성물 중 시알산의 총 몰 수를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 이러한 조성물은 다양한 수준의 시알릴화(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 0-25 몰의 시알산 범위에서)를 갖는 조성물 내에서 개별 IL-22 Fc 융합 단백질과 함께 IL-22 Fc 융합 단백질의 이종 풀을 함유할 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 평균 시알산 함량을 포함하는 본원에 기재된 시알한 함량에 대한 모든 값은 이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "배치"는 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질 또는 이의 조성물을 포함하는 일련의 생산 공정의 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 이의 조성물의 배치를 생성하는데 사용될 수 있다. 상기 배치는 본원에 기재된 방법에 따라, 예를 들어, 배치의 평균 시알산 함량을 평가함으로써 방출을 위해(즉, 분포 또는 판매를 위해) 선택될 수 있다.
용어 "비푸코실화", "비푸코실화된", "탈푸코실화", 또는 "탈푸코실화된"은 N-글리칸, 예를 들어, 단백질(예를 들어, IL-22 폴리펩티드) 또는 단백질의 일부(예를 들어, Fc의 CH2 도메인)에 부착된 N-글리칸으로부터 코어-푸코스의 부재 또는 제거를 지칭한다.
용어 "이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질"은 각각의 단량체가 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 이량체를 지칭한다. 용어 "단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질"은 하나의 단량체가 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하지만(IL-22 Fc 아암), 다른 단량체가 IL-22 폴리펩티드가 없는 Fc 영역을 포함하는(Fc 아암) 이량체를 지칭한다. 따라서, 이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22R 결합에 대해 2가인 반면, 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22R 결합에 대해 1가이다. 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질의 이종이량체화는 비제한적으로, 놉-인투-홀(knob-into-hole) 기술에 의한 이종이량체화를 포함하는 당업계에 알려진 방법에 의해 용이하게 될 수 있다. 놉-인투-홀 기술의 구조 및 어셈블리 방법은, 예를 들어, US5,821,333, US7,642,228, US 2011/0287009, 및 PCT/US2012/059810에서 찾을 수 있으며, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 이 기술은 하나의 Fc의 CH3 도메인에서 작은 아미노산 잔기를 큰 아미노산 잔기로 대체함으로써 "놉"(또는 돌출부)을 도입하고, 하나 이상의 큰 아미노산 잔기를 작은 아미노산 잔기로 대체함으로써 다른 Fc의 CH3 도메인에서 "홀"(또는 공동)을 도입함으로써 개발되었다. 특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 아암은 놉을 포함하고, Fc 단독 아암은 홀을 포함한다.
놉의 형성을 위한 바람직한 잔기는 일반적으로 자연 발생 아미노산 잔기이고 바람직하게는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 및 트립토판(W)으로부터 선택된다. 트립토판 및 티로신이 가장 바람직하다. 일 구현예에서, 놉의 형성을 위한 원래의 잔기는 작은 측쇄 부피, 예컨대 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글리신, 세린, 트레오닌 또는 발린을 갖는다. 놉을 형성하기 위한 CH3 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 비제한적으로 T366W, T366Y, 또는 F405W 치환을 포함한다.
홀의 형성을 위한 바람직한 잔기는 일반적으로 자연 발생 아미노산 잔기이고 바람직하게는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 및 발린(V)으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 홀의 형성을 위한 원래의 잔기는 큰 측쇄 부피, 예컨대 티로신, 아르기닌, 페닐알라닌, 또는 트립토판을 갖는다. 홀을 생성하기 위한 CH3 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 비제한적으로 T366S, L368A, F405A, Y407A, Y407T, 및 Y407V 치환을 포함한다. 특정한 구현예에서, 놉은 T366W 치환을 포함하고, 홀은 T366S/L368A/Y407V 치환을 포함한다. 특정한 특정 구현예에서, 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 IgG1 Fc 영역을 포함한다. 특정한 특정 구현예에서, 단량체성 IL-22 IgG1 Fc 융합은 IL-22 Fc 놉 아암 및 Fc 홀 아암을 포함한다. 특정한 구현예에서, IL-22 Fc 놉 아암은 T366W 치환(서열번호: 61)을 포함하고, Fc 홀 아암은 T366S, L368A, 및 Y407V(서열번호: 62)를 포함한다. 특정한 다른 구현예에서, 두 아암의 Fc 영역은 N297G 또는 N297A 돌연변이를 추가로 포함한다. 특정한 구현예에서, 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질은 이. 콜라이(E. coli) 세포에서 발현된다. 이종이량체화를 용이하게 하는 당업계에 알려진 Fc 영역에 대한 다른 변형이 또한 본 출원에 의해 고려되고 포함되는 것으로 이해된다.
용어 "상처"는 손상, 특히 피부 또는 또 다른 외부 표면이 찢어지거나, 뚫려 있거나, 절단되거나 또는 달리 절개되어 있는 손상을 지칭한다.
용어 "궤양"은 종종 고름 형성, 조직 사멸을 특징으로 하고, 염증 반응을 빈번하게 동반하는 피부 또는 점막에 대한 손상 부위이다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "장내" 또는 "장"은 소장 및 대장을 광범위하게 포함한다.
용어 "상처 치유를 가속화" 또는 "상처 치유의 가속화"는 치유 속도의 증가, 예를 들어 상처 봉합이 완료될 때까지의 시간 감소 또는 상처 부위의 퍼센트(%)가 감소될 때까지의 시간 감소를 지칭한다.
"당뇨병성 상처"는 당뇨병과 연관된 상처이다.
"당뇨병성 궤양"은 당뇨병과 연관된 궤양이다.
"만성 상처"는 치유되지 않은 상처를 지칭한다. 예를 들어, Lazarus et al., Definitions and guidelines for assessment of wounds and evaluation of healing, Arch. Dermatol. 130:489-93(1994) 참조. 만성 상처는 예를 들어, 동맥성 궤양, 당뇨병성 궤양, 압박 궤양 또는 욕창, 정맥성 궤양 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 급성 상처는 만성 상처로 발전할 수 있다. 급성 상처는, 예를 들어, 열 손상(예를 들어, 화상), 외상, 수술, 광범위한 피부암의 절제, 진균 및 박테리아 감염, 혈관염, 경피증, 수포창, 독성 표피 괴사 등에 의해 야기된 상처를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 따라서, 특정한 구현예에서, 만성 상처는 감염된 상처이다. "정상 상처"는 정상 상처 치유 회복을 겪은 상처를 지칭한다. "친화성"은 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 리간드 또는 항체) 및 이의 결합 파트너(예를 들어, 수용체 또는 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화성"은 결합 쌍(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질 및 IL-22 수용체)의 구성원 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수(KD)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것들을 포함하여 당업계에 알려진 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 구체적 예시 및 예시적인 구현예는 하기에 기재되어 있다.
IL-22 Fc 융합 단백질에 대해 본원에 사용된 용어 "효능"은 IL-22R(예를 들어, IL-22-R1a, 또는 이의 일부, 예를 들어, 세포외 도메인)에 결합하고/하거나 하류 IL-22R 신호전달(예를 들어, STAT3 신호전달)을 활성화하는 IL-22 Fc 융합 단백질의 능력을 지칭한다. 일부 구현예에서, 효능은 예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같이 수용체 결합 검정 또는 세포-기반 결합 검정에서 평가된다. 일부 구현예에서, 효능은 예를 들어, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 생체내 검정을 사용하여 평가된다. 일부 구현예에서, 효능은 참조 IL-22 Fc 융합 단백질, 예를 들어, 표 12 및/또는 표 13에 제시된 N-글리칸 분포를 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질과 비교된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고 바람직한 항원-결합 활성을 나타내는 한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 항원 구조를 포함한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단쇄 항체 분자(예를 들어, scFv), 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
항체의 "클래스"는 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 클래스가 있으며: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 이들 중 몇몇은 하위클래스(이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나눠질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, β, ε, γ, 및 μ로 불린다.
"이펙터 기능" 또는 "이펙터 활성"은 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하며, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화. 특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 임의의 이펙터 기능 또는 임의의 검출가능한 이펙터 기능을 나타내지 않는다. 특정한 다른 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 실질적으로 감소된 이펙터 기능, 예를 들어, 약 50%, 60%, 70% 80%, 또는 90% 감소된 이펙터 기능을 나타낸다.
제제, 예를 들어, 약제학적 제형의 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 바람직한 치료적 또는 예방적 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
예를 들어, 심혈관 질환 또는 상태의 경우, 치료 유효량의 IL-22 Fc 융합 단백질은 죽상경화 플라크 형성 정도를 감소시키고/시키거나; 죽상경화 플라크(들)의 크기를 감소시키고/시키거나; 죽상경화 플라크를 억제(즉, 어느 정도 둔화시키고 바람직하게는 정지시킴)하고/하거나; 혈전증 또는 죽상경화 플라크의 파열을 억제(즉, 어느 정도 둔화시키고 바람직하게는 정지시킴)하고/하거나; 질환 또는 상태와 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 완화시킬 수 있다.
"감소시키다 또는 억제하다"란 바람직하게는 20% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 75%, 85%, 90%, 95% 이상의 전반적인 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 감소시키다 또는 억제하다는 치료되는 장애의 증상, 죽상경화 플라크의 존재 또는 크기, 또는 죽상경화 플라크(들)의 수를 지칭할 수 있다.
"차선량(suboptimal amount)"은 특정 치료에 전형적으로 사용되는 치료제의 최적량 보다 적은 양을 지칭한다. 2개의 치료제가 동시에 또는 순차적으로 대상체에 주어질 때, 각각의 치료제는 각각의 치료제가 단독으로 주어질 때의 치료와 비교하여 차선량으로 주어질 수 있다. 예를 들어, 특정한 구현예에서, IBD 치료를 필요로 하는 대상체는 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질 및 덱사메타손을 차선량으로 포함하는 약제학적 조성물로 투여받는다.
용어 "전장 항체", "온전한 항체", 및 "전체 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되며 이러한 세포의 자손을 포함하는 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대 수와 상관없이 그들로부터 유래된 자손을 포함한다. 형질전환된 세포는 일시적으로 또는 안정되게 형질전환된 세포를 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다. 특정한 구현예에서, 숙주 세포는 외인성 핵산으로 일시적으로 형질감염된다. 특정한 다른 구현예에서, 숙주 세포는 외인성 핵산으로 안정되게 형질감염된다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체 또는 항체의 단편이다.
"개체", "대상체", 또는 "환자"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류(예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정한 구현예에서, 개체, 대상체 또는 환자는 인간이다.
"단리된" IL-22 Fc 융합 단백질은 융합 단백질을 재조합적으로 생성하는 숙주 세포의 환경으로부터 분리된 것이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 예를 들어, 전기영동(예를 들어, SDS-PAGE, 등전점 전기영동(IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피(예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 접근법에 의해 결정시 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과 순도로 정제된다.
"단리된" 핵산은 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 통상적으로 핵산 분자를 함유하는 세포에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외로 또는 그의 자연적 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
용어 "IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산"은 단일 벡터 또는 별도의 벡터에서 이러한 핵산 분자(들), 숙주 세포 내로 일시적으로 또는 안정되게 형질감염된 이러한 핵산 분자(들), 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들)를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭한다.
용어 "제어 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은 예를 들어, 프로모터, 임의적으로 작동자 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 및 인핸서를 활용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "작동가능하게 연결된"다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더를 위한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우 폴리펩티드를 위한 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하기 위해 위치하는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접하고, 분비 리더의 경우 인접하고 판독 단계에 있음을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접할 필요는 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 관례에 따라 사용된다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 상기 집단을 포함하는 개별 항체는 동일하고/하거나, 예를 들어, 자연 발생 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체를 제외하고, 동일한 에피토프에 결합하며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자(에피토프)에 대하여 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대하여 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 동종 집단으로부터 수득되는 것으로서 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의해 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한다.　 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 면역글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 유전자이식 동물을 활용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 기술로 제조될 수 있으며, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재되어 있다.　
"천연 항체"는 다양한 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VH), 이어서 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 불리는 가변 영역(VL), 이어서 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은, 비제한적으로, 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역(비-A 및 A 동종형); 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역; 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역; 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역, 뿐만 아니라 이의 자연 발생 변이체를 포함한다.
"변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형, 바람직하게는 하나 이상의 아미노산 치환(들)에 의해 천연 서열 Fc 영역의 것과 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역에서 약 1 내지 약 10개의 아미노산 치환, 바람직하게는 약 1 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 80% 상동성, 가장 바람직하게는 이와 적어도 약 90% 상동성, 보다 바람직하게는 이와 적어도 약 95% 상동성을 보유할 것이다. 특정한 구현예에서, 변이체 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 "장애", "질환", 또는 "병태"는 본원에 기재된 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물), 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)로의 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 병태이다. 이는 포유동물이 해당 장애에 취약하게 되는 병리학적 병태를 포함하는 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 일부 구현예에서, 장애는 IL-22 연관된 장애이다. 예시적인 장애는 IBD(예를 들어, UC 또는 크론병), 세균 감염, 급성 신부전, 급성 췌장염, 상처, 심혈관 병태, 대사 증후군, 급성 내독소혈증, 및 패혈증을 포함하나 이제 제한되지 않는다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "염증성 장 장애", "염증성 장 질환", 및 "IBD"는 가장 넓은 의미로 본원에 사용되고 발병기전이 소장 및 결장을 포함하는 장내에서 재발성 염증을 수반하는 모든 질환 및 병리학적 병태를 포함한다. IBD는 예를 들어, 궤양성 대장염 및 크론병을 포함한다. IBD는 UC 및 CD로 제한되지 않는다. 질환의 징후는 염증 및 장내 상피 완전성의 감소를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
용어 "심혈관 질환" 또는 "심혈관 장애"는 가장 넓은 의미로 본원에 사용되고 발병기전이 예를 들어, 죽상경화 플라크 형성(안정한 또는 불안정한/취약한 플라크 포함), 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 세동맥경화증, 및 상승된 전신성 리포폴리사카라이드(LPS) 노출과 같은 혈관의 이상을 수반하는 모든 질환 및 병리학적 병태를 포함한다. 용어는 추가적으로 죽상경화 플라크 형성의 억제로부터 이익을 얻는 질환 및 병리학적 병태를 포함한다. 심혈관 질환은, 비제한적으로, 관상 동맥 죽상동맥경화증, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 허혈, 관상 동맥 질환(CAD), 급성 관상 동맥 증후군(ACS), 관상 동맥 심장 질환(CHD), CAD 및 CHD와 연관된 상태, 뇌혈관 질환, 말초 혈관 질환, 동맥류, 혈관염, 정맥 혈전증, 진성 당뇨병, 대사 증후군만성 신장 질환, 허혈 및 재관류, 및 심폐 우회술 후 원격 조직 손상을 포함한다. 구체적으로 죽상경화 플라크 형성의 억제에 의해 제어될 수 있는 발생, 발달, 또는 진행과 연관된 모든 심혈관 질환이 이 그룹 내에 포함된다.
용어 "심혈관 병태"는 가장 넓은 의미로 본원에 사용되고 병리가 죽상경화 플라크 형성(안정한 또는 불안정한/취약한 플라크 포함), 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 세동맥경화증, 및 상승된 전신성 리포폴리사카라이드(LPS) 노출을 수반하는 모든 심혈관 병태 및 질환을 포함한다. 구체적으로 죽상경화 플라크 형성, 죽상경화 플라크 형성의 억제에 의해 제어될 수 있는 발생, 발달, 또는 진행과 연관된 모든 심혈관 병태 및 질환이 이 그룹 내에 포함된다. 상기 용어는 구체적으로 죽상경화 플라크 형성의 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 질환 및 병리학적 병태를 포함한다. 심혈관 병태는, 비제한적으로, 관상 동맥 죽상동맥경화증, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 허혈, 관상 동맥 질환(CAD), 관상 동맥 심장 질환(CHD), CAD 및 CHD와 연관된 상태, 뇌혈관 질환 및 뇌혈관 질환과 연관된 병태, 말초 혈관 질환 및 말초 혈관 질환과 연관된 병태, 동맥류, 혈관염, 정맥 혈전증, 진성 당뇨병, 대사 증후군만성 신장 질환, 허혈 및 재관류, 및 심폐 우회술 후 원격 조직 손상을 포함한다. 본원에 사용된 "뇌혈관 질환과 연관된 병태"는, 예를 들어, 일과성 허혈 발작(TIA) 및 뇌졸중을 포함한다. 본원에 사용된 "말초 혈관 질환과 연관된 병태"는, 예를 들어, 파행증을 포함한다. 구체적으로 죽상경화 플라크 형성의 억제에 의해 제어될 수 있는 발생, 발달, 또는 진행과 연관된 모든 심혈관 질환 및 상태가 이 그룹 내에 포함된다.
죽상경화 플라크 형성은 대사성 내독소혈증에 대한 선천적 면역 반응의 결과로서 발생할 수 있으며, 이는 장 미생물총으로부터 유래하는 상승된 수준의 전신성 리포폴리사카라이드(LPS) 및 장 점막 장벽에서 기능적 완전성의 상실을 특징으로 한다. 내독소혈증에 대한 선천적 면역 반응은 플라크 형성에 기여하는 저급 만성 염증을 초래한다.
용어 "대사 증후군"은 가장 넓은 의미로 본원에 사용된다. 대사 증후군은 다음 5가지 특성 중 적어도 3가지를 포함하는 여러 대사성 위험 요인이 성인 대상체에서 동시 발생함을 포함한다: 예를 들어, 남성에서 90 cm 이상 및 여성에서 80 cm 이상의 허리 둘레일 수 있는 복부 비만; 예를 들어, 150 mg/dL 이상일 수 있는 상승된 혈청 트리글리세리드, 또는 상승된 트리글리세리드에 대한 약물 치료; 예를 들어, 남성에서 40 mg/dL 미만 및 여성에서 50 mg/dL 미만일 수 있는 감소된 혈청 HDL 콜레스테롤 수준, 또는 낮은 HDL 콜레스테롤에 대한 약물 치료; 예를 들어, 130 mmHg 초과의 수축기 혈압 및 85 mmHg 초과의 확장기 혈압일 수 있는 고혈압, 또는 고혈압에 대한 약물 치료; 및 예를 들어, 100 mg/dL 이상일 수 있는 상승된 공복 혈장 글루코스, 상승된 글루코스에 대한 약물 치료, 또는 이전에 진단된 2형 당뇨병.
16세 이상 어린이의 경우, 상기 성인 기준이 사용될 수 있다. 10-16세 사이의 어린이의 경우, 대사 증후군은 다음 5가지 특성 중 적어도 3가지를 포함하는 여러 대사성 위험 요인이 대상체에서 동시 발생하는 것을 포함한다: 예를 들어, 90번째 백분위수 초과인 허리 둘레일 수 있는 복부 비만; 예를 들어, 110 mg/dL 이상, 95번째 백분위수 초과일 수 있는 상승된 혈청 트리글리세리드, 또는 상승된 트리글리세리드에 대한 약물 치료; 예를 들어, 40 mg/dL 미만, 5번째 백분위수 미만일 수 있는 감소된 혈청 HDL 콜레스테롤 수준, 또는 낮은 HDL 콜레스테롤에 대한 약물 치료; 예를 들어, 130 mmHg 초과의 수축기 혈압 및 85 mmHg 초과의 확장기 혈압, 90번째 백분위수 초과일 수 있는 고혈압, 또는 고혈압에 대한 약물 치료; 및 예를 들어, 100 mg/dL이상일 수 있는 상승된 공복 혈장 글루코스, 손상된 글루코스 내성, 상승된 글루코스에 대한 약물 치료, 또는 이전에 진단된 2형 당뇨병.
일반적으로 말하면, 대사 증후군에서 동시 발생하는 위험 요인은 비만(예컨대 복부 비만), 고혈당증, 이상지질혈증, 인슐린 내성, 및/또는 고혈압을 포함한다. 모든 이러한 위험 요인은 죽상경화 심혈관 질환, 당뇨병, 또는 둘 다의 발생을 촉진시킨다. 대사 증후군은 또한 만성 지방 조직 염증을 특성으로 할 수 있다.
대사 증후군은 전염증성, 프로트롬빈성 상태로 인식될 수 있고, C-반응성 단백질, IL-6, LPS, 및 플라스미노겐 활성인자 억제제 1 중 하나 이상의 상승된 수준과 연관될 수 있으며; 이러한 마커는 죽상경화 심혈관 질환, 당뇨병, 또는 둘 다의 후속 발달에 대한 증가된 위험과 연관될 수 있다.
대사 증후군은 지방증, 섬유증, 및 간경변이 있는 지방간 질환, 간세포 및 간내 담관암종, 만성 신장 질환, 다낭성 난소 증후군, 폐쇄성 수면 무호흡을 포함하는 수면 관련 호흡장애, 및 요산과다혈증 및 통풍 중 하나 이상을 포함하는 여러 비만-관련 장애와 연관될 수 있다.
용어 "인슐린-관련 장애"는 손상된 글루코스 내성을 특징으로 하는 질환 또는 상태를 포함한다. 일 구현예에서, 인슐린-관련 장애는 비제한적으로, I형(인슐린-의존성 진성 당뇨병 또는 IDDM), II형(비-인슐린 의존성 진성 당뇨병 또는 NIDDM) 당뇨병을 포함하는 진성 당뇨병, 임신성 당뇨병, 및 인슐린 분비를 자극하는 제제에 의해 이익을 얻을 수 있는 임의의 다른 장애이다. 또 다른 구현예에서, 인슐린-관련 장애는 인슐린 내성을 특징으로 한다.
용어 "패혈증"은 가장 넓은 의미로 본원에 사용되고 중증 감염에 의해 야기된 전신성 염증 상태를 포함할 수 있다. 패혈증은 혈액, 요로관, 폐, 피부, 또는 다른 조직에서 심각한 감염, 가장 흔히 박테리아, 뿐만 아니라 진균, 바이러스, 및 기생충에 대한 면역계의 반응에 의해 야기될 수 있다.
용어 "급성 내독소혈증"은 가장 넓은 의미로 본원에 사용되고 증가된 혈장 박테리아 리포폴리사카라이드(LPS)의 상태를 포함할 수 있다. 급성 내독소혈증은 결국 패혈증을 초래할 수 있다. 전신 순환에서 증가된 LPS는 저급 만성 염증을 유도하여, 만성 상태에서 식이 유도된 비만, 인슐린 내성 및 죽상동맥경화증, 및 궁극적인 CVD 사건에 기여하는 혈장 지질을 상승시키기 위한 내인성 보호 숙주 반응을 활성화시킬 것이다.
용어 "이식편대숙주병(GVHD)"은 동종이계 줄기 세포 이식의 합병증을 지칭한다. GVHD에서, 공여자 조혈 줄기 세포는 이식 수령자를 외부물질로 인식하여 환자의 조직 및 기관을 공격하며, 조직 또는 기관의 기능을 손상시키거나 또는 장애를 유발할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, GVHD는 예를 들어, 급성 GVHD 또는 만성 GVHD를 포함한다. 또한, 비제한적인 예는 장내 GVHD를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"(및 이의 문법적 변이 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체의 자연 과정을 변경하려는 시도에서 임상 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 동안 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과는 질환 발생 또는 재발 방지, 증상 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과 감소, 전이 예방, 질환 진행률 감소, 질환 상태 개선 또는 경감, 및 차도 또는 예후 개선을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, IBD에 대해, "치료"는 IBD 발생 가능성 감소, IBD 발생률 감소, 및 질환 중증도 감소를 지칭할 수 있다. 또 다른 예로서, 죽상경화 플라크 형성에 대해, "치료"는 죽상경화 플라크 침착물 발생 가능성 감소, 침착물 발생률 감소, 기존 침착물의 수 또는 크기 감소, 또는 플라크 안정성 개선을 지칭할 수 있다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 장애가 있는 대상 뿐만 아니라 장애를 예방해야 하는 대상을 포함한다. 치료의 바람직한 효과는 질환 발생 또는 재발 방지, 증상 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과 감소, 질환 예방, 질환 진행률 감소, 질환 상태 개선 또는 경감, 및 차도 또는 예후 개선 유발을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 질환 발생을 지연시키거나 또는 질환 진행을 둔화시키는데 사용된다.
특정한 구현예에서, 심혈관 병태를 예방 또는 치료하는 맥락에서 "이를 필요로 하는 대상체"는 심혈관 질환 또는 심혈관 병태(CVD) 또는 대사 증후군으로 진단되거나 또는 CVD 또는 대사 증후군과 연관된 하나 이상의 상태를 나타내는 대상체, 과거에 CVD 또는 대사 증후군으로 진단되거나 또는 연관된 하나 이상의 상태를 나타낸 대상체, 또는 유전적 또는 환경적 요인으로 인해 미래에 CVD 또는 대사 증후군 또는 CVD 또는 대사 증후군과 연관된 하나 이상의 상태가 발생할 위험이 있다고 여겨지는 대상체를 지칭한다. 따라서, 특정한 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 CVD 또는 대사 증후군 또는 CVD 또는 대사 증후군과 연관된 상태를 나타내는 대상체 또는 과거에 CVD 또는 대사 증후군 또는 CVD 또는 대사 증후군와 연관된 상태를 나타냈거나 또는 미래에 CVD 또는 대사 증후군 또는 CVD 또는 대사 증후군과 연관된 상태가 발생할 위험이 있다고 여겨지는 대상체일 수 있다.
심혈관 질환 또는 병태의 치료에서, 치료제는 면역 반응의 성분에 대한 반응 규모를 직접적으로 변경시키거나, 또는 질환이 다른 치료제, 예를 들어, 항생제, 항진균제, 항염증제, 화학요법제 등에 의한 치료에 보다 취약하게 만들 수 있다. 동맥 질환의 치료에서, 치료는 예를 들어, 질환 진행을 예방하거나 또는 둔화시킬 수 있다. 따라서, 동맥 질환의 치료는 구체적으로 병태의 발생, 또는 병태의 하나의 단계에서 또 다른 단계로, 보다 진행된 단계로, 또는 보다 심각한 관련 병태로의 진행을 예방, 억제, 또는 둔화시키는 것을 포함한다.
질환 또는 병태의 "병리"는 대상체의 웰빙을 위태롭게 하는 모든 현상을 포함한다. 심혈관 질환 또는 병태의 경우, 비제한적으로, 죽상경화 플라크 형성(안정한 또는 불안정한/취약한 플라크 포함), 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 세동맥경화증, 및 상승된 전신성 리포폴리사카라이드(LPS) 노출을 포함한다.
"완화", "완화하는", 또는 이의 등가물은 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭하며, 여기서 목적은 질환 또는 병태, 예를 들어, 죽상경화 플라크의 형성을 개선, 예방, 둔화(늦춤), 감소 또는 억제하는 것이다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 질환 또는 병태가 있는 대상 뿐만 아니라 질환 또는 병태에 걸리기 쉬운 대상 또는 질환 또는 병태가 예방되는 대상을 포함한다.
"만성" 투여는 연장된 기간 동안 초기 치료 효과를 유지하기 위해, 급성 모드와 대조적으로 연속 모드로 제제(들)의 투여를 지칭한다.
"간헐적" 투여는 중단 없이 연속적으로 수행되지 않지만, 오히려 사실상 주기적으로 수행되는 치료이다.
용어 "패키지 삽입물"은 치료 제품의 상업적인 패키지에 통상적으로 포함되는 설명서를 지칭하는데 사용되며, 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금지, 및/또는 경고에 관한 정보를 함유한다.
참조 폴리펩티드 서열에 대해 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 필요한 경우, 서열을 정렬하고 갭을 도입하고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않은 후, 참조 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 잔기와 일치하는 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당업계 내의 다양한 방식, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 작성되었고, 소스 코드는 20559 워싱턴 D.C. 소재의 미국 저작권청에 사용자 문서와 함께 제출되었으며, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재의 Genentech, Inc.로부터 공개적으로 이용가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 운영 체제에서 사용하기 위해 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 서열 B와, 또는 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(이는 대안적으로 주어진 아미노산 서열 B에 대해, 서열 B와, 또는 서열 B에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 또는 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
100 x 분율 X/Y
여기서 X는 A 및 B의 프로그램의 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치로 점수 매겨진 아미노산 잔기의 수이고, 여기서 Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대해 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대해 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않은 것으로 이해될 것이다. 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 % 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 직전 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
하기는 "IL-22"로 지정된 아미노산 서열에 대해 "비교 단백질" 또는 "참조 단백질"로 지정된 아미노산 서열의 % 아미노산 서열 동일성을 계산하는 방법의 예이며, 여기서 "IL-22"는 관심 IL-22 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 관심 "IL-22 " 폴리펩티드가 비교되는 것에 대한 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, 및 "X", "Y", 및 "Z"는 각각 상이한 아미노산 잔기를 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
용어 "작용제"는 가장 넓은 의미로 본원에 사용되고 IL-22 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 모방하는 임의의 분자를 포함한다. 또한 "작용제"에 의해 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA의 전사 또는 번역을 자극하는 분자가 포함된다.
적합한 작용제 분자는 예를 들어, 작용제 항체 또는 항체 단편; 천연 폴리펩티드; 천연 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체; 펩티드; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 작은 유기 분자; 및 폴리펩티드 작용제 또는 항체를 암호화하는 핵산을 포함한다. 작용제에 대한 언급은 단일 작용제 또는 2개 이상의 상이한 작용제의 조합을 포함한다.
용어 "IL-22 작용제"는 가장 넓은 의미로 본원에 사용되고, 천연 서열 IL-22 폴리펩티드의 정성적 생물학적 활성(상기 정의된 바와 같음)을 모방하는 임의의 분자를 포함한다. IL-22 작용제는 구체적으로 IL-22-Fc 또는 IL-22 Ig 폴리펩티드(면역부착소) 뿐만 아니라, 적어도 하나의 IL-22 생물학적 활성을 모방하는 소분자를 포함한다. 바람직하게는, 생물학적 활성은 IL-22 수용체의 결합, IL-22BP와의 상호작용, 선천적 면역 반응 경로 촉진, 또는 심혈관 질환 또는 상태의 경우, 죽상경화 플라크 형성에 영향을 미치는 것, 특히 죽상경화 플라크 형성의 형성을 억제하는 것이다. 플라크 형성의 억제는 당업자에게 알려진 임의의 적합한 영상화 방법에 의해 평가될 수 있다.
IL-22R1은 다른 단백질과 쌍을 이루어 특정 IL-10 패밀리 구성원에 대한 수용체로서 이종이량체를 형성한다. 상기 Ouyang et al., 2011 참조. 따라서, 특정한 구현예에서, IL-22 작용제는 IL-22R1에 결합하고 이의 하류 신호전달을 촉발시키는 시토카인(또는 이의 융합 단백질 또는 작용제)을 포함하는 IL-22 수용체 작용제를 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, IL-22 작용제는 비제한적으로 항-IL-22R1 작용제 항체를 포함하는 IL-22R1 작용제; 비제한적으로 IL-20 폴리펩티드 또는 IL-20 Fc 융합 단백질을 포함하는 IL-20 작용제; 및 비제한적으로 IL-24 폴리펩티드 또는 IL-24 융합 단백질을 포함하는 IL-24 작용제를 포함한다. 특정한 다른 구현예에서, IL-22R1 작용제는 비제한적으로 IL-19 폴리펩티드 또는 IL-19 Fc 융합 단백질을 포함하는 IL-19 작용제; 및 비제한적으로 IL-26 폴리펩티드 또는 IL-26 Fc 융합 단백질을 포함하는 IL-26 작용제를 포함한다. IL-19(GenBank 수탁번호 AAG16755.1, 서열번호: 77), IL-20(GenBank 수탁 번호 AAH69311.1, 서열번호: 78), IL-24(GenBank 수탁 번호 AAH09681.1, 서열번호: 79) 및 IL-26(GenBank 수탁 번호 NP_060872.1, 서열번호: 80)에 대한 예시적인 서열이 본원에 제공되어 있다. 특정한 구현예에서, IL-19 폴리펩티드는 서열번호: 77의 아미노산 서열 또는 신호 펩티드가 없는 성숙 단백질을 포함한다. 특정한 다른 구현예에서, IL-20 폴리펩티드는 서열번호: 78의 아미노산 서열 또는 신호 펩티드가 없는 성숙 단백질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, IL-24 폴리펩티드는 서열번호: 79의 아미노산 서열 또는 신호 펩티드가 없는 성숙 단백질을 포함한다. 특정한 다른 구현예에서, IL-26 폴리펩티드는 서열번호: 80의 아미노산 서열 또는 신호 펩티드가 없는 성숙 단백질을 포함한다.
"소분자"는 약 600 미만, 바람직하게는 약 1000 달톤 미만의 분자량을 갖는 것으로 본원에 정의된다.
본원에 사용된 "작용제 항체"는 IL-22 폴리펩티드의 생물학적 활성을 부분적으로 또는 완전히 모방하는 항체이다.
용어 "약제학적 제형" 또는 "약제학적 조성물"은 그 안에 함유된 활성 구성요소의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 이러한 형태이고, 제형이 투여될 수 있는 대상체에 허용할 수 없게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"약제학적으로 허용되는 담체"는 대상체에 무독성인, 활성 구성요소 이외의 약제학적 제형의 구성요소를 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 희석제, 안정화제, 또는 보존제를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각 VH, VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 초가변 영역(HVR)을 포함한다. (예를 들어, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91(2007) 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들어, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887(1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628(1991) 참조.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 번식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
본 출원 내에서, 달리 명시되지 않는 한, 활용되는 기술은 다음과 같은 여러 널리 알려진 임의의 참고문헌에서 찾을 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA), 및 Harlow and Lane(1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
적절한 경우, 상업적으로 이용가능한 키트 및 시약의 사용을 수반하는 절차는 달리 나타내지 않는 한 제조업체 정의된 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 일반적으로 수행된다. 따라서 본 발명의 방법 및 이의 용도가 기재되기 전에, 본 발명은 이와 같이 물론 달라질 수 있는 기재된 특정한 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 작제물, 및 시약으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용되는 용어는 단지 특정한 구현예를 기재하기 위한 목적을 위한 것이고, 첨부된 청구범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아님이 이해되어야 한다.
II. 조성물 및 방법
본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질, 이의 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물), 및 예를 들어, IBD(예를 들어, 궤양성 대장염(UC) 및 크론병), 심혈관 병태, 대사 증후군, GVHD과 같은 IL-22 연관된 질환의 치료, 및 상처 치유(예를 들어, 당뇨병성 상처 치유)를 가속화하기 위한 이의 용도를 제공한다. 또한 본원에는 IL-22 Fc 융합 단백질의 제조 방법 및 정제 방법이 제공된다. 본 발명은, 적어도 부분적으로, IL-22 Fc 융합 단백질의 IL-22 폴리펩티드 모이어티가 시알릴화되고, 시알릴화 함량이 본원에 제공된 IL-22 Fc 융합 단백질의 효능 및 약동학 특성 둘 다와 연관되어 있다는 발견에 기초한다. 이러한 발견은 부분적으로 제조 공정에 의해 영향을 받고 분자의 활성 및 PK/PD 특성에 영향을 미치는 분자의 특정 특성을 확인하는 것과 관련하여 이루어졌다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 전반적으로 낮은 글리코실화(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰 미만의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질 및 이의 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않음)를 갖는 IL-22 Fc-함유 조성물이 바람직하게 않게 빠른 생체내 클리어런스를 갖고, 추가로 이들 조성물의 높은 글리코실화(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 12 몰 초과의 시알산을 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질 및 이의 조성물을 포함하나 이에 제한되지 않음)가 IL-22 수용체에 대한 바람직하지 않은 결합 특성을 갖는 것으로 현재 발견되었다. 따라서, 특정 측면에서, 확인된 문제에 대한 해결책은 본원에 기재된 바와 같이 적합한 클리어런스 속도 뿐만 아니라 적합한 결합 활성 둘 다를 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질 및 이의 조성물에 대한 평균 시알산 함량 범위를 확인하는 것이었다. 보다 특히, 바람직한 범위는 완전 시알릴화보다 적은 범위이며, 달리 전형적으로 당업자가 예를 들어 제조의 용이성을 위해 선택할 수 있는 것으로 현재 발견되었다. 구체적 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질 및 이의 조성물에 대한 평균 시알산 함량의 특히 바람직한 범위는 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산이다.
A. IL-22 Fc 융합 단백질 및 조성물
본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질 및 이의 조성물을 제공한다. 일반적으로, IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 글리코실화된다(예를 들어, N-글리코실화된다). 특정 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 시알릴화된다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 글리코실화되지 않고, 따라서 또한 시알릴화되지 않는다.
일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 3 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 4 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 10 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 11 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 12 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 13 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 14 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 15 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 16 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 17 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 18 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 19 몰 초과의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 20 몰 초과의 시알산이다.
일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 20 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 19 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 18 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 17 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 16 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 15 몰의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 14 몰의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 13 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 12 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 11 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 10 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 몰 미만의 시알산이다. 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 몰 미만의 시알산이다.
예를 들어, 일 측면에서, 본 발명은 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 4 내지 약 20 몰(예를 들어, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 또는 약 15 몰, 약 16 몰, 약 17 몰, 약 18 몰, 약 19 몰, 또는 약 20 몰)의 시알산의 시알산 함량을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공하며, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해, 약 20% 내지 약 180%(예를 들어, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 100%, 약 110%, 약 120%, 약 130%, 약 140%, 약 150%, 약 160%, 약 170%, 또는 약 180%)의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해, 약 40% 내지 약 130%의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰 내지 약 12 몰(예를 들어, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 또는 약 12 몰)의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해, 약 80% 내지 약 120%의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰 내지 약 12 몰(예를 들어, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 또는 약 12 몰)의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해, 약 60% 내지 약 110%의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰 내지 약 12 몰(예를 들어, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 또는 약 12 몰)의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해, 약 80% 내지 약 10%의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해, 약 40% 내지 약 130%의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해, 60% 내지 약 110%의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해, 약 80% 내지 약 10%의 효능을 갖는다. 일부 구현예에서, 효능은 본원에 기재된 바와 같이(예를 들어, 실시예 2에서), 수용체 결합 검정 또는 세포-기반 결합 검정에서 평가된다. 일부 구현예에서, 참조 IL-22 Fc 융합 단백질은 표 12 및/또는 표 13에 제시된 N-글리칸 분포를 갖는다.
예를 들어, 임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 내지 약 16 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 내지 약 15 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 내지 약 14 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 내지 약 13 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 내지 약 12 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 내지 약 11 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 내지 약 10 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 내지 약 9 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 내지 약 8 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 내지 약 7 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 내지 약 6 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 16 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 15 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 14 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 13 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 12 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 11 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 10 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 9 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 8 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 7 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 내지 약 16 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 내지 약 15 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 내지 약 14 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 내지 약 13 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 내지 약 12 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 내지 약 11 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 내지 약 10 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 내지 약 9 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 내지 약 8 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 16 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 15 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 14 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 13 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 11 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 10 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 내지 약 16 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 내지 약 15 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 내지 약 14 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 내지 약 13 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 내지 약 12 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 내지 약 11 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 내지 약 10 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 10 내지 약 16 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 10 내지 약 15 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 10 내지 약 14 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 10 내지 약 13 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 10 내지 약 12 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 10 내지 약 11 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 11 내지 약 16 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 11 내지 약 15 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 11 내지 약 14 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 11 내지 약 13 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 11 내지 약 12 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 12 내지 약 16 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 12 내지 약 15 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 12 내지 약 14 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 12 내지 약 13 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 13 내지 약 16 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 13 내지 약 15 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 13 내지 약 14 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 14 내지 약 16 몰의 시알산, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 14 내지 약 15 몰의 시알산, 또는 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 15 내지 약 16 몰의 시알산이다.
일부 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰(예를 들어, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 또는 약 12 몰)이다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산이다. 다른 특정 구현예에서, 시알산 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 몰의 시알산이다.
시알산은 당업자에게 알려진 임의의 적합한 시알산 또는 이의 임의의 적합한 조합일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 시알산은 N-아세틸뉴라민산(NANA), Kdn, NGNA, Neu, Neu2en5Ac, 또는 이의 조합이다. 일부 구현예에서, 우세한 시알산은 NANA이다. 일부 구현예에서, 실질적으로 모든 시알산은 NANA이다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 약 6,000 ng/mL 내지 약 25,000 ng, 예를 들어, 약 6,000 ng/mL, 약 7,000 ng/mL, 약 8,000 ng/mL, 약 9,000 ng/mL, 약 10,000 ng/mL, 약 11,000 ng/mL, 약 12,000 ng/mL, 약 13,000 ng/mL, 약 14,000 ng/mL, 약 15,000 ng/mL, 약 16,000 ng/mL, 약 17,000 ng/mL, 약 18,000 ng/mL, 약 19,000 ng/mL, 약 20,000 ng/mL, 약 21,000 ng/mL, 약 22,000 ng/mL, 약 23,000 ng/mL, 약 24,000 ng/mL, 또는 약 25,000 ng/mL의 최대 관찰 농도(Cmax)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 약 9,000 ng/mL 내지 약 18,000 ng, 예를 들어, 약 9,000 ng/mL, 약 10,000 ng/mL, 약 11,000 ng/mL, 약 12,000 ng/mL, 약 13,000 ng/mL, 약 14,000 ng/mL, 약 15,000 ng/mL, 약 16,000 ng/mL, 약 17,000 ng/mL, 또는 약 18,000 ng/mL의 Cmax를 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 약 8,000 ng/mL 내지 약 19,000 ng의 Cmax를 갖는다. 일부 구현예에서, Cmax는 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가되거나, 또는 동등한 인간 Cmax 값이다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 약 2,000 일·ng/mL 내지 약 42,000 일·ng/mL, 예를 들어, 약 2,000 일·ng/mL, 약 4,000 일·ng/mL, 약 6,000 일·ng/mL, 약 7,000 일·ng/mL, 약 7,500 일·ng/mL, 약 8,000 일·ng/mL, 약 8,500 일·ng/mL, 약 9,000 일·ng/mL, 약 9,500 일·ng/mL, 약 10,000 일·ng/mL, 약 12,000 일·ng/mL, 약 16,000 일·ng/mL, 약 20,000 일·ng/mL, 약 24,000 일·ng/mL, 약 30,000 일·ng/mL, 약 36,000 일·ng/mL, 또는 약 42,000 일·ng/mL의 면적 시간 0에서 최종 측정가능한 시점까지 혈청 농도-시간 곡선하 면적(AUClast)을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 약 7,000 일·ng/mL 내지 약 25,000 일·ng/mL의 AUClast을 갖는다. 일부 구현예에서, AUClast은 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가되거나, 또는 동등한 인간 AUClast 값이다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 약 25 mL/kg/일 내지 약 400 mL/kg/일, 예를 들어, 약 25 mL/kg/일, 약 50 mL/kg/일, 약 75 mL/kg/일, 약 100 mL/kg/일, 약 125 mL/kg/일, 약 150 mL/kg/일, 약 175 mL/kg/일, 약 200 mL/kg/일, 약 225 mL/kg/일, 약 250 mL/kg/일, 약 275 mL/kg/일, 약 300 mL/kg/일, 약 325 mL/kg/일, 약 350 mL/kg/일, 약 375 mL/kg/일, 또는 약 400 mL/kg/일의 클리어런스(CL)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, CL은 약 40 mL/kg/일 내지 약 140 mL/kg/일이다. 일부 구현예에서, CL은 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가되거나, 또는 동등한 인간 CL 값이다.
일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 4 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 3 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 2 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 1 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.5 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.2 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.1 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.08 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.05 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.01 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.001 몰 미만의 NGNA이다. 일부 구현예에서, NGNA 함량은 IL-22-Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.001 몰 내지 약 5 몰 사이의 NGNA, IL-22-Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.001 몰 내지 약 1 몰 사이의 NGNA, IL-22-Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.01 몰 내지 약 1 몰 사이의 NGNA, IL-22-Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.1 몰 내지 약 1 몰 사이의 NGNA, 또는 IL-22-Fc 융합 단백질의 몰 당 약 0.5 몰 내지 약 1 몰 사이의 NGNA이다.
임의의 상기 측면에서, IL-22 폴리펩티드는 N-글리코실화될 수 있다. 임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 1-안테나리, 2-안테나리, 3-안테나리, 및/또는 4-안테나리 구조를 갖는 N-글리칸을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.01% 내지 약 5%(예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 또는 약 40%)는 1-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 2%는 1-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.5% 내지 약 1.5%는 1-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.6% 내지 약 1.5%는 1-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.3% 내지 약 1.7%는 1-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1%는 1-안테나리 구조를 갖는다.
예를 들어, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 40%(예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 또는 약 40%)는 2-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 25%는 2-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 20%는 2-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 13.1% 내지 약 20.4%는 2-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10.6% 내지 약 22.8%는 2-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 17%는 2-안테나리 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 50%(예를 들어, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 또는 약 50%)는 3-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 20% 내지 약 40%는 3-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 25% 내지 약 35%는 3-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 28.2% 내지 약 33.5%는 3-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 26.5% 내지 약 35.3%는 3-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 31%는 3-안테나리 구조를 갖는다.
일부 구현예에서, N-글리칸의 약 20% 내지 약 60%(예를 들어, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 또는 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 또는 약 60%)는 4-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸는 약 30% 내지 약 50%는 4-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 35% 내지 약 45%는 4-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 35.9% 내지 약 47%는 4-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 26.5% 내지 약 35.3%는 4-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 42%는 4-안테나리 구조를 갖는다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 40%(예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 또는 약 40%)는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 13.7% 내지 약 27.5%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 9.1% 내지 약 32.1%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 21%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함한다.
또 다른 예에서, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 35%(예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 또는 약 35%)는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 20%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 12% 내지 약 16%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 12.3% 내지 약 15.6%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 11.2% 내지 약 16.7%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 14%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함한다.
또 다른 예에서, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 35%(예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 또는 약 35%)는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 25%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 8% 내지 약 25%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 16%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 20%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10.9% 내지 약 15.7%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 9.3% 내지 약 17.4%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 13%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함한다.
또한 추가의 예에서, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 40%(예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 또는 약 40%)는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 12% 내지 약 25%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 16.4% 내지 약 20.6%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 22%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 19%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함한다.
또 다른 예에서, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 45%(예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 또는 약 45%)는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 20.8% 내지 약 26.4%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 18.9% 내지 약 28.3%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 24%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 시알산 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 50%(예를 들어, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 또는 약 50%)는 0개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 35%는 0개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 20% 내지 약 30%는 0개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 17.3% 내지 약 30%는 0개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 13.1% 내지 약 34.3%는 0개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 24%는 0개의 시알산 모이어티를 포함한다.
또 다른 예에서, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 45%(예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 또는 약 45%)는 1개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 1개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%는 1개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 17.6% 내지 약 22.3%는 1개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 16% 내지 약 23.9%의 1개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 20%는 1개의 시알산 모이어티를 포함한다.
또 다른 예에서, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 45%(예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 또는 약 45%)는 2개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 2개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%는 2개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 17.5% 내지 약 23.7%는 2개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15.5% 내지 약 25.8%는 2개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 21%는 2개의 시알산 모이어티를 포함한다.
또 다른 예에서, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 40%(예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 또는 약 40%)는 3개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 3개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 12% 내지 약 24%는 3개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 14.2% 내지 약 19.1%는 3개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 12.5% 내지 약 20.7%는 3개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 17%는 3개의 시알산 모이어티를 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 30%(예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 또는 약 30%)는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 15%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 6.4% 내지 약 12%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 4.5% 내지 약 13.9%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 9%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질에서, IL-22 폴리펩티드는 말단 만노스 모이어티를 포함하는 약 0% 내지 약 20%(예를 들어, 약 0%, 약 0.1, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 또는 약 20%) N-글리칸을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 5%는 말단 만노스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 4%는 말단 만노스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1.6% 내지 약 2.9%는 말단 만노스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1.2% 내지 약 3.3%는 말단 만노스 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 2%는 말단 만노스 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질에서, IL-22 폴리펩티드는 말단 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 모이어티를 포함하는 약 10% 내지 약 70%(예를 들어, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 또는 약 70%) N-글리칸을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 30% 내지 약 50%는 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 35% 내지 약 45%는 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 35.1% 내지 약 49.2%는 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 30.4% 내지 약 53.8%는 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 42%는 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 35%(예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 또는 약 35%)는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 15%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 8.4% 내지 약 12.5%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 7% 내지 약 13.8%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 35%(예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 또는 약 35%)는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 15%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 8.1% 내지 약 12.5%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 6.7% 내지 약 14%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 40%(예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 또는 약 40%)는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 25%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 20%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10.1% 내지 약 18.6%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 7.2% 내지 약 21.5%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 14%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 25%(예를 들어, 약 0.1%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 또는 약 25%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 15%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 4% 내지 약 24%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 2.3% 내지 약 11.8%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 15%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 7%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 말단 갈락토스 모이어티를 포함하는 약 10% 내지 약 70%(예를 들어, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 또는 약 70%) N-글리칸을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 20% 내지 약 50%는 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 25% 내지 약 35%는 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 26.1% 내지 약 38.3%는 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 22.1% 내지 약 42.3%는 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 32%는 말단 Gal 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 1, 2, 또는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함할 수 있다.
예를 들어, 임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 50%(예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 또는 약 50%)는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 19.8% 내지 약 27.1%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 17.4% 내지 약 29.5%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 23%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0% 내지 약 25%(예를 들어, 약 0%, 약 0.1%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 또는 약 25%)는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 15%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 2% 내지 약 12%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 4.6% 내지 약 9.2%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 3% 내지 약 10.8%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 7%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0% 내지 약 15%(예를 들어, 약 0%, 약 0.1%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 또는 약 15%)는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.1%% 내지 약 10%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 5%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1.1% 내지 약 2.6%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0.7% 내지 약 3%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 2%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질에서, IL-22 폴리펩티드는 갈락토스 N-아세틸글루코사민(LacNAc) 반복부를 포함하는 N-글리칸을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 0% 내지 약 20%(예를 들어, 예를 들어, 약 0%, 약 0.1%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 또는 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 또는 약 20%)는 LacNAc 반복부를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 1% 내지 약 10%는 LacNAc 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 2% 내지 약 8%는 LacNAc 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 3.7% 내지 약 5.2%는 LacNAc 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 3.2% 내지 약 5.7%는 LacNAc 반복부를 포함한다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5%는 LacNAc 반복부를 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질에서, IL-22 폴리펩티드는 푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 50% 내지 약 100%(예를 들어, 약 50%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%)는 푸코실화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 60% 내지 약 80%는 푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 65% 내지 약 75%는 푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 65.1% 내지 약 75%는 푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 61.7% 내지 약 78.3%는 푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 70%는 푸코실화된다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질에서, IL-22 폴리펩티드는 비푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 5% 내지 약 50%(예를 들어, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 또는 약 50%)는 비푸코실화된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 비푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%는 비푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 16.4% 내지 약 23.7%는 비푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 14% 내지 약 16.1%는 비푸코실화된다. 일부 구현예에서, N-글리칸의 약 20%는 비푸코실화된다.
임의의 상기 IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및/또는 Asn143 상에서 글리코실화될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및 Asn143 상에서 글리코실화된다.
예를 들어, 임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유는 약 50% 내지 약 100%(예를 들어, 약 50%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%)일 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유는 약 70% 내지 약 90%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유는 약 75% 내지 약 85%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유는 약 82%이다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질에서, 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유는 약 60% 내지 약 100%(예를 들어, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%)일 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유는 약 90% 내지 약 100%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유는 약 95% 내지 약 100%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유는 약 100%이다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질에서, 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유는 약 60% 내지 약 100%(예를 들어, 약 60%, 약 61%, 약 62%, 약 63%, 약 64%, 약 65%, 약 66%, 약 67%, 약 68%, 약 69%, 약 70%, 약 70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%)일 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유는 약 90% 내지 약 100%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유는 약 95% 내지 약 100%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유는 약 100%이다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질에서, 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유는 약 1% 내지 약 60%(예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 또는 약 60%)일 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유는 약 15% 내지 약 45%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유는 약 25% 내지 약 35%이다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유는 약 33%이다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 일부 구현예에서, Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 일부 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 Gly이다. 일부 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 Ala이다. 일부 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 299에서 아미노산 잔기는 Ala, Gly, 또는 Val이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 12, 서열번호: 14, 및 서열번호: 16으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 10의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 16의 아미노산 서열로 이루어진다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 N-글리코실화되지 않는다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질일 수 있다. 다른 구현예에서, 임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질일 수 있다.
임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 인간 IL-22 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호: 4의 아미노산 서열.
임의의 적합한 링커가 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 RVESKYGPP(서열번호: 44)를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 아미노산 서열 RVESKYGPP(서열번호: 44)로 이루어진다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 수용체에 결합한다. 일부 구현예에서, IL-22 수용체는 인간 IL-22 수용체이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22RA1 및/또는 IL-10R2에 결합한다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22RA1에 결합한다.
일부 구현예에서, 임의의 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 IL-22 Fc 융합 단백질을 발혐할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다.
본원에 기재된(예를 들어, 상기 기재된) 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질은 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에 포함될 수 있다. 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질에 대해 상기 기재된 임의의 값은 IL-22 Fc 단백질의 조성에 대한 평균 값일 수 있다.
예를 들어, 본원에는 인터류킨(IL)-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 N-글리코실화된다.
또 다른 예에서, 본원에는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및/또는 Asn143 상에서 글리코실화되고, 여기서 (a) 잔기 Asn21에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 70 내지 90 범위이고/이거나; (b) 잔기 Asn35에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 90 내지 100 범위이고/이거나; (c) 잔기 Asn64에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 90 내지 100 범위이고/이거나; (d) 잔기 Asn143에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 25 내지 35 범위이다.
임의의 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 또는 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는다. 다른 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는다.
본원에 기재된 임의의 조성물에서, 시알산은 N-아세틸뉴라민산(NANA)일 수 있다.
임의의 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 1 몰 미만의 NGNA의 평균 NGNA 함량을 가질 수 있다.
일부 구현예에서 (i) IL-22 Fc 융합 단백질은 약 8,000 ng/mL 내지 약 19,000 ng의 최대 관찰 농도(Cmax)를 가질 수 있고/있거나; (ii) IL-22 Fc 융합 단백질은 약 7,000 일·ng/mL 내지 약 25,000 일·ng/mL의 시간 0에서 최종 측정가능한 시점까지 혈청 농도-시간 곡선하 면적(AUClast)을 가질 수 있고/있거나; (iii) IL-22 Fc 융합 단백질은 약 40 mL/kg/일 내지 약 140 mL/kg/일의 클리어런스(CL)를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, Cmax, AUClast, 및/또는 CL은 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가된다.
임의의 조성물에서, IL-22 폴리펩티드는 1-안테나리, 2-안테나리, 3-안테나리, 및/또는 4-안테나리 구조를 갖는 N-글리칸을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 2%는 1-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (ii) N-글리칸의 약 10% 내지 약 25%는 2-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (iii) N-글리칸의 약 25% 내지 약 40%는 3-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (iv) N-글리칸의 약 30% 내지 약 51%는 4-안테나리 구조를 갖는다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 0.1% 내지 2%는 1-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (ii) N-글리칸의 10% 내지 25%는 2-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (iii) N-글리칸의 25% 내지 40%는 3-안테나리 구조를 갖고/갖거나; (iv) N-글리칸의 30% 내지 51%는 4-안테나리 구조를 갖는다.
임의의 조성물에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 약 9% 내지 약 32%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 약 10% 내지 약 20%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 약 8% 내지 약 25%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 약 12% 내지 약 25%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (v) N-글리칸의 약 12% 내지 약 30%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 9% 내지 32%는 0개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 10% 내지 20%는 1개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 8% 내지 25%는 2개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 12% 내지 25%는 3개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나; (v) N-글리칸의 12% 내지 30%는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함한다.
임의의 조성물에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 시알산 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 약 12% 내지 약 35%는 0개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 1개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 2개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%는 3개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (v) N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 12% 내지 35%는 0개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 10% 내지 30%는 1개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 10% 내지 30%는 2개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 10% 내지 30%는 3개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나; (v) N-글리칸의 1% 내지 20%는 4개의 시알산 모이어티를 포함한다.
임의의 조성물에서, (i) IL-22 폴리펩티드는 말단 만노스 모이어티를 포함하는 약 0% 내지 약 10% N-글리칸을 포함할 수 있고/있거나; (ii) IL-22 폴리펩티드는 말단 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 모이어티를 포함하는 약 30% 내지 약 55% N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, (i) IL-22 폴리펩티드는 말단 만노스 모이어티를 포함하는 0% 내지 10% N-글리칸을 포함하고/하거나; (ii) IL-22 폴리펩티드는 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는 30% 내지 55% N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 말단 만노스 모이어티를 포함하는 0% 내지 10% N-글리칸을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는 30% 내지 55% N-글리칸을 포함한다.
임의의 조성물에서, N-글리칸은 1, 2, 3, 또는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 약 5% 내지 약 25%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 약 0% 내지 약 15%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 1% 내지 20%는 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 1% 내지 20%는 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 5% 내지 25%는 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나; (iv) N-글리칸의 0% 내지 15%는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함한다.
임의의 조성물에서, (i) IL-22 폴리펩티드는 말단 갈락토스(Gal) 모이어티를 포함하는 약 20% 내지 약 45% N-글리칸을 포함할 수 있고/있거나; (ii) N-글리칸은 1, 2, 또는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, (i) IL-22 폴리펩티드는 말단 Gal 모이어티를 포함하는 20% 내지 45% N-글리칸을 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸은 1, 2, 또는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다.
임의의 조성물에서 (i) N-글리칸의 약 15% 내지 약 30%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함할 수 있고/있거나; (ii) N-글리칸의 약 1% 내지 약 15%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함할 수 있고/있거나; (iii) N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 6%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서 (i) N-글리칸의 15% 내지 30%는 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함하고/하거나; (ii) N-글리칸의 1% 내지 15%는 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함하고/하거나; (iii) N-글리칸의 0.1% 내지 6%는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함한다.
임의의 조성물에서 (i) IL-22 폴리펩티드는 갈락토스 N-아세틸글루코사민(LacNAc) 반복부를 포함하는 N-글리칸을 포함할 수 있고/있거나; (ii) IL-22 폴리펩티드는 푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함할 수 있고/있거나; (iii) IL-22 폴리펩티드는 비푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함할 수 있다.
임의의 조성물에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 글리코실화되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서 (i) Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 Gly 또는 Ala이고/이거나; (ii) Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 299에서 아미노산 잔기는 Ala, Gly, 또는 Val이다. 일부 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 Gly 또는 Ala이다. 일부 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 Gly이다. 다른 구현예에서, Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기는 Ala이다.
임의의 조성물에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 IgG1 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다.
임의의 조성물에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 95%(예를 들어, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
임의의 조성물에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
임의의 조성물에서, IL-22 폴리펩티드는 인간 IL-22 폴리펩티드일 수 있다. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다.
임의의 조성물에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 링커는 아미노산 서열 RVESKYGPP(서열번호: 44)를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
임의의 조성물에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 수용체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-22 수용체는 인간 IL-22 수용체이다.
IL-22 Fc 융합 단백질의 임의의 적합한 농도가 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 20 mg/mL일 수 있다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 농도는 약 0.5 mg/mL 내지 약 5 mg/mL이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 농도는 약 1 mg/mL이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 농도는 약 8 mg/mL 내지 약 12 mg/mL이다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 농도는 약 10 mg/mL이다.
본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질은 적어도 약 500 L의 부피를 갖는 생산 배양물로부터 생성될 수 있다. 임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 약 500 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는 생산 배양물로부터 생성되었다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 약 1,000 L 내지 약 3,000 L의 부피를 갖는 생산 배양물로부터 생성되었다. 일부 구현예에서 IL-22 Fc 융합 단백질은 약 1,500 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는 생산 배양물로부터 생성되었다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 약 2000 L의 부피를 갖는 생산 배양물로부터 생성되었다.
임의의 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 추가적인 치료제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 겔화제를 추가로 포함한다.
1. 예시적인 IL-22 폴리펩티드
임의의 적합한 IL-22 폴리펩티드는 본원에 제공된 IL-22 Fc 융합 단백질에 포함될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 71을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드(내인성 IL-22 리더 서열을 갖는 인간 IL-22), 또는 서열번호: 71과 적어도 80% 서열 동일성(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성)을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정한 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4를 포함하는 아미노산 서열(리더 서열이 없는 인간 IL-22) 또는 서열번호: 4와 적어도 80%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 특정한 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
핵산 및 폴리펩티드 서열과 함께, 천연 IL-22 분자의 제조는 당업자에게 알려진 방법을 통해 달성될 수 있다. 예를 들어, IL-22 폴리펩티드는 IL-22 핵산을 함유하는 백터로 형질전환되거나 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 생성될 수 있다. 물론, 당업계에 널리 알려진 대안적인 방법은 IL-22를 제조하는데 이용될 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, IL-22 서열, 또는 이의 부분은 고체-상 기술을 사용하여 직접 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, Stewart et al., 1969, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif.(1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85:2149-2154 참조). 시험관내 단백질 합성은 수동 기술을 사용하거나 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화된 합성은 예를 들어, 제조업체의 지침을 사용하여 Applied Biosystems Peptide Synthesizer(캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 달성될 수 있다. IL-22의 다양한 부분은 전장 IL-22를 생성하기 위해 별도로 화학적으로 합성되고 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 조합될 수 있다.
IL-22 변이체는 천연 서열 IL-22 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 내로 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나, 또는 바람직한 IL-22 폴리펩티드의 합성에 의해 제조될 수 있다. 당업자는 아미노산 변화가 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 바꾸거나 또는 막 고정 특성을 변경하는 것과 같은, IL-22의 번역후 공정을 변경할 수 있음을 이해할 것이다.
본원에 기재된 천연 서열 IL-22 폴리펩티드의 변이는 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,364,934호에 제시된 보존적 및 비-보존적 돌연변이에 대한 임의의 기술 및 지침을 사용하여 이루어질 수 있다. 변이는 상응하는 천연 서열 또는 변이체 IL-22와 비교하여 아미노산 서열의 변화를 초래하는 천연 서열 또는 변이체 IL-22를 암호화하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실, 또는 삽입일 수 있다. 임의적으로 변이는 천연 서열 IL-22 폴리펩티드의 도메인 중 하나 이상에서 적어도 하나의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 아미노산 잔기가 바람직한 활성에 악영향을 미치지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있다는 것을 결정하는 지침은 IL-22의 서열을 알려진 상동 단백질의 서열과 비교하고 높은 상동성 영역으로 이루어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 찾을 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체한 결과, 예컨대 류신을 세린으로 대체, 즉, 보존적 아미노산 대체일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의적으로 1 내지 5개의 아미노산 범위일 수 있다. 허용되는 변이는 서열에서 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환하고, 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 시험관내 검정에서 생성된 변이체를 활성에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다.
특정 구현예에서, 관심 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 제목 하에 표 A에 제시되어 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하면, 표 A에서 예시적인 치환으로 명명되거나, 또는 아미노산 클래스와 관련하여 하기 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입되고 생성물이 스크리닝된다.
본 발명의 범위 내에 포함된 IL-22 폴리펩티드의 또 다른 유형의 공유 변형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. "천연 글리코실화 패턴을 변경시키는 것"은 본원의 목적상 천연 서열 IL-22에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 결실시키고/시키거나, 천연 서열 IL-22에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가하고/하거나, 글리코실화 부위(들)에 부착된 당 잔기의 비 및/또는 조성을 변경하는 것을 의미하도록 의도된다.
폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 또는 O-연결된다. IL-22 폴리펩티드에 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열을 변경시킴으로써 달성될 수 있다. 상기 변경은 예를 들어, 천연 서열 IL-22에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 또는 치환(N-연결된 글리코실화 부위에 대해), 또는 O-연결된 글리코실화에 대한 인식 서열의 부가에 의해 이루어질 수 있다. IL-22 아미노산 서열은 임의적으로 DNA 수준에서의 변화를 통해, 특히 바람직한 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 미리 선택된 염기에서 IL-22 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 변경될 수 있다.
IL-22 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 수를 증가시키는 또 다른 수단은 폴리펩티드에 클리코시드의 화학적 또는 효소적 커플링이다. 이러한 방법은 당업계, 예를 들어, WO 87/05330 및 Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306(1981)에 기재되어 있다.
IL-22 폴리펩티드 상에 존재하는 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 또는 글리코실화에 대한 표적으로서 작용하는 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈의 돌연변이 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259:52(1987) 및 Edge et al., Anal. Biochem. 118:131(1981)에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138:350(1987)에 의해 기재된 바와 같이 다양한 엔도- 및 엑소-글리코시다제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
변이는 올리고뉴클레오티드-매개(부위-지정) 돌연변이유발, 알라닌 스캐닝, 및 PCR 돌연변이유발과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발(Carter et al., 1986, Nucl. Acids Res. 13:4331; Zoller et al., 1987, Nucl. Acids Res. 10:6487), 카세트 돌연변이유발(Wells et al., 1985, Gene 34:315), 제한 선택 돌연변이유발(Wells et al., 1986, Philos. Trans. R. Soc. London A 317:415), 또는 다른 알려진 기술은 클로닝된 DNA 상에서 수행되어 IL-22 변이체 DNA를 생성할 수 있다.
IL-22 폴리펩티드의 단변이 또한 본원에 제공된다. 이러한 단편은 N-말단 또는 C-말단에서 절두될 수 있거나, 또는 예를 들어, 전장 천연 단백질과 비교할 때 내부 잔기가 없을 수 있다. 특정 단편은 본 발명의 IL-22 폴리펩티드의 바람직한 생물학적 활성에 필수적이지 않는 아미노산 잔기가 없다. 따라서, 특정한 구현예에서, IL-22 폴리펩티드의 단편은 생물학적으로 활성이다. 특정한 구현예에서, 전장 IL-22의 단편은 N-말단 신호 펩티드 서열이 없다.
천연 서열 및 변이체 IL-22 폴리펩티드의 공유 변형은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 공유 변형의 한가지 유형은 IL-22의 표적화된 아미노산 잔기를 IL-22 폴리펩티드의 선택된 측쇄 또는 N- 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시키는 것을 포함한다. 이작용성제로의 유도체화는 예를 들어, IL-22를 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 가교시키는데, 예를 들어, 항-IL-22 항체를 정제하는 방법에 사용하기에 유용하다. 통상적으로 사용되는 가교제는 예를 들어, 1,1-비스(디아조-아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-하이드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산을 갖는 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜-프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 이작용성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 동종이작용성 말레이미드, 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 제제를 포함한다.
다른 변형은 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 상응하는 각각 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 기의 인산화, 리신, 아르기닌, 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 기의 메틸화(T. E. Creighton, 1983, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86i), N-말단 아민의 아세틸화, 및 임의의 C-말단 카르복실 기의 아미드화를 포함한다.
IL-22의 또 다른 유형의 공유 변형은 예를 들어 미국 특허 번호 제4,640,835호; 제4,496,689호; 제4,301,144호; 제4,670,417호; 제4,791,192호; 또는 제4,179,337호에 제시된 방식으로, 다양한 비단백성 중합체, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 IL-22 폴리펩티드를 연결하는 것을 포함한다. 천연 서열 및 변이체 IL-22는 또한 또 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 IL-22의 단편을 포함하는 IL-22를 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수 있다.
일 구현예에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 IL-22의 융합을 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 IL-22 폴리펩티드의 아미노- 또는 카르복실-말단에 배치된다. IL-22 폴리펩티드의 이러한 에피토프-태깅된 형태의 존재는 태그 폴리펩티드에 대하여 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그의 제공은 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또 다른 유형의 친화성 매트릭스를 사용하는 친화성 정제에 의해 IL-22 폴리펩티드를 용이하게 정제할 수 있게 한다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들의 각각의 항체는 당업계에 널리 알려져 있다. 예는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신(poly-his-gly) 태그; 플루(flu) HA 태그 폴리펩티드 및 이의 항체 12CA5(Field et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165); c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, 및 9E10 항체(Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3610-3616); 및 단순 포진 바이러스 당단백질 D(gD) 태그 및 이의 항체(Paborsky et al., 1990, Protein Engineering 3(6):547-553)를 포함한다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드(Hopp et al., 1988, BioTechnology 6:1204-1210); KT3 에피토프 펩티드(Martin et al., 1992, Science 255:192-194); 튜불린 에피토프 펩티드(Skinner et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15163-15166); 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그(Lutz-Freyermuth et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397)를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 키메라 분자는 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정한 영역과 IL-22 폴리펩티드 또는 이의 단편의 융합을 포함할 수 있다. 2가 형태의 키메라 분자의 경우, 이러한 융합은 IgG 분자의 Fc 영역에 대한 것일 수 있다. 이들 융합 폴리펩티드는 이종 단백질("부착소")의 결합 특이성을 면역글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 조합하는 항체-유사 분자이고, 종종 면역부착소로 지칭된다. 구조적으로, 면역부착소는 IL-22의 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 및 면역글로불린 불변 도메인 서열의 융합을 포함한다. 면역부착소 분자의 부착소 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접한 아미노산 서열이다. 면역부착소 내 면역글로불린 불변 도메인 서열은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위유형, IgA(IgA1 및 IgA2 포함), IgE, IgD, 또는 IgM과 같은 임의의 면역글로불린으로부터 수득될 수 있다. 특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 변형된 이펙터 활성을 나타낸다.
IL-22 폴리펩티드, 또는 이의 단편은 예를 들어, IL-22-Ig 융합 단백질(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질)을 생성하기 위해 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열에 융합될 수 있다. IL-22 폴리펩티드는 인간 또는 뮤린 IL-22일 수 있다. 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열은 인간 또는 뮤린 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열일 수 있다.
2. 예시적인 IL-22 Fc 융합 단백질
특정한 구현예에서, 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 수용체에 결합하고 활성 또는 신호전달을 유도하고/하거나 IL-22 수용체 활성의 작용제이다.
또 다른 측면에서, 본원에 제공된 IL-22 Fc 융합 단백질은 서열번호: 4의 아미노산 서열과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하며 참조 서열에 비해 치환(예를 들어, 보존적 치환), 삽입, 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 수용체에 결합하는 능력을 유지한다. 특정한 구현예에서, 총 1 내지 10개의 아미노산이 서열번호: 8, 10, 12, 14, 16, 24, 또는 26에서 치환, 삽입, 및/또는 결실되었다. 특정한 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 IL-22의 외부 영역(즉, Fc)에서 발생한다. 일부 구현예에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 IL-22 Fc 융합 단백질의 링커, 힌지, CH2 도메인, CH3 도메인에 있을 수 있다. 특정한 특정 구현예에서, Fc의 C-말단 Lys 잔기는 결실된다. 특정한 다른 구현예에서, Fc의 C-말단 Gly 및 Lys 잔기는 둘 다 결실된다.
일부 구현예에서, 링커는 DKTHT(서열번호: 32), EPKSCDKTHT(서열번호: 33), VEPKSCDKTHT(서열번호: 34), KVEPKSCDKTHT(서열번호: 35), KKVEPKSCDKTHT(서열번호: 36), DKKVEPKSCDKTHT(서열번호: 37), VDKKVEPKSCDKTHT(서열번호: 38), KVDKKVEPKSCDKTHT(서열번호: 39), EPKSSDKTHT(서열번호: 40), GGGDKTHT(서열번호: 41), ELKTPLGDTTHT(서열번호: 42), SKYGPP(서열번호: 43), RVESKYGPP(서열번호: 44), GGGSTHT(서열번호: 63), DKKVEPKSSDKTHT(서열번호: 64), KVDKKVEPKSSDKTHT(서열번호: 65), 또는 KKVEPKSSDKTHT(서열번호: 66)와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제9,815,880호의 표 2를 참조하며, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
특정한 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질 변이체가 제공된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제 하에 표 A에 제시되어 있다. 보다 실질적인 변화는 "예시적인 치환"이라는 표제 하에 표 A에 제공되어 있고, 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 하기 추가로 기재된다. 아미노산 치환은 IL-22 Fc 융합 단백질 내에 도입될 수 있고 생성물은 바람직한 활성, 예를 들어, 유지된/개선된 IL-22 수용체 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 IL-22 수용체 신호전달에 대해 스크리닝된다.
표 A
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아미노산은 통상의 측쇄 특성에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 단백질의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 Cunningham and Wells(1989) Science, 244:1081-1085에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라고 불린다. 이 방법에서, 표적 잔기의 잔기 또는 기(예를 들어, 하전된 잔기 예컨대 Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu)를 확인하고 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산(예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체하여 단백질과 그의 결합 파트너의 상호작용이 영향을 받는지를 결정한다. 추가의 치환이 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 단백질 복합체(예를 들어, 시토카인-수용체 복합체)의 결정 구조를 사용하여 단백질 및 그의 결합 파트너 사이의 접촉점을 확인할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화 또는 제거될 수 있다. 변이체는 바람직한 특성을 보유하는지를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개의 잔기에서 수백 개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수의 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다.
본원에는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산이 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호: 8, 서열번호: 10, 서열번호: 12, 서열번호: 14, 서열번호: 24 또는 서열번호: 26, 바람직하게는 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 16, 보다 바람직하게는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화한다. 특정한 다른 구현예에서, 핵산은 서열번호: 7, 서열번호: 9, 서열번호: 11, 서열번호: 13, 서열번호: 23 또는 서열번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정한 특정 구현예에서, 핵산은 서열번호: 7 또는 서열번호: 11, 바람직하게는 서열번호: 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정한 구현예에서, 단리된 핵산은 서열번호: 7, 서열번호: 9, 서열번호: 11, 서열번호: 13; 서열번호: 23 또는 서열번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정한 구현예에서, 단리된 핵산은 서열번호: 7, 서열번호: 9, 서열번호: 11, 서열번호: 13; 서열번호: 23 또는 서열번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 단리된 핵산은 IL-22R에 결합하고/하거나 IL-22R 활성을 촉발할 수 있는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화할 수 있고 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질의 Fc 영역은 글리코실화되지 않는다. 특정한 구현예에서, 단리된 핵산은 서열번호: 7, 서열번호: 9, 서열번호: 11, 서열번호: 13; 서열번호: 23 또는 서열번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 단리된 핵산은 서열번호: 8, 10, 12, 또는 14의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 관련 측면에서, 본 발명은 상기 기재된 핵산을 포함하는 벡터, 및 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정한 구현예에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포이다. 특정한 특정 구현예에서, 숙주 세포는 비제한적으로, 이. 콜라이 세포를 포함하는 원핵생물 세포이다. 특정한 다른 구현예에서, 숙주 세포는 비제한적으로, CHO 세포를 포함하는 진핵생물 세포이다. 특정한 구현예에서, 숙주 세포는 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.
a) 글리코실화 변이체
특정한 구현예에서, 본원에 제공된 IL-22 Fc 융합 단백질은 융합 단백질의 Fc 부분이 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경된다. 단백질에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로서 편리하게 달성될 수 있다.
융합 단백질이 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 N-결합에 의해 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 일반적으로 부착된 분지형, 2-안테나리 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, Wright et al. TIBTECH 15:26-32(1997) 참조. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민(GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 2-안테나리 올리고사카라이드 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 특정 개선된 특성을 갖는 Fc 변이체를 생성하기 위해 항체 또는 항체의 Fc 영역에서 올리고사카라이드의 변형이 이루어질 수 있다.
Fc 영역의 CH2 도메인에 부착된 푸코스의 양은 예를 들어 WO　2008/077546에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정시 Asn 297 또는 N297에 부착된 모든 당구조(예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고 만노스 구조)의 합에 비해, Asn297에서 당 쇄 내에서 평균 푸코스 양을 계산함으로써 결정될 수 있다. Asn297은 Fc 영역에서 약 위치 297에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만(Fc 영역 잔기의 EU 넘버링); Asn297은 또한 항체에서 사소한 서열 변이로 인해, 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294 및 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108; US 2004/0093621 참조. "탈푸코실화된" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체와 관련된 간행물의 예는 다음을 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249(2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614(2004). 탈푸코실화된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포(Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545(1986); 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1; 및 WO　2004/056312 A1, 특히 실시예 11), 및 녹아웃(knockout) 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포(예를 들어, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614(2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688(2006); 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 2-안테나리 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된, 이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공된다. 이러한 항체 변이체는 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어, WO 2003/011878; 미국 특허 번호 제6,602,684호; 및 US 2005/0123546에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드에서 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 기재되어 있다.
b) Fc 영역 변이체
특정한 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 Fc 융합 단백질의 Fc 영역 내에 도입되어, 이에 의해 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열(예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정한 구현예에서, 본 발명은 이펙터 기능을 전부는 아니지만 일부 보유하는 Fc 변이체를 고려하며, 이는 생체내에서 항체 또는 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질의 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능(예컨대 보체 및 ADCC)이 불필요하거나 또는 유해한 적용에 대해 바람직한 후보가 된다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들어, Fc 수용체(FcR) 결합 검정은 항체 또는 Fc가 FcγR 결합이 없지만(따라서 ADCC 활성이 없을 가능성이 있음), FcRn 결합 능력을 보유하는 것을 보장하도록 수행될 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492(1991)의 464쪽에 있는 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하는 시험관내 검정의 비제한적인 예는 미국 특허 번호 제5,500,362호(예를 들어 Hellstrom et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063(1986) 및 Hellstrom et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502(1985) 참조; 미국 특허 번호 제5,821,337호(Bruggemann et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361(1987) 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있다(예를 들어, 유세포 분석을 위한 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정(CellTechnology, Inc. 캘리포니아주 마운틴뷰 소재; 및 CYTOTOX 96® 비-방사성 세포독성 검정(Promega, 위스콘신주 매디슨 소재) 참조. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서 예를 들어, Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656(1998)에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 또한 항체 또는 Fc가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 없다는 것을 확인하기 위해 C1q 결합 검정이 또한 수행될 수 있다. 예를 들어, WO　2006/029879 및 WO　2005/100402에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(예를 들어, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163(1996); Cragg et al., Blood 101:1045-1052(2003); 및 Cragg et al., Blood 103:2738-2743(2004) 참조). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정이 또한 당업계에 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Petkova et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769(2006) 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상이 치환된 것들을 포함한다(미국 특허 번호 제6,737,056호). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환된 Fc 돌연변이체를 포함하며, 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함한다(미국 특허 번호 제7,332,581호).
FcR에 대한 개선 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 또는 Fc 변이체가 기재되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 번호 제6,737,056호; WO 2004/056312, 및 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604(2001) 참조.)
특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 ADCC를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, N-글리코실화 부위를 제거하지만 FcRn 결합 활성을 보유하는 Fc 영역의 위치 297에서 치환을 갖는 Fc 변이체를 포함한다(잔기의 EU 넘버링).
일부 구현예에서, 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,194,551호, WO　99/51642, 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184(2000)에 기재된 바와 같이, 감소된 C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 초래하는 Fc 영역에서 변경이 이루어진다.
증가된 반감기를 갖고 모체 IgG를 태아로 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체(FcRn)(Guyer et al., J. Immunol. 117:587(1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249(1994))에 대한 개선된 결합을 갖는 항체는 US2005/0014934A1(Hinton et al.)에 기재되어 있다.　 이들 항체는 Fc 영역의 FcRn에 대한 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것들을 포함한다(미국 특허 번호 제7,371,826호).
또한 Fc 영역 변이체의 다른 예에 관련하여 Duncan & Winter, Nature 322:738-40(1988); 미국 특허 번호 제5,648,260호; 미국 특허 번호 제5,624,821호; 및 WO 94/29351 참조.
c) 시스테인 조작된 변이체
특정한 구현예에서, 항체의 Fc 영역의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된, 시스테인 조작된 Fc 융합 단백질을 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 구현예에서, 치환된 잔기는 Fc의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 이에 의해 반응성 티올 기는 Fc의 접근가능한 부위에 위치하고, 본원에 추가로 기재된 바와 같이, Fc를 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티와 같은 다른 모이어티에 접합시켜 면역 접합체를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 Fc 영역의 S400(EU 넘버링)은 시스테인으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,521,541호 참조.
B. IL-22 Fc 융합 단백질의 제조 및/또는 정제 방법
본원에 제공된 IL-22 Fc 융합 단백질은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 단편, 또는 이의 변이체를 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 제조될 수 있다. 임의의 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 또한 제공된다. 임의의 적합한 숙주 세포, 예를 들어, 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포), 이. 콜라이, 또는 효모가 사용될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질을 생성하기 위한 공정이 추가로 제공되며, 일반적으로, 바람직한 IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 숙주 세포를 배양하고 회수하는 단계, 및 임의적으로 세포 배양물로부터 바람직한 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계를 수반한다. 또한 본원에는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 배치를 선택하는 방법이 제공된다.
예를 들어, 본원에는 하기 단계 중 1, 2, 3, 또는 4개 모두를 포함하는 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 방법이 제공된다: (a) 본원에 기재된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질(예를 들어, 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질)을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 숙주 세포를 시드 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 시드 트레인 배지에서 배양하는 단계 배양물; (c) 상기 시드 트레인 배양물을 접종물 배지 내에 접종하고 접종물 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및/또는 (d) 상기 접종물 트레인 배양물을 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 생산 배지에서 배양하며, 여기서 생산 배양물의 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 이에 의해 IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 단계. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 글리코실화된다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 16 몰의 시알산(예를 들어, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 또는 약 16 몰의 시알산)의 시알산 함량을 갖는다.
임의의 상기 방법에서, 숙주 세포는 동결된 숙주 세포일 수 있고, 단계 (a)는 동결된 숙주 세포를 시드 트레인 배지에서 해동시키는 단계를 추가로 포함한다. 숙주 세포는 임의의 적합한 온도, 예를 들어, 약 0℃, 약 -10℃, 약 -20℃, 약 -30℃, 약 -40℃, 약 -50℃, 약 -60℃, 약 -70℃, 약 -80℃, 약 -90℃, 약 -100℃, 또는 그 이하에서 동결될 수 있다. 동결된 숙주 세포는 임의의 적합한 시간 동안 및 임의의 적합한 온도(들)에서 해동될 수 있다. 다른 예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 생산을 위해 롤링 시드 트레인이 사용될 수 있다. 이 예에서, 시드 트레인은 동결된 숙주 세포를 사용하기 보다는 접종물 트레인을 접종하기 위해 (특정 세포 연령까지) 연속적으로 성장된다.
임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물은 약 1L 내지 약 100 L, 예를 들어, 약 1L, 약 2 L, 약 3 L, 약 4L, 약 5 L, 약 10 L, 약 15 L, 약 20 L, 약 25 L, 약 30 L, 약 35 L, 약 40 L, 약 45 L, 약 50 L, 약 55 L, 약 60 L, 약 70 L, 약 75 L, 약 80 L, 약 85 L, 약 90 L, 약 95 L, 또는 약 100 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물은 약 5 L 내지 약 50 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물은 약 10 L 내지 약 40 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물은 약 15 L 내지 약 25 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물은 약 20 L의 부피를 갖는다.
접종물 트레인 배지 또는 접종물 트레인 배양물은 임의의 적합한 부피를 가질 수 있다. 임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배지 또는 접종물 트레인 배양물은 약 10 L 내지 약 4,000 L, 예를 들어, 약 10 L, 약 15 L, 약 20 L, 약 25 L, 약 30 L, 약 35 L, 약 40 L, 약 45 L, 약 50 L, 약 55 L, 약 60 L, 약 70 L, 약 75 L, 약 80 L, 약 85 L, 약 90 L, 약 95 L, 약 100 L, 약 105 L, 약 110 L, 약 115 L, 약 120 L, 약 125 L, 약 130 L, 약 135 L, 약 140 L, 약 145 L, 약 150 L, 약 155 L, 약 160 L, 약 165 L, 약 170 L, 약 175 L, 약 180 L, 약 185 L, 약 190 L, 약 195 L, 약 200 L, 약 300 L, 약 400 L, 약 500 L, 약 600 L, 약 700 L, 약 800 L, 약 900 L, 약 1000 L, 약 1,500 L, 약 2,000 L, 약 2,500 L, 약 3,000 L, 약 3,500 L, 또는 약 4,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배지 또는 접종물 트레인 배양물은 약 50 L 내지 약 100 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배지 또는 접종물 트레인 배양물은 약 75 L 내지 약 90 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배지 또는 접종물 트레인 배양물은 약 80 L의 부피를 갖는다. 다른 구현예에서, 접종물 트레인 배지 또는 접종물 트레인 배양물은 약 300 L 내지 약 500 L(예를 들어, 약 300 L, 약 320 L, 약 340 L, 약 360 L, 약 380 L, 약 400 L, 약 420 L, 약 440 L, 약 460 L, 약 480 L, 또는 약 500 L)의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배지 또는 접종물 트레인 배양물은 약 350 L 내지 약 450 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배지 또는 접종물 트레인 배양물은 약 400 L의 부피를 갖는다.
생산 배지 또는 생산 배양물은 임의의 적합한 부피를 가질 수 있다. 임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물은 약 100 L 내지 약 30,000 L, 예를 들어, 약 100 L, 약 200 L, 약 300 L, 약 400 L, 약 500 L, 약 600 L, 약 700 L, 약 800 L, 약 900 L, 약 1000 L, 약 1,500 L, 약 2,000 L, 약 2,500 L, 약 3,000 L, 약 3,500 L, 약 4,000 L, 약 4,500 L, 약 5,000 L, 약 5,500 L, 약 6,000 L, 약 6,500 L, 약 7,000 L, 약 7,500 L, 약 8,000 L, 약 8,500 L, 약 9,000 L, 약 9,500 L, 약 10,000L, 약 12,000 L, 약 15,000 L, 약 20,000 L, 약 25,000 L, 또는 약 30,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물은 약 500 L 내지 약 5,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물은 약 1,000 L 내지 약 3,000 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물은 약 1,500 L 내지 약 2,500 L의 부피를 갖는다. 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물은 약 2000 L의 부피를 갖는다.
임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은 단계 (d) 전에 접종물 트레인 배양물을 약 1 내지 20회, 예를 들어, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 약 16, 약 17, 약 18, 약 19, 또는 약 20회 계대하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배양물은 단계 (d) 전에 약 1 내지 10회 계대된다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배양물은 단계 (d) 전에 약 2 내지 약 6회 계대된다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배양물은 단계 (d) 전에 약 2 내지 약 3회 계대된다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배양물은 단계 (d) 전에 약 5회 계대된다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배양물은 단계 (d) 전에 약 2회 계대된다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배양물은 단계 (d) 전에 약 3회 계대된다. 일부 구현예에서, 접종물 트레인 배양물은 단계 (d) 전에 약 4회 계대된다.
임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지, 접종물 트레인 배지, 및/또는 생산 배지는 숙주 세포를 선택할 수 있는 선택제를 포함한다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지는 선택제를 포함한다. 임의의 적합한 선택제가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택제는 메티오닌 술폭시민, 메토트렉세이트, 또는 항생제(예를 들어, 블라스티시딘, 게네티신, 하이그로마이신 B, 퓨로마이신, 마이코페놀산, 또는 제오신)이다. 특정 구현예에서, 선택제는 메티오닌 술폭시민이다.
임의의 상기 방법에서, 시드 트레인 배지, 접종물 배지, 및/또는 생산 배지는 소포제를 포함할 수 있다. 임의의 적합한 소포제가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 소포제는 시메티콘 에멀젼, 소포제 204, 소포제 A, 소포제 B, 소포제 C, 소포제 Y-30, 또는 소포제 SE-15이다. 특정 구현예에서, 소포제는 시메티콘 에멀젼이다. 일부 구현예에서, 소포제의 농도는 약 10% 내지 약 50%, 예를 들어, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 또는 약 50%(예를 들어, w/v)이다. 일부 구현예에서, 소포제의 농도는 약 30%(w/v)이다. 일부 구현예에서, 30% 시메티콘을 사용하여 거품을 최소화하기 위해 필요에 따라 배양물(예를 들어, 시드 트레인 배양물, 접종물 배양물, 및/또는 생산 배양물)에 첨가되는 1% 또는 10% 소포제 용액을 제조한다.
임의의 상기 방법에서, 시드 트레인 배지, 접종물 배지, 및/또는 생산 배지는 완충제, 세포 보호제, 폴리사카라이드, 및/또는 삼투압 조절제를 포함할 수 있다.
임의의 상기 방법에서, 단계 (b)는 임의의 적합한 온도, 예를 들어, 약 20℃ 내지 약 45℃, 예를 들어, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 또는 약 45℃의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 35℃ 내지 약 39℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 36℃ 내지 약 38℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 37℃의 온도에서 수행된다.
임의의 상기 방법에서, 단계 (b)는 임의의 적합한 배양 용기, 예를 들어, 스피너, 진탕 플라스크, 또는 시드 트레인 생물 반응기(예를 들어, 스테인리스 강 생물 반응기 또는 1회용 생물 반응기(예를 들어, WAVE BIOREACTOR™ 또는 AMBR® 생물 반응기(예를 들어, AMBR® 15 또는 AMBR® 250 생물 반응기)))에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 고속 트레인 스피너 또는 진탕 플라스크에서 수행된다. 다른 구현예에서, 단계 (b)는 1회용 생물 반응기(예를 들어, WAVE BIOREACTOR™ 또는 AMBR® 생물 반응기(예를 들어, AMBR® 15 생물 반응기 또는 AMBR® 250 생물 반응기))에서 수행된다. 다른 구현예에서, 단계 (b)는 고속 트레인 생물 반응기에서 수행된다.
임의의 상기 방법에서, 단계 (b)는 계대 당 약 1 일 내지 약 20 일, 예를 들어, 계대 당 약 1 일, 약 2 일, 약 3 일, 약 4 일, 약 5 일, 약 6 일, 약 7 일, 약 8 일, 약 9 일, 약 10 일, 약 11 일, 약 12 일, 약 13 일, 약 14 일, 약 15 일, 약 16 일, 약 17 일, 약 18 일, 약 19 일, 또는 약 20 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 계대 당 약 1 일 내지 약 12 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 계대 당 약 2 일 내지 약 7 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 계대 당 약 2 일 내지 약 6 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 계대 당 약 2 일 내지 약 5 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 계대 당 약 2 일 내지 약 4 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 계대 당 약 2 일 내지 약 3 일의 지속기간을 갖는다.
임의의 상기 방법에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물은 임의의 적합한 pH를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물의 pH는 약 5 내지 약 9, 예를 들어, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.15, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 또는 약 9이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물의 pH는 약 6.5 내지 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물의 pH는 약 7.0 내지 약 7.5, 예를 들어, 약 7.0, 약 7.05, 약 7.1, 약 7.15, 약 7.2, 약 7.25, 약 7.3, 약 7.35, 약 7.4, 약 7.45, 또는 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물의 pH는 약 7.15이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배양물의 pH는 약 7.15이다.
임의의 상기 방법에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물은 임의의 적합한 용존 산소(예를 들어, 용존 산소의 퍼센트, 여기서 100%는 배지가 포화되어 있음을 나타냄), 예를 들어, 약 10% 내지 약 60%(예를 들어, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 또는 약 60%를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물의 용존 산소는 약 15% 내지 약 50%이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물의 용존 산소는 약 20% 내지 약 40%이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물의 용존 산소는 약 25% 내지 약 35%이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배지 또는 시드 트레인 배양물의 용존 산소는 약 30%이다. 일부 구현예에서, 시드 트레인 배양물의 용존 산소는 약 30%이다.
임의의 상기 방법에서, 단계 (b)는 임의의 적합한 지속기간, 예를 들어, 약 6 시간 내지 약 20 일, 예를 들어, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 1 일, 약 1.5 일, 약 2 일, 약 2.5 일, 약 3 일, 대략 3.5 일, 약 4 일, 약 4.5 일, 약 5 일, 약 5.5 일, 약 6 일, 약 6.5 일, 약 7 일, 약 7.5 일, 약 8 일, 약 8.5 일, 약 9 일, 약 9.5 일, 약 10 일, 약 10.5 일, 약 11 일, 약 11.5 일, 약 12 일, 약 12.5 일, 약 13 일, 약 13.5 일, 약 14 일, 약 14.5 일, 약 15 일, 약 15.5 일, 약 16 일, 약 16.5 일, 약 17 일, 약 17.5 일, 약 18 일, 약 18.5 일, 약 19 일, 약 19.5 일, 또는 약 20 일을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 1 일 내지 약 10 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 2 일 내지 약 8 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 2 일 내지 약 7 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 2 일 내지 약 6 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 2 일 내지 약 5 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 2 일 내지 약 4 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 약 2 일 내지 약 3 일의 지속기간을 갖는다.
임의의 상기 방법에서, 단계 (c)는 임의의 적합한 온도, 예를 들어, 약 20℃ 내지 약 45℃, 예를 들어, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 또는 약 45℃의 온도에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 35℃ 내지 약 39℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 36℃ 내지 약 38℃의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 37℃의 온도에서 수행된다.
임의의 상기 방법에서, 단계 (c)는 하나 이상의 생물 반응기, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20개, 또는 그 이상의 생물 반응기(예를 들어, 스테인리스 강 생물 반응기 또는 1회용 생물 반응기(예를 들어, WAVE BIOREACTOR™))에서 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 3개의 생물 반응기 또는 4개의 생물 반응기에서 수행된다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 3개의 생물 반응기에서 수행된다.
임의의 상기 방법에서, 접종물 배지 또는 접종물 배양물은 임의의 적합한 pH를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 접종물 배지 또는 접종물 배양물의 pH는 약 5 내지 약 9, 예를 들어, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.15, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 또는 약 9이다. 일부 구현예에서, 접종물 배지 또는 접종물 배양물의 pH는 약 6.5 내지 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 접종물 배지 또는 접종물 배양물의 pH는 약 7.0 내지 약 7.5, 예를 들어, 약 7.0, 약 7.05, 약 7.1, 약 7.15, 약 7.2, 약 7.25, 약 7.3, 약 7.35, 약 7.4, 약 7.45, 또는 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 접종물 배지 또는 접종물 배양물의 pH는 약 7.1이다. 일부 구현예에서, 접종물 배양물의 pH는 약 7.1이다.
임의의 상기 방법에서, 접종물 배지 또는 접종물 배양물은 임의의 적합한 용존 산소, 예를 들어, 약 10% 내지 약 60%(예를 들어, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 또는 약 60%를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 접종물 배지 또는 접종물 배양물의 용존 산소는 약 15% 내지 약 50%이다. 일부 구현예에서, 접종물 배지 또는 접종물 배양물의 용존 산소는 약 20% 내지 약 40%이다. 일부 구현예에서, 접종물 배지 또는 접종물 배양물의 용존 산소는 약 25% 내지 약 35%이다. 일부 구현예에서, 접종물 배지 또는 접종물 배양물의 용존 산소는 약 30%이다. 일부 구현예에서, 접종물 배양물의 용존 산소는 약 30%이다.
임의의 상기 방법에서, 단계 (c)는 임의의 적합한 지속기간, 예를 들어, 약 6 시간 내지 약 20 일, 예를 들어, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 1 일, 약 1.5 일, 약 2 일, 약 2.5 일, 약 3 일, 대략 3.5 일, 약 4 일, 약 4.5 일, 약 5 일, 약 5.5 일, 약 6 일, 약 6.5 일, 약 7 일, 약 7.5 일, 약 8 일, 약 8.5 일, 약 9 일, 약 9.5 일, 약 10 일, 약 10.5 일, 약 11 일, 약 11.5 일, 약 12 일, 약 12.5 일, 약 13 일, 약 13.5 일, 약 14 일, 약 14.5 일, 약 15 일, 약 15.5 일, 약 16 일, 약 16.5 일, 약 17 일, 약 17.5 일, 약 18 일, 약 18.5 일, 약 19 일, 약 19.5 일, 또는 약 20 일을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 1 일 내지 약 10 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 2 일 내지 약 8 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 2 일 내지 약 7 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 2 일 내지 약 6 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 2 일 내지 약 5 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 2 일 내지 약 4 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 2 일 내지 약 3 일의 지속기간을 갖는다.
임의의 상기 방법에서, 단계 (d)는 초기 온도에서 이동후 온도까지 온도 이동을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 초기 온도는 약 20℃ 내지 약 45℃, 예를 들어, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 또는 약 45℃이다. 일부 구현예에서, 초기 온도는 약 25℃ 내지 약 40℃이다. 일부 구현예에서, 초기 온도는 약 35℃ 내지 약 39℃이다. 일부 구현예에서 초기 온도는 약 36℃ 내지 약 38℃이다. 일부 구현예에서, 초기 온도는 약 37℃이다.
임의의 상기 방법에서, 이동후 온도는 초기 온도 미만 또는 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 이동후는 약 20℃ 내지 약 45℃, 예를 들어, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 약 40℃, 약 41℃, 약 42℃, 약 43℃, 약 44℃, 또는 약 45℃이다. 일부 구현예에서, 이동후는 약 25℃ 내지 약 35℃이다. 일부 구현예에서, 초기 온도는 약 30℃ 내지 약 35℃이다. 일부 구현예에서 초기 온도는 약 32℃ 내지 약 34℃이다. 일부 구현예에서, 초기 온도는 약 33℃이다.
임의의 상기 방법에서, 온도 이동은 약 1 시간 내지 약 140 시간의 기간, 예를 들어, 약 1 시간, 약 2 시간, 약 3 시간, 약 4 시간, 약 5 시간, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 24 시간, 약 25 시간, 약 30 시간, 약 35 시간, 약 40 시간, 약 45 시간, 약 50 시간, 약 55 시간, 약 56 시간, 약 57 시간, 약 58 시간, 약 59 시간, 약 60 시간, 약 61 시간, 약 62 시간, 약 63 시간, 약 64 시간, 약 65 시간, 약 66 시간, 약 67 시간, 약 68 시간, 약 69 시간, 약 70 시간, 약 71 시간, 약 72 시간, 약 73, 약 74 시간, 약 75 시간, 약 76 시간, 약 77 시간, 약 78 시간, 약 79 시간, 약 80 시간, 약 85 시간, 약 90 시간, 약 95 시간, 약 100 시간, 약 105 시간, 약 110 시간, 약 115 시간, 약 120 시간, 약 125 시간, 약 130 시간, 약 135 시간, 또는 약 140 시간에 걸쳐 발생할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 온도 이동은 약 12 시간 내지 약 120 시간의 기간에 걸쳐 발생한다. 일부 구현예에서, 온도 이동은 약 24 시간 내지 약 96 시간의 기간에 걸쳐 발생한다. 일부 구현예에서, 온도 이동은 약 48 시간 내지 약 96 시간의 기간에 걸쳐 발생한다. 일부 구현예에서, 온도 이동은 약 60 시간 내지 약 80 시간의 기간에 걸쳐 발생한다. 일부 구현예에서, 온도 이동은 약 72 시간의 기간에 걸쳐 발생한다.
임의의 상기 방법에서, 생산 배지 또는 생산 배양물은 임의의 적합한 pH를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물의 pH는 약 5 내지 약 9, 예를 들어, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.15, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 또는 약 9이다. 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물의 pH는 약 6.5 내지 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물의 pH는 약 7.0 내지 약 7.5, 예를 들어, 약 7.0, 약 7.05, 약 7.1, 약 7.15, 약 7.2, 약 7.25, 약 7.3, 약 7.35, 약 7.4, 약 7.45, 또는 약 7.5이다. 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물의 pH는 약 7.0이다. 일부 구현예에서, 생산 배양물의 pH는 약 7.0이다.
임의의 상기 방법에서, 단계 (d)는 임의의 적합한 배양 용기, 예를 들어, 생산 생물 반응기(예를 들어, 스테인리스 강 생물 반응기 또는 1회용 생물 반응기(예를 들어, WAVE BIOREACTOR™))에서 수행될 수 있다.
임의의 상기 방법에서, 생산 배지 또는 생산 배양물은 임의의 적합한 용존 산소, 예를 들어, 약 10% 내지 약 60%(예를 들어, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 약 30%, 약 31%, 약 32%, 약 33%, 약 34%, 약 35%, 약 36%, 약 37%, 약 38%, 약 39%, 약 40%, 약 41%, 약 42%, 약 43%, 약 44%, 약 45%, 약 46%, 약 47%, 약 48%, 약 49%, 약 50%, 약 51%, 약 52%, 약 53%, 약 54%, 약 55%, 약 56%, 약 57%, 약 58%, 약 59%, 또는 약 60%를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물의 용존 산소는 약 15% 내지 약 50%이다. 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물의 용존 산소는 약 20% 내지 약 40%이다. 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물의 용존 산소는 약 25% 내지 약 35%이다. 일부 구현예에서, 생산 배지 또는 생산 배양물의 용존 산소는 약 30%이다. 일부 구현예에서, 생산 배양물의 용존 산소는 약 30%이다.
임의의 상기 방법에서, 단계 (d)는 임의의 적합한 지속기간, 예를 들어, 약 6 시간 내지 약 30 일, 예를 들어, 약 6 시간, 약 7 시간, 약 8 시간, 약 9 시간, 약 10 시간, 약 11 시간, 약 12 시간, 약 13 시간, 약 14 시간, 약 15 시간, 약 16 시간, 약 18 시간, 약 19 시간, 약 20 시간, 약 21 시간, 약 22 시간, 약 23 시간, 약 1 일, 약 1.5 일, 약 2 일, 약 2.5 일, 약 3 일, 대략 3.5 일, 약 4 일, 약 4.5 일, 약 5 일, 약 5.5 일, 약 6 일, 약 6.5 일, 약 7 일, 약 7.5 일, 약 8 일, 약 8.5 일, 약 9 일, 약 9.5 일, 약 10 일, 약 10.5 일, 약 11 일, 약 11.5 일, 약 12 일, 약 12.5 일, 약 13 일, 약 13.5 일, 약 14 일, 약 14.5 일, 약 15 일, 약 15.5 일, 약 16 일, 약 16.5 일, 약 17 일, 약 17.5 일, 약 18 일, 약 18.5 일, 약 19 일, 약 19.5 일, 약 20 일, 약 20.5 일, 약 21 일, 약 21.5 일, 약 22 일, 약 22.5 일, 약 23 일, 약 23.5 일, 약 24 일, 약 24.5 일, 약 25 일, 약 25.5 일, 약 26 일, 약 26.5 일, 약 27 일, 약 27.5 일, 약 28 일, 약 28.5 일, 약 29 일, 약 29.5 일, 또는 약 30 일을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 1 일 내지 약 10 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 2 일 내지 약 25 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 5 일 내지 약 25 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 7 일 내지 약 14 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 8 일 내지 약 16 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 약 10 일 내지 약 14 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 11 일 내지 약 13 일의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)는 약 12 일의 지속기간을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본원에는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 숙주 세포를 시드 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 시드 트레인 배지에서 배양하는 단계; (c) 상기 시드 트레인을 접종물 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 접종물 배지 내에 접종하는 단계; 및 (d) 상기 접종물 트레인을 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 생산 배지에서 배양하며, 여기서 생산 배양물의 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 여기서 단계 (d)의 지속기간이 적어도 10 일이고, 이에 의해 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 단계, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 지속기간은 적어도 11 일, 적어도 12 일, 또는 적어도 13 일이다. 일부 구현예에서, 단계 (d)의 지속기간은 12 일이다.
임의의 상기 방법에서, 단계 (d)는 영양소 공급물에 의해 생산 배지 또는 생산 배양물에 영양소를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 방법에서, 임의의 적합한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포이다. 다른 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 일부 구현예에서, 진핵생물 세포는 포유동물 세포(예를 들어, CHO 세포, 예컨대 현탁-적합한 CHO 세포)이다. 추가적인 적합한 숙주 세포는 당업계에 알려져 있고 예를 들어, 곤충 세포 또는 식물 세포로 하기 기재되어 있다.
임의의 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다: (e) 생산 배양물로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (e)는 생산 배양물을 냉각시키는 단계(예를 들어, 내지 약 1℃ 내지 약 10℃(예를 들어, 약 1℃, 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 8℃, 약 9℃, 또는 약 10℃), 예를 들어, 2℃ 내지 약 8℃)를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (e)는 원심분리에 의해 생산 배지로부터 숙주 세포를 제거하여 세포 배양액을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (e)는 세포 배양액을 여과하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 상기 방법은 하기 단계를 추가로 포함할 수 있다: (f) 세포 배양액에서 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (f)는 하기 하위단계 중 1, 2, 3, 또는 4개 모두를 포함한다: (i) 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계; (ii) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및 (iii) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계.
또 다른 측면에서, 본 발명은 하기 단계 중 1, 2, 3, 또는 4개 모두를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 방법을 제공한다: (a) IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 제공하고 임의적으로 세포 배양액에서 바이러스를 불활성화시키는 단계; (b) 상기 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계; (c) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및 (d) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계. 일부 구현예에서, IL-22 폴리펩티드는 글리코실화된다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 내지 약 16 몰의 시알산(예를 들어, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 약 14, 약 15, 또는 약 16 몰의 시알산)의 시알산 함량을 갖는다.
임의의 상기 방법은 정제된 생성물 풀을 농축시켜 농축된 생성물 풀을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 상기 방법은 상기 정제된 생성물 풀을 한외여과하는 단계를 포함할 수 있다. 임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 한외여과하는 것은 정제된 생성물 풀을 재생 셀룰로스 한외여과 막, 예를 들어, 10 kDa 복합 재생 셀룰로스 한외여과 막으로 여과하는 것을 포함한다. 임의의 상기 방법은 농축된 생성물 풀의 완충액을 교환하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 한외여과 및 투석여과(UFDF) 풀을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 농축된 생성물 풀의 완충액은 0.01 M 나트륨 포스페이트, pH 7.2, 최종 농도를 포함하는 투석여과 완충액으로 교환된다. 임의의 상기 방법은 상기 UFDF 풀을 제형 완충액으로 조건화하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조건화된 UFDF 풀을 형성하는 단계를 포함할 수 있다.
임의의 상기 방법은 하나 이상의 바이러스 불활성화 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 바이러스를 불활성화시키는 단계는 세포 배양액, 친화성 풀, 음이온-교환 풀, 및/또는 정제된 생성물 풀에 세제를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스를 불활성화시키는 단계는 세포 배양액에 세제를 첨가하는 것을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 하위단계 (i)은 세포 배양액을 친화성 칼럼에 접촉시키기 전에 세포 배양액에 세제를 첨가하여 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스를 불활성화시키는 단계는 친화성 풀에 세제를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 하위단계 (i)은 친화성 풀에 세제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함한다.
임의의 적합한 세제, 예를 들어, TRITON® X-100 또는 TRITON® CG110이 바이러스를 불활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양액 중 세제의 최종 농도는 약 0.001% 내지 약 5%(예를 들어, v/v), 예를 들어, 약 0.001%, 약 0.01%, 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1%, 약 1.1%, 약 1.2%, 약 1.3%, 약 1.4%, 약 1.5%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 또는 약 5%이다. 일부 구현예에서, 세포 배양액 중 세제의 최종 농도는 약 0.01% 내지 약 2%이다. 일부 구현예에서, 세제의 최종 농도는 약 0.1% 내지 약 1%이다. 일부 구현예에서, 세제의 최종 농도는 약 0.3% 내지 약 0.5%이다. 일부 구현예에서, 세제의 최종 농도는 약 0.5%이다. 바이러스 불활성화는 임의의 적합한 온도, 예를 들어, 약 4℃ 내지 약 40℃, 예를 들어, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃, 약 9℃, 약 10℃, 약 11℃, 약 12℃, 약 13℃, 약 14℃, 약 15℃, 약 16℃, 약 17℃, 약 18℃, 약 19℃, 약 20℃, 약 21℃, 약 22℃, 약 23℃, 약 24℃, 약 25℃, 약 26℃, 약 27℃, 약 28℃, 약 29℃, 약 30℃, 약 31℃, 약 32℃, 약 33℃, 약 34℃, 약 35℃, 약 36℃, 약 37℃, 약 38℃, 약 39℃, 또는 약 40℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화는 약 2012° 내지 약 25℃에서 수행된다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화는 약 0.25 시간 초과, 예를 들어, 약 0.25 시간, 약 0.5 시간, 약 1 시간, 약 1.5 시간, 약 2 시간, 약 2.5 시간, 약 3 시간, 약 3.5 시간, 약 4 시간, 약 4.5 시간, 약 5 시간, 약 5.5 시간, 약 6 시간 초과, 또는 그 이상의 지속기간을 갖는다. 일부 구현예에서, 바이러스 불활성화는 약 0.5 시간 초과, 예를 들어, 약 5 시간 내지 48 시간, 약 5 시간 내지 약 24 시간의 지속기간, 또는 임의의 다른 적합한 지속기간을 갖는다.
또 다른 예에서, 본 발명은 복수의 숙주 세포를 포함하는 접종물 트레인 배양물을 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 생산 배지에서 배양하며, 여기서 숙주 세포는 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고, 여기서 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 여기서 배양 지속기간은 적어도 10 일이고, 이에 의해 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 내지 12 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 배양 지속기간은 적어도 11 일, 적어도 12 일, 또는 적어도 13 일이다. 일부 구현예에서, 배양 지속기간은 12 일이다.
임의의 상기 측면의 일부 구현예에서, 상기 방법은 생산 배지에서 접종물 트레인 배양물을 배양하기 전에 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 시드 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 시드 트레인 배지에서 배양함으로써 시드 트레인 배양물을 생성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생산 배지에서 접종물 트레인 배양물을 배양하기 전에 상기 시드 트레인 배양물을 접종물 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 접종물 배지 내에 접종하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 적합한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 임의의 방법에서, 숙주 세포는 진핵생물 숙주 세포 또는 원핵생물 숙주 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 진핵생물 숙주 세포는 포유동물 숙주 세포이다. 일부 구현예에서, 포유동물 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다. 일부 구현예에서, 세포 배양액을 수확하는 단계는 (i) 생산 배양물을 냉각시키는 단계; (ii) 원심분리에 의해 생산 배지로부터 숙주 세포를 제거하여 세포 배양액을 형성하는 단계; 및/또는 (iii) 세포 배양액을 여과하는 단계를 포함한다.
임의의 방법은 세포 배양액에서 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계는 하기 하위단계를 포함한다: (i) 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계; (ii) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및 (iii) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계는 하기 하위단계 중 하나 이상을 추가로 포함한다: (iv) 정제된 생성물 풀을 농축시켜 농축된 생성물 풀을 형성하는 단계; (v) 상기 정제된 생성물 풀을 한외여과하는 단계; (vi) 상기 농축된 생성물 풀의 완충액을 교환하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 한외여과 및 투석여과(UFDF) 풀을 형성하는 단계; 및/또는 (vii) 상기 UFDF 풀을 제형 완충액으로 조건화하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조건화된 UFDF 풀을 형성하는 단계. 일부 구현예에서, 하위단계 (i)은 세포 배양액을 친화성 칼럼에 접촉시키기 전에 세포 배양액에 세제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 예에서, 본 발명은 링커에 의해 항체 Fc 영역에 연결된 글리코실화된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물의 시알산 함량을 제어하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 적어도 약 10 일 동안 생산 배지에서 복수의 숙주 세포를 포함하는 접종물 트레인 배양물을 배양하며, 여기서 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 여기서 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는, 단계; 및 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위로 조성물의 평균 시알산 함량을 풍부화하여, 이에 의해 조성물의 시알산 함량을 제어하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위로 조성물의 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법은 조성물의 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 포함할 수 있다. 풍부화는 임의의 적합한 접근법을 사용하여, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 평균 시알산 함량을 풍부화하는 것은 생산 배양물로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 배양액을 수확하는 단계는 (i) 생산 배양물을 냉각시키는 단계; (ii) 원심분리에 의해 생산 배지로부터 숙주 세포를 제거하여 세포 배양액을 형성하는 단계; 및/또는 (iii) 세포 배양액을 여과하는 단계를 포함한다. 조성물의 평균 시알산 함량을 풍부화하는 것은 세포 배양액에서 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계는 하기 하위단계를 포함한다: (i) 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계; (ii) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및 (iii) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계는 하기 하위단계 중 하나 이상을 추가로 포함한다: (iv) 정제된 생성물 풀을 농축시켜 농축된 생성물 풀을 형성하는 단계; (v) 상기 정제된 생성물 풀을 한외여과하는 단계; (vi) 상기 농축된 생성물 풀의 완충액을 교환하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 한외여과 및 투석여과(UFDF) 풀을 형성하는 단계; 및/또는 (vii) 상기 UFDF 풀을 제형 완충액으로 조건화하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조건화된 UFDF 풀을 형성하는 단계. 일부 구현예에서, 하위단계 (i)은 세포 배양액을 친화성 칼럼에 접촉시키기 전에 세포 배양액에 세제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 지지체는 단백질 A 수지, 단백질 G 수지, 또는 IL-22 수용체 수지를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 A 수지는 MABSELECT SURE® 수지이다. 일부 구현예에서, 음이온-교환 크로마토그래피 지지체는 다중모드 기능성 수지를 갖는 강한 음이온 교환기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음이온-교환 크로마토그래피 지지체는 CAPTO™ 부착 수지를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 1 내지 약 8 몰(예를 들어, 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 또는 약 8 몰)의 시알산 범위의 초기 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6, 약 7, 또는 약 8 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량을 갖는다. 다른 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 7 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량을 갖는다. 또한 다른 구현예에서, 조성물은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위로 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위로 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 1 내지 약 8 몰의 시알산 범위의 초기 평균 시알산 함량(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7 몰, 또는 약 8 몰의 시알산)에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 3 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 4 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 예에서, 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 1 내지 8 몰의 시알산(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 몰의 시알산) 범위의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 3 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 4 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 5 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 7 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 1 내지 약 8 몰의 시알산(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7 몰, 또는 약 8 몰의 시알산)의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 3 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 3 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 4 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 6 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 7 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다.
또한 다른 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 1 내지 8 몰의 시알산(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8 몰의 시알산)의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 3 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 3 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 4 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 5 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 7 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량에서 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위까지 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함한다.
임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 지지체는 단백질 A 수지, 단백질 G 수지, 또는 IL-22 수용체 수지를 포함한다. 임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 친화성 크로마토그래피 지지체는 단백질 A 수지를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 A 수지는 MABSELECT SURE® 수지이다. 일부 구현예에서, 세척 완충액은 0.4 M 칼륨 포스페이트, pH 7.0, 최종 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 용리 완충액은 0.3 M L-아르기닌 하이드로클로라이드, 0.013 M 나트륨 포스페이트, pH 3.8, 최종 농도를 포함한다.
임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 음이온-교환 크로마토그래피 지지체는 다중모드 기능성 수지를 갖는 강한 음이온 교환기를 포함한다. 일부 구현예에서, 음이온-교환 크로마토그래피 지지체는 CAPTO™ 부착 수지를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 평형 완충액은 0.04 M 나트륨 아세테이트, pH 5.8, 최종 농도를 포함한다.
임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 제2 용리 완충액은 구배 용리 완충액이다. 일부 구현예에서, 구배 용리 완충액은 0.04 M 나트륨 아세테이트, pH 5.8 내지 0.04 M 나트륨 아세테이트, 0.3M 나트륨 술페이트 pH 5.8을 포함한다.
임의의 상기 방법의 일부 구현예에서, 제2 평형 완충액은 0.025 M MOPS, 0.3 M 나트륨 술페이트, pH 7.0, 최종 농도를 포함한다.
본 발명은 또한 방출을 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 배치를 선택하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 하기 단계 중 1, 2, 또는 3개 모두를 포함한다: (a) IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 배치를 제공하는 단계; (b) 상기 배치에서 시알산의 수준을 평가하는 단계; 및 (c) 배치가 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는 경우 방출을 위한 배치를 선택하는 단계. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 배치가 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 경우 방출을 위한 배치를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 배치가 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 경우 방출을 위한 배치를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (c)는 배치가 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 경우 방출을 위한 배치를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 배치에서 시알산 수준을 평가하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, 역상 HPLC(RP-HPLC) 포함), 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC), 모세관 전기영동, 또는 비색 분석법을 사용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단계 (b)는 HPLC(예를 들어, RP-HPLC)를 사용하는 것을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 이의 조성물의 시알산 함량을 제어하는 방법에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 이의 조성물의 시알산 함량을 조정함으로써 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 이의 조성물의 생체내 클리어런스를 감소/반감기를 증가시키는 방법에 사용될 수 있다.
숙주 세포는 IL-22 폴리펩티드 생산을 위해 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환되고 적절한 경우 프로모터 유도, 형질전환체 선택, 또는 바람직한 서열을 암호화하는 유전자 증폭을 위해 변형된 통상적인 영양소 배지에서 배양된다. 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 선택될 수 있다. 일반적으로, 세포 배양의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜, 및 실시 기술은 Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler, ed.(IRL Press, 1991) 및 상기 Sambrook et al.에서 찾을 수 있다.
형질감염 방법은 예를 들어, CaPO4 및 전기천공법, 또는 리포펙션(예를 들어, LIPOFECTAMINE® 사용)에 의해 당업자에게 알려져 있다. 사용되는 숙수 세포에 따라, 형질전환은 이러한 세포에 적절한 표준 기술을 사용하여 수행된다. 상기 Sambrook et al.에 기재된 바와 같이 칼슘 클로라이드를 이용하는 칼슘 처리, 또는 전기천공법은 일반적으로 실질적인 세포-벽 장벽을 함유하는 원핵생물 또는 다른 세포에 사용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로의 감염은 Shaw et al., Gene, 23:315(1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859에 의해 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용된다. 이러한 세포 벽이 없는 포유동물 세포의 경우, Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457(1978)의 칼슘 포스페이트 침전 방법이 이용될 수 있다. 포유동물 세포 숙수 시스템 형질전환의 일반적인 측면은 미국 특허 번호 제4,399,216호에 기재되었다. 효모 내로 형질전환은 전형적으로 Van Solingen et al., J. Bact, 130:946(1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979)의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 핵 미세주입, 전기천공법, 온전한 세포와의 박테리아 원형질체 융합, 또는 다가양이온, 예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴과 같은, DAN를 세포 내에 도입하는 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 포유동물 세포를 형질전환시키는 다양한 기술에 대해, Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537(1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352(1988) 참조.
본 발명의 재조합적으로 발현된 폴리펩티드는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 이온-교환 칼럼 상에서 분별; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상에서 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 암모늄 술페이트 침전; 예를 들어, Sephadex G-75를 사용한 겔 여과; IgG와 같은 오염물을 제거하는 단백질 A 세파로즈 칼럼; 및 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프-태깅된 형태에 결합하는 금속 킬레이트 칼럼. 다양한 단백질 정제 방법이 이용될 수 있고 이러한 방법은 당업계에 알려져 있으며 예를 들어 Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York(1982)에 기재되어 있다. 선택된 정제 단계(들)는 예를 들어, 사용되는 생산 공정의 특성 및 생성되는 특정한 폴리펩티드에 따라 달라질 것이다.
당업계에 널리 알려져 있는 대안적인 방법을 이용하여 본 발명의 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 또는 이의 일부를 암호화하는 서열은 고체-상 기술을 사용하여 직접 펩티드 합성에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, Stewart et al., 1969, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA; Merrifield, J. 1963,Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 참조. 시험관내 단백질 합성은 수동 기술을 사용하거나 또는 자동화에 의해 수행될 수 있다. 자동화된 합성은 예를 들어, 제조업체의 지침을 사용하여 Applied Biosystems Peptide Synthesizer(캘리포니아주 포스터 시티)를 사용하여 달성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 다양한 부분 또는 이의 일부는 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 별도로 화학적으로 합성되고 조합되어 전장 폴리펩티드 또는 이의 일부를 생성할 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 분자를 제공한다. 이러한 키메라 분자의 예는 에피토프 태그 서열 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 융합된 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 포함하나 이제 제한되지 않는다.
본원의 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 효모, 또는 고등 진핵생물 세포를 포함한다. 적합한 원핵생물은 그람-음성 또는 그람-양성 유기체와 같은 진정세균, 예를 들어, 이. 콜라이와 같은 장내세균(Enterobacteriaceae)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이. 콜라이 K12 균주 MM294(ATCC 31,446); 이. 콜라이 X1776(ATCC 31,537); 이. 콜라이 균주 W3110(ATCC 27,325) 및 K5 772(ATCC 53,635)와 같은 다양한 이. 콜라이 균주가 공개적으로 이용가능하다.
원핵생물 이외에도, 사상 균류 또는 효모와 같은 진핵생물 미생물은 IL-22-암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)는 통상적으로 사용되는 하등 진핵생물 숙주 미생물이다.
글리코실화된-IL-22의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포도프테라(Spodoptera) Sf9와 같은 곤충 세포, 뿐만 아니라 식물 세포를 포함한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 중국 햄스터 난소(CHO) 및 COS 세포를 포함한다. 보다 구체적인 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포(COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포(현탁 배양물에서 성장하기 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1977)); 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251(1980)); 인간 폐 세포(W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포(Hep G2, HB 8065); 및 마우스 유선 종양 세포(MMT 060562, ATCC CCL51)를 포함한다. 적절한 숙주 세포의 선택은 당업계 내에서 간주된다.
IL-22를 암호화하는 핵산(예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 다양한 벡터가 공개적으로 이용가능하다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자, 또는 파지 형태일 수 있다. 적절한 핵산 서열은 다양한 절차에 의해 벡터 내로 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA는 당업계에 알려진 기술을 사용하여 적절한 제안 엔도뉴클레아제 부위(들) 내로 삽입된다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기원, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열 중 하나 이상을 포함하나 이제 제한되지 않는다. 이들 성분 중 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축(construct)은 당업자에게 알려진 표준 결찰 기술을 이용한다.
IL-22 폴리펩티드는 직접적으로 뿐만 아니라, 이종 폴리펩티드를 갖는 융합 폴리펩티드로서 재조합적으로 생성될 수 있으며, 이는 성숙 단백질 또는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 IL-22 Fc 융합 단백질의 N-말단에서 특이적 절단 부위를 갖는 신호 서열 또는 다른 폴리펩티드일 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 구성성분 일 수 있거나, 또는 벡터 내로 삽입된 IL-22 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, 1 pp, 또는 열-안정한 엔테로톡신 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비의 경우 신호 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 리더, 알파 인자 리더(사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) "--인자 리더 포함, 후자는 미국 특허 번호 제5,010,182호에 기재됨), 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제 리더(1990년 4월 4일 공개된 EP 362,179), 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호일 수 있다. 포유동물 세포 발현에서, 포유동물 신호 서열, 예컨대 동일하거나 또는 관련된 종, 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더의 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열은 단백질의 분비를 지시하는데 사용될 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 둘 다는 벡터가 하나 이상의 분비된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모, 및 바이러스에 대해 널리 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기원은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2: 플라스미드 기원은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기원(SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 전형적으로 선택가능한 마커로도 불리는 선택 유전자를 함유할 것이다. 전형적인 선택 유전자, 예를 들어 바실루스(Bacilli)에 대한 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트, 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, (b) 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 중요한 영양소를 공급하는 단백질을 암호화한다.
포유동물 세포에 적합한 선택가능한 마커의 예는 DHFR 또는 티미딘 키나제와 같은, IL-22 핵산을 흡수할 수 있는 세포의 확인을 가능하게 하는 것이다. 야생형 DHFR이 이용될 때 적절한 숙주 세포는 Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216(1980)에 기재된 바와 같이 제조되고 번식된, DHFR 활성이 결핍된 CHO 세포주이다. 효모에서 사용하기에 적합한 선택 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [예를 들어, Stinchcomb et al., Nature, 282:39(1979); Kingsman et al., Gene, 7:141(1979); Tschemper et al., Gene, 10:157(1980) 참조]. trp1 유전자는 트립토판에서 성장하는 능력이 없는 효모의 돌연변이체 균주, 예를 들어, ATCC 번호 44076 또는 PEP4-1에 대한 선택 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85:12(1977)].
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 지시하기 위해 IL-22 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식된 프로모터가 널리 알려져 있다. 원핵생물 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터는 구적-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템(예를 들어, Chang et al., Nature, 275:615(1978); Goeddel et al., Nature, 281:544(1979) 참조), 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템(예를 들어, Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057(1980); EP 36,776 참조), 및 하이브리드 프로모터 예컨대 tac 프로모터(예를 들어, deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25(1983) 참조)를 포함한다. 박테리아 시스템에 사용하기 위한 프로모터는 또한 IL-22를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 함유할 것이다.
효모 숙주와 함께 사용하기에 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제(예를 들어, Hitzeman et al., J. Biol. Chem, 255:2073(1980) 참조) 또는 다른 글리콜산 효소(예를 들어, Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149(1968); Holland, Biochemistry, 17:4900(1978) 참조), 예컨대 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프룩토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글리코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
성장 조건에 의해 제어된 전사의 추가적인 이점을 갖는 유도성 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 데하이드로게나제 2, 이소사이토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 연관된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 활용을 담당하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657에 추가로 기재되어 있다.
이러한 프로모터가 숙주 세포 시스템과 호환가능하다면, 포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 IL-22 전사는 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스(1989년 7월 5일 공개된 UK 2,211,504), 아데노바이러스(예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 유인원 바이러스 40(SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 수득된 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 및 열-충격 프로모터에 의해 제어된다.
고등 진핵생물에 의해 IL-22 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 보통 10 내지 300 bp의 DNA의 시스-작용 요소이며, 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용한다. 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자(글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질, 및 인슐린)로부터 현재 알려져 있다. 그러나, 전형적으로 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 예는 복제 기원의 말기 측(bp 100-270) 상에 있는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 말기 측 상에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 인핸서는 IL-22 코딩 서열의 위치 5' 또는 3'에서 벡터 내로 스플라이싱될 수 있지만, 바람직하게는 프로모터로부터 위치 5'에 위치한다.
진핵생물 숙주 세포(효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간, 또는 다른 다세포 유기체로부터의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 또한 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 진핵생물 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때때로 3' 비번역된 영역으로부터 통상적으로 이용가능하다. 이들 영역은 IL-22를 암호화하는 mRNA의 비번역된 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사된 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다.
재조합 척추동물 세포 배양물에서 IL-22의 합성에 적응하기에 적합한 또 다른 방법, 벡터, 및 숙주 세포는 Gething et al., Nature, 293:620-625(1981); Mantei et al., Nature, 281:4046(1979); EP 117,060; 및 EP 117,058에 기재되어 있다.
유전자 증폭 및/또는 발현은 예를 들어, 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하는 노던 블롯팅(예를 들어, Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205(1980) 참조), 도트 블롯팅(DNA 분석), 또는 본원에 제공된 서열에 기초하여 적절하게 표지된 프로브를 사용하는 인-시츄 혼성화법(in situ hybridization)에 의해 직접적으로 샘플에서 측정된다. 대안적으로, DNA 듀플렉스, RNA 듀플렉스, 및 DNA-RNA 하이브리드 듀플렉스 또는 DNA-단백질 듀플렉스를 포함하는 특이적 듀프렉스를 인식할 수 있는 항체가 이용될 수 있다. 항체는 결국 표지될 수 있고 듀플렉스가 표면에 결합되어 표면 상에 듀플렉스의 형성 시, 듀플렉스에 결합된 항체의 존재를 검출하도록 검정이 수행될 수 있다.
대안적으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학 염색 및 세포 배양액 또는 체액의 검정과 같은 면역학적 방법에 의해 측정되어, 유전자 생성물의 발현을 직접적으로 정량할 수 있다. 샘플 유체의 면역조직화학 염색 및/또는 검정에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조될 수 있다. 편리하게, 천연 서열 IL-22 폴리펩티드 또는 본원에 제공된 DNA 서열에 기초한 합성 펩티드 또는 IL-22 DNA에 융합되고 특이적 항체 에피토프를 암호화하는 외인성 서열에 대하여 항체가 제조될 수 있다.
IL-22의 형태는 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수 있다. 막-결합된 경우, 적합한 세제 용액(예를 들어 TRITON® X-100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 방출될 수 있다. IL-22의 발현에 이용되는 세포는 동결-해동 사이클링, 초음파처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 IL-22를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 하기 절차는 적합한 정제 절차의 예시이다: 이온-교환 칼럼 상에서 분별; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 DEAE와 같은 양이온-교환 수지 상에서 크로마토그래피; 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 암모늄 술페이트 침전; 예를 들어, Sephadex G-75를 사용한 겔 여과; IgG와 같은 오염물을 제거하는 단백질 A 세파로즈 칼럼; 및 IL-22 폴리펩티드의 에피토프-태깅된 형태에 결합하는 금속 킬레이트 칼럼. 다양한 단백질 정제 방법이 이용될 수 있고 이러한 방법은 당업계에 알려져 있으며 예를 들어 Deutscher, Methods in Enzymology, 182(1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York(1982)에 기재되어 있다. 선택된 정제 단계(들)는 예를 들어, 사용되는 생산 공정의 특성 및 생산되는 특정한 IL-22에 따라 달라질 것이다. 상기 기재된 일반적인 방법은 또한 IL-2 Fc 융합 단백질의 제조에 적용될 수 있다.
유사하게, IL-22 Fc 융합 단백질은 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) 및 PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Innis, et al. 1990. Academic Press, San Diego, CA)에 기재된 바와 같이, 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 단리된 핵산이 제공된다. 추가의 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가의 구현예에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 이러한 일 구현예에서, 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들어 형질전환되었다). 특정 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 진핵생물, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 림프 세포(예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 일 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 상기 방법은 상기 제공된 바와 같이, IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 배양하고, 임의적으로 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 Fc 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.
IL-22 Fc 융합 단백질의 재조합 생산을 위해, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산이 단리되고 숙주 세포에서 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 사용하여(예를 들어, 융합 단백질을 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다. 특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질을 제조할 때, IL-22 폴리펩티드 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 불변 도메인 상의 명시된 위치에서 면역글로불린 불변 도메인 서열을 암호화하는 핵산에 결찰되어 IL-22의 C-말단에서 Fc 융합을 초래할 수 있지만; N-말단 융합이 또한 가능하다.
IL-22 Fc 융합 단백질을 구축하는 예로서, IL-22를 암호화하는 DNA는 IL-22를 암호화하는 DNA의 3' 단부 또는 근처에서 및 성숙 폴리펩티드의 N-말단 단부를 암호화하는 DNA 또는 근처의 지점에서(상이한 리더의 사용이 고려되는 경우) 또는 IL-22 전장 단백질에 대한 N-말단 코딩 영역 또는 근처에서(천연 서열이 이용되는 경우) 제한 효소에 의해 절단된다. 이후 이 DNA 단편은 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA 내로 용이하게 삽입되고, 필요한 경우, 결실 돌연변이유발에 의해 조정된다. 바람직하게는, 이는 융합 단백질이 인간에 대한 생체내 요법을 위해 의도될 때 인간 면역글로불린이다.
일부 구현예에서, IL-22-면역글로불린 키메라는 단량체, 이종- 또는 동종-다량체로서, 또는 이량체 또는 사량체로서 어셈블리된다. 일반적으로, 이들 어셈블리된 면역글로불린은 하기 다이어그램에 의해 나타낸 바와 같이 알려진 단위 구조를 가질 것이다. 기본적인 4개의 쇄 구조 단위는 IgG, IgD, 및 IgE가 존재하는 형태이다. 4개의 쇄 단위는 고 분자량 면역글로불린에서 반복되고; IgM은 일반적으로 디술피드 결합에 의해 함께 유지되는 기본적인 4-쇄 단위의 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 및 때때로 IgG 글로불린은 또한 혈청에서 다량체 형태로 존재할 수 있다. 다량체의 경우, 각각의 4개의 쇄 단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 또한 Capon 등의 미국 특허 번호 제5,116,964호를 참조하며, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA는 알려져 있거나 cDNA 라이브러리로부터 용이하게 이용가능하거나 또는 합성된다. 예를 들어, Adams et al., Biochemistry 19:2711-2719(1980); Gough et al., Biochemistry 19:2702-2710(1980); Dolby et al; P.N.A.S. USA, 77:6027-6031(1980); Rice et al P.N.A.S USA 79:7862-7865(1982); Falkner et al; Nature 298:286-288(1982); 및 Morrison et al; Ann. Rev. Immunol. 2:239-256(1984) 참조. 내인성 리더 서열을 갖는 인간 IL-22를 암호화하는 DNA 서열이 본원에 제공된다(서열번호: 70). 알려져 있거나 또는 cDNA 라이브러리로부터 용이하게 이용가능한 다른 바람직한 결합 파트너를 암호화하는 DNA 서열이 본 발명의 실시에 적합하다.　
본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 DNA는 발현을 위해 숙주 세포 내로 형질감염된다. 다량체가 바람직하다면 숙주 세포는 다량체를 구성할 각각의 쇄를 암호화하는 DNA로 형질전환되며, 숙주 세포는 바람직한 방식으로 다량체의 쇄를 어셈블리할 수 있도록 최적으로 선택된다. 숙주 세포가 형질감염 전에 면역글로불린을 생성한다면, 이종항체를 생성하기 위해 경쇄 또는 중쇄에 융합된 결합 파트너로의 형질감염만이 필요하다. 결합 파트너 도메인을 보유하는 하나 이상의 아암 및 동행 가변 영역을 보유하는 하나 이상의 아암을 갖는 상기 언급된 면역글로불린은 결합 파트너 리간드 및 항원 또는 치료 모이어티에 대한 이중 특이성을 초래한다. 다중 공동형질전환된 세포는 상기 기재된 재조합 방법과 함께 사용되어 상기 논의된 이종사량체 면역글로불린과 같은 다중 특이성을 갖는 폴리펩티드를 생성한다.
면역글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 면역부착소에 요구되지 않지만, 면역글로불린 경쇄는 IL-22-면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유적으로 회합되어 존재할 수 있다. 이 경우, 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA는 전형적으로 IL-22-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 암호화하는 DNA와 공동-발현된다. 분비 시, 하이브리드 중쇄 및 경쇄는 공유적으로 회합되어 2개의 디술피드-연결된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 면역글로불린-유사 구조를 제공할 것이다. 이러한 구조의 제조에 적합한 방법은 예를 들어, 1989년 3월 28일 허여된 미국 특허 번호 제4,816,567호에 개시되어 있다. 표적 단백질-암호화 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질은 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않거나 또는 해로울 때 박테리아에서 생성될 수 있다. 박테리아에서 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,648,237호, 제5,789,199호, 및 제5,840,523호 참조. 또한 이. 콜라이에서 항체 단편의 발현을 기재하는 Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254 참조. 발현 후, Fc 융합 단백질은 박테리아 세포 페이스트로부터 가용성 분획으로 단리될 수 있고 추가로 정제될 수 있다. 실시예 섹션에 예시된 바와 같이, 추가의 정제 방법은 비제한적으로 단백질 A 칼럼을 사용한 정제를 포함한다.
원핵생물 이외에도, 사상성 진균 또는 효모와 같은 진핵생물 미생물은 글리코실화 경로가 "인간화"된 진균 및 효모 균주를 포함하는 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이며, 부분적으로 또는 완전히 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산을 초래한다. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414(2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215(2006) 참조.
글리코실화된 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 많은 배큘로바이러스 균주가 확인되었다.
식물 세포 배양물이 또한 숙주로서 활용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,959,177호; 제6,040,498호; 제6,420,548호; 제7,125,978호; 및 제6,417,429호(형질전환 식물에서 항체를 생성하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술 기재) 참조.
척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통(COS-7); 인간 배아 신장 계통(예를 들어, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59(1977)에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포(BHK); 마우스 세르톨리 세포(예를 들어, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251(1980)에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포(CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포(HELA); 개 신장 세포(MDCK; 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A); 인간 폐 세포(W138); 인간 간 세포(Hep G2); 마우스 유선 종양(MMT 060562); 예를 들어, Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68(1982)에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216(1980))를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 Y0, NS0 및 Sp2/0과 같은 골수종 세포주를 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248(B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) 참조.
C. 검정
본원에 제공된 IL-22 Fc 융합 단백질은 당업계에 알려진 다양한 검정에 의해 그들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 특징화될 수 있다.
1. 결합 검정 및 다른 검정
일 측면에서, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯팅 분석, 스캐차드(Scatchard)에 의한 세포 표면 결합, 표면 플라즈몬 공명과 같은 알려진 방법에 의해 그의 수용체 결합 활성에 대해 시험된다. 또 다른 측면에서, IL-22 수용체에 결합하기 위해 IL-22 Fc 융합 단백질과 경쟁하는 항체를 확인하는데 경쟁 검정이 사용될 수 있다. 추가의 측면에서, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 생물학적 샘플에 존재하는 IL-22 수용체 또는 IL-22 결합 단백질(가용성 수용체)의 존재 또는 양을 검출하는데 사용될 수 있다. 추가의 측면에서, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 생물학적 샘플에 존재하는 IL-22 수용체의 존재 또는 양을 검출하는데 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, 생물학적 샘플은 먼저 샘플에서 임의의 Fc 수용체를 포화시키기 위해 비-특이적 이소형 대조군 항체로 차단된다.
2. 활성 검정
일 측면에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 생물학적 활성을 확인하기 위한 검정이 제공된다. IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질의 생물학적 활성은 예를 들어, IL-22 수용체에 결합, IL-22 신호전달 자극, 및 STAT3, RegIII 및/또는 PancrePAP 발현 유도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 검정은 실시예 2에 기재된 바와 같은 효능 검정(예를 들어, 수용체 결합 검정, 세포-기반 효능 검정, 또는 생체내 검정)이다. 일부 구현예에서, 효능은 참조 IL-22 Fc 융합 단백질, 예를 들어 표 12 및/또는 표 13에 제시된 N-글리칸 분포를 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질과 비교된다. 추가로, 심혈관 질환 또는 상태의 경우, 생물학적 활성은 죽상경화 플라크의 형성에 영향을 미치며, 특히 죽상경화 플라크 형성의 형성을 억제하는 것을 포함할 수 있다. 플라크 형성의 억제는 당업자에게 알려진 임의의 적합한 영상화 방법에 의해 평가될 수 있다.
D. 접합체
본 발명은 또한 검출, 제형, 반감기 연장, 면역원성 완화 또는 조직 침투를 위한 하나 이상의 제제에 접합된 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 접합체를 제공한다. 예시적인 접합은 비제한적으로 페길화(PEGylation) 및 방사성 동위원소에 부착을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함한다. 방사성접합체의 생산을 위해 다양한 방사성 동위원소가 이용가능하다. 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성접합체가 검출을 위해 사용될 때, 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 요오드-123 원상태, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철과 같은 핵 자기 공명(NMR) 영상화(또한 자기 공명 영상화, mri로도 알려짐)를 위한 스핀 라벨을 포함할 수 있다.
E. 약제학적 제형
본원의 조성물(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물)은 우수한 의학적 실시와 일치하는 방식으로 제형화, 투약, 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려할 요인은 치료되는 특정한 장애, 치료되는 특정한 포유동물, 개체 대상체의 임상 상태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 알려진 다른 요인을 포함한다. 일 구현예에서, 조성물은 질환 또는 상태 질환에 걸리기 쉽거나 또는 이로 진단된 인간 대상체의 생존 지속기간을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 생존 지속기간은 약물의 첫 투여부터 사망까지의 시간으로 정의된다.
약제학적 제형은 바람직한 순도를 갖는 활성 구성요소를 동결건조된 제형 또는 수성 용액 형태의 하나 이상의 임의적인 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합함으로써(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980) 및 Remington's Pharmaceutical Sciences 20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa) 당업계에 알려진 표준 방법을 사용하여 제조된다. 약제학적으로 허용되는 담체는 일반적으로 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 산화방지제; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레솔); 저 분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 금속 복합체(예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본원의 예시적인 약제학적으로 허용되는 담체는 사이질 약물 분산제 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질(sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20(HYLENEX®, Baxter International, Inc.)을 추가로 포함한다.　 rHuPH20을 포함한 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다.　 일 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가적인 글리코사미노글리카나제 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
임의적으로, 제형은 약제학적으로 허용되는 염, 바람직하게는 나트륨 클로라이드를 바람직하게는 약 생리학적 농도로 함유한다.
임의적으로, 본 발명의 제형은 약제학적으로 허용되는 보존제를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서 보존제 농도는 0.1 내지 2.0%, 전형적으로 v/v 범위이다. 적합한 보존제는 약제학적 분야에 알려진 것들을 포함한다. 벤질 알코올, 페놀, m-크레솔, 메틸파라벤, 벤즈알코늄 클로라이드 및 프로필파라벤이 바람직한 보존제이다. 임의적으로, 본 발명의 제형은 0.005 내지 0.02%의 농도로 약제학적으로 허용되는 계면활성제를 포함할 수 있다.
본원의 제형은 또한 치료되는 특정한 적응증에 대해 필요에 따라 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
예시적인 동결건조된 제형은 미국 특허 번호 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 제형은 미국 특허 번호 제6,171,586호 및 WO2006/044908에 기재된 것들을 포함하며, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원의 제형은 또한 치료되는 특정한 적응증에 대해 필요에 따라 하나 초과의 활성 구성요소, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 스테로이드, TNF 길항제 또는 다른 항-염증 치료제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 활성 구성요소는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다.
활성 구성요소는 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자, 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서 예를 들어, 액적형성 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.(1980)에 개시되어 있다.
서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적합한 예는 IL-22 Fc 융합 단백질을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국 특허 번호 제3,773,919호), L-글루탐산 및 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌 -비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체 예컨대 LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주입가능한 미소구체), 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정 하이드로겔은 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 항체가 장기간 체내에 남아있을 때, 이들은 37℃에서 수분에 노출된 결과로 변성 또는 응집되어, 생물학적 활성의 상실 및 면역원성의 변화 가능성을 초래할 수 있다. 수반되는 메카니즘에 따라 안정화를 위한 합리적인 전략이 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 술피드릴 잔기 변형, 산성 용액으로부터 동결건조, 수분 함량 제어, 적절한 첨가제 사용, 및 특이적 중합체 매트릭스 조성물 개발에 의해 안정화가 달성될 수 있다.
국소 투여를 위한 약제학적 조성물은 예를 들어, 국소 겔의 형태로 제형화될 수 있다. 예를 들어, US 4,717,717; US 5,130,298; US 5,427,778; US 5,457,093; US 5,705,485; US 6,331,309; 및 WO2006/138,468 참조. 특정한 구현예에서, 조성물은 셀룰로스 유도체의 존재 하에 제형화될 수 있다. 특정한 다른 구현예에서, 국소 제형은 투여 전에 충분한 완충제 또는 희석제를 사용하여 동결건조된 제형으로부터 재구성될 수 있다. 특정한 구현예에서, IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 상피 상처 치유에 결함이 있는 대상체에 국소 투여하기 위해 제형화된다. 특정한 특정 구현예에서, 상피 상처 치유는 피부에서 발생한다. 특정 다른 특정한 구현예에서, 대상체는 상처 치유에 결함이 있는 인간이다. 특정한 다른 구현예에서, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 국소 제형은 내부 또는 외부 수술 절개 후 상처 치유를 개선시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 상처 치유를 가속화, 촉진 또는 개선시키는데 사용하기 위한 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 국소 겔의 제형, 예를 들어, 미리 채워진 주사기 또는 용기에 있거나, 또는 대안적으로, 본 발명의 화합물은 환자에게 국소 투여 직전에 겔 매트릭스와 혼합될 수 있다. 특정한 구현예에서, 추가적인 치료제는 또한 동시에 또는 순차적으로 국소로 투여된다. 예를 들어, 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 척추강내, 경구, 및 비강내 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 적합한 수단에 의해 투여되는 다른 투여 경로가 임의적으로 사용될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다.
전형적으로 상처 치유를 위해, IL-22 Fc 융합 단백질은 부위-특이적 전달을 위해 제형화된다. 국소로 적용될 때, IL-22 Fc 융합 단백질은 담체 및/또는 애주번트(adjuvant)와 같은 다른 구성요소와 적절히 조합된다. 이들이 약제학적으로 허용되고 의도된 투여에 효과적이어야 하고, 조성물의 활성 구성요소의 활성을 저하시킬 수 없다는 점을 제외하고, 이러한 다른 구성요소의 특성에는 제한이 없다. 적합한 비히클의 예는 정제된 콜라겐이 있거나 없는, 연고, 크림, 겔, 스프레이, 또는 현탁액을 포함한다. 조성물은 또한 임의적으로 액체 또는 반액체 형태로 멸균 드레싱, 경피 패치, 깁스, 및 붕대 내에 함침될 수 있다. 산화된 재생 셀룰로스/콜라겐 매트릭스, 예를 들어, PROMOGRAN 매트릭스 상처 드레싱 또는 PROMOGRAN PRISMA MATRIX가 또한 사용될 수 있다.
겔 제형을 수득하기 위해, 액체 조성물로 제형화된 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질은 유효량의 수용성 폴리사카라이드 또는 합성 중합체와 혼합되어 국소로 적용되기에 적절한 점도의 제형을 형성하기 위해 폴리에틸렌 글리콜과 같은 겔(예를 들어, 겔화제)을 형성할 수 있다. 사용될 수 있는 폴리사카라이드 또는 겔화제는 예를 들어, 알킬 셀룰로스, 하이드록시알킬 셀룰로스, 및 알킬하이드록시알킬 셀룰로스, 예를 들어, 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 및 하이드록시프로필 셀룰로스를 포함하는 에테르화된 셀룰로스 유도체와 같은 셀룰로스 유도체; 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스; POE-POP 블록 공중합체: 다양한 등급의 폴록사머 USP; 히알루론산; 폴리아크릴산 예컨대 카르보폴 940; 전분 및 분별화된 전분; 한천; 알긴산 및 알기네이트; 아라비아 검; 풀룰란; 아가로스; 카라기난; 덱스트란; 덱스트린; 프룩탄; 이눌린; 만난; 크실란; 아라비난; 키토산; 글리코겐; 글루칸; 및 합성 생체고분자; 뿐만 아니라 검 예컨대 잔탄 검; 구아 검; 메뚜기 콩 검; 아라비아 검; 트라가칸트 검; 및 카라야 검; 및 이의 유도체, 조합 및 혼합물을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본원의 겔화제는 예를 들어, 생물학적 시스템에 불활성이고/이거나, 무독성이고/이거나, 제조가 용이하고/하거나, 너무 묽거나 끈적거리지 않는 것이며, 그 안에 보유하고 있는 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합을 불안정하게 하지 않을 것이다.
본 발명의 특정한 구현예에서, 폴리사카라이드는 에테르화된 셀룰로스 유도체, 또 다른 구현예에서 USP에서 널리 정의되고, 정제되고, 열거된 것, 예를 들어, 메틸셀룰로스 및 하이드록시알킬 셀룰로스 유도체, 예컨대 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 및 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(모두 셀룰로스제로 지칭됨)이다. 일부 구현예에서, 폴리사카라이드는 하이드록시에틸 메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스이다.
겔화에 유용한 폴리에틸렌 글리콜은 전형적으로 적절한 점도를 수득하기 위한 저 및 고 분자량 폴리에틸렌 글리콜의 혼합물이다. 예를 들어, 분자량 400-600의 폴리에틸렌 글리콜과 분자량 1500인 것의 혼합물은 페이스트를 수득하기 위해 적절한 비율로 혼합될 때 이 목적에 효과적일 것이다.
폴리사카라이드 및 폴리에틸렌 글리콜에 적용되는 용어 "수용성"은 콜로이드성 용액 및 분산액을 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로, 셀룰로스 유도체의 용해도는 에테르 기의 치환 정도에 의해 결정되고, 본원에 유용한 안정화 유도체는 유도체를 수용성으로 만들기 위해 셀룰로스 쇄 내 무수글루코스 단위 당 이러한 에테르 기를 충분한 양으로 가져야 한다. 무수글루코스 단위 당 적어도 0.35 에테르 기의 에테르 치환 정도가 일반적으로 충분하다. 추가적으로, 셀룰로스 유도체는 알칼리 금속 염, 예를 들어, Li, Na, K, 또는 Cs 염의 형태일 수 있다.
특정한 구현예에서, 메틸셀룰로스는 겔에 이용되며, 예를 들어, 겔의 약 1-5%, 또는 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 또는 약 5%를 포함하고 IL-22 Fc 융합 단백질은 겔 ml 당 약 50-2000 μg, 100-2000 μg, 또는 100-1000 μg의 양으로 존재한다. 특정한 구현예에서, 국소 투여에 의해 상처 치유를 위한 IL-22 Fc 융합 단백질의 유효량은 상처 면적 cm 2 당 약 25 μg 내지 약 500 μg, 약 50 μg 내지 약 300 μg, 약 100 μg 내지 약 250 μg, 약 50 μg 내지 약 250 μg, 약 50 μg 내지 약 150 μg, 약 75 μg, 약 100 μg, 약 125 μg, 약 150 μg, 약 175 μg, 약 200 μg, 약 225 μg, 약 250 μg, 약 300 μg, 또는 약 350 μg일 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균된다. 멸균은 예를 들어, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
본 발명은 IL-22 Fc 융합 단백질-기반 치료를 위한 투여량을 제공한다. 예를 들어, 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어, 하나 이상의 개별 투여에 의해서든 또는 연속 주입에 의해서든, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어 0.1-20 mg/kg)의 폴리펩티드가 대상체에 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 요인에 따라, 약 1μ.g/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸쳐 반복되는 투여의 경우, 상태에 따라, 치료는 질환 증상의 바람직한 억제가 발생할 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여량 레지멘이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 폴리펩티드의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 조합하여 사용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 폴리펩티드의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 폴리펩티드가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지, 이전 요법, 대상체의 임상 이력 및 폴리펩티드에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따를 것이다. 폴리펩티드는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어, 하나 이상의 개별 투여에 의해서든 또는 연속 주입에 의해서든, 약 1 μg/kg 내지 20 mg/kg(예를 들어 0.1mg/kg-15mg/kg)의 폴리펩티드가 대상체에 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 요인에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸쳐 반복되는 투여의 경우, 상태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 바람직한 억제가 발생할 때까지 지속될 수 있다. 폴리펩티드의 하나의 예시적인 투여랑은 약 0.05 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 범위일 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 20 mg/kg(또는 이의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 대상체에 투여될 수 있다. 특정한 구현예에서, 약 0.5 mg/kg, 1.0 mg.kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5.0 mg/kg, 6.0 mg/kg, 7.0 mg/kg, 8.0 mg/kg, 9.0 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 또는 20 mg/kg(또는 이의 임의의 조합)이 대상체에 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주, 2주마다, 또는 3주마다(예를 들어 대상체가 폴리펩티드를 약 2 내지 약 12 회, 또는 예를 들어 약 6 회 용량으로 받도록) 투여될 수 있다. 초기에 더 높은 로딩 용량, 이어서 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 예시적인 투약 레지멘은 약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량, 이어서 약 2 mg/kg의 항체의 주별 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여량 레지멘이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
심혈관 질환 또는 상태, 대사 증후군, 급성 내독소혈증 또는 패혈증, GVHD, 또는 당뇨병의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 화합물은 전형적으로 정맥내 주사에 의해 투여된다.
다른 투여 방법이 또한 사용될 수 있으며, 국소, 비경구, 정맥내, 피하, 복강내, 폐내, 비강내, 안구내, 안내, 유리체내, 병변내, 뇌척수내, 관절내, 활액내, 척추강내, 경구, 또는 흡입 투여를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 본원에 기재된 화합물은 알려진 방법에 따라, 예컨대 볼루스로서 정맥내 투여 또는 일정 기간에 걸쳐 연속 주입에 의해 인간 대상체에 투여된다.
F. 치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 IL-22 Fc 융합 단백질 및 이의 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)은 치료 방법에 사용될 수 있다.
a) 염증성 장 질환
일 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질이 제공된다. 추가의 측면에서, UC 및 CD를 포함하는 IBD를 치료하는데 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질이 제공된다. 특정한 구현예에서, 치료 방법에 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질이 제공된다. 특정한 구현예에서, 본 발명은 유효량의 IL-22 Fc 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 UC 또는 CD를 갖는 개체을 치료하는 방법에 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 이러한 일 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기 기재된 바와 같이, 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 본 발명은 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 향상시키는데 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 특정한 특정 구현예에서, 상피 조직은 장내 상피 조직이다. 특정한 구현예에서, 본 발명은 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 향상시키기 위해 유효량의 IL-22 Fc 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 향상시키는 방법에 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 당뇨병, 특히 II형 당뇨병, 당뇨병성 상처 치유, 대사 증후군 및 죽상동맥경화증을 치료하는데 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 특정한 구현예에서, 본 발명은 유효량의 IL-22 Fc 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 당뇨병, 특히 II형 당뇨병, 당뇨병성 상처 치유, 대사 증후군 및 죽상동맥경화증을 치료하는 방법에 사용하기 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 제공한다. 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2014/145016를 참조하며, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 임의의 상기 구현예에 따른 "개체" 또는 "대상체" 또는 "환자"는 바람직하게는 인간이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 의약의 제조 또는 조제에서 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질의 용도를 제공한다. 일 구현예에서, 의약은 IBD 및 상처 치유의 치료를 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 의약은 유효량의 의약을 IBD를 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 IBD 및 상처 치유를 치료하는 방법에 사용하기 위한 것이다. 이러한 일 구현예에서, 상기 방법은 예를 들어, 하기 기재된 바와 같이, 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 구현예에서, 의약은 장 상피 세포에서 염증 반응을 억제하기 위한 것이다. 추가의 구현예에서, 의약은 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 향상시키기 위해 유효량의 의약을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 향상시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 구현예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 UC 및 CD를 포함하는 IBD를 치료하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 IBD를 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이러한 일 구현예에서, 상기 방법은 하기 기재된 바와 같이, 유효량의 적어도 하나의 추가적인 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 상기 구현예에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 개체에서 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 향상시키는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 상피 증식, 분화 및/또는 이동을 향상시키기 위해 유효량의 IL-22 폴리펩티드 또는 IL-22 Fc 융합 단백질을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구현예에서, "개체"는 인간이다.
b) 다른 치료 적응증
본 발명은 심혈관 질환 및 상태, 대사 증후군, 급성 내독소혈증 및 패혈증, 이식편대숙주병(GVHD), 및 당뇨병에 대한 IL-22 Fc 융합 단백질-기반 치료제를 제공한다. 주어진 질환 또는 상태의 중증도의 예방, 치료 또는 감소를 위해, 본 발명의 화합물의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같이, 치료되는 질환 또는 상태의 유형, 질환 또는 상태의 중증도 및 과정, 제제가 예방 또는 치료 목적을 위해 투여되는지, 이전 요법, 대상체의 임상 이력 및 화합물에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따를 것이다. 화합물은 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 대상체에 적절하게 투여된다. 바람직하게는, 먼저 시험관내에서, 이어서 인간에서 시험하기 전에 유용한 동물 모델에서 본 발명의 용량-반응 곡선 및 약제학적 조성믈을 결정하는 것이 바람직하다.
일 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환 또는 장애, 대사 증후군, 급성 내독소혈증 및 패혈증, GVHD, 및 인슐린-관련 장애에 대한 치료 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 치료 유효량의 IL-22 Fc 융합 단백질을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환 또는 장애, 대사 증후군, GVHD, 및 인슐린-관련 장애의 진행을 지연 또는 둔화시키는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 IL-22 Fc 융합 단백질을 질환, 상태, 또는 장애로 진단된 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 심혈관 질환 또는 장애, GVHD, 및 인슐린-관련 장애의 징후를 예방하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 IL-22 Fc 융합 단백질을 질환, 상태, 또는 장애의 위험이 있는 대상체에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 질환, 상태, 또는 장애의 징후 발달에 대하여 효과적이다. 일 측면에서, 본 발명은 GVHD의 치료 방법을 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 GVHD의 진행을 지연 또는 둔화시키는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 유효량의 IL-22 Fc 융합 단백질을 질환, 상태, 또는 장애로 진단된 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
심혈관 질환 및 상태
일 측면에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 대상체에서 심혈관 질환 또는 상태의 임상적 및/또는 조직학적 및/또는 생화학적 및/또는 병리학적 징후(증상 및 징후 둘 다 포함)의 발달, 또는 진행에 대하여 치료적, 방지적, 또는 예방적 효과를 제공한다. 일 구현예에서, 질환 또는 상태는 죽상동맥경화증이다. 일 구현예에서, 징후는 죽상경화 플라크 형성 및/또는 혈관 염증을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 심혈관 질환의 위험이 있다. 일반적으로, 위험이 있는 대상체는 이전에 본원에 기재된 바와 같은 심혈관 질환 또는 상태를 가졌거나, 또는 심혈관 질환 또는 상태에 대한 유전적 소인을 가질 것이다.
심혈관 질환 및 상태의 치료 효능은 심혈관 질환을 평가하는데 통상적으로 사용되는 다양한 평가에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 심혈관 건강이 평가될 수 있다. 심혈관 건강은 예를 들어, 혈액 검사(예를 들어, 총 콜레스테롤, LDL-C, HDL-C, 트리글리세리드, C-반응성 단백질, 피브리노겐, 호모시스테인, 공복 인슐린, 페리틴, 지단백질, 및 LPS), 혈압, 청진, 심전도, 심장 스트레스 검사, 심장 영상(예를 들어, 관상동맥 카테터삽입법, 심초음파도, 혈관내 초음파, 양전자 방출 단층촬영술, 컴퓨터 단층촬영 혈관조영술, 및 자기 공명 영상)에 의해 평가될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
대사 증후군
일 측면에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 대상체에서 대사 증후군(또는 대사 장애 또는 질환)의 임상적 및/또는 조직학적 및/또는 생화학적 및/또는 병리학적 징후(증상 및 징후 둘 다 포함)의 발달, 또는 진행에 대하여 치료적, 방지적, 또는 예방적 효과를 제공한다. 하나 이상의 구현예에서, 대상체는 대사 증후군의 위험이 있다.
대사 증후군의 치료 효능은 대사 증후군을 평가하는데 통상적으로 사용되는 다양한 평가에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 비만이 측정될 수 있다. 추가의 예로서, 고혈당증, 이상지질혈증, 인슐린 내성, 만성 지방 조직 염증, 및/또는 고혈압이 측정될 수 있다. C-반응성 단백질, IL-6, LPS, 및 플라스미노겐 활성인자 억제제 1 중 하나 이상의 수준의 감소가 측정될 수 있다. 이들 측정은 당업예에 널리 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
인슐린-관련 장애
인슐린-관련 장애의 경우, 용어 "치료"는 장애에 대한 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭하며, 여기서 목적은 표적화된 병리학적 병태 또는 장애를 예방하거나 또는 둔화시키는(줄이는) 것이다. 치료를 필요로 하는 대상은 이미 인슐린-관련 장애가 있는 대상 뿐만 아니라 이러한 장애에 걸리기 쉬운 대상 또는 장애를 예방해야 하는 대상을 포함한다.
일 측면에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 대상체에서 인슐린-관련 장애의 임상적 및/또는 조직학적 및/또는 생화학적 및/또는 병리학적 징후(증상 및 징후 둘 다 포함)의 발달, 또는 진행에 대하여 방지적 또는 예방적 효과를 제공한다. 일 구현예에서, 장애는 I형 당뇨병, II형 당뇨병, 또는 임신성 당뇨병이다. 일 구현예에서, 병리학 또는 병리학적 징후는 췌장(예를 들어, 섬 세포)에 의한 인슐린 생산이 거의 없거나 또는 없음, 인슐린 내성, 및 고혈당증 중 하나 이상을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 대상체는 인슐린-관련 장애의 위험이 있다. 일반적으로, 위험이 있는 대상체는 인슐린-관련 장애에 대한 유전적 소인을 갖거나, 섬 세포의 자가면역 파괴를 촉진하는 바이러스(예를 들어, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 콕사키바이러스, 볼거리 바이러스 또는 사이토메갈로바이러스)에 노출되었거나, 비만이거나, 전당뇨병성이거나(정상 혈당 수준보다 높음), 또는 임신성 당뇨병을 갖는다.
인슐린-관련 장애의 치료 효능은 이러한 장애를 평가하는데 통상적으로 사용되는 다양한 평가에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, I형 및 II형 당뇨병 둘 다는 하기 중 하나 이상으로 평가될 수 있다: 당화 헤모글로빈 검사(A1C), 정규 혈당 검사, 및 공복 혈당 검사. I형은 또한 혈액 내 자가항체 및/또는 소변 내 케톤에 대한 검사에 의해 평가될 수 있다. II형은 또한 경구 글루코스 내성을 검사함으로써 평가될 수 있다.
급성 내독소혈증 및 패혈증
일 측면에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 대상체에서 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다의 임상적 및/또는 조직학적 및/또는 생화학적 및/또는 병리학적 징후(증상 및 징후 둘 다 포함)의 발달, 또는 진행에 대하여 치료적, 방지적 또는 예방적 효과를 제공한다. 하나 이상의 구현예에서, 대상체는 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다의 위험이 있다.
급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다의 치료의 효능은 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다를 평가하는데 통상적으로 사용되는 다양한 평가에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, LPS 또는 염증 마커 수준의 감소가 측정될 수 있다. 이들 측정은 당업계에 널리 알려진 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다.
상처 치유
상처 치유를 측정하는 다양한 방식이 있다. 종종 선형 치수, 둘레 및 면적을 계산하기 위해 영상을 취한다. NIH에는 영상으로부터 상처 면적을 측정하게 하는 무로 프로그램인 Image J가 있다. 최종 치유 예후는 중심부를 향하는 주변부의 이동에 기초하여 초기 치유 속도로부터 외삽될 수 있다. 이는 다수의 수학적 방정식을 사용하여 수행되며, 이 중 가장 일반적인 것은 변형된 Gilman의 방정식이다. 육안 검사 외에도, 상처 치유 측정은 또한 분광 방법 또는 MRI의 도움을 받을 수 있다. 예를 들어, Dargaville et al., Biosensors Bioelectronics, 2013, 41:30-42, Tan et al., 2007, British J. Radiol. 80:939-48 참조. 치유가 느리고/부적절하면, 상처 가장자리의 생검을 취하여 감염 및 악성종양을 배제하거나 또는 결정할 수 있다. 특정한 구현예에서, 상처 치유의 가속화 또는 개선은 IL-22-치료된 상처 및 대조군 상처의 상처 봉합을 비교함으로써 평가될 수 있다. 특정한 구현예에서, 상처 치유의 가속화 또는 개선은 대조군보다 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 이상 빠르거나 또는 더 우수하다.
특정 측면에서, 본 발명은 상처에서 활성 감염, 미생물 오염 또는 집락화가 있거나 없이 상처 치유를 촉진/가속화/개선시키는 방법을 제공한다. IL-22 Fc 융합 단백질은 감염된 상처를 치료하거나 또는 감염된 상처 치유를 촉진/가속화/개선시키기 위해 사용될 수 있다. 특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 감염의 존재 하에 상처를 치료하거나, 또는 상처 치유를 촉진/가속화/개선시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 감염될 위험이 있는 미생물 오염 또는 집락화의 존재 하에 상처를 치료하거나 또는 상처 치유를 촉진/가속화/개선시키기 위해 사용될 수 있다. 추가의 구현예에서, 상처 치유 치료를 필요로 하는 환자는 당뇨병성 환자일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 상처는 당뇨병성 상처, 예를 들어, 당뇨병성 족부 궤양이다. 일부 추가의 구현예에서, 상처는 감염된 당뇨병성 상처, 예를 들어, 감염된 당뇨병성 족부 궤양이다.
본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 요법에서 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공동 투여될 수 있다. 특정한 구현예에서, 추가적인 치료제는 비제한적으로, 메토트렉세이트, TNF 억제제, TNF 길항제, 메살라진, 스테로이드, 덱사메타손, 아자티오프린, 및 이의 조합을 포함하는 염증 반응을 감소시키는 면역 억제제이다. 염증 반응을 감소시키는 적합한 추가적인 치료제는 비제한적으로, 5-아미노살리실산(5-ASA), 메르캅토퓨린(또한 6-메르캅토퓨린 또는 6-MP로도 불림), 또는 이의 조합을 포함한다. 특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합물은 IBD의 치료를 위한 염증 반응을 감소시키는 하나 이상의 추가적인 치료제(예를 들어, 5-ASA, 6-MP, 또는 TNF 길항제)와 공동 투여될 수 있다. 특정한 다른 구현예에서, IL-22 Fc 융합물은 IBD의 치료를 위한 인테그린 길항제 예컨대 에트롤리주맙과 공동 투여될 수 있다. 일 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 작용제와 조합하여 사용된다.
당뇨병성 족부 궤양의 치료와 같은 만성 상처 치유를 가속화하기 위해, IL-22 Fc 융합 단백질의 투여는 하나 이상의 추가적인 상처 치유제와 조합될 수 있다. 적합한 추가적인 상처 치유제는 비제한적으로, 성장 인자(예를 들어, EGF, FGF, IGF, PDGF, TGF, 및 VEGF), 신경 성장 인자(NGF), 혈관형성 인자(예를 들어, HGF, TNF-α, 안지오제닌, IL-8, 안지오포이에틴 1 및 2, Tie-2, 인테그린 α5, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 산화질소, 및 COX-2), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF) 패밀리의 구성원(예를 들어, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, 및 PDGF-D), 인슐린 성장 인자(IGF) 패밀리의 구성원(예를 들어, IGF-I 및 IGF-II), 형질전환 성장 인자(TGF) 패밀리의 구성원(예를 들어, TGF-α 및 TGF-β), 및 동화 산소(진공 요법)를 포함한다. 특정한 구현예에서, IL-22 Fc 융합물은 본원에 기재된 하나 이상의 추가적인 상처 치유제 및/또는 국소 투여에 사용하기에 적합한 하나 이상의 항미생물제 또는 항생제와 공동 투여될 수 있다. WO 2006/138468을 참조하며, 이의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 이러한 구현예에서, 항생제는 비제한적으로, 은 술파디아진, 즉 실바덴을 포함하는 황 항생제일 수 있다. 공동 투여된 하나 이상의 추가적인 제제는 IL-22 Fc 융합 단백질과 동시에, 교대로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
추가의 예시적인 구현예에서, 표적이 심혈관 질환 또는 상태 또는 대사 증후군의 예방 또는 치료인 경우, IL-22 Fc 융합 단백질의 투여는 하기 제제의 투여와 조합되거나 또는 보충될 수 있다: 콜레스테롤 저하제 예컨대 스타틴(예를 들어, 로바스타틴, 로수바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 프라바스타틴, 및 심바스타틴), 답즙산 결합 수지(콜레스티폴, 콜레스티라민 수크로스, 및 콜레세벨람), 에제티미브, 또는 에제티미브-심바스타틴 조합; 항혈소판제 예컨대 사이클로옥시게나제 억제제(예를 들어, 아스피린), 아데노신 디포스페이트(ADP) 수용체 억제제(예를 들어, 클로피도그렐, 프라수그렐, 티카그렐로르, 및 티클로피딘), 포스포디에스테라제 억제제(예를 들어, 실로스타졸), 당단백질 IIB/IIIA 억제제(예를 들어, 아브식시마브, 에프티피바티드, 및 티로피반), 아데노신 재흡수 억제제(예를 들어, 디피리다몰), 트롬복산 억제제(예를 들어, 트롬복산 신타제 억제제, 트롬복산 수용체 길항제, 및 테루트로반); 베타 차단제 예컨대 알프레놀롤, 부신돌롤, 카르테올롤, 카르베딜롤, 라베탈롤, 나돌롤, 옥스프레놀롤, 펜부톨롤, 핀돌롤, 프로프라놀롤, 소탈롤, 티몰롤, 두충, 아세부톨롤, 아테놀롤, 베탁솔롤, 비소프롤롤, 셀리프롤롤, 에스몰롤, 메토프롤롤, 네비볼롤, 부탁사민, ICI-118,551, 및 SR 59230A; 안지오텐신-전환 효소(ACE) 억제제 예컨대 카프토프릴, 조페노프릴, 디카르복실레이트-함유제(예를 들어, 에날라프릴, 라미프릴, 퀴나프릴, 페린도프릴, 리시노프릴, 베나제프릴, 이미다프릴, 및 조페노프릴), 포스페이트-함유제(예를 들어, 포시노프릴), 카소키닌, 락토키닌, 락토트리펩티드(예를 들어, 프로바이오틱 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus)로부터 생성되거나 또는 카제인으로부터 유래된 Val-Pro-Pro, 및 Ile-Pro-Pro); 칼슘 채널 차단제 예컨대 디하이드로피리딘(예를 들어, 암로디핀, 아라니디핀, 아젤니디핀, 바르니디핀, 베니디핀, 실니디핀, 클레비디핀, 이스라디핀, 에포니디핀, 펠로디핀, 라시디핀, 레르카니디핀, 마니디핀, 니카르디핀, 니페디핀, 닐바디핀, 니모디핀, 니솔디핀, 니트렌디핀, 및 프라니디핀), 페닐알킬아민(예를 들어, 베라파밀), 벤조티아제핀(예를 들어, 딜티아젬), 미베프라딜, 베프리딜, 플루스피릴렌, 및 펜딜린; 이뇨제 예컨대 고효능 루프 이뇨제(예를 들어, 푸로세미드, 에타크린산, 토르세미드 및 부메타니드), 티아지드(예를 들어, 하이드로클로로티아지드산), 탄산 탈수효소 억제제(예를 들어, 아세타졸아미드 및 메타졸아미드), 칼륨-보존 이뇨제(예를 들어, 알도스테론 길항제: 스피로노락톤, 및 상피 나트륨 채널 차단제: 아밀로리드 및 트리암테렌), 및 칼슘-보존 이뇨제, 및 상기 중 임의의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체.
인슐린-관련 장애 또는 대사 증후군의 경우, IL-22 Fc 융합 단백질의 투여는 다양한 치료제의 투여와 조합되거나 또는 보충될 수 있다. I형 당뇨병(인슐린-의존성 진성 당뇨병 또는 IDDM)의 경우, 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질은 정규 인슐린 대체 요법(빠른-작용 및 장기-작용 인슐린 포함), 면역억제 치료, 섬 이식 및 줄기 세포 요법 중 하나 이상과 조합될 수 있다. 일 구현예에서, 정규 인슐린 대체 요법은 비제한적으로, 정규 인슐린(예를 들어, HUMULIN R®, NOVOLIN R®), 인슐린 이소판(예를 들어, HUMULIN N®, NOVOLIN N®), 인슐린 리스프로(예를 들어, HUMALOG®), 인슐린 아스파르트(예를 들어, NOVOLOG®), 인슐린 글라르진(예를 들어, LANTUS®), 및 인슐린 디테미르(예를 들어, LEVEMIR®)를 포함한다. 다른 구현예에서, 인슐린 대체 요법은 프람린티드(SYMLIN®)를 추가로 포함한다.
II형 당뇨병(비인슐린 의존성 진성 당뇨병 또는 NIDDM) 또는 대사 증후군의 경우, 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질은 인슐린 대체 요법(상기 기재된 바와 같음), 간에 의해 글루코스 생산을 저하시키는 제제, 췌장 생산 및 인슐린 방출을 자극하는 제제, 탄수화물의 효소적 분해를 차단하는 제제, 또는 인슐린 감수성을 증가시키는 제제 중 하나 이상과 조합될 수 있다. 일 구현예에서, 글루코스 생산을 저하시키는 제제는 메트포르민(예를 들어, GLUCOPHAGE® 및 GLUMETZA®)이다. 또 다른 구현예에서, 췌장 생산 및 인슐린 방출을 자극하는 제제는 글리피지드(예를 들어, GLUCOTROL® 및 GLUCOTROL XL®), 글리부리드(예를 들어, DIABETA® 및 GLYNASE®) 또는 글리메피리드(예를 들어, AMARYL®)이다. 다른 일 구현예에서, 탄수화물의 효소적 분해를 차단하거나 또는 인슐린 감수성을 증가시키는 제제는 피오글리타존(예를 들어, Actos)이다. 또 다른 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 메트포르민에 대해 다음 대체제 중 하나와 조합될 수 있다: 시타글립틴(예를 들어, JANUVIA®), 삭사글립틴(예를 들어, ONGLYZA®), 레파글리니드(예를 들어, PRANDIN®) 및 나테글리니드(예를 들어, STARLIX®), 엑세나티드(예를 들어, BYETTA®) 및 리라글루티드(예를 들어, VICTOZA®). 또 다른 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 경구 혈당강하제, 예를 들어, 술포닐우레아와 조합될 수 있다.
임신성 당뇨병 또는 대사 증후군의 경우, 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질은 경구 혈당 제어 의약과 조합될 수 있다. 일 구현예에서, 의약은 글리부리드이다.
GVHD
일 측면에서, IL-22 Fc 융합 단백질은 GVHD의 임상적 및/또는 조직학적 및/또는 생화학적 및/또는 병리학적 징후(증상 및 징후 둘 다 포함)의 발달에 대하여 예방적 효과, 또는 상기 징후의 진행에 대하여 치료적 효과를 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 방법은 본원에 기재된 유효량의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 이의 조성물(약제학적 조성물 포함)을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 GVHD를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 이의 조성물의 투여는 통증, 발진, 피부 두께, 황색 피부 또는 눈, 구강 건조 또는 궤양, 미각 이상, 안구 건조, 감염, 또는 체중 감소를 포함하는 GVHD의 하나 이상의 증상을 감소시킬 수 있다. IL-22 Fc 융합 단백질 또는 이의 조성물은 예를 들어, 면역억제제(예를 들어, 사이클로스포린, 미코페놀레이트 모페틸 (MMF), 또는 타크롤리무스), mTOR 억제제(예를 들어, 시롤리무스 또는 에베롤리무스)), 화학요법제(예를 들어, 이마티니브, 펜토스타틴, 메토트렉세이트, 또는 탈리도미드), TNF 길항제(예를 들어, 에타네르셉트), 스테로이드(예를 들어, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 국소 스테로이드, 또는 스테로이드 점안액), 광 치료(예를 들어, 체외 광분반술), 하이드록시클로로퀸, 항섬유화제(예를 들어, 할로푸기논), 모노클로날 항체(예를 들어, 알렘투주마브, 인플릭시마브, 또는 리툭시마브), 또는 이의 조합을 포함하는 추가적인 GVHD 요법과 조합하여 투여될 수 있다.
조합 요법은 "상승효과"를 제공하고 "상승적", 즉, 함께 사용되는 활성 구성요소가 화합물을 개별적으로 사용하여 초래되는 효과의 합보다 클 때 달성되는 효과를 입증할 수 있다. 상승적 효과는 활성 구성요소가 (1) 조합된 단위 투여량 제형으로 공동 제형화되고 투여되거나 또는 동시에 전달되거나; (2) 개별 제형으로 교대로 또는 동시에 전달되거나; 또는 (3) 일부 다른 레지멘에 의할 때 수득될 수 있다. 교대 요법으로 전달될 때, 상승적 효과는 화합물이 예를 들어 개별 주사기로 상이한 주입에 의해 순차적으로 투여되거나 또는 전달될 때 수득될 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안, 각각의 활성 구성요소의 효과적인 투여량은 순차적으로, 즉, 연속적으로 투여되는 반면, 조합 요법에서, 2종 이상의 활성 구성요소의 효과적인 투여량은 함께 투여된다.
상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여(2종 이상의 치료제가 동일 또는 개별 제형에 포함된 경우), 및 개별 투여를 포함하며, 이 경우, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질의 투여는 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여 전, 동시, 및/또는 후에 발생할 수 있다. 일 구현예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로 약 1 개월 이내, 또는 약 1, 2 또는 3 주 이내, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 일 이내에 발생한다.
본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질(및 임의의 추가적인 치료제)은 비경구, 폐내, 국소 및 비강내, 및 국소 치료가 바람직한 경우 병변내 투여를 포함하여 임의의 적합한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 부분적으로 투여가 잠시인지 또는 만성인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의할 것이다. 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여, 및 펄스 주입을 포함하나 이제 제한되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질은 우수한 의료 실시와 일치하는 방식으로 제형화, 투약, 및 투여될 것이다. 이러한 맥락에서 고려되는 요인은 치료되는 특정한 장애, 치료되는 특정한 포유동물, 개체 환자의 임상 조건, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료 종사자에게 알려진 다른 요인을 포함한다. IL-22 Fc 융합 단백질은 필요하지 않지만, 임의적으로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 제제로 제형화된다. 이러한 다른 제제의 유효량은 제형에 존재하는 융합 단백질의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 요인에 따른다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 동일한 투여량 및 투여 경로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%, 또는 경험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질의 적절한 투여량(단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가적인 치료제와 조합하여 사용될 때)은 치료되는 질환의 유형, Fc 영역의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 융합 단백질이 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지, 이전 요법, 환자의 임상 이력 및 IL-22 Fc 융합 단백질에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따를 것이다. IL-22 Fc 융합 단백질은 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어, 하나 이상의 개별 투여에 의해서든 또는 연속 주입에 의해서든, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg(예를 들어, 0.1 mg/kg -10 mg/kg) 또는 약 0.1 μg/kg 내지 1.5 mg/kg(예를 들어, 0.01 mg/kg - 1 mg/kg)의 IL-22 Fc 융합 단백질이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 요인에 따라, 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 수 일 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라, 치료는 일반적으로 질환 증상의 바람직한 억제가 발생할 때까지 지속될 것이다. IL-22 Fc 융합 단백질의 하나의 예시적인 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 특정 다른 투여량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 0.02mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 및 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위를 포함한다. 따라서, 약 0.01 mg/kg, 0.02mg/kg, 0.03mg/kg, 0.04mg/kg, 0.05mg/kg, 0.06 mg/kg, 0.07mg/kg, 0.08mg/kg, 0.09mg/kg, 0.1mg/kg, 0.2mg/kg, 0.3mg/kg, 0.4mg/kg, 0.5mg/kg , 0.6mg/kg, 0.7mg/kg, 0.8mg/kg , 0.9mg/kg , 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5mg/kg, 6mg/kg, 7mg/kg, 8mg/kg, 9mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 임의의 이의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 국소 상처 치유의 경우, 약 0.001 mg/cm2 내지 약 10 mg/cm2 상처 면적, 약 0.05 mg/cm2 내지 약 5mg/cm2 상처 면적, 약 0.01 mg/cm2 내지 약 1 mg/cm2 상처 면적, 약 0.05 mg/cm2 내지 약 0.5 mg/cm2 상처 면적, 약 0.01 mg/cm2 내지 약 0.5 mg/cm2 상처 면적, 약 0.05 mg/cm2 내지 약 0.2 mg/cm2 상처 면적, 또는 약 0.1 mg/cm2 내지 약 0.5 mg/cm2 상처 면적(또는 임의의 이의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 특정한 구현예에서, 약 0.01 mg/cm2, 0.02 mg/cm2, 0.03 mg/cm2, 0.04 mg/cm2, 0.05 mg/cm2, 0.06 mg/cm2, 0.07 mg/cm2, 0.08 mg/cm2, 0.09 mg/cm2, 0.1 mg/cm2, 0.15 mg/cm2, 0.2 mg/cm2, 0.25 mg/cm2, 0.3 mg/cm2, 0.4 mg/cm2, 또는 0.5 mg/cm2 상처 면적 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다(예를 들어, 환자가 IL-22 Fc 융합 단백질을 약 2 내지 약 12 회, 또는 예를 들어 약 6 회 용량으로 받도록) 투여될 수 있다. 초기에 더 높은 로딩 용량, 이어서 하나 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투여량 레지멘이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제형 또는 치료 방법은 IL-22 Fc 융합 단백질 대신에 또는 이외에도 본 발명의 접합체를 사용하여 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
G. 제조 물품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 연관된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로 또는 상태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하고 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 뚫을 수 있는 스토퍼가 있는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본원에 제공된 IL-22 Fc 융합 단백질이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 상태를 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 더욱이, 제조 물품은 (a) 본 발명의 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물이 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물이 안에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 구현예에서 제조 물품은 조성물이 특정한 상태를 치료하는데 사용될 수 있는 것을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품은 주사용 정균수(BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 다른 완충제, 희석제, 충전제, 바늘, 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품은 IL-22 Fc 융합 단백질 대신에 또는 이외에도 본 발명의 접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 구현예가 실시될 수 있고, 실시예는 청구범위의 범위를 한정하려는 것이 아님이 이해된다.
실시예 1: IL-22 Fc 융합 단백질의 구조적 및 분자적 특성화
예시적인 IL-22 Fc 융합 단백질의 1차 구조
본 발명의 예시적인 IL-22 Fc 융합 단백질은 2개의 쇄간 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 단일-쇄 단위로 이루어진다. 각각의 단일 쇄는 인간 면역글로불린 G4(IgG4)의 Fc 영역과 융합된 시토카인 IL-22로 구성된 인간 인터류킨-22(IL-22) 융합 단백질로 이루어진다.
Fc 영역은 시토카인의 약동학 특성을 개선시킨다. 융합 단백질의 Fc 영역은 N81G 돌연변이를 포함하며(이는 시토카인 및 Fc의 전체 융합 폴리펩티드의 N-말단으로부터 넘버링될 때 N227G 돌연변이에 상응하고, EU 지수에 따른 Fc 영역의 넘버링에 대해 N297G 돌연변이에 상응함), 이는 글리코실화를 제거하여, Fc 이펙터 기능에 대한 가능성을 최소화한다. 추가적으로, 분자의 안정성을 증가시키기 위해 예를 들어, 부위-지정 돌연변이를 통해 CP P CP(서열번호: 31)의 아미노산 서열에서 굵게 표시되고 밑줄친 Pro 잔기로 나타낸 바와 같이 Ser를 Pro로 치환함으로써 변형된 힌지 영역을 생성하였다. IL-22 Fc 융합 단백질은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에 의해 생성되었으며 대략 85,131　Da의 예측된 분자 질량(Fc 상의 C-말단 리신 잔기가 없는 온전한 펩티드 쇄만)을 갖는다. 탄수화물이 없는 IL-22 시토카인의 계산된 분자 질량은 16,749.4 Da(시스테인 잔기는 환원된 형태임)이다. C-말단 리신 잔기가 없는 IgG4 Fc의 계산된 분자 질량은 25,844.3 Da(시스테인 잔기는 환원된 형태임)이다. IL-22 Fc 융합 단백질의 구조는 도 1a에 제시되어 있다. IL-22 Fc 융합 단백질의 IL-22 시토카인 및 IgG4 Fc 영역 아미노산 서열은 각각 도 1b 및 도 1c에 제시되어 있다.
특성화 시험 방법
IL-22 Fc 융합 단백질의 구조적 및 분자적 특성은 하기 생리화학적 속성에 중점을 두고 조사하였다: 1차 구조, 크기 및 전하 이질성, 등전점, 흡광 계수, N-글리칸 분포 및 시알산 함량, 고차 구조, 및 생물학적 활성. 특성화에 사용되는 시험 방법은 표 1에 열거되어 있고 본원에 기재되어 있다.
IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치　1, 2, 및 3에 대해 특성화 연구를 수행하였다. 모든 배치는 10　mg/mL IL-22 Fc 융합 단백질의 최종 공칭 농도로, 10　mM 나트륨 포스페이트, 240　mM 수크로스, 5　mM 메티오닌, 및 0.02%(w/v) 폴리소르베이트　20, pH　7.1로 제형화하였다.
표 1: 특성화 시험 방법
Figure pct00004
생리화학적 특성
질량 분석법
IL-22 Fc 융합 단백질 샘플은 PNGase　F로 탈글리코실화 후, 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP)와의 디술피드 결합의 탈글리코실화 및 환원 후 온전한 상태에서 전자분무 이온화-질량 분석법(ESI-MS)에 의해 분석하였다. 직접 온라인 MS 분석을 위한 역상 고성능 액체 크로마토그로피(RP-HPLC)에 의해 샘플을 탈염화 후 ESI-MS 분석을 수행하였다.
비환원된, 탈글리코실화된 IL-22 Fc 융합 단백질의 분석을 사용하여 온전한 IL-22 Fc 융합 단백질의 주요 종의 질량을 후 수득한 반면(도 2a), 환원된, 탈글리코실화된 IL-22 Fc 융합 단백질의 분석을 사용하여 단일 쇄 분자의 질량을 수득하였다(도 2b). IL-22 Fc 융합 단백질의 관찰된 질량은 아미노산 서열로부터 추정된 예측된 질량에 상응한다(표 2). 온전한 분자에 대해 수득된 주요 질량은 카르복시-말단 리신 잔기가 없고 N-연결된 글리칸이 없는 IL-22 Fc 융합 단백질에 대한 예측된 질량에 상응한다.
MS 분석은 분자 질량이 IL-22 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열로부터 추정된 예측된 질량에 따른다는 것을 보여준다.
표 2: 탈글리코실화된, 온전한, 및 환원된 IL-22 Fc 융합 단백질의 전자분무 이온화-질량 분석법
Figure pct00005
트립신분해 펩티드 맵
고분해능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS-MS) 분석에 의한 펩티드 맵 분석을 사용하여 예측된 1차 구조를 확인하고 펩티드 패턴의 비치-대-배치 일관성을 입증하였다. 또한, 재조합 단백질의 처리 또는 저장에 의해 야기된 아미노산 측쇄에 대한 번역후 변형, 뿐만 아니라 화학적 변형을 검출하였다.
IL-22 Fc 융합 단백질 펩티드 맵을 생성하기 위해, 단백질을 구아니디늄 하이드로클로라이드로의 변성 조건, 디티오트레이톨로의 환원, 및 요오도아세트산으로의 시스텐인의 카르복시메틸화에 적용시킨 후 단백질을 트립신으로 소화시켰다. 생성된 펩티드를 MS-MS 가능한 질량 분석계에 연결된 RP-HPLC에 의해 분리하고, 펩티드의 용리를 214　nm에서 모니터링하였다. 트립신분해 펩티드의 질량은 분리된 소화 혼합물의 LC-MS 분석에 의해 결정하였다.
펩티드 할당은 온전한 펩티드의 관찰된 질량에 기초하였다(도 3a 및 도 3b). N-연결된 탄수화물과 회합된 트립신 분해 펩티드는 그룹화된 피크로 제시된다. 펩티드의 서열 및 이들의 예측 및 관찰된 질량은 표 3 및 표 4에 참조 표준 배치에 대해 제공되어 있다. 모든 관찰된 펩티드는 통상의 번역후 변형을 포함하여 IL-22 Fc 융합 단백질의 서열을 갖는 단백질의 트립신분해 소화로부터 예상되는 펩티드와 일치하였다. 서열 변이체는 관찰되지 않았다.
표 3: IL-22 Fc 융합 단백질의 인간 IL-22 시토카인으로부터의 트립신분해 펩티드
Figure pct00006
표 3: IL-22 Fc 융합 단백질의 인간 IL-22 시토카인으로부터의 트립신분해 펩티드(계속)
Figure pct00007
표 4: IL-22 Fc 융합 단백질의 인간 면역글로불린 G4(IgG4) Fc로부터 트립신분해 펩티드
Figure pct00008
표 4: IL-22 Fc 융합 단백질의 인간 면역글로불린 G4(IgG4) Fc로부터 트립신분해 펩티드(계속)
Figure pct00009
펩티드 맵을 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 모든 임상 배치에 대해 비교하였다(도 3c 및 도 3d). 참조 표준 배치 및 모든 임상 배치의 펩티드 맵은 펩티드 패턴에 대해 일치하였으며, 이는 제조 공정의 배치-대-배치 일관성을 입증한다.
SE-HPLC
배치 방출 시험의 일부로서 크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피(SE-HPLC)를 수행하였다. 임상 배치 및 참조 표준 배치에 대한 정량적 방출 데이터는 표 5에 나란히 제시되어 있다.
표 5: SE-HPLC에 의한 IL-22 Fc 융합 단백질의 분자 크기 분포(피크 면적%)
Figure pct00010
IL-22 Fc 융합 단백질은 약 16　분의 체류 시간을 갖는 주요 피크로서 용리된다. IL-22 Fc 융합 단백질 배치에 대한 SE-HPLC 프로파일의 실치도(full-scale view) 및 확대도는 임상 배치가 피크 패턴 및 주요 피크 함량에 대해 일치하였음을 입증하였다(도 4a 및 도 4b). 또한, 확장된 특성화의 일부로서 분석적 초원심분리(AUC)를 직교 크기 이질성 방법으로 활용하였다. AUC로부터의 데이터는 다양한 수준의 응집체의 일련의 응력 샘플을 분석할 때 SE-HPLC와 밀접한 상관관계가 있다.
CE-SDS-NGS
배치 방출 시험의 일부로서 비환원된 조건 하에 모세관 전기영동 나트륨 도데실 술페이트-비-겔 체질(CE-SDS-NGS)을 수행하였다. 정량적 방출 데이터는 표 6에 나란히 제시되어 있다. 확장된 특성화로서 환원된 조건 하에 CE-SDS-NGS(디티오트레이톨의 존재 하에)를 수행하였다. 확장된 특성화 시험의 일부로서 추가적인 종을 평가하였다(표 7).
표 6: CE-SDS-NGS에 의한 비환원된 IL-22 Fc 융합 단백질의 분자 크기 분포(%CPA)
Figure pct00011
표 7: CE-SDS-NGS에 의한 환원된 IL-22 Fc 융합 단백질의 분자 크기 분포(%CPA)
Figure pct00012
비환원된 IL-22 Fc 융합 단백질은 돌출된 피크로 이동하였으며, 나머지 사소한 피크는 겉보기 저분자량 또는 고분자량을 갖는 종을 나타낸다(도 5a(실치도) 및 도 5b(확대도)). 비환원된 샘플의 CE-SDS-NGS에 의해 분리된 변이체의 상대적 분포는 표 6에 제공되어 있다. IL-22 Fc 융합 단백질 배치에 대한 CE-SDS-NGS 프로파일은 일치하는 피크 패턴 및 퍼센트 보정 피크 면적(CPA)을 제시하였다. 또한, 이 방법은 존재하는 경우 단백질 디술피드 환원을 겸출할 수 있었다.
환원된 IL-22 Fc 융합 단백질의 CE-SDS-NGS 분석으로부터의 전기영동도는 단일 쇄 분자에 상응하는 하나의 주요 피크의 존재를 제시하였다(도 5c 및 도 5d). 환원된 형태의 상대적 분포는 표 7에 열거되어 있다. IL-22 Fc 융합 단백질 배치에 대한 CE-SDS-NGS 프로파일은 일치하는 피크 패턴 및 보정된 퍼센트 CPA를 제시하였다.
SDS-PAGE 분석
SYPRO® Ruby 염색을 사용한 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석을 사용하여 IL-22 Fc 융합 단백질 로트의 순도를 평가하였다. 이 방법은 정량적이지 않지만, 사소한 단백질 불순물을 검출하는데 사용될 수 있다. 환원된(도 6a) 및 비환원된(도 6b) IL-22 Fc 융합 단백질 샘플 둘 다를 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 샘플을 SDS-PAGE 샘플 완충제의 존재 하에 가열하여 변성시켰다. 비환원된 샘플을 요오도아세트아미드의 존재 하에 5 분 동안 60℃로 가열한 반면, 환원된 샘플을 환원제(DTT)를 첨가하여 10 분 동안 60℃로 가열하였다. 모든 샘플을 5　μg으로 로딩하였다. 제조된 샘플, 분자량 표준, 및 감수성 표준(소 혈청 알부민의 레인 당 2 및 8　ng)을 4%　-　20% 폴리아크릴아미드 구배 겔 상에서 분리하였다. 이어서 단백질 성분을 SYPRO® Ruby 염색에 의해 시각화하였다.
환원된(도 6a, 레인 4-7) 및 비환원된(도 6b, 레인 4-7) 샘플 둘 다에서 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 IL-22 Fc 융합 단백질 임상 배치에 대한 일치하는 밴딩 패턴이 관찰되었다.
환원된 샘플의 경우(도 6a, 레인 4-7), 하나의 주요 밴드는 대략 50　kDa의 겉보기 질량으로 이동하였으며, 이는 IL-22 Fc 융합 단백질의 단일 쇄와 일치한다. 환원된 샘플에서 관찰된 밴딩 패턴은 또한 환원된 IL-22 Fc 융합 단백질의 CE-SDS-NGS 분석에서 관찰된 이동 패턴과 일치하였다(도 5c 및 도 5d). 겔의 모든 밴드를 잘라내고, 트립신으로 소화시키고, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형 질량 분석법(MALDI-TOF MS)에 의해 분석하였다. 트립신분해 맵 질량 분석의 결과는 겔의 모든 밴드가 관련된 생성물이었음을 나타내었다
비환원된 샘플의 경우(도 6b, 레인 4-7), 온전한 IL-22 Fc 융합 단백질은 주요 밴드이고 대략 125　kDa의 겉보기 질량으로 이동한다. 비환원된 샘플에서 관찰된 밴딩 패턴은 또한 비환원된 IL-22 Fc 융합 단백질의 CE-SDS-NGS 분석에서 관찰된 이동 패턴과 일치하였다(도 5a 및 도 5b). 겔의 모든 밴드를 잘라내고, 트립신으로 소화시키고, MALDI-TOF MS에 의해 분석하였다. 트립신분해 맵 질량 분석의 결과는 겔의 모든 밴드가 관련된 생성물이었음을 나타내었다.
ICIEF
영상화 모세관 등전점 전기영동(ICIEF)은 단백질의 전하 이질성을 정량적으로 평가하는 수단을 제공한다. CpB 처리가 있거나 또는 없는 IL-22 Fc 융합 단백질 배치를 분석하였다. CpB는 C-말단 리신 잔기를 제거하는 효소이다. C-말단 리신 잔기의 이질성은 세포 배양 작동 동안 내인성 CHO 염기성 카르복시펩티다제(들)에 의한 단백질분해의 결과인 것으로 여겨진다. C-말단 리신 잔기에 의해 부여된 전하 이질성을 제거함으로써, 단백질에 존재하는 남아있는 전하 변이체의 보다 철저한 평가가 가능하다.
배치 방출 시험의 일부로서 CpB 및 시알리다제 처리 후 ICIEF를 수행하였다. 정량적 방출 데이터는 표 8에 나라히 제시되어 있다. 또한, 확장된 특성화로서 CpB 처리가 없는 ICIEF(C-말단 리신 이질성을 갖는 천연 IL-22 Fc 융합 단백질)를 수행하였다.
표 8에 요약되어 있고 도 7a(실치도) 및 도 7b(확대도)에 제시되어 있는 CpB 처리가 없는 천연 IL-22 Fc 융합 단백질의 ICIEF 분석 결과는　배치가 C-말단 리신 전하 이질성으로 인해 가변 전하 변이체 분포를 가짐을 제시한다. 표 9에 요약되어 있고 도 7c(실치도) 및 도 7d(확대도)에 제시되어 있는 CpB-처리된 IL-22 Fc 융합 단백질의 분석 결과는 전하 변이체 분포에서 배치-대-배치 일관성을 입증하였다. CpB 처리 유무에 따라 수득된 결과의 비교는 염기성 변이체가 주로 리신 이질성에 기여한다는 것을 나타낸다(도 7e).
표 8: 천연 IL-22 Fc 융합 단백질의 ICIEF에 의한 전하 변이체의 분포(피크 면적 %)
Figure pct00013
표 9: CpB-처리된 IL-22 Fc 융합 단백질의 ICIEF에 의한 전하 변이체의 분포(피크 면적 %)
Figure pct00014
등전점
pI은 단백질이 순 전하를 갖지 않는 pH이다. 천연 IL-22 Fc 융합 단백질 pI은 시알리다제로 처리 후 ICIEF에 의해 결정하였다. 이 분석으로부터 주요 성분의 pI는 6.5인 것으로 결정하였다. ICIEF 전하 이질성 방법에서 주요 피크에 대해 관찰된 pI은 이 값과 약간 상이할 수 있는데, 전하 이질성 방법이 2개의 브라케팅(bracketing) pI 마커에 의해 보정된 pH 구배를 생성하는 좁은 범위의 양쪽성 물질(ampholyte)을 이용하기 때문이다.
흡광 계수 결정
단백질가수분해적으로 절단되고 펼쳐진 IL-22 Fc 융합 단백질의 스펙트럼을 아미노산 서열로부터 계산된 스펙트럼과 비교함으로써 IL-22 Fc 융합 단백질 용액의 단백질 농도를 결정하였다. 이 계산은 개별 아미노산의 알려진 흡광도 값에 기초하였다(Bewley et al. Analytical Biochemistry 123:55-65, 1982). 이 방법을 사용하여, IL-22 Fc 융합 단백질의 흡광 계수가 280　nm에서 0.98　mL　mg-1　cm-1인 것으로 결정되었다. 이 흡광 계수를 자외선-가시광선 분광광도계 스캔 분석에 사용하여 시험된 모든 배치에 대한 IL-22 Fc 융합 단백질 농도를 계산하였다.
N-글리코실화 부위 점유
IL-22 Fc 융합 단백질은 분자의 2개의 시토카인 도메인 각각에 4개의 N-글리코실화 부위(Asn21, Asn35, Asn64, 및 Asn143)를 함유한다. IL-22 Fc 융합 단백질의 N-글리코실화 부위 점유는 IL-22 Fc 융합 단백질의 효소적 탈글리코실화 이어서 Lys-C 펩티드 맵핑 및 LC-MS 분석에 의해 결정하였다. IL-22 Fc 융합 단백질 펩티드 맵을 생성하기 위해, 단백질을 구아니디늄 하이드로클로라이드로의 변성 조건, 디티오트레이톨로의 환원, 및 요오도아세트산으로 시스테인의 카르복시메틸화에 적용한 후 단백질을 엔도프로테이나제 Lys-C로 소화시켰다. PNGase　F 효소를 사용하여 단백질로부터 N-글리칸을 절단하였다. 생성된 펩티드를 질량 분석계에 연결된 UHPLC에 의해 분리하였다.
퍼센트 부위 점유는 탈글리코실화된 펩티드의 추출된 이온 크로마토그램의 통합된 피크 면적을 탈글리코실화된 펩티드 및 천연 펩티드의 총 피크 면적으로 나눈 값에 기초하여 계산하였다. (PNGase　F는 아스파라긴을 아스파르트산으로 전환시켜, 탈글리코실화된 펩티드에 대해 1　Da 질량 이동을 초래한다.) 펩티드의 가장 풍부한 전하 상태는 추출된 이온 크로마토그램의 계산을 위해 고려되었다.
Asn21, Asn35, Asn64, 및 Asn143의 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 표 10에 제시되어 있다. 부위 점유는 참조 표준 배치 및 임상 배치　1, 2, 및 3에 대한 4개의 N-글리코실화 부위 사이에 일치하는 것으로 제시되었다.
표 10: Lys-C 펩티드 맵핑 및 LC-MS에 의한 IL-22 Fc 융합 단백질의 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유
Figure pct00015
Asn21, Asn35, Asn64, 및 Asn143의 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유의 추가적인 특성화를 임상 배치 4, 5, 및 6에서 수행하였다. 모든 6개의 임상 배치는 일치하는 부위 점유를 입증하였다(표 11).
표 11: Lys-C 펩티드 맵핑 및 LC-MS에 의한 IL-22 Fc 융합 단백질 임상 배치 1-6의 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유
Figure pct00016
2-AA HILIC-UHPLC에 의한 N-연결된 글리칸 분석
IL-22 Fc 융합 단백질은 단일 쇄 분자 당 4개의 N-글리코실화 부위를 함유하며, 이들 모두 Asn21, Asn35, Asn64, 및 Asn143에서 분자의 시토카인 도메인에 위치한다. 부위 점유는 부위 참조 표준 배치 및 임상 배치 1, 2, 3, 4, 5, 및 6에 대한 4개의 N-글리코실화 부위 사이에 일치하는 것으로 제시되었다.
IL-22 Fc 융합 단백질의 N-연결된 글리칸의 상대적 분포는 형광 검출과 함께 HILIC-UHPLC에 의해 정량적으로 평가하였다. 이 방법의 경우, 변성 조건 하에 PNGase　F 효소를 사용하여 단백질로부터 N-글리칸을 절단하였다. 방출된 글리칸을 형광 표지 2-AA로 유도체화하고 형광 검출과 조합된 HILIC-UHPLC에 의해 분리하고 검출하였다.
IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치　1, 2, 및 3에서 관찰된 글리칸의 크로마토그램은 도 8a 및 도 8b에 제시되어 있다. IL-22 Fc 융합 단백질 배치의 상대적 N-연결된 글리칸 분포는 표 12에 제공되어 있고 도 8c에 제시되어 있다. 도 8d는 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 및 임상 배치 2, 3, 4, 5, 및 6의 상대적 N-연결된 글리칸 분포를 제공한다. N-연결된 글리칸을 속성에 따라 그룹화하였다(도 8a 및 도 8b). IL-22 Fc 융합 단백질 임상 배치에 대한 글리코실화 패턴 및 글리코실화 속성의 일관성이 입증되었다. 모든 6개의 임상 배치는 퍼센트(%) 피크 면적으로 나타낸 것과 유사한 분포를 제시하였다(표 13). 이들 확장된 특성화 분석 결과는 IL-22 Fc 융합 단백질 배치가 일치하는 글리칸 프로파일을 가짐을 입증하였다.
또한, 확장된 특성화의 일부로서 갈락토스-알파-1,3-갈락토스에 대한 분석을 또한 수행하였다. 갈락토스-알파-1,3-갈락토스는 고성능 음이온-교환 크로마토그래피-펄스 전류측정 검출(HPAEC-PAD)에 의해 정량적으로 평가하였다. 이 방법을 사용하여 갈락토스-알파-1,3-갈락토스는 참조 표준 배치 및 임상 배치에서 검출되지 않았다.
표 12: 2-AA HILIC-UHPLC에 의한 IL-22 Fc 융합 단백질의 상대적 N-글리칸 분포(피크 면적 %)
Figure pct00017
표 12: 2-AA HILIC-UHPLC에 의한 IL-22 Fc 융합 단백질의 상대적 N-글리칸 분포(피크 면적 %)(계속)
Figure pct00018
표 12: 2-AA HILIC-UHPLC에 의한 IL-22 Fc 융합 단백질의 상대적 N-글리칸 분포(피크 면적 %)(계속)
Figure pct00019
표 13: 2-AA HILIC UHPLC에 의한 IL-22 Fc 융합 단백질 임상 배치 1-6의 상대적 N-글리칸 분포
Figure pct00020
Figure pct00021
부위-특이적 N-글리코실화
IL-22 Fc 융합 단백질의 시토카인 도메인에서 Asn21 N-글리코실화 부위는 IL-22 수용체와의 상호작용 계면 또는 근처에 위치한다(Jones et al. Structure 16:1333-44, 2008; Logsdon et al. J Mol. Biol. 342(2):503-14, 2004).
부위 Asn21에서 N-연결된 글리칸의 상대적 분포는 Lys-C 펩티드 맵핑 및 LC-MS 분석에 의해 결정하였다. IL-22 Fc 융합 단백질 펩티드 맵을 생성하기 위해, 단백질을 구아니디늄 하이드로클로라이드로의 변성 조건, 디티오트레이톨로의 환원, 및 요오도아세트산으로 시스테인의 카르복시메틸화에 적용한 후 상기 단백질을 엔도프로네이나제 Lys-C로 소화시켰다. 생성된 펩티드를 질량 분석계에 연결된 UHPLC로 분리하였다.
LC-MS 방법에 의한 Lys-C 펩티드 맵핑은 주어진 N-글리코실화 부위에서 N-연결된 글리칸의 확인 및 상대적 풍부화에 관한 정보를 제공한다. IL-22 Fc 융합 단백질에서 많은 글리코펩티드의 이온화 효율의 잠재적 차이로 인해, 상대적 정량화를 사용하여 배치 사이의 글리코펩티드 풍부도를 비교하였다. Asn21에 대한 상대적 N-연결된 글리칸 분포는 도 9에 제시되어 있다. 선택된 주요 글리코실화 속성에 따라 N-연결된 글리칸을 그룹화하였다. IL-22 Fc 융합 단백질 임상 배치에 대한 Asn21에서의 글리코실화 패턴 및 글리코실화 속성의 일관성이 입증되었다.
NANA 함량에 대한 시알산 분석
시알산 RP-HPLC 방법을 사용하여 N-아세틸뉴라민산(NANA) 함량을 결정하고 배치 방출 시험의 일부로서 수행하였다. 임상 배치 및 참조 표준 배치에 대한 정량적 방출 데이터는 표 14에 나란히 제시되어 있다. 시알산 분석 결과는 배치가 IL-22 Fc 융합 단백질 방출 사양(8　-　12　몰 NANA/몰 IL-22 Fc 융합 단백질) 내에서 일치하는 NANA 함량을 가졌음을 입증하였다. 또한, 확장된 특성화의 일부로서 N-글리콜릴뉴라민산(NGNA)에 대한 분석을 수행하였다. NGNA의 양은 참조 표준 배치 및 임상 배치 사이에서 일관되게 낮게 유지되었다(표 14).
표 14: RP HPLC에 의한 IL-22 Fc 융합 단백질의 N-아세틸뉴라민산 및 N-글리콜릴뉴라민산 함량
Figure pct00022
구조적 특성화
디술피드 결합은 단백질의 고차 구조에 기여한다. 공통 서열로부터, 시토카인에서 2개(Cys7　-　Cys99 및 Cys56　-　Cys145) 및 Fc에서 2개(Cys45　-　Cys105 및 Cys151　-　Cys209)를 갖는 단일 쇄 당 4개의 총 쇄간 디술피드 결합을 추론하였다. 온전한 분자에서, 단일 쇄 당 2개의 시스테인 잔기가 쇄간 디술피드 결합에 수반되는 것으로 예상된다. 이들 결합은 Fc에 있고 공통 서열: 2개의 단일 쇄 사이의 2개의 디술피드 결합(Cys10　-　Cys10 및 Cys13　-　Cys13)로부터 추론될 수 있다.
단백질의 고차 구조는 아미노산 서열 및 번역후 변형에 의해 지시된다. 따라서, 단백질의 1차 구조의 확인은 구조적 특성의 특성화에 기본이다. 분자의 공유 구조 및 기능적 특성의 직접 평가를 제공하는 방법은 분자 표면의 특성에서 미묘한 변이에 감수성이고 정량적인 방법과 함께 이용되었다. 확장된 특성화의 일부로서 원평관 이색성(CD) 분광법을 사용하여 IL-22 Fc 융합 단백질에서 고차 구조적 요소의 존재를 찾았다. α 나선 및 β 시트를 포함하는 2차 구조적 특성은 CD 스펙트럼의 원자외선(UV) 영역(190　-　250　nm)에서 나타난다. 이들 밴드는 단백질의 나머지 부분과 비교하여 단백질 골격을 따라 펩티드 밴드의 상대적 배향에 의해 야기된다. 또한, CD 스펙트럼의 근-UV 영역(250　-　340　nm)은 소수성, 3차-구조 접촉에 수반될 수 있는 방향족 잔기(예를 들어 트립토판, 티로신 및 페닐알라닌)의 키랄 배양 변화에 대한 정보를 제공한다. 참조 표준 배치 및 임상 배치의 스펙트럼은 서로 유사하였으며, 이는 CD 분석에 의한 IL-22 Fc 융합 단백질의 고차 구조에서 확인가능한 차이가 없음을 나타낸다(도 10).
실시예 2: IL-22 Fc 융합 단백질 효능 및 시알릴화의 효과
시험관내 연구
IL-22 Fc 융합 단백질 효능 검정은 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22　RA1 ECD에 결합하는 능력을 측정한다. 상기 검정에서, 다양한 농도의 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치, 대조군, 및 샘플을 IL-22　RA1 ECD로 코팅된 96-웰 플레이트에 첨가한다. 결합된 IL-22 Fc 융합 단백질을 염소 항-인간 IgG-서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 항체 및 테트라메틸벤디진 기질 용액으로 검출한다. 광학 밀도(OD) 단위로 표시된 결과를 IL-22 Fc 융합 단백질 농도에 대해 플롯팅하고, 평행 곡선 프로그램을 사용하여 참조 표준 배치에 비해 IL-22 Fc 융합 단백질 샘플(들)의 측정된 효능을 계산한다.
효능 측정 결과는 배치가 일치하는 효능을 가졌고, 허용 기준(40% - 130% 상대적 효능)을 충족시켰으며, 의도된 용도에 적합하였음을 나타내었다(표 15).
표 15: IL-22 Fc 융합 단백질 효능
Figure pct00023
시알릴화의 존재 및 수준은 IL-22와 같은 당단백질의 상호작용에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Marchal et al. Biol Chem 382:151-9, 2001). IL-22　Fc 융합 단백질 및 IL-22 수용체 사이의 상호작용에 대한 시알산의 영향을 연구하기 위해, 다양한 수준의 시알산(검정 정량 한계 3　mol/mol)을 갖는 상이한 개발 배치로부터의 IL-22　Fc 융합 단백질 샘플, 0.7, 4.6, 8.1, 12.0, 또는 15.4　mol 시알산/mol IL-22 Fc 융합 단백질을 생성하고 결합 검정 및 세포-기반 리포터 유전자 검정에서 시험하였다. 세포-기반 검정은 IL-22 수용체를 내인성으로 발현하는 조작된 안정한 colo205 세포에서 루시퍼라제 발현을 활성화시키는 IL-22 Fc 융합 단백질의 능력을 측정하는 리포터 유전자 검정이다. 조작된 안정한 colo205 세포 리포터 세포주에서, 리포터 유전자의 프로모터에서 DNA 반응 요소에 전사 3(STAT3)의 신호 변환기 및 활성인자의 결합은 파이어플라이 루시퍼라제 발현을 유도한다. 상기 검정에서, colo205 리포터 유전자-발현 세포를 96-웰 검정 플레이트에서 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준, 검정 대조군, 및 시험 샘플의 제조된 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 일정시간 인큐베이션 후, 루시퍼라제 시약을 검정 플레이트의 웰에 첨가하였고, 발광 플레이트 판독기를 사용하여 리포터 유전자 활성을 측정하였다. 검정 플레이트의 각각의 웰에서 방출된 광의 양은 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준, 검정 대조군, 및 시험 샘플에 의해 유도된 루시퍼라제의 양에 정비례한다. 발광 단위(LUM)로 표시된 결과를 IL-22 Fc 융합 단백질 농도에 대해 플롯팅하였고 평행 선 분석을 사용하여 참조 표준에 비해 IL-22 Fc 융합 단백질 샘플(들)의 활성을 추정하였다. 이 검정의 개략도는 도 11에 제시되어 있다. 다양한 수준의 시알산을 갖는 물질을 생성하기 위해, 세포 배양 및 정제 공정을 변형시켰다.
시알산 함량 및 결합 사이의 상관관계는 활성이 세포-기반 검정에서 측정될 때 유지된다(도 12a). 상관관계의 선은 평행하지 않지만, 동일한 경향을 보인다.
결합 검정 및 세포-기반 검정을 사용하여 효능 조사 전에 시알리다제로 낮은 수준의 시알산 변이체 및 높은 시알산 변이체의 처리는 효능이 시알산 단독에 의해 결정되지 않을 뿐만 아니라, 기저 글리칸에 의해 영향을 받는다는 것을 입증하였다(표 16). SA 변이체를 시알리다제 A와 함께 0.01 U/mg으로 인큐베이션하고, 시알리다제 A를 제거하도록 처리하고, 제형화하였다. 시알산(SA) 변이체 15(mol/mol) 물질을 탈시알릴화하여 SA 변이체 0 높은 물질을 생성하였다. SA 변이체 4 물질을 탈시알릴화하여 SA 변이체 0 낮은 물질을 생성하였다. SA 변이체 0 높은 물질은 SA 수준 0 낮은 물질보다 많은 4-안테나리 글리칸(즉, 더 많은 분지화, 따라서 "High"로 지정됨), 많은 갈락토실화된 글리칸, 및 적은 말단 GlcNAc-함유 글리칸을 함유한다. 다시 말해서, SA 변이체 0 높은 물질은 SA 변이체 0 낮은 물질보다 더 완전한 글리칸 구조를 함유한다. 더 많은 분지화 및 갈락토실화를 갖는 SA 변이체 0 높은 물질은 갈락토스 잔기에만 첨가될 수 있는 많은 시알산의 첨가를 허용한다. 증가된 분지화 및 갈락토실화 정도(이용가능한 갈락토스 잔기)는 15 이상의 시알산 수준을 달성하는데 수반되는 것으로 고려된다.
표 16: IL-22 Fc 융합 단백질 시알산 변이체에 대한 효능
Figure pct00024
시알산 함량 및 결합 사이의 관계를 추가로 탐구하기 위해, 여러 임상 배치를 시알리다제로 처리하여 시알산을 제거하였다. 탈시알릴화된 샘플을 결합 검정에서 분석하였다. 임상 배치(2, 4, 5, 및 6) 및 참조 표준 배치로부터의 탈시알릴화된 물질은 균일한 효능 값으로 수렴되지 않으며, 이는 다른 생성물 품질 속성이 효능 차이에 기여한다는 것을 시사한다(도 12b). IL-22 Fc 융합 단백질의 IL-22　RA1에 대한 결합에 영향을 미칠 수 있는 총 시알산 함량 이외의 글리칸 속성은 분지화(안테나성) 및 갈락토실화 및 시알릴화의 수준을 포함한다. 임상 배치와 비교하여 참조 표준 배치에 대한 증가된 효능은 많은 말단 만노스 및 말단 GlcNAc, 적은 분지화, 적은 갈락토실화, 및 적은 시알릴화에 기여하여, 이에 의해 임상 배치에 대해 관찰된 것들 보다 덜 완전한 글리칸 구조를 나타낸다. 모든 임상 배치에 대한 글리코실화 패턴 및 글리코실화 속성의 일관성이 입증되었다.
결합 활성에 대한 기저 글리칸 구조의 역할을 조사하기 위해, 상기와 같이 동일한 임상 배치를 PNGase　F 효소로 처리하여 모든 N-글리칸을 제거하고 효능 검정에서 분석하였다. PNGase　F 첨가를 제외하고 샘플과 동일한 처리를 통해 참조 표준 배치로부터 제조된 공정 제어 샘플의 효능은 참조 표준 배치의 효능과 상이하였다. 또한, 참조 표준 배치와 비교하여 공정 제어에 대한 분자 크기 이질성의 차이를 관찰하였다. 공정 제어는 크기-배제 초고성능 액체 크로마토그래피(SE-UHPLC)에 의해 측정 시, 참조 표준 배치보다 더 높은 분자량 (HMW) 형태 및 더 낮은 분자량(LMW) 형태를 함유하였다. 공정 제어에 대한 SE-UHPLC 크로마토그램은 인큐베이션 및 정제 공정 후 글리칸 조성물의 변화를 나타내는 피크 형상 및 체류 시간의 변화를 입증하였다.
참조 표준 배치를 포함하여 모든 탈글리코실화된 샘플은 검증된 검정 범위를 벗어난 수준으로 수렴되는 결합 수준을 가졌다. 모든 탈글리코실화된 샘플에 대한 EC50(도 13 참조)은 유사하였으며, 이는 시알산 이외의 기저 글리칸이 또한 결합 활성에 기여하였음을 시사한다. 공정 제어의 효능 이동은 SE-UHPLC 피크의 변화에 의해 나타낸 바와 같이 글리칸 조성물에서의 차이로 인한 것일 수 있다. 상기 결과는 효능 검정이 IL-22　RA1에 결합하는 IL-22 Fc 융합 단백질의 능력에 영향을 미치는 생성물 품질 속성에 감수성이었음을 나타내었다.
생체내 연구
약동학(PK) 및 혈청 REG3β　PD 반응에 대한 IL-22　Fc 융합 단백질의 시알산 함량의 영향을 마우스에서 평가하였다. 균주 CD1의 96마리의 암컷 마우스를 6개 그룹 중 하나에 할당하였다(n　=　16마리 마우스/그룹). 그룹 1의 동물에게는 단일 볼루스 용량의 비히클 대조군을 제공하였고 그룹 2-6의 동물에게는 0.7, 4.6, 8.1, 12.0, 또는 15.4 mol 시알산/mol IL-22 Fc 융합 단백질의 시알산 수준을 갖는 단일 1,000 mg/kg(1　mg/kg) IV　볼루스 용량의 IL-22　Fc 융합 단백질 변이체를 꼬리 정맥을 통해 제공하였다. 투여후 최대 21 일까지 다양한 시점에서, 혈청 샘플(n　=　4/시점)을 수집하고 IL-22　Fc 융합 단백질 농도 및 혈청 REG3β 농도에 대해 분석하였다. 개별 동물로부터의 혈청 농도-시간 데이터를 사용하여 비-구획 희소 분석을 사용하는 PK 파라미터를 추정하였다.
평균　±　SD(표준 편차) 혈청 IL-22　Fc 융합 단백질 농도-시간 프로파일은 도 14에 제시되어 있고, 그룹 평균 PK 파라미터 추정치는 표 17에 제공되어 있다.
표 17: CD1 마우스에서 IL-22 Fc 융합 단백질 변이체의 1,000 μg/kg 정맥내 투여 후 비-구획 약동학 파라미터 추정치
Figure pct00025
1,000 μg/kg으로 0.7, 4.6, 8.1, 12.0, 또는 15.4 mol/mol의 시알산 수준을 갖는 단일 IV 볼루스 용량의 IL-22　Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 투여한 후, 각각 평균 클리어런스(CL) 추정치는 945, 399, 132, 42.6, 및 25.1　mL/kg/일이었고; 최대 관찰 혈청 농도(Cmax)는 3,100, 6,850, 10,300, 15,800, 및 23,200　ng/mL이었고; 정상 상태에서 분포 부피(Vss) 추정치는 2,430, 797, 301, 107, 및 71.2　mL/kg이었다. 말단 반감기 추정치는 상이한 시알산 수준을 갖는 물질에 걸쳐 유사하였고 1.93 내지 2.66 일 범위였다. 전반적으로, IL-22　Fc 융합 단백질 노출은 증가하였고, Vss는 증가하였고, CL은 시알산 수준의 증가에 따라 감소하였으며(도 15), 비시알화당단백질(ASGP) 수용체에 의한 노출된 갈락토스 잔기의 인식을 통해 간 흡수에 의해 매개될 가능성이 있다(Stefanich et　al. J Pharmacol Exp Ther 327:308-15, 2008).
REG3α는 장의 상피 세포 및 췌장 꽈리 세포에 의해 생성된 항균성 펩티드이고 IL-22R 표적 개입을 나타내는 관련 PD 바이오마커이다. REG3β는 인간 및 시노몰구스 원숭이 REG3α의 마우스 오솔로그(ortholog)이다. 평균　±　SD 혈청 REG3β 농도-시간 프로파일은 도 16a에 제시되어 있다. 단일　IV 볼루스 용량의 1,000 μg/kg을 CD1 마우스에 투여한 후 IL-22　Fc 융합 단백질의 시알산 수준이 증가함에 따라 REG3β의 혈청 수준의 단조로운 증가를 관찰하였다. IL-22 Fc 융합 단백질 곡선하 면적(AUC)의 변화 및 상이한 시알산 수준을 갖는 혈청 REG3β AUC의 상응하는 변화 사이의 관계는 도 16b에 제시되어 있다. 조합된 PK/PD 데이터는 IL-22　Fc 융합 단백질의 시알산 수준이 증가함에 따라 IL-22　Fc 융합 단백질 노출 및 혈청 REG3β 반응이 증가됨을 제시하였다. 이는 시알산 함량 증가에 따른 IL-22　Fc 융합 단백질 노출의 증가가 시알산 함량의 증가에 따른 시험관내 효능의 감소에도 불구하고, CD1 마우스에서 1,000　μg/kg IV의 용량으로 생체내에서 혈청 REG3β PD 반응의 증가를 초래함을 시사한다.
이들 연구는 결합 효능 검정이 예비 세포-기반 검정과 일치하는 방식으로 시알산 함량에 감수성임을 입증하였다.
마우스 PK/PD 연구에서 시알산 함량 및 PD 반응 사이에 양의 상관관계가 관찰되면, 시알산 함량 및 효능 사이에 관찰된 음의 상관관계는 생체내 약동학 효과의 감소를 초래하지 않는다. 시알산 증가에 따라 효능이 감소되는 동안, 생체내 클리어런스 및 분포 부피 또한 감소되어 더 높은 노출로 이어졌다(Cmax 및 AUC 둘 다에서). 조합된 PK/PD 데이터는 시알산 함량 변화로 인한 IL-22　Fc 융합 단백질 노출의 변화가 시험관내 효능에 대한 시알산 함량의 반대 효과에도 불구하고, 생체내 혈청 REG3β PD 반응에서 관찰된 변화의 우세한 구동인자였음을 제시하였다.
실시예 3: IL-22 Fc 융합 단백질의 화학, 제조 공정, 및 공정 제어
배치 및 규모 정의
현탁-적합한 CHO 세포주를 사용하여 생물 반응기에서 IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하였다. 세포의 공급원은 마스터 세포 은행(MCB)이었으며, MCB의 해동을 사용하여 여러 생산 가동을 공급할 수 있다. 수확된 세포 배양액(HCCF)의 단일 배치는 각각의 세포 배양 생산 가동으로부터 생성하였다. HCCF의 하나 이상의 배치를 정제 및 최종 조건화를 통해 처리하여 IL-22 Fc 융합 단백질의 단일 배치를 생성하였다. 모든 제조는 cGMP에 따랐다. 본원에 기재된 공정을 사용한 생산은 표 18에 열거된 규모로 발생하였다.
표 18: 세포 배양 공정을 위한 제조 규모
Figure pct00026
세포 배양 및 수확
IL-22 Fc 융합 단백질을 생성하는데 사용되는 세포 배양 공정은 다음 4 단계로 이루어진다: 시드 트레인, 접종물 트레인, 생산, 및 수확. 도 17의 흐름도는 단계, 공정중 제어(IPC), 및 세포 배양 및 수확 공정에 대한 관련 정보를 예시한다. 이 섹션에 기재된 공정을 사용하는 생산은 표 18에 열거된 규모로 발생하였다. 공정 파라미터는 표 19에 열거되어 있다.
세포 배양 공정의 설명
세포 배양 배지
세포 배양 단계는 상이한 유형의 배지를 사용하였으며, 이들 모두 화학적으로 정의된 배지이다. 메티오닌 술폭시민(MSX)을 함유하는 선택 배지를 시드 트레인 단계에서 사용한 반면, 비-선택적 배지를 접종 및 생산 단계에서 사용하였다. 비-선택적 영양소 공급물 배지를 또한 생산 단계에서 사용하였다. 생산 세포 배양 동안 사용되는 기저 배지는 화학적으로 정의된 배지이며, 우발적인 제제에 대해 동물-유래 조질 물질의 사용와 연관된 위험 가능성을 최소화하기 위해 선택하였다. 배지는 아미노산, 비타민, 미량 원소, 및 완충제 성분을 함유한다.
모든 세포 배양 배지는 무혈청이며, 화학적으로 정의되었고, 세포 보호제, 폴리사카라이드, 및 삼투압 조절제를 포함한다. 동물-유래 성분을 함유하는 하나의 조질 물질을 공정에 사용하였다: 30% 시메티콘 에멀젼은 거품형성을 제어하기 위해 필요에 따라 첨가된다.
시드 트레인
시드 트레인을 개시하기 위해, 무혈청 IL-22 Fc 융합 단백질 MCB로부터 세포의 앰플 또는 앰플들을 액체 질소 저장물로부터 제거하고, 해동시키고, 스피너, 진탕 플라스크, 또는 시드 트레인 생물 반응기에 접종하기 위해 사용하였였다.
세포를 해동 후 하위배양하였고 후속적으로 선택적 시드 트레인 배지에서 계대배양한다. 시드 트레인에 대한 배양 조건은 표 19에 제공되어 있다. 시드 트레인으로부터의 세포는 제1 접종물 트레인 생물 반응기에 접종하기 위해 사용하였다.
다른 예에서, IL-22 Fc 융합 단백질의 생산을 위해 롤링 시드 트레인을 사용할 수 있다. 이 예에서, 시드 트레인은 접종물 트레인에 접종하기 위해 연속적으로 성장된다(특정 세포 연령까지).
접종물 트레인
IL-22 Fc 융합 단백질 생산 배양물에 대한 접종물을 제공하기 위해, 시드 트레인 세포 질량을 비-선택적 배지에서 하위배양에 의해 더 큰 크기의 생물 반응기 또는 생물 반응기들로 확장시켰다. 시드 트레인 및 생산 단계 사이의 하위배양은 접종물 트레인(N-2, 및 N-1 배양)으로 지정된다. 현재 4개 이하로 제한되는 접종물 트레인의 최대 계대배양 수는 비-선택적 배지에서 IL-22 Fc 융합 단백질 발현의 안정성에 대한 향후 연구에 의해 정의될 것이다. 접종물 트레인에 대한 배양 조건은 표 19에 제공되어 있다.
생산 단계
IL-22 Fc 융합 단백질의 생산 단계를 비-선택적 배지를 사용하여 생물 반응기에서 수행하였다. 생산 배양물을 접종하기 위해, 접종물 트레인의 최종 단계로부터의 세포(N-1 배양물로 지칭됨)를 생산 배지를 함유하는 생산 생물 반응기로 옮겼다. 세포 생존력 및 생산성을 유지하기 위해, 영양소 공급물을 배양 과정에 걸쳐 생산 생물 반응기에 첨가하였다. 생산 공정은 또한 배양 생존력을 연장하고 생산성을 향상시키기 위해 온도 이동을 이용하였다. 생산 배양물 조건은 표 19에 요약되어 있다.
생산 배양물의 수확 전에, 샘플을 취하고 분석하여 미생물 및 바이러스에 대해 생성물 안전성을 확인하였다.
공정 제어
세포 배양 성능 지표(예를 들어,　세포 밀도, 생존력, 및 역가), 및 공정 파라미터(배양 pH, 온도, 및 용존 산소)를 모니터링하였다. 모니터링되고 제어된 공정 파라미터는 표 19에 제시되어 있다. 공정중 제어 시험에 대한 작용 및 거부 한계는 표 20에 제공되어 있다. 생물 반응기 배양물의 pH는 CO2 가스(산) 및/또는 Na2CO3, NaOH, 또는 다른 적합한 염기를 필요에 따라 첨가하여 조정하였다. 거품 형성을 최소화하기 위해 생물 반응기 배양물에 소포제(시메티콘 에멀젼)를 보충하였다. 모든 배지 용액은 사용 전에 멸균-등급 막 필터(기공 크기 등급 0.1　μm)를 통해 여과하였다. pH 및 용존 산소 제어를 위해 사용되는 모든 가스는 사용 전에 멸균-등급 막 필터(기공 크기 등급 0.22　μm)를 통해 여과하였다. 공정중 제어 시험에 대한 작용 및 거부 한계는 표 20에 제공되어 있다. 제조 공정은 유가(fed batch) 배양 공정을 사용하여 작동하도록 고안하였다. IL-22 Fc 융합 단백질의 처리 시 중간체는 없었다.
표 19: 각각의 세포 배양 공정 단계에 대한 공정 파라미터 표적
Figure pct00027
표 20: 공정중 제어 한계
Figure pct00028
공정-관련 불순물
숙주 세포 DNA, 잔류 단백질　A, 및 숙주 세포 단백질(HCP)을 포함하는 공정-관련 불순물을 공정중-제어 시험의 일부로서 IL-22 Fc 융합 단백질에서 정기적으로 모니터링하였다.
IL-22 Fc 융합 단백질 정제 공정에서 MSX로도 알려진 메티오닌 술폭시민, 소포제(시메티콘 에멀젼), 및 다르게는 폴록사머 188로도 알려진 Kolliphor P　188과 같은 불순물 제거 능력의 평가는 불순물이 공정에서 허용되는 낮은 수준까지 상당히 희석되거나(MSX) 또는 불순물의 농도가 정제 공정에서 허용되는 낮은 수준까지 상당히 감소된다(시메티콘 및 폴록사머 188)는 문서에 의해, 이 섹션에서 제시되어 있다.
시드 트레인 배양물에 대한 선택적 압력을 위해 MSX를 50　μM의 수준으로 첨가하였다. MSX를 접종물 트레인 또는 생산 생물 반응기에 첨가하지 않았으며; 따라서, 생산 배양 배지에서 MSX의 최대 농도는 1.5　g/L의 최대 부피 및 최저 예상된 역가에 기초하여 IL-22 Fc 융합 단백질 mg 당 81　μg/L 또는 54　ng MSX이다. 정제 공정에서 MSX의 클리어런스가 없다고 가정할 때, 잠재적으로 남아있는 MSX의 최대 양은 I상 임상 연구에 대해 제안된 최대 용량(42 mg) 당 2.3　μg MSX일 것이다. 그러나, 크로마토그래피 및 한외여과 및 투석여과(UFDF) 단계가 MSX와 같은 소분자 수준을 추가로 감소시킬 것으로 예상되었다.
IL-22 Fc 융합 단백질 정제 공정에서 시메티콘 및 폴록사머 188과 같은 공정-관련 불순물을 친화성 풀에서 제1 크로마토그래피 단계 후 핵 자기 공명(NMR)에 의해 측정하였다. 시메티콘 및 폴록사머 188은 친화성 풀에서 검정 정량 한계(LOQ) 미만(10　ug/mL)이었다(표 21 참조).
표 21: 친화성 풀에서 공정-관련 불순물 수준
Figure pct00029
잔류 용매
클래스 1 또는 클래스 2 용매는 IL-22 Fc 융합 단백질의 생산에 사용되지 않았다. 낮은 농도의 빙초산이 IL-22 Fc 융합 단백질 정제에 사용되었다. 잔류 용매에 대한 국제 의약품 규제 조화 위원회(IHC) 지침(Q3C)에 따라, 빙초산은 독성이 낮고 인간 건강에 대한 위험이 낮다.
수확
생산 배양의 종료 시, 세포 배양액을 세포로부터 분리하였다. 수확을 위해, 배양물을 생산 생물 반응기에서 냉각시켰다. 이어서 세포를 디스크 스택 분리기를 사용하여 원심분리에 의해 제거하고 후속적으로 1회용 심층 미생물 체류 필터를 사용하여 여과하였다.
mAb 또는 mAb 관련 구성방식으로 디술피드 결합 감소가 발생할 가능성이 있다. 현재까지, 이 현상은 IL-22 Fc 융합 단백질에 대해 관찰되지 않았다. 그러나, 예방 조치로서 IL-22 Fc 융합 단백질의 개발 동안 여러 완화 전략이 구현되었다. IL-22 Fc 융합 단백질은 하기 기재된 바와 같이 수확된 세포 배양액으로부터 정제하였다.
정제 및 변형 반응
IL-22 Fc 융합 단백질의 정제 및 최종 조건화에 대해 사용되는 공정 단계 및 IPC는 도 18에 예시되어 있다.
정제 공정 단계에 사용되는 완충액의 조성은 표 22, 표 23, 표 24, 표 25, 및 표 26에 제공되어 있다.
표 22: IL-22 Fc 융합 단백질 정제 공정에 사용되는 세제 바이러스 불활성화 용액의 조성
Figure pct00030
표 23: IL-22 Fc 융합 단백질 정제 공정에 사용되는 친화성 크로마토그래피 완충액의 조성
Figure pct00031
표 24: IL-22 Fc 융합 단백질 정제 공정에 사용되는 다중모드 음이온-교환 크로마토그래피 완충액의 조성
Figure pct00032
표 25: IL-22 Fc 융합 단백질 정제 공정에 사용되는 소수성-상호작용 크로마토그래피 완충액의 조성
Figure pct00033
표 26: IL-22 Fc 융합 단백질 정제 공정에 사용되는 한외여과 및 투석여과 완충액의 조성
Figure pct00034
세제 첨가에 의한 바이러스 불활성화
세제 Triton X-100의 10% 스톡 용액을 첨가하여 0.5% Triton X-100의 최종 농도를 달성하도록 수확된 세포 배양액(HCCF)을 생성하였다. HCCF는 20℃　-　24℃에서 ≥ 1 시간 동안 유지되어 잠재적인 바이러스 입자를 불활성화시켰다.
친화성 크로마토그래피
친화성 크로마토그래피 단계는 MABSELECT SURE® 수지를 사용하는 결합-및-단계-용리 공정이었다. 세포 분리 및 Triton 첨가 후, HCCF를 평형화된 칼럼 위에 적용하였다. 칼럼을 세척함으로써 단백성 및 비-단백성 불순물을 제거하였다. 생성물을 낮은 pH 용리 완충액으로 칼럼으로부터 회수하였다. 친화성 풀링을 부피에 의해 개시하고 280　nm에서 흡광도에 기초하여 종료하였다. 이 크로마토그래피 단계는 DNA, 숙주 세포 단백질, 내독소, 바이러스, 및 소분자와 같은 잔류 불순물을 제거하였다.
다중모드 음이온-교환 크로마토그래피
다중모드 음이온-교환 단계는 CAPTO™ 부착 수지를 사용하는 결합-및-구배 용리 공정이었다. 다중모드 음이온-교환 칼럼을 평형 완충액으로 평형화시킨 후, 전도성- 및 pH-조정된 친화성 풀을 칼럼 위에 로딩하였다. IL-22 Fc 융합 단백질이 수지에 결합한 후, 칼럼을 평형 완충액으로 세척하였다. IL-22 Fc 융합 단백질을 증가하는 염 구배를 사용하여 용리 완충액으로 칼럼에서 용리시켰다. 다중모드 음이온-교환 풀링을 개시하고 280　nm에서 흡광도에 기초하여 종료하였다. 이 크로마토그래피 단계는 DNA, 숙주 세포 단백질, 바이러스, 및 고분자량 형태(HMWF)와 같은 잔류 불순물을 제거하였다.
소형 바이러스 체류 여과에 의한 바이러스 제거
이전 단계의 생성물 풀을 1회용 정류 소형 바이러스 체류 필터(VIRESOLVE® Pro Magnus)를 통해 여과하였다. 사용 전 및 후에 필터 상에서 완전성 시험을 수행하였다.
소수성 상호작용 크로마토그래피
소수성-상호작용 단계는 페닐　SEPHAROSE™　FF 수지를 사용하여 통과 모드로 작동시켰다. 소수성-상호작용 칼럼을 평형 완충액으로 평형화시킨 후, 이전 단계로부터의 전도성 및 pH-조정된 생성물 풀을 칼럼 위에 로딩하였다. IL-22 Fc 융합 단백질을 칼럼을 통해 흘려보낸 다음, 평형 완충액으로 세척하였다. 소수성-상호작용 풀링을 개시하고 280　nm에서 흡광도에 기초하여 종료하였다. 이 크로마토그래피 단계는 숙주 세포 단백질, 바이러스, 및 HMWF와 같은 잔류 불순물을 제거하였다.
한외여과 및 투석여과
생성물 풀을 10 kDa 복합 재생 셀룰로스 한외여과 막을 사용하는 한외 여과에 의해 대략 20　g/L로 농축하였다. 이어서 농축된 풀을 투석여과 완충액 내로 투석여과하였다(완충액 교환).
조건화
한외여과 및 투석여과(UFDF) 풀을 투석여과 완충액으로 희석하고, 0.010　M 나트륨 포스페이트, 0.24　M 수크로스, 0.005　M 메티오닌, 0.02% 폴리소르베이트　20, pH　7.1에서 10.0　±　1.0　g/L IL-22 Fc 융합 단백질의 최종 농도로 조건화하였다.
IL-22 Fc 융합 단백질의 최종 여과, 충전, 및 저장
조건화된 UFDF 풀을 0.22　μm막을 통해 여과하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하였고 ≤-20℃에서 저장한다.
동일-단계 공정중 풀 조합
생성물-함유 공정중 풀은 공정 단계 사이에 실온 또는 2℃　-　8℃에서 저장될 수 있고 추가 처리를 위해 조합될 수 있다. 생성된 IL-22 Fc 융합 단백질이 방출을 위해 허용되는 경우, 조합된 개별 풀은 각각 개별적으로 공정중 한계를 충족시켜야 한다. 품질 문제를 해결하기 위해 풀을 조합하는 것은 허용되지 않는다.
재여과
재여과는 공정중 풀의 손상을 방지하기 위해서만 허용된 사전 조치이다. 드물게, 재여과는 공정중 풀이 하기와 같은 작동 사건으로 인해 위험할 때 공정에서 필요할 수 있다:
a.) 여과 단계의 면제로 이전 공정 단계에 대해 허용되지 않는 사용후 필터 완전성 시험.
b.) 저장 용기의 완전성을 잠재적으로 손상시킬 수 있는 장비 문제(예를 들어, 밸브 고장 또는 부적절한 벤트 필터 설치).
c.) 세정되거나 또는 스팀처리된 장비에 대해 검증된 보류 시간 초과
미생물 오염물 제거 또는 임의의 다른 생성물 품질 문제 해결을 위한 재여과는 허용되지 않았다.
재처리
IL-22 Fc 융합 단백질 배치의 재처리는 명확하게 확인될 수 있는 장비 오작동과 같은 제한된 상황 하에 수행될 수 있다. 예는 다음을 포함한다:
a.) 비-일체형 칼럼 베드
b.) 결합성 구배 펌프
c.) 공정 설명에 기재된 여과 단계(예를 들어, 심층 여과, 나노여과 [소형 바이러스 체류 필터], 또는 최종 IL-22 Fc 융합 단백질 여과)의 반복을 초래하는 이전 여과 단계에 대한 허용되지 않는 사용후 필터 완전성 시험.
재처리는 이 섹션에 기재된 제조 단계 중 하나 이상을 반복함으로써 수행하였다. 재처리 단계(들)에 대한 모든 관련 IPC 한계가 충족되어야 한다.
배치의 품질을 조사하고 재처리에 의해 영향을 받지 않음을 입증해야 한다. 따라서, 모든 IPC 한계 및 방출 사양이 충족되어야 한다. 적용가능한 경우, 재처리 물질의 확장된 특성화 및 안정성을 평가하여 품질 영향을 배제하였다.
충전 및 저장
조건화된 UFDF 풀을 1회용 생물공정 백 내로 여과하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 생성하였고, 이를 추가 처리를 위해 2℃　-　8℃에서 저장하거나 또는 ≤　-20℃에서 장기 저장을 위해　동결시켰다. IL-22 Fc 융합 단백질은 운송 절차에 따라 장기간 저장 또는 IL-22 Fc 융합 단백질 약제학적 조성물 제조를 위해 제조 현장에서 저장되거나 또는 제어된 온도 조건 하에 다른 후원자 현장/계약 제조 조직 현장으로 운송될 수 있다.
사양
IL-22 Fc 융합 단백질에 대해 사용되는 방출 사양 및 허용 기준은 표 27에 열거되어 있다.
표 27: IL-22 Fc 융합 단백질 방출 사양
Figure pct00035
실시예 4: IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준
이 실시예는 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준으로서 참조 표준 배치 번호 1의 사용에 관한 데이터를 제공한다. 이 배치를 IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준을 필요로 하는 모든 방출 및 안정성 검정에 사용하였다.
참조 표준은 정성적, 정량적, 및 반정량적 공정중 샘플 시험, 및 IL-22 Fc 융합 단백질 및 IL-22 Fc 융합 단백질 약제학적 조성물 방출 및 안정성 시험에 사용되어 일치하는 생성물 품질을 검증하였다. 참조 표준은 또한 적용가능한 경우 시스템 적합성을 위해 사용하였다.
각각의 참조 표준 배치를 적절한 방출 시험을 사용하여 분석하여 IL-22 Fc 융합 단백질에 대한 참조 표준으로서 사용하기에 적절한 허용되는 조성, 순도, 및 강도를 입증하였다.
참조 표준 배치 시험에 대한 결과는 표 28에 제공되어 있고 참조 배치의 방출 시간 대신에 방출 시험 절차에 기초하였다. 참조 표준 배치 1의 효능은 100%의 값으로 할당하였다. 참조 표준 배치의 후속 배치를 이전 참조에 관하여 정량화하고 새로운 활성(즉, 새로운 상대적 효능 값)을 할당하였다.
표 28: IL-22 Fc 융합 단백질 참조 표준 배치 방출 시험 결과
Figure pct00036
실시예 5: 세포 배양 지속기간에 따른 시알산 수준의 변화
IL-22 Fc 융합 단백질 시알산 수준에 대한 세포 배양 지속기간의 영향을 평가하였다. IL-22 Fc 융합 단백질을 본원에 기재된 바와 같이 생성하였다(예를 들어, 실시예 3 참조). 시알산 수준을 RP-HPLC를 사용하여 생산 생물 반응기에서 배양 동안 다수의 시점에서 평가하였다. 이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 시알산 수준은 세포 배양 지속기간이 증가함에 따라 감소하였다(도 20). 이들 결과는 10 일의 세포 배양 지속기간 동안, 시알산 함량이 약 8 mol/mol인 반면, 세포 배양 12 일 후, 시알산 함량이 약 6 mol/mol이었음을 제시한다. 시알산 함량은 본원에 기재된 정제 공정(예를 들어, 실시예 3 참조)에 의해, 예를 들어, MABSELECT SURE® 수지와 같은 친화성 크로마토그래피 수지 및 예를 들어, CAPTO™ 부착 수지를 사용하는 다중모드 음이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 추가로 풍부화된다. 따라서, 생산 생물 반응기에서 생산 단계 동안 10 일의 세포 배양 지속기간을 사용하여 생성된 대략 8 mol/mol 시알산 함량의 IL-22 Fc 융합 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 정제에 의해 8 내지 12 mol/mol 시알산(예를 들어, 8 내지 9 mol/mol 시알산)으로 풍부화될 수 있다. 유사하게, 생산 생물 반응기에서 생산 단계 동안 12 일의 세포 배양 지속기간을 사용하여 생성된 대략 6 mol/mol 시알산 함량의 IL-22 Fc 융합 단백질은 또한 본원에 기재된 바와 같은 정제에 의해 8 내지 12 mol/mol 시알산(예를 들어, 8 내지 9 mol/mol 시알산)으로 풍부화될 수 있다.
이들 데이터는 세포 배양 지속 기간이 예를 들어, 생산 생물 반응기에서 배양 동안 본원에 기재된 바와 같이 생성된 IL-22 Fc 융합 단백질의 시알산 함량을 조절하기 위해 공정 레버로 사용될 수 있음을 입증한다. 세포 배양 지속기간은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산(예를 들어, IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산)의 평균 시알산 함량을 갖는 IL-22 Fc 융합 단백질 조성물에 대해 풍부하게 하기 위해 본원에 기재된 정제 공정과 조합하여 사용될 수 있다.
다른 구현예
본원에 기재된 기술의 일부 구현예는 하기 넘버링된 임의의 구현예에 따라 정의될 수 있다:
1. 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 인터류킨(IL)-22 Fc 융합 단백질로, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
2. 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질로, 여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해 약 40% 내지 약 130%의 효능을 가지며, 임의적으로 여기서 참조 IL-22 Fc 융합 단백질은 표 12 및/또는 표 13에 제시된 N-글리칸 분포를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
3. 구현예 2에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해 약 80% 내지 약 120%의 효능을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
4. 구현예 2 또는 3에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해 약 60% 내지 약 110%의 효능을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
5. 구현예 2 내지 4 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는 참조 IL-22 Fc 융합 단백질에 비해 약 80% 내지 약 100%의 효능을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
6. 구현예 2 내지 5 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 효능이 수용체 결합 검정 또는 세포-기반 결합 검정에서 평가되는, IL-22 Fc 융합 단백질.
7. 구현예 2 내지 6 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
8. 구현예 1 또는 7에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 11 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
9. 구현예 1 또는 8에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 10 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
10. 구현예 1, 8, 또는 9에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
11. 구현예 1 및 8 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
12. 구현예 1 및 8 내지 10 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
13. 구현예 1 및 8 내지 11 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 시알산이 N-아세틸뉴라민산(NANA)인, IL-22 Fc 융합 단백질.
14. 구현예 1 내지 13 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 약 8,000 ng/mL 내지 약 19,000 ng/mL의 최대 관찰 농도(Cmax)를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
15. 구현예 14에 있어서, 상기 Cmax가 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가되는, 방법.
16. 구현예 1 내지 15 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 약 7,000 일·ng/mL 내지 약 25,000 일·ng/mL의 시간 0에서 최종 측정가능한 시점까지 혈청 농도-시간 곡선하 면적(AUClast)을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
17. 구현예 16에 있어서, 상기 AUClast이 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가되는, 방법.
18. 구현예 1 내지 17 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 약 40 mL/kg/일 내지 약 140 mL/kg/일의 클리어런스(CL)를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
19. 구현예 18에 있어서, 상기 CL이 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가되는, IL-22 Fc 융합 단백질.
20. 구현예 1 내지 19 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 N 글리코실화되는, IL-22 Fc 융합 단백질.
21. 구현예 20에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 1-안테나리, 2-안테나리, 3-안테나리, 및/또는 4-안테나리 구조를 갖는 N-글리칸을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
22. 구현예 21에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 2%가 1-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
23. 구현예 22에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 0.5% 내지 약 1.5%가 1-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
24. 구현예 23에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 1%가 1-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
25. 구현예 21 내지 24 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 25%가 2-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
26. 구현예 25에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 12% 내지 약 21%가 2-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
27. 구현예 26에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 17%가 2-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
28. 구현예 21 내지 27 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 25% 내지 약 40%가 3-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
29. 구현예 28에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 28% 내지 약 35%가 3-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
30. 구현예 29에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 31%가 3-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
31. 구현예 21 내지 30 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 30% 내지 약 51%가 4-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
32. 구현예 31에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 35% 내지 약 48%가 4-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
33. 구현예 32에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 42%가 4-안테나리 구조를 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
34. 구현예 20 내지 33 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
35. 구현예 34에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 9% 내지 약 32%가 0개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
36. 구현예 35에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%가 0개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
37. 구현예 36에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 21%가 0개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
38. 구현예 34 내지 37 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 20%가 1개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
39. 구현예 38에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 12% 내지 약 16%가 1개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
40. 구현예 39에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 14%가 1개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
41. 구현예 34 내지 40 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 8% 내지 약 25%가 2개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
42. 구현예 41에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 16%가 2개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
43. 구현예 42에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 13%가 2개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
44. 구현예 34 내지 43 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 12% 내지 약 25%가 3개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
45. 구현예 44에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 15% 내지 약 22%가 3개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
46. 구현예 45에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 19%가 3개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
47. 구현예 34 내지 46 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 12% 내지 약 30%가 4개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
48. 구현예 47에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%가 4개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
49. 구현예 48에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 24%가 4개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
50. 구현예 20 내지 49 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 시알산 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
51. 구현예 50에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 12% 내지 약 35%가 0개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
52. 구현예 51에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 20% 내지 약 30%가 0개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
53. 구현예 52에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 24%가 0개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
54. 구현예 50 내지 53 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%가 1개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
55. 구현예 54에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%가 1개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
56. 구현예 55에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 20%가 1개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
57. 구현예 50 내지 56 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%가 2개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
58. 구현예 57에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%가 2개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
59. 구현예 58에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 21%가 2개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
60. 구현예 50 내지 59 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%가 3개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
61. 구현예 60에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 12% 내지 약 24%가 3개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
62. 구현예 61에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 17%가 3개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
63. 구현예 50 내지 62 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%가 4개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
64. 구현예 63에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 5% 내지 약 15%가 4개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
65. 구현예 64에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 9%가 4개의 시알산 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
66. 구현예 20 내지 65 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 말단 만노스 모이어티를 포함하는 약 0% 내지 약 10% N-글리칸을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
67. 구현예 66에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 1% 내지 약 4%가 말단 만노스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
68. 구현예 67에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 2%가 말단 만노스 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
69. 구현예 20 내지 68 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 말단 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 모이어티를 포함하는 약 30% 내지 약 55% N-글리칸을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
70. 구현예 69에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 35% 내지 약 50%가 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
71. 구현예 70에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 42%가 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
72. 구현예 69 내지 71 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸이 1, 2, 3, 또는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
73. 구현예 72에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%가 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
74. 구현예 73에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 5% 내지 약 15%가 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
75. 구현예 74에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 10%가 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
76. 구현예 72 내지 75 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%가 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
77. 구현예 76에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 5% 내지 약 15%가 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
78. 구현예 77에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 10%가 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
79. 구현예 72 내지 78 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 5% 내지 약 25%가 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
80. 구현예 79에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 20%가 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
81. 구현예 80에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 14%가 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
82. 구현예 72 내지 81 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 0% 내지 약 15%가 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
83. 구현예 82에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 4% 내지 약 12%가 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
84. 구현예 83에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 7%가 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
85. 구현예 20 내지 84 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 말단 갈락토스(Gal) 모이어티를 포함하는 약 20% 내지 약 45% N-글리칸을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
86. 구현예 85에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 25% 내지 약 35%가 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
87. 구현예 86에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 32%가 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
88. 구현예 85 내지 87 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸이 1, 2, 또는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
89. 구현예 88에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 15% 내지 약 30%가 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
90. 구현예 89에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 20% 내지 약 25%가 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
91. 구현예 90에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 23%가 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
92. 구현예 88 내지 91 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 1% 내지 약 15%가 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
93. 구현예 92에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 2% 내지 약 12%가 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
94. 구현예 93에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 7%가 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
95. 구현예 88 내지 94 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 6%가 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
96. 구현예 95에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 1% 내지 약 3%가 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
97. 구현예 96에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 2%가 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
98. 구현예 20 내지 97 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 갈락토스 N-아세틸글루코사민(LacNAc) 반복부를 포함하는 N-글리칸을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
99. 구현예 98에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 1% 내지 약 10%가 LacNAc 반복부를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
100. 구현예 99에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 3% 내지 약 6%가 LacNAc 반복부를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
101. 구현예 100에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 5%가 LacNAc 반복부를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
102. 구현예 20 내지 101 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
103. 구현예 102에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 60% 내지 약 80%가 푸코실화되는, IL-22 Fc 융합 단백질.
104. 구현예 103에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 65% 내지 약 75%가 푸코실화되는, IL-22 Fc 융합 단백질
105. 구현예 104에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 70%가 푸코실화되는, IL-22 Fc 융합 단백질.
106. 구현예 20 내지 105 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 비푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
107. 구현예 106에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%가 비푸코실화되는, IL-22 Fc 융합 단백질.
108. 구현예 107에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 15% 내지 약 25%가 비푸코실화되는, IL-22 Fc 융합 단백질.
109. 구현예 108에 있어서, 상기 N-글리칸의 약 20%가 비푸코실화되는, IL-22 Fc 융합 단백질.
110. 구현예 1 내지 109 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및/또는 Asn143 상에서 글리코실화되는, IL-22 Fc 융합 단백질.
111. 구현예 110에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및 Asn143 상에서 글리코실화되는, IL-22 Fc 융합 단백질.
112. 구현예 110 또는 111에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유가 약 70% 내지 약 90%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
113. 구현예 112에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유가 약 75% 내지 약 85%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
114. 구현예 113에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21 상의 글리코실화 점유가 약 82%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
115. 구현예 111 내지 114 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유가 약 90% 내지 약 100%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
116. 구현예 115에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유가 약 95% 내지 약 100%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
117. 구현예 116에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn35 상의 글리코실화 점유가 약 100%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
118. 구현예 111 내지 117 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유가 약 90% 내지 약 100%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
119. 구현예 118에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유가 약 95% 내지 약 100%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
120. 구현예 119에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn64 상의 글리코실화 점유가 약 100%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
121. 구현예 111 내지 120 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유가 약 15% 내지 약 45%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
122. 구현예 121에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유가 약 25% 내지 약 35%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
123. 구현예 122에 있어서, 상기 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn143 상의 글리코실화 점유가 약 33%인, IL-22 Fc 융합 단백질.
124. 구현예 1 내지 123 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc 영역이 글리코실화되지 않은, IL-22 Fc 융합 단백질.
125. 구현예 124에 있어서, 상기 Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기가 Gly인, IL-22 Fc 융합 단백질.
126. 구현예 124에 있어서, 상기 Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기가 Ala인, IL-22 Fc 융합 단백질.
127. 구현예 124 내지 126 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 299에서 아미노산 잔기가 Ala, Gly, 또는 Val인, IL-22 Fc 융합 단백질.
128. 구현예 1 내지 127 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc 영역이 IgG1 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
129. 구현예 128에 있어서, 상기 Fc 영역이 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
130. 구현예 1 내지 129 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
131. 구현예 130에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 96% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
132. 구현예 131에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
133. 구현예 132에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
134. 구현예 133에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
135. 구현예 1 내지 134 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
136. 구현예 135에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
137. 구현예 136에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8의 아미노산 서열로 이루어지는, IL-22 Fc 융합 단백질.
138. 구현예 135에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 10의 아미노산 서열을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
139. 구현예 138에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 10의 아미노산 서열로 이루어지는, IL-22 Fc 융합 단백질.
140. 구현예 135에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
141. 구현예 140에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 16의 아미노산 서열로 이루어지는, IL-22 Fc 융합 단백질.
142. 구현예 124 내지 141 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 Fc 영역이 N-글리코실화되지 않은, IL-22 Fc 융합 단백질.
143. 구현예 1 내지 142 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 이량체성 IL-22 Fc 융합 단백질인, IL-22 Fc 융합 단백질.
144. 구현예 1 내지 142 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 단량체성 IL-22 Fc 융합 단백질인, IL-22 Fc 융합 단백질.
145. 구현예 1 내지 144 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 인간 IL-22 폴리펩티드인, IL-22 Fc 융합 단백질.
146. 구현예 145에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
147. 구현예 1 내지 146 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 링커가 아미노산 서열 RVESKYGPP(서열번호: 44)를 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
148. 구현예 147에 있어서, 상기 링커가 아미노산 서열 RVESKYGPP(서열번호: 44)로 이루어지는, IL-22 Fc 융합 단백질.
149. 구현예 1 내지 148 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 수용체에 결합하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
150. 구현예 149에 있어서, 상기 IL-22 수용체가 인간 IL-22 수용체인, IL-22 Fc 융합 단백질.
151. 구현예 149 또는 150에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22RA1 및/또는 IL-10R2에 결합하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
152. 구현예 151에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22RA1에 결합하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
153. 구현예 1 내지 152 중 어느 한 구현예에 있어서, IL-22 Fc 융합 단백질의 발현에 적합한 조건 하에 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는, IL-22 Fc 융합 단백질.
154. 구현예 153에 있어서, 상기 방법이 세포 배양물 또는 배양 배지로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, IL-22 Fc 융합 단백질.
155. 구현예 153 또는 154에 있어서, 상기 숙주 세포가 CHO 세포인, IL-22 Fc 융합 단백질.
156. 구현예 1 내지 155 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 5 몰 미만의 NGNA의 NGNA 함량을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
157. 구현예 156에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 1 몰 미만의 NGNA의 NGNA 함량을 갖는, IL-22 Fc 융합 단백질.
158. 구현예 1 내지 157 중 어느 한 구현예의 IL-22 Fc 융합 단백질 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
159. 구현예 158에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는, 약제학적 조성물.
160. 구현예 158 또는 159에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 10 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는, 약제학적 조성물.
161. 구현예 158 내지 160 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는, 약제학적 조성물.
162. 구현예 158 내지 161 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는, 약제학적 조성물.
163. 구현예 158 내지 162 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는, 약제학적 조성물.
164. 구현예 158 내지 163 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 시알산이 N-아세틸뉴라민산(NANA)인, 약제학적 조성물.
165. 구현예 158 내지 164 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
166. 구현예 165에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
167. 구현예 165에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
168. 구현예 158 내지 167 중 어느 한 구현예에 있어서, 추가적인 치료제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
169. 구현예 158 내지 168 중 어느 한 구현예에 있어서, 겔화제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
170. 구현예 169에 있어서, 상기 겔화제가 폴리사카라이드인, 약제학적 조성물.
171. 구현예 169 또는 170에 있어서, 상기 겔화제가 셀룰로스제인, 약제학적 조성물.
172. 구현예 169 내지 171 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 겔화제가 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 카르복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, POE-POP 블록 공중합체, 알기네이트, 히알루론산, 폴리아크릴산, 하이드록시에틸 메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스인, 약제학적 조성물.
173. 구현예 172에 있어서, 상기 겔화제가 하이드록시프로필 메틸셀룰로스인, 약제학적 조성물.
174. 구현예 173에 있어서, 상기 약제학적 조성물이 국소 투여를 위한 것인, 약제학적 조성물.
175. 염증성 장 질환(IBD)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 염증성 장 질환(IBD)을 치료하는 방법으로, 구현예 1 내지 157 중 어느 한 구현예의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 구현예 158 내지 168 중 어느 한 구현예의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
176. 구현예 175에 있어서, 상기 IBD가 궤양성 대장염 또는 크론병인, 방법.
177. 구현예 176에 있어서, 상기 IBD가 궤양성 대장염인, 방법.
178. 구현예 177에 있어서, 상기 궤양성 대장염이 중등증 내지 중증 궤양성 대장염인, 방법.
179. 구현예 176에 있어서, 상기 IBD가 크론병인, 방법.
180. 장내 세균 감염의 억제, 세균 감염 동안 장내 배상 세포의 보존, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유의 향상을 필요로 하는 대상체에서 장내 세균 감염을 억제하고, 세균 감염 동안 장내 배상 세포를 보존하고, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유를 향상시키는 방법으로, 구현예 1 내지 157 중 어느 한 구현예의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 구현예 158 내지 168 중 어느 한 구현예의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
181. 구현예 180에 있어서, 상기 상피 세포가 장의 상피 세포인, 방법.
182. 급성 신부전 또는 급성 췌장염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 급성 신부전 또는 급성 췌장염을 치료하는 방법으로, 구현예 1 내지 157 중 어느 한 구현예의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 구현예 158 내지 168 중 어느 한 구현예의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
183. 상처 치유의 가속화 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유를 가속화 또는 개선시키는 방법으로, 구현예 1 내지 157 중 어느 한 구현예의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 구현예 158 내지 174 중 어느 한 구현예의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
184. 구현예 183에 있어서, 상기 상처가 만성 상처 또는 감염된 상처인, 방법.
185. 구현예 183 또는 184에 있어서, 상기 대상체가 당뇨병성인, 방법.
186. 구현예 185에 있어서, 상기 당뇨병성 대상체가 II형 당뇨병을 갖는, 방법.
187. 구현예 183 내지 186 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 상처가 당뇨병성 족부 궤양인, 방법.
188. 구현예 183 내지 187 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물이 상처 봉합이 완료될 때까지 투여되는, 방법.
189. 죽상경화 플라크 형성의 병리를 포함하는 심혈관 병태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 심혈관 병태를 예방 또는 치료하는 방법으로, 구현예 1 내지 157 중 어느 한 구현예의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 구현예 158 내지 168 중 어느 한 구현예의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
190. 구현예 189에 있어서, 상기 심혈관 질환이 관상 동맥 질환, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 또는 만성 신장 질환인, 방법.
191. 구현예 189 또는 190에 있어서, 죽상경화 플라크 형성의 진행을 둔화시키는 단계 또는 죽상동맥경화증의 징후를 예방하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
192. 구현예 191에 있어서, 상기 죽상동맥경화증의 징후가 플라크 축적 또는 혈관 염증을 포함하는, 방법.
193. 대사 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에서 대사 증후군을 치료하는 방법으로, 구현예 1 내지 157 중 어느 한 구현예의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 구현예 158 내지 168 중 어느 한 구현예의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
194. 구현예 193에 있어서, 복부 비만, 고혈당증, 이상지질혈증, 및 고혈압 중 하나 이상을 포함하는 대사 증후군과 연관된 하나 이상의 위험 요인을 감소시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
195. 구현예 193 또는 194에 있어서, 대상체에서 박테리아 리포폴리사카라이드의 수준을 감소시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
196. 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다의 치료를 필요로 하는 대상체에서 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다를 치료하는 방법으로, 구현예 1 내지 157 중 어느 한 구현예의 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 구현예 158 내지 168 중 어느 한 구현예의 약제학적 조성물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
197. 구현예 193 내지 196 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 대상체가 HDL/LDL 지질 프로파일의 교환을 필요로 하는, 방법.
198. 구현예 175 내지 197 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는, 방법.
199. 구현예 198에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 10 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는, 방법.
200. 구현예 198 또는 199 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 9 몰의 시알산 범위에서 시알산 함량을 갖는, 방법.
201. 구현예 198 내지 200 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는, 방법.
202. 구현예 198 내지 200 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 9 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는, 방법.
203. 구현예 198 내지 202 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 시알산이 N-아세틸뉴라민산(NANA)인, 방법.
204. 구현예 175 내지 203 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
205. 구현예 204에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
206. 구현예 204에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
207. 구현예 175 내지 206 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물이 정맥내로, 피하로, 복강내로, 또는 국소로 투여되는, 방법.
208. 구현예 207에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는, 방법.
209. 구현예 207에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질 또는 약제학적 조성물이 피하로 투여되는, 방법.
210. 구현예 175 내지 209 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 대상체가 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공동 투여받는, 방법.
211. 구현예 175 내지 210 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
212. 구현예 1 내지 157 중 어느 한 구현예의 IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 방법으로, 하기 단계를 포함하는, 방법:
(a) 구현예 1 내지 157 중 어느 한 구현예의 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 숙주 세포를 시드 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 시드 트레인 배지에서 배양하는 단계;
(c) 상기 시드 트레인을 접종물 배지 내에 접종하고 접종물 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및
(d) 상기 접종물 트레인을 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 생산 배지에서 배양하며, 여기서 생산 배양물의 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 이에 의해 IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 단계.
213. IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 방법으로, 하기 단계를 포함하며:
(a) 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 숙주 세포를 시드 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 시드 트레인 배지에서 배양하는 단계;
(c) 상기 시드 트레인을 접종물 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 접종물 배지 내에 접종하는 단계; 및
(d) 상기 접종물 트레인을 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 생상 배지에서 배양하며, 여기서 생산 배양물의 숙주 세포는 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 이에 의해 IL-22 Fc 융합 단백질을 제조하는 단계,
여기서 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 여기서 IL-22 Fc 융합 단백질은 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는, 방법.
214. 구현예 212 또는 213에 있어서, 상기 숙주 세포가 동결된 숙주 세포이고, 단계 (a)가 시드 트레인 배지에서 동결된 숙주 세포를 해동시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
215. 구현예 212 내지 214 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 방법이 단계 (d) 전에 접종물 트레인을 약 1 내지 약 10회 계대하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
216. 구현예 215에 있어서, 상기 접종물 트레인을 단계 (d) 전에 약 2 내지 약 6회 계대하는, 방법.
217. 구현예 216에 있어서, 상기 접종물 트레인을 단계 (d) 전에 약 2회 계대하는, 방법.
218. 구현예 212 내지 217 중 어느 한 구현예에서, 상기 시드 트레인 배지가 숙주 세포를 선택할 수 있는 선택제를 포함하는, 방법.
219. 구현예 218에 있어서, 상기 선택제가 메티오닌 술폭시민, 메토트렉세이트, 또는 항생제인, 방법.
220. 구현예 219에 있어서, 상기 선택제가 메티오닌 술폭시민인, 방법.
221. 구현예 219에 있어서, 상기 선택제가 항생제인, 방법.
222. 구현예 221에 있어서, 상기 항생제가 블라스티시딘, 게네티신, 하이그로마이신 B, 퓨로마이신, 마이코페놀산, 또는 제오신으로부터 선택되는, 방법.
223. 구현예 212 내지 222 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 시드 트레인 배지, 접종물 배지, 및/또는 생산 배지가 소포제를 포함하는, 방법.
224. 구현예 223에 있어서, 상기 소포제가 시메티콘 에멀젼, 소포제 204, 소포제 A, 소포제 B, 소포제 C, 소포제 Y-30, 또는 소포제 SE-15인, 방법.
225. 구현예 224에 있어서, 상기 소포제가 시메티콘 에멀젼인, 방법.
226. 구현예 212 내지 225 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 시드 트레인 배지, 접종물 배지, 및/또는 생산 배지가 완충제, 세포 보호제, 폴리사카라이드, 및/또는 삼투압 조절제를 포함하는, 방법.
227. 구현예 212 내지 225 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)가 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행되는, 방법.
228. 구현예 227에 있어서, 상기 단계 (b)가 약 35℃ 내지 약 39℃의 온도에서 수행되는, 방법.
229. 구현예 228에 있어서, 상기 단계 (b)가 약 37℃의 온도에서 수행되는, 방법.
230. 구현예 212 내지 229 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)가 스피너, 스핀 튜브, 진탕 플라스크, 또는 시드 트레인 생물 반응기에서 수행되는, 방법.
231. 구현예 230에 있어서, 상기 단계 (b)가 시드 트레인 스피너, 1회용 생물 반응기(예를 들어, WAVE BIOREACTOR™ 또는 AMBR® 생물 반응기(예를 들어, AMBR® 15 생물 반응기)), 또는 진탕 플라스크에서 수행되는, 방법.
232. 구현예 231에 있어서, 상기 단계 (b)가 계대 당 약 1 일 내지 약 12 일의 지속기간을 갖는, 방법.
233. 구현예 232에 있어서, 상기 단계 (b)가 계대 당 약 2 일 내지 약 7 일의 지속기간을 갖는, 방법.
234. 구현예 230에 있어서, 상기 단계 (b)가 시드 트레인 생물 반응기에서 수행되는, 방법.
235. 구현예 234에 있어서, 상기 시드 트레인 배양물의 pH가 약 6 내지 약 8인, 방법.
236. 구현예 235에 있어서, 상기 시드 트레인 배양물의 pH가 약 6.5 내지 약 7.5인, 방법.
237. 구현예 236에 있어서, 상기 시드 트레인 배양물의 pH가 약 7.15인, 방법.
238. 구현예 234 내지 237 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 시드 트레인 배양물의 용존 산소가 약 15% 내지 약 50%인, 방법.
239. 구현예 238에 있어서, 상기 시드 트레인 배양물의 용존 산소가 약 20% 내지 약 40%인, 방법.
240. 구현예 239에 있어서, 상기 시드 트레인 배양물의 용존 산소가 약 30%인, 방법.
241. 구현예 234 내지 240 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단계 (b)가 약 1 일 내지 약 10 일의 지속기간을 갖는, 방법.
242. 구현예 241에 있어서, 상기 단계 (b)가 약 2 일 내지 약 5 일의 지속기간을 갖는, 방법.
243. 구현예 212 내지 242 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)가 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행되는, 방법.
244. 구현예 243에 있어서, 상기 단계 (c)가 약 35℃ 내지 약 39℃의 온도에서 수행되는, 방법.
245. 구현예 244에 있어서, 상기 단계 (c)가 약 37℃의 온도에서 수행되는, 방법.
246. 구현예 212 내지 245 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)가 하나 이상의 생물 반응기에서 수행되는, 방법.
247. 구현예 246에 있어서, 상기 단계 (c)가 3 또는 4개의 생물 반응기에서 수행되는, 방법.
248. 구현예 246 또는 247에 있어서, 상기 접종물 배양물의 pH가 약 6 내지 약 8인, 방법.
249. 구현예 248에 있어서, 상기 접종물 배양물의 pH가 약 6.5 내지 약 7.5인, 방법.
250. 구현예 249에 있어서, 상기 접종물 배양물의 pH가 약 7.1인, 방법.
251. 구현예 246 내지 250 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 접종물 배양물의 용존 산소가 약 15% 내지 약 50%인, 방법.
252. 구현예 251에 있어서, 상기 접종물 배양물의 용존 산소가 약 20% 내지 약 40%인, 방법.
253. 구현예 252에 있어서, 상기 접종물 배양물의 용존 산소가 약 30%인, 방법.
254. 구현예 246 내지 253 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)가 약 1 일 내지 약 5 일의 지속기간을 갖는, 방법.
255. 구현예 254에 있어서, 상기 단계 (c)가 약 2 일 내지 약 3 일의 지속기간을 갖는, 방법.
256. 구현예 212 내지 255 중 어느 한 구현예에서, 상기 단계 (d)가 초기 온도에서 이동후 온도까지 온도 이동을 포함하는, 방법.
257. 구현예 256에 있어서, 상기 초기 온도가 약 25℃ 내지 약 40℃인, 방법.
258. 구현예 257에 있어서, 상기 초기 온도가 약 35℃ 내지 약 39℃인, 방법.
259. 구현예 258에 있어서, 상기 초기 온도가 약 37℃인, 방법.
260. 구현예 256 내지 259 중 어느 한 구현예에서, 상기 이동후 온도가 약 25℃ 내지 약 40℃인, 방법.
261. 구현예 260에 있어서, 상기 이동후 온도가 약 30℃ 내지 약 35℃인, 방법.
262. 구현예 261에 있어서, 상기 이동후 온도가 약 33℃인, 방법.
263. 구현예 256 내지 262 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 온도 이동이 약 12 시간 내지 약 120 시간의 기간에 걸쳐 발생하는, 방법.
264. 구현예 263에 있어서, 상기 온도 이동이 약 48 시간 내지 약 96 시간의 기간에 걸쳐 발생하는, 방법.
265. 구현예 264에 있어서, 상기 온도 이동이 약 72 시간의 기간에 걸쳐 발생하는, 방법.
266. 구현예 212 내지 265 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 생산 배양물의 pH가 약 6 내지 약 8인, 방법.
267. 구현예 266에 있어서, 상기 생산 배양물의 pH가 약 6.5 내지 약 7.5인, 방법.
268. 구현예 267에 있어서, 상기 생산 배양물의 pH가 약 7.0인, 방법.
269. 구현예 212 내지 268 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단계 (d)가 생산 생물 반응기에서 수행되는, 방법.
270. 구현예 269에 있어서, 상기 생산 배양물의 용존 산소가 약 15% 내지 약 50%인, 방법.
271. 구현예 270에 있어서, 상기 생산 배양물의 용존 산소가 약 20% 내지 약 40%인, 방법.
272. 구현예 271에 있어서, 상기 생산 배양물의 용존 산소가 약 30%인, 방법.
273. 구현예 269 내지 272 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단계 (d)가 약 5 일 내지 약 25 일의 지속기간을 갖는, 방법.
274. 구현예 273에 있어서, 상기 단계 (d)가 약 7 일 내지 약 16 일의 지속기간을 갖는, 방법.
275. 구현예 274에 있어서, 상기 단계 (d)가 약 12 일의 지속기간을 갖는 방법.
276. 구현예 212 내지 275 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단계 (d)가 영양소 공급물에 의해 생산 배양물에 영양소를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
277. 구현예 212 내지 276 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포인, 방법.
278. 구현예 277에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵생물 세포인, 방법.
279. 구현예 278에 있어서, 상기 진핵생물 세포가 포유동물 세포인, 방법.
280. 구현예 279에 있어서, 상기 포유동물 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 방법.
281. 구현예 280에 있어서, 상기 CHO 세포가 현탁-적합한 CHO 세포인, 방법.
282. 구현예 212 내지 281 중 어느 한 구현예에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법:
(e) 생산 배양물로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계.
283. 구현예 282에 있어서, 상기 단계 (e)가 생산 배양물을 냉각시키는 단계를 포함하는, 방법.
284. 구현예 283에 있어서, 상기 단계 (e)가 생산 배양물을 약 2℃ 내지 약 8℃로 냉각시키는 단계를 포함하는, 방법.
285. 구현예 282 내지 284 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단계 (e)가 원심분리에 의해 생산 배지로부터 숙주 세포를 제거하여 세포 배양액을 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
286. 구현예 285에 있어서, 상기 단계 (e)가 세포 배양액을 여과하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
287. 구현예 282 내지 286 중 어느 한 구현예에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법:
(f) 세포 배양액에서 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계.
288. 구현예 287에 있어서, 상기 단계 (f)가 하기 하위단계를 포함하는, 방법:
(i) 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계;
(ii) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및
(iii) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계.
289. 구현예 288에 있어서, 상기 단계 (f)가 하기 하위단계를 추가로 포함하는, 방법:
(iv) 정제된 생성물 풀을 농축하여 농축된 생성물 풀을 형성하는 단계.
290. 구현예 289에 있어서, 상기 단계 (f)가 하기 하위단계를 추가로 포함하는, 방법:
(v) 정제된 생성물 풀을 한외여과하는 단계.
291. 구현예 290에 있어서, 상기 한외여과 단계가 정제된 생성물 풀을 10 kDa 복합 재생 셀룰로스 한외여과 막으로 여과하는 단계를 포함하는, 방법.
292. 구현예 289 내지 291 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 단계 (f)가 하기 하위단계를 추가로 포함하는, 방법:
(vi) 농축된 생성물 풀의 완충액을 교환하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 한외여과 및 투석여과(UFDF) 풀을 형성하는 단계.
293. 구현예 292에 있어서, 상기 농축된 생성물 풀의 완충액을 0.01 M 나트륨 포스페이트, pH 7.2, 최종 농도를 포함하는 투석여과 완충액과 교환하는, 방법.
294. 구현예 292 또는 293에 있어서, 상기 단계 (f)가 하기 하위단계를 추가로 포함하는, 방법:
(vii) UFDF 풀을 제형 완충액으로 조건화하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조건화된 UFDF 풀을 형성하는 단계.
295. 구현예 288 내지 294 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 하위단계 (i)이 세포 배양액을 친화성 칼럼에 접촉시키기 전에 세포 배양액에 세제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
296. 구현예 288 내지 294 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 하위단계 (i)이 세제를 친화성 풀에 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함하는, 방법.
297. 구현예 295 또는 296에 있어서, 상기 세제가 TRITON® X-100 또는 TRITON® CG110인, 방법.
298. 구현예 295 내지 297에 있어서, 상기 세제의 최종 농도가 약 0.01% 내지 약 2%(v/v)인, 방법.
299. 구현예 298에 있어서, 상기 세제의 최종 농도가 약 0.1% 내지 약 1%(v/v)인, 방법.
300. 구현예 299에 있어서, 상기 세제의 최종 농도가 약 0.3% 내지 약 0.5%(v/v)인, 방법.
301. 구현예 300에 있어서, 상기 세제의 최종 농도가 약 0.5%인, 방법.
302. 구현예 295 내지 301 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 바이러스 불활성화가 약 12° 내지 약 25℃에서 수행되는, 방법.
303. 구현예 288 내지 302 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 바이러스를 불활성화시키는 단계가 약 0.5 시간 초과의 지속시간을 갖는, 방법.
304. 구현예 288 내지 303 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체가 단백질 A 수지, 단백질 G 수지, 또는 IL-22 수용체 수지를 포함하는, 방법.
305. 구현예 304에 있어서, 상기 단백질 A 수지가 MABSELECT SURE® 수지인, 방법.
306. 구현예 288 내지 305 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 세척 완충액이 0.4 M 칼륨 포스페이트, pH 7.0, 최종 농도를 포함하는, 방법.
307. 구현예 288 내지 306 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 용리 완충액이 0.3 M L-아르기닌 하이드로클로라이드, 0.013 M 나트륨 포스페이트, pH 3.8, 최종 농도를 포함하는, 방법.
308. 구현예 288 내지 307 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체가 다중모드 기능성 수지를 갖는 강한 음이온 교환기를 포함하는, 방법.
309. 구현예 308에 있어서, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체가 CAPTO™ 부착 수지를 포함하는, 방법.
310. 구현예 288 내지 309 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제1 평형 완충액이 0.04 M 나트륨 아세테이트, pH 5.8, 최종 농도를 포함하는, 방법.
311. 구현예 288 내지 310 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제2 용리 완충액이 구배 용리 완충액인, 방법.
312. 구현예 311에 있어서, 상기 구배 용리 완충액이 구배 용리 완충액의 완충액 A로서 0.04 M 나트륨 아세테이트, pH 5.8 및 구배의 완충액 B로서 0.04 M 나트륨 아세테이트, 0.3M 나트륨 술페이트 pH 5.8을 포함하며, 여기서 구배가 완충액 B의 10%에서 시작하는, 방법.
313. 구현예 288 내지 312 중 어느 한 구현예에 있어서, 상기 제2 평형 완충액이 0.025 M MOPS, 0.3 M 나트륨 술페이트, pH 7.0, 최종 농도를 포함하는, 방법.
314. IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 방법으로, 하기 단계를 포함하는 방법:
(a) IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 제공하고 임의적으로 상기 세포 배양액에서 바이러스를 불활성화시키는 단계;
(b) 상기 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계;
(c) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및
(d) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계.
315. 구현예 314에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 글리코실화되고, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 약 8 내지 약 12 몰의 시알산의 시알산 함량을 갖는, 방법.
본 명세서는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있게 하는데 충분한 것으로 간주된다. 전술한 발명이 이해의 명확성을 목적으로 예시 및 예의 방식으로 일부 상세하게 기재되었지만, 설명 및 예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것들 이외에도 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명으로부터 당업자에게 명백하게 되고 첨부된 청구범위의 범위 내에 속할 것이다.
본원에 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타낸 바와 같이 그들의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 상충하는 경우, 본원의 임의의 정의를 포함하는 본 출원이 우선될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Genentech, Inc. <120> IL-22 Fc FUSION PROTEINS AND METHODS OF USE <130> 50474-180WO2 <150> US 62/622,767 <151> 2018-01-26 <160> 84 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 495 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Human IL-22 <400> 1 atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caactggagt acattcagcg 60 cccatcagct cccactgcag gcttgacaag tccaacttcc agcagcccta tatcaccaac 120 cgcaccttca tgctggctaa ggaggctagc ttggctgata acaacacaga cgttcgtctc 180 attggggaga aactgttcca cggagtcagt atgagtgagc gctgctatct gatgaagcag 240 gtgctgaact tcacccttga agaagtgctg ttccctcaat ctgataggtt ccagccttat 300 atgcaggagg tggtgccctt cctggccagg ctcagcaaca ggctaagcac atgtcatatt 360 gaaggtgatg acctgcatat ccagaggaat gtgcaaaagc tgaaggacac agtgaaaaag 420 cttggagaga gtggagagat caaagcaatt ggagaactgg atttgctgtt tatgtctctg 480 agaaatgcct gcatt 495 <210> 2 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human IL-22 <400> 2 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His 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acttcaccct tgaagaagtg ctgttccctc aatctgatag gttccagcct 240 tatatgcagg aggtggtgcc cttcctggcc aggctcagca acaggctaag cacatgtcat 300 attgaaggtg atgacctgca tatccagagg aatgtgcaaa agctgaagga cacagtgaaa 360 aagcttggag agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcatt 438 <210> 4 <211> 146 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> IL-22 (mature) <400> 4 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu 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aagcttggag agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattcg cgttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accatgccca 480 gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 540 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 600 cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 ccgcgggagg agcagttcgg aagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 780 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 960 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1020 accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggt 1128 <210> 8 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG4 (minus C-terminal Lys) N297G <400> 8 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 Cys Ile Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Phe Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 370 375 <210> 9 <211> 1128 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 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tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 960 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1020 accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggt 1128 <210> 10 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG4 (minus C-terminal Lys) N297A <400> 10 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val 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cacagtgaaa 360 aagcttggag agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattga gcccaaatct agtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 480 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 540 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 600 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 660 aagccgcggg aggagcagta cggaagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 720 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 780 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 840 accctgcccc catcccggga agagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 900 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 960 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1020 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1080 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg t 1131 <210> 12 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG1 (minus C-terminal Lys) N297G <400> 12 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 Cys Ile Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 145 150 155 160 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 165 170 175 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 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Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG1 (minus C-terminal Lys) N297A <400> 13 gcgcccatca gctcccactg caggcttgac aagtccaact tccagcagcc ctatatcacc 60 aaccgcacct tcatgctggc taaggaggct agcttggctg ataacaacac agacgttcgt 120 ctcattgggg agaaactgtt ccacggagtc agtatgagtg agcgctgcta tctgatgaag 180 caggtgctga acttcaccct tgaagaagtg ctgttccctc aatctgatag gttccagcct 240 tatatgcagg aggtggtgcc cttcctggcc aggctcagca acaggctaag cacatgtcat 300 attgaaggtg atgacctgca tatccagagg aatgtgcaaa agctgaagga cacagtgaaa 360 aagcttggag agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattga gcccaaatct agtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 480 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 540 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 600 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 660 aagccgcggg aggagcagta cgctagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 720 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 780 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 840 accctgcccc catcccggga agagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 900 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 960 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1020 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1080 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg t 1131 <210> 14 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG1 (minus C-terminal Lys) N297A <400> 14 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr 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agctgaagga cacagtgaaa 360 aagcttggag agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattcg cgttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accatgccca 480 gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 540 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 600 cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 ccgcgggagg agcagttcgg aagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 780 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 960 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1020 accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a 1131 <210> 16 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG4 (full) N297G <400> 16 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 Cys Ile Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 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Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG4 (full) N297A <400> 17 gcgcccatca gctcccactg caggcttgac aagtccaact tccagcagcc ctatatcacc 60 aaccgcacct tcatgctggc taaggaggct agcttggctg ataacaacac agacgttcgt 120 ctcattgggg agaaactgtt ccacggagtc agtatgagtg agcgctgcta tctgatgaag 180 caggtgctga acttcaccct tgaagaagtg ctgttccctc aatctgatag gttccagcct 240 tatatgcagg aggtggtgcc cttcctggcc aggctcagca acaggctaag cacatgtcat 300 attgaaggtg atgacctgca tatccagagg aatgtgcaaa agctgaagga cacagtgaaa 360 aagcttggag agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattcg cgttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accatgccca 480 gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 540 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 600 cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 ccgcgggagg agcagttcgc tagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 780 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 960 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1020 accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa a 1131 <210> 18 <211> 377 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG4 (full) N297A <400> 18 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 Cys Ile Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Phe Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 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agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattga gcccaaatct agtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 480 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 540 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 600 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 660 aagccgcggg aggagcagta cggaagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 720 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 780 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac 840 accctgcccc catcccggga agagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc 900 aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac 960 aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag 1020 ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat 1080 gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 1134 <210> 20 <211> 378 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG1 (full) N297G <400> 20 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 Cys Ile Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 145 150 155 160 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 165 170 175 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 180 185 190 Val Val Val Asp Val 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<220> <223> IL-22 Fc fusion IgG1 (full) N297A <400> 21 gcgcccatca gctcccactg caggcttgac aagtccaact tccagcagcc ctatatcacc 60 aaccgcacct tcatgctggc taaggaggct agcttggctg ataacaacac agacgttcgt 120 ctcattgggg agaaactgtt ccacggagtc agtatgagtg agcgctgcta tctgatgaag 180 caggtgctga acttcaccct tgaagaagtg ctgttccctc aatctgatag gttccagcct 240 tatatgcagg aggtggtgcc cttcctggcc aggctcagca acaggctaag cacatgtcat 300 attgaaggtg atgacctgca tatccagagg aatgtgcaaa agctgaagga cacagtgaaa 360 aagcttggag agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattga gcccaaatct agtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 480 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 540 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 600 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 660 aagccgcggg aggagcagta cgctagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 720 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 780 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 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gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattcg cgttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accatgccca 480 gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 540 ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 600 cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 660 ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 720 caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 780 tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 840 ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 900 ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 960 tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta 1020 accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1080 gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggt 1128 <210> 24 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG4 (wt N297, minus Lys) <400> 24 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 Cys Ile Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser Gln 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IL-22 Fc fusion IgG1 (wt N297, minus Lys) <400> 25 gcgcccatca gctcccactg caggcttgac aagtccaact tccagcagcc ctatatcacc 60 aaccgcacct tcatgctggc taaggaggct agcttggctg ataacaacac agacgttcgt 120 ctcattgggg agaaactgtt ccacggagtc agtatgagtg agcgctgcta tctgatgaag 180 caggtgctga acttcaccct tgaagaagtg ctgttccctc aatctgatag gttccagcct 240 tatatgcagg aggtggtgcc cttcctggcc aggctcagca acaggctaag cacatgtcat 300 attgaaggtg atgacctgca tatccagagg aatgtgcaaa agctgaagga cacagtgaaa 360 aagcttggag agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct 420 ctgagaaatg cctgcattga gcccaaatct agtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 480 ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac 540 accctcatga tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 600 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca 660 aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg 720 caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca 780 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 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<220> <223> IL-22 Fc fusion IgG4 (N297 wt) <400> 28 Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln Gln 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser Leu 20 25 30 Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe His 35 40 45 Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu Asn 50 55 60 Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln Pro 65 70 75 80 Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg Leu 85 90 95 Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn Val 100 105 110 Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu Ile 115 120 125 Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn Ala 130 135 140 Cys Ile Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 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atcctttttc tagtagcaac tgcaactgga 60 gtacattcag cgcccatcag ctcccactgc aggc 94 <210> 55 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IL-22 Fc fusion IgG4 reverse primer <400> 55 aggtcgactt atttacccag agacagggag agg 33 <210> 56 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG1 N297G forward primer <400> 56 gcgggaggag cagtacggaa gcacgtaccg tgtgg 35 <210> 57 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG1 N297G reverse primer <400> 57 ccacacggta cgtgcttccg tactgctcct cccgc 35 <210> 58 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG4 N297G forward primer <400> 58 acaaagccgc gggaggagca gttcggaagc acgtaccgtg tggtcagcgt c 51 <210> 59 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic IgG4 N297G reverse primer <400> 59 gacgctgacc acacggtacg tgcttccgaa ctgctcctcc cgcggctttg t 51 <210> 60 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> IL-22 Fc fusion IgG2a <400> 60 Met Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala Asn 20 25 30 Ala Leu Pro Val Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln 35 40 45 Gln Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 65 70 75 80 Arg Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 85 90 95 Asn Phe Thr Leu Glu Asp Val Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln 100 105 110 Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln 115 120 125 Leu Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn 130 135 140 Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu 145 150 155 160 Ile Lys Ala 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tggatttatt tatagaaaca tcattcgata 1057 ttgctacttg agtgtaaggc taatattgat atttatgaca ataattatag agctataaca 1117 tgtttatttg acctcaataa acacttggat atccc 1152 <210> 71 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu 1 5 10 15 Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala 20 25 30 Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln 35 40 45 Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser 50 55 60 Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe 65 70 75 80 His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu 85 90 95 Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln 100 105 110 Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg 115 120 125 Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn 130 135 140 Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu 145 150 155 160 Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu 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Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn 275 280 285 Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys 290 295 300 Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu 305 310 315 320 Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe 325 330 335 Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu 340 345 350 Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr 355 360 365 Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg 370 375 380 Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His 385 390 395 400 Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 405 410 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 74 aggtccattc agatgctggt 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 75 taggtgtggt tgacgtggag 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 76 ccaccccaca ctcacaccgg 20 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Phe Tyr 1 5 10 15 Leu Leu Trp Thr Pro Ser Thr Gly Leu Lys Thr Leu Asn Leu Gly Ser 20 25 30 Cys Val Ile Ala Thr Asn Leu Gln Glu Ile Arg Asn Gly Phe Ser Glu 35 40 45 Ile Arg Gly Ser Val Gln Ala Lys Asp Gly Asn Ile Asp Ile Arg Ile 50 55 60 Leu Arg Arg Thr Glu Ser Leu Gln Asp Thr Lys Pro Ala Asn Arg Cys 65 70 75 80 Cys Leu Leu Arg His Leu Leu Arg Leu Tyr Leu Asp Arg Val Phe Lys 85 90 95 Asn Tyr Gln Thr Pro Asp His Tyr Thr Leu Arg Lys Ile Ser Ser Leu 100 105 110 Ala Asn Ser Phe Leu Thr Ile Lys Lys Asp Leu Arg Leu Cys His Ala 115 120 125 His Met Thr Cys His Cys Gly Glu Glu Ala Met Lys Lys Tyr Ser Gln 130 135 140 Ile Leu Ser His Phe Glu Lys Leu Glu Pro Gln Ala Ala Val Val Lys 145 150 155 160 Ala Leu Gly Glu Leu Asp Ile Leu Leu Gln Trp Met Glu Glu Thr Glu 165 170 175 <210> 79 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Met Asn Phe Gln Gln Arg Leu Gln Ser Leu Trp Thr Leu Ala Ser Arg 1 5 10 15 Pro Phe Cys Pro Pro Leu Leu Ala Thr Ala Ser Gln Met Gln Met Val 20 25 30 Val Leu Pro Cys Leu Gly Phe Thr Leu Leu Leu Trp Ser Gln Val Ser 35 40 45 Gly Ala Gln Gly Gln Glu Phe His Phe Gly Pro Cys Gln Val Lys Gly 50 55 60 Val Val Pro Gln Lys Leu Trp Glu Ala Phe Trp Ala Val Lys Asp Thr 65 70 75 80 Met Gln Ala Gln Asp Asn Ile Thr Ser Ala Arg Leu Leu Gln Gln Glu 85 90 95 Val Leu Gln Asn Val Ser Asp Ala Glu Ser Cys Tyr Leu Val His Thr 100 105 110 Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Lys Thr Val Phe Lys Asn Tyr His Asn Arg 115 120 125 Thr Val Glu Val Arg Thr Leu Lys Ser Phe Ser Thr Leu Ala Asn Asn 130 135 140 Phe Val Leu Ile Val Ser Gln Leu Gln Pro Ser Gln Glu Asn Glu Met 145 150 155 160 Phe Ser Ile Arg Asp Ser Ala His Arg Arg Phe Leu Leu Phe Arg Arg 165 170 175 Ala Phe Lys Gln Leu Asp Val Glu Ala Ala Leu Thr Lys Ala Leu Gly 180 185 190 Glu Val Asp Ile Leu Leu Thr Trp Met Gln Lys Phe Tyr Lys Leu 195 200 205 <210> 80 <211> 171 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Met Leu Val Asn Phe Ile Leu Arg Cys Gly Leu Leu Leu Val Thr Leu 1 5 10 15 Ser Leu Ala Ile Ala Lys His Lys Gln Ser Ser Phe Thr Lys Ser Cys 20 25 30 Tyr Pro Arg Gly Thr Leu Ser Gln Ala Val Asp Ala Leu Tyr Ile Lys 35 40 45 Ala Ala Trp Leu Lys Ala Thr Ile Pro Glu Asp Arg Ile Lys Asn Ile 50 55 60 Arg Leu Leu Lys Lys Lys Thr Lys Lys Gln Phe Met Lys Asn Cys Gln 65 70 75 80 Phe Gln Glu Gln Leu Leu Ser Phe Phe Met Glu Asp Val Phe Gly Gln 85 90 95 Leu Gln Leu Gln Gly Cys Lys Lys Ile Arg Phe Val Glu Asp Phe His 100 105 110 Ser Leu Arg Gln Lys Leu Ser His Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ser Ala 115 120 125 Arg Glu Met Lys Ser Ile Thr Arg Met Lys Arg Ile Phe Tyr Arg Ile 130 135 140 Gly Asn Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Ile Ser Glu Leu Asp Ile Leu Leu 145 150 155 160 Ser Trp Ile Lys Lys Leu Leu Glu Ser Ser Gln 165 170 <210> 81 <211> 574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Met Arg Thr Leu Leu Thr Ile Leu Thr Val Gly Ser Leu Ala Ala His 1 5 10 15 Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln Ser 20 25 30 Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly Thr 35 40 45 Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg Asp 50 55 60 Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys Asn 65 70 75 80 Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg Val 85 90 95 Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp Arg 100 105 110 Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr Cys 115 120 125 Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile Phe 145 150 155 160 His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr Gln 165 170 175 Met His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu Thr 180 185 190 Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr Trp 195 200 205 Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro Asp 210 215 220 Arg Thr Trp Thr Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met Gly 225 230 235 240 Phe Leu Val Ala Val Leu Cys Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr Val Thr Lys 245 250 255 Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr Phe 260 265 270 Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Phe Asp 275 280 285 Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Ala Gln Pro Val Gln Tyr Ser Gln Ile 290 295 300 Arg Val Ser Gly Pro Arg Glu Pro Ala Gly Ala Pro Gln Arg His Ser 305 310 315 320 Leu Ser Glu Ile Thr Tyr Leu Gly Gln Pro Asp Ile Ser Ile Leu Gln 325 330 335 Pro Ser Asn Val Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ser Pro Leu Ser Tyr Ala 340 345 350 Pro Asn Ala Ala Pro Glu Val Gly Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln Val 355 360 365 Thr Pro Glu Ala Gln Phe Pro Phe Tyr Ala Pro Gln Ala Ile Ser Lys 370 375 380 Val Gln Pro Ser Ser Tyr Ala Pro Gln Ala Thr Pro Asp Ser Trp Pro 385 390 395 400 Pro Ser Tyr Gly Val Cys Met Glu Gly Ser Gly Lys Asp Ser Pro Thr 405 410 415 Gly Thr Leu Ser Ser Pro Lys His Leu Arg Pro Lys Gly Gln Leu Gln 420 425 430 Lys Glu Pro Pro Ala Gly Ser Cys Met Leu Gly Gly Leu Ser Leu Gln 435 440 445 Glu Val Thr Ser Leu Ala Met Glu Glu Ser Gln Glu Ala Lys Ser Leu 450 455 460 His Gln Pro Leu Gly Ile Cys Thr Asp Arg Thr Ser Asp Pro Asn Val 465 470 475 480 Leu His Ser Gly Glu Glu Gly Thr Pro Gln Tyr Leu Lys Gly Gln Leu 485 490 495 Pro Leu Leu Ser Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Met Ser Leu Pro 500 505 510 Leu Gln Pro Pro Ser Arg Pro Cys Ser Pro Ser Asp Gln Gly Pro Ser 515 520 525 Pro Trp Gly Leu Leu Glu Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Ala Lys 530 535 540 Ser Pro Ala Pro Glu Thr Ser Asp Leu Glu Gln Pro Thr Glu Leu Asp 545 550 555 560 Ser Leu Phe Arg Gly Leu Ala Leu Thr Val Gln Trp Glu Ser 565 570 <210> 82 <211> 559 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 His Ala Pro Glu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Gln His Val Lys Phe Gln 1 5 10 15 Ser Ser Asn Phe Glu Asn Ile Leu Thr Trp Asp Ser Gly Pro Glu Gly 20 25 30 Thr Pro Asp Thr Val Tyr Ser Ile Glu Tyr Lys Thr Tyr Gly Glu Arg 35 40 45 Asp Trp Val Ala Lys Lys Gly Cys Gln Arg Ile Thr Arg Lys Ser Cys 50 55 60 Asn Leu Thr Val Glu Thr Gly Asn Leu Thr Glu Leu Tyr Tyr Ala Arg 65 70 75 80 Val Thr Ala Val Ser Ala Gly Gly Arg Ser Ala Thr Lys Met Thr Asp 85 90 95 Arg Phe Ser Ser Leu Gln His Thr Thr Leu Lys Pro Pro Asp Val Thr 100 105 110 Cys Ile Ser Lys Val Arg Ser Ile Gln Met Ile Val His Pro Thr Pro 115 120 125 Thr Pro Ile Arg Ala Gly Asp Gly His Arg Leu Thr Leu Glu Asp Ile 130 135 140 Phe His Asp Leu Phe Tyr His Leu Glu Leu Gln Val Asn Arg Thr Tyr 145 150 155 160 Gln Met His Leu Gly Gly Lys Gln Arg Glu Tyr Glu Phe Phe Gly Leu 165 170 175 Thr Pro Asp Thr Glu Phe Leu Gly Thr Ile Met Ile Cys Val Pro Thr 180 185 190 Trp Ala Lys Glu Ser Ala Pro Tyr Met Cys Arg Val Lys Thr Leu Pro 195 200 205 Asp Arg Thr Trp Thr Tyr Ser Phe Ser Gly Ala Phe Leu Phe Ser Met 210 215 220 Gly Phe Leu Val Ala Val Leu Cys Tyr Leu Ser Tyr Arg Tyr Val Thr 225 230 235 240 Lys Pro Pro Ala Pro Pro Asn Ser Leu Asn Val Gln Arg Val Leu Thr 245 250 255 Phe Gln Pro Leu Arg Phe Ile Gln Glu His Val Leu Ile Pro Val Phe 260 265 270 Asp Leu Ser Gly Pro Ser Ser Leu Ala Gln Pro Val Gln Tyr Ser Gln 275 280 285 Ile Arg Val Ser Gly Pro Arg Glu Pro Ala Gly Ala Pro Gln Arg His 290 295 300 Ser Leu Ser Glu Ile Thr Tyr Leu Gly Gln Pro Asp Ile Ser Ile Leu 305 310 315 320 Gln Pro Ser Asn Val Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ser Pro Leu Ser Tyr 325 330 335 Ala Pro Asn Ala Ala Pro Glu Val Gly Pro Pro Ser Tyr Ala Pro Gln 340 345 350 Val Thr Pro Glu Ala Gln Phe Pro Phe Tyr Ala Pro Gln Ala Ile Ser 355 360 365 Lys Val Gln Pro Ser Ser Tyr Ala Pro Gln Ala Thr Pro Asp Ser Trp 370 375 380 Pro Pro Ser Tyr Gly Val Cys Met Glu Gly Ser Gly Lys Asp Ser Pro 385 390 395 400 Thr Gly Thr Leu Ser Ser Pro Lys His Leu Arg Pro Lys Gly Gln Leu 405 410 415 Gln Lys Glu Pro Pro Ala Gly Ser Cys Met Leu Gly Gly Leu Ser Leu 420 425 430 Gln Glu Val Thr Ser Leu Ala Met Glu Glu Ser Gln Glu Ala Lys Ser 435 440 445 Leu His Gln Pro Leu Gly Ile Cys Thr Asp Arg Thr Ser Asp Pro Asn 450 455 460 Val Leu His Ser Gly Glu Glu Gly Thr Pro Gln Tyr Leu Lys Gly Gln 465 470 475 480 Leu Pro Leu Leu Ser Ser Val Gln Ile Glu Gly His Pro Met Ser Leu 485 490 495 Pro Leu Gln Pro Pro Ser Arg Pro Cys Ser Pro Ser Asp Gln Gly Pro 500 505 510 Ser Pro Trp Gly Leu Leu Glu Ser Leu Val Cys Pro Lys Asp Glu Ala 515 520 525 Lys Ser Pro Ala Pro Glu Thr Ser Asp Leu Glu Gln Pro Thr Glu Leu 530 535 540 Asp Ser Leu Phe Arg Gly Leu Ala Leu Thr Val Gln Trp Glu Ser 545 550 555 <210> 83 <211> 325 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Met Ala Trp Ser Leu Gly Ser Trp Leu Gly Gly Cys Leu Leu Val Ser 1 5 10 15 Ala Leu Gly Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val 20 25 30 Asn Phe Lys Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly 35 40 45 Asn Leu Thr Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp 50 55 60 Lys Cys Met Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser 65 70 75 80 Lys Tyr Gly Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu 85 90 95 His Ser Asp Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile 100 105 110 Ile Gly Pro Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Leu His 115 120 125 Met Arg Phe Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr 130 135 140 Met Lys Asn Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys 145 150 155 160 Asn Gly Thr Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu 165 170 175 Val Leu Arg Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg 180 185 190 Gly Phe Leu Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val 195 200 205 Cys Glu Gln Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser Trp Met Val Ala 210 215 220 Val Ile Leu Met Ala Ser Val Phe Met Val Cys Leu Ala Leu Leu Gly 225 230 235 240 Cys Phe Ala Leu Leu Trp Cys Val Tyr Lys Lys Thr Lys Tyr Ala Phe 245 250 255 Ser Pro Arg Asn Ser Leu Pro Gln His Leu Lys Glu Phe Leu Gly His 260 265 270 Pro His His Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro Leu Ser Asp Glu 275 280 285 Asn Asp Val Phe Asp Lys Leu Ser Val Ile Ala Glu Asp Ser Glu Ser 290 295 300 Gly Lys Gln Asn Pro Gly Asp Ser Cys Ser Leu Gly Thr Pro Pro Gly 305 310 315 320 Gln Gly Pro Gln Ser 325 <210> 84 <211> 306 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Met Val Pro Pro Pro Glu Asn Val Arg Met Asn Ser Val Asn Phe Lys 1 5 10 15 Asn Ile Leu Gln Trp Glu Ser Pro Ala Phe Ala Lys Gly Asn Leu Thr 20 25 30 Phe Thr Ala Gln Tyr Leu Ser Tyr Arg Ile Phe Gln Asp Lys Cys Met 35 40 45 Asn Thr Thr Leu Thr Glu Cys Asp Phe Ser Ser Leu Ser Lys Tyr Gly 50 55 60 Asp His Thr Leu Arg Val Arg Ala Glu Phe Ala Asp Glu His Ser Asp 65 70 75 80 Trp Val Asn Ile Thr Phe Cys Pro Val Asp Asp Thr Ile Ile Gly Pro 85 90 95 Pro Gly Met Gln Val Glu Val Leu Ala Asp Ser Leu His Met Arg Phe 100 105 110 Leu Ala Pro Lys Ile Glu Asn Glu Tyr Glu Thr Trp Thr Met Lys Asn 115 120 125 Val Tyr Asn Ser Trp Thr Tyr Asn Val Gln Tyr Trp Lys Asn Gly Thr 130 135 140 Asp Glu Lys Phe Gln Ile Thr Pro Gln Tyr Asp Phe Glu Val Leu Arg 145 150 155 160 Asn Leu Glu Pro Trp Thr Thr Tyr Cys Val Gln Val Arg Gly Phe Leu 165 170 175 Pro Asp Arg Asn Lys Ala Gly Glu Trp Ser Glu Pro Val Cys Glu Gln 180 185 190 Thr Thr His Asp Glu Thr Val Pro Ser Trp Met Val Ala Val Ile Leu 195 200 205 Met Ala Ser Val Phe Met Val Cys Leu Ala Leu Leu Gly Cys Phe Ala 210 215 220 Leu Leu Trp Cys Val Tyr Lys Lys Thr Lys Tyr Ala Phe Ser Pro Arg 225 230 235 240 Asn Ser Leu Pro Gln His Leu Lys Glu Phe Leu Gly His Pro His His 245 250 255 Asn Thr Leu Leu Phe Phe Ser Phe Pro Leu Ser Asp Glu Asn Asp Val 260 265 270 Phe Asp Lys Leu Ser Val Ile Ala Glu Asp Ser Glu Ser Gly Lys Gln 275 280 285 Asn Pro Gly Asp Ser Cys Ser Leu Gly Thr Pro Pro Gly Gln Gly Pro 290 295 300 Gln Ser 305

Claims (103)

  1. 인터류킨-22(IL-22) Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물로, 여기서 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 항체 Fc 영역에 연결된 글리코실화된 IL-22 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 조성물은 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 N-글리코실화되는, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및/또는 Asn143에 상응하는 하나 이상의 위치에서 글리코실화되는, 조성물.
  4. IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물로, 여기서 상기 IL-22 Fc 융합 단백질은 링커에 의해 항체 Fc 영역에 연결된 글리코실화된 IL-22 폴리펩티드를 포함하고, 여기서 상기 IL-22 폴리펩티드는 서열번호: 4의 아미노산 잔기 Asn21, Asn35, Asn64, 및/또는 Asn143에 상응하는 하나 이상의 위치에서 글리코실화되고, 여기서:
    (a) 잔기 Asn21에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 70 내지 90 범위;
    (b) 잔기 Asn35에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 90 내지 100 범위;
    (c) 잔기 Asn64에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 90 내지 100 범위; 및/또는
    (d) 잔기 Asn143에서 퍼센트 N-글리코실화 부위 점유는 25 내지 35 범위인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는, 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 조성물이 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 또는 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시알산 글리코실화가 N-아세틸뉴라민산(NANA)을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 1 몰 미만의 N 글리콜릴뉴라민산(NGNA)의 평균 NGNA 함량을 갖는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 액체 조성물인, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 약 8,000 ng/mL 내지 약 19,000 ng의 최대 관찰 농도(Cmax)를 갖고/갖거나;
    (ii) 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 약 7,000 일·ng/mL 내지 약 25,000 일·ng/mL의 시간 0에서 최종 측정가능한 시점까지 혈청 농도-시간 곡선하 면적(AUClast)을 갖고/갖거나;
    (iii) 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 약 40 mL/kg/일 내지 약 140 mL/kg/일의 클리어런스(CL)를 갖는, 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 Cmax, AUClast, 및/또는 CL이 약 1,000 μg/kg의 IL-22 Fc 융합 단백질을 CD1 마우스에 정맥내 투여한 후 평가되는, 조성물.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 1-안테나리, 2-안테나리, 3-안테나리, 및/또는 4-안테나리 구조를 갖는 N-글리칸을 포함하는, 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    (i) 상기 N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 2%가 1-안테나리 구조를 갖고/갖거나;
    (ii) 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 25%가 2-안테나리 구조를 갖고/갖거나;
    (iii) 상기 N-글리칸의 약 25% 내지 약 40%가 3-안테나리 구조를 갖고/갖거나;
    (iv) 상기 N-글리칸의 약 30% 내지 약 51%가 4-안테나리 구조를 갖는, 조성물.
  14. 제2항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 갈락토스 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함하는, 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    (i) 상기 N-글리칸의 약 9% 내지 약 32%가 0개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나;
    (ii) 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 20%가 1개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나;
    (iii) 상기 N-글리칸의 약 8% 내지 약 25%가 2개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나;
    (iv) 상기 N-글리칸의 약 12% 내지 약 25%가 3개의 갈락토스 모이어티를 포함하고/하거나;
    (v) 상기 N-글리칸의 약 12% 내지 약 30%가 4개의 갈락토스 모이어티를 포함하는, 조성물.
  16. 제2항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 0, 1, 2, 3, 또는 4개의 시알산 모이어티를 포함하는 N-글리칸을 포함하는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    (i) 상기 N-글리칸의 약 12% 내지 약 35%가 0개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나;
    (ii) 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%가 1개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나;
    (iii) 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%가 2개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나;
    (iv) 상기 N-글리칸의 약 10% 내지 약 30%가 3개의 시알산 모이어티를 포함하고/하거나;
    (v) 상기 N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%가 4개의 시알산 모이어티를 포함하는, 조성물.
  18. 제2항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 IL-22 폴리펩티드가 말단 만노스 모이어티를 포함하는 약 0% 내지 약 10% N-글리칸을 포함하고/하거나; (ii) 상기 IL-22 폴리펩티드가 말단 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 모이어티를 포함하는 약 30% 내지 약 55% N-글리칸을 포함하는, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 N-글리칸이 1, 2, 3, 또는 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    (i) 상기 N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%가 1개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나;
    (ii) 상기 N-글리칸의 약 1% 내지 약 20%가 2개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나;
    (iii) 상기 N-글리칸의 약 5% 내지 약 25%가 3개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하고/하거나;
    (iv) 상기 N-글리칸의 약 0% 내지 약 15%가 4개의 말단 GlcNAc 모이어티를 포함하는, 조성물.
  21. 제2항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 IL-22 폴리펩티드가 말단 갈락토스(Gal) 모이어티를 포함하는 약 20% 내지 약 45% N-글리칸을 포함하고/하거나; (ii) 상기 N-글리칸이 1, 2, 또는 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    (i) 상기 N-글리칸의 약 15% 내지 약 30%가 1개의 말단 Gal 모이어티를 포함하고/하거나;
    (ii) 상기 N-글리칸의 약 1% 내지 약 15%가 2개의 말단 Gal 모이어티를 포함하고/하거나;
    (iii) 상기 N-글리칸의 약 0.1% 내지 약 6%가 3개의 말단 Gal 모이어티를 포함하는, 조성물.
  23. 제2항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, (i) 상기 IL-22 폴리펩티드가 갈락토스 N-아세틸글루코사민(LacNAc) 반복부를 포함하는 N-글리칸을 포함하고/하거나; (ii) 상기 IL-22 폴리펩티드가 푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함하고/하거나; (iii) 상기 IL-22 폴리펩티드가 비푸코실화된 N-글리칸을 포함하는 N-글리칸을 포함하는, 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역이 글리코실화되지 않은, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, (i) Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 297에서 아미노산 잔기가 Gly 또는 Ala이고/이거나; (ii) Fc 영역의 EU 지수에서의 위치 299에서 아미노산 잔기가 Ala, Gly, 또는 Val인, 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 영역이 IgG1 또는 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 Fc 영역이 IgG4의 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는, 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8의 아미노산 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 서열번호: 8, 서열번호: 10, 또는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 조성물.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 인간 IL-22 폴리펩티드인, 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 상기 IL-22 폴리펩티드가 서열번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 링커가 아미노산 서열 RVESKYGPP(서열번호: 44)를 포함하거나 또는 이로 이루어지는, 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 IL-22 수용체에 결합하는, 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 IL-22 수용체가 인간 IL-22 수용체인, 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 인간 IL-22 수용체가 IL-22R1 폴리펩티드 및 IL-10R2 폴리펩티드로 이루어진 이종이량체를 포함하는, 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 IL-22R1 폴리펩티드가 서열번호: 82의 아미노산 서열을 포함하고 상기 IL-10R2 폴리펩티드가 서열번호: 84의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 2개의 쇄간 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 단일-쇄 단위로 이루어지며, 여기서 각각의 단일 쇄 단위가 인간 면역글로불린 IgG4의 Fc 영역과 융합된 IL-22를 포함하는 인간 IL-22 융합 단백질로 이루어지는, 조성물.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적 조성물인, 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 조성물이 수성 및/또는 멸균된, 조성물.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 추가적인 치료제를 추가로 포함하는, 조성물.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 겔화제를 추가로 포함하는, 조성물.
  42. 염증성 장 질환(IBD)의 치료를 필요로 하는 대상체에서 염증성 장 질환(IBD)을 치료하는 방법으로, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 IBD가 궤양성 대장염 또는 크론병인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 IBD가 궤양성 대장염인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 궤양성 대장염이 중등증 내지 중증 궤양성 대장염인, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 IBD가 크론병인, 방법.
  47. 의약으로서 사용하기 위한 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 인터류킨(IL)-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물.
  48. 하기에서 사용하기 위한 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 인터류킨(IL)-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물:
    (i) 염증성 장 질환(IBD)의 치료,
    (ii) 장내 세균 감염의 억제, 세균 감염 동안 장내 배상 세포의 보존, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유의 향상,
    (iii) 급성 신부전 또는 급성 췌장염의 치료,
    (iv) 상처 치유의 가속화 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유의 가속화 또는 개선,
    (v) 심혈관 질환 예컨대 관상 동맥 질환, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 또는 만성 신장 질환의 예방 또는 치료,
    (vi) 대사 증후군의 치료, 또는
    (vii) 급성 내독소혈증 또는 패혈증의 치료.
  49. 하기에서 사용하기 위한 의약의 제조를 위한 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 인터류킨(IL)-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물의 용도:
    (i) 염증성 장 질환(IBD)의 치료,
    (ii) 장내 세균 감염의 억제, 세균 감염 동안 장내 배상 세포의 보존, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유의 향상,
    (iii) 급성 신부전 또는 급성 췌장염의 치료,
    (iv) 상처 치유의 가속화 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유의 가속화 또는 개선,
    (v) 심혈관 질환 예컨대 관상 동맥 질환, 관상 미세혈관 질환, 뇌졸중, 경동맥 질환, 말초 동맥 질환, 또는 만성 신장 질환의 예방 또는 치료,
    (vi) 대사 증후군의 치료, 또는
    (vii) 급성 내독소혈증 또는 패혈증의 치료.
  50. 장내 세균 감염의 억제, 세균 감염 동안 장내 배상 세포의 보존, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유의 향상을 필요로 하는 대상체에서 장내 세균 감염의 억제, 세균 감염 동안 장내 배상 세포의 보존, 장내 상피 세포 완전성, 상피 세포 증식, 상피 세포 분화, 상피 세포 이동 또는 상피 상처 치유의 향상의 방법으로, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  51. 급성 신부전 또는 급성 췌장염의 치료를 필요로 하는 대상체에서 급성 신부전 또는 급성 췌장염을 치료하는 방법으로, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  52. 상처 치유의 가속화 또는 개선을 필요로 하는 대상체에서 상처 치유를 가속화 또는 개선하는 방법으로, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  53. 죽상경화 플라크 형성의 병리를 포함하는 심혈관 병태의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에서 심혈관 병태를 예방 또는 치료하는 방법으로, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  54. 대사 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에서 대사 증후군을 치료하는 방법으로, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  55. 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다의 치료를 필요로 하는 대상체에서 급성 내독소혈증, 패혈증, 또는 둘 다를 치료하는 방법으로, 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  56. 제42항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 정맥내로, 피하로, 복강내로, 또는 국소로 투여되는, 방법, 조성물, 또는 용도.
  57. 제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 적어도 하나의 추가적인 치료제와 공동 투여받는, 방법, 조성물, 또는 용도.
  58. IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 방법으로, 상기 방법은
    생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 적어도 약 10일 동안 생산 배지에서 복수의 숙주 세포를 포함하는 접종물 트레인 배양물을 배양하며, 여기서 상기 숙주 세포는 링커에 의해 Fc 영역에 연결된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고, 여기서 상기 숙주 세포는 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하고, 이에 의해 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하며,
    상기 IL-22 폴리펩티드는 글리코실화되고, 상기 조성물은 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 배양 지속기간이 적어도 11 일, 적어도 12 일, 또는 적어도 13 일인, 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 배양 지속기간이 12 일인, 방법.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 생산 배지에서 접종물 트레인 배양물을 배양하기 전에 시드 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 시드 트레인 배지에서 배양함으로써 시드 트레인 배양물을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 생산 배지에서 접종물 트레인 배양물을 배양하기 전에 접종물 트레인 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 시드 트레인 배양물을 접종물 배지 내에 접종하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵생물 숙주 세포인, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 진핵생물 숙주 세포가 포유동물 숙주 세포인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 포유동물 숙주 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포인, 방법.
  66. 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    생산 배양물로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 세포 배양액을 수확하는 단계가 (i) 생산 배양물을 냉각시키는 단계; (ii) 원심분리에 의해 생산 배지로부터 숙주 세포를 제거하여 세포 배양액을 형성하는 단계; 및/또는 (iii) 상기 세포 배양액을 여과하는 단계를 포함하는, 방법.
  68. 제58항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 배양액에서 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계가 하기 하위단계를 포함하는, 방법:
    (i) 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계;
    (ii) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및
    (iii) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계.
  70. 제69항에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계가 하기 하위단계 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법:
    (iv) 상기 정제된 생성물 풀을 농축시켜 농축된 생성물 풀을 형성하는 단계;
    (v) 상기 정제된 생성물 풀을 한외여과하는 단계;
    (vi) 상기 농축된 생성물 풀의 완충액을 교환하여 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 한외여과 및 투석여과(UFDF) 풀을 형성하는 단계; 및/또는
    (vii) 상기 UFDF 풀을 제형 완충액으로 조건화하여 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조건화된 UFDF 풀을 형성하는 단계.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 하위단계 (i)이 상기 세포 배양액을 친화성 칼럼에 접촉시키기 전에 상기 세포 배양액에 세제(detergent)를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  72. 제58항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 조성물의 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 조성물이 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 내지 8 몰의 시알산 범위의 초기 평균 시알산 함량을 갖는, 방법.
  74. 제72항에 있어서, 상기 조성물이 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6, 7, 또는 8 몰의 시알산의 초기 평균 시알산 함량을 갖는, 방법.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위로 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 포함하는, 방법.
  76. 제62항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위로 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  77. 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체가 단백질 A 수지, 단백질 G 수지, 또는 IL-22 수용체 수지를 포함하는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 단백질 A 수지가 MABSELECT SURE® 수지인, 방법.
  79. 제70항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체가 다중모드 기능성 수지를 갖는 강한 음이온 교환기를 포함하는, 방법.
  80. 제79항에 있어서, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체가 CAPTO™ 부착 수지를 포함하는, 방법.
  81. 제58항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는, 방법.
  82. 제58항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 또는 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는, 방법.
  83. 제58항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질이 2개의 쇄간 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 단일-쇄 단위로 이루어지며, 여기서 각각의 단일 쇄 단위가 인간 면역글로불린 IgG4의 Fc 영역과 융합된 IL-22를 포함하는 인간 IL-22 융합 단백질로 이루어지는, 방법.
  84. 제58항 내지 제83항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성된 조성물.
  85. 제84항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적 조성물인, 조성물.
  86. 방출을 위한 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 배치를 선택하는 방법으로, 하기 단계를 포함하는, 방법:
    (a) IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 배치(batch)를 제공하는 단계;
    (b) 상기 배치에서 시알산의 수준을 평가하는 단계; 및
    (c) 상기 배치가 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는 경우 방출을 위한 배치를 선택하는 단계.
  87. 제86항에 있어서, 상기 배치가 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 경우에 단계 (c)가 방출을 위한 배치를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 배치가 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 경우에 단계 (c)가 방출을 위한 배치를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  89. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 배치가 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 9 몰의 시알산의 평균 시알산 함량을 갖는 경우에 단계 (c)가 방출을 위한 배치를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  90. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가 상기 배치에서 시알산의 수준을 평가하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC), 모세관 전기영동, 또는 비색 분석법을 사용하는 것을 포함하는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 단계 (b)가 HPLC를 사용하여 시알산의 수준을 평가하는 단계를 포함하는, 방법.
  92. 링커에 의해 항체 Fc 영역에 연결된 글리코실화된 IL-22 폴리펩티드를 포함하는 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조성물의 시알산 함량을 제어하는 방법으로, 하기 단계를 포함하는, 방법:
    적어도 10 일 동안 생산 배양물을 형성하기에 적합한 조건 하에 생산 배지에서 복수의 숙주 세포를 포함하는 접종물 트레인 배양물을 배양하며, 여기서 상기 숙주 세포는 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하고 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 발현하며, 여기서 상기 조성물은 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 6 내지 12 몰의 시알산 범위의 평균 시알산 함량을 갖는, 단계; 및
    상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 12 몰의 시알산 범위로 상기 조성물의 평균 시알산 함량을 풍부화하여, 이에 의해 상기 조성물의 시알산 함량을 제어하는 단계.
  93. 제92항에 있어서, 상기 방법이 상기 IL-22 Fc 융합 단백질의 몰 당 8 내지 9 몰의 시알산 범위로 상기 조성물의 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계를 포함하는, 방법.
  94. 제92항 또는 제93항에 있어서, 상기 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계가 생산 배양물로부터 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 세포 배양액을 수확하는 단계를 포함하는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 세포 배양액을 수확하는 단계가 (i) 상기 생산 배양물을 냉각시키는 단계; (ii) 원심분리에 의해 생산 배지로부터 숙주 세포를 제거하여 상기 세포 배양액을 형성하는 단계; 및/또는 (iii) 상기 세포 배양액을 여과하는 단계를 포함하는, 방법.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 상기 조성물의 평균 시알산 함량을 풍부화하는 단계가 상기 세포 배양액에서 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계가 하기 하위단계를 포함하는, 방법:
    (i) 상기 세포 배양액을 친화성 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 친화성 크로마토그래피 지지체를 세척 완충액으로 세척하고, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체로부터 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 제1 용리 완충액으로 용리시켜 친화성 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 친화성 풀에서 바이러스를 불활성화시키는 단계;
    (ii) 상기 친화성 풀을 음이온-교환 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고, 임의적으로 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체를 제1 평형 완충액으로 세척하고, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체로부터 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 제2 용리 완충액으로 용리시켜 음이온-교환 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 음이온-교환 풀을 여과하여 바이러스를 제거하는 단계; 및
    (iii) 상기 음이온-교환 풀을 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체에 접촉시키고 통과액을 수집하여 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 정제된 생성물 풀을 형성하고, 임의적으로 상기 소수성-상호작용 크로마토그래피 지지체를 제2 평형 완충액으로 세척하고, 통과액을 수집하고, 이를 상기 정제된 생성물 풀에 첨가하는 단계.
  98. 제97항에 있어서, 상기 IL-22 Fc 융합 단백질을 정제하는 단계가 하기 하위단계 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법:
    (iv) 정제된 생성물 풀을 농축하여 농축된 생성물 풀을 형성하는 단계;
    (v) 상기 정제된 생성물 풀을 한외여과하는 단계;
    (vi) 상기 농축된 생성물 풀의 완충액을 교환하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 한외여과 및 투석여과(UFDF) 풀을 형성하는 단계; 및/또는
    (vii) 상기 UFDF 풀을 제형 완충액으로 조건화하여 IL-22 Fc 융합 단백질을 포함하는 조건화된 UFDF 풀을 형성하는 단계.
  99. 제97항 또는 제98항에 있어서, 상기 하위단계 (i)이 상기 세포 배양액을 친화성 칼럼에 접촉시키기 전에 상기 세포 배양액에 세제를 첨가함으로써 바이러스를 불활성화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피 지지체가 단백질 A 수지, 단백질 G 수지, 또는 IL-22 수용체 수지를 포함하는, 방법.
  101. 제100항에 있어서, 상기 단백질 A 수지가 MABSELECT SURE® 수지인, 방법.
  102. 제97항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체가 다중모드 기능성 수지를 갖는 강한 음이온 교환기를 포함하는, 방법.
  103. 제102항에 있어서, 상기 음이온-교환 크로마토그래피 지지체가 CAPTO™ 부착 수지를 포함하는, 방법.
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