KR20200016259A - 올리고뉴클레오타이드의 보존 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 보존 방법, 및 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명은 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 용액에 핵산 결합 단백질을 미리 첨가하는 것에 의해, 상기 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 용액을 안정적으로 보존하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 보존 방법, 및 표적 핵산을 증폭하기 위한 키트에 관한 것이다.
DNA 합성은 연구에 있어서 여러 가지 목적으로 사용된다. 그중, 단쇄 DNA의 화학합성을 제외한 대개의 DNA합성은 DNA 폴리머라아제나 역전사 효소를 이용하는 효소법에 의해 수행된다. In vitro에서 소망하는 DNA 단편을 용이하게 증폭하는 것이 가능한 폴리머라아제 연쇄반응(이하, 'PCR'이라고 언급한다.)은 매우 유익해서, 생물학, 의학, 농학, 및 다른 분야에서 필수적인 툴이 되고 있다. PCR에 의한 DNA의 증폭에서는 많은 경우, 반응이 높은 특이성이 필요하게 된다. 비특이적 증폭을 저감하기 위해서 새로운 DNA 폴리머라아제의 개발 및 반응 혼합물(이하, '반응액'이라고 언급한다.)의 조성의 최적화가 이루어져 있지만, 그렇다고 해도 여전히 PCR 증폭 특이성의 향상이 필요한 것으로 되어 있다.
일반적으로, PCR에 의한 DNA의 증폭에서 반응액에는 주형 핵산, 프라이머, 데옥시리보뉴클레오타이드, 효소, 등의 성분이 포함된다. 또, 증폭한 DNA를 검출하는 경우에는 반응액에 형광색소나 프로브가 포함되는 경우가 있다. 안정적이고 정확한 DNA 합성반응을 실현시키기 위해서는, 이것들의 성분을 반응액에 제공할 때까지, 또는 PCR을 개시할 때까지, 적절하게 보존하는 것이 중요하다.
프라이머나 프로브는 고체 또는 용액(동결된 용액을 포함한다)으로서 보존하는 것이 가능하다. 고체는 안정적이므로 실온에서 보존할 수 있다는 이점이 있는 반면에, 반응액에 제공되기 위해서는 용해해야 하다는 등의 단점이 있다. 한편, 프라이머나 프로브를 용액으로 보존해 두면, 곧 반응액에 사용할 수 있다. 또, 프라이머, 프로브, 데옥시리보뉴클레오타이드, 효소 등, PCR에 필요한 성분을 모두 포함한 반응액을 미리 조제해서 보존해 두는 것에 의해, 신속하게 PCR을 실시할 수 있다. 그러나 용액으로의 보존은 안정성이 부족하다는 단점이 있다. 즉, 프라이머나 프로브를 용액으로 보존했을 경우, PCR의 반응성이 저하되기 쉽다. 용액을 저온에서 보존하거나, 동결 보존하는 것에 의해, 반응성의 저하를 억제시킬 수 있지만, 더욱 효과적인 보존 방법이 요구되고 있다.
상기 PCR의 반응성이나 특이성의 향상을 목적으로 해서 여러 개량이 수행되었다. 예를 들면, PCR 시에 계면활성제나 어떤 종류의 단백질을 공존시키는 것을 들 수 있다. 당해 PCR의 개선으로서 비이온성 계면활성제를 공존시키는 기술이 보고되고 있다(특허문헌 1). 또, 핵산 결합활성을 가지는 단백질, 예를 들면 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질은 PCR과 같은 핵산 합성반응에서 비특이적인 핵산 합성을 억제하는 것이 알려지고 있다(특허문헌 2). 상기 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질로서, 대장균 유래 SSB나 T4 파지 유래 SSB('T4 gene 32 protein'이라고도 언급된다)가 예시되고 있다. 또한, 콜드 쇼크 단백질을 DNA 합성 반응액 조제 시에 첨가하는 것에 의해, DNA 합성반응의 반응성을 향상시키는 방법이 보고되었다(특허문헌 3).
상기 콜드 쇼크 단백질은 여러 미생물로부터 발견되고 있고, 생육 온도를 저온으로 시프트키는 적응에 관여하는 것으로 여겨진다. 이 중, Major Cold Shock Protein으로서 알려진 CspA는 그 유전자가 대장균(Escherichia coli)으로부터 단리되고, 재조합체가 제조되고 있다(특허문헌 4). 또, CspA는 싱글-스트랜드 DNA나 싱글-스트랜드 RNA에 결합하는 성질을 가지고 있다.
이상과 같이, 핵산 결합활성을 가지는 단백질이 DNA 합성반응에 유익한 작용을 가지는 것은 알려지고 있다. 이것들의 방법에서는 합성 반응 개시 직전에, 단백질이 반응액에 첨가된다. 그렇지만, 프라이머나 프로브를 포함하는 용액의 장기 보존에 관해서, 상기의 단백질의 효과가 검토된 적은 없다.
상기한 바와 같이, 프라이머나 프로브의 용액상태에서의 보존은 안정성이 부족하다는 과제가 있었다. 또, 본 발명자들은 프라이머나 프로브를 용액상태로 저온 또는 동결 보존해도 안정성이 부족하게 되는 경우가 있다는 과제를 알아냈다(예를 들면, 실시예 1). 본 발명은 프라이머나 프로브 등의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 용액을 안정적으로 보존하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하도록 예의 노력한 결과, 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 용액에 핵산 결합 단백질을 미리 첨가하는 것에 의해, 상기 올리고뉴클레오타이드를 안정적으로 보존할 수 있음을 알아 내고, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 하기에 관한 것이다.
[1] 올리고뉴클레오타이드의 보존 방법으로서, 핵산 결합 단백질 및 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액을 저온에서 보존하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
[2] 상기 [1]에서, 핵산 결합 단백질이 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질인 방법,
[3] 상기 [2]에서, 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질이 콜드 쇼크 단백질 및 SSBD에서 선택되는 단백질인 방법.
[4] 상기 [2]에서, 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질이 CspA, T4 파지 유래 SSB 및 대장균 유래 SSBD에서 선택되는 단백질인 방법.
[5] 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드가 올리고데옥시리보뉴클레오타이드인 방법.
[6] 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에서, 용액을 동결시켜서 보존하는 공정을 포함하는 방법.
[7] 표적 핵산을 증폭하기 위한 키트로서, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
[8] 상기 [7]에서, 핵산 결합 단백질이 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질인 키트.
[9] 상기 [8]에서, 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질이 콜드 쇼크 단백질 및 SSBD에서 선택되는 단백질인 키트,
[10] 상기 [9]에서, 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질이 CspA, T4 파지 유래 SSB 및 대장균 유래 SSBD에서 선택되는 단백질인 키트.
[11] 상기 [7] 내지 [10] 중 어느 하나에서, 올리고뉴클레오타이드가 올리고데옥시리보뉴클레오타이드인 키트.
[12] 상기 [11]에서, 올리고데옥시리보뉴클레오타이드가 표적 핵산의 증폭에 사용되는 프라이머인 키트.
[13] 상기 [7] 내지 [12] 중 어느 하나에서, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액이 저온에서 보존되고 있는 키트.
[14] 상기 [7] 내지 [13] 중 어느 하나에서, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액이 동결하고 있는 용액인 키트.
[15] 상기 [7] 내지 [14] 중 어느 하나에서, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 제1 용액과, DNA 폴리머라아제, 2가 금속 이온, 데옥시리보뉴클레오타이드 3인산 및 완충 성분으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1이상의 요소를 함유하는 제2 용액을 포함하는 키트.
[16] 상기 [7] 내지 [14] 중 어느 하나에서, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드를 함유하는 용액이, 추가로 DNA 폴리머라아제, 2가 금속 이온, 데옥시리보뉴클레오타이드 3인산 및 완충 성분을 함유하는 키트.
본 발명에 의해, 핵산 합성반응에 유용한 올리고뉴클레오타이드의 보존 방법이 제공된다. 또, 본 발명에 의해, 표적 핵산을 증폭하기 위한 키트가 제공된다.
도 1은 실시예 1에서의 PCR의 증폭 곡선의 예를 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 1에서의 PCR의 융해 곡선의 예를 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 1에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 2에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 3에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 4에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 5에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 6에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 1에서의 PCR의 융해 곡선의 예를 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 1에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 2에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 3에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 4에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 5에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 6에서의 Ct값을 나타내는 도면이다.
(정의)
본 명세서 중에서 사용되는 「핵산」(「폴리뉴클레오타이드」 및 「올리고뉴클레오타이드」를 포함한다)이라는 용어는 뉴클레오타이드가 쇄상으로 연결되어 형성된 직쇄상의 폴리머를 의미하고, 디옥시리보핵산, 리보핵산, 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 폴리아미드 핵산이 예시된다. 천연의 핵산, 인위적으로 제작된 핵산, 및 변형된 핵산이나 그것들의 단편도 「핵산」에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 「프라이머」라는 용어는 DNA 주형 또는 RNA 주형과 중합용 시약(DNA 폴리머라아제, 뉴클레오타이드 3인산 등)의 존재하에서 일어나는 핵산 합성반응에서 개시점으로 기능하는 올리고뉴클레오타이드를 나타낸다. 프라이머는 바람직하게는 싱글-스트랜드이지만, 더블-스트랜드 프라이머도 상기의 기능을 할 수 있다. 더블-스트랜드 프라이머가 사용되는 경우, 증폭반응에서의 사용 전에 그것을 그 싱글-스트랜드 형태로 변환하는 것이 바람직하다. 프라이머는 주지의 방법을 사용해서 화학적 또는 효소적으로 합성될 수 있고, 또 생물로부터 단리될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 「프로브」라는 용어는 표적 핵산을 검출 또는 정량하기 위한 올리고뉴클레오타이드이로서, 표적 핵산과 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 것을 나타낸다. 프로브는 바람직하게는 싱글-스트랜드이지만, 더블-스트랜드 프로브도 상기의 기능을 할 수 있다. 더블-스트랜드 프로브가 사용되는 경우, 검출 반응에서의 사용 전에 그것을 그 싱글-스트랜드형태로 변환하는 것이 바람직하다. 프로브는 주지의 방법을 사용해서 화학적 또는 효소적으로 합성될 수 있고, 또 생물로부터 단리될 수 있다.
(1) 본 발명의 「
올리고뉴클레오타이드의
보존 방법」
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 보존 방법은 핵산 결합 단백질 및 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액을 저온에서 보존하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.
핵산 결합 단백질 및 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액(이하, 「본 발명의 용액」이라고 부른다)을 조제하는 공정을 이하에 나타낸다.
<
올리고뉴클레오타이드
>
본 발명에서의 올리고뉴클레오타이드는 통상은 아데닌, 구아닌, 사이토신 및 타이민의 어느 하나의 염기를 가지는 데옥시리보뉴클레오타이드가 연결한 DNA(올리고데옥시리보뉴클레오타이드) 및/또는 아데닌, 구아닌, 사이토신 및 우라실의 어느 하나의 염기를 가지는 리보뉴클레오타이드가 연결한 RNA(올리고리보뉴클레오타이드), 게다가 DNA와 RNA의 키메라와 같은 천연형 뉴클레오타이드가 연결해서 이루어지는 핵산이 해당된다. 자연계에 존재하는 천연의 핵산을 제한 엔도뉴클레아제 등으로 소화하고, 그 소화물로부터 단리해서 제작한 올리고뉴클레오타이드일 수도 있다. 효소적 혹은 화학적인 방법으로 인위적으로 제작된 올리고뉴클레오타이드도 본 발명의 올리고뉴클레오타이드에 포함된다.
그 밖에도 본 발명에 사용되는 올리고뉴클레오타이드는 비천연형 핵산도 포함할 수 있다. 본 명세서에서 「비천연형 핵산」이란 천연형 핵산에 유사한 구조 및/또는 성질을 가지는 인공적으로 구축된 핵산 유사체를 말한다. 예를 들면, 펩티드 핵산(PNA: Peptide Nucleic Acid), 포스페이트기를 가지는 펩티드 핵산(PHONA), 비천연형의 염기(이노신, 데아자구아노신 등)을 포함하는 핵산, 가교화 핵산(BNA/LNA: Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid), 모르폴리노 핵산 등을 들 수 있다. 메틸포스포네이트형 DNA/RNA, 포스포로티오에이트형 DNA/RNA, 포스포라미데이트형 DNA/RNA, 2'-O-메틸형 DNA/RNA 등의 화학 변형 핵산이나 핵산 유사체를 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 본 발명에 사용할 수도 있다. 또, 형광시료, 소광물질, 색소, 하프텐, 비오틴 등이 부가된 올리고뉴클레오타이드일 수도 있다.
본 발명에서 올리고뉴클레오타이드는 싱글-스트랜드 올리고뉴클레오타이드, 더블-스트랜드 올리고뉴클레오타이드, 및 이것들의 올리고뉴클레오타이드의 혼합물이 해당된다. 예를 들면, 올리고뉴클레오타이드는 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드일 수도 있다. 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드로서는 표적 핵산 검출을 위한 프로브로서 기능하는 것, 표적 핵산의 증폭에 있어서 프라이머로서 기능하는 것이 예시된다.
본 발명에서 올리고뉴클레오타이드의 쇄 길이에는 특별히 제한은 없지만, 싱글-스트랜드 올리고뉴클레오타이드의 경우에는 바람직하게는 6 뉴클레오타이드 이상이고, 더 바람직하게는 10 뉴클레오타이드 이상이다. 인공합성한 싱글-스트랜드 올리고뉴클레오타이드의 경우, 올리고뉴클레오타이드의 합성 관점으로부터, 바람직하게는 100 뉴클레오타이드 이하이고, 더 바람직하게는 30 뉴클레오타이드 이하이다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 포스포라미다이트법에 의해 합성할 수 있다. 그 외에도 인산 트라이에스테르법, H-포스포네이트법, 티오포스포네이트법 등 어떤 방법으로 합성될 수도 있다. 또, 천연의 핵산을 효소적 혹은 화학적인 방법으로 절단해서 올리고뉴클레오타이드를 제작할 수도 있다.
본 발명의 용액에 포함되는 올리고뉴클레오타이드의 종류 수에는 특별히 제한은 없지만, 예를 들면 1종 이상, 바람직하게는 2종 이상, 더 바람직하게는 3종 이상의 핵산이 예시된다. 또, 2종 이상의 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 경우에는 그것들의 혼합비에 한정은 없다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 멀티플렉스 핵산 증폭반응에 사용하는 다른 염기서열을 가지는 프라이머 쌍의 혼합물도 포함된다. 또 당해 혼합물에 표적 핵산 검출용 프로브로서 사용하는 올리고뉴클레오타이드가 포함되는 경우일 수도 있다.
본 발명의 용액에 포함되는 올리고뉴클레오타이드의 농도는 본 발명의 효과를 얻을 수 있을 수 있는 농도라면, 특별하게 한정되지 않고, 올리고뉴클레오타이드의 종류, 핵산 결합 단백질의 종류나 농도, 기타 성분의 종류나 농도, 및 보존 온도등을 고려해서 적당하게 결정할 수 있다. 쇄 길이가 10∼30 뉴클레오타이드의 싱글-스트랜드 올리고뉴클레오타이드 DNA인 경우에는 토탈 농도로서 예를 들면 0.1∼100㎛, 바람직하게는 0.5∼50㎛, 더 바람직하게는 1∼20㎛가 예시된다.
<핵산 결합 단백질>
본 발명에 사용되는 핵산 결합 단백질은 핵산에 결합하는 것이 가능한 단백질일 수도 있으며, 그 종류는 특별하게 한정되지 않는다. 자연계로부터 단리한 단백질일 수도 있고, 인위적으로 작성한 재조합 단백질일 수도 있다. 바람직하게는 본 발명에 사용되는 핵산 결합 단백질은 재조합 단백질이다.
본 발명에서 사용되는 핵산 결합 단백질로서 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질이 예시된다. 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질은 싱글-스트랜드 핵산, 즉 싱글-스트랜드 DNA 및/또는 싱글-스트랜드 RNA에 결합하는 것이 가능한 단백질일 수 있다. 특별하게 한정되지 않지만, 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질로서 SSB(Single-Stranded binding protein) 및 콜드 쇼크 단백질이 예시된다.
본 발명에 사용되는 SSB로서 대장균으로 대표되는 미생물이나 초파리, 아프리카 발톱 개구리, 및 박테리오파지(T4 파지, T7 파지 등)에 유래하는 SSB가 예시된다. 바람직하게는, 대장균의 SSB 또는 T4 파지 유래의 SSB가 사용된다. SSB는 싱글-스트랜드 DNA에 결합하는 성질을 가지고 있다. 또, T4 파지 유래의 SSB는 T4 gene 32 protein(T4gp32)으로 불리는 경우가 있다.
대장균의 배양 온도를 37℃에서 15℃로 저하시키면, CspA가 일과성으로 고레벨로 발현된다. 대장균에는 CspA와 아미노산 서열 상의 동일성이 있는 호몰로그(homologue)로서 CspB∼CspI의 8종의 단백질이 알려지고 있다 J. Bacteriol., 1999, 181, 1603-1609). 추가로, CspA의 호몰로그(homologue)가 Bacillus subtilis(CspB), Bacillus caldolyticus(CspB), Thermotoga maritima(CspB, CspL), Lactobacillus plantarum(CspL) 등의 미생물에도 존재하고 있는 것이 알려지고 있다. 본 발명에서 「콜드 쇼크 단백질」이란 대장균의 CspA의 아미노산 서열에 대하여 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 말한다.
본 발명에는 이것들의 콜드 쇼크 단백질을 사용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 콜드 쇼크 단백질로서는 바람직하게는 CspA가, 더 바람직하게는 그램 음성균 유래의 CspA가, 더욱 바람직하게는 대장균의 CspA가 예시된다. CspA는 싱글-스트랜드 DNA 및 싱글-스트랜드 RNA에 결합하는 성질을 가지고 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명에서는 대장균 유래의 SSB(GenBank Acc. No. NP_418483.1), T4 파지 유래의 SSB(GenBank Acc. No .NP_049854.1), 대장균 유래의 CspA(GenBank Acc. No. NP_418012.1)를 사용할 수 있다. 이것들의 단백질의 아미노산 서열에는 상동성을 가지는 영역이 존재한다. 즉, 대장균 유래 SSB의 부분 아미노산 서열(VASEYLRKGSQV), T4 파지 유래 SSB의 부분 아미노산 서열(EGANFVLKVKQV), 대장균 유래 CspA의 부분 아미노산 서열(DGYKSLDEGQKV)은 서로 상동성을 가진다. 즉, 상기 부분 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가지는 핵산 결합 단백질은 본 발명에서 동일한 효과를 나타내는 것으로 생각되고, 본 발명에서 사용할 수 있다.
본 발명의 용액에 포함되는 핵산 결합 단백질의 종류 수에는 특별히 제한은 없고, 1종의 핵산 결합 단백질을 포함할 수도 있고, 2종 이상을 포함할 수도 있다. 또, 2종 이상의 핵산 결합 단백질을 사용하는 경우에는 그것들의 혼합비에 한정은 없다.
본 발명의 용액에 포함되는 핵산 결합 단백질의 농도는 본 발명의 효과를 얻을 수 있을 수 있는 농도라면, 특별하게 한정되지 않고, 올리고뉴클레오타이드의 종류나 농도, 핵산 결합 단백질의 종류, 기타 성분의 종류나 농도, 및 보존 온도 등을 고려해서 적당하게 결정할 수 있다. 핵산 결합 단백질의 농도(토탈)로서 특별하게 한정되지 않지만, 0.1㎎/㎖ 이상, 0.2㎎/㎖ 이상, 0.3㎎/㎖ 이상, 0.4㎎/㎖ 이상, 0.5㎎/㎖ 이상, 0.6㎎/㎖ 이상, 0.7㎎/㎖ 이상, 0.8㎎/㎖ 이상, 0.9㎎/㎖ 이상, 1.0㎎/㎖ 이상, 1.5㎎/㎖ 이상, 2.0㎎/㎖ 이상, 2.5㎎/㎖ 이상, 3.0㎎/㎖ 이상, 3.5㎎/㎖ 이상, 4.0㎎/㎖ 이상, 4.5㎎/㎖ 이상, 5.0㎎/㎖ 이상, 또는 5.5㎎/㎖ 이상이 예시된다. 또, 핵산 결합 단백질의 농도(토탈)의 상한은 특별하게 한정되지 않지만, 10.0㎎/㎖ 이하, 9.0㎎/㎖ 이하, 8.0㎎/㎖ 이하, 7.0㎎/㎖ 이하, 또는 6.0㎎/㎖ 이하가 예시된다.
<용액>
핵산 결합 단백질과 올리고뉴클레오타이드를 용매 중에서 혼합하는 것에 의해, 핵산 결합 단백질 및 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액(본 발명의 용액)이 조제된다. 핵산 결합 단백질 및 올리고뉴클레오타이드를 혼합하는 용매의 예로서, 한정하나 것은 아니지만, 물, 및 버퍼를 들 수 있다.
본 발명의 용액은 핵산 결합 단백질 및 올리고뉴클레오타이드에 부가해서, 기타의 성분을 함유할 수도 있다. 본 발명의 용액 조성은 본 발명의 효과를 얻을 수 있는 조성이라면, 특별하게 한정은 없다. 올리고뉴클레오타이드의 종류나 농도, 핵산 결합 단백질의 종류나 농도, 및 기타 성분의 종류나 농도는 그 사용 목적이나 보존 온도 등을 고려해서 적당하게 결정할 수 있다.
본 발명의 용액은 완충 성분을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 「완충 성분」은 용액의 수소이온 농도(pH)의 변동을 부드럽게 하는 작용을 가지는 화합물 또는 혼합물을 말한다. 본 발명의 용액에 포함되는 완충 성분으로서 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면, 트리스, 비신, 트라이신, HEPES, 인산염(인산 나트륨, 인산 칼륨 등)을 호적하게 사용할 수 있다. 특히 트리스, 비신, 트라이신, HEPES, 혹은 인산염이 완충 성분으로서 본 발명에 호적하다. 예를 들면, 상기의 핵산 결합 단백질 및 올리고뉴클레오타이드를 혼합하는 용매로서 TE 버퍼를 사용할 수 있다. TE 버퍼란 핵산을 용해 및/또는 보존할 때에 사용되는 표준적인 용액으로 핵산의 분해를 방지하는 작용이 있다. 일반적인 TE 버퍼의 조성은 10mM Tris-HCl(pH 7.2∼8.0), 1mM EDTA다.
본 발명을 특별하게 한정하지 않지만, 본 발명의 용액 pH는 예를 들면 pH 6.0∼pH 10.0, 바람직하게는 pH 6.5∼pH 9.5, 더욱 바람직하게는 pH 7.0∼pH 9.0의 범위로 설정되는 것이 적당하다. 본 발명의 용액이 PCR 반응액에 제공되는 경우에는 반응온도, 사용하는 DNA 폴리머라아제나 기타의 성분을 고려하고, 완충 성분의 종류, 농도, 및 pH를 최적화하는 것은 당연한 것이다.
본 발명의 용액은 추가로 표적 핵산을 증폭하기 위해서 필요 또는 유용한 성분, 예를 들면, 데옥시리보뉴클레오타이드, 효소(DNA 폴리머라아제, 역전사 효소, 등), 금속염, 계면활성제 등을 포함할 수 있다. 또, 증폭한 표적 핵산을 검출하기 위해서 필요 또는 유용한 성분, 즉, 인터컬레이팅 색소 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용액에 포함되는 데옥시리보뉴클레오타이드는, 효소(DNA 폴리머라아제, 역전사 효소, 등)의 기질이 될 수 있는 것일 수 있다. 천연형 DNA로 여겨지는 아데닌, 구아닌, 사이토신 또는 티민염기를 가지는 뉴클레오타이드나 그것들의 혼합물이 예시된다. 일반적으로, DNA 폴리머라아제는 3개의 인산 부분을 가지는 데옥시리보뉴클레오타이드를 핵산 합성반응의 기질로 한다. 따라서 하나의 형태에 있어서, 본 발명의 용액은 데옥시리보뉴클레오타이드 3인산(예를 들면, dATP, dCTP, dITP, dGTP 및 dTTP) 및 그것들의 유도체로 이루어지는 그룹에서 선택되는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 데옥시리보뉴클레오타이드 유도체는 [αS]dATP, 7-데아자-dGTP, 7-데아자-dATP 및 핵산 분해에 저항성을 나타내는 데옥시뉴클레오타이드 유도체를 포함한다. 뉴클레오타이드 유도체는 예를 들면, 32P 혹은 35S 등의 방사성 동위체, 형광 부분, 화학발광 부분, 생물발광 부분 또는 효소로 검출할 수 있도록 표지되어 있는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명의 용액은 DNA 폴리머라아제를 포함할 수도 있다. 본 발명의 용액에 포함되는 DNA 폴리머라아제는 특별하게 한정되지 않지만, 본 발명의 용액이 PCR에 사용되는 경우에는 열안정성 DNA 폴리머라아제가 바람직하다. 본 발명에 이용 가능한 DNA 폴리머라아제로서는 진정세균, 예를 들면 써머스(Thermus)속 또는 바실러스속에 속하는 세균(Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Bacillus caldotenax 등)에 유래하는 DNA 폴리머라아제, 고세균, 예를 들면 피로콕쿠스속 또는 써모코커스속에 속하는 세균(Pyrococcus furiosus, Thermococcus litralis, Thermococcus kodakaraensis 등)에 유래하는 DNA 폴리머라아제가 예시된다. 또한, 이것들 DNA 폴리머라아제의 돌연변이체도 본 발명에 사용할 수 있다.
2종 이상의 DNA 폴리머라아제가 본 발명의 용액에 포함되는 경우도 있다. 예를 들면, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 가지는 DNA 폴리머라아제와, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 실질적으로 가지지 않는 별도의 DNA 폴리머라아제와의 조합을 본 발명에서 사용할 수 있다. 이러한 DNA 폴리머라아제의 조합을 사용하는 기술은 LAPCR(Long and accurate PCR)로서 알려져 있다.
본 발명의 용액은 역전사 효소를 포함할 수도 있다. 본 발명의 용액에 포함되는 역전사 효소는 역전사 활성, 즉 RNA를 주형으로 해서 이것에 상보적인 DNA를 합성하는 활성을 가지는 것이라면 본 발명에 사용할 수 있고, 이러한 역전사 효소로서는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MMLV) 유래 역전사 효소나 조류 골수아구증 바이러스(AMV) 유래 역전사 효소 등의 바이러스 유래의 역전사 효소나 그것들의 돌연변이체가 예시된다. 또, 써머스속 세균(예를 들면 Thermus thermophilus) 유래 DNA 폴리머라아제나 호열성 바실러스속 세균(예를 들면 Bacillus caldotenax) 유래 DNA 폴리머라아제 등의 진정세균 유래의 내열성 역전사 효소(역전사 효소 활성을 가지는 DNA 폴리머라아제)가 예시된다.
본 발명의 용액은 금속염을 포함할 수도 있다. 예를 들면, DNA 폴리머라아제의 활성에 필수적인 2가의 금속 이온염을 들 수 있다. 이러한 2가의 금속 이온으로서는 마그네슘이온, 망간이온, 및 코발트이온이 예시된다. 각 DNA 폴리머라아제에 적합한 2가의 금속 이온과 그 농도는 당해 분야에서 알려져 있다. 2가의 금속 이온은 염화물, 황산염, 또는 아세트산염 등의 염 형태로 공급될 수 있다. 본 발명을 특별하게 한정하지 않지만, 본 발명의 용액에 포함되는 2가의 금속 이온 농도로서는 예를 들면 0.1∼200mM, 바람직하게는 0.2∼100mM, 더욱 바람직하게는 0.5∼50mM가 예시된다. 사용하는 효소(DNA 폴리머라아제, 역전사 효소, 등)의 금속 요구성 등이나 당해 효소를 포함하는 반응액 조제의 순서 등에 따라서 염의 종류 및 농도를 최적화하는 것은 당연한 것이다. 또, 본 발명의 용액은 기타의 염(나트륨염, 칼륨염, 암모늄염 등)을 포함할 수도 있다.
본 발명의 용액은 인터컬레이팅 색소를 포함할 수도 있다. 본 발명의 용액에 포함되는 인터컬레이팅 색소는 더블-스트랜드 핵산으로의 인터컬레이션에 의해 형광이 증강되는 색소를 말한다. 본 발명에 사용되는 인터컬레이팅 색소로서는 PCR에 사용 가능한 것이 바람직하고, SYBR(등록상표) Green I, TB Green(등록상표), SYTO-60, SYTO-62, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3, TO-PRO-3, YO-PRO-1, 및 SYTOX Orange가 예시되고, 그 중에서도 SYBR(등록상표) Green I나 TB Green(등록상표)이 더 적합하게 예시된다.
SYBR(등록상표) Green I는 시판되고 있는 비대칭 시아닌계 색소이고, 그 구조는 Zipper H 들("Nucleic Acids Research", 2004년, 제32권, 제12호, e103)에 의해 밝혀져 있다. Zippe rH 들에 의하면, Life Technologies Corporation에서 판매되고 있는 SYBR(등록상표) Green I의 DMSO 용액에 10,000배 희석액(1X 농도)의 SYBR(등록상표) Green I의 몰 농도는 약 2㎛이다.
본 발명의 용액은 계면활성제를 포함할 수도 있다. 본 발명의 용액에 포함되는 계면활성제는 특별하게 한정은 없지만, Triton(등록상표) X-100(폴리옥시에틸렌(10)옥틸페닐에테르), Tween(등록상표) 20(폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트), 및 Nonidet(등록상표) P-40(옥틸페닐-폴리에틸렌글리콜) 등의 비이온성 계면활성제, 폴리(에틸렌글리콜) 4-노닐페닐 3-설포프로필에테르(PNSE) 등의 음이온성 계면활성제, 염화 디스테아릴디메틸암모늄 등의 양이온성 계면활성제, 및 코가미도프로필 베타인 등의 양성 계면활성제가 예시된다.
본 발명의 용액에 포함되는 계면활성제의 농도는 특별하게 한정은 없지만, 당해 용액이 PCR에 사용되는 것인 경우, 조제되는 PCR 반응액에 함유되는 계면활성제가 적절한 농도가 되도록 설정된다.
<조제>
핵산 결합 단백질과 올리고뉴클레오타이드, 및 필요에 따라서 기타 성분을 용매 중에서 혼합하는 것에 의해, 핵산 결합 단백질 및 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액(본 발명의 용액)이 조제된다. 상기 조제 방법은 특별하게 한정되지 않지만, 미리 각 성분을 고농도로 포함한 용액을 제작해 두고, 그것들을 필요량 분취해서 순차적으로 용기에 첨가해 가는 것이 바람직하다. 각 성분의 혼합 순서는 본 발명의 효과를 얻을 수 있을 수 있는 순서라면, 특별하게 한정되지 않는다. 모든 성분을 첨가한 후, 온화하게 교반하고, 모든 성분이 균일해 질 때까지 혼합한다. 예를 들면, 피펫팅이나 전도 혼화 등에 의한 교반이 예시된다.
<보존>
조제한 본 발명의 용액은 용기에 분주해서 보존할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용기의 소재는 본 발명의 효과를 얻을 수 있을 수 있는 소재라면, 특별하게 한정되지 않지만, 적어도 올리고뉴클레오타이드에 대한 흡착성이 낮은 소재에 의해 형성되고 있는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 용기의 크기 및 형상은 본 발명의 효과를 얻을 수 있을 수 있으면, 특별하게 한정되지 않는다. 또, 분주 방법 및 분주량은 본 발명의 효과를 얻을 수 있을 수 있는 방법 및 분주량이라면, 특별하게 한정되지 않는다.
상기 공정에서 조제한 용액, 즉 「핵산 결합 단백질 및 핵산을 함유하는 용액(본 발명의 용액)」을 저온에서 보존한다.
본 발명에서 「저온」이란 본 발명의 효과를 얻을 수 있을 수 있는 온도라면, 특별하게 한정되지 않고, 올리고뉴클레오타이드의 종류나 농도, 핵산 결합 단백질의 종류나 농도, 올리고뉴클레오타이드와 핵산 결합 단백질의 혼합비, 기타 성분의 종류나 농도, 및 보존 시간 등을 고려해서 적당하게 결정할 수 있다. 특별하게 한정되지 않지만, 4℃ 이하, 0℃ 이하, -10℃ 이하, -20℃ 이하, -30℃ 이하, -40℃ 이하, -50℃ 이하, -60℃ 이하, -70℃ 이하, -80℃ 이하가 예시된다. 특별하게 한정되지 않지만, 용액이 동결하는 온도가 바람직하다.
본 발명의 용액을 보존하는 시간은 본 발명의 효과를 얻을 수 있을 수 있는 시간이라면, 특별하게 한정되지 않고, 올리고뉴클레오타이드의 종류나 농도, 핵산 결합 단백질의 종류나 농도, 올리고뉴클레오타이드와 핵산 결합 단백질의 혼합비, 기타 성분의 종류나 농도, 및 보존 온도 등을 고려해서 적당하게 결정할 수 있다. 특별하게 한정되지 않지만, 24시간 이상, 2일간 이상, 3일간 이상, 4일간 이상, 6일간 이상, 1주일 이상, 2주일 이상, 3주일 이상, 4주일 이상, 5주일 이상, 6주일 이상, 7주일 이상, 또는 8주일 이상의 보존이 예시된다. 또, 보존하는 시간의 상한은 특별하게 한정되지 않지만, 10년 이하, 9년 이하, 8년 이하, 7년 이하, 6년 이하, 5년 이하, 4년 이하, 3년 이하, 2년 이하, 1년 이하, 또는 사용 기한까지의 보존이 예시된다. 상기 사용 기한은 본 발명의 용액이 그 효과를 얻을 수 있을 수 있는 범위에서 적당하게 설정할 수 있다.
용액이 동결해서 보존되었을 경우, 적절한 방법으로 융해해서 사용할 수 있다. 융해 방법은 특별하게 한정되지 않고, 예를 들면 동결한 용액을 포함하는 용기를 실온에서 방치하는 것에 의해 융해할 수 있다. 또, 동결한 용액을 포함하는 용기를 얼음 중(또는 빙상)이나 항온수조 중에서 방치하는 것에 의해 융해할 수도 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 보존 방법에 의해 보존된 올리고뉴클레오타이드는 공지의 핵산 해석 방법을 사용해서 해석할 수 있다. 이러한 핵산 해석 방법으로서 예를 들면, 핵산을 정량하는 방법이나, PCR 등의 핵산 증폭반응을 사용해서 증폭 산물을 해석하는 방법 등이 있다.
본 발명에 하나 형태에서는 본 발명의 올리고뉴클레오타이드 보존 방법에 의해 보존된 올리고뉴클레오타이드는 공지의 핵산 해석 방법에서의 프라이머, 프로브로서 사용된다. 이러한 핵산해석 방법으로서 예를 들면, 주형 핵산의 상보쇄의 합성(예를 들면 cDNA의 합성), 표적 핵산의 증폭(예를 들면, PCR법), 여러 하이브리다이제이션법에 의한 핵산의 검출이나 정량 등이 예시된다. 프라이머를 함유하는 본 발명의 용액은 단일 프라이머를 포함하는 것, 표적 핵산을 증폭 가능한 1쌍의 프라이머를 포함하는 것, 복수의 표적 핵산의 각각에 대응하는 복수의 프라이머 쌍을 포함하는 것 등이 예시된다. 프로브의 경우도 동일하게, 1종 혹은 복수 종의 프로브를 포함할 수 있다. 또, 하나 또는 복수의 프라이머와, 하나 또는 복수의 프로브를 포함하는 용액도 본 발명의 형태 하나이다.
본 발명의 용액에 함유되는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서, 또는 프로브로서 사용하는 핵산 증폭반응은 본 발명에 하나 형태이다. 본 발명의 용액 및 핵산 증폭반응에 필요한 각종 성분을 혼합해서 핵산 증폭용 반응액을 조제하고, 반응이 실시된다. 핵산 증폭반응에 필요한 성분은 당업자에게 주지이다. 대표적인 성분으로서는 DNA 폴리머라아제, 2가 금속 이온, 데옥시리보뉴클레오타이드 3인산, 완충 성분이 예시되지만, 그 이외의 성분을 적당하게 사용할 수 있다. 본 발명의 용액에 함유되는 올리고뉴클레오타이드가 프라이머 혹은 프라이머 쌍인 경우, 반응액에는 적절한 주형 핵산 혹은 주형 핵산을 포함할 가능성이 있는 시료가 첨가된다. 상기의 핵산 증폭반응은, 주형 핵산의 정성적인 검출 및/또는 정량에 이용할 수 있다.
핵산 증폭 과정의 모니터링 결과를 이용한 DNA의 정량은 당해 기술분야에서 공지 의 방법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 핵산 증폭반응에 사용하는 프라이머 쌍에 의한 핵산 증폭의 주형이 되는 핵산서열을 가지는 스탠더드 DNA(포지티브 컨트롤 DNA)의 희석 계열을 작성하고, 그 각각을 주형으로 해서 사용한 리얼타임 PCR에 의해 Ct값을 산출해서 검량선을 작성하고, 이것에 의거하여 검체 중의 DNA를 정량할 수 있다. 상기의 스탠더드 DNA로서는 예를 들면 플라스미드 DNA를 사용할 수 있다. Ct값의 산출 방법으로서는 예를 들면 임계값과 증폭 곡선의 교점을 Ct값으로 하는 방법(Crossing Point법)이나, 증폭 곡선에 2차 도함수를 산출해서 그것이 최대가 되는 점을 Ct값으로 하는 방법(2nd Derivative Maximum법)을 이용할 수 있다.
상기 방법은 추가로 융해곡선분석을 실시하는 공정을 포함할 수 있다. 융해곡선분석에서는 핵산 증폭반응 후에 반응액의 온도를 서서히 올리고, 그 때에 인터컬레이팅 색소의 형광 시그널을 모니터링한다. 저온에서는 핵산 증폭 산물이 더블-스트랜드를 형성해서 강한 형광 시그널을 나타내지만, 어떤 일정한 온도에 도달하면 싱글-스트랜드로 분해하고, 인터컬레이팅 색소의 형광 시그널 강도는 급격하게 저하된다. 이 때의 온도가 융해 온도(Tm값)이다. 융해곡선분석에 의해 증폭 산물의 Tm값을 조사하고, 특이적인 증폭 산물인지의 여부를 확인 할 수 있다.
표지 프로브를 사용하는 핵산의 검출ㆍ정량방법이 알려져 있다. 대표적인 방법은 형광시료와 소광물질로 이중 표지한 프로브와 표적 핵산을 접촉시키고, 양자가 하이브리드화 했을 경우에 상기의 프로브의 절단이 일어나도록 한 것이다. 프로브가 절단되어 발생하는 형광을 지표로 해서 표적 핵산을 검출 및/또는 정량할 수 있다. 이러한 방법으로서, DNA 폴리머라아제가 가지는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성으로 프로브를 절단하는 Taqman법, 프로브로서 DNA/RNA 키메라 프로브를 사용하고, 이것을 리보뉴클레아제 H로 절단하는 사이클링 프로브법을 들 수 있다. 본 발명의 용액은 이러한 용도에 사용 가능한 표지 프로브(올리고뉴클레오타이드)를 함유하는 것일 수도 있다.
표적 핵산의 증폭에 사용되는 프라이머 쌍과 핵산 결합 단백질을 함유하는 본 발명의 용액 하나 형태로서, 추가로 핵산 증폭반응에 필요한 성분(단, 주형핵산을 제외한다)을 함유시킨 용액(프리믹스 용액)이 예시된다. 이러한 용액은 주형 핵산 혹은 주형 핵산을 포함할 가능성이 있는 시료를 첨가해서 간편하게 핵산 증폭용의 반응액을 조제할 수 있고, 주형 핵산이 신속한 검출이나 정량에 유용하다. 장기 보존해도 핵산 증폭 반응의 효율이 저하되지 않기 때문에 검출ㆍ정량을 재현성 좋게 실시할 수 있다.
(2) 본 발명의 「표적 핵산을 증폭하기 위한
키트
」
핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 본 발명의 용액 형태는 당해 표적 핵산의 검출 또는 증폭에 유용하다. 본 발명의 용액은 저온에서 보존되었을 때에 올리고뉴클레오타이드의 열화가 보다 억제되기 때문에, 바람직하게는, 저온 보존된 본 발명의 용액을 사용해서 표적 핵산의 검출이나 정량을 재현성 좋게 실시할 수 있다. 상기의 올리고뉴클레오타이드로서는 표적 핵산 검출을 위한 프로브로서 기능하는 것, 표적 핵산의 증폭에서 프라이머로서 기능하는 것이 예시된다. 따라서 본 발명에 1형태에 있어서, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액을 포함하는, 표적 핵산을 증폭하기 위한 키트(이하, 「본 발명의 키트」라고 언급한다)가 제공된다.
본 발명의 키트는 추가로 핵산 증폭에 필요 또는 유용한 각종 성분, 예를 들면, 상기한 효소(예를 들면, DNA 폴리머라아제, 역전사 효소, 등), 금속염(예를 들면, 2가 금속 이온), 데옥시리보뉴클레오타이드(예를 들면, 데옥시리보뉴클레오타이드 3인산), 완충 성분, 계면활성제 등을 포함하는 것일 수도 있다. 이것들의 성분은 예를 들면, DNA 폴리머라아제, 2가 금속 이온, 데옥시리보뉴클레오타이드 3인산 및 완충 성분으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1이상의 성분일 수도 있다. 상기의 핵산 증폭에 필요 또는 유용한 성분은 각각 별도의 컴포넌트로서 키트에 포함될 수도 있지만, 복수의 성분을 조합시킨 컴포넌트로 할 수도 있다. 또, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액이 이것들의 성분에 1 이상을 포함하고 있을 수도 있다.
본 발명의 키트 하나 형태로서, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액과, DNA 폴리머라아제를 함유하는 용액을 조합시킨 본 발명의 키트 형태는 표적 핵산의 증폭이나 검출에 유용하다. 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드가 프라이머일 경우, 양쪽 용액을 혼합해서 표적 핵산 증폭용의 반응액을 조제할 수 있다. 또, 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드가 프로브일 경우, 양쪽 용액에 부가해서 적절한 프라이머를 사용하고, 표적 핵산 검출용의 반응액을 조제할 수 있다. 또한, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액, 또는 DNA 폴리머라아제를 함유하는 용액은 상기의 핵산 증폭에 필요 또는 유용한 성분에 1 이상을 포함하고 있을 수도 있다. 예를 들면, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 제1 용액과, DNA 폴리머라아제, 2가 금속 이온, 데옥시리보뉴클레오타이드 3인산 및 완충 성분으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1 이상의 요소를 함유하는 제2 용액을 포함하는 키트를 들 수 있다. 상기의 각 컴포넌트 또는 제1 용액 및 제2 용액은 각각, 별도의 용기 중에서 보존된다.
본 발명의 키트의 다른 형태로서, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드에 부가해서, 핵산 증폭 반응에 필요한 성분 기타의 성분(단, 주형 핵산을 제외한다)의 전부를 함유시킨 용액(프리믹스 용액)을 컴포넌트로 하는 키트가 예시된다. 프리믹스 용액의 일례로서, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드에 부가해서, DNA 폴리머라아제, 2가 금속 이온, 데옥시리보뉴클레오타이드 3인산 및 완충 성분을 함유하는 용액을 들 수 있다. 당해 키트는 상기의 컴포넌트에 주형 핵산 혹은 주형 핵산을 포함할 가능성이 있는 시료를 첨가해서 간편하게 핵산 증폭용의 반응액을 조제할 수 있고, 주형 핵산이 신속한 검출이나 정량에 유용하다. 장기로 보존해도 핵산 증폭 반응의 효율이 저하되지 않기 때문에 검출ㆍ정량을 재현성 좋게 실시할 수 있다.
본 발명이 호적한 형태에서는 본 발명의 키트는 표적 핵산의 염기서열 적어도 일부를 가지는 양성 대조 핵산, 시료의 전 처리에서 사용되는 시약 등을 포함할 수 있다.
또, 본 발명이 다른 형태로서, 올리고뉴클레오타이드를 안정되게 보존하기 위한 핵산 결합 단백질의 사용을 들 수 있다. 본 형태에 의해 보존된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 반응액을 사용한 핵산 증폭반응에서의 핵산 증폭 효율의 저하가 방지된다. 본 발명의 「핵산 결합 단백질의 사용」은 구체적으로는, 상기의 본 발명의 「올리고뉴클레오타이드의 보존 방법」에 기재된 바와 같이 해서 실시할 수 있고, 표적 핵산의 증폭/검출 방법, 당해 방법에 사용되는 키트의 제조에 유용하다.
상기의 본 발명의 키트는 바람직하게는, 사용할 때까지는 저온에서 보존된다. 특히 바람직하게는 본 발명의 키트에 있어서, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액이 저온에서 보존되고 있다. 특별하게 본 발명을 한정하나 것은 아니지만, 핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고데옥시리보뉴클레오타이드를 함유하는 용액에 대해서는 동결한 상태로 보존되는 것이 바람직하다.
실시예
이하의 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이것들의 실시예에 의해 한정되지 않는다.
조제예
1:
CspA
원액의 조제
S. Chatterjee 들(J. Biochem., 1993, 114, 663-669)에 기재된 방법에 따라서, 대장균의 CspA단백질을 발현, 정제한 후, CspA 원액(10㎎/㎖ CspA 단백질, 20mM Tris-HCl(pH 7.8(4℃)), 100mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 50% Glycerol)을 조제했다. CspA 원액을 튜브에 분주하고, 사용시까지, -20℃에서 동결 보존했다.
조제예
2:
프라이머
원액의 조제
invA_F-6프라이머(서열번호 1), invA_R-6프라이머(서열번호 2), 및 stx1_R-2프라이머(서열번호 3)를 각각 TE 버퍼(pH 8.0)에 용해하고, 프라이머 원액(100㎛)을 조제했다. 프라이머 원액을 튜브에 분주하고, 사용시까지, -20℃에서 동결 보존했다.
실시예
1:
프라이머
믹스
용액의 경시적인
PCR
반응성 저하
프라이머 원액 및 TE 버퍼를 혼합하고, 프라이머 믹스 용액을 조제했다. 즉, invA_F-6프라이머(10㎛, 서열번호 1), invA_R-6프라이머(10㎛, 서열번호 2), 및 stx1_R-2프라이머(10㎛, 서열번호 3)를 TE 버퍼 중에 포함하는 프라이머 믹스 용액을 조제했다.
이 프라이머 믹스 용액을 튜브에 분주하고, -20℃에서 동결 보존했다. 동결 전의 프라이머 믹스 용액, 및 동결 개시 후 3, 5, 7, 10일째에 융해한 프라이머 믹스 용액을 각각 하기 PCR에 제공했다. 여기에서, 동결 전의 프라이머 믹스 용액에 대해서는 조정 후 곧바로, 또 동결 보존한 프라이머 믹스 용액은 융해 후 신속하게, 각각 PCR을 실시했다. 이후의 실시예에서도 동일한 순서로 PCR을 실시했다.
PCR 반응액은 n=2로 조제했다. 즉, 상기 프라이머 믹스 용액을 2.5㎕, TaKaRa 장관계 병원 세균 유전자 검출 키트(TAKARA BIO INC., RR139A)에 포함되는 Reaction Mix Fast를 12.5㎕, 100X SYBR(등록상표) Green I(TAKARA BIO INC.)를 0.25㎕, 및 멸균수를 혼합하고, 최종 용량을 25㎕로 했다. PCR 및 형광검출은 Thermal Cycler Dice(등록상표) Real Time System III(TAKARA BIO INC., TP950)로 실시했다. PCR의 반응 조건은 94℃ 30초의 예열한 후, 90℃ 1초, 64℃ 10초를 1사이클로 하는 45사이클 반응으로 실시하고, 마지막으로 해리 반응으로서 68℃에서 90℃까지 연속적으로 온도를 상승시키고, 각 온도의 형광강도를 관찰했다. 또, 대조로서, 5pg의 살모넬라 게놈을 주형 DNA로서 포함하는 반응액에서 동일한 측정을 실시했다.
상기 PCR 가운데, 동결 전의 프라이머 믹스 용액을 사용했을 경우의 증폭 곡선 및 융해 곡선의 예를, 각각 도 1 및 도 2에 나타낸다. 도 1에 나타나 있는 바와 같이, 주형 DNA를 포함하는 반응액(대조)에서는 주형 DNA를 포함하지 않는 경우와 비교해서 형광의 상승이 빨라진다. 또, 도 2에서 관찰되는 85℃ 부근의 피크는 invA 유전자 단편의 증폭 산물에 유래하고, 73℃ 부근의 피크는 비특이적 증폭 산물에 유래한다. 이것들의 결과는 주형 DNA를 포함하지 않는 반응액에서는 비특이적 증폭 산물이 생성하는 것을 나타낸다. 즉, 증폭 곡선 및 융해 곡선을 해석하는 것에 의해, 비특이적 증폭 산물의 생성을 모니터링할 수 있다.
측정결과로부터 계산되는 주형 DNA를 포함하지 않는 반응액의 Ct값의 경시적 변화를 도 3에 나타낸다. 도 3 에 나타나 있는 바와 같이, 프라이머 믹스 용액을 동결 보존하면, 반응액에 주형 DNA가 포함되지 않음에도 불구하고, Ct값이 경시적으로 감소한다. 이 결과는, 프라이머 믹스 용액의 보존 기간이 길어짐에 따라서, 비특이적 증폭 산물이 생성되기 쉬워지는 것을 나타낸다.
실시예
2:
프라이머
믹스
용액으로의
CspA
첨가에 의한
PCR
반응성 유지
3종의 프라이머 및 첨가물(CspA 또는 Tween 20)을 포함하는 프라이머 믹스 용액을 조제했다. 즉, 실시예 1과 동일한 방법으로 프라이머 믹스 용액을 조제할 때에, 추가로 CspA 단백질(TAKARA BIO INC.)을 최종농도 4㎎/㎖가 되도록 첨가하는 것에 의해, CspA를 포함하는 프라이머 믹스 용액을 조제했다. 또, 실시예 1과 동일한 방법으로 프라이머 믹스 용액을 조제하고, 추가로, Tween(등록상표) 20(Nacalai Tesque, Inc.)을 최종농도 0.5%가 되도록 첨가하는 것에 의해, Tween 20을 포함하는 프라이머 믹스 용액을 조제했다. 대조로서, 첨가물을 포함하지 않는 프라이머 믹스 용액도 조제하고, TE control로 했다.
이것들의 프라이머 믹스 용액을 튜브에 분주하고, -20℃에서 동결 보존했다. 동결 전의 프라이머 믹스 용액, 및 동결 개시 후 3, 6일째에 융해한 프라이머 믹스 용액을 PCR에 제공했다. 실시예 1기재된 방법으로 PCR 반응액을 n=4로 조제하고, 실시예 1기재의 조건으로 PCR을 실시했다. 또, PCR의 조건을 맞추기 위해서, TE control 및 Tween 20의 PCR 반응액에는 반응액 조제시에, CspA 단백질을 첨가했다. 측정결과로부터 계산되는 주형 DNA를 포함하지 않는 반응액의 Ct값을 도 4에 나타낸다.
도 4에 나타나 있는 바와 같이, CspA 또는 Tween 20을 프라이머 믹스 용액에 첨가하는 것에 의해, Ct값의 감소를 억제할 수 있다. 특히, CspA를 첨가하는 것에 의해, 효과적으로 Ct값의 감소를 억제할 수 있었다. 이 결과는, 프라이머 믹스 용액에 CspA를 첨가해서 보존하는 것에 의해, 비특이적 증폭 산물의 생성을 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예
3:
CspA의
농도 평가(1회째)
3종의 프라이머 및 농도가 다른 CspA를 포함하는 프라이머 믹스 용액을 조제했다. 즉, 실시예 1과 동일한 방법으로 프라이머 믹스 용액을 조제할 때에, 추가로 CspA 단백질을 최종농도 4㎎/㎖ 또는 최종농도 2㎎/㎖가 되도록 첨가하는 것에 의해, 농도가 다른 CspA를 포함하는 프라이머 믹스 용액을 조제했다. 대조로서, CspA를 포함하지 않는 프라이머 믹스 용액도 조제하고, TE control로 했다.
이것들의 프라이머 믹스 용액을 튜브에 분주하고, -20℃에서 동결 보존했다. 동결 전의 프라이머 믹스 용액, 및 동결 개시 후 3, 6일째에 융해한 프라이머 믹스 용액을 PCR에 제공했다. 실시예 1기재된 방법으로 PCR 반응액을 n=4로 조제하고, 실시예 1기재의 조건으로 PCR을 실시했다. 또, PCR의 조건을 맞추기 위해서, TE control 및 2㎎/㎖ CspA의 PCR 반응액에는 반응액 조제시에, CspA 단백질을 첨가했다. 측정결과로부터 계산되는 주형 DNA를 포함하지 않는 반응액의 Ct값을 도 5에 나타낸다.
도 5에 나타나 있는 바와 같이, 최종농도 4㎎/㎖ 또는 최종농도 2㎎/㎖의 CspA를 포함하는 프라이머 믹스 용액은 CspA를 포함하지 않는 프라이머 믹스 용액(TEcontrol)에 비해서 Ct값의 감소를 억제할 수 있다. 이 결과는, 프라이머 믹스 용액에 최종농도 4㎎/㎖ 또는 최종농도 2㎎/㎖의 CspA를 첨가해서 보존하는 것에 의해, 비특이적 증폭 산물의 생성을 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예
4:
CspA의
농도 평가(2회째)
3종의 프라이머 및 농도가 다른 CspA를 포함하는 프라이머 믹스 용액을 조제했다. 즉, 실시예 1과 동일한 방법으로 프라이머 믹스 용액을 조제할 때에, 추가로 CspA 단백질을 최종농도 4㎎/㎖, 최종농도 1㎎/㎖, 또는 최종농도 0.25㎎/㎖가 되도록 첨가하는 것에 의해, 농도가 다른 CspA를 포함하는 프라이머 믹스 용액을 조제했다. 대조로서 CspA를 포함하지 않는 프라이머 믹스 용액도 조제하고, TE control로 했다.
이것들의 프라이머 믹스 용액을 튜브에 분주하고, -20℃에서 동결 보존했다. 동결 전의 프라이머 믹스 용액, 및 동결 개시 후 3, 7일째에 융해한 프라이머 믹스 용액을 PCR에 제공했다. 실시예 1기재된 방법으로 PCR 반응액을 n=4로 조제하고, 실시예 1기재의 조건으로 PCR을 실시했다. 또, PCR의 조건을 맞추기 위해서, TE control, 1㎎/㎖ CspA, 및 0.25㎎/㎖ CspA의 PCR 반응액에는 반응액 조제시에, CspA단백질을 첨가했다. 측정결과로부터 계산되는 주형 DNA를 포함하지 않는 반응액의 Ct값을 도 6에 나타낸다.
도 6에 나타나 있는 바와 같이, CspA의 농도 의존적으로 Ct값이 감소했다. 이 결과는, 프라이머 믹스 용액에 첨가하는 CspA의 농도 의존적으로 비특이적 증폭 산물의 생성을 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예
5:
프라이머
믹스
용액에의 핵산 결합 단백질 첨가에 의한
PCR
반응성 유지
3종의 프라이머 및 핵산 결합 단백질(CspA, T4 SSB, 또는 E.coli SSB)을 포함하는 프라이머 믹스 용액을 조제했다. 즉, invA_F-6프라이머(20㎛, 서열번호 1), invA_R-6프라이머(20㎛, 서열번호 2), 및 stx1_R-2프라이머(20㎛, 서열번호 3)를 포함하는 TE 버퍼를 조제할 때에, 추가로 CspA단백질(최종농도 4㎎/㎖), T4 파지 유래 SSB 단백질(바이오 Academia사, 최종농도 2㎎/㎖), 또는 대장균의 SSB 단백질(Bio Academia사, 최종농도 2㎎/㎖)을 각각 첨가하는 것에 의해, 핵산 결합 단백질을 포함하는 프라이머 믹스 용액을 조제했다. 대조로서 핵산 결합 단백질을 포함하지 않는 프라이머 믹스 용액도 조제하고, TE control로 했다.
이것들의 프라이머 믹스 용액을 튜브에 분주하고, -20℃에서 동결 보존했다. 동결 전의 프라이머 믹스 용액, 및 동결 개시 후 2, 5, 9일째에 융해한 프라이머 믹스 용액을 PCR에 제공했다.
PCR 반응액은 n=4로 조제했다. 즉, 상기 프라이머 믹스 용액을 1.25㎕, Reaction Mix Fast를 12.5㎕, 100X SYBR(등록상표) Green I를 0.25㎕, 및 멸균수를 혼합하고, 최종용량을 25㎕로 하고, 실시예 1에 기재된 조건으로 PCR을 실시했다. 또, PCR의 조건을 맞추기 위해서, TE control의 PCR 반응액에는 반응액 조제시에, CspA 단백질을 첨가했다. 측정결과로부터 계산되는 주형 DNA를 포함하지 않는 반응액의 Ct값(비율)을 도 7에 나타낸다.
도 7에 나타나 있는 바와 같이, 핵산 결합 단백질(CspA, T4 SSB, 또는 E.coli SSB)을 프라이머 믹스 용액에 첨가하는 것에 의해, Ct값의 감소를 억제할 수 있다. 이 결과는, 프라이머 믹스 용액에 핵산 결합 단백질을 첨가해서 보존하는 것에 의해, 비특이적 증폭 산물의 생성을 억제할 수 있음을 나타낸다.
실시예
6:
프리믹스
용액에의
CspA
첨가에 의한
PCR
반응성 유지
주형 DNA 이외의 PCR에 필요한 성분(프라이머, dNTP, 효소, 형광색소 등) 및 CspA를 포함하는 프리믹스 용액을 조제했다. 즉, 용량 14.5㎕ 당에 invA_F-6프라이머(1.7㎛, 서열번호 1), invA_R-6프라이머(1.7㎛, 서열번호 2), stx1_R-2프라이머(1.7㎛, 서열번호 3), Reaction Mix Fast(12.5㎕), SYBR(등록상표) Green I(1.7X), 및 CspA(0.69㎎/㎖)를 포함하는 프리믹스 용액을 조제했다. 대조로서 CspA를 포함하지 않는 프리믹스 용액도 조제하고, TE control로 했다.
이것들의 프리믹스 용액을 튜브에 분주하고, -20℃에서 동결 보존했다. 동결 전의 프리믹스 용액, 및 동결 개시 후 3, 7일째에 융해한 프리믹스 용액을 PCR에 제공했다. 즉, 상기 프리믹스 용액 14.5㎕ 및 멸균수 10.5㎕을 혼합하고, PCR 반응액을 조제하고, 실시예 1기재의 조건으로 PCR을 실시했다(n=4). 측정결과로부터 계산되는 주형 DNA를 포함하지 않는 반응액의 Ct값을 도 8에 나타낸다.
도 8 에 나타나 있는 바와 같이, CspA를 프리믹스 용액에 첨가하는 것에 의해, Ct값의 감소를 억제할 수 있다. 이 결과는, 프리믹스 용액에 CspA를 첨가해서 보존하는 것에 의해, 비특이적 증폭 산물의 생성을 억제할 수 있음을 나타낸다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명은 유전자 공학, 생물학, 의학, 농업 등 폭넓은 분야에서 유용하다.
서열번호 1; PCR 프라이머 "invA_F-6"
서열번호 2; PCR 프라이머 "invA_R-6"
서열번호 3; PCR 프라이머 "stx1_R-2"
SEQUENCE LISTING
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<120> Method for preservation of oligonucleotide
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<400> 3
tcgttgacta cttcttatct gga 23
Claims (16)
- 올리고뉴클레오타이드의 보존 방법으로서,
핵산 결합 단백질 및 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액을 저온에서 보존하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1 항에 있어서,
핵산 결합 단백질이 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질인 방법. - 제2 항에 있어서,
싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질이 콜드 쇼크 단백질 및 SSB에서 선택되는 단백질인 방법. - 제2 항에 있어서,
싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질이 CspA, T4 파지 유래 SSB 및 대장균 유래 SSBD에서 선택되는 단백질인 방법. - 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서,
올리고뉴클레오타이드가 올리고데옥시리보뉴클레오타이드인 방법. - 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서,
용액을 동결시켜서 보존하는 공정을 포함하는 방법. - 표적 핵산을 증폭하기 위한 키트로서,
핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트. - 제7 항에 있어서,
핵산 결합 단백질이 싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질인 키트. - 제8 항에 있어서,
싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질이 콜드 쇼크 단백질 및 SSBD에서 선택되는 단백질인 키트. - 제9 항에 있어서,
싱글-스트랜드 핵산에 결합하는 단백질이 CspA, T4 파지 유래 SSB 및 대장균 유래 SSBD에서 선택되는 단백질인 키트. - 제7 항 내지 제10 항 중 어느 한 항에 있어서,
올리고뉴클레오타이드가 올리고데옥시리보뉴클레오타이드인 키트. - 제11 항에 있어서,
올리고데옥시리보뉴클레오타이드가 표적 핵산의 증폭에 사용되는 프라이머인 키트. - 제7 항 내지 제12 항 중 어느 한 항에 있어서,
핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액이 저온에서 보존되고 있는 키트. - 제7 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서,
핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액이 동결하고 있는 용액인 키트. - 제7 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 제1 용액과, DNA 폴리머라아제, 2가 금속 이온, 데옥시리보뉴클레오타이드 3인산 및 완충 성분으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1 이상의 요소를 함유하는 제2 용액을 포함하는 키트. - 제7 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 있어서,
핵산 결합 단백질 및 표적 핵산에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 용액이 추가로 DNA 폴리머라아제, 2가 금속 이온, 데옥시리보뉴클레오타이드 3인산 및 완충 성분을 함유하는 키트.
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