JPWO2018225772A1

JPWO2018225772A1 - オリゴヌクレオチドの保存方法

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Publication number: JPWO2018225772A1
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Inventors: 美和秋友; 上森　隆司; 隆司上森
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Filing date: 2018-06-06
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Abstract

本発明は、オリゴヌクレオチドの保存方法、及びオリゴヌクレオチドを含むキットに関する。本発明は、オリゴヌクレオチドを含む溶液に核酸結合タンパク質をあらかじめ添加することにより、該オリゴヌクレオチドを含む溶液を安定的に保存する方法を提供する。

Description

本発明は、オリゴヌクレオチドの保存方法、及び標的核酸を増幅するためのキットに関する。

ＤＮＡ合成は研究において様々な目的で使用される。そのうち、短鎖ＤＮＡの化学合成を除く大抵のＤＮＡ合成は、ＤＮＡポリメラーゼや逆転写酵素を利用する酵素法によって行われる。ｉｎｖｉｔｒｏで所望のＤＮＡ断片を容易に増幅することが可能なポリメラーゼ連鎖反応（以下、ＰＣＲと称す）は非常に有益であり、生物学、医学、農学、及び他の分野において必須のツールとなっている。ＰＣＲによるＤＮＡの増幅においては、多くの場合、反応の高い特異性が必要とされる。非特異的増幅を低減するために新たなＤＮＡポリメラーゼの開発及び反応混合物（以下、反応液と称す）の組成の最適化がされているが、それでも依然としてＰＣＲ増幅特異性の向上が必要とされている。

一般的に、ＰＣＲによるＤＮＡの増幅において、反応液には、鋳型核酸、プライマー、デオキシリボヌクレオチド、酵素、などの成分が含まれる。さらに、増幅したＤＮＡを検出する場合は、反応液に蛍光色素やプローブが含まれることがある。安定的で正確なＤＮＡ合成反応を実現するためには、これらの成分を反応液に供するまで、又はＰＣＲを開始するまで、適切に保存することが重要である。

プライマーやプローブは固体または溶液（凍結された溶液を包含する）として保存することが可能である。固体は安定なので室温で保存できるというメリットがある反面、反応液に供するためには、溶解しなければならないなどのデメリットがある。一方、プライマーやプローブを溶液で保存しておくと、すぐに反応液に供することができる。さらに、プライマー、プローブ、デオキシリボヌクレオチド、酵素など、ＰＣＲに必要な成分を全て含んだ反応液をあらかじめ調製して保存しておくことにより、迅速にＰＣＲを行うことができる。しかし、溶液での保存は安定性に欠けるというデメリットがある。すなわち、プライマーやプローブを溶液として保存した場合、ＰＣＲの反応性が低下しやすい。溶液を低温で保存したり、凍結保存することにより、反応性の低下を抑制することはできるが、より効果的な保存方法が求められている。

前記ＰＣＲの反応性や特異性の向上を目的として種々の改良がなされた。例えば、ＰＣＲ時に界面活性剤やある種のタンパク質を共存させることが挙げられる。当該ＰＣＲの改善として、非イオン性界面活性剤を共存させる技術が報告されている（特許文献１）。また、核酸結合活性を有するタンパク質、例えば一本鎖核酸に結合するタンパク質はＰＣＲのような核酸合成反応において非特異的な核酸合成を抑制することが知られている（特許文献２）。前記一本鎖核酸に結合するタンパク質として、大腸菌由来ＳＳＢやＴ４ファージ由来ＳＳＢ（Ｔ４ｇｅｎｅ３２ｐｒｏｔｅｉｎとも称される）が例示されている。さらに、コールドショックタンパク質をＤＮＡ合成反応液調製時に添加することにより、ＤＮＡ合成反応の反応性を向上させる方法が報告された（特許文献３）。

前記コールドショックタンパク質は、種々の微生物から見出されており、低温への生育温度シフトへの適応に関与すると考えられている。このうち、ＭａｊｏｒＣｏｌｄＳｈｏｃｋＰｒｏｔｅｉｎとして知られるＣｓｐＡは、その遺伝子が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）から単離され、組換え体が製造されている（特許文献４）。また、ＣｓｐＡは一本鎖ＤＮＡや一本鎖ＲＮＡに結合する性質を有している。

以上のように、核酸結合活性を有するタンパク質がＤＮＡ合成反応に有益な作用を有することは知られている。これらの方法では、合成反応開始の直前に、タンパク質が反応液に添加される。しかしながら、プライマーやプローブを含む溶液の長期保存に関して、前記のタンパク質の効果が検討されたことはない。

米国特許第６１２７１５５号公報米国特許第５７７３２５７号公報国際公開第２００９／１０８９４９号パンフレット国際公開第９０／０９４４４号パンフレット

上記の通り、プライマーやプローブの溶液状態での保存は安定性に欠けるという課題がある。さらに、本発明者らは、プライマーやプローブを溶液状態で低温または凍結保存しても安定性に欠けることがあるという課題を見出した（例えば、実施例１）。本発明は、プライマーやプローブ等のオリゴヌクレオチドを含む溶液を安定的に保存する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意努力した結果、オリゴヌクレオチドを含む溶液に核酸結合タンパク質をあらかじめ添加することにより、該オリゴヌクレオチドを安定的に保存できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は
［１］オリゴヌクレオチドの保存方法であって、核酸結合タンパク質及びオリゴヌクレオチドを含有する溶液を低温で保存する工程、を包含することを特徴とする方法、
［２］核酸結合タンパク質が一本鎖核酸に結合するタンパク質である、［１］に記載の方法、
［３］一本鎖核酸に結合するタンパク質がコールドショックタンパク質及びＳＳＢより選択されるタンパク質である、［２］に記載の方法、
［４］一本鎖核酸に結合するタンパク質がＣｓｐＡ、Ｔ４ファージ由来ＳＳＢ及び大腸菌由来ＳＳＢより選択されるタンパク質である［２］に記載の方法、
［５］オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法、
［６］溶液を凍結させて保存する工程を含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法、
［７］標的核酸を増幅するためのキットであって、核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液を包含することを特徴とするキット、
［８］核酸結合タンパク質が一本鎖核酸に結合するタンパク質である、［７］に記載のキット、
［９］一本鎖核酸に結合するタンパク質がコールドショックタンパク質及びＳＳＢより選択されるタンパク質である、［８］に記載のキット、
［１０］一本鎖核酸に結合するタンパク質がＣｓｐＡ、Ｔ４ファージ由来ＳＳＢ及び大腸菌由来ＳＳＢより選択されるタンパク質である［９］に記載のキット。
［１１］オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、［７］〜［１０］のいずれかに記載のキット、
［１２］オリゴデオキシリボヌクレオチドが標的核酸の増幅に使用されるプライマーである［１１］に記載のキット、
［１３］核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液が低温で保存されている、［７］〜［１２］のいずれかに記載のキット、
［１４］核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液が凍結している溶液である、［７］〜［１３］のいずれかに記載のキット、
［１５］核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する第一の溶液と、ＤＮＡポリメラーゼ、二価金属イオン、デオキシリボヌクレオシド３リン酸及び緩衝成分からなる群より選択される１以上の要素を含有する第二の溶液を包含する［７］〜［１４］のいずれかに記載のキット、
［１６］核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴデオキシリボヌクレオチドを含有する溶液が、さらにＤＮＡポリメラーゼ、二価金属イオン、デオキシリボヌクレオシド３リン酸及び緩衝成分を含有する［７］〜［１４］のいずれかに記載のキット、
に関する。

本発明により、核酸合成反応に有用な、オリゴヌクレオチドの保存方法が提供される。また、本発明により、標的核酸を増幅するためのキットが提供される。

実施例１における、ＰＣＲの増幅曲線の例を示す図である。実施例１における、ＰＣＲの融解曲線の例を示す図である。実施例１における、Ｃｔ値を示す図である。実施例２における、Ｃｔ値を示す図である。実施例３における、Ｃｔ値を示す図である。実施例４における、Ｃｔ値を示す図である。実施例５における、Ｃｔ値を示す図である。実施例６における、Ｃｔ値を示す図である。

（定義）
本明細書中で使用される「核酸」（「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」を包含する）という用語は、ヌクレオシドが鎖状に連結されて形成された直鎖上のポリマーを意味し、デオキシリボ核酸、リボ核酸、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ポリアミド核酸が例示される。天然の核酸、人為的に作製された核酸、ならびに修飾された核酸やそれらの断片も「核酸」に包含される。

本明細書で使用される「プライマー」という用語は、ＤＮＡ鋳型またはＲＮＡ鋳型と重合用試薬（ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド３リン酸など）の存在下で起こる核酸合成反応において開始点として機能するオリゴヌクレオチドを示す。プライマーは好ましくは一本鎖であるが、二本鎖プライマーも前記の機能を果たし得る。二本鎖プライマーが用いられる場合、増幅反応での使用前にそれをその一本鎖形態に変換することが望ましい。プライマーは、周知の方法を用いて化学的または酵素的に合成されることができ、また生物から単離されうる。

本明細書で使用される「プローブ」という用語は、標的核酸を検出又は定量するためのオリゴヌクレオチドであって、標的核酸と特異的にハイブリダイズできるものを示す。プローブは好ましくは一本鎖であるが、二本鎖プローブも前記の機能を果たし得る。二本鎖プローブが用いられる場合、検出反応での使用前にそれをその一本鎖形態に変換することが望ましい。プローブは、周知の方法を用いて化学的または酵素的に合成されることができ、また生物から単離されうる。

（１）本発明の「オリゴヌクレオチドの保存方法」
本発明のオリゴヌクレオチドの保存方法は、核酸結合タンパク質及びオリゴヌクレオチドを含有する溶液を低温で保存する工程、を包含することを特徴とする。

核酸結合タンパク質及びオリゴヌクレオチドを含有する溶液（以下、「本発明の溶液」と称す）を調製する工程を以下に示す。

＜オリゴヌクレオチド＞
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、通常は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが連結したＤＮＡ（オリゴデオキシリボヌクレオチド）及び／又はアデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが連結したＲＮＡ（オリゴリボヌクレオチド）、さらにはＤＮＡとＲＮＡのキメラのような、天然型ヌクレオチドが連結してなる核酸が該当する。自然界に存在する天然の核酸を制限エンドヌクレアーゼなどで消化し、その消化物から単離して作製したオリゴヌクレオチドであっても良い。酵素的もしくは化学的な方法で人為的に作製されたオリゴヌクレオチドも本発明のオリゴヌクレオチドに包含される。

その他にも、本発明に使用されるオリゴヌクレオチドは非天然型核酸も含むことができる。本明細書において、「非天然型核酸」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された核酸類似体をいう。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ：ＰｅｐｔｉｄｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、非天然型の塩基（イノシン、デアザグアノシン等）を含む核酸、架橋化核酸（ＢＮＡ／ＬＮＡ：ＢｒｉｄｇｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ／ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。メチルホスホネート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、ホスホルアミデート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、２'−Ｏ−メチル型ＤＮＡ／ＲＮＡ等の化学修飾核酸や核酸類似体を含むオリゴヌクレオチドを本発明に使用することもできる。さらに、蛍光物質、消光物質、色素、ハプテン、ビオチン等が付加されたオリゴヌクレオチドであってもよい。

本発明において、オリゴヌクレオチドは一本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、及びこれらのオリゴヌクレオチドの混合物が該当する。例えば、オリゴヌクレオチドは、標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドであってもよい。標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとしては、標的核酸検出のためのプローブとして機能するもの、標的核酸の増幅においてプライマーとして機能するもの、が例示される。

本発明において、オリゴヌクレオチドの鎖長には特に制限はないが、一本鎖オリゴヌクレオチドの場合は好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上である。人工合成した一本鎖オリゴヌクレオチドの場合、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。前記オリゴヌクレオチドは、例えばホスホアミタイト法により合成出来る。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等いかなる方法で合成されても良い。また、天然の核酸を酵素的もしくは化学的な方法で切断してオリゴヌクレオチドを作製してもよい。

本発明の溶液に含まれるオリゴヌクレオチドの種類の数には、特に制限はないが、例えば１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくは３種以上の核酸が例示される。また、２種以上のオリゴヌクレオチドを使用する場合は、それらの混合比に限定はない。特に限定はされないが、マルチプレックス核酸増幅反応に用いる異なる塩基配列を有するプライマー対の混合物も含まれる。さらに当該混合物に標的核酸検出用のプローブとして使用するオリゴヌクレオチドが含まれる場合であってもよい。

本発明の溶液に含まれるオリゴヌクレオチドの濃度は、本発明の効果を奏し得る濃度であれば、特に限定されず、オリゴヌクレオチドの種類、核酸結合タンパク質の種類や濃度、その他の成分の種類や濃度、及び保存温度等を考慮して適宜決定することができる。鎖長が１０〜３０ヌクレオチドの一本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡの場合は、トータルの濃度として、例えば０．１〜１００μＭ、好ましくは０．５〜５０μＭ、より好ましくは１〜２０μＭが例示される。

＜核酸結合タンパク質＞
本発明に使用される核酸結合タンパク質は、核酸に結合することが可能なタンパク質であればよく、その種類は特に限定されない。自然界から単離したタンパク質でもよいし、人為的に作成した組換えタンパク質であってもよい。好ましくは、本発明に使用される核酸結合タンパク質は、組換えタンパク質である。

本発明で使用される核酸結合タンパク質として、一本鎖核酸に結合するタンパク質が例示される。一本鎖核酸に結合するタンパク質は、一本鎖核酸、すなわち一本鎖ＤＮＡ及び／又は一本鎖ＲＮＡに結合することが可能なタンパク質であればよい。特に限定されないが、一本鎖核酸に結合するタンパク質として、ＳＳＢ（Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）及びコールドショックタンパク質が例示される。

本発明に使用されるＳＳＢとして、大腸菌に代表される微生物やショウジョウバエ、アフリカツメガエル、およびバクテリオファージ（Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ等）に由来するＳＳＢが例示される。好ましくは、大腸菌のＳＳＢまたはＴ４ファージ由来のＳＳＢが使用される。ＳＳＢは一本鎖ＤＮＡに結合する性質を有している。なお、Ｔ４ファージ由来のＳＳＢは、Ｔ４ｇｅｎｅ３２ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｔ４ｇｐ３２）と称されることもある。

大腸菌の培養温度を３７℃から１５℃に低下させると、ＣｓｐＡが一過性に高レベルで発現される。大腸菌にはＣｓｐＡとアミノ酸配列上の同一性のあるホモローグとしてＣｓｐＢ〜ＣｓｐＩの８種のタンパク質が知られている［ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．），１９９９，１８１，１６０３−１６０９］。さらに、ＣｓｐＡのホモローグがＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＣｓｐＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＣｓｐＢ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ（ＣｓｐＢ、ＣｓｐＬ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ（ＣｓｐＬ）等の微生物にも存在していることが知られている。本発明において、「コールドショックタンパク質」とは、大腸菌のＣｓｐＡのアミノ酸配列に対して好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するタンパク質のことを言う。

本発明には、これらのコールドショックタンパク質を使用することができる。本発明に使用されるコールドショックタンパク質としては、好ましくはＣｓｐＡが、より好ましくはグラム陰性菌由来のＣｓｐＡが、さらにより好ましくは大腸菌のＣｓｐＡが例示される。ＣｓｐＡは一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡに結合する性質を有している。

上述したように、本発明では、大腸菌由来のＳＳＢ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿４１８４８３．１）、Ｔ４ファージ由来のＳＳＢ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿０４９８５４．１）、大腸菌由来のＣｓｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿４１８０１２．１）を使用することができる。これらのタンパク質のアミノ酸配列には相同性を有する領域が存在する。すなわち、大腸菌由来ＳＳＢの部分アミノ酸配列（ＶＡＳＥＹＬＲＫＧＳＱＶ）、Ｔ４ファージ由来ＳＳＢの部分アミノ酸配列（ＥＧＡＮＦＶＬＫＶＫＱＶ）、大腸菌由来ＣｓｐＡの部分アミノ酸配列（ＤＧＹＫＳＬＤＥＧＱＫＶ）は互いに相同性を有する。すなわち、前記部分アミノ酸配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有する核酸結合タンパク質は、本発明において同様の効果を示すと考えられ、本発明において使用できる。

本発明の溶液に含まれる核酸結合タンパク質の種類の数には、特に制限はなく、１種の核酸結合タンパク質を含んでもよく、２種以上を含んでいてもよい。また、２種以上の核酸結合タンパク質を使用する場合は、それらの混合比に限定はない。

本発明の溶液に含まれる核酸結合タンパク質の濃度は、本発明の効果を奏し得る濃度であれば、特に限定されず、オリゴヌクレオチドの種類や濃度、核酸結合タンパク質の種類、その他の成分の種類や濃度、及び保存温度等を考慮して適宜決定することができる。核酸結合タンパク質の濃度（トータル）として、特に限定されないが、０．１ｍｇ／ｍｌ以上、０．２ｍｇ／ｍｌ以上、０．３ｍｇ／ｍｌ以上、０．４ｍｇ／ｍｌ以上、０．５ｍｇ／ｍｌ以上、０．６ｍｇ／ｍｌ以上、０．７ｍｇ／ｍｌ以上、０．８ｍｇ／ｍｌ以上、０．９ｍｇ／ｍｌ以上、１．０ｍｇ／ｍｌ以上、１．５ｍｇ／ｍｌ以上、２．０ｍｇ／ｍｌ以上、２．５ｍｇ／ｍｌ以上、３．０ｍｇ／ｍｌ以上、３．５ｍｇ／ｍｌ以上、４．０ｍｇ／ｍｌ以上、４．５ｍｇ／ｍｌ以上、５．０ｍｇ／ｍｌ以上、または５．５ｍｇ／ｍｌ以上が例示される。また、核酸結合タンパク質の濃度（トータル）の上限は、特に限定されないが、１０．０ｍｇ／ｍｌ以下、９．０ｍｇ／ｍｌ以下、８．０ｍｇ／ｍｌ以下、７．０ｍｇ／ｍｌ以下、または６．０ｍｇ／ｍｌ以下が例示される。

＜溶液＞
核酸結合タンパク質とオリゴヌクレオチドを溶媒中で混合することにより、核酸結合タンパク質及びオリゴヌクレオチドを含有する溶液（本発明の溶液）が調製される。核酸結合タンパク質およびオリゴヌクレオチドを混合する溶媒の例として、限定するものではないが、水、およびバッファーが挙げられる。

本発明の溶液は、核酸結合タンパク質およびオリゴヌクレオチドに加えて、その他の成分を含有していてもよい。本発明の溶液の組成は、本発明の効果を奏し得る組成であれば、特に限定はない。オリゴヌクレオチドの種類や濃度、核酸結合タンパク質の種類や濃度、及びその他の成分の種類や濃度はその使用目的や保存温度等を考慮して適宜決定することができる。

本発明の溶液は、緩衝成分を含むことが好ましい。本発明において「緩衝成分」は、溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物又は混合物のことをいう。本発明の溶液に含まれる緩衝成分として、特に限定はないが、例えば、トリス、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）が好適に使用できる。特にトリス、ビシン、トリシン、ヘペス、あるいはリン酸塩が緩衝成分として本発明に好適である。例えば、上記の核酸結合タンパク質およびオリゴヌクレオチドを混合する溶媒として、ＴＥバッファーを使用してもよい。ＴＥバッファーとは、核酸を溶解及び／又は保存する際に使用される標準的な溶液で、核酸の分解を防ぐ働きがある。一般的なＴＥバッファーの組成は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２〜８．０）、１ｍＭＥＤＴＡである。

本発明を特に限定しないが、本発明の溶液のｐＨは、例えばｐＨ６．０〜ｐＨ１０．０、好ましくはｐＨ６．５〜ｐＨ９．５、さらに好ましくはｐＨ７．０〜ｐＨ９．０、の範囲に設定されるのが適当である。本発明の溶液がＰＣＲ反応液に供される場合は、反応温度、使用するＤＮＡポリメラーゼやその他の成分を考慮し、緩衝成分の種類、濃度、及びｐＨを最適化するのは当然のことである。

本発明の溶液は、さらに標的核酸を増幅するために必要又は有用な成分、例えば、デオキシリボヌクレオチド、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、等）、金属塩、界面活性剤、などを含んでもよい。さらに、増幅した標的核酸を検出するために必要又は有用な成分、すなわち、インターカレーティング色素などをさらに含んでもよい。

本発明の溶液に含まれるデオキシリボヌクレオチドは、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、等）の基質となりうるものであればよい。天然型ＤＮＡに見られる、アデニン、グアニン、シトシン又はチミン塩基を有するヌクレオチドやそれらの混合物が例示される。一般に、ＤＮＡポリメラーゼは３つのリン酸部分を有するデオキシリボヌクレオチドを核酸合成反応の基質とする。従って、ひとつの態様において、本発明の溶液はデオキシリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）並びにそれらの誘導体からなる群より選択されるデオキシリボヌクレオチドを含む。デオキシリボヌクレオチド誘導体は、［αＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デアザ−ｄＡＴＰ及び核酸分解に抵抗性を示すデオキシヌクレオチド誘導体を含む。ヌクレオチド誘導体は、例えば、３２Ｐ若しくは３５Ｓなどの放射性同位体、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分又は酵素で検出できるように標識されているデオキシリボヌクレオチドを含む。

本発明の溶液はＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよい。本発明の溶液に含まれるＤＮＡポリメラーゼは、特に限定されないが、本発明の溶液がＰＣＲに使用される場合には熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。本発明に利用可能なＤＮＡポリメラーゼとしては、真正細菌、例えばサーマス属又はバシラス属に属する細菌（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘ等）に由来するＤＮＡポリメラーゼ、古細菌、例えばパイロコッカス属又はサーモコッカス属に属する細菌（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ等）に由来するＤＮＡポリメラーゼが例示される。さらに、これらＤＮＡポリメラーゼの改変体も本発明に使用することができる。

２種以上のＤＮＡポリメラーゼが本発明の溶液に含まれる場合もある。例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼと、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しない別のＤＮＡポリメラーゼとの組み合わせを本発明において使用することができる。かかるＤＮＡポリメラーゼの組み合わせを用いる技術は、ＬＡＰＣＲ（ＬｏｎｇａｎｄａｃｃｕｒａｔｅＰＣＲ）として知られている。

本発明の溶液は逆転写酵素を含んでいてもよい。本発明の溶液に含まれる逆転写酵素は、逆転写活性、すなわちＲＮＡを鋳型としてこれに相補的なＤＮＡを合成する活性を有するものであれば本発明に使用でき、このような逆転写酵素としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来逆転写酵素やトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）由来逆転写酵素等のウイルス由来の逆転写酵素やそれらの改変体が例示される。さらに、サーマス属細菌（例えばＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来ＤＮＡポリメラーゼや好熱性バシラス属細菌（例えばＢａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）由来ＤＮＡポリメラーゼ等の真正細菌由来の耐熱性の逆転写酵素（逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ）が例示される。

本発明の溶液は金属塩を含んでいてもよい。例えば、ＤＮＡポリメラーゼの活性に必須である２価の金属イオンの塩が挙げられる。このような２価の金属イオンとしては、マグネシウムイオン、マンガンイオン、及びコバルトイオンが例示される。各ＤＮＡポリメラーゼに適する２価の金属イオンとその濃度は、当該分野で知られている。２価の金属イオンは塩化物、硫酸塩、又は酢酸塩等の塩の形態で供給され得る。本発明を特に限定しないが、本発明の溶液に含まれる２価の金属イオンの濃度としては、例えば０．１〜２００ｍＭ、好ましくは０．２〜１００ｍＭ、さらに好ましくは０．５〜５０ｍＭが例示される。使用する酵素（ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、等）の金属要求性等や当該酵素を含む反応液調製の手順等に応じて塩の種類及び濃度を最適化するのは当然のことである。さらに、本発明の溶液はその他の塩（ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等）を含んでもよい。

本発明の溶液はインターカレーティング色素を含んでもよい。本発明の溶液に含まれるインターカレーティング色素は、二本鎖核酸へのインターカレーションにより蛍光が増強される色素のことをいう。本発明に使用されるインターカレーティング色素としては、ＰＣＲに使用可能なものが好ましく、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ、ＴＢＧｒｅｅｎ（登録商標）、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６２、ＰＯＰＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−１、及びＳＹＴＯＸＯｒａｎｇｅが例示され、中でもＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩやＴＢＧｒｅｅｎ（登録商標）がより好適に例示される。

ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩは、市販されている非対称シアニン系色素であり、その構造はＺｉｐｐｅｒＨら（“ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ”、２００４年、第３２巻、第１２号、ｅ１０３）により明らかにされている。ＺｉｐｐｅｒＨらによれば、ライフテクノロジーズ社より販売されているＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩのＤＭＳＯ溶液の１０，０００倍希釈液（１Ｘ濃度）のＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩのモル濃度は、約２μＭである。

本発明の溶液は界面活性剤を含んでもよい。本発明の溶液に含まれる界面活性剤は、特に限定はないが、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（１０）ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｒ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＰｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅＳｏｒｂｉｔａｎＭｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、及びＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）等の非イオン性界面活性剤、ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌｅｔｈｅｒ（ＰＮＳＥ）等の陰イオン性界面活性剤、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム等の陽イオン性界面活性剤、及びコカミドプロピルベタイン等の両性界面活性剤が例示される。

本発明の溶液に含まれる界面活性剤の濃度は、特に限定はないが、当該溶液がＰＣＲに使用されるものである場合、調製されるＰＣＲ反応液に含有される界面活性剤が適切な濃度となるように設定される。

＜調製＞
核酸結合タンパク質とオリゴヌクレオチド、及び必要に応じてその他の成分を溶媒中で混合することにより、核酸結合タンパク質及びオリゴヌクレオチドを含有する溶液（本発明の溶液）が調製される。上記調製方法は、特に限定されないが、あらかじめ各成分を高濃度で含んだ溶液を作製しておき、それらを必要量分取して、順次容器に加えていくことが好ましい。各成分の混合の順番は、本発明の効果を奏し得る順番であれば、特に限定されない。すべての成分を加えた後、穏やかに撹拌し、すべての成分が均一になるまで混合する。例えば、ピペッティングや転倒混和などによる撹拌が例示される。

＜保存＞
調製した本発明の溶液は容器に分注して保存してもよい。本発明において使用される容器の素材は、本発明の効果を奏し得る素材であれば、特に限定されないが、少なくともオリゴヌクレオチドに対する吸着性が低い素材によって形成されていることが好ましい。本発明において使用される容器の大きさ及び形状は、本発明の効果を奏し得れば、特に限定されない。また、分注方法及び分注量は、本発明の効果を奏し得る方法及び分注量であれば、特に限定されない。

上記工程で調製した溶液、すなわち「核酸結合タンパク質及び核酸を含有する溶液（本発明の溶液）」を低温で保存する。

本発明において「低温」とは、本発明の効果を奏し得る温度であれば、特に限定されず、オリゴヌクレオチドの種類や濃度、核酸結合タンパク質の種類や濃度、オリゴヌクレオチドと核酸結合タンパク質の混合比、その他の成分の種類や濃度、及び保存時間等を考慮して適宜決定することができる。特に限定されないが、４℃以下、０℃以下、−１０℃以下、−２０℃以下、−３０℃以下、−４０℃以下、−５０℃以下、−６０℃以下、−７０℃以下、−８０℃以下が例示される。特に限定されないが、溶液が凍結する温度が好ましい。

本発明の溶液を保存する時間は、本発明の効果を奏し得る時間であれば、特に限定されず、オリゴヌクレオチドの種類や濃度、核酸結合タンパク質の種類や濃度、オリゴヌクレオチドと核酸結合タンパク質の混合比、その他の成分の種類や濃度、及び保存温度等を考慮して適宜決定することができる。特に限定されないが、２４時間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、６日間以上、１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、または８週間以上の保存が例示される。また、保存する時間の上限は、特に限定されないが、１０年以下、９年以下、８年以下、７年以下、６年以下、５年以下、４年以下、３年以下、２年以下、１年以下、または使用期限までの保存が例示される。前記使用期限は本発明の溶液がその効果を奏し得る範囲で適宜設定すればよい。

溶液が凍結して保存された場合、適切な方法で融解して使用することができる。融解方法は、特に限定されず、例えば凍結した溶液を含む容器を室温で静置することにより、融解することができる。また、凍結した溶液を含む容器を氷中（又は氷上）や恒温水槽中で静置することにより、融解することもできる。

本発明のオリゴヌクレオチドの保存方法により保存されたオリゴヌクレオチドは、公知の核酸解析方法を用いて解析することができる。このような核酸解析方法として、例えば、核酸を定量する方法や、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を用いて増幅産物を解析する方法等がある。

本発明の一つの態様では、本発明のオリゴヌクレオチドの保存方法により保存されたオリゴヌクレオチドは、公知の核酸解析方法におけるプライマー、プローブとして使用される。このような核酸解析方法として、例えば、鋳型核酸の相補鎖の合成（例えばｃＤＮＡの合成）、標的核酸の増幅（例えばＰＣＲ法）、種々のハイブリダイゼーション法による核酸の検出や定量等が例示される。プライマーを含有する本発明の溶液は、単一のプライマーを含むもの、標的核酸を増幅可能な１対のプライマーを含むもの、複数の標的核酸のそれぞれに対応する複数のプライマー対を含むもの、等が例示される。プローブの場合も同様に、１種もしくは複数種のプローブを含むことができる。さらに、１又は複数のプライマーと、１又は複数のプローブとを含む溶液も本発明の態様の一つである。

本発明の溶液に含有されるオリゴヌクレオチドをプライマーとして、又はプローブとして使用する核酸増幅反応は本発明の一つの態様である。本発明の溶液ならびに核酸増幅反応に必要な各種の成分を混合して核酸増幅用の反応液を調製し、反応が実施される。核酸増幅反応に必要な成分は当業者に周知である。代表的な成分としてはＤＮＡポリメラーゼ、２価金属イオン、デオキシリボヌクレオシド３リン酸、緩衝成分が例示されるが、それ以外の成分を適宜使用することができる。本発明の溶液に含有されるオリゴヌクレオチドがプライマーもしくはプライマー対である場合、反応液には適切な鋳型核酸もしくは鋳型核酸を含む可能性のある試料が添加される。前記の核酸増幅反応は、鋳型核酸の定性的な検出及び／又は定量に利用することができる。

核酸増幅過程のモニタリング結果を利用したＤＮＡの定量は、当該技術分野で公知の方法を利用すればよい。例えば、核酸増幅反応に使用するプライマー対による核酸増幅の鋳型となる核酸配列を有するスタンダードＤＮＡ（ポジティブコントロールＤＮＡ）の希釈系列を作成し、そのそれぞれを鋳型として用いたリアルタイムＰＣＲによりＣｔ値を算出して検量線を作成し、これに基づいて検体中のＤＮＡを定量することができる。上記のスタンダードＤＮＡとしては、例えばプラスミドＤＮＡを用いることができる。Ｃｔ値の算出方法としては、例えば閾値と増幅曲線の交点をＣｔ値とする方法（ＣｒｏｓｓｉｎｇＰｏｉｎｔ法）や、増幅曲線の２次導関数を求めてそれが最大となる点をＣｔ値とする方法（２ｎｄＤｅｒｉｖａｔｉｖｅＭａｘｉｍｕｍ法）が利用できる。

上記方法は、更に融解曲線分析を実施する工程を含んでもよい。融解曲線分析では、核酸増幅反応後に反応液の温度を徐々に上げ、その際にインターカレーティング色素の蛍光シグナルをモニタリングする。低温では核酸増幅産物が二本鎖を形成して強い蛍光シグナルを示すが、ある一定の温度に達すると一本鎖に解離し、インターカレーティング色素の蛍光シグナル強度は急激に低下する。このときの温度が融解温度（Ｔｍ値）である。融解曲線分析により増幅産物のＴｍ値を調べ、特異的な増幅産物であるか否かを確認することができる。

標識プローブを使用する核酸の検出・定量方法が知られている。代表的な方法は、蛍光物質と消光物質とで二重標識したプローブと標的核酸とを接触させ、両者がハイブリダイズした場合に前記のプローブの切断が起こるようにしたものである。プローブが切断されて生じる蛍光を指標として標的核酸を検出及び／又は定量することができる。このような方法として、ＤＮＡポリメラーゼが有する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性でプローブを切断するＴａｑｍａｎ法、プローブとしてＤＮＡ／ＲＮＡキメラプローブを使用し、これをリボヌクレアーゼＨで切断するサイクリングプローブ法が挙げられる。本発明の溶液は、このような用途に使用可能な標識プローブ（オリゴヌクレオチド）を含有するものであってもよい。

標的核酸の増幅に使用されるプライマー対と核酸結合タンパク質とを含有する本発明の溶液の一つの態様として、さらに核酸増幅反応に必要な成分（ただし鋳型核酸を除く）を含有させた溶液（プレミックス溶液）が例示される。このような溶液は鋳型核酸もしくは鋳型核酸を含む可能性のある試料を添加して簡便に核酸増幅用の反応液を調製することができ、鋳型核酸の迅速な検出や定量に有用である。長期に保存しても核酸増幅反応の効率が低下しないことから、検出・定量を再現性良く実施することができる。

（２）本発明の「標的核酸を増幅するためのキット」
核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する本発明の溶液の態様は、当該標的核酸の検出または増幅に有用である。本発明の溶液は低温で保存された際にオリゴヌクレオチドの劣化がより抑えられることから、好ましくは、低温保存された本発明の溶液を用いて標的核酸の検出や定量を再現性良く実施することができる。前記のオリゴヌクレオチドとしては、標的核酸検出のためのプローブとして機能するもの、標的核酸の増幅においてプライマーとして機能するもの、が例示される。したがって、本発明の一態様において、核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液を含む、標的核酸を増幅するためのキット（以下、「本発明のキット」と称す）が提供される。

本発明のキットは、さらに核酸増幅に必要又は有用な各種の成分、例えば、前記の酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、等）、金属塩（例えば、２価金属イオン）、デオキシリボヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオシド３リン酸）、緩衝成分、界面活性剤などを含むものであってもよい。これらの成分は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、二価金属イオン、デオキシリボヌクレオシド３リン酸及び緩衝成分からなる群より選択される１以上の成分であってもよい。前記の核酸増幅に必要又は有用な成分はそれぞれ別のコンポーネントとしてキットに含まれてもよいが、複数の成分を組み合わせたコンポーネントとすることもできる。さらに、核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液がこれらの成分の１以上を含んでいてもよい。

本発明のキットの一つの態様として、核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液と、ＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液とを組み合わせた本発明のキットの態様は、標的核酸の増幅や検出に有用である。標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドがプライマーである場合、両溶液を混合して標的核酸増幅用の反応液を調製することができる。また、標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドがプローブである場合、両溶液に加えて適切なプライマーを使用し、標的核酸検出用の反応液を調製することができる。さらに、核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液、又はＤＮＡポリメラーゼを含有する溶液は、前記の核酸増幅に必要又は有用な成分の１以上を含んでいてもよい。例えば、核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する第一の溶液と、ＤＮＡポリメラーゼ、二価金属イオン、デオキシリボヌクレオシド３リン酸及び緩衝成分からなる群より選択される１以上の要素を含有する第二の溶液を包含するキットが挙げられる。前記の各コンポーネント又は第一の溶液及び第二の溶液は、それぞれ、別の容器中で保存される。

本発明のキットの別の態様として、核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに加えて、核酸増幅反応に必要な成分その他の成分（ただし鋳型核酸を除く）のすべてを含有させた溶液（プレミックス溶液）をコンポーネントとするキットが例示される。プレミックス溶液の一例として、核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに加えて、ＤＮＡポリメラーゼ、二価金属イオン、デオキシリボヌクレオシド３リン酸及び緩衝成分を含有する溶液が挙げられる。当該キットは、前記のコンポーネントに鋳型核酸もしくは鋳型核酸を含む可能性のある試料を添加して簡便に核酸増幅用の反応液を調製することができ、鋳型核酸の迅速な検出や定量に有用である。長期に保存しても核酸増幅反応の効率が低下しないことから、検出・定量を再現性良く実施することができる。

本発明の好適な態様では、本発明のキットは、標的核酸の塩基配列の少なくとも一部を有する陽性対照核酸、試料の前処理で使用される試薬等を含んでもよい。

さらに、本発明の別の態様として、オリゴヌクレオチドを安定に保存するための核酸結合タンパク質の使用、が挙げられる。本態様により、保存されたオリゴヌクレオチドを含む反応液を使用した核酸増幅反応における、核酸増幅効率の低下が防止される。本発明の「核酸結合タンパク質の使用」は、具体的には、前記の本発明の「オリゴヌクレオチドの保存方法」に記載されたようにして実施することができ、標的核酸の増幅／検出方法、当該方法に使用されるキットの製造に有用である。

前記の本発明のキットは、好ましくは、使用するまでは低温で保存される。特に好ましくは、本発明のキットにおいて、核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液が低温で保存されている。特に本発明を限定するものではないが、核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴデオキシリボヌクレオチドを含有する溶液については、凍結した状態で保存されることが望ましい。

以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されない。

調製例１ＣｓｐＡ原液の調製
Ｓ．Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．），１９９３，１１４，６６３−６６９］に記載の方法に従って、大腸菌のＣｓｐＡタンパク質を発現、精製した後、ＣｓｐＡ原液（１０ｍｇ／ｍＬＣｓｐＡタンパク質、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８（４℃））、１００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、５０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を調製した。ＣｓｐＡ原液をチューブに分注し、使用時まで、−２０℃で凍結保存した。

調製例２プライマー原液の調製
ｉｎｖＡ＿Ｆ−６プライマー（配列番号１）、ｉｎｖＡ＿Ｒ−６プライマー（配列番号２）、及びｓｔｘ１＿Ｒ−２プライマー（配列番号３）をそれぞれＴＥバッファー（ｐＨ８．０）に溶解し、プライマー原液（１００μＭ）を調製した。プライマー原液をチューブに分注し、使用時まで、−２０℃で凍結保存した。

実施例１プライマーミックス溶液の経時的なＰＣＲ反応性低下
プライマー原液及びＴＥバッファーを混合して、プライマーミックス溶液を調製した。すなわち、ｉｎｖＡ＿Ｆ−６プライマー（１０μＭ、配列番号１）、ｉｎｖＡ＿Ｒ−６プライマー（１０μＭ、配列番号２）、及びｓｔｘ１＿Ｒ−２プライマー（１０μＭ、配列番号３）をＴＥバッファー中に含む、プライマーミックス溶液を調製した。

このプライマーミックス溶液をチューブに分注し、−２０℃で凍結保存した。凍結前のプライマーミックス溶液、及び凍結開始後３、５、７、１０日目に融解したプライマーミックス溶液を、それぞれ下記ＰＣＲに供した。ここで、凍結前のプライマーミックス溶液については調整後すぐに、また凍結保存したプライマーミックス溶液は融解後速やかに、それぞれＰＣＲを実施した。以降の実施例においても同様の手順でＰＣＲを実施した。

ＰＣＲ反応液は、ｎ＝２で調製した。すなわち、上記プライマーミックス溶液を２．５μｌ、ＴａＫａＲａ腸管系病原細菌遺伝子検出キット（タカラバイオ社製、ＲＲ１３９Ａ）に含まれるＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘＦａｓｔを１２．５μｌ、１００ＸＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ（タカラバイオ社製）を０．２５μｌ、及び滅菌水を混合して、最終容量を２５μｌとした。ＰＣＲおよび蛍光検出は、ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒＤｉｃｅ（登録商標）ＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍＩＩＩ（タカラバイオ社製、ＴＰ９５０）で行った。ＰＣＲの反応条件は、９４℃３０秒の予温の後、９０℃１秒、６４℃１０秒を１サイクルとする４５サイクル反応で行い、最後に解離反応として６８℃から９０℃まで継時的に温度を上昇させ、各温度の蛍光強度を観察した。また、対照として、５ｐｇのサルモネラゲノムを鋳型ＤＮＡとして含む反応液で同様の測定を行った。

上記ＰＣＲのうち、凍結前のプライマーミックス溶液を使用した場合の増幅曲線及び融解曲線の例を、それぞれ図１及び図２に示す。図１に示したように、鋳型ＤＮＡを含む反応液（対照）では、鋳型ＤＮＡを含まない場合に比べて蛍光の立ち上がりが早くなる。また、図２で観察される８５℃付近のピークはｉｎｖＡ遺伝子断片の増幅産物に由来し、７３℃付近のピークは非特異的増幅産物に由来する。これらの結果は、鋳型ＤＮＡを含まない反応液では、非特異的増幅産物が生成することを示す。すなわち、増幅曲線及び融解曲線を解析することにより、非特異的増幅産物の生成をモニターできる。

測定結果から計算される、鋳型ＤＮＡを含まない反応液のＣｔ値の経時的変化を図３に示す。図３に示したように、プライマーミックス溶液を凍結保存すると、反応液に鋳型ＤＮＡが含まれないにも関わらず、Ｃｔ値が経時的に減少する。この結果は、プライマーミックス溶液の保存期間が長くなるにつれて、非特異的増幅産物が生成しやすくなることを示す。

実施例２プライマーミックス溶液へのＣｓｐＡ添加によるＰＣＲ反応性維持
３種のプライマー及び添加物（ＣｓｐＡ又はＴｗｅｅｎ２０）を含むプライマーミックス溶液を調製した。すなわち、実施例１と同様の方法でプライマーミックス溶液を調製する際に、更にＣｓｐＡタンパク質（タカラバイオ社製）を終濃度４ｍｇ／ｍｌになるように添加することにより、ＣｓｐＡを含むプライマーミックス溶液を調製した。また、実施例１と同様の方法でプライマーミックス溶液を調製し、更にＴｗｅｅｎ（登録商標）２０（ナカライテスク社製）を終濃度０．５％になるように添加することにより、Ｔｗｅｅｎ２０を含むプライマーミックス溶液を調製した。対照として、添加物を含まないプライマーミックス溶液も調製し、ＴＥｃｏｎｔｒｏｌとした。

これらのプライマーミックス溶液をチューブに分注し、−２０℃で凍結保存した。凍結前のプライマーミックス溶液、及び凍結開始後３、６日目に融解したプライマーミックス溶液を、ＰＣＲに供した。実施例１記載の方法でＰＣＲ反応液をｎ＝４で調製し、実施例１記載の条件でＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲの条件を合わせるために、ＴＥｃｏｎｔｒｏｌ及びＴｗｅｅｎ２０のＰＣＲ反応液には、反応液調製時に、ＣｓｐＡタンパク質を添加した。測定結果から計算される、鋳型ＤＮＡを含まない反応液のＣｔ値を図４に示す。

図４に示したように、ＣｓｐＡ又はＴｗｅｅｎ２０をプライマーミックス溶液に添加することにより、Ｃｔ値の減少が抑えられる。特に、ＣｓｐＡを添加することにより、効果的にＣｔ値の減少を抑えることができた。この結果は、プライマーミックス溶液へＣｓｐＡを添加して保存することにより、非特異的増幅産物の生成を抑制できることを示す。

実施例３ＣｓｐＡの濃度評価（１回目）
３種のプライマー及び濃度の異なるＣｓｐＡを含むプライマーミックス溶液を調製した。すなわち、実施例１と同様の方法でプライマーミックス溶液を調製する際に、更にＣｓｐＡタンパク質を終濃度４ｍｇ／ｍｌ又は終濃度２ｍｇ／ｍｌになるように添加することにより、濃度の異なるＣｓｐＡを含むプライマーミックス溶液を調製した。対照として、ＣｓｐＡを含まないプライマーミックス溶液も調製し、ＴＥｃｏｎｔｒｏｌとした。

これらのプライマーミックス溶液をチューブに分注し、−２０℃で凍結保存した。凍結前のプライマーミックス溶液、及び凍結開始後３、６日目に融解したプライマーミックス溶液を、ＰＣＲに供した。実施例１記載の方法でＰＣＲ反応液をｎ＝４で調製し、実施例１記載の条件でＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲの条件を合わせるために、ＴＥｃｏｎｔｒｏｌ及び２ｍｇ／ｍｌＣｓｐＡのＰＣＲ反応液には、反応液調製時に、ＣｓｐＡタンパク質を添加した。測定結果から計算される、鋳型ＤＮＡを含まない反応液のＣｔ値を図５に示す。

図５に示したように、終濃度４ｍｇ／ｍｌ又は終濃度２ｍｇ／ｍｌのＣｓｐＡを含むプライマーミックス溶液は、ＣｓｐＡを含まないプライマーミックス溶液（ＴＥｃｏｎｔｒｏｌ）に比べてＣｔ値の減少が抑えられる。この結果は、プライマーミックス溶液へ終濃度４ｍｇ／ｍｌ又は終濃度２ｍｇ／ｍｌのＣｓｐＡを添加して保存することにより、非特異的増幅産物の生成を抑制できることを示す。

実施例４ＣｓｐＡの濃度評価（２回目）
３種のプライマー及び濃度の異なるＣｓｐＡを含むプライマーミックス溶液を調製した。すなわち、実施例１と同様の方法でプライマーミックス溶液を調製する際に、更にＣｓｐＡタンパク質を終濃度４ｍｇ／ｍｌ、終濃度１ｍｇ／ｍｌ、又は終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌになるように添加することにより、濃度の異なるＣｓｐＡを含むプライマーミックス溶液を調製した。対照として、ＣｓｐＡを含まないプライマーミックス溶液も調製し、ＴＥｃｏｎｔｒｏｌとした。

これらのプライマーミックス溶液をチューブに分注し、−２０℃で凍結保存した。凍結前のプライマーミックス溶液、及び凍結開始後３、７日目に融解したプライマーミックス溶液を、ＰＣＲに供した。実施例１記載の方法でＰＣＲ反応液をｎ＝４で調製し、実施例１記載の条件でＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲの条件を合わせるために、ＴＥｃｏｎｔｒｏｌ、１ｍｇ／ｍｌＣｓｐＡ、及び０．２５ｍｇ／ｍｌＣｓｐＡのＰＣＲ反応液には、反応液調製時に、ＣｓｐＡタンパク質を添加した。測定結果から計算される、鋳型ＤＮＡを含まない反応液のＣｔ値を図６に示す。

図６に示したように、ＣｓｐＡの濃度依存的にＣｔ値が減少した。この結果は、プライマーミックス溶液へ添加するＣｓｐＡの濃度依存的に非特異的増幅産物の生成を抑制できることを示す。

実施例５プライマーミックス溶液への核酸結合タンパク質添加によるＰＣＲ反応性維持
３種のプライマー及び核酸結合タンパク質（ＣｓｐＡ、Ｔ４ＳＳＢ、又はＥ．ｃｏｌｉＳＳＢ）を含むプライマーミックス溶液を調製した。すなわち、ｉｎｖＡ＿Ｆ−６プライマー（２０μＭ、配列番号１）、ｉｎｖＡ＿Ｒ−６プライマー（２０μＭ、配列番号２）、及びｓｔｘ１＿Ｒ−２プライマー（２０μＭ、配列番号３）を含むＴＥバッファーを調製する際に、更にＣｓｐＡタンパク質（終濃度４ｍｇ／ｍｌ）、Ｔ４ファージ由来ＳＳＢタンパク質（バイオアカデミア社製、終濃度２ｍｇ／ｍｌ）、又は大腸菌のＳＳＢタンパク質（バイオアカデミア社製、終濃度２ｍｇ／ｍｌ）をそれぞれ添加することにより、核酸結合タンパク質を含むプライマーミックス溶液を調製した。対照として、核酸結合タンパク質を含まないプライマーミックス溶液も調製し、ＴＥｃｏｎｔｒｏｌとした。

これらのプライマーミックス溶液をチューブに分注し、−２０℃で凍結保存した。凍結前のプライマーミックス溶液、及び凍結開始後２、５、９日目に融解したプライマーミックス溶液を、ＰＣＲに供した。

ＰＣＲ反応液は、ｎ＝４で調製した。すなわち、上記プライマーミックス溶液を１．２５μｌ、ＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘＦａｓｔを１２．５μｌ、１００ＸＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩを０．２５μｌ、及び滅菌水を混合して、最終容量を２５μｌとし、実施例１記載の条件でＰＣＲを行った。なお、ＰＣＲの条件を合わせるために、ＴＥｃｏｎｔｒｏｌのＰＣＲ反応液には、反応液調製時に、ＣｓｐＡタンパク質を添加した。測定結果から計算される、鋳型ＤＮＡを含まない反応液のＣｔ値（比率）を図７に示す。

図７に示したように、核酸結合タンパク質（ＣｓｐＡ、Ｔ４ＳＳＢ、又はＥ．ｃｏｌｉＳＳＢ）をプライマーミックス溶液に添加することにより、Ｃｔ値の減少が抑えられる。この結果は、プライマーミックス溶液へ核酸結合タンパク質を添加して保存することにより、非特異的増幅産物の生成を抑制できることを示す。

実施例６プレミックス溶液へのＣｓｐＡ添加によるＰＣＲ反応性維持
鋳型ＤＮＡ以外のＰＣＲに必要な成分（プライマー、ｄＮＴＰ、酵素、蛍光色素、など）及びＣｓｐＡを含むプレミックス溶液を調製した。すなわち、容量１４．５μｌあたりにｉｎｖＡ＿Ｆ−６プライマー（１．７μＭ、配列番号１）、ｉｎｖＡ＿Ｒ−６プライマー（１．７μＭ、配列番号２）、ｓｔｘ１＿Ｒ−２プライマー（１．７μＭ、配列番号３）、ＲｅａｃｔｉｏｎＭｉｘＦａｓｔ（１２．５μｌ）、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ（１．７Ｘ）、及びＣｓｐＡ（０．６９ｍｇ／ｍｌ）を含むプレミックス溶液を調製した。対照として、ＣｓｐＡを含まないプレミックス溶液も調製し、ＴＥｃｏｎｔｒｏｌとした。

これらのプレミックス溶液をチューブに分注し、−２０℃で凍結保存した。凍結前のプレミックス溶液、及び凍結開始後３、７日目に融解したプレミックス溶液を、ＰＣＲに供した。すなわち、上記プレミックス溶液１４．５μｌ及び滅菌水１０．５μｌを混合して、ＰＣＲ反応液を調製し、実施例１記載の条件でＰＣＲを行った（ｎ＝４）。測定結果から計算される、鋳型ＤＮＡを含まない反応液のＣｔ値を図８に示す。

図８に示したように、ＣｓｐＡをプレミックス溶液に添加することにより、Ｃｔ値の減少が抑えられる。この結果は、プレミックス溶液へＣｓｐＡを添加して保存することにより、非特異的増幅産物の生成を抑制できることを示す。

本発明は、遺伝子工学、生物学、医学、農業等幅広い分野において有用である。

SEQ ID NO:1 ; PCR primer "invA_F-6"
SEQ ID NO:2 ; PCR primer "invA_R-6"
SEQ ID NO:3 ; PCR primer "stx1_R-2"

Claims

オリゴヌクレオチドの保存方法であって、核酸結合タンパク質及びオリゴヌクレオチドを含有する溶液を低温で保存する工程、を包含することを特徴とする方法。
核酸結合タンパク質が一本鎖核酸に結合するタンパク質である、請求項１に記載の方法。
一本鎖核酸に結合するタンパク質がコールドショックタンパク質及びＳＳＢより選択されるタンパク質である、請求項２に記載の方法。
一本鎖核酸に結合するタンパク質がＣｓｐＡ、Ｔ４ファージ由来ＳＳＢ及び大腸菌由来ＳＳＢより選択されるタンパク質である請求項２に記載の方法。
オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
溶液を凍結させて保存する工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
標的核酸を増幅するためのキットであって、核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液を包含することを特徴とするキット。
核酸結合タンパク質が一本鎖核酸に結合するタンパク質である、請求項７に記載のキット。
一本鎖核酸に結合するタンパク質がコールドショックタンパク質及びＳＳＢより選択されるタンパク質である、請求項８に記載のキット。
一本鎖核酸に結合するタンパク質がＣｓｐＡ、Ｔ４ファージ由来ＳＳＢ及び大腸菌由来ＳＳＢより選択されるタンパク質である請求項９に記載のキット。
オリゴヌクレオチドがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載のキット。
オリゴデオキシリボヌクレオチドが標的核酸の増幅に使用されるプライマーである請求項１１に記載のキット。
核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液が低温で保存されている、請求項７〜１２のいずれか一項に記載のキット。
核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液が凍結している溶液である、請求項７〜１３のいずれか一項に記載のキット。
核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する第一の溶液と、ＤＮＡポリメラーゼ、二価金属イオン、デオキシリボヌクレオシド３リン酸及び緩衝成分からなる群より選択される１以上の要素を含有する第二の溶液を包含する、請求項７〜１４のいずれか一項に記載のキット。
核酸結合タンパク質及び標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含有する溶液が、さらにＤＮＡポリメラーゼ、二価金属イオン、デオキシリボヌクレオシド３リン酸及び緩衝成分を含有する、請求項７〜１４のいずれか一項に記載のキット。