KR20120117746A - 열 안정성 중합효소와 이중 가닥 핵산 복합체를 사용하여 디옥시리보뉴클레오티드 사슬을 합성하는 조성물 및 이들의 합성방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 분자 생물학 분야, 더 구체적으로 증폭 방법에 사용되는 핵산 구조물에 관한 것이다. 좀 더 정확하게는, 본 발명은 이중 가닥 핵산의 연장을 억제할 수 있는 분자로 개조된 이중 가닥 뉴클레오티드를 사용하여 핵산의 특이적인 증폭을 강화한다.

Description

열 안정성 중합효소와 이중 가닥 핵산 복합체를 사용하여 디옥시리보뉴클레오티드 사슬을 합성하는 조성물 및 이들의 합성방법{Composition and Methods for Synthesizing a Deoxyribonucleotide Chain using a Double Stranded Nucleic Acid Complex with a Thermostable Polymerase}

[연관된 출원]

본 출원은 Stephen Picone 등에 의해서 2009년 11월 6일자에 제출된 미국임시출원 제61/258,684호, 발명의 명칭“열 안정성 중합효소와 이중 사슬 핵산 복합체를 사용하여 디옥시리보뉴클레오티드를 합성하는 조성물 및 방법(Composition and Method for Synthesizing a Deoxyribonucleotide Chain Using a Double Stranded Nucleic Acid Complex with a Thermostable Polymerase)에 대한 우선권을 주장한다.

상기 출원서의 전체 내용은 본 발명의 참조로 통합되었다.

DNA 중합효소는 핵산의 가닥 내로 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide)의 중합을 촉매하는 효소이다. 중합효소는 DNA 가닥을 복사하거나 증폭하는 방법인 PCR 합성을 포함한 다양한 DNA 기술에서 사용된다. 일부 PCR 방법에서의 주요 문제점은 산물이 비-특이적으로 증폭된다는 것이다(예, 원하는 않은 DNA 가닥의 생성). 이러한 현상의 원인은 실질적인 써모사이클링(thermoxycling)을 시작하기 전에 다른 DNA의 프라이밍(priming) 및/또는 프라이머 올리고머화 및 그에 따른 프라이머 확장(extension)과 같은 비정상적인 반응을 야기하는 올리고뉴클레오티드의 비-특이적인 프라이밍 및 비-특이적인 올리고뉴클레오티드의 생산이다. 이러한 현상은 열 안정성 DNA 중합효소가 실온에서 어느 정도 활성을 가지기 때문에 발생한다.

이러한 문제점들을 최소화하기 위하여 "핫 스타트(hot start)" PCR로 알려진 방법을 사용할 수 있다. 핫 스타트 PCR에서, 증폭 반응을 위한 하나의 필수적인 요소는 반응 혼합물의 온도가 처음으로 상승될 때까지 반응 혼합물로부터 분리되거나 또는 비활성 상태로 유지되어야 한다. 이러한 중합효소는 상기의 조건에서 기능을 할 수 없기 때문에, 프라이머가 비-특이적으로 결합하는 기간 동안 프라이머 연장은 비교적 적다. 이러한 효과를 얻기 위하여, 몇몇 방법을 적용한다: DNA 중합효소의 물리적인 분리(예, 반응 혼합물로부터 DNA 중합효소를 분리하기 위하여 고체의 왁스 방해물의 사용), DNA 중합효소의 화학적인 변경(예, DNA 중합효소의 비활성은 가역적이다), 중합효소 DNA 항체(예, 항체는 증폭하는 동안 실온에서는 결합하고 증폭하는 동안 고온에서는 분리된다), 핵산 첨가물에 의한 DNA 중합효소의 활성 억제, 앱타머(aptamer(예, 루프(loop), 유사매듭(pseudoknot), 및 항체와 같은 기능을 하는 복잡한 3차원의 구조물을 형성하는 뉴클레오티드의 단일 가닥 형태)), 폐쇄된 프라이머, 및 다른 이러한 일부 방법들은 불편할 뿐만 아니라 비-특이적인 증폭을 최소화할 수 있을 정도로 효과적이지 않다.

따라서, 증폭 과정 및 써모사이클링 과정 전에 비-특이적인 프라이밍 및 프라이머 연장을 억제하는 특별한 대체 조성물이 필요하다. 좀 더 구체적으로, 핫 스타트 PCR용의 향상된 대체 조성물 및 방법이 필요하다.

[발명의 요약]

본 발명은 핵산 증폭에 사용되는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체(blocking double stranded nucleic acid complex, DSC)에 관한 것이다. 하나의 구체예에서, 상기 복합체는 약 9 내지 40개 범위의 핵산 염기를 포함하고 있는 제1 핵산 가닥, 및 제1 서열에 상보적인 약 9 내지 40개 범위의 핵산 염기를 포함하고 있는 제2 서열을 가지고 있는 제2 핵산 가닥을 가지는 분리된 이중 가닥 핵산 분자를 포함하며, 상기 제1 핵산 가닥 및 제2 핵산 가닥은 각각 3’말단 및 5’ 말단을 가지고, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 약 50% 내지 약 70% 범위 내에서 시토신(cytosine, C) 및 구아닌(guanine, G)을 가지고 있다. 상기 이중 가닥 핵산 복합체는 폐쇄 분자(blocking molecule)도 포함하며, 폐쇄 분자는 상기 제1 핵산 가닥, 제2 핵산 가닥, 또는 두 핵산 가닥의 3’말단 또는 5’말단에 공유 결합한다. 한 측면에서, 상기 이중 가닥 핵산 분자의(예, DNA 또는 RNA) 녹는점은 약 25 ℃ 내지 약 90℃ 범위 내이다. 한 구체예에서, 본 발명의 DSC는 우리실(uracil) 염기의 도입을 더 포함한다. 고세균(Archaebacteria) 유래의 DNA 중합효소를 사용할 때 하나 이상의 우라실 염기의 첨가는 실온에서의 중합효소 활성을 더 감소시킨다. 특히, DSC의 제1 및 제2 서열은 하나 이상의 우라실 염기를 더 포함한다.

페쇄 분자의 예는 디옥시티미딘(deoxythymidine), 디디옥시뉴클로오티드(dideoxynucleotides), 3'에서의 인산화반응, 헥산디올(hexanediol), 스페이서 분자(spacer molecules), l'2'-디데옥시리보스(dideoxyribose), 2'-0-메틸 RNA(Methyl RNA), 및/또는 잠금 핵산(Locked Nucleic Acids, LNAs)을 포함한다. 하나의 구체예에서, 상기 폐쇄 분자는 하기의 구조를 가진다:

역전된 dT

또한, 본 발명은 핵산 증폭용 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체에 관한 것으로, 상기 복합체는 약 9 내지 40개 범위의 핵산 염기를 포함하고 있는 제1 서열을 가지고 있는 제1 핵산 가닥, 및 제1 서열에 상보적인 약 9 내지 40개 범위의 핵산 염기를 포함하고 있는 제2 서열을 가지는 제2 핵산 가닥을 가지는 분리된 이중 가닥 핵산 분자를 포함하고, 상기 제1 핵산 가닥 및 제2 핵산 가닥은 각각 3’말단 및 5’ 말단을 가지며, 상기 이중 가닥 핵산 분자의 범위는 25℃ 내지 90℃이다. 이러한 구체예는 제1 핵산 가닥, 제2 핵산 가닥, 또는 두 개의 핵산 가닥의 3’말단 또는 5’말단에 결합된 폐쇄 분자를 포함한다. 한 측면에서, 제1 서열 및 제2 서열은 하나 이상의 우라실 염기를 더 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체는 다음의 서열 중의 하나와 상동성이 약 70% 이상인 제1 핵산 서열을 가진 제1 핵산 가닥을 가지는 분리된 이중 가닥 핵산 분자를 포함하는 복합체를 가진다: 서열 번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 이들의 조합; 다음 서열 번호의 상보적인 서열: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 이들의 조합; 또는 다음의 서열번호에 하이브리다이즈하는(hybridize) 서열: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 이들의 조합.

상기 복합체는 제1 핵산 서열에 상보적인 약 9 내지 40개 범위의 핵산 염기를 포함하는 제2 서열을 가지는 제2 핵산 가닥을 포함하며, 상기 제1 핵산 가닥 및 제2 핵산 가닥 각각은 3’말단 및 5’말단을 가지고, 상기 이중 가닥 핵산 분자의 녹는점은 약 25℃ 내지 90℃의 범위 내이다. 상기 복합체는 제1 핵산 가닥, 제2 핵산 가닥, 또는 두 개의 핵산 가닥에 공유 결합하는 폐쇄 분자도 가진다. 하나의 측면에서, 제1 및 제2 핵산 가닥의 3’말단은 폐쇄 분자를 포함하고, 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체가 핵산 중합 효소와 상호작용할 때, 이로 인하여 비-특이적인 증폭 산물은 감소한다. 상기 복합체의 바람직한 녹는점은 약 48.9℃이다.

본 발명은 핵산 증폭용 조성물도 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물은 버퍼, 본 발명에서 설명되는 이중 가닥 핵산 복합체, 및 열 안정성 중합 효소를 포함한다. 중합 효소는 택(Taq) DNA 중합효소; BST DNA 중합효소; PFU DNA 중합효소; Klenow(크레나우) DNA 중합효소; T7 DNA 중합효소; T4 DNA 중합효소; Phi29 DNA 중합효소; or RB69 DNA 중합효소와 같은 DNA 중합효소일 수 있다. 농도 범위는 예를 들어, 모든 5,000 U/mL의 중합효소에 대한 2 uM 핵산 복합체 및 모든 5,000 U/mL의 중합효소에 대한 2 mM의 핵산 복합체 범위 내일 수 있다. 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법은 본 발명에 의해 더 포함된다. 상기 방법은 본 발명에서 설명되는 DNA 중합 효소 및 이중 가닥 핵산 복합체와 타겟 핵산 분자를 접촉하는 단계를 포함하며, 이중 가닥 핵산 복합체는 25℃ 내지 90℃의 온도 범위에서 DNA 중합효소에 결합한다. 이중 가닥 핵산 복합체와 접촉하지 않는 것들과 비교하면, 하나 이상의 비-특이적인 증폭 산물 또는 이차 산물의 생성은 감소한다. 실온(예, 약 20℃ 내지 25℃ 사이)에서의 중합효소 활성을 이중 가닥 핵산 복합체와 접촉하지 않은 타겟 핵산 분자에 대한 중합효소의 활성과 비교하면, 약 50% 내지 약 90%(예, 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소)의 범위로 감소한다. 게다가, 하나의 측면에서, 본 발명의 방법은 더 우수한 수율을 제공한다. 특정 구체예에서, 이중 가닥 핵산 복합체와 접촉하지 않은 타겟 핵산 분자에서 획득된 양과 비교하면 증폭된 타겟 핵산 분자의 양은 약 2X 내지 약 20X의 범위로 증가한다(예, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 15X 또는 20X로 증가). 다른 구체예에서, 하나 이상의 우라실 염기를 가지는 고세균 종 유래의 DNA 중합효소를 사용할 때에 본 발명에서 설명되는 것처럼 실온에서의 중합효소 활성 또한 감소한다.

본 발명에서 구현되는 부가적인 방법은 본 발명에서 설명되는 버퍼, 타겟 핵산 분자, 하나 이상의 프라이머, DNA 중합 효소, 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 시토신(cytosine) 및 티미닌(thymine)의 공급, 및 이중 가닥 핵산 복합체를 혼합함으로써 타겟 핵산 분자를 증폭하는 것을 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 사이클에서 온도를 상승시킴으로써 타겟 핵산 분자를 증폭하는 것을 더 포함하며, 온도 범위는 약 25℃ 내지 90℃ 범위이다. 이러한 방법은 이중 가닥 핵산 복합체와 접촉하지 않는 것들과 비교할 때, 하나 이상의 비-특이적인 증폭 산물 또는 이차 산물의 생산을 가능케 한다. 본 발명에서 더 설명되는 것처럼, 하나의 구체예에서, 실온에서의 중합 효소 활성은 감소하거나/또는 수율이 증가한다.

본 발명은 핵산 증폭용 키트도 포함한다. 이러한 키트 또는 시스템은 본 발명에서 설명되는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체 및 중합효소를 포함한다. 상기 중합효소는 DNA 중합효소이고 예를 들어, 택 DNA 중합효소; BST DNA 중합효소; PFU DNA 중합효소; 크레노우 DNA 중합효소; T7 DNA 중합효소; T4 DNA 중합효소; Phi29 DNA 중합효소; 또는 RB69 DNA 중합효소일 수 있다.

본 발명은 핫 스타트 PCR 증폭 방법을 개선하는 조성물 및 방법을 편리하게 제공한다. 특히, 본 발명은 증폭 과정 전 또는 증폭 과정 동안의 비-특이적인 프라이밍 및 프라이머 연장을 억제하는 조성물을 제공한다. 게다가, 본 발명은 비-특이적인 증폭 산물 없이 PCR 반응을 가능케 하고 PCR을 수행하는데 있어서 향상된 조성물을 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

본 특허 또는 출원 파일은 유색인 적어도 하나의 도면을 포함한다. 유색의 도면을 가지고 있는 본 특허 또는 특허 출원서의 사본은 필요한 요금을 지불한 후 사무소에서 제공받을 수 있다.

도1은 1.1 kb의 pUC19 플라스미드의 증폭을 나타낸다. 1번째 및 2번째 행은 각각 1번 및 2번 PCR 버터 내에서 3’말단에 캡(cap)을 가진 프라이머와의 반응을 포함하며, 올리고뉴클레오티드의 3’말단에 병합된 억제 분자가 DNA 중합효소에 의한 연장을 효과적으로 방지하는 것을 나타낸다. 3번째 및 4번째 행은 증폭 산물을 생성한 개조되지 않은 프라이머와의 반응을 보여준다. M행은 DNA 표준 마커를 나타낸다.

도2는 반응 프라이머로서 동일한 서열을 가지는 폐쇄 시약과 이중 가닥 핵산 분자가 있는 상태와 없는 상태에서 pUC19 플라스미드의 1.1kb 지역의 PCR 산물의 증폭을 나타낸다. 1번째 및 2번째 행은 PCR 버퍼Ⅰ에서 수행된 반응을 나타내고, 3번째 및 4번째 행은 PCR 버퍼 Ⅱ에서 수행하였다. M행은 DNA 표준 마커를 나타낸다.

도3은 DSC 분자가 존재하는 상태에서의 PCR 증폭을 보여준다. 모든 반응물들은 외래 DNA와 경쟁하는 것으로서 대장균 게놈 DNA 1 ng을 포함한다. 홀수 번호 행은 람다(Lambda) 주형 DNA(11번 행을 제외)를 포함하지만, 짝수 번호 행은 주형 DNA를 포함하지 않는다. 반응 11은 버퍼 Ⅰ, DNTP를 포함하고 있지만, 주형 및 효소는 포함하고 있지 않는 음성 대조군이다. M 행은 DNA 표준 마커를 나타낸다.

도4는 람다 DNA 유래의 1.9 kb 지역의 증폭을 비교하여 보여준다. 1 내지 4 번째 행은 DSC 분자의 존재 하에서 택(Enzymatics, Inc. (Beverly, MA)) 및 택-B DNA 중합효소(저장 버퍼 내에 있는 - 및 + 안정화제)를 포함한다. 5 내지 7 번째 행은 시중에서 구입이 가능한 핫 스타트 DNA 중합효소를 포함하고 있다. 모든 PCR 반응은 람다 DNA 및 대장균 게놈 DNA 1 ng이 존재하는 상태에서 이루어진다. M 행은 DNA 표준 마커를 나타낸다.

도5A는 DSC 분자가 존재하는 상태에서 1.9 kb의 람다 DNA의 증폭을 보여준다. PCR 증폭은 A에서 포워드(forward) 프라이머 5'-CTGGCTGAC ATTTTCG-3'(서열번호: 17) 및 리버스(reverse) 프라이머 5'-TATCGACATTTCTGCACC-3'(서열번호: 18); B에서 포워드 프라이머 5'-GAAGTCAACAAAAAGGAGCTGGCTGACATTTTCG-3'(서열번호: 19) 및 리버스 프라이머 5'-CAGCAGATACGGGATATCGACATTTCTGCACC-3'(서열번호: 20)와 함께 수행한다. PCR 증폭은 1.523 pg의 람다 DNA, 1ng의 대장균 게놈 DNA와 함께 수행한다. 반응은 2번 반복 수행한다(도5A에서 1 및 2번째 행, 3 및 4번째 행; 도5B에서 1 및 3번째 행, 2 및 4번째 행).

도6은 녹는점이 다양한(1 내지 10번째 행) DSC 분자 및 억제성 폐쇄 분자가(15 내지 17번째 행) 있는 상태에서 인간 태반 DNA의 베타-엑틴(β-actin ) 유전자 653-bp 조각의 증폭을 나타낸다.

도7A 및 B는 올리고뉴클레오티트 혼합물 B를 사용하여 DNA B로부터 100-bp 산물의 증폭을 나타낸다. 1 내지 3번째 행은 다른 DSC 분자들이 존재하는 상태에서의 PCR 증폭을 보여준다. 4번째 행은 본 발명의 DSC 분자가 없는 조건에서의 증폭결과를 보여준다. 5번째 행의 증폭은 시중에서 구입이 가능한 화학적으로 개조된 핫 스타트 택 중합효소로 수행하였다. M 행은 DNA 표준 마커를 나타낸다. 모든 행은 100 카피(copy)의 DNA B를 포함하고 있다. 각각의 반응에서의 DSC 분자의 최종 농도는 0.4 uM이다. 도7A에서의 PCR 증폭은 실험실 대 위에서 미리 배양(pre-incubation)하지 않고 준비한 후 즉시 수행할 수 있다. 도7B에서의 PCR 증폭은 23℃의 실온에서 24시간 동안 배양한 후에 수행한다.

도8은 올리고뉴클레오티드 혼합물 B를 사용하여 DNA B로부터 100-bp 산물의 증폭을 보여준다. 1-4 번째 행은 다른 DSC 분자들이 존재하는 조건에서의 PCR 증폭을 보여준다. 5번째 행은 본 발명의 DSC 분자가 존재하지 않는 조건에서의 증폭 결과를 보여준다. 6번째 행에서의 증폭은 시중에서 구입 가능한 화학적으로 개조된 핫 스타트 택 중합효소로 수행하였다. M 행은 DNA 표준 마커를 나타낸다. 모든 행은 5 카피의 DNA B를 포함한다. 1 및 3번째 행에서의 DSC 분자의 최종 농도는 0.4 uM인 반면, 2 및 4번째 행에서의 DSC의 최종 농도는 4 uM이다. 상기 PCR 증폭은 실험실 대 위에서 배양하지 않고 준비한 후 즉시 수행할 수 있다.

도9는 올리고뉴클레오티드 혼합물 B를 사용한 DNA B로부터 100-bp 산물의 증폭을 보여준다. 1-5번째 행은 다른 DSC 분자들이 존재하는 조건에서의 PCR 증폭을 보여준다. 6번째 행은 본 발명의 DSC 분자가 존재하지 않는 조건에서의 증폭 결과를 보여준다. 7번째 행에서의 증폭은 시중에서 구입 가능한 화학적으로 개조된 핫 스타트 택 중합효소로 수행하였다. M 행은 DNA 표준 마커를 나타낸다. 모든 행은 5개 카피의 DNA를 포함한다. 1-5번째 행에서의 DSC 분자의 최종 농도는 4 uM이다. PCR 증폭은 23℃의 실온에서 24 시간동안 배양한 후에 수행하였다.

도10A-C는 올리고뉴클레오티드 혼합물 A, B, 및 C를 각각 DNA A, B, 및 C에 사용하면서 100 내지 120-bp 산물을 증폭한 것을 나타낸다. 1-5번째 행은 다른 DSC 분자들이 존재하는 조건에서의 PCR 증폭을 보여준다. 6번째 행은 본 발명의 DSC 분자가 존재하지 않는 조건에서의 증폭 결과를 보여준다. 7번째 행에서의 증폭은 시중에서 구입이 가능한 화학적으로 개조된 핫 스타트 택 중합효소로 수행하였다. M 행은 DNA 표준 마커를 나타낸다. 모든 PCR 증폭 반응은 5개 카피의 DNA B를 포함한다. 각각의 반응에서의 최종 DSC 분자의 농도는 4 uM이다. 상기 PCR 증폭은 실험대에서 배양단계 없이 준비한 후 즉시 수행할 수 있다.

도11A-C는 각각 올리고뉴클레오티드 혼합물 A, B, 및 C를 사용하면서 DNA A, B, 및 C로부터 100-bp 산물의 증폭을 나타낸다. 1-5번째 행은 다른 DSC가 존재하는 조건에서의 PCR 증폭을 보여준다. 6번째 행은 본 발명의 DSC 분자가 없는 조건에서의 증폭결과를 보여준다. 7번째 행에서의 증폭은 시중에서 구입이 가능한 화학적으로 개조된 핫 스타트 택 중합효소로 수행한다. M 행은 DNA 표준 마커를 나타낸다. 모든 행은 5개 카피의 DNA B를 포함하고 있다. 각각의 반응에서의 최종 DSC 분자 농도는 4 uM이다. 도7B에서의 PCR 증폭은 23℃의 실온에서 24시간 동안 배양한 후에 수행하였다.

도12는 CY5 형광 염료에 의한 탐지를 사용하면서 DNA C로부터 100-bp 산물의 형성에 대한 실시간(real-time) PCR 분석을 나타낸다. 1280-5개 카피의 DNA C를 포함하는 반응을 네 차례 수행하였다. 평균 Ct 값, + 표준 편차는 각각의 카피 값에 대하여 나타내었다. 0.6 이상의 표준편차는 볼드체이다. 평균선에 대한 R-제곱 값에 따른 전반적인 PCR 효율성 또한 표기하였다. 사선 표시로 결과들을 나타내었다.

도13은 HBB2 올리고 혼합물을 사용하면서 인간 태반 DNA로부터 100-bp의 산물 형성의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. 1280-5개 카피의 DNA C를 포함하는 반응을 네 차례 수행하였다. 평균 Ct 값, + 표준 편차는 각각의 카피 값에 대하여 나타내었다. 0.6 이상의 표준 편차는 볼드체이다. 평균선에 대한 R-제곱 값에 따른 전반적인 PCR 효율도 보여준다. 결과들은 사선 표시들로 보여준다.

도14A 및 B는 HEX 형광 염료에 의한 탐지를 사용하면서 DNA B로부터 100-bp 산물 형성의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. 1000, 100, 및 10개 카피의 DNA B를 포함하는 반응을 네 차례 수행하였다. 평균 Ct 값 + 표준 편차를 각각의 카피 값에 대하여 표기하였다. 도14A는 2.5 U의 택-B 및 0.4 uM의 DSCI 최종농도와 25 ㎕ 반응물에서 산물의 증폭을 나타낸다. 도14B는 2.5 U 택-B 및 최종농도 0.2 uM의 DSCI와 50 ㎕ 반응물 내에서 산물의 증폭 곡선을 보여준다.

도15A-C는 HEK 형광 염료에 의한 탐지를 사용하면서 DNA B로부터 100-bp의 산물 형성의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. 1,000, 100, 및 10 카피의 DNA를 포함하는 반응을 네 차례 수행한다. 반응물에서 DSC5 분자의 최종 농도는 1X-20X로 표기되었으며, 1X는 0.2 uM이고 20X는 4 uM이다. 상기 반응에서 1X에서 DSCI, 0.2 uM의 최종농도를 보여준다. DSC 분자를 가지고 있지 않는 택-B 및 패스트 스타드(Fast Start)도 보여준다. 도15A는 각각의 분류 내의 각각의 카피 값에 대한 평균 Ct 값을 나타낸다.

도15B는 택-B와 함께 각각의 택-B DSC의 조합 및 단지 FastStart에 대한 증폭 곡선을 나타낸다. 도15C는 각각의 분류 내에서 각각의 카피 값에 대한 최종 크기를 보여준다. 결과들은 사선으로 표기하였다.

[발명의 상세한 설명]

하기에서 바람직한 구체예를 설명한다.

본 발명은 증폭반응에서 사용되는 핵산 복합체, 핵산 복합체의 사용 방법, 중합효소 및 핵산 복합체를 포함하고 있는 버퍼, 뿐만 아니라 핵산 복합체 및 중합효소를 포함하고 있는 키트에 관한 것이다. 본 명세서에서 설명하는 것처럼, 본 발명은 증폭 반응을 개선하는 핵산 복합체를 포함한다. 상기 핵산 복합체는 폐쇄 분자를 포함하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 핵산 복합체는 이중 가닥 복합체(DSC)로도 알려져 있다.

특히, 본 발명은 각각 가닥의 말단 위에 폐쇄 분자가 공유결합으로 부착된 짧은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드로 이루어진 핵산 복합체를 사용한다. 다른 구체예에서, 상기 폐쇄 분자는 핵산 복합체의 모든 부분(예, 중간 부분)으로 배치되거나 부착될 수 있다. 핵산 복합체는 중합효소에 결합하고 증폭 반응의 수행을 강화한다. 증폭 반응의 결과를 개선하고자 상기 핵산 리간드를 주의 깊게 고안하였으며, 그 자체가 상기 반응 내의 다른 비-특이적인 서열 또는 타겟 서열의 증폭에 대한 프라이머로 작동할 수는 없다.

실시예 부분에서 설명되는 모든 상세한 실험은 하기의 다양한 조합들을 사용하면서 수행하였다: DSC 및 이들의 유도체, 다수의 DNA 중합효소, 다수의 폐쇄 분자, 및 핵산 복합체의 다양한 농도. 본 발명의 방법 및 조성물은 핵산 증폭 반응 결과를 개선하고자 다른 핵산 복합체 및 다른 중합효소와 함께 적용할 수 있다.

본 발명에 따라서, 상기 핵산 복합체는 약 90℃까지의 녹는점을 가질 수 있다. 핵산 복합체에 대한 녹는점의 범위는 약 25℃보다 더 클 수 있으며, 예를 들어, 약 45℃ 내지 약 75℃, 또는 약 45℃ 내지 약 55℃일 수 있다(예를 들어, 약 25℃ 내지 약 90℃ 범위). 가장 바람직한 구체예에서, 핵산 복합체는 약 48.9℃의 녹는점을 가진다. 이러한 녹는점의 범위는 당업자들에게 알려져 있으며, 본 발명에서 설명되는 것처럼 다양한 증폭 반응에 유용하다.

핵산 복합체에 대한 녹는점(Tm)은 참조로 사용된 Owczarzy,R. 등, Biochemistry, 2004년 3월 30;43(12):3537-54 및 Owczarzy, R. 등, Biochemistry, 2008년 5월 13;47(19):5336-53에서 설명되는 계산을 사용할 수 있으며, Integrated DNA Technologies, 1710 Commercial Park, Coralville, IA 52241 USA에서 제공된 최근린 열역학 변수(nearest-neighbor thermodynamic parameter)를 사용하여 계산할 수 있다.

상기 핵산 복합체는 다양한 적용에 대한 다양한 농도 범위를 가질 수 있다. 핵산 복합체에 대한 농도 범위는 5,000 U/mL에 대하여 2 uM DSC 보다 더 클 수 있으며, 모든 5,000 U/ml의 중합효소에 대하여 2 mM DSC까지이다. 좀 더 바람직하게, 상기 범위는 5,000 U/ml 의 중합효소에 대하여 약 20 uM DSC부터이고, 모든 5,000 U/ml의 중합효소에 대하여 200 uM까지이다. 한 구체예에서, 중합효소에 대한 가장 바람직한 농도는 200 uM의 DSC에 대하여 약 5,000 U/ml이다.

택 DNA 중합효소의 특이적인 활성은 2-배의 순차적인 희석 방법을 사용하여서 측정할 수 있다. 효소의 희석은 택-B DNA 중합효소 저장 용액([Taq-B]f = 0.009-0.0001 ㎍/㎕)을 포함하고 있는 감소된-글리세롤(5%)에서 실시하였으며 12.5 ㎍의 소 흉선 DNA, 25 mM TAPS (pH 9.3), 50 mM KC1, 1 mM DTT, 4mCi/mL 3H-dTTP 및 200 μΜ dNTPs를 포함하고 있는 50 ㎕의 반응물에 희석물을 첨가하였다. 반응물은 75℃에서 10분간 배양하였으며, 얼음에 재빨리 넣고, Sambrook 및 Russell 방법(Molecular Cloning, v3, 2001, pp.A8.25-A8.26)을 사용하면서 분석하였다.

본 발명은 신규한 분리된 핵산 복합체를 제공하며, 예를 들어서 폐쇄 분자와 함께 이중 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드로부터 유래된 표 1의 신규한 분리된 핵산 복합체를 제공한다. 상기 핵산 복합체는 배경(background) DNA의 잘못된 프라이밍 및/또는 프라이머 올리고화와 같은 잘못된 반응으로 인한 비-특이적인 증폭 산물의 생산 또는 타겟이 아닌 올리고뉴클레오티드의 증폭을 억제할 수 있음을 보여준다. 핵산 복합체를 포함하고 있는 증폭 반응은 타겟 올리고뉴클레오티드의 생성을 증가하는 것으로 나타났다. 게다가, 표 1의 핵산 복합체는 서로 간에 30%의 서열 동일성을 가진다.

서열 번호	이름	서열(5'-3')	Tm (℃)
1	DSC1	GCC AAT CCT ACG CC/InvT/	51.5
2	DSC1-1	GCC AAT CCT ACG CC/Phosph/	49.6
3	DSC1-2	GCC AAT CCT ACG CC/hexanediol/	49.6
4	DSC2	GCC GGC CAA TGT/InvT/	49.6
5	DSC3	CCT GAC AAT GCC GCG/InvT/	56.2
6	DSC3-1	CCT GAC AAT GCC GCG/hexane diol/	54.3
7	DSC5	AGC GGA TAA CAA TAT CAC A/InvT/	48.9
8	DSC6	GCC AAT CAT/InvT/	26.0
9	DSC7	GCC AAT CCT A/InvT/	30.7
10	DSC8	GCC AAT CCT AC/InvT/	36.8
11	DSC9	GCC AAT CCT ACG/InvT/	43.0
12	DSC10	GCC AAT CCT ACG C/InvT/	47.8
13	DSC11	GCC AAT CCT ACG CCT CC/InvT/	57.1
14	DSC12	GCC AAT CCT ACG CCT CCG T/InvT/	60.0
15	DSC13	GCC AAT CCT ACG CCT CCG TGA CGA TCC/InvT/	66.6
16	DSC14	GCC AAT CCT ACG CCT CCG TGA CGA TCC GCTC/InvT/	70.8

한 구체예에 있어서, 본 발명에서 포함되는 바람직한 핵산 복합체의 서열은 표 1에서 나타냈다. 표 1에서 사용되는 약자는 다음과 같다: “InvT" = 역상된 데옥시티미딘(inverted deoxythymidine(dt)); "인산(Phospho)”= 인산기. 핵산 복합체는 BLAST((Altschul, S.F., et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990)를 사용하면서 유사성 찾기(similarity search)에서 확인된 것처럼 1 이하의 E-값(value)을 가지고 있는 많은 서열에 대한 유사성을 보여준다. 본 발명에서 사용되는 단어 “핵산 복합체” 및 “이중 가닥 복합체(DSC)"의 뜻은 동일하고 상호 교환하여 사용한다. 본 발명은 최적의 녹는점에 대한 서열과 한편으론 이중 가닥 핵산의 양쪽의 말단에 높은 비율의 GC 뉴클레오티드를 가지고 있는 약 16개의 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥 올리고뉴클레오티의 양쪽 말단에 부착된 폐쇄 분자와 함께 제조되는 것을 특징으로 하는 핵산 복합체를 포함한다. 본 발명은 하기의 하나 이상의 방법으로 개조된 핵산 복합체를 포함한다: 증폭반응에서 이들의 연장을 막기 위한 방법, 비-특이적인 증폭 산물의 생성을 억제하기 위하여 녹는점을 갖도록 하기 위한 방법, 및 양쪽 말단에 AT 결합보다 더 높은 녹는점을 가지고 그로 인해 이중 가닥과 같은 핵산 복합체를 더 잘 유지할 수 있는 GC의 높은 비율을 갖도록 하기 위한 방법. 더욱이, 본 발명은 폐쇄 분자와 함께 이중 가닥 핵산, 및 중합효소를 포함하고 있는 저장 버퍼 및 핵산 복합체를 포함하는 반응 버퍼에 관한 것이다.

상기 이중 가닥 핵산 복합체의 향상된 안정성은 다른 핫 스타트 방법이 금지되는 조건에서의 사용을 가능케 하며, 이는 이중 가닥 핵산 복합체가 상승된 온도에서 비가역적으로 디네이쳐(denature)되고 이로 인하여 핵산 복합체가 비-특이적인 증폭 산물을 감소시키는데 사용될 수 있는 가능성을 높인다. 예를 들어, 비-특이적인 산물을 증폭하는 가능성을 가지는 다양한 특이적인 프라이머와 다양한 PCR에서의 증폭은 반응 산물에 부정적인 영향을 주는 반면, 화학적으로 개조된 항체 형태의 핫 스타트 방법은 초기 디네이쳐 가열 단계 후에 대부분 비-활성화되고, 본 발명의 핵산 복합체는 상기 반응 혼합물이 비-특이적인 프라이밍에 대하여 가장 취약한 때인 증폭의 첫 몇 사이클 동안 계속하여 상호작용할 것이다. 게다가, 상기 핵산 복합체는 등온선(isothermal)의 증폭 반응, 가변수 일렬 반복(Variable Number Tandem Repeats, VNTR) PCR, 비대칭의 PCR, 긴 사슬 PCR, 네스티드(nested) PCR, 정량( quantative) PCR, 터치다운(touchdown) PCR, 어셈블리(assembly) PCR, 콜로니(colony) PCR, 역전사(reverse transcription) PCR, 리게이션-조절된(ligation-mediated) PCR 및 메틸화-특이적인 PCR에 사용될 수 있으며, 이로 한정되지는 않는다.

핫-스타트 PCR 반응에서 이중 가닥 핵산 복합체의 사용은 원하는 타겟 서열의 증폭 수율을 현저하게 개선하고, 반면에 원하지 않는 서열의 타겟이 아닌 증폭 또한 현저하게 줄인다. 이러한 반응은 본 발명에서 기재된 것처럼(실시예 5 및 도면 14 내지 15) DSC 기술을 도입하지 않는 전형적인 핫-스타트 PCR 반응과 비교할 때 실온에서 중합효소의 활성을 줄임으로써 이루어질 수 있다. 하나의 구체예에서, 핫-스타트 PCR 반응에서의 DSC의 사용은 최소한 2배(2X)로 반응 수율의 증가를 가져온다. 다른 구체예에서, DSC의 사용은 최소한 5배(5X)의 수율 증가를 가져오는 반면, 다른 구체예에서, DSC의 사용은 7배(7X) 또는 10배(10X) 또는 더 높은 수율을 가져온다. 한 구체예에서, 본 발명의 방법 또는 조성물로 수행되지 않은 증폭된 타겟 핵산 분자의 양과 비교할 때, 증가된 수율은 약 2X 증가 내지 약 20X 증가의 범위 내에(예, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 15X 또는 20X) 이다. 유사하게, 한 구체예에서, 핫-스타트 PCR 반응에서 DSC의 사용은 실온(예, 약 20℃ 내지 25℃)에 있는 중합효소의 활성에서 최소한 50 퍼센트(50%) 감소를 준다. 다른 구체예에서, DSC의 사용으로 실온에서의 중합효소 활성은 약 70퍼센트(70%) 감소하는 반면, 다른 구체예에서는, DSC의 사용으로 인해 실온에서의 중합효소 활성은 80 퍼센트(80%) 이상 감소한다. 한 측면에서, 본 발명의 DSC로 처치되지 않은 타겟 핵산 분자에서의 중합효소 활성과 비교할 때, 본 발명은 약 20℃ 및 25℃ 사이 온도에서 중합효소 활성의 감소를 제공하며, 감소 범위는 약 50% 내지 약 90% 사이이다(예, 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소).

중합효소의 활성을 평가하는 방법은 당분야에서 잘 알려진 방법이며 이러한 방법은 표지된-뉴클레오티드 병합 분석(labeled-nucleotide incorporation assays)을 포함하다. 요약하면, 탐지되는 표지(label)는 핵산 분자 내로 병합될 수 있으며 분석은 중합효소의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다(예, 자동화된 형광-기반의 서열 분석 장치(fluorescence-based sequencing apparatus) 예, Applied Biosystems (Life Technologies Corporation, Carlsbad, California)).

Examples of detectable labels include fluorescent dyes, streptavidin conjugate, magnetic beads, dendrimers, radiolabels, enzymes, colorimetric labels, digoxigenin, biotin, nanoparticles, and/or nanocrystals). Methods for incorporating labels are known in the art.

탐지 가능한 표지의 예는 형광 염료, 스트렙타비딘 컨쥬게이트(streptavidin conjugate), 자성의 구슬(magnetic beads), 덴드리머(dendrimers), 방사선 동위원소 표지(radiolabels), 효소(enzymes), 화학 비색계의 표지(colorimetric labels), 디곡시제닌(digoxigenin), 바이오틴(biotin), 나노입자(nanoparticles), 및/또는 나노크리스탈(nanocrystals)를 포함한다. 중합효소 분석을 측정하는 몇 가지의 분석 방법이 있다. 한 예로, 상기에서 언급된 것처럼, 표지된 뉴클레오티드 병합 분석이 있다. DNA 중합효소 분석은 새롭게 합성된 DNA 내로 개조된 뉴클레오티드를 병합하기 위하여 DNA에 의존적인 DNA 중합효소의 활성을 이용한다. 일부 분석은 방사능을 사용하며, 반면에, 방사능을 사용하지 않는 표지들을 사용하는 분석도 사용한다(예, 제품 번호 No. 1 669 8085, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, Indiana). 최적화된 비율로 표지된 뉴클레오티드는 DNA 중합효소의 활성에 의해서 동일한 DNA 분자로 병합한다. DNA 중합효소 활성의 측정값으로서 합성된 DNA의 탐지 및 양은 모든 탐지 방법을 사용하여서 분석할 수 있다.

유사하게, PCR 반응 수율을 분석하는 방법은 당 분야에서 잘 알려져 있으며, 정량적-PCR 방법을 포함한다. 예를 들어, 수율은 표지될 수 있으며, PCR의 각 사이클 후에, 실시간 PCR 기기는 표지(예, 형광) 정도를 측정할 수 있다. 수율양은 알려진 양(Nolan, Tania 등, Nature Protocols 1: 1559 - 1582, 2006)을 순차적으로 희석한 것에(예, 1:4, 1: 16, 1:64로 희석된) 대한 실시간 PCR에 의해서 생산된 표준 곡선에 대하여 결과들을 비교함으로써 평가될 수 있다.

단어“프라이머”는 핵산 가닥에 대하여 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건에서 DNA 합성 시작 시점에 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명의 핵산 복합체는 이중 가닥 RNA 또는 DNA를 포함하는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 핵산 복합체의 올리고뉴클레오티드는 개조된 뉴클레오티드 또는 합성 핵산 분자로 이루어질 수 있다. 개조는 핵산 또는 전체로서 핵산 복합체에 대한 부가적인 전하, 분극률(polarizability), 수소 결합, 정전기 상호작용(electrostatic interaction), 및 프루시오나리티(fluxionality)를 병합하는 다른 화학적인 기를 제공하는 것을 포함하며, 이로 한정되지는 않는다. 개조는 메틸화, 3‘ 개조 및 5’개조를 포함하며 뼈대 구조의 개조로 한정되지는 않는다. 한 측면에서, 상기 폐쇄 분자는 개조된 염기, 개조된 당 및/또는 개조된 인산기를 가진 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다.

다른 구체예에서, 상기 복합체의 핵산은 예를 들어, 아바식(abasic) 부분, 역상된 아바식 부분, 역상된 뉴클레오티드 아바식, 3’연결에 대한 역상된 디옥시뉴클레오티드 3’, 이당류 뉴클레오티드, 잠금 핵산(locked nucleic acid), 2’-아미노 피리미딘(Amino pyrimidine), 2‘-플루오로 피리미딘(Fluoro pyrimidine), 2’-O-메틸 뉴클레오티드, 보라노포스포 인터뉴클레오티드(Boranophosphate internucleotide) 연결, 5’-개조된 피리미딘, 4’-티오 피리미딘(Thio pyrimidine), 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결(Phosphorothioate internucleotide linkage)이며, 이로 한정되지는 않는다.

다른 구체예에서, 핵산 복합체의 뉴클레오티드는 합성 뉴클레오티드이다. 합성 뉴클레오티드는 유전자 조작을 포함하는 분자 생물학과 같은 다양한 분야에서 광범위하게 사용되며, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드로, 진단용으로, 리보자임으로 알려진 촉매를 만드는데 사용된다. 예를 들어, PCR 기술은 유전자 물질의 증폭용 프라이머로서 항상 올리고뉴클레오티드를 사용하고 합성 유전자는 효율적인 발현을 위하여 코돈 사용의 최적화를 포함하는 다양한 목적을 위해 제작된다. 유용한 합성 올리고뉴클레오티드는 천연의 리보뉴클레오티드(ribonucleotide) 및 디옥시뉴클레오티드를 포함하는 고분자 뿐만 아니라 개조된 염기, 개조된 당 및 인산기가 개조된 뉴클레오티드와 같은 개조된 뉴클레오티드를 포함하는 고분자를 포함한다.

바람직하게는 상기 핵산 복합체는 약 9 내지 40개 길이의 뉴클레오티드이고, 더 바람직하게는 약 14 내지 20개 길이의 뉴클레오티드인 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 16 내지 19개의 뉴클레오티드 길이이다.

고세균 종으로부터 분리된 DNA 중합효소(예, PFU DNA 중합효소)는 이들이 읽는 뉴클레오티드 서열 중에서 우라실(U) 염기를 만날 때 종종(활성을) 멈추게 된다(참조, 예, Hogrefe 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 596-602, 2002; Fogg 등, Nat. Struct. Biol. 9(12): 922-927, 2002). 본 발명에 따라서, 이중 가닥 핵산 복합체 내로 하나 이상의 우라실(U) 염기의 도입은 고세균 종으로부터 DNA 중합효소가 도입될 때 실온에서의 원하지 않는 중합효소의 활성이 감소한다. 따라서, 본 발명의 한 구체예에서, 본 명세서에서 기재된 것처럼 이중 가닥 핵산 복합체를 제공하고 적어도 하나의 우라실(U) 염기를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 본 명세서에서 기재된 방법은 이러한 우라실 염기를 포함하고 있는 DSC를 도입하고 고세균 종 유래의 적어도 하나의 열 안정성 DNA 중합효소를 도입한다. 한 구체예에서, 핫-스타트 PCR 반응에서 우라실을 포함하고 있는 DSC의 이러한 사용으로 실온에서의 중합효소 활성은 최소한 50 퍼센트(50%)가 감소한다. 다른 구체예에서, 이러한 사용으로 실온에서의 중합효소 활성은 적어도 70 퍼센트(70%) 감소하게 되는 반면, 다른 구체예에서, 이러한 사용으로 실온에서의 중합효소 활성은 80 퍼센트(80%) 이상 감소한다. 한 측면에서, 타겟 핵산 분자가 본 발명의 DSC로 처치되지 않았을 때의 중합효소 반응과 비교하면, 본 발명의 우라실을 포함하고 있는 DSC의 사용으로 약 20℃ 내지 25℃ 사이 온도에서 중합효소 활성은 감소하며, 감소 범위는 약 50% 내지 약 90%사이(예, 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소)이다.

중합효소의 활성을 평가하는 방법은 당 분야에서 잘 알려져 있는 방법이며, 표지-뉴클레오티드 병합 분석 방법을 포함한다. 본 발명의 DSC는 적어도 두 개의 억제 방법을 가지는 것으로 판단된다. 첫 번째, DSC는 효과적으로 역상된 dT 없이 DSC 위의 DNA 중합효소에 대한 억제자로 작동한다. DNA 중합효소가 있는 용액 내에서, DNA 중합효소는 자연적으로 본 발명의 DSC에 결합하며, 일부 이중 가닥 DNA 서열이 다른 것들보다 좀 더 효율적인 억제를 제공하는 것으로 보인다(참조, Kainz 등, BioTechniques 28:278-282, 2000년 2월). 두 번째, 상기 PCR 반응이 첫 사이클을 시작할 때, 반응 온도가 DSC의 녹는점보다 높기 때문에 DSC는 각각의 가닥이 분리할 때 DNA 중합효소로부터 제거된다. 식히는 중에, 각각의 DSC 가닥은 일반적으로 이들의 상보적인 가닥과 다시 하이브리다이즈할 것이며, 이는 DNA 중합효소의 중합 활성을 억제한다. 그러나, 만약 DSC가 우연히 타겟 주형 DNA에 하이브리다이즈 한다면, 역상된 dT는 DNA 중합효소가 부가적인 뉴클레오티드를 첨가하는데 필요한 3’수산기가 부족하기 때문에 DNA 중합효소가 경쟁하는 이차 산물을 연장하고 형성하는 것을 효율적으로 억제할 것이다. 게다가, 역상된 dT는 엑소뉴클레아제(exonuclease)로부터 보호된다. 역상된 dT의 특이적인 구조로 인하여, 엑소뉴클레아제는 역상된 dT를 제거할 수 없는 반면에, 역상된 dT의 분해는 DSC가 비-특이적으로 어닐(anneal)하고 DNA 연장을 위한 프라이머로 작동하도록 할 것이다.

한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는“분리되고(isolated)"; 본 명세서에서 사용된 것처럼,“분리된”핵산 분자 또는 뉴틀레오티드 서열은 일반적으로(자연적으로) 유전자 또는 뉴클레오티드 서열의 측면에 위치하는 핵산 서열이 측면에 위치하지 않고 다른 전사되는 서열로부터 완벽하게 또는 부분적으로 선별된 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열을 의미하도록 의도하였다. 예를 들어, 본원 발명의 분리된 핵산은 자연적으로 발생하는 복잡한 세포 환경에서 실질적으로 분리될 수 있다. 일부 경우에, 분리된 물질은 조성물, 버퍼 시스템 또는 시약 혼합물의 일부분을 형성할 수 있다. 따라서, 핵산 복합체의 분리된 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열은 화학적으로 또는 재조합 방법에 의해서 실질적으로 합성되는 핵산 분자 또는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 선별된 핵산 서열은 용액 내에 있는 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 핵산 분자를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 서열 번호: 1-16 중에서 어느 하나의 핵산 서열을 가지는 분리된 핵산 분자를 포함하며, 공유결합으로 부착된 폐쇄 분자; 서열번호: 1-16 중에서 어느 하나의 약 80% 내지 100% 사이의 인접한 뉴클레오티드를 가지는 핵산 서열; 서열번호 1-16 중 어느 하나의 약 7 내지 20 사이의 인접한 뉴클레오티드를 가지는 핵산 서열; 이들에 상보적인 서열; 및 이들의 모든 조합을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 사용된 것처럼, 단어 “DNA 분자”또는 “핵산 분자”는 센스 및 안티센스 가닥 모두, cDNA, 상보적인 DNA, 재조합 DNA, RNA, 전체적으로 또는 부분적으로 합성된 핵산 분자, PNA 및 다른 합성 DNA 상동물을 포함한다. 뉴클레오티드 “변형물(variant)” 또는 “파생물(derivative)”은 PCR 동안에 분자가 비-특이적인 증폭을 막도록 하나 이상의 뉴클레오티드 삭제, 치환 또는 첨가를 가지는, 사용된 핵산 서열과는 다른 서열이다. 또한 상기 DNA 서열에 대하여 실질적으로 상보적인 핵산 서열, DNA 또는 RNA, PNA 또는 다른 DNA 유사물이 본 발명에 포함된다.

본 명세서에서 정의된 것처럼, 실질적으로 상보적인 서열, 유사물 또는 파생물은 상기 핵산이 본 발명 서열을 정확하게 반영할 필요가 없음을 의미하지만, 매우 엄격한 조건에서 본 발명의 핵산 서열과의 하이브리다이즈를 가능케 하는 서열과 충분히 유사해야 한다. 예를 들어, 비-상보적인 염기는 핵산서열에 산재하거나, 또는 상기 서열은 PCR 동안의 비-특이적인 증폭을 줄이기 위하여 충분한 개수의 염기를 가지도록 제공된 본 발명의 핵산 서열보다 더 길거나 짧을 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본 명세서에서 설명된 모든 핵산 분자의 길이에서(예, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20) 최소한 약 7 내지 20개의 인접한 뉴클레오티드, 및 바람직하게는 서열번호: 1-16를 가지고 있는 분자를 포함한다. 별개로, 본 발명의 분자는 본 명세서에서 설명되는 서열 중 어느 하나의 길이의 약 60% 및 약 100%의 인접한 뉴클레오티드를 가지는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명은 본 명세서에서 설명된 핵산 복합체의 서열과 실질적으로 동일한 핵산 복합체; 특히 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 최소한 약 10%, 바람직하게는 최소한 약 20%, 더 바람직하게는 최소한 약 30%, 더 바람직하게는 최소한 약 40%, 더 바람직하게는 최소한 약 50%, 더 바람직하게는 최소한 약 70%, 더 바람직하게는 최소한 약 80%, 더 바람직하게는 최소한 약 90%, 더 바람직하게는 최소한 약 95% 동일성을 가지는 뉴클레오티드 서열이 바람직하다. 이러한 예에서, 본 발명에서 설명된 것처럼 핵산 복합체의 활성을 가지는 핵산 복합체가 특히 바람직하다.

두 핵산 복합체의 동일성 퍼센트를 결정하기 위하여, 서열들을 최적의 비교로 어라인(aligne) 하였다(예, 갭은 제1 뉴클레오티드 서열로 도입될 수 있다.). 그런 후, 상응하는 뉴클레오티드 위치에서 상기 뉴클레오티드를 비교하였다. 제1 서열 내의 위치가 상응하는 제2 서열 내의 위치에서 동일한 뉴클레오티드로 위치하면, 상기 분자는 상기 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 서열에 의해 나눠지는 동일한 위치들의 수의 함수이다(즉, % 동일성=(동일한 위치/위치 X100의 총수)의 수).

본 발명에서 설명되는 핵산 복합체는(예, 표 1에서 나타내는 핵산 복합체) 증폭 반응, 예, PCR,에서의 비-특이적인 증폭을 줄이는데 유용하다(참조, 일반적인 PCR 기술: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR 프로토콜: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1, 17 (1991); PCR (eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford); and U.S. Pat. No. 4,683,202).

단어 “증폭하는(amplifying)”은 특이적이거나 또는 타겟 폴리뉴클레오티드의 카피 수를 증가하는 것을 의미한다. 예를 들어, PCR은 중합효소 및 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하면서 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하는 방법으로, 두 개의 올리고뉴클레오티드 프리이머는 증폭된 서열의 한쪽 말단에 있는 두 개의 폴리뉴클레오티드 가닥 중에서 하나에 대한 하나의 상보적인 서열 및 다른 말단에 있는 두 개의 폴리뉴클레오티드 가닥 중 다른 하나에 대하여 다른 상보적인 서열이다. 새롭게 합성된 DNA 가닥은 실질적으로 동일한 프라이머 서열에 대한 부가적인 주형으로 작동하기 때문에, 프라이머 어닐링(annealing), 가닥 연장, 및 분해(dissociation)의 성공적인 과정은 원하는 서열을 매우 빠르고 특이적으로 증폭한다. 상기 시료의 DNA는 한 구체예에서, PCR에 의해서 증폭되거나 복제될 수 있다. PCR 방법은 당 분야에서 잘 알려져 있으며 예로서 다음 문헌에서 설명된다: Mullis, K.B. Scientific American 256:56-65, 1990.

요약하면, PCR은 DNA 중합효소를 사용하여 이루어지며, 예를 들어 유전적으로 조작된 박테리아 유래의 중합효소를 포함한다. 바람직한 중합효소는 써머스 테르무스(Thermus aquaticus, Taq)와 같은 열 안정성 생물 유래의 중합효소이다. 부가적인 중합효소를 본 발명에서 설명하고 열 안정성 고세균 중합효소를 포함한다. 프라이머와 함께 상기 중합효소, 본 발명의 DSC 복합체, 및 뉴클레오티드 염기가(아데닌, 구아닌, 시토신 및 티미) 제공된다. 일부 조건에서(예, 30초 동안 95℃), DNA는 가닥이 분리되도록 디네이쳐(denature)된다. DNA 용액이 차갑게 되면, 프라이머들은 DNA 가닥에 결합하고 그런 후, 용액은 택 중합효소가 효과를 낼 수 있도록 가열된다(Mullis, K.B. Scientific American 256:56-65, 1990).

다른 적절한 증폭 방법은 리가제(ligase) 사슬 반응(ligase chain reaction, LCR)(참조, Wu 및 Wallace, Genomics, 4:560 (1989), Landegren, 등, Science, 241: 1077, 1988), 전사 증폭 (Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173, 1989), 스스로 지속되는(self- sustained) 서열 복제(Guatelli, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874, 1990) 및 핵산을 기반으로 한 서열 증폭(nucleic acid based sequence amplification, NASBA)을 포함한다. 두 후자의 증폭 방법은 등온선 전사(isothermal transcription)를 기반으로 한 등온성 반응과 관련되며, 각각 약 30대 1 또는 100대 1의 비율로 증폭산물로서 단일 가닥 RNA(ssRNA) 및 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 생산한다.

증폭된 DNA는 상동 뉴클레오티드 서열을 확인하기 위하여 방사선 표지되고 라이브러리 스크린용 프로브 또는 다른 적절한 벡터로 사용된다. 상응하는 클론은 분리될 수 있으며, DNA는 체내 적출에 의해서 확보할 수 있고, 클론된 인서트(insert)는 적절한 분자량의 단백질을 인코딩하는 정확한 리딩 프레임(reading frame)을 확인하고자 당 분야에서 알려진 방법 또는 방법들로 시컨싱(sequencing)할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 상동 핵산 추가 분자의 뉴클레오티드 서열의 직접적인 분석은 디데옥시 사슬 종결 방법(dideoxy chain termination method) 또는 마삼 길버트 방법(MaxaM Gilbert method)을 사용하면서 수행할 수 있다(참조, Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd 에디션, CSHP, New York 1989); Zyskind 등, Recombinant DNA Laboratory Manual, Acad. Press, 1988). 상기의 방법 또는 유사한 방법들을 사용하면서, 단백질(들) 및 단백질을 인코딩하는 DNA를 분리하고, 시컨싱하고, 더 분석할 수 있다.

본 발명의 핵산 복합체는 상응하는 cDNA의 합성을 포함하면서 mRNA의 증폭용 방법과 같은 RNA 증폭에 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 DNA 중합효소는 택 DNA 중합효소, BST DNA 중합효소, PFU DNA 중합효소, 크레나우 DNA 중합효소, T7 DNA 중합효소, T4 DNA 중합효소, Phi29 DNA 중합효소, RB69 DNA 중합효소로부터 선택할 수 있다. 고세균 종 유래의 열 안정성 DNA 중합효소는 시중에서 구입이 가능하고(예, New England Biolabs, Inc.; Stratagene, Inc) 9°N DNA 중합효소 및 벤트(Vent) DNA 중합효소를 포함한다.

한 구체예에서, 핵산 복합체는 열 안정성 DNA 중합효소에 결합한다. 다른 구체예에서, 핵산 복합체는 단지 잠깐 DNA 중합효소와 결합하고, DNA 중합효소는 빠르게 결합을 해제하고 동일한 핵산 복합체 또는 다른 핵산 복합체에 재결합한다.

다른 구체예에서, 핵산 복합체는 핵산의 녹는점보다 낮은 온도에서 증폭 반응물 내에 있는 비-특이적인 증폭 산물의 양을 감소시킨다. 다른 구체예에서, 핵산 복합체는 증폭 반응에서 열 안정성 DNA 중합효소의 활성을 억제하는 DNA 구조물로, 상기 DNA 구조물은 약 51.5℃의 녹는점을 가지거나 또는 DNA 구조물은 비-특이적인 증폭 산물의 양을 감소시키는 것을 특징으로 한다.

핵산 복합체의 핵산은 폐쇄분자를 더 포함한다. 바람직한 구체예에서, 폐쇄분자는 중합효소에 의한 핵산 복합체의 연장을 저지한다. 다른 구체예에서, 폐쇄분자는 DNA 중합효소와 같은 특정한 중합효소에 의한 연장을 저지한다. 폐쇄분자는 핵산의 5’또는 3’에 부착할 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 폐쇄분자는 5’및/또는 3’엑소뉴클레아제 절단에 대한 저항성을 가진다. 가장 바람직한 구체예에서, 폐쇄분자는 3’말단에 공유결합으로 부착된 역상된 데옥시디미딘이며, 열 안정성 DNA 중합효소에 의한 연장을 저지하고 3’엑소뉴클레아제 활성에 대한 저항성을 준다.

한 구체예에서, 상기 방법 및 시약은 3’수산화기 말단에 폐쇄된 이중 가닥 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 바람직한 구체예에서, 택 DNA 중합효소는 폐쇄 분자로 캡된(capped) 이중 가닥 올리고뉴클레오티드와 결합한다. 폐쇄분자는 올리고뉴클레오티드에 공유결합으로 부착된다. 폐쇄 분자는 상승된 온도에서 증폭 반응에서 배양하는 것으로 제거될 수 없다. 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 및 폐쇄 분자의 조합은 본 발명에서 이중 가닥 복합체(Double Stranded Complex, DSC)로 언급된다. 한 구체예에서, 폐쇄분자로 인하여, DSC는 오염하고 있는 모든 3’엑소뉴클레아제에 의해 분해되지 않을 것이며, 핵산은 중합효소에 의해 연장되지 않을 것이다. DSC의 단일 가닥이 우연히 반응 프라이머 또는 주형에 하이브리다이즈하면, 폐쇄분자는 DSC가 의도되지 않은 프라이머로서 작동하고 경쟁하고 오염하는 산물을 형성하는 것을 방지한다. 따라서, 본 발명은 핵산 증폭 반응성을 개선하고자 제공된다. 본 발명은 DNA 증합효소에 결합하고 비-특이적인 증폭 산물의 생산을 저지하는 이중 가닥 올리고뉴클레오티드로 구성된 핵산 복합체에 관한 것으로, 이로 한정되지는 않는다. 이중 가닥 핵산 복합체의 각각의 가닥은 폐쇄분자를 포함하고, 이는 엑소뉴클레아제 분해로부터 핵산 복합체를 보호하고 또한 핵산 복합체 자체가 비-특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이밍의 원인이 되는 것을 막는다.

폐쇄분자는 중합효소에 의한 핵산 복합체의 연장을 저지하는 모든 분자를 포함하는 것으로 정의한다. 폐쇄분자는 엑소뉴클레아제 분해에 대하여 저항할 수 있다. 다른 바람직한 구체예에서, 폐쇄분자는 중합효소에 의한 연장을 막을 뿐만 아니라 엑소뉴클레아제에 의한 절단을 막는다. 폐쇄 분자는 핵산 복합체의 3’또는 5’말단에 위치할 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 폐쇄 분자는 역상된 dT이다. 역상된 dT는 디옥시티미딘의 합성된 뉴클레오티드이며, 리보스 구조물 및 티미딘 염기 사이의 이들의 결합은 표준 디옥시티미딘 위치에 역상되어져 있다:

역상된 dT

폐쇄분자의 예로는 핵산 복합체의 연장을 막고 엑소뉴클레아제에 의한 절단에 저항성이 있는 디옥시티미딘, 디디옥시뉴클레오티드, 3’인산화, 헥사디올, 스페이서 분자, 1’2’-디디옥시리보스, 2’-O-메틸 RNA, 잠금 핵산(LNAs), 및 합성 또는 천연의 분자를 포함하며, 이로 한정되지는 않는다.

또한, 본 발명은 저장 버퍼와 같은 용액 내에서 본 발명의 분리된 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 구조물에 관한 것이다. 저장 버퍼는 예를 들어, TRIS 버퍼, MOPS, 또는 HEPES 버퍼를 포함한다. 게다가, 본 발명은 본 발명의 핵산 복합체 및 DNA 중합효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 저장버퍼에 관한 것이다.

따라서, 한 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는,

a) 디옥시리보핵산으로 구성된 핵산;

b) 상기 핵산의 중간에 폐쇄분자를 가지는 핵산;

c) 핵산의 말단에 부착된 폐쇄분자를 가지는 핵산;

d) 핵산의 3’말단에 부착된 폐쇄분자를 가지는 핵산;

e) 비-특이적인 증폭을 감소시키는 핵산;

f) 표 1로의 서열 중 어느 하나의 핵산 서열을 가지는 핵산;

g) 약 48.9℃ 내지 약 51.5℃의 녹는점을 가진 핵산;

h) 약 64.3%의 GC 범위를 가지는 핵산;

i) 상기 핵산이 하나 이상의 개조된 뉴클레오티드를 가지는 것을 특징으로 하는 핵산;

j) 상기 하나 이상의 인위적인 핵산이 포함되는 것을 특징으로 하는 핵산;

k) 상기 폐쇄 분자는 스페이서 분자인 것을 특징으로 하는 핵산;

m) 상기 폐쇄 분자는 역상된 분자인 것을 특징으로 하는 핵산; 및

n) a), b), c), d), e), f), g), h), i), j), k), 1) 및 m)의 단편 또는 유도체;

로 이루어진 군으로부터 선택되는 부착된 폐쇄분자를 가진 이중가닥 핵산 구조물이다.

다른 구체예에서, 본 발명은 분리된 핵산 자체 및 하기와 같이 다양한 조성물 내에 있는 분리된 핵산에 관한 것이다:

a) DSCI 서열을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 핵산;

b) DSCI 핵산을 담고 있는 저장 버퍼;

c) DSCI 핵산을 담고 있는 반응 버퍼;

d) DSCI 핵산 서열과 최소한 90%의 서열 동일성을 가지는 DNA 구조물; 및

e) a), b) 또는 c)의 단편 또는 유도물.

실시예 1(제1도)은 본 발명의 DSC가 DNA 중합효소에 의한 연장을 막는 것을 설명하는 PCR 증폭이다. 올리고뉴클레오티드의 3’말단에 병합되는 억제분자는 유리 수산기 말단을 캡하고, 이는 어떤 산물도 증폭되지 않도록 한다.

또한, 실시예 1(제2도)은 본 발명의 DSC는 pUC 플라스미드 1.1 kb 지역의 성공적인 증폭을 억제하지 않음을 설명하는 PCR 증폭을 설명한다. 포워드 및 리버스 반응 프라이머로서 동일한 서열을 가지는 캡된 3’말단을 가진 이중 가닥 분자의 존재는 반응 결과에 영향을 끼치지 않는다.

실시예 2는 수동의 핫 스타트 조건 없이 본 발명의 이중 가닥 복합체의 존재 하에서 표준 PCR, 시중에서 구입 가능한 핫 스타트 PCR, 및 PCR을 포함하는 다수의 PCR 증폭을 설명한다. 실시예 2는 외래 DNA와 경쟁함으로써 대장균 게놈 DNA의 존재 하에서 람다 파지 DNA 1.9 kb의 탐지를 설명한다.

도3은 DSC1, DSC2, DSC 3, 및 DSC3-1 분자의 존재 하에서 PCR 증폭 결과를 설명한다. PCR 증폭은 홀수 행에 있는 10,000 카피의 람다 파지 DNA와 함께 수행한다. 모든 반응은 경쟁하는 외래 DNA로서 1 ng의 대장균 게놈 DNA를 포함한다. 어떤 DSC도 첨가되지 않은 반응에서, 산물의 증폭이 일어나지 않았다. DSC 분자가 1, 5, 7 행에 첨가되었을 때, 산물이 증폭되었으며, 수율은 비-특이적인 증폭을 포함하지 않았다. DSC 분자의 존재는 수율을 감쇠시키지 않으면서 타겟 밴드의 탐지를 촉진한다.

도4는 람다 DNA 유래의 1.9 kb 지역의 증폭에서의 비교를 나타낸다. 모든 PCR 반응은 람다 DNA 및 1 ng의 오염하는 대장균 게놈 DNA의 존재 하에서 이루어졌다. 1-4 행은 DSC 분자의 존재 하에서 택 및 택-B DNA 중합효소를 사용하면서 산물의 증폭을 나타낸다. 택-B는 이들의 저장 버퍼 내에 안정제를 가진다. 5-7 행에서, 증폭은 시중에서 구입 가능한 화학적으로 개조된 핫 스타트 DNA 중합효소로 수행하였다. DSC 분자의 존재 하에서 증폭된 산물의 수율은 화학적으로 개조된 택에 의해서 획득된 수율과 비슷하거나 더 크다.

도5A 및 B는 DSC 분자의 존재 하에서 1.9 kb 람다 DNA 부분의 증폭을 보여준다. 도5A에서, PCR 증폭은 도3 및 4에서 사용된 프라이머들보다 더 낮은 녹는점을 가지는 포워드 프라이머 5-'CTGGCTGACATTTTCG-3'(서열번호: 17) 및 리버스 프라이머 5-'TATCGACATTTCTGCACC-3'(서열번호: 18)로 수행한다. 도5B에서, 증폭은 도3 및 4에서 사용된 프라이머들보다 더 높은 녹는점을 가지는 포워드 프라이머 5-'GAAGTCAACAAAAAGGAGCTGGCTGACATTTTCG-3'(서열번호: 19) 및 리버스 프라이머 5-'CAGCAGATACGGGATATCGACATTTCTGCACC-3'(서열번호: 20)로 수행한다.

PCR 증폭은 0.523 g의 람다 DNA 및 1 ng의 대장균 게놈 DNA로 수행한다. 반응 조건은 95℃에서 5 분 동안 초기 디네이쳐, 그런 후, (40 초간 95℃, 30 초간 48℃ 또는 61 ℃, 2 분간 72 ℃)를 40 사이클, 마지막으로 72℃에서 7 분간 연장이었다. 결과들은 DSC 분자의 존재 하에서 산물의 증폭이 이루어졌음을 보여준다. 반응 프라이머들의 녹는 점 및 더 낮은/더 높은 온도에서의 어닐링은 택-B DSC의 작용에 영향을 끼치지 않았다.

실시예 3은 DSC 분자의 존재 하에서 표준 PCR, 수동의 핫 스타트 PCR, 및 PCR에서 인간 태반 DNA(제6도)의 베타 엑틴 유전자 653-bp 조각의 증폭을 보여준다. 일반적인 PCR에서, 원하는 밴드의 수율은 비-특이적인 밴드의 증폭에 의해 영향을 받지 않았다(제6도, 11행).

수동의 핫 스타트 조건 하에서, 수율은 증가하였으나 PCR 특이성은 증가하지 않았다(제6도, 13 및 13행). 화학적으로 개조된 중합효소는 특이적이며 이것은 분명한 밴드를 증폭한다(제6도, 14행). 1-10 행에서, DSC 분자의 녹는점은 각각의 연속되는 행에서 약 5℃ 상승하였다. 낮은 녹는점을 가지는 DSC 분자의 존재 하에서 수행된 증폭으로 원하는 밴드의 낮은 것으로 확인되었다(제6도, 1-4행).

중간 정도의 녹는점을 가지는 DSC 분자의 존재 하에서 수행된 증폭의 결과는 수동의 핫 스타트에 의한 증폭으로 획득된 결과와 유사하다(제6도, 5-7행). 높은 녹는점을 가지는 DSC 분자의 첨가는 반응의 특이성을 증가시켰으며 원하는 밴드를 분명하게 생성하였다(제6도, 8-10행). 또한, 폐쇄분자에서의 차이는 원하는 밴드의 증폭에 영향을 끼쳤다. 도6의 16 및 17 행에서 사용된 DSC 분자는 이들의 3’말단에 성공적인 증폭 반응을 방해할 가능성이 있는 다른 폐쇄 분자로 캡(cap)하였다.

실시예 4는 1,000 카피 내지 5 카피에서 DNA A, B, C의 100-120 bp 단편을 증폭하는 연속적인 PCR 반응을 설명한다. PCR 증폭은 본 발명의 DSC 분자의 존재 하에서 표준 PCR 조건, 화학적으로 개조된 효소를 가지는 핫 스타트 PCR 조건, 핫 스타트 조건이 아닌 조건에서 수행한다. PCR 증폭의 시작을 실온에서 24 시간 배양 후에 수행하는 것과 비교한 후에 즉시 PCR 증폭을 수행한다.

도7A는 올리고뉴클레오티드 혼합물 B를 사용하면서 DNA B로부터 100-bp 산물의 증폭을 나타낸다. 모든 PCR 증폭은 1,000 카피의 DNA B를 포함한다. 도7A에서의 PCR 증폭은 실험대에서 이전 배양 없이 준비 후 즉시 수행한다.

반응물에 존재하는 DNA의 양은 중합효소가 수율을 감소시키지 않으면서 특이적으로 증폭하는데 충분하다(도7A, 1-5 행). 모든 행에서는 원하는 산물의 증폭에 해당하는 단 하나의 밴드가 존재한다. 도7A에서의 준비 하에서, PCR 증폭이 핫 스타트 조건에서 수행되는 것이 필요하지 않다.

도7B에서, PCR 증폭은 23℃의 실온에서 24시간의 배양 후에 수행한다. 일반적인 PCR 조건 하에서, 원하는 밴드의 증폭은 도7A에 있는 4행에서의 동일한 증폭과 비교할 때 크게 감소하였다. 본 발명의 DSC 분자들이 반응에 첨가되었을 때, 결과는 명확하게 차이가 났다. 반응물에서 DSC 분자의 존재로 인해 증폭 수율은 증가하였다(도7B, 1-3행).

도8은 DNA B 유래의 100-bp 산물의 증폭을 나타낸다. 모든 PCR 증폭은 5 카피의 DNA를 가지고 수행하였다. 상기 PCR 증폭은 실험대에서 미리 배양하지 않고 준비 즉시 수행하였다. 1 및 3행에서, DSC 분자의 최종 농도는 0.4 uM인 반면, 2 및 4행에서, DSC의 최종 농도는 4 uM이었다. 더 높은 DSC 농도는 증폭 결과를 억제하지 않았다. 두 개의 DSC 농도를 가지고 있는 반응들에 의해 반응물의 양은 더 증폭되었다.

도9는 DNA B로부터 100-bp 산물의 증폭을 나타낸다. 모든 PCR 증폭은 5 카피의 DNA B와 함께 수행하였다. 이러한 PCR 증폭은 실험대에서 실온에서 24시간 동안 배양한 후에 수행하였다. 표준 PCR 조건하에서, 배양 기간은 원하는 산물의 성공적인 증폭을 방해하였다(도9, 6행).

1-5행은 4 uM의 최종 농도에서 다른 DSC 분자의 존재하에서 PCR 증폭의 결과를 보여준다. DSCI 존재 하에서 증폭 수율을(도9, 1행) 화학적으로 개조된 효소에 의해 획득된 수율과 비교하였다. DSC5 및 DSC12를 가지고 획득된 수율은(도9, 2 및 3행) 화학적으로 개조된 효소를 가지고 획득된 수율(도9, 7행)보다 더 높았다. DSC13 및 DSC14의 존재 하에서 수행된 증폭 산물은 표준 조건하에서 PCR에 의해 획득된 것과 유사하다.

도10A-C는 DNA A-C 각각으로부터 100-120-bp 산물의 증폭을 나타낸다. 모든 PCR 증폭은 5 카피의 DNA를 가지고 수행한다. PCR 증폭은 실험대에서 배양 없이 준비한 즉시 수행한다. DSC 분자의 최종농도는 4 uM이다(도 10A-C, 1-5행).

DSC의 더 높은 농도는 증폭 산물을 억제하지 않는다(도10A-C, 1-3행). 이러한 반응에서, 원하는 산물의 증폭에 해당하는 단 하나의 밴드가 있다. DSC13 및 DSC14의 존재 하에서 수행된 PCR의 결과에서 산물은 증폭되지 않았으며, 원인은 이들의 길이 때문인 것으로 추정된다. 표준 PCR 조건 하에서, 원하는 산물의 증폭에 해당하는 단 하나의 밴드가 있다(도10A-C, 6행). PCR 증폭은 준비한 즉시 수행하였기 때문에, PCR이 핫 스타드 조건 하에서 수행될 필요는 없다(도10A-C).

도11A-C는 DNA A-C 각각으로부터 100-120-bp의 증폭을 나타낸다. 모든 PCR 증폭은 5 카피 DNA를 가지고 수행하였다. PCR 증폭은 23℃에서 실험대에서 24시간 동안 배양한 후에 수행하였다. DSC 분자의 최종 농도는 4 uM이다(도11A-C, 1-5행). DSC 분자가 없는 조건에서 수행된 PCR에 의해 어떤 산물도 증폭되지 않았다(도11A-C, 6행). DSC13 및 DSC14의 존재 하에서 수행되는 증폭의 결과는 핫 스타트 PCR조건이 아닌 PCR에서 확보된 것과 유사한다(도 11A-C, 5 및 6행).

도11A에서, DSC1 및 DSC2의 존재 하에서의 증폭 수율은 화학적으로 개조된 중합효소에 의해 획득된 것과 유사하다(도11A, 1, 3, 및 7행). DSC5의 존재 하에서 반응수율은 증가하였다(도11A, 2행).

도11B에서, DSC1의 존재 하에서 어떤 산물도 증폭하지 않았다(도11B, 1행). 그러나, DSC5 및 DSC12의 존재 하에서는 타겟 산물에 상응하는 단 하나의 밴드가 탐지되었다(도1B, 2 및 3행).

도11C에서, DSCl, DSC5, 및 DSC12의 존재 하에서 화학적으로 개조된 중합효소를 가지고 획득된 것과 비교할 만한 수율로 산물이 형성되었다(도11C, 1-3행). 그러나, DSC5 및 DSC12의 존재하에서 타겟 산물에 해당하는 단 하나의 밴드가 증폭되었다.

도10에서 나타낸 본 발명의 DSC5의 존재 하에서, 최상의 결과 산물이 증폭되었다.

실시예 5는 1280-5 카피에서 DNA A, B, C, 및 인간 태반 DNA의 100-120-bp를 증폭하는 순차적인 qPCR을 설명한다. PCR 증폭은 본 발명의 DSC 분자의 존재 하에서 표준 PCR 조건, 화학적으로 개조된 효소를 가진 핫 스타트 PCR 조건, 핫 스타트가 아닌 조건에서 수행된다.

도12는 CY5 형광 염료에 의한 탐지를 사용하면서 DNA C로부터 120-bp 산물 형성의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. 시중에서 구입 가능한 개조된 택에 대한 택-B DSCI를 평가하는 비교를 열거하였다.

각각의 반응에서의 DSC의 최종 농도는 0.4 uM이었다. 1280-5 카피의 DNA C를 포함하는 qPCR을 네 차례 수행하였다. 택 DSCI에 대한 평균 Ct값은 각각의 카피 수에서 화학적으로 개조된 택을 가지고 획득된 것 보다 더 낮았다. 표준 편차는 10 카피 수에서 가장 높은 택 DSCI에 대하여 약간 더 높았다. 전반적인 PCR 효율성 및 R-제곱 값은 택 DSCI 및 화학적으로 개조된 택에 대한 비교이다.

도13은 인간 태반 DNA로부터 HBB2의 100-bp 산물 형성의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. 시중에서 구입 가능한 화학적으로 개조된 택에 대하여 택-B DSCI를 평가하는 비교를 나란히 수행하였다. 각각의 반응에서 DSCI의 최종 농도는 0.4 uM이었다. 인간 태반 DNA의 1280-5 카피를 포함하고 있는 qPCR 증폭을 네 차례 수행하였다. 택-B DSCI에 대한 평균 Ct값은 각각의 카피 수에서 화학적으로 개조된 택을 가지고 획득된 것 보다 더 낮았다. 표준편차는 택-B DSCI에 대하여 약간 더 낮았다. 10 카피에 있는 화학적으로 개조된 택은 수용 가능한 값인 6.6보다 더 높은 반면 Taq-B DSCI는 5 카피로 발생한다. 택-B DSCI 및 화학적으로 개조된 택에 대한 전반적인 PCR 효율 및 R-제곱 값을 비교할 수 있다.

도14A 및 B는 HEX 형광 염료에 의한 탐지를 사용하면서 DNA B로부터 100-bp 산물의 형성의 실시간 PCR 분석을 나타낸다. 도14A는 2.5 U의 택-B 및 최종 농도 0.4 uM의 DSC1과 함께 25 ㎕ 반응물 내에 있는 산물의 증폭을 나타낸다. 도14B는 2.5 U의 택-B 및 최종농도 0.2 uM의 DSCI와 함께 50 ㎕ 반응물 내에 있는 산물의 증폭 곡선을 나타낸다.

1,000, 100, 및 10 카피의 DNA B를 포함하는 증폭 반응을 네 차례 수행하였다. 반응물의 부피를 증가시킴으로써, 각각의 카피 수에서 최종 크기는 택-B DSCI 및 화학적으로 개조된 택에 대하여 증가하였으며, 효소를 unit/ml보다 더 적게 사용해야 함을 제안한다. 이러한 반응에서(도14A), 도14B에 있는 측정값과 비교되는 탐지되는 Ct값(한계치 값보다 더 낮은 증폭)이 없다.

도15A-C는 HEK 형광 염료에 의한 탐지를 사용함으로써 DNA B로부터 100-bp 산물의 형성에 대한 실시간 PCR 분석을 나타낸다. 1,000, 100, 및 10 카피의 DNA B를 포함하는 반응을 네 차례 수행하였다. 이러한 분석에서, 택-B, 택-B DSC1, 택-B DSC5, 및 화학적으로 개조된 택을 사용하면서 수행된 qPCR 증폭을 비교하였다. 반응 내에서 DSC5 분자의 최종 농도는 1X-20X로 표기되었으며, 1X는 0.2 uM이고 20X는 4 uM이다. DSCI의 최종 농도는 0.2 uM이다.

도15A는 각각의 카피 수에 대하여 각각의 효소 조합을 사용함으로써 획득된 평균적인 Ct값을 나타낸다. 10-카피 값에서, DSC 분자가 없는 택-B에서는 Ct값이 탐지되지 않았다. DSC 분자의 존재 하에서 수행된 qPCR은 화학적으로 개조된 택을 가지고 획득된 것과 비교할 만한 측정 가능한 Ct 값을 가진다. 또한, 상기 Ct 값은 DSC 농도가 증가하면서 감소한다. PCR 효율성은 DSC 농도가 증가할수록 더 우수하다.

도15B는 택-B 및 FastStart에 따른, 또는 단지 FastStart에 따른 각각의 택-B DSC 조합에 대한 증폭 곡선을 나타낸다. DSC 농도가 증가할수록 증폭 크기는 더 높다. 10X에 있는 택-B DSC5 조성물은 화학적으로 개조된 택이 더 우수하다.

도15C는 각각 카피 수에서 각각의 조합에 대한 최종 크기를 보여준다. 전반적으로, 10X 농도에서 DSC5 분자의 존재 하에서 가장 우수한 결과를 얻었다.

단어 “필수적으로 구성한다”또는“필수적으로 구성하는”은 본 발명에서 설명되는 모든 구체예에서 작동하도록 본 발명에서 주장된 필수적이거나 또는 요구되는 발명 내에 있는 요소들을 의미한다. 예를 들어, 한 구체예에서, 본 발명의 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체는 본 명세서에서 설명된 이중 가닥 핵산 복합체 및 폐쇄 분자를 필수적으로 구성한다. 유사하게, 본 발명의 조성물, 방법, 키트 또는 시스템은 본 명세서에서 설명된 것처럼 DNA 중합효소, 버퍼, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민의 공급, 및 프라이머와 함께 본 명세서에서 설명되는 DSC를 필수적으로 구성한다.

[실시예]

실시예 1

택-B 중합효소로 촉매되는 PCR은 pUC 플라스미드(도1 및 2)의 1.1 kb 부위를 증폭하는 시스템을 사용하면서 수행한다. PCR 증폭은 3' OH 개조와 함께 또는 개조없이 프라이머를 사용하면서 수행한다. 한 프라이머 세트는 유리 3’OH 기를 가지는 5'-AACAATTTCACACAGGAACAGCT-3'(서열번호: 21) 및 5'-GTTTTCCCAGTCACGACGT-3'(서열번호: 22)를 포함한다. 제2 프라이머 세트에서, 역상된 dT개조에 의하여 3’기의 적용을 제한하였다: 5'-AACAATTTCACACAGCAACAGC/역상된 T/-3'(서열번호: 23) 및 5' -GTTTTCCCAGTCACGACG/역상된 T/-3'(서열번호: 24). 반응물은 lx PCR 버퍼 I (50 mM KC1, 1.5 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCl, pH 8.6 at 25°C) 또는 1x PCR 버퍼 II (10 mM (NH4)2S04, 10 mM KC1, 2 mM MgS04, 0.01% 트리톤(Triton) X-100, 50% 글리세롤, 20 mM Tris-HCl, pH 8.8 at 25°C)를 포함한다. 각각의 반응물은 0.2mM dNTPs, 0.2μΜ의 각각의 프라이머, 4ng의 pUC19 DNA, 및 5 U의 택-B 중합효소를 포함한다. 모든 PCR 반응은 2720 PCR Thermal Cycler (Applied Biosystems)를 사용하면서 100 ㎕의 부피에서 수행할 수 있다. 반응조건은 다음과 같다: 95℃에서 3분간 초기 디네이쳐, 그런 후, (95℃에서 20초간, 55℃에서 20초간, 68℃에서 1분 15초)를 35 사이클, 마지막으로 68℃에서 7분간 연장. PCR 후에, 각각의 20 ㎕의 시료를 1% 아가로스 겔에 적용하고 UV 조명하에서(Alpha Innotech Corporation Alphalmager HP, 2401 Merced St. San Leandro, CA 94577, 미국) 관찰한다. 택-B 중합효소(제품번호 P725L)는 Enzymatics, Inc. 100 Cummings Center, Suite 336H, Beverly, MA 01915, 미국에서 구입이 가능하다. DNA 표준 마커는 1 kb 래더(ladder)이고, New England Biolabs, 240 County Road Ipswich, MA 01938 미국(제품번호 N3232S)에서 구입이 가능하다.

실시예 2

도3-5에서 나타낸 실험에서 사용된 PCR 증폭 프로토콜은 100 ㎕의 반응량 내에서 lX PCR 버퍼 I(50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCl, 25℃에서 pH 8.6), 0.2 mM dNTPs, 및 5 U의 택 중합효소를 포함한다. PCR 증폭은 경쟁하는 외래 DNA로서 1 ng의 대장균 게놈 DNA의 존재 하에서 10,000 카피에서 람다 파지 DNA로부터 1.9 kb 부위를 증폭하는 포워드 프라이머 5'-AAGGAGCTGGCTGACATTTTCG-3'(서열번호: 25) 및 리버스 프라이버 5'- CGGGATATCG ACATTTCTGCACC-3'(서열번호: 26)를 각각 02 uM 사용하면서 수행할 수 있다. PCR 실험은 Applied Biosystems 2720 thermal cycler을 사용하여서 수행하였다. 반응조건은 95℃에서 5분간 초기 디네이쳐, 그런 후(95℃에서 40초간, 56℃에서 30초간, 75℃에서 2분간)을 40 사이클, 마지막으로 72℃에서 7분간 연장이었다. PCR 후에 20 ㎕의 각각의 시료는 1% 아가로스 겔로 적용하였으며 Alpha Innotech Corporation Alphalmager HP를 사용하여 UV 조명에서 관찰하였다. 사용된 시중에서 구입이 가능한 핫 스타트 DNA 중합효소는 Life Technologies Corp(5791 Van Allen Way PO Box 6482, Carlsbad, CA 92008 미국)의 Applied Biosystems에서 구입이 가능한 제품 번호 N8080246인 Amplitaq Gold이다. 제품번호 12032902001의 FastStart 택 DNA 중합효소는 Roche Diagnostics Corporation(P.O. Box 50414, 9115 Hague Road, Indianapolis, IN 46250-0414, 미국)에서 구입이 가능하다. 람다 PCR 프로토콜은 Koukhareva and Lebedev (2009) Anal.Chem. 81: 12에서 도입하였으며, 본 명세서에서 참조로 사용하였다.

실시예 3

도6에서, 인간 태반 DNA 유래의 베타-엑틴 유전자의 653-bp 조각을 증폭하였다. 모든 100 ㎕의 PCR 반응물은 lx PCR 버퍼 I(50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCl, 25℃에서 pH 8.6), 0.2mM dNTPs, 각각 0.5μΜ의 포워드 프라이머 5'- AGAGATGGCCACGGCTGCTT-3'(서열번호: 26) 및 리버스 프라이머 5'- ATTTGCGGTGGACGATGGAG-3'(서열번호: 26), 100 ng의 주형, 및 5 U의 택 중합효소를 포함한다. PCR 조건은 94℃에서 2분간 초기 디네이쳐, 그런 후 (94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 45초)를 35 사이클, 마지막으로 72℃에서 7분간 연장이다. PCR 후에, 20 ㎕의 각각의 시료를 1% 아가로스 겔에 적용하였으며 Alpha Innotech Corporation Alphalmager HP를 사용하여 UV 조명에서 관찰하였다. 베타-엑틴에 대한 PCR 프로토콜은 본 명세서에서 참조로 사용된 Lebedev 등, 2008, Nucleic Acid Research 31:20에서 인용하였다.

실시예 4

도7-11에서 나타낸 실험에서 사용된 PCR 증폭 프로토콜은 25 ㎕의 반응량내에서 lx qPCR buffer, 0.4 mM dNTPs, 및 2.5 U의 택 중합효소이다. PCR 증폭은 각각 1,000 카피 내지 5 카피에서 DNA A, B, 및 C의 100-120-bp를 증폭하는 1X의 올리고 혼합물, A-FAM, B-HEX, 및 C-CY5를 사용하면서 수행하였다. DNA 타겟의 연속적인 희석물은 qPCR 반응 버퍼내에서 제조하였다. dNTPs, 트레하로스(trehalose), 택 효소 및 올리고 혼합물을 포함하는 분석 혼합물은 첫 번째로 5 ㎕의 최종량 내에서 제조하였으며, 여기로 20 ㎕의 타겟 혼합물을 첨가하였다. PCR 실험은 Applied Biosystems 2720 thermal cycler를 사용하여 수행하였다. 반응 조건은 초기 디네이쳐로 95℃에서 10분간, 그런 후 (95℃로 30분간, 56℃로 1분간)을 40 사이클 수행하였다. PCR 후에, 20 ㎕의 각각의 시료를 3% 아가로스 겔에 적용하였으며, Alpha Innotech Corporation Alphalmager HP를 사용하여 UV 조명에서 관찰하였다. DNA 표준 마커는 New England Biolabs(240 County Road Ipswich, MA 01938 미국)의 제품번호 N3231S인 100 bp DNA 래더이다. 실시간 PCR은 TaqMan프로브 탐지를 사용하였다.

실시예 5

도12-15에서 나타낸 실험에서 사용된 PCR 증폭은 25 ㎕의 반응량 내에(도14B에서 25 및 50 ㎕의 반응량) 1X qPCR 버퍼, 0.4 mM dNTPs, 및 2.5 U의 택 중합효소를 사용하였다. PCR 증폭은 1,280 내지 5 카피에서 DNA A, B, C, 및 인간 태반 DNA 각각에서 100-120-bp 단편을 증폭하는 1X의 각각의 올리고 혼합물, A-FAM, B-HEX, C-CY5, 및 HBB2을 사용하면서 수행하였다. DNA 타겟 연속적인 희석물은 qPCR 반응 버퍼내에서 제조하였다. dNTPs, 트레하로스, 택 효소 및 올리고 혼합물을 포함하고 있는 분석 혼합물은 최종량 5 ㎕ 내에서 우선 제조되었으며, 여기에 20 ㎕의 타겟 혼합물을 첨가하였다. 반응 조건은 초기 디네이쳐로 95℃에서 10분, (95℃에서 30초, 56℃에서 1분)을 40 사이클 수행하였다.

본 발명에서 인용된 모든 참조문헌, 특허 및/또는 특허 출원과 연관된 전반적인 내용들이 본 발명의 참조로 사용되었다. 본 발명은 특이적으로 기재하였으며, 이들의 구체예에 의해 참조를 설명하였으나, 청구범위에서 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 형식 및 세부사항에서의 다양한 변경이 있을 수 있음을 당업자들은 이해할 수 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> ENZYMATICS, INC. Picone, Stephen Benoit, Christopher Koleva, Bilyana <120> Composition And Method For Synthesizing A Deoxyribonucleotide Chain Using A Double Stranded Nucleic Acid Complex With A Thermostable Polymerase <130> 137887.00102 <140> Not Yet Assigned <141> 2010-11-05 <150> 61/258,684 <151> 2009-11-06 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 1 gccaatccta cgcc 14 <210> 2 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 2 gccaatccta cgcc 14 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 3 gccaatccta cgcc 14 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 4 gccggccaat gt 12 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 5 cctgacaatg ccgcg 15 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 6 cctgacaatg ccgcg 15 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 7 agcggataac aatatcac 18 <210> 8 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 8 gccaatcat 9 <210> 9 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 9 gccaatccta 10 <210> 10 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 10 gccaatccta c 11 <210> 11 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 11 gccaatccta cg 12 <210> 12 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 12 gccaatccta cgc 13 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 13 gccaatccta cgcctcc 17 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 14 gccaatccta cgcctccgt 19 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 15 gccaatccta cgcctccgtg acgatcc 27 <210> 16 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> blocking double stranded nucleic acid complex for use in nucleic acid amplification <400> 16 gccaatccta cgcctccgtg acgatccgct c 31 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 ctggctgaca ttttcg 16 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 tatcgacatt tctgcacc 18 <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 gaagtcaaca aaaaggagct ggctgacatt ttcg 34 <210> 20 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 cagcagatac gggatatcga catttctgca cc 32 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 aacaatttca cacaggaaca gct 23 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 gttttcccag tcacgacgt 19 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 aacaatttca cacagcaaca gc 22 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 gttttcccag tcacgacg 18 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 aaggagctgg ctgacatttt cg 22 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 cgggatatcg acatttctgc acc 23 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 agagatggcc acggctgctt 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 atttgcggtg gacgatggag 20

Claims (29)

1. 핵산 증폭에 사용되는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체로, 상기 복합체는,
   (a) 약 9 내지 약 40개 사이의 핵산 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 제1 서열을 가지는 제1 핵산 가닥(i), 및 상기 제1 서열에 상보적인 약 9 내지 약 40개 사이의 핵산 염기를 포함하는 제2 서열을 가지는 제2 핵산 가닥(ii)을 포함하고, 상기 제1 핵산 가닥 및 제2 핵산 가닥은 각각 3’말단 및 5’말단을 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 이중 가닥 핵산 분자이며, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 약 50% 내지 약 70% 사이의 범위에서 시토신(C) 및 구아닌(G)을 가지는 것을 특징하는 분리된 이중 가닥 핵산 분자; 및
   (b) 상기 제1 핵산 가닥, 상기 제2 핵산 가닥 또는 상기 두 핵산 가닥의 3’말단 또는 5’말단에 공유결합 하는 것을 특징으로 폐쇄 분자;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 약 25℃ 내지 약 90℃ 범위의 녹는점을 가지는 것을 특징으로 하는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 복합체는 DNA 또는 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 폐쇄 분자는 디옥시티미딘, 디데옥시뉴클레오티드, 3’인산화, 헥산디올, 스페이서 분자, 1’2’-디데옥시리보스, 2’-O-메틸 RNA, 및 잠금 핵산(NLAs)으로 이루어진 군으로부터 구성되는 것을 특징으로 하는 폐쇄 이중 가닥 핵산 분자.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 폐쇄 분자는 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체:
   

   

   
   역상된 dT
   
6. 제1항에 있어서, 상기 제1 서열 또는 제2 서열은 하나 이상의 우라실 염기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체.
   
7. 핵산 증폭에 사용되는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체로, 상기 복합체는,
   (a) 약 9 내지 약 40개 사이의 핵산 염기를 포함하는 제1 서열을 가지는 제1 핵산 가닥(i), 및 상기 제1 서열에 상보적인 약 9 내지 약 40개 사이의 핵산 염기를 포함하는 제2 서열을 가지는 제2 핵산 가닥(ii)을 포함하는 분리된 이중 가닥 핵산 분자; 및
   (b) 제1 핵산 가닥, 제2 핵산 가닥, 또는 상기 두 핵산 가닥의 3’말단 또는 5’말단에 공유 결합하는 폐쇄분자;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체이며,
   상기 제1 핵산 가닥 및 제2 핵산 가닥은 각각 3’말단 및 5’말단을 가지고, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 약 25℃ 내지 약 90℃ 사이의 녹는점을 가지는 것을 특징으로 함.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 폐쇄 분자는 디옥시티미딘, 디데옥시뉴클레오티드, 3’인산화, 헥산디올, 스페이서 분자, 1’2’-디데옥시리보스, 2’-O-메틸 RNA, 및 LNAs로 이루어진 군으로부터 구성되는 것을 특징으로 하는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체.
   
9. 핵산 증폭에 사용되는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체로, 상기 복합체는,
   a. 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 이중 가닥 핵산 분자:
   (i) 하기 서열과 약 70% 이상이 동일한 제1 핵산 서열을 가지는 제1 핵산 가닥: (a). 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 이들의 조합; (b). 서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 이들의 조합에 대한 상보적인 서열; 또는 (c).서열번호: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 이들의 조합에 하이브리다이즈하는 서열; 및
   (ii) 제1 핵산 서열에 상보적인 약 9 내지 약 40개 사이의 핵산 염기를 포함하는 제2 서열을 가지는 제2 핵산 가닥; 및
   b. 상기 제1 핵산 가닥, 상기 제2 핵산 가닥, 또는 상기 두 핵산 가닥의 3’말단 또는 5’말단에 공유 결합하는 폐쇄 분자;
   를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체이며, 상기 제1 핵산 가닥 및 제2 핵산 가닥은 각각 3’및 5’말단을 가지고, 상기 이중 가닥 핵산 분자는 약 25℃ 내지 약 90℃ 범위의 녹는점을 가지는 것을 특징으로 함.
   
10. 제9항에 있어서, 제1 및 제2 핵산 가닥의 3’말단은 폐쇄분자를 포함하고, 상기 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체가 핵산 중합효소와 상호작용할 때, 이로 인하여 비-특이적인 증폭 산물이 감소하는 것을 특징으로 하는 폐쇄 이중 가닥 핵산 분자.
    
11. 제9항에 있어서, 상기 복합체는 약 48.9℃의 녹는점을 가지는 것을 특징으로 하는 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체.
    
12. 제9항에 있어서, 상기 제1 서열 또는 제2 서열은 하나 이상의 우라실 염기를 더 포함하는 것을 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체.
    
13. a. 하나의 버퍼;
    b. 제1항의 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체; 및
    c. 열 안정성 중합효소;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 조성물.
    
14. 제13항에 있어서, 상기 중합효소는 하기의 군으로 이루어진 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 조성물: 택 DNA 중합효소; BST DNA 중합효소; PFU DNA 중합효소; 크레나우 DNA 중합효소; T7 DNA 중합효소; T4 DNA 중합효소; Phi29 DNA 중합효소; 및 RB69 DNA 중합효소.
    
15. 제13항에 있어서, 농도 범위는 모든 5,000 U/ml의 중합효소에 대하여 약 2 uM 핵산 복합체 내지 모든 5,000 U/ml의 중합효소에 대하여 2 mM 핵산 복합체 사이인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 조성물.
    
16. 제13항에 있어서, 상기 버퍼는 TRIS 버퍼, MOPS, 또는 HEPES 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 조성물.
    
17. 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법으로, 상기 방법은,
    제1항의 DNA 중합효소 및 이중 가닥 핵산 복합체와 타겟 핵산 분자를 접촉하는 단계를 포함하며, 상기 이중 가닥 핵산 복합체는 약 25℃ 내지 약 90℃의 온도 범위에서 DNA 중합효소에 결합하는 것을 특징으로 하고; 그리고
    증폭된 타겟 핵산 분자를 획득하고, 하나 이상의 비-특이적인 증폭 산물 또는 이차 산물의 생성이 상기 이중 가닥 복합체와 접촉하지 않은 것과 비교할 때 감소하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법.
    
18. 제17항에 있어서, 약 20℃ 내지 약 25℃ 사이 온도에서의 상기 중합효소의 활성은 상기 이중 가닥 핵산 복합체와 접촉하지 않은 타겟 핵산 분자에 대한 중합효소 활성과 비교할 때 감소하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법.
    
19. 제18항에 있어서, 약 20℃ 내지 25℃ 사이 온도에서 상기 중합효소의 활성은 약 50% 내지 90% 사이의 범위에서 감소하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법.
    
20. 제17항에 있어서, 증폭된 핵산 분자의 양은 상기 이중 가닥 핵산 복합체와 접촉하지 않았을 때 획득된 타겟 핵산 분자의 양과 비교할 때 증가하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법.
    
21. 제20항에 있어서, 획득되는 증폭된 타겟 핵산의 양은 약 2X 내지 약 20X 사이의 범위에서 증가하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법.
    
22. 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법으로, 상기 방법은,
    고세균 종 유래의 DNA 중합효소 및 제6항의 이중 가닥 핵산 분자와 타겟 핵산 분자를 접촉하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하고, 상기 이중 가닥 핵산 분자 복합체는 약 25℃ 내지 약 90℃ 범위의 온도에서 DNA 중합효소에 결합하며; 그리고
    증폭된 타겟 핵산 분자를 획득하고, 하나 이상의 비-특이적인 증폭 산물 또는 이차 산물의 생성은 상기 이중 핵산 복합체와 접촉하지 않은 것과 비교할 때 감소하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법.
    
23. 제22항에 있어서, 약 20℃ 내지 25℃ 사이의 온도에서 중합효소 활성은 상기 이중 가닥 핵산 복합체와 접촉하지 않은 타겟 핵산 분자에 대한 중합효소 활성과 비교할 때 감소하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법.
    
24. 제23항에 있어서, 약 20℃ 내지 약 25℃ 사이 온도에서 중합효소 활성은 약 50% 내지 약 90% 사이의 범위에서 감소하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법.
    
25. 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법으로, 상기 방법은,
    a. 버퍼, 타겟 핵산 분자, 하나 이상의 프라이머, DNA 중합효소, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티미딘의 제공, 및 청구항 1의 이중 가닥 핵산 복합체를 혼합하는 단계; 및
    b. 하나 이상의 사이클에서 온도를 증가시킴으로써 타겟 핵산 분자의 증폭을 가능케 하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하며,
    상기 온도의 범위는 약 25℃ 내지 약 90℃이고, 증폭된 타겟 핵산 분자를 획득하고, 하나 이상의 비-특이적인 증폭 산물 또는 이차 산물의 생성은 이중 가닥 핵산 복합체와 접촉하지 않은 것과 비교할 때 감소하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법.
    
26. 제25항에 있어서, 약 20℃ 내지 약 25℃ 사이 온도에서 중합효소 활성은 상기 이중 가닥 핵산 복합체와 접촉하지 않은 타겟 핵산 분자에 대한 중합효소 활성과 비교할 때 감소하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법.
    
27. 제25항에 있어서, 증폭된 타겟 핵산 분자의 양은 이중 가닥 핵산 복합체와 접촉하지 않은 타겟 핵산 분자와 비교할 때 증가하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산 분자를 증폭하는 방법.
    
28. a. 제1항의 폐쇄 이중 가닥 핵산 복합체; 및
    b. 중합효소;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 키트.
    
29. 제28항에 있어서, 상기 중합효소는 하기의 군으로 이루어진 DNA 중합효소 인 것을 특징으로 하는 핵산 증폭용 키트: 택 DNA 중합효소; BST DNA 중합효소; PFU DNA 중합효소; 그레나우 DNA 중합효소; T7 DNA 중합효소; T4 DNA 중합효소; Phi29 DNA 중합효소; 및 RB69 DNA 중합효소.
    
    

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