CN106460040B - 在低盐条件下的等温扩增 - Google Patents

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Abstract

本文提供用于等温核酸扩增的方法和试剂盒，其使用靶向核酸模板；包含具有链替代活性的DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸酯(dNTP)混合物、具有3’端和5’端的引物、分子拥挤剂和缓冲溶液的反应混合物，以便扩增所述靶向核酸模板。所述缓冲溶液维持所述反应混合物的低盐浓度，且其中所述盐浓度产生比反应温度低至少10℃的引物的熔融温度(Tm)。所述扩增在等温条件下进行。

Description

在低盐条件下的等温扩增
发明领域
本发明通常涉及在低盐条件下采用分子拥挤剂执行等温扩增反应的方法和试剂盒。
背景
DNA扩增是复制靶向双链DNA(dsDNA)以产生多个复制体的方法。因为dsDNA的单个链是反并联且互补的，所以各个链可充当生成其互补链的模板链。模板链作为整体或作为截短部分保持且互补链通过DNA聚合酶由脱氧核糖核苷三磷酸酯(dNTP)组装。互补链合成从与模板链杂交的引物序列的3’终端开始以5’→3’方向进行。当前可利用各种有效核酸扩增技术，例如聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、自持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链替代扩增(SDA)、多重替代扩增(MDA)或滚环扩增(RCA)。这些技术中的许多在短时间跨度中产生大量扩增产物。
全基因组扩增(WGA)包括靶向DNA的非特异性扩增。WGA常通过MDA采用用于在靶向DNA的多个位置引发DNA合成的随机低聚核苷酸引物(例如，NNNNN*N)以及具有链替代活性的高保真度DNA聚合酶(例如，Phi29聚合酶)来实现。虽然例如GenomiPhi (GE Healthcare,USA)和RepliG (Qiagen)试剂盒的当前市售WGA***在1毫微克或更多的输入DNA下提供最佳结果，但是在靶向DNA仅以较小量利用时或在执行DNA从几个细胞或单细胞扩增时，这些***的性能差。
尽管存在这些进步，但是仍然需要研发在序列覆盖度方面具有降低偏倚且生成低水平的非特异性本底扩增的更有效的全基因组核酸扩增方法。痕量的靶向DNA使用常规方法扩增常引起DNA序列的不完全扩增，使得序列覆盖度和扩增偏倚“下降(dropouts)”，其中DNA序列不规则地扩增。另外，扩增反应的产物(扩增子)常可在本身之中退火，这导致产生不合需要的嵌合产物。因此非常需要用于非特异性扩增痕量的靶向DNA的有效方法。
发明简述
在一些实施方案中，提供核酸扩增方法，其在低盐条件下利用分子拥挤剂和具有低熔融温度的引物以使靶向核酸扩增，产生扩增子。
在一些实施方案中，提供用于基于靶向DNA生成至少一种扩增子的等温扩增方法。所述方法包括以下步骤：提供靶向核酸模板和使所述靶向核酸模板与包含具有链替代活性的DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸酯(dNTP)混合物、具有3'端和5'端的引物、分子拥挤剂和缓冲溶液的反应混合物接触，其中所述缓冲溶液维持所述反应混合物的盐浓度在10mM和30mM之间。所述扩增在等温条件下在恒定反应温度下实现，其中所述盐浓度使引物的熔融温度(Tm)优化至比反应温度低至少10℃。
在一些实施方案中，提供用于基于靶向DNA生成至少一种扩增子的等温扩增方法。所述方法包括以下步骤：提供靶向核酸模板；使所述靶向核酸模板与包含具有链替代活性的DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸酯(dNTP)混合物、具有3'端和5'端的引物、作为分子拥挤剂的聚乙二醇和缓冲溶液的反应混合物接触，其中所述缓冲溶液维持所述反应混合物的盐浓度在15mM下。所述扩增在等温条件下在30℃的恒定反应温度下实现，其中所述盐浓度使引物的熔融温度(Tm)优化至比反应温度低至少10℃。
在一些实施方案中，提供用于等温DNA扩增的试剂盒。所述试剂盒包含具有链替代活性的DNA聚合酶、分子拥挤剂和在扩增期间提供10mM-20mM的最终盐浓度的缓冲液。
附图
在参考附图阅读以下详述时将更好理解本发明的这些和其他特征、方面和优势。
图1A说明在缺乏低盐和分子拥挤剂的情况下MDA反应的动力学；
图1B说明在没有分子拥挤剂的情况下在低盐存在下MDA反应的动力学；
图1C说明分子拥挤剂和低盐条件增加来自单细胞的MDA反应的动力学和灵敏度的有效性；
图2说明分子拥挤剂和低盐条件降低本底非特异性扩增，允许映射到靶向基因组的总读数的较大百分数的有效性；
图3说明分子拥挤剂和低盐条件增加在变化深度下的总基因组序列覆盖度和由单细胞引发的DNA扩增反应的扩增平衡的有效性。
发明详述
为了更清楚且简明地描述并指出所要求保护的发明的主题，对于专用名词提供以下定义，其用于以下描述和随附权利要求中。
本文使用的术语“靶向DNA”是指希望在DNA扩增反应中扩增的天然或合成来源的DNA序列。靶向DNA充当DNA扩增反应中的模板。靶向DNA的一部分或靶向DNA的整个区域可在DNA扩增反应中通过DNA聚合酶扩增以生成扩增产物或扩增子。扩增子可包括所述靶向DNA的多个复制体或与所述靶向DNA互补的序列的多个复制体。所述靶向DNA可以自生物样品体内或体外得到。例如，所述靶向DNA可从体液(例如，血液、血浆、血清或尿)、器官、组织、细胞、器官或组织的分段部分、从生物受试者分离出的细胞(例如，含有患病细胞的区域或循环肿瘤细胞)、法医样品或古代样品得到。含有或疑似含有靶向DNA的生物样品可为真核源、原核源、病毒源或噬菌体源的。例如，所述靶向DNA可自昆虫、原生动物、鸟、鱼、爬虫、哺乳动物(例如，大鼠、小鼠、奶牛、狗、豚鼠或兔)或灵长类动物(例如，黑猩猩或人类)得到。所述靶向DNA也可为使用逆转录酶由RNA模板(例如，mRNA、核糖体RNA)产生的互补DNA (cDNA)。通过例如连接反应、PCR反应的另一反应产生的DNA产物或合成DNA也可充当合适的靶向DNA。所述靶向DNA可分散在溶液中或可固定在例如斑渍、阵列、载玻片、微量滴定板、珠粒或ELISA板的固体载体上。
本文使用的术语“低聚核苷酸”是指核苷酸的低聚物。核苷酸可通过其字母标识使用对应于其核苷的字母表示。例如，A指示腺苷，C指示胞苷，G指示鸟苷，U指示尿苷且T指示胸苷(5-甲基尿苷)。W指示A或T/U，且S指示G或C。N表示随机核苷且可为A、C、G或T/U中的任一种。在字母标识前的星形(*)符号指示由该字母标识的核苷酸为硫代磷酸酯修饰的核苷酸。例如，*N表示硫代磷酸酯修饰的随机核苷酸。在字母标识前的加(+)符号指示由该字母标识的核苷酸为锁核酸(LNA)核苷酸。例如，+A表示腺苷LNA核苷酸，且+N表示锁随机核苷酸。所述低聚核苷酸可为DNA低聚核苷酸、RNA低聚核苷酸或DNA-RNA嵌合序列。每当低聚核苷酸由字母序列表示时，所述核苷酸为从左到右的5'→3'顺序。例如，由字母序列(W)x(N)y(S)z表示的低聚核苷酸，其中x = 2，y = 3且z = 1，表示低聚核苷酸序列WWNNNS，其中W为5'末端核苷酸且S为3'末端核苷酸(“末端核苷酸”是指位于低聚核苷酸序列的末端位置的核苷酸。位于3'末端位置的末端核苷酸称为3'末端核苷酸，且位于5'末端位置的末端核苷酸称为5'末端核苷酸)。
本文使用的术语“核苷酸类似物”是指在结构上类似于天然存在的核苷酸的化合物。核苷酸类似物可具有改变的磷酸酯主链、糖部分、核碱基或其组合。核苷酸类似物可为合成核苷酸、修饰的核苷酸或代替物取代部分(例如，肌苷)。通常，具有改变的核碱基的核苷酸类似物尤其赋予不同的碱基配对和碱基堆栈性质。
本文使用的术语“引物”或“引物序列”是指杂交到靶向DNA模板以产生靶向DNA:引物杂交体并引发DNA合成反应的直链低聚核苷酸。凭经验确定引物长度的上限和下限。引物长度的下限为在核酸扩增反应条件下与靶向核酸杂交时形成稳定双链体所需要的最小长度。非常短的引物(通常小于3个核苷酸长)在这样的杂交条件下并不会与靶向核酸形成热力学稳定的双链体。上限常通过在除了靶向核酸中的预定核酸序列以外的区域中双链体形成的可能性来确定。通常，合适的引物长度在约3个核苷酸长至约40个核苷酸长的范围内。所述引物可为RNA低聚核苷酸、DNA低聚核苷酸或嵌合序列。
本文使用的术语“随机低聚核苷酸”是指通过以指定位置可由任何可能的核苷酸或其类似物组成(完全随机化)的这样的方式使在低聚核苷酸序列中的任何指定位置处的核苷酸随机化产生的低聚核苷酸序列的混合物。随机低聚核苷酸在作为随机引物使用时表示低聚核苷酸序列的随机混合物，其由在所述序列内的每一可能的核苷酸组合组成。例如，六聚体随机引物可由序列NNNNNN或(N)6表示。六聚体随机DNA引物由4种DNA核苷酸A、C、G和T的每一可能的六聚体组合组成，产生包含46 (4,096)种独特六聚体DNA低聚核苷酸序列的随机混合物。在靶向核酸的序列未知时或对于全基因组扩增反应，随机引物可有效地用于引发核酸合成反应。
如本文所述，“部分受限的低聚核苷酸”是指通过以下方式产生的低聚核苷酸序列的混合物：使低聚核苷酸序列的核苷酸中的一些完全随机化(例如，所述核苷酸可为A、T/U、C、G中的任一种或其类似物)，同时限制一些其他核苷酸的完全随机化(例如，在某些位置的核苷酸的随机化达到比可能组合A、T/U、C、G或其类似物低的程度)。部分受限的低聚核苷酸可作为引物序列使用。例如，由WNNNNN表示的部分受限的DNA六聚体引物表示引物序列的混合物，其中在所述混合物中的所有序列的5'末端核苷酸为A或T。在此，与完全随机DNA引物(NNNNNN)的最大四种可能组合(A、T、G或C)对比，5'末端核苷酸限于两种可能的组合(A或T)。部分受限的引物的合适引物长度可在约3个核苷酸长至约15个核苷酸长的范围内。
本文使用的dNTP混合物是指混合物脱氧核糖核苷三磷酸酯，其中N为包含A、C、G或T/U中的任一种的随机核苷酸。
本文使用的术语“链替代核酸聚合酶”或“具有链替代活性的聚合酶”是指除其核酸合成活性以外还具有链替代活性的核酸聚合酶。链替代核酸聚合酶可基于核酸模板链的序列通过读出模板链，同时替代与模板链退火的互补链来继续核酸合成。
本文使用的多重替代扩增(MDA)是指核酸扩增方法，其中所述扩增包括以下步骤：使引物与变性核酸退火，接着DNA合成，其中可能阻断继续合成的一个或多个下游双链DNA区域被穿过这些区域的链替代核酸合成破坏。因为核酸通过链替代合成，所以单链DNA通过链替代产生，且因此发生数目逐渐增加的引发事件，形成超支化核酸结构的网络。MDA非常适用于全基因组扩增，以便在有限的序列偏倚下由少量的基因组DNA样品产生高分子量DNA。在MDA中可使用除其核酸合成活性外还具有链替代活性的任何链替代核酸聚合酶(例如，Phi29 DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶的大片段)。MDA常在等温反应条件下使用随机引物执行，以在有限序列偏倚下实现扩增。
本文使用的术语“滚环扩增(RCA)”是指经由滚环机制扩增环形核酸模板(例如，单链DNA环)的核酸扩增反应。RCA通过引物杂交到环形(常为单链的)核酸模板而引发。核酸聚合酶随后使引物延伸，其通过围绕环形核酸模板连续进行而杂交到环形核酸模板，以一而再地复制核酸模板的序列(滚环机制)。RCA通常生成包含环形核酸模板序列补体的串联重复单元的多联体。
本文使用的术语“分子拥挤剂”是指改变在溶液中的其他分子的性质的试剂或分子。分子拥挤剂的实例包括但不限于葡聚糖或聚乙二醇(PEG)。通常，所述分子拥挤剂具有高分子量或在包含其他分子的溶液中产生拥挤环境的大体积结构。所述分子拥挤剂减小在溶液中的其他分子可用的溶剂的体积，其造成分子拥挤。在一些实施方案中，高浓度的具有6000Da的分子量的聚乙二醇(PEG 6000)占据包含其他分子的溶液的体积的一大部分。例如，PEG 6000存在于包含其他反应物的反应混合物中，其中PEG分子占据反应混合物的溶剂的一大部分。所述分子拥挤可改变反应的速率或平衡常数。在一些实施方案中，其中引物-模板DNA双链体的熔融温度(Tm)在低盐浓度存在下减小，所述熔融温度在将分子拥挤剂加到扩增反应混合物中时提高。
本文使用的术语“反应温度”是指在扩增反应期间维持的温度。本发明的实施方案包括等温扩增反应，其中所述反应的温度是恒定的。整个等温扩增反应在反应温度下实现，例如用于使用GenomiPhi的等温扩增反应的反应温度为约30℃。所述反应温度随变化条件而变，包括但不限于使用不同的聚合酶、引物或模板的尺寸、使用另外的盐或稳定剂。
本文使用的术语“熔融温度”(Tm)是指一半的引物-模板核酸双链体在其下分离产生单链低聚物或例如DNA的核酸的温度。引物-模板DNA双链体的稳定性可通过其Tm测量。引物长度和序列在设计成功扩增的参数方面重要。核酸双链体的熔融温度随着其长度和GC含量增加而增加。Mg2+、K+和溶剂的浓度影响引物的Tm。在一个实施例中，Tm在85mM K+/Na+和GenomiPhi V2TM存在下在15.8-27.8℃范围内，其中引物序列为NNNNN*N。在另一实施例中，Tm在19mM K+/Na+存在下对于单细胞GenomiPhiTM在5-17℃范围内，其中引物序列为NNNNN*N。
本文所述的方法和试剂盒旨在高效地扩增靶向核酸，其中另外的优点在于降低用核酸扩增的其他方法观察的非靶向核酸(例如，引物-二聚体、嵌合核酸产物等)的非特异性扩增。在不想要限于特定作用机制的情况下，所公开的方法通过采用分子拥挤剂、低盐条件和在等温条件下扩增核酸来实现这些目标。
方法的一个或多个实施方案包括提供靶向核酸模板，使所述靶向核酸模板与反应混合物接触；和在等温扩增条件下在恒定反应温度下扩增所述靶向核酸模板。在这些实施方案中，所述反应混合物包含具有链替代活性的DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸酯(dNTP)混合物、具有3’端和5’端的引物、分子拥挤剂和缓冲溶液，其中所述缓冲溶液维持所述反应混合物的盐浓度为10-30mM且其中所述反应混合物的盐浓度使引物的熔融温度(Tm)比反应温度低至少10℃。如所提到的，所述反应温度是指在等温扩增反应期间维持恒定的单一温度。
如所提到的，所述反应混合物的盐温度影响引物-靶向核酸双链体的熔融温度(Tm)，其中所得熔融温度小于反应温度。在一个或多个实施方案中，所述引物-靶向核酸双链体的熔融温度在扩增反应中在低盐条件存在下减小。在一个或多个实施方案中，所述一种或多种低聚核苷酸引物的双联熔融温度(Tm)在低盐条件下低8-10℃，因为在该条件下在核酸-引物杂交体中沃森-克里克碱基配对的稳定性可减小。在一个或多个实施例中，与在缺乏PEG的情况下相同反应的反应速率相比较，反应速率在低盐条件下在扩增反应混合物中存在PEG的情况下增加。实验观察确立随着盐浓度减小，例如10-15mM，扩增反应具有非常缓慢的反应动力学的事实。所述扩增反应的反应速率在相同低盐条件下在加入例如PEG的分子拥挤剂的情况下改善。所述引物(低聚物)的熔融温度在低盐条件下减小，这也减小反应动力学，其中所述扩增反应的动力学通过加入分子拥挤剂而进一步增加。比双链体的Tm高的反应温度可导致引物-模板双链体去稳定化且可使双链体熔融，因为引物的熔融温度在该低盐条件下低。然而，出乎意料地，在加入例如PEG的分子拥挤剂的情况下，观察到反应速率增加且扩增反应随着其他常规扩增反应而进行，且因此引物-模板双链体在相对较高的温度下稳定。例如，即使当引物-模板双链体的熔融温度为15℃时，双链体在30℃下在分子拥挤剂存在下在低盐条件下稳定。相同引物-模板双链体的熔融温度在低盐条件下降低，且其可降低8-10℃。在一些实施方案中，所述双链体的降低的Tm需要扩增反应在比在传统扩增反应中使用的温度低的温度下进行。
如所提到的，所述方法包括使所述靶向核酸模板与包含分子拥挤剂的反应混合物接触。所述分子拥挤剂用于增加扩增反应在严格条件下的速度和效率。所述分子拥挤剂可增加所述反应的速率。在一些实施方案中，所述低盐浓度优化Tm，使得Tm比反应温度低至少10℃，且分子拥挤剂的存在在增加的反应速率下产生所要的非偏倚扩增产物。
引物-模板双链体的熔融温度可使用各种标准方法计算。本发明方法的熔融温度使用如下所述的方法计算。所述计算仅估算熔融温度且不同的因素可影响熔融温度，包括清洁剂、盐浓度、反荷离子或溶剂。因为Tm通过使用低盐条件修改，但在一些实施方案中，Tm在本文中可称为盐调节的熔融温度(Tm)。为了确定Tm，使用关于两种标准近似计算的变体。对于小于14个核苷酸的序列，在盐浓度调节下，使用与碱基计算相同的公式：
Tm= (wA+xT)*2 + (yG+zC)*4-16.6*log10(0.050) + 16.6*log10([Na+])
其中，w、x、y和z分别为在低聚核苷酸序列中碱基A、T、G、C的数目。术语16.6*log10([Na+])针对盐浓度方面的变化调节Tm，且术语log10(0.050)针对在50mM Na+下的盐调节来调节。所述反应混合物可含有一种或多种单价和二价盐，其可影响低聚核苷酸的Tm。因为钠离子在DNA链之间形成盐桥方面更加有效，且因此其对于使双链DNA稳定化具有显著作用。熔融温度(Tm)计算假定退火在50mM引物的标准条件下在pH7.0下在浓度为0.01-1.0M的单价阳离子(Na+或K+)存在下发生，非对称序列为至少8个碱基长且含有至少一个G或C。(参见Nakano等人，(1999) Proc. Nucleic Acids Res.27:2957-65和http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)。
使用MDA扩增的动力学通过在反应混合物中结合分子拥挤剂而增加。分子拥挤为决定核酸的结构、稳定性和功能的因素。在一些实施方案中，DNA双链体的结构和稳定性受分子拥挤剂影响。所述分子拥挤剂可影响核酸结构，其可取决于在核酸结构中的碱基配对或氢连接的模式。分子拥挤剂的不同尺寸对DNA双链体的稳定化具有不同的影响，其中DNA双链体的长度还促进稳定性。例如，聚乙二醇(PEG)为具有变化分子量且对DNA双链体的稳定性具有不同影响的分子拥挤剂。在一些实施方案中，扩增反应速率在低盐条件存在下在加入PEG的情况下增加。
在一个或多个实施方案中，在所述扩增反应中使用的分子拥挤剂选自聚乙二醇、FicollTM、海藻糖及其组合。在一个实施方案中，所述分子拥挤剂包括聚乙二醇。所述分子拥挤剂可选自PEG 2000、PEG 6000、PEG 8000及其组合。在一些实施方案中，所述扩增反应采用2.5% PEG-8000，与例如GenomiPhiTM条件的标准扩增条件相比较，其增加扩增速率。
在所述核酸扩增反应的一个或多个实施方案中，可采用高度严格的杂交条件以减少不想要的扩增产物和假象。高度严格的杂交条件是指与通过对于核酸扩增反应通常使用的条件提供的严格度相比对低聚核苷酸杂交事件赋予更高严格度的反应条件。通常，执行核酸扩增反应，其中一种或多种低聚核苷酸引物的Tm在用于扩增的反应温度的10℃内。这允许所述一种或多种低聚核苷酸引物稳定地键合到模板。在高度严格的条件下，一种或多种所用的低聚核苷酸引物的Tm大于比反应温度低10℃的温度。这可防止引物稳定地键合到模板，且通常不用于扩增反应。例如，高度严格的杂交条件可在核酸扩增反应中通过增加反应温度或减小盐浓度来实现。低盐(~15mM)和使用分子拥挤剂(例如，2.5% PEG-8000)的组合提供增加的反应动力学和更均匀的扩增序列覆盖度，如在图1A、1B、1C、2和3中所示。
如所提到的，所述方法包括使所述靶向核酸模板与包含缓冲溶液的反应混合物接触的步骤。用于扩增反应的缓冲溶液可具有1-75mM的盐浓度。在一些实施方案中，所述盐浓度为1-35mM。在一些实施方案中，所述缓冲溶液维持反应混合物的盐浓度为10-30mM。在一个实施方案中，所述反应混合物的盐浓度维持在约20mM下。在一些其他的实施方案中，所述扩增反应在与常规扩增方法相比较低的盐浓度下发生。例如，与在传统扩增反应中使用的75mM KCl相对照，对于扩增使用15mM KCl。利用随机六聚体的核酸扩增反应常在约75mM盐浓度下且在30℃下进行，其中所述方法的实施方案包括在约15mM盐浓度和30℃下的核酸扩增反应的步骤，其为高度严格的杂交条件。在低盐浓度下在分子拥挤剂存在下的扩增反应在自痕量核酸样品扩增时改善反应的速度和灵敏度。
在一些实施方案中，所述双联熔融温度(Tm)在低盐浓度下降低约5-10℃，但加入分子拥挤剂，这允许扩增反应在更严格的条件下，例如在较高的温度下执行。盐浓度可根据引物的长度以及引物的核苷酸的组成而变，从而产生降低的熔融温度。本发明方法使用的盐可为单价盐，例如钠或钾。
在本发明方法的实施方案中，引物-模板双链体在75mM盐浓度下的所得熔融浓度范围为15-27℃，其中所述反应在30℃下在存在随机六聚体引物的情况下且在缺乏分子拥挤剂的情况下执行。在反应条件在存在随机六聚体引物的情况下且在缺乏分子拥挤剂的情况下在30℃反应温度下改善到15mM盐浓度时，引物-模板双链体的所得熔融温度在3-15℃范围内，这比反应温度低超过15℃。在该15mM盐浓度条件下，预计反应动力学显著减慢。然而，出乎意料地，与在缺乏PEG的情况下在相同条件下的反应速率相比较，反应速率在PEG存在下在15mM盐浓度、30℃反应温度下在随机六聚体引物存在下增加，这可由在PEG存在下出现较佳的引物-模板杂交引起。除了较佳反应动力学之外，分子拥挤剂(PEG)还引起产生较佳的代表性扩增产物。
如所提到的，在一些实施方案中，等温扩增方法包括提供靶向DNA的步骤。足够量的靶向核酸为扩增反应的主要需求之一，从而产生具有恰当序列的均匀扩增的核酸。在标准GenomiPhiTM反应条件下，量大于~1-10ng的靶向核酸产生非偏倚的扩增产物，而当输入靶向核酸的量较少时，在整个基因组中出现更偏倚的扩增。使用较少量的靶向核酸，基因组的某些区域以降低的效率扩增，其中基因组的一些区域以增加的效率扩增，产生不均匀的扩增产物。尽管在所述方法的本发明实施方案中使用少量的输入靶向核酸如飞克水平的输入靶向核酸，在扩增产物中下降(dropouts)和高水平的扩增偏倚或错失序列降低。所述方法的一个或多个实施方案降低形成有缺陷的扩增子的概率，特别是在尝试从含有有限量的开始扩增反应的核酸的单细胞扩增DNA时。例如，人类细胞含有~6.6pg的DNA，其中细菌细胞含有~5fg的DNA。即使在使用约5fg的可自单微生物细胞得到的靶向核酸之后，扩增核酸的本发明方法产生具有低水平的不恰当序列或扩增偏倚的扩增子。在一个或多个实施方案中，提供至少约5fg靶向核酸模板，或基本上一种微生物基因组。在一些实施例中，与标准扩增方法相比较，在低盐条件和分子拥挤剂存在下，其中得到至少约5fg的细菌靶向核酸的自单一细菌细胞的扩增产生更高水平的靶向序列和更具代表性的扩增产物。在一些其他的实施方案中，其中得到至少约6.6pg的人类靶向核酸的自单一人类细胞的扩增在低盐和分子拥挤剂的相同条件下产生更完整且代表性的扩增产物。在这些实施方案中，与标准扩增条件相比较，还增加了扩增速率。
所述靶向DNA可为线性模板、断口模板或环形模板。其可为天然或合成的DNA。所述靶向DNA可为cDNA或基因组DNA。所述DNA模板可为合成模板(例如，通过酶/化学反应使线性或断口DNA成环)，或者其可为质粒DNA。
如所提到的，用于所述扩增方法的引物具有低熔融温度。为了引发DNA合成，所述扩增反应常利用具有序列5'-NNNN*N*N的随机六聚体，其中“N”代表脱氧腺苷(dA)、脱氧胞苷(dC)、脱氧鸟苷(dG)或脱氧胸苷(dT)，且“*”代表硫代磷酸酯键。
在一个或多个实施方案中，所述引物可为特异性引物序列、随机引物序列或部分受限的随机引物序列。在沃森-克里克碱基对中，特异性引物序列与在靶向DNA模板中存在的特定序列互补。特异性低聚核苷酸序列可用于引物中，例如用于特异性扩增在混合物中的线粒体DNA、在混合物中的某一质粒或某些基因组区域。
在一些实施方案中，在所述引物中的低聚核苷酸序列为随机引物序列。在一些实施方案中，所述引物的长度为5-9个核苷酸长。在一个实施方案中，所述引物长度为6个核苷酸(六聚体)。例如，所述引物可为随机六聚体序列。在15mM盐、30℃反应温度的条件下使用随机六聚体引物的扩增反应的实施方案中，引物-模板双链体的熔融温度降低到比所述反应温度低至少10℃。
另外，所述随机序列可包含一种或多种修饰的核苷酸且可包含一个或多个硫代磷酸酯键。例如，所述引物可为NN(N)mNN，其中m的整数值范围为0-36。在一些实施方案中，m的整数值范围可为0-20。在一些其他的实施方案中，m的整数值范围可为0-10。在一些例示性实施方案中，所述低聚核苷酸序列可为随机四聚体、随机五聚体、随机六聚体、随机七聚体或随机八聚体。所述引物可包含天然、合成或修饰的核苷酸或核苷酸类似物。为了引发DNA合成，所述扩增反应通常利用具有序列5'-NNNNN*N的随机六聚体，其中“N”代表脱氧腺苷(dA)、脱氧胞苷(dC)、脱氧鸟苷(dG)或脱氧胸苷(dT)，且“*”代表硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，修饰所述引物以使竞争非靶向核酸(即，模板DNA)扩增减至最少，从而修饰低聚核苷酸引物，以此方式抑制其彼此退火的能力。
已经使用不能经由分子内或分子间杂交而交叉杂交的受限随机化六聚体引物(例如，R6，其中R = A/G)在核酸扩增期间抑制引物-二聚体结构形成。然而，这些受限的随机化引物在核酸扩增反应中赋予显著的偏倚。这样的引物对于序列非特异性或序列非偏倚性核酸扩增反应(例如，全基因组或未知核酸序列扩增)还具有有限的用途。
在一些实施方案中，所述引物可包含赋予引物(例如，肽核酸或PNA)、锁核酸(LNA)的稳定性和/或其他优势(例如，次要结构形成)的合成主链或核苷酸类似物或者可包含修饰的糖部分(例如，木糖核酸或其类似物)。
在一些实施方案中，所述引物包含一种或多种LNA核苷酸。例如MDA的扩增反应的速度和灵敏度在使用LNA自痕量核酸样品扩增成低聚核苷酸引物时可改善。LNA是用于增加碱基配对的速度、效率和稳定性的一类构象受限的核苷酸类似物，由此促进修饰的低聚核苷酸杂交到其在目标核酸中的靶序列。LNA核苷酸含有锁在核糖核酸模拟糖构象中的双环呋喃糖单元。从脱氧核糖核苷酸(或核糖核苷酸)到LNA核苷酸的结构改变从化学观点上看可限制例如在2'位和4'位的碳原子之间的另外键(例如，2'-C、4'-C-氧基亚甲基键)的引入。在LNA核苷酸中的呋喃糖单元的2位和4位可被O-亚甲基(例如，氧-LNA：2'-O、4'-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基核苷酸)、S-亚甲基(硫-LNA)或NH-亚甲基部分(氨基-LNA)等连接。这样的键限制呋喃糖环的构象自由度。在一些实施方案中，包含一种或多种LNA低聚核苷酸的引物对于互补单链RNA、单链DNA或双链DNA显示增强的杂交亲和性。另外，在低聚核苷酸中包含LNA可诱发A-型(RNA样)双链体构象。
在一些实施方案中，所述核酸扩增使用通用结构5'-+W+WNNN*S-3'的随机六聚体引物，其中“+”在锁核酸碱基(即，“LNA碱基”：例如，+A = 腺苷LNA分子)前面，“W”代表仅dA和dT的混合物，且“S”代表仅dC和dG的混合物。“*”代表在两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键。因为“W”碱基不能与“S”碱基稳定地配对，所以低聚核苷酸双链体的形成受到抑制，这引起非模板核酸的扩增降低。
在一些实施方案中，用于DNA扩增反应的引物可抵抗核酸酶，例如核酸外切酶。例如，所述引物可包含为使其具有核酸外切酶抵抗性的一种或多种修饰的磷酸酯键(例如，硫代磷酸酯键)。在一些实施方案中，所述引物包含核酸外切酶抵抗性随机低聚核苷酸序列。例如，所述引物可具有随机序列，例如NNNNN*N或NNNN*N*N。
在一些实施方案中，所述引物为部分受限的引物序列。仅在末端核苷酸处具有受限随机化的部分受限的引物序列的非限制性实例包括但不限于W(N)yS、S(N)yW、D(N)yG、G(N)yD、C(N)yA或A(N)yC。y的整数值可在2-13范围内。在一些实施方案中，y的值可为2、3、4或5。在一些例示性实施方案中，部分受限的引物序列(W)x(N)y(S)z，其中x、y和z为彼此独立的整数值，且其中x值为2或3，y值为2、3、4或5且z值为1或2。所述部分受限的引物序列可包含一种或多种核苷酸类似物。在一些实施方案中，所述部分受限的引物序列可具有末端错配的引物-二聚体结构。例如，因为W不能与S进行碱基配对，所以如果通过分子间杂交形成不具有任何凹口端的引物-二聚体结构，则在两个3'端核苷酸处将存在末端错配。在一些实施方案中，所述引物序列为包含修饰的核苷酸且具有末端错配引物-二聚体结构的核酸酶抵抗性的部分受限的序列。
在一些实施方案中，基于靶向DNA产生至少一种扩增子的方法包括以下步骤：提供所述靶向DNA，使至少一种引物与所述靶向DNA退火以产生靶向DNA:引物杂交体和经由等温核酸扩增反应延伸所述引物以产生与所述靶向DNA的至少一部分互补的至少一种扩增子。
用于所述等温扩增方法的核酸聚合酶可为校对或非校对核酸聚合酶。所述核酸聚合酶可为嗜热或嗜温核酸聚合酶。适合在所述方法中使用的DNA聚合酶的实例包括但不限于Phi29 DNA聚合酶、hi-保真融合DNA聚合酶(例如，具有持续性增强结构域的火球菌样酶，New England Biolabs, MA)、来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的Pfu DNA聚合酶(Strategene, Lajolla, CA)、来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的Bst DNA聚合酶(New England Biolabs, MA)、T7 DNA聚合酶的Sequenase™变体、exo(-)VentR TM DNA聚合酶(New England Biolabs, MA)、来自大肠杆菌的DNA聚合酶I的Klenow片段、T7 DNA聚合酶、T4 DNA聚合酶、来自火球菌属GB-D的DNA聚合酶(New England Biolabs,MA)或来自嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)的DNA聚合酶(New England Biolabs,MA)。
在一些实施方案中，用于等温扩增的核酸聚合酶为链替代核酸聚合酶。所述方法可采用高持续的链替代聚合酶以在用于高保真碱基合并的条件下扩增靶向DNA。高保真DNA聚合酶是指在合适条件下具有等于或小于与常用热稳定PCR聚合酶例如Vent DNA聚合酶或T7 DNA聚合酶相关联的那些的错误掺入率(从约1.5 x 10-5到约5.7 x 10-5)的DNA聚合酶。在一些实施方案中，Phi29 DNA聚合酶或Phi29样聚合酶可用于扩增DNA模板。在一些实施方案中，Phi29 DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的组合可用于环状DNA扩增。
在所述等温扩增反应混合物中还包含另外的酶以使错误掺入（mis-incorporation）事件减至最少。例如，可加入例如MutS的蛋白质介导的纠错酶以在DNA聚合酶反应期间或之后改善DNA聚合酶保真性。
在一些实施方案中，一种或多种扩增子可通过滚环扩增(RCA)由环形靶向DNA模板产生。可将包括DNA聚合酶、引物、dNTP和分子拥挤剂和维持低盐浓度的缓冲剂的扩增试剂加到靶向DNA中以产生用于引发RCA反应的扩增反应混合物。所述扩增反应混合物还可包含例如单链DNA结合蛋白和/或合适的扩增反应缓冲剂的试剂。在扩增反应之后或期间，扩增子可通过用于DNA检测的任何当前已知的方法检测。RCA可为表现出线性扩增动力学的线性RCA(LRCA) (例如，使用单一特异性引物的RCA)，或者可为表现出指数扩增动力学的指数RCA(ERCA)。RCA也可使用产生超支化多联体的多种引物(多重引发的滚环扩增或MPRCA)执行。例如，在双重引发的RCA中，如在线性RCA中，一种引物可与环形核酸模板互补，而另一种引物可与RCA产物的串联重复单元核酸序列互补。因此，双重引发的RCA可作为具有指数(几何)扩增动力学的链式反应进行，其特点在于包括两种引物的多重杂交、引物-扩增和链替代事件的分支级联。这常产生多联、双链核酸扩增产物的离散集。在一些例示性实施方案中，RCA在等温条件下使用例如Phi29 DNA聚合酶的合适核酸聚合酶体外执行。
在一些其他的实施方案中，线性DNA模板可使用MDA扩增。在30℃下使用随机引物和75mM盐的MDA的常规方法可产生序列偏倚扩增并形成嵌合产物。当盐浓度在这些反应中降到15mM盐来尝试降低嵌合序列的生成时，反应动力学显著减慢。相比之下，在MDA反应中使用分子拥挤剂和低盐条件促进更快的DNA扩增动力学并改善DNA序列覆盖度和平衡。另外，靶向DNA:引物杂交体的Tm的减小允许MDA反应在更严格的条件下，例如在较低盐浓度(例如，15mM KCl，与在其他标准条件下75mM相对照)执行或允许对于高度严格的杂交条件使用更严格的缓冲剂。所述严格反应进一步减少不必要的反应中间体和产物，例如通过自杂交形成的嵌合产物。
另外，在扩增反应中使用分子拥挤剂和低盐浓度允许痕量的DNA样品在广泛的条件下稳固地扩增，包括但不限于循环等离子体DNA、自***固定的石蜡嵌入(FFPE)样品分离的DNA、已经暴露于环境条件的法医DNA样品或古代DNA样品。包含扩增子的扩增库还可用于经由qPCR或测序来靶向检测扩增序列。
在一些实施方案中，提供用于等温DNA扩增的试剂盒。所述试剂盒包含具有链替代活性的DNA聚合酶和引物、分子拥挤剂、缓冲溶液，其中所述缓冲溶液维持10-30mM的盐浓度。
在一些实施方案中，所述试剂盒包含Phi29 DNA聚合酶。所述试剂盒还可包含具有较低的熔融温度的一种或多种随机引物。
本文所述的方法和试剂盒可用于扩增并分析DNA样品，例如用于法医分析、生物威胁识别或医学分析的那些DNA样品。所述方法的灵敏度允许用于下游试验和分析的全基因组扩增的单细胞和真核细胞的全基因组扩增。另外，分子拥挤剂和低盐条件的使用促进更快的DNA扩增动力学、对于低输入DNA量的较高灵敏度并产生较少偏倚的更平衡的扩增。
在本文中公开以下实施例只为了说明且不应该将其视为限制本发明的范围。在实施例部分中使用的一些缩写可如下扩展：“mg”：毫克；“ng”：毫微克；“pg”：皮克；“fg”：飞克；“mL”：毫升；“mg/mL”：毫克/毫升；“mM”：毫摩尔浓度；“mmol”：毫摩尔；“pM”：皮摩尔浓度；“pmol”：皮摩尔；“μL”：微升；“min.”：分钟且“h.”：小时。
实施例：
实施例1：在PEG和低盐条件存在下来自单细胞的DNA的MDA反应的反应动力学和灵敏度。
大肠杆菌MG1655的培养物在LB培养基中生长到对数期，通过离心分离收获，且使用TEN缓冲液(10mM Tris，pH 7.5、100mM NaCl和0.1mM EDTA)洗涤三次。在洗涤之后，使细胞在缓冲液TEN + 30%甘油中再悬浮并进行连续稀释。随后将细胞在室温下用10µM FM1-43FX染料(F-35355，得自Invitrogen, Life Technologies)染色10分钟，将染色的细胞加到透明底部的384孔板的每个孔中，并使用反向荧光显微镜(Nikon Eclipse TE2000-U)计数。在识别含有单细胞的孔之后，裂解通过加入2µl的0.2M KOH、50mM DTT、0.015% Tween-20起始并在-80℃下冷冻过夜。在下一个早晨，将板解冻且裂解物在65℃下进一步孵化10分钟，冷却并通过加入1µl的0.4M HCl、0.6M Tris，pH 7.5中和。
扩增(GenomiPhiTM)反应在PEG 8000和低盐条件的存在和缺乏下使用随机六聚体引物执行以确定分子拥挤剂和低盐条件对MDA反应的影响。含有50mM HEPES（pH 8.0）、20mMMgCl2、0.01% Tween-20、1mM TCEP、40µM随机六聚体、在1:20,000稀释下的SYBR Green I(Invitrogen)、20µg/ml Phi29聚合酶和所指示浓度的PEG-8000和KCl的GenomiPhiTM扩增反应混合物(表1)通过在30℃下孵化1小时以除去任何少量的污染DNA来制备。扩增反应通过将400µM dNTP加到细胞裂解物中来起始。反应在板阅读器(Tecan)中在30℃下孵化8小时，同时以5分钟间隔进行荧光测量以测量扩增动力学。扩增反应通过测量在Tecan板阅读器(Tecan SNiPer，Amersham-Pharmacia Biotech)中荧光随时间的增加而实时监测。反应随后通过在65℃下加热20分钟钝化且扩增的DNA通过乙醇沉淀纯化。如通过由Pico Green(Invitrogen)定量确定的平均DNA产率示于表1中，其中dN6代表具有NNNN*N*N的低聚核苷酸序列的六聚体引物。假定20mM的盐来源于细胞裂解和中和程序，列出在这些反应中的盐浓度。剩余盐来自加到反应混合物中的另外KCl。平均产率来自三个20μl反应，除了其中仅两个反应生成扩增产物的清洁GenomiPhiTM制剂之外。
表1：如通过Pico Green测定确定的平均DNA产率。
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荧光测量在扩增反应的5分钟间隔下从如在图1A-1C所示的5fg纯化大肠杆菌DNA(大致来自单细胞的DNA的量)、从含有裂解的单细胞的反应和从其中没有加入DNA的反应(NTC)进行，其中RFU(相对荧光单位)相对于时间测量。NTC代表“无模板对照物”，其中扩增反应在不添加靶向DNA模板的情况下执行。在dN6-PEG制剂中盐的减少允许所有三种单细胞扩增并提供较高平均产率的扩增DNA产物。图1A、1B和1C说明使用标准随机六聚体引物分别地在缺乏PEG的情况下在高盐条件下、在缺乏PEG的情况下在低盐条件下和在存在PEG的情况下在低盐条件下靶向核酸的扩增动力学。无模板对照物(NTC)、5fg DNA和每种单细胞样品的扩增速率通过监测在每种样品中产生可检测水平的扩增子产物所用的时间来估算。
图1C示出在存在PEG的情况下在低盐条件下MDA反应的增加的反应动力学和灵敏度。在存在PEG的情况下在低盐条件下的扩增反应提供增加的扩增速度(约2.5倍)且允许飞克(fg)量的DNA和自单细胞的DNA高效地扩增。反应动力学的分析(图1A-1C)示出清洁GenomiPhiTM制剂和dN6-PEG制剂的扩增速率大致相同。然而，在如在dN6 +PEG制剂中加入2.5% PEG-8000时，扩增动力学剧烈改善，显示大致2.5倍增加。另外，与无模板的对照物相比较，在单细胞之间扩增时间存在明确差别，这提示较高品质的扩增产物。
动力学和产率出乎意料地提示，尽管提供低盐和存在分子拥挤剂的反应条件，含有PEG和低盐的扩增反应迅速且高效地进行。与公开了低盐条件阻止有效引物杂交的当前已知方法不同，本发明方法显示，与在低盐条件下没有分子拥挤剂的反应速率相比较，在低盐和分子拥挤剂两者的存在下，反应速率增加。通常阻止引物-模板有效杂交的反应条件包括但不限于低盐浓度、高温和具有比反应温度低8-10℃的Tm的引物的使用。另外，扩增产物的分析指示模板基因组DNA的所有区域代表性地扩增，其中富A/T区域没有扩增不足（under-amplification）且富G/C区域没有过扩增，通常将在其中引物结合条件严格且仅允许富G/C引物杂交的条件下预期。此外，作为分子拥挤剂的PEG和低盐条件的存在不抑制引物和模板DNA的结合及通过DNA聚合酶实现的扩增，以及在等温扩增期间通过DNA聚合酶实现引物的链替代。如果PEG或低盐条件抑制引物-模板的杂交，接着通过DNA聚合酶实现的扩增的起始，动力学将减慢且产率将降低。
将来自单细胞的扩增的DNA处理成库且使用具有配对端读数和100个碱基对读数长度的Illumina HiSeqTM 2000进行全基因组测序。对于各样品得到大约8百万-16百万读数，随后将其映射到大肠杆菌MG1655参考基因组，如在图2中所示。将粗数据加载到DNANexus (www.dnanexus.com)，其提供DNA分析计算服务且将数据映射到大肠杆菌MG1655参考基因组。仅准确映射的读数包括在包括反复映射的读数的分析中。在单细胞复本之间的标准偏差通过错误柱状图指示，如在图2中所示。
根据图2，三种不同GenomiPhiTM扩增制剂在产生成功映射的DNA读数中的明确差别。较低的盐浓度和PEG-8000的存在共同允许生成更多靶向的大肠杆菌DNA和相应较少的不可映射的序列。
在映射读数到大肠杆菌MG1655参考基因组之后，计算在总共4.6Mb基因组中被至少读数的指示值(1X-100X)覆盖的碱基的百分数，如在图3中所示，其中在单细胞复本之间的标准偏差由错误柱状图指示。另外，低盐和添加PEG-8000的组合允许通过序列读数的大肠杆菌基因组的更大程度的碱基覆盖度，其在1X-100X的覆盖深度范围内明显(图3)。这将允许改善未知序列的构建体基因组序列的能力且允许在测序应用中的更稳固分析。
以上详述是示例性的且并非想要限制本申请的发明和本发明的用途。贯穿本说明书，专用名词的范例应该视为非限制性实施例。除非上下文明确规定，否则单数形式“一个/种”和“所述”包括复数个讨论对象。在文中的整个说明书和权利要求中使用的近似语言可用于修饰任何定量表述，这些表述可获准在不造成其相关的基本功能发生变化的条件下进行改变。因此，由例如“约”的术语修饰的值不限于所指定的精确值。除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表达成分的量、性质如分子量、反应条件等的所有数值在所有情况下都应该理解为由术语“约”修饰。因此，除非指出相反情况，否则以下说明书和随附权利要求中陈述的数值参数都是近似值，其可根据设法通过本发明获得的所要性质而改变。至少而不是试图限制与权利要求书的范围等效的原则的应用，至少可根据所报道的有效数字的数目且通过应用普通舍入技术解释各数值参数。在必要处，提供了范围且那些范围包括在其间的所有子范围。
在不脱离本发明的精神或其本质特征的情况下，本发明可以其他特定形式体现。上述实施方案为选自多种所有可能的实施方案或实施例的实施方案或实施例。因此，在各方面，可将上述实施方案视为说明，而不是限制本发明。虽然在本文中仅说明并描述了本发明的某些特点，但是应理解本领域的技术人员考虑到本公开的益处将能够鉴定、选择、优化或改进用于使用根据本发明的原理的方法、适合这些及其他类型的应用的合适条件/参数。明确的用途；试剂的选择；例如浓度、体积、孵化时间、孵化温度等变量的选择在很大程度上可依赖于所期望的特定应用。因此，应理解所附权利要求书将涵盖所有这类属于本发明的精神内的修改和变化。另外、在权利要求书的等效内容的意义和范围内的所有改变都确定为包括在其中。

Claims (25)

1.通过多重替代扩增扩增核酸的方法，其包括：
a) 提供靶向核酸模板；
b) 使所述靶向核酸模板与包含具有链替代活性的DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸酯(dNTP)混合物、具有3’端和5’端的引物、分子拥挤剂和缓冲溶液的反应混合物接触，其中所述缓冲溶液维持所述反应混合物的盐浓度在1mM-75mM之间；和
c) 在等温扩增条件下在恒定反应温度下扩增所述靶向核酸模板，
其中所述盐浓度使所述引物的熔融温度(Tm)比所述反应温度低至少10℃，其中所述引物具有5个核苷酸-9个核苷酸的长度且所述盐浓度维持在1mM-35mM之间；
其中所述分子拥挤剂选自PEG 400、PEG 2000、PEG 6000、PEG 8000或其组合。
2.权利要求1的方法，其中所述反应混合物的盐浓度维持在10mM-30mM之间。
3.权利要求1的方法，其中所述反应混合物的盐浓度维持在约20mM。
4.权利要求1的方法，其中所述靶向核酸模板的输入量为至少5飞克。
5.权利要求4的方法，其中来自细菌源的靶向核酸模板的输入量为至少5飞克。
6.权利要求4的方法，其中来自人类源的靶向核酸的输入量为至少5皮克。
7.权利要求1的方法，其中扩增所述核酸模板在高度严格的条件下执行。
8.权利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。
9.权利要求1的方法，其中所述反应温度在25-35℃范围内。
10.权利要求1的方法，其中所述引物为随机引物。
11.权利要求1的方法，其中所述引物为硫代的。
12.权利要求1的方法，其中所述引物包含核苷酸类似物。
13.权利要求12的方法，其中所述引物包含在3'端核苷酸与邻近于所述3'端核苷酸的核苷酸之间的硫代磷酸酯键。
14.权利要求12的方法，其中所述引物包含在核苷酸碱基之前的锁核酸(LNA)。
15.权利要求12的方法，其中在所述引物中的核苷酸类似物为2-氨基-脱氧腺苷(2-氨基-dA)。
16.权利要求15的方法，其中所述引物还包含防止形成引物-二聚体的核苷酸类似物2-硫-脱氧胸苷(2-硫-dT)。
17.权利要求1的方法，其中所述引物为六聚体。
18.权利要求17的方法，其中所述引物包含NNNN*N*N序列。
19.权利要求17的方法，其中所述六聚体具有(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N的通用结构，其中(atN)为所述六聚体的5'端核苷酸且*N为所述六聚体的3'端核苷酸，且其中“N”代表脱氧腺苷(dA)、脱氧胞苷(dC)、脱氧鸟苷(dG)或脱氧胸苷(dT)，(atN)代表2-氨基-dA、dC、dG和2-硫-dT的随机混合物，且“*”代表硫代磷酸酯键。
20.通过多重替代扩增扩增核酸的方法，其包括：
a) 提供靶向核酸模板；
b) 使所述靶向核酸模板与包含具有链替代活性的DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸酯(dNTP)混合物、具有3'端和5'端的六聚体引物、作为分子拥挤剂的聚乙二醇和缓冲溶液的反应混合物接触，其中所述缓冲溶液维持所述反应混合物的盐浓度在15mM；和
c) 在等温条件下在30℃的恒定温度下扩增所述靶向核酸模板；
其中所述盐浓度使所述引物的熔融温度(Tm)比所述反应温度低至少10℃；
其中所述引物具有5个核苷酸-9个核苷酸的长度且所述盐浓度维持在1mM-35mM之间；其中所述聚乙二醇选自PEG 400、PEG 2000、PEG 6000、PEG 8000或其组合。
21.通过多重替代扩增用于扩增核酸的试剂盒，其包含：
(a) 具有链替代活性的DNA聚合酶；
(b) 分子拥挤剂；
(c) 在扩增期间提供10mM-20mM的最终盐浓度的缓冲液；和
(d) 脱氧核糖核苷三磷酸酯(dNTP)混合物，具有3'端和5'端的随机引物；
其中所述随机引物具有5个核苷酸-9个核苷酸的长度；其中所述分子拥挤剂选自PEG400、PEG 2000、PEG 6000、PEG 8000或其组合。
22.权利要求21的试剂盒，其中所述DNA聚合酶为phi29 DNA聚合酶。
23.权利要求21的试剂盒，其中所述随机引物为六聚体。
24.权利要求23的试剂盒，其中所述随机引物具有(atN)(atN)(atN)(atN)(atN)*N的通用结构，其中所述六聚体的5'端为(atN)，且所述六聚体的3'端为*N，“N”代表dA、dC、dG或dT，其中(atN)代表2-氨基-dA、dC、dG和2-硫-dT的随机混合物，且“*”代表硫代磷酸酯键。
25.权利要求24的试剂盒，其中所述随机引物包含核苷酸类似物2-氨基-dA和核苷酸类似物2-硫-dT。
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