KR20200010209A

KR20200010209A - Clpb로부터 유래된 단백질 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20200010209A
Application number: KR1020197031900A
Authority: KR
Inventors: 세르게이 페티소프; 그레고리 램버트; 로맹 르그랑; 니콜라스 루카스
Original assignee: 타르제디스; 유니베르시떼 드 루앙 노르망디; 인썸(인스티튜트 내셔날 드 라 싼테 에 드 라 리셰르셰메디칼르)
Priority date: 2017-04-03
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2020-01-30
Also published as: MX2019011891A; CA3058816A1; RU2019135294A; CN111108114A; US20200131495A1; EP3385276A1; IL269751A; BR112019020779A2; AU2018247816A1; WO2018185080A1; EP3606943A1; JP2020515647A

Abstract

본 발명은 ClpB 단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 및 단백질 및 그의 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 염증, 특히 과체중 및/또는 비만 관련 질병 및 장애의 치료 및/또는 예방에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포만 상태를 유도하고, 포만감을 연장시키고, 식사 규모를 감소시키고, 식품 섭취를 감소시키고, 중량 증가를 제어하고, 중량 손실을 자극하는 방법에 관한 것이다.

Description

CLPB로부터 유래된 단백질 및 그의 용도

본 발명은 염증, 예컨대 비만, 과체중 및/또는 비만 관련 질병 및 장애의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 본 발명은 포만 상태 유도, 포만감 연장, 식품 섭취 감소, 중량 증가 제어 및 중량 손실 자극 방법에 관한 것이다.

비만은 다수의 동반 질병을 수반하며, 치료하기 어려운 만성 질환 중 하나이다. 비만 및 과체중은 일반적으로, 에너지 균형을 조절하는 펩다이드성 시스템의 역할의 변이를 시사하는 것으로, 식품 섭취량의 증가 및 에너지 소비의 감소를 특징으로 한다. 실제로, 식욕 및 섭식 행동의 조절은 장내 공복 및 포만 펩타이드 호르몬과 식욕유발 및 식욕억제 신경 펩타이드를 포함하는 뇌 신경 회로와의 상호작용을 포함한다 (문헌[Schwartz et al., 2000. Nature. 404(6778):661-71]).

현재 식품 섭취 제어 모델은 섭식의 항상성 및 식욕 양상을 조절하는 수 개의 뇌 회로에 신호를 전달하는 장 유도 공복 및 포만 호르몬을 포함한다 (문헌[Berthoud H.-R., 2011. Curr. Opin. Neurobiol. 21(6):888-896; Murphy et al., 2006. Nature. 444(7121):854-859]). 이들 중에서 각각 뇌실결핵 (PVN)으로 전달되는 프로오피오멜라노코르틴 (prooreiomelanocortin) (POMC) 및 신경 펩타이드 Y (NPY)/아구티 관련 단백질 (AgRP) 뉴런을 포함하는 시상하부 궁상핵 (ARC)으로부터 유래한 식욕억제 및 식욕유발 경로가 두드러진다 (문헌[Atasoy et al., 2012. Nature. 488(7410):172-177; Garfield et al., 2015. Nat. Neurosci. 18(6):863-71; Shi et al., 2013. Cell Metab. 17(2):236-248]).

전구체 프로오피오멜라노코르틴 (POMC)으로부터 유래된 α-멜라닌 세포 자극 호르몬 (α-MSH)을 포함하고, MC 유형 4 수용체 (MC4R)에 작용하는 멜라노코르틴 펩타이드로 구성된 중앙 멜라노코르틴 (MC) 시스템은 에너지 균형 조절에 결정적으로 관여한다 (문헌[Cone, 2006. Endocr. Rev. 27(7):736-49]). 실제로, POMC 발현 및 MC4R 신호전달 둘 모두의 결핍은 인간 및 유전자 변형된 설치류 둘 모두에서 과식증 및 비만을 야기한다 (문헌[Huszar et al., 1997. Cell. 88(1):131-41; Krude et al., 1998. Nat. Genet. 19(2):155-7; Farooqi et al., 2003. N.　Engl.　J. Med. 348(12):1085-95]). 따라서 중앙 MC4R의 선택적 자극은 과식증 및 비만을 치료하기 위한 매우 흥미로운 표적으로 나타나고, 예를 들어 프래더윌리 증후군 (Prader-Willi syndrome)에서 과식증의 치료 및 POMC 결핍 동안의 대체 요법으로서 세트멜라노타이드 (setmelanotide)와 같은 수 개의 α-MSH 펩타이드 유사체가 개발되고 임상적으로 시험되었다 (문헌[Chen et al., 2015. J. Clin. Endocrinol. Metab. 100(4):1639-45; Kuehnen et al., 2016. N. Engl. J. Med. 375(3):240-6]). 그러나 뇌에서 고친화성 α-MSH 유사 약제의 투과는 혈압 상승과 같은 부적절한 부작용의 위험이 있다.

최근에, 장 공생 에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli) (E. 콜라이) 카제인 분해 프로테아제 B (ClpB) 단백질은 α-MSH의 입체형태 모방체로서 확인되었으며, 이는 새로운 유형의 펩타이드 유사 약제로서 특정 박테리아 단백질의 잠재적인 용도를 시사한다 (문헌[Tennoune et al., 2014. Transl. Psychiatry. 4:e458]). ClpB 단백질은 95 kDa보다 높은 분자량을 가지며, 이는 일부 문제점 (예를 들어, 생성, 안정성 등)을 유발한다.

장 내분비 세포에서 MC4R의 활성화는 포만 호르몬 글루카곤-유사 펩타이드-1 (GLP-1) 및 펩타이드 YY (PYY)의 방출을 자극하는 것으로 나타났다 (문헌[Panaro et al., 2014. Cell Metab. 20(6):1018-1029]).

최근의 연구에 의해 E. 콜라이로부터의 ClpB 서열의 아미노산 잔기 534 내지 548에 상응하는 ClpB 단편이 MC3R 및 MC5R에 대해 부분적 활성을 갖지만 MC4R에 대해서는 활성이 없는 완전한 마이크로몰 MC1R 작용제인 것으로 밝혀졌다 (문헌[Ericson et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2015, 25:5306-5308]). 그러나, 전체 ClpB 또는 MCR 상 α-MSH-유사 에피토프를 포함하는 더 큰 단편의 활성은 Ericson 등에 의해 연구된 변형된 짧은 단편과 상이할 수 있다.

호르몬 α-MSH는 또한 면역계 세포 및 MC1R 및 MC3R과 같은 멜라노코르틴 수용체를 발현하는 말초 비 면역 세포 유형에 대해 강력한 항 염증 효과 및 보호 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다 (문헌[Brzoska et al., 2008. Endrocr. Rev. 29(5):581-602]). 또한, 최근의 연구는 α-MSH는 건선, 알레르기성 비염, 골관절염 및 신경 염증성 질병의 치료를 위해 흥미로운 표적임을 보여준다 (문헌[Auriemma et al., 2012. J. Invest. Dermatol. 132(7):1814-24; Kleiner et al., Clin. Exp. Allergy. 46(8):1066-74; Boehm et al., 2016. Biochem. Pharmacol. 116:89-99; Mykicki et al., 2016. Sci. Transl. Med. 8(362):362ra146]).

따라서, α-MSH의 생물학적 활성, 특히 멜라노코르틴 수용체에 결합하는 생물학적 활성을 보유하는 신규한 폴리펩타이드 또는 단백질을 동정할 필요가 여전히 존재한다.

본 발명자들은 놀랍게도 α-MSH 에피토프와 서열 상동성을 포함하는 ClpB 단편이 장 점막 세포에 직접적으로 작용하여, PYY의 분비를 자극한다는 것을 밝혀내었다.

본 발명은 따라서 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 및 단백질, 및 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 음으로 하전된 잔기 및 2개의 연속 Arg 및 Trp 잔기를 포함하는 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하여 적어도 15개의 아미노산의 폴리펩타이드 또는 단백질에 관한 것이고, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 전장(full-length) ClpB 단백질이 아니다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 아미노산 서열 서열번호 2를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 아미노산 서열 서열번호 3을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 아미노산 서열 서열번호 4를 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 서열 GKPV와 적어도 75% 서열 상동성을 갖는 서열을 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 아미노산 서열 서열번호 6을 포함한다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 의약품이다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 식이 보충제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 비만, 과체중 및/또는 비만 관련 질병 및 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 약제학적 조성물, 또는 의약품에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 대상은 대상체의 중량을 감소시키기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 용도이다. 일 실시형태에서, 대상체는 비만이 아니다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 식이 보충제 또는 식품 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

정의

본 발명에서, 하기 용어는 다음의 의미를 갖는다:

수치 앞의 "약"은 상기 수치 값의 + 또는 -10%를 의미한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같은 "아미노산"은 당 업계에 널리 공지된 바와 같이 이들의 전체 명칭, 3 문자 코드 또는 1 문자 코드로 표시된다. 펩타이드의 아미노산 잔기는 다음과 같이 약칭된다: 페닐알라닌은 Phe 또는 F이고; 류신은 Leu 또는 L이고; 이소류신은 Ile 또는 I이고; 메티오닌은 Met 또는 M이고; 발린은 Val 또는 V이고; 세린은 Ser 또는 S이고; 프롤린은 Pro 또는 P이고; 트레오닌은 Thr 또는 T이고; 알라닌은 Ala 또는 A이고; 티로신은 Tyr 또는 Y이고; 히스티딘은 His 또는 H이고; 글루타민은 Gln 또는 Q이고; 아스파라긴은 Asn 또는 N이고; 리신은 Lys 또는 K이고; 아스파르트산은 Asp 또는 D이고; 글루탐산은 Glu 또는 E이고; 시스테인은 Cys 또는 C이고; 트립토판은 Trp 또는 W이고; 아르기닌은 Arg 또는 R이고; 글리신은 Gly 또는 G이다.

용어 "아미노산"은 천연 및 합성 아미노산, 및 D 및 L 아미노산 둘 모두를 포함한다. "표준 아미노산" 또는 "자연 발생 아미노산"은 자연 발생 펩타이드에 일반적으로 존재하는 20개의 표준 L-아미노산 중 임의의 것을 의미한다. "비표준 아미노산 잔기"는 합성에 의해 제조되었는지 천연 공급원으로부터 유래되었는지에 관계없이 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 의미한다. 예를 들어, 합성을 용이하게 하기 위해, 나프틸알라닌을 트립토판으로 치환시킬 수 있다. 치환될 수 있는 다른 합성 아미노산은 다음에 제한되는 것은 아니나, L-하이드록시프로필, L-3,4-디하이드록시페닐알라닐, α-아미노산 예컨대 L-α-하이드록시리실 및 D-α-메틸알라닐, L-α-메틸알라닐, β-아미노산 및 이소퀴놀릴을 포함한다.

용어 "아미노산"은 또한 다음에 제한되는 것은 아니나, 염, 아미노산 유도체 (예컨대 아미드화물) 및 치환을 포함하는 화학적으로 변형된 아미노산을 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드 내에, 특히 카복시- 또는 아미노-말단에 포함된 아미노산은, 그의 활성에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 폴리펩타이드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 메틸화, 아미드화, 아세틸화 또는, 다른 화학적 기로의 치환에 의해 변형될 수 있다. 또한, 이황화 연결이 본 발명의 폴리펩타이드에 존재하거나 부재할 수 있다.

"항체" 및 "면역글로불린" ("Ig")은 상호 혼용되며, 적절한 생물학적 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 항체 단편을 포함한다.

"폭식", "강박식이", "폭식 장애" 및 "강박식이 장애"는 제어할 수 없는 식이의 에피소드로 구성되어 있지만 후속 보상행동 (purging) 에피소드 (예를 들어, 구토)가 부재하는 식이 장애를 지칭한다. "폭식 장애자"는 폭식 규모 점검표 (문헌[Gormally et al., 1982. Addict Behav. 7 (1): 47-55]) 또는 균등한 진단 조치 (예를 들어, 전문 평가)를 기반으로 폭식 또는 강박 식이를 경험하는 것으로 확인된다. 폭식 또는 강박 식이 중증도는 개별 사건의 중증도 및/또는 이러한 사건의 빈도에 의해 측정된다.

"입체형태적 모방체"는 또 다른 단백질과 적어도 부분적으로 동일한 입체형태를 공유하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 일 실시형태에서, "α-MSH 펩타이드의 입체형태적 모방체"는 α-MSH 펩타이드 (서열번호 20)와 적어도 부분적으로 동일한 입체형태를 공유하는 폴리펩타이드 또는 단백질을 의미한다. 특정 실시형태에서, α-MSH 펩타이드의 입체형태 모방체는 연속 Arg 및 Trp 잔기, 서열 GKPV와 적어도 75% 서열 상동성을 갖는 서열, 및/또는 연속 Arg 및 Trp의 상류의 음으로 하전된 잔기를 갖는다.

"보존적 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되어서, 펩타이드 화학 분야의 당업자가 폴리펩타이드의 2차 구조 및 친수성 특성이 실질적으로 변하지 않을 것으로 예상할 수 있는 것이다. 따라서, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환기의 상대적 유사성, 예를 들어 그의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기반으로 한다. 전술한 다양한 특성을 고려한 예시적인 치환은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 아르기닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 류신 및 이소류신을 포함한다. 아미노산 치환은 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성을 기반으로 하여 추가로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 히스티딘, 리신 및 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 기를 갖는 아미노산은 류신, 이소류신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 다른 아미노산 그룹에는 다음이 포함된다:

(1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr;

(2) Cys, Ser, Tyr, Thr;

(3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe;

(4) Lys, Arg, His; 및

(5) Phe, Tyr, Trp, His.

용어 "보존적 아미노산 치환"은 다음 5개의 그룹 중 하나 내의 아미노산 교환으로서 추가로 정의될 수 있다:

(ⅰ) 작은 지방족 비극성 또는 극성이 작은 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

(ⅱ) 극성의 음으로 하전된 잔기 및 그의 아미드화물: Asp, Asn, Glu, Gln;

(ⅲ) 극성의 양으로 하전된 잔기: His, Arg, Lys;

(ⅳ) 큰 지방족 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val, Cys;

(ⅴ) 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr, Trp.

"에피토프"는 항체가 결합하는 단백질 또는 단백질들 상에 위치된 아미노산의 특정 배열을 지칭한다. 에피토프는 종종 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 기로 구성되며, 특정한 3차원 구조적 특성 및 특정 전하 특성을 갖는다. 에피토프는 선형 및/또는 입체형태적일 수 있고, 즉 항원의 다양한 영역에서 2개 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이는 반드시 인접한 것일 필요는 없다.

"단편"은 예를 들어 무손상 또는 완전한 단백질, 예를 들어 ClpB 단백질보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 단백질, 예를 들어 ClpB 단백질의 일부 또는 영역을 지칭한다. 용어 "단편"은 추가로 예를 들어, 아미노산 서열, 예를 들어, 아미노산 서열 서열번호 1의 적어도 약 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800개 이상의 아미노산 부분을 지칭하며, 이 부분은 적어도 하나의 프로테아제에 의한 단백질 분해 절단에 의해 자연 발생 아미노산 서열로부터 절단되거나, 당업자에 공지된 화학적 방법에 의해 또는 재조합 DNA 기술에 의해 합성된 (예를 들어, 자연 발생 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로부터 발현된) 자연 발생 아미노산 서열의 일부이다. "단편"은 또한 특정 아미노산 서열, 예를 들어, 아미노산 서열 서열번호 1의 예를 들어 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 약 90% 약 95% 또는 약 99%의 일부분을 지칭할 수 있다.

2개 이상의 아미노산 서열의 서열 사이의 관계에 사용되는 경우, "동일성" 또는 "동일한"은 2개의 아미노산 잔기의 사슬 사이의 매치 수에 의해 결정되는 바와 같은 아미노산 서열 사이의 서열 관련성 정도를 지칭한다. "동일성"은 특정 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 처리되는 갭 정렬 (존재하는 경우)에 의에 2개 이상의 서열 중 더 작은 서열 간의 동일한 매치 퍼센트를 측정한다. 2개 이상의 서열의 동일성을 비교하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법은 다음에 제한되는 것은 아니나, 문헌[Arthur M. Lesk, Computational Molecular Biology: Sources and Methods for Sequence Analysis (New-York: Oxford University Press, 1988); Douglas W. Smith, Biocomputing: Informatics and Genome Projects (New-York: Academic Press, 1993); Hugh G. Griffin and Annette M. Griffin, Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 (New Jersey: Humana Press, 1994); Gunnar von Heinje, Sequence Analysis in Molecular Biology: Treasure Trove or Trivial Pursuit (Academic Press, 1987); Michael Gribskov and John Devereux, Sequence Analysis Primer (New York: M.　Stockton Press, 1991); and Carillo et al., 1988. SIAM J. Appl. Math. 48(5):1073-1082]에 기재된 것을 포함한다. 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험되는 서열 사이에 최대 매칭을 제공하도록 설계된다. 정체성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에 기재되어 있다. 2개의 서열 사이의 동일성을 결정하기 위한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP (문헌[Devereux et al., 1984. Nucl. Acid. Res. 12(1 Pt 1):387-395]; Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, TBLASTN 및 FASTA (문헌[Altschul et al., 1990. J. Mol. Biol. 215(3):403-410])를 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 포함한다. BLASTX 프로그램은 미국 국립 생물정보센터 (NCBI) 및 기타 출처 (BLAST Manual, 문헌[Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 1990. J. Mol. Biol. 215(3):403-410])로부터 공개적으로 이용 가능하다. Needleman-Wunsch 전체 정렬 알고리즘 (문헌[Needleman S.B. and Wunsch C.D., 1970. J. Mol. Biol. 48:443-453])을 사용함으로써, 전체 길이를 고려하여, 2개의 서열의 최적 정렬 (갭 포함)을 찾는 "바늘" 프로그램이 바람직하게 사용될 수 있다. 예를 들어 바늘 프로그램은 ebi.ac.uk 월드 와이드 웹 사이트에서 제공된다. 본 발명에 따른 동일성의 백분율은 바람직하게는 EMBOSS: 10.0과 동일한 "갭 오픈" 매개변수, 0.5와 동일한 "갭 연장" 매개변수 및 Blosum62 매트릭스의 바늘 (전체) 프로그램을 사용하여 계산된다. 또한 널리 공지되어 있는 Smith Waterman 알고리즘을 사용하여 동일성을 결정할 수 있다.

"비만"은 대상체가 바람직하게는 BMI가 30 초과인 의학적 질환을 지칭한다. "BMI"또는 "체질량 지수"는 대상체의 체질량을 그의 키의 제곱으로 나눈 값으로 규정된다. 의학에서 보편적으로 사용되는 공식은 kg/m²의 측정 단위를 생성한다. "중등도 비만" 대상체는 BMI가 30 내지 35인 대상체를 지칭한다. "비-비만" 대상체는 BMI가 30 미만인 대상체이다. "비-비만" 대상체는 따라서 정상 체중을 가질 수 있거나, 과체중일 수 있다. "정상 체중"은 본 명세서에서 18.5 내지 25의 BMI를 야기하는 체중을 지칭한다.

"과체중"은 25 내지 30의 BMI를 야기하는 체중을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 건강한 과체중 또는 합병증을 수반하지 않는 과체중 대상체이다. "건강한 과체중" 또는 "합병증을 수반하지 않는 과체중" 대상체는 본 명세서에서 그의 중량과 직접 관련된 임의의 질병 또는 질환을 나타내지 않는 과체중 대상체를 의미한다.

"약제학적으로" 또는 "약제학적으로 허용 가능한"은 대상체, 특히 인간에게 적절하게 투여되는 경우, 유해하거나, 알레르기성이거나, 다른 부적절한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 비 독성 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 캡슐화 물질 또는 임의의 유형의 제형화 보조제를 지칭한다. 본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 다음에 제한되는 것은 아니나, 이온 교환기, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예컨대, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 일부 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어 프로타민 술페이트,인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스계 물질 (예를 들어, 소듐 카복시메틸셀룰로스), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에서, 하기와 같은 활성 구성성분은 단독으로 또는 또 다른 활성 구성성분과 조합하여 동물 및 인간에게 통상적인 약제학적 지지체와의 혼합물로서 단위 투여 형태로 투여될 수 있다. 적합한 단위 투여 형태는 경구 경로 형태, 예컨대 정제, 겔 캡슐, 분말, 과립 및 경구 현탁액 또는 용액, 설하 및 협측 투여 형태, 에어로졸, 이식체, 피하, 경피, 국소, 복강내, 근육내, 정맥내, 피부하, 척수강내 및 비강내 투여 형태 및 직장 투여 형태를 포함한다. 바람직하게는, 약제학적 조성물은 주사 가능한 제형을 위한 약제학적으로 허용 가능한 비히클을 포함한다. 이는 특히 등장성, 멸균성, 식염수 용액 (인산나트륨 또는 인산이나트륨, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘 염화물 등 또는 이러한 염의 혼합물), 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가시 주사용 용액의 조제를 가능하게 하는 건조, 특히 동결 건조 조성물일 수 있다. 주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨유, 땅콩유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 이러한 형태는 멸균되어야 하고, 주사가 용이하도록 존재하는 정도로 유동적이어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건하에서 안정해야하며, 박테리아 및 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용에 대비하여 보존되어야 한다. 유리 염기 또는 약리학적으로 허용 가능한 염으로서 본 발명의 화합물을 포함하는 용액은 계면활성제, 예컨대 하이드록시프로필셀룰로스와 적절히 혼합된 물 중에서 제조될 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 및 오일 중에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건에서 이러한 제조물은 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 포함한다. 활성 구성성분은 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 산 부가 염 (단백질의 유리 아미노기로 형성됨)을 포함하고, 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 이러한 유기산에 의해 형성된다. 유리 카복실기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제2철 및 유기 염기, 예컨대 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래할 수 있다. 담체는 또한 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산시 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 야기될 수 있다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물 중 사용에 의해 야기될 수 있다. 멸균 주사용 용액은 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 구성성분을 포함하는 적절한 용매 중에 필요한 양의 활성 폴리펩타이드를 혼입시킨 후, 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 구성성분을 포함하는 멸균 비히클에 다양한 멸균 활성 구성성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이며, 이는 사전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 구성성분의 분말 및 임의의 추가의 적절한 구성성분을 생성한다. 제형화시, 용액은 투여 제형에 적합한 방식으로 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 상기 기재된 주사용 용액의 유형과 같은 다양한 투여 형태로 용이하게 투여되지만, 약제 방출 캡슐 등이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 수용액 중 비경구 투여의 경우, 용액은 필요에 따라 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 우선 충분한 식염수 또는 글루코스에 의해 등장액이 되도록 해야 한다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용에 비추어 당업자에게 인식될 것이다. 예를 들어, 1회 투여량을 등장성 NaCl 용액 1 mL에 용해시키고, 1000 mL의 피하 분해 유액에 첨가하거나, 제시된 주입 부위에 주사될 수 있다. 치료되는 대상체의 질환에 따라 투여량의 일정 변화가 반드시 이루어질 것이다. 임의의 경우, 투여 처치자는 개별 대상체의 적절한 투여량을 결정할 것이다.

"폴리펩타이드"는 통상적인 의미, 즉 100개 미만의 아미노산의 서열로서 사용된다. 폴리펩타이드는 일반적으로 단량체 물질을 지칭한다. 용어 "단백질"은 100개 초과의 아미노산의 서열 및/또는 다량체 물질을 지칭한다. 본 발명의 단백질은 특정 길이의 생성물로 제한되지 않는다. 이 용어는 단백질의 발현 후 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등뿐만 아니라, 당 업계에 공지된 자연 발생 및 비 자연 발생 두 경우 모두의 다른 변형를 지칭하거나 배제하지 않는다. 단백질은 전체 단백질 또는 그의 하위 서열일 수 있다. "단리된 단백질"은 자연 환경의 성분으로부터 동정 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 바람직한 실시형태에서, 단리된 단백질은

(1) 로우리 법 (Lowry method)에 의해 결정된 바와 같이, 단백질의 80, 85, 90, 95중량% 초과, 가장 바람직하게는 96, 97, 98 또는 99 중량% 초과;

(2) 회전 컵 배열 분석장치를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 획득하기에 충분한 정도; 또는

(3) 쿠마시 블루 (Coomassie blue) 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비 환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의한 균질성

으로 정제될 것이다.

단리된 단백질은 단백질의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내의 본래의 단백질을 포함한다. 그러나, 일반적으로 단리된 단백질은 적어도 1회의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"폴리펩타이드 유도체" 또는 "단백질 유도체"는 아미노기 (--NH--), 더욱 구체적으로 펩타이드 결합을 갖는 화합물을 지칭한다. 폴리펩타이드 및 단백질은 치환된 아미드화물로 간주될 수 있다. 아미드기와 마찬가지로, 펩타이드 결합은 높은 수준의 공명 안정화를 나타낸다. 펩타이드 연결에서 C--N 단일 결합은 통상적으로 약 40% 이중 결합 특성을 가지며, C=O 이중 결합은 약 40% 단일 결합 특성을 갖는다. "보호기"는 보호되지 않은 작용기를 포함하는 부적절한 반응 (예컨대, 단백 분해)을 방지하는 기이다. 아미노 보호기의 구체적인 예는 포르밀; 트리플루오로아세틸; 벤질옥시카보닐; 치환된 벤질옥시카보닐, 예컨대 (오르쏘- 또는 파라-) 클로로벤질옥시카보닐 및 (오르쏘- 또는 파라-) 브로모벤질옥시카보닐; 및 지방족 옥시카보닐, 예컨대 t-부톡시카보닐 및 t-아밀록시카보닐을 포함한다. 아미노산의 카복실기는 에스테르기로의 전환을 통해 보호될 수 있다. 에스테르기는 벤질 에스테르, 치환된 벤질 에스테르, 예컨대 메톡시벤질 에스테르; 알킬 에스테르, 예컨대 사이클로헥실 에스테르, 사이클로헵틸 에스테르 또는 t-부틸 에스테르를 포함한다. 구아니디노 모이어티는 보호기가 필요하지 않은 경우에도, 니트로; 또는 아릴술포닐, 예컨대 토실, 메톡시벤젠술포닐 또는 메시틸렌술포닐에 의해 보호될 수 있다. 이미다졸의 보호기는 토실, 벤질 및 디니트로페닐을 포함한다. 트립토판의 인돌기는 포르밀에 의해 보호될 수 있거나, 보호되지 않을 수 있다.

적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질의 변형은 특히 생체내에서의 수명을 개선하기 위한 것이다. 변형의 한 유형은 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 폴리펩타이드 또는 단백질의 N 또는 C 말단에 첨가하는 것이다. PEG는 높은 수용성, 용액 중 높은 이동성 및 낮은 면역원성과 같은 폴리펩타이드를 위한 이상적인 담체가 되도록 하는 많은 특성을 갖는 것으로 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 변형은 또한 폴리펩타이드 및 단백질을 엑소펩티다제로부터 보호하고, 따라서 생체내에서 그의 전반적인 안정성을 증가시킨다.

엔도펩티다제 또는 엑소펩티다제에 의한 폴리펩타이드 및 단백질의 분해를 방지하기 위해 사용되는 다른 변형은 폴리펩타이드 또는 단백질 내의 특정 부위에서의 N-말단 변형, 예컨대 아세틸화 또는 글리코실화, C-말단 변형, 예컨대 아미드화 및 비 천연 아미노산 (β-아미노 및 α-트리플루오로메틸 아미노산)의 사용을 포함한다.

폴리펩타이드 및 단백질 분자 크기를 증가시키는 또 다른 대안에는 인간 면역글로불린의 Fc 도메인 (예를 들어, IgA, IgM 및 IgG 포함)에의 폴리펩타이드의 유전자 융합 또는 알부민에의 폴리펩타이드의 융합이 있다.

"포만감"은 개체가 그의 욕구가 만족되거나 최소화되는 것을 느끼는 필수적 항상성 상태를 지칭한다. 많은 생리적 인자가 개체의 포만감에 관여하는 것으로 고려된다. 예를 들어, 위장의 충만감뿐만 아니라, 미각, 또는 맛, 후각 또는 냄새는 모두 개체의 "만족"감에 영향을 줄 수 있다. 더욱 특히, "포만감"은 추가의 식품 섭취가 억제되는 상태이며, 식사 사이의 시간 및 다음 식사에 섭취되는 식품의 양을 결정한다. "포만감 증대" 등은 대조군 상황과 비교하여, 포만감이 더 현저하고/거나 더 연장되는 의미를 갖는다.

"포만 상태"는 일반적으로 식사 섭취가 시작된 후 일정 기간 (예를 들어, 20 내지 30분) 내에 발생/관찰되는 식사 내 섭취를 종료하는 상태를 지칭한다. 따라서, 본 명세서에서 "포만 상태 유도" 등이 언급되는 경우, 이는 식사 동안 대상체가 식품 섭취를 중단하는 경향을 유발하는 의미를 갖는다. 포만 상태에 미치는 영향은 식사 종료 시점, 즉 식사 시작과 식사 종료 사이에 경과된 시간을 점수화함으로써 결정될 수 있다. 식사 종료시 섭취된 칼로리의 양이 예를 들어 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20% 이상인 경우와 같이, 대조군보다 유의하게 적은 경우, 포만 상태 효과가 도출된다. 또한 더 긴 기간 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5주 이상) 동안, 대조군 식이와 비교하여, 체중 감소 또는 체중 변화를 점수화할 수 있다. 규칙적인 양의 시험 조성물 (예를 들어, 1일 1회, 1일 2회 또는 그 이상)이 투여되는 대상체의 체중은 바람직하게는 대조군 대상체와 비교하여 유의하게 제어 (감소 또는 더 소폭 증가)된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "대조군 대상체"는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신이 투여되지 않은 대상체를 지칭한다.

"대상체"는 온혈 동물, 바람직하게는 인간, 애완동물 또는 가축을 지칭한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "애완동물" 및 "가축"은 다음에 제한되는 것은 아니나, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 돼지, 소, 양, 염소, 말 및 가금류를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 남성 또는 여성 대상체이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 성인 (예를 들어, 18세 초과의 대상체 [인간의 연령] 또는 생식 능력이 획득된 대상체)이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 소아 (예를 들어, 18세 미만의 대상체 [인간의 연령] 또는 생식 능력이 획득되기 이전의 대상체)이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 "환자", 즉 의학적 치료를 받기 위해 대기 중이거나, 받는 중이거나, 본 발명의 방법에 따른 의학적 절차와 같은 의학적 절차의 대상이었거나/이거나/이 될 예정이거나, 질병의 진행에 대해 모니터링되는 대상체일 수 있다.

"지속 방출"은 치료적 활성 제제가 혈액 수준 (의약품의 독성 수준보다 여전히 낮은 수준)이 연장된 기간 (예를 들어, 24시간 이상, 이에 의해 단일 투여량, 1일 투여 제형을 제공함) 동안 치료적으로 유리한 수준으로 유지될 수 있는 방식으로 제어된 속도로 조성물로부터 방출될 수 있음을 나타낸다.

"치료 유효량"은 다음의 양을 지칭한다:

대상체에 유의한 부적정인 효과 또는 부작용을 유발하지 않으면서, 유리한 효과 (예를 들어, 포만감 자극, 포만 상태 연장, 식품 섭취 감소, 중량 증가 제어, 특히 감소, 중량 손실 자극 및/또는 지방 중량 대 제지방 중량 비율 감소)를 달성하기에 충분한

적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질; 또는

본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 또는

본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 벡터.

본 발명과 관련하여, 대상체에 투여되는 폴리펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 양은 개체의 특성, 예컨대 일반적인 건강, 연령, 성별, 체중에 따라 달라질 것이다. 당업자는 이러한 인자 및 다른 인자에 따라 적절한 투여량을 결정할 수 있다.

"치료하는", "치료" 또는 "완화"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 지칭하고; 목적은 표적 질환 또는 장애를 예방 또는 지연 (감퇴)시키기 위한 것이다. 치료가 필요한 자는 이미 장애에 걸린 자뿐만 아니라, 장애에 걸리기 쉬운 자 또는 장애를 예방해야 하는 자들을 포함한다. 본 발명에 따른 제제의 치료량이 제공된 후, 대상체에서 다음의 것이 관찰 가능하고/거나, 측정 가능한 경우, 대상체 또는 포유류는 표적 질환 또는 장애에 대해 성공적으로 "치료"된 것이다: 포만 상태, 포만감 연장, 식품 섭취 감소, 중량 증가 제어, 중량 손실 자극 및/또는 지방 중량 대 제지방 중량 비율 감소. 질환 또는 장애의 성공적인 치료 및 개선을 평가하기 위한 이러한 매개변수는 의사에게 보편적인 통상적인 절차에 의해 용이하게 측정될 수 있다.

"변이체" 및 "돌연변이체"는 상호 혼용 가능한 용어이고, 하나 이상의 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입에 의해 본 명세서에 구체적으로 개시된 폴리펩타이드 또는 단백질과 통상적으로 상이한 폴리펩타이드 또는 단백질을 지칭한다. 이러한 변이체는 자연적으로 발생하거나, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질 서열을 변형시키고, 폴리펩타이드 또는 단백질의 하나 이상의 생물학적 활성을 평가하고/거나, 당 업계에 널리 공지된 다수의 기술 중 하나를 사용함으로써 합성에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩타이드 또는 단백질의 구조에 변형이 이루어질 수 있고, 여전히 적절한 특성을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 기능성 분자를 획득할 수 있다.

폴리펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열을 변경하여 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질의 균등물 또는 심지어 개선된 변이체 또는 일부분을 생성하는 것이 요망되는 경우, 당업자는 통상적으로 인코딩 DNA 서열의 하나 이상의 코돈을 변화시킬 것이다. 예를 들어, 야생형 단백질, 예를 들어 ClpB 단백질과 비교하여, 상당한 기능 손실 없이 단백질 구조에서 특정 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.

특정 아미노산 서열 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입이 폴리펩타이드 또는 단백질 서열, 및 물론 그의 기본 DNA 인코딩 서열에 이루어질 수 있고, 따라서 상이한 특성을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질을 획득할 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열, 또는 상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 해당 DNA 서열에서 이들의 생물학적 유용성 또는 활성을 현저하게 조절 (즉, 활성화/증대 또는 억제/손실)하는 다양한 변화가 이루어질 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 돌연변이는 다음에 제한되는 것은 아니나, 비-센스 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이 및 비-보존적 미스센스 돌연변이를 포함한다.

특정 아미노산 서열 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입이 폴리펩타이드 또는 단백질 서열, 및 물론 그의 기본 DNA 인코딩 서열에서 이루어질 수 있지만, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 폴리펩타이드 또는 단백질을 획득할 수 있다. 따라서, 폴리펩타이드 또는 단백질 서열, 또는 상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 해당 DNA 서열에서 생물학적 유용성 또는 활성의 현저한 손실 없이 다양한 변화가 이루어질 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 돌연변이는 다음에 제한되는 것은 아니나, 침묵 돌연변이, 침묵 미스센스 돌연변이 및 보존적 돌연변이를 포함한다.

용어 "변이체" 및 "돌연변이체"는 또한 하기 변형 중 하나 이상을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다:

ⅰ)하나 이상의 펩티딜 -C(O)NR-연결 (결합)이 비 펩티딜 연결, 예컨대 -CH₂-카바메이트 연결 (-CH₂OC(O)NR-), 포스포네이트 연결, -CH₂-술폰아미드 (-CH₂-S(O)₂NR-) 연결, 우레아 (-NHC(O)NH-) 연결, -CH₂-2차 아민 연결, 또는 알킬화 펩티딜 연결 (-C(O)NR-)로 대체된 폴리펩타이드 (R은 C₁-C₄알킬임);

ⅱ) N-말단이 -NRR₁ 기, -NRC(O)R 기, -NRC(O)OR 기, -NRS(O)₂R 기, -NHC(O)NHR 기로 유도체화된 폴리펩타이드 (R 및 R₁은 수소 또는 C₁-C₄ 알킬이며, 단 R 및 R₁ 둘 모두가 수소는 아님);

ⅲ) C 말단이 -C(O)R₂ (R₂는 C₁-C₄ 알콕시로 이루어진 군으로부터 선택됨), -NR₃R₄ (R₃ 및 R₄는 수소 및 C₁-C₄알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택됨)로 유도체화된 폴리펩타이드.

"야생형"은 자연 발생 공급원으로부터 단리된 유전자 또는 단백질의 특성을 갖는 유전자 또는 단백질을 지칭한다. 야생형 유전자 또는 단백질은 집단 내에서 가장 빈번하게 관찰되는 것이며, 따라서 "변이체" 또는 "돌연변이체"와 달리 유전자 또는 단백질의 "야생형" 형태로 임의로 지칭된다.

상세한 설명

본 발명은 따라서 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 적어도 15개의 아미노산 길이를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 적어도 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100개 이상의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 100, 75, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 또는 16개 미만의 아미노산 길이를 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 4 내지 100개 이상의 아미노산, 10 내지 80개의 아미노산, 15 내지 70개의 아미노산, 20 내지 60개의 아미노산, 25 내지 50개의 아미노산, 30 내지 45개의 아미노산, 또는 35 내지 40개의 아미노산을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 10 내지 100개의 아미노산, 또는 10 내지 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 또는 15개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 15 내지 100개의 아미노산, 또는 15 내지 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 또는 20개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 20 내지 100개의 아미노산, 또는 20 내지 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 또는 25개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 25 내지 100개의 아미노산, 또는 25 내지 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 또는 30개의 아미노산을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100개의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 15개 미만의 아미노산을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 15개의 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 20개 미만의 아미노산을 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 적어도 20개의 아미노산을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 적어도 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600개 이상의 아미노산 길이를 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 100 내지 1500개 이상의 아미노산, 100 내지 1000개의 아미노산, 100 내지 900개의 아미노산, 100 내지 850 아미노산, 100 내지 800개의 아미노산, 100 내지 750개의 아미노산, 또는 100 내지 700개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 150 내지 1500, 1000, 900, 850, 800, 750 또는 700개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 200 내지 1500, 1000, 900, 850, 800, 750 또는 700개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 단백질은 300 내지 1500, 1000, 900, 850, 800, 750 또는 700개의 아미노산을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 15 내지 1500개 이상의 아미노산, 15 내지 1000개의 아미노산, 15 내지 900개의 아미노산, 15 내지 800개의 아미노산, 15 내지 700개의 아미노산, 15 내지 600개의 아미노산, 또는 15 내지 500개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 20 내지 1500, 1000, 900, 800, 700, 600 또는 500개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 25 내지 1500, 1000, 900, 800, 700, 600 또는 500개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 30 내지 1500, 1000, 900, 800, 700, 600 또는 500개의 아미노산을 포함한다.

본 발명에 따른 ClpB 단백질은 Hsp100/ClpB 부류의 6량체 AAA+-ATPase의 일원인 카제인 분해 프로테아제 B 단백질을 지칭한다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 ClpB 단백질은 박테리아 ClpB 단백질이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 ClpB 단백질은 장내세균과 단백질이다. 장내세균과는 다음에 제한되는 것은 아니나, 아세노포누스 (Arsenophonus), 브렌네리아 (Brenneria), 부크네라 (Buchnera), 부드비키아 (Budvicia), 부티아욱셀라 (Buttiauxella), 세데세아 (Cedecea) 시트로박터 (Citrobacter) 코센자에아 (Cosenzaea), 크로노박터 (Cronobacter), 디케이아 (Dickeya), 에드와르드시엘라 (Edwardsiella), 덴테로바실루스 (Enterobacillus), 엔테로박터 (Enterobacter), 에위니아 (Erwinia), 에쉐리키아 (Escherichia), 에윙엘라 (Ewingella), 프란코니박터 (Franconibacter), 깁시엘라 (Gibbsiella) 하프니아 (Hafnia), 이자키엘라 (Izhakiella), 코사코니아 (Kosakonia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 클루이베라 (Kluyvera), 베클레시아 (Leclercia), 렐리오티아 (Lelliottia), 레미노렐라 (Leminorella), 레비네아 (Levinea), 론스달레아 (Lonsdalea), 망로비박터 (Mangrovibacter), 모엘레렐라 (Moellerella), 모가넬라 (Morganella), 오베숨박테리움 (Obesumbacterium), 판토에아 (Pantoea), 펙토박테리움 (Pectobacterium), 파세올리박터 (Phaseolibacter), 파토합두스 (Photorhabdus), 플레시오모나스 (Plesiomonas), 플루랄리박터 (Pluralibacter), 프라기아 (Pragia), 프로테우스 (Proteus), 프로비덴시아 (Providencia), 슈도시트로박터 (Pseudocitrobacter), 라넬라 (Rahnella), 라오울텔라 (Raoultella), 로센베기엘라 (Rosenbergiella), 로욱시엘라 (Rouxiella), 사카로박터 (Saccharobacter), 살모넬라 (Salmonella), 삼소니아 (Samsonia), 세라티아 (Serratia), 쉬겔라 (Shigella), 쉼웰리아 (Shimwellia), 시키박터 (Siccibacter), 소달리스 (Sodalis), 타우멜라 (Tatumella), 토셀리아 (Thorsellia), 트라불시엘라 (Trabulsiella) 위글레스와티아 (Wigglesworthia), 제노합두스 (Xenorhabdus), 예시니아 (Yersinia) 및 요케넬라 (Yokenella)를 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 ClpB 단백질은 하프니아, 바람직하게는 하프니아 알베이 (서열번호 1)로부터의 ClpB이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 ClpB 단백질은 E. 콜라이, 바람직하게는 E. 콜라이 K12 (서열번호 21)로부터의 ClpB이다.

하프니아 알베이에서, 샤프롱 단백질 ClpB는 857개의 아미노산의 단백질이다. 일 실시형태에서, ClpB 단백질은 서열번호 1 (GenBank 참조 번호: KIC99545.2)에 제시된 바와 같은 하프니아 알베이로부터의 샤프롱 단백질 ClpB의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, ClpB의 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 약 95 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 본 출원과 관련하여, 전체 정렬을 사용하여 동일성 백분율을 계산한다 (즉, 2개의 서열을 그의 전체 길이에 걸쳐 비교함).

서열번호 1

MRLDRLTSKFQLALADAQSLALGRDNQFIEPVHLMSALLNQDGGTVRPLLTSAGVNTASLRQELEQAISRLPQVEGAGGDVQPSNELIRVLNLCDKLAQKRNDTFISSELFVLAVLEDRGNLGDILKAAGANVQKVSTAIEQMRGGEKVDDANAEDQRQALKKYTVDLTERAEQGKLDPVIGRDEEIRRTIQVLQRRTKNNPVLIGEPGVGKTAIVEGLAQRIINGEVPEGLKNKRVLSLDMGSLIAGAKFRGEFEERLKAVLSDLSKQEGNVILFIDELHTMVGAGKGDGAMDAGNMLKPALARGELHCVGATTLDEYRQYIEKDAALERRFQKVFVAEPTVEDTIAILRGLKERYELHHHVQITDPAIVAAANLSHRYIADRQLPDKAIDLIDEAASSIRMQMDSKPESLDRLERRIIQLKLEQQALNKESDEASKKRLEMLNEELEHKEREYSELEEEWKAEKASLSGTQNIKAEIEQAKIALEQARRVGDLAKMSEIQYGKLPGLEKQLEAATQSEGKTMKLLRNKVTDVEIAEVLARWTGIPVSRMLESERAKLLRMEDDLHERVIGQNEAVEAVSNAIRRSRAGLSDPNRPIGSFLFLGPTGVGKTELCKALANFLFDSDDAMVRIDMSEFMEKHSVSRLVGAPPGYVGYEEGGYLTEAVRRRPYSVILLDEVEKAHPDVFNILLQVLDDGRLTDGQGRTVDFRNTVVIMTSNLGSDLIQDRFGQLDYGEMKELVMSVVSHHFRPEFINRIDETVVFHPLDQKNIKAIARIQLERLYQRLEEKGYSVTITDAALEQLSKAGFDPVYGARPLKRAIQQEIENPLAQQILSGKLIPGKDITLDVADEQIVAKQ

E. 콜라이 K12에서, 샤프롱 단백질 ClpB는 857개의 아미노산의 단백질이다. 일 실시형태에서, ClpB 단백질은 서열번호 21 (GenBank 참조 번호: BAA16476.1)에 제시된 바와 같은 E. 콜라이 K12로부터의 샤프롱 단백질 ClpB의 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, ClpB의 아미노산 서열은 서열번호 21의 아미노산 서열과 적어도 약 95 내지 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 본 출원과 관련하여, 전체 정렬을 사용하여 동일성 백분율을 계산한다 (즉, 2개의 서열을 그의 전체 길이에 걸쳐 비교함).

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 ClpB 단백질은 ClpB 변이체이다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 ClpB 변이체는 아미노산 서열 서열번호 1과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다.

ClpB 변이체는 추가로 또는 대안적으로 비보존적 변화를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 변이체 폴리펩타이드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 첨가에 의해 천연 서열과 상이하다. 변이체는 또한 (또는 대안적으로) 예를 들어 폴리펩타이드의 면역원성, 이차 구조 및 친수성에 최소한의 영향을 주는 아미노산의 결실 또는 첨가에 의해 변형될 수 있다.

일 실시형태에서, 서열번호 1의 변이체는 이를 필요로 하는 대상체에서 서열번호 1 중 하나와 적어도 동등한 효율로 포만 상태를 유도하고, 포만감을 연장하고, 식품 섭취를 감소시키고, 중량 증가를 제어하고, 중량 손실을 자극하고/거나, 지방 중량 대 제지방 중량 비율을 감소시키는 것을 수행할 수 있다.

일 실시형태에서, 서열번호 1의 변이체는 서열번호 1의 서열과 비교하여, 보존적 아미노산 치환, 예컨대, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 서열번호 1의 변이체는 폴리펩타이드이고, 서열번호 1의 서열로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산이 부재하거나, 임의의 아미노산으로 치환되거나, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 아미노산 (인접하거나, 인접하지 않음)이 첨가된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 적어도 ClpB의 단편, 바람직하게는 적어도 아미노산 서열 서열번호 1을 갖는 ClpB의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 ClpB 단백질의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100개 이상의 아미노산, 바람직하게는 아미노산 서열 서열번호1을 갖는 ClpB를 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 최대한 100, 75, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10개 미만의 아미노산 길이를 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 4 내지 100개 이상의 아미노산, 10 내지 80개의 아미노산, 15 내지 70개의 아미노산, 20 내지 60개의 아미노산, 25 내지 50개의 아미노산, 30 내지 45개의 아미노산, 또는 35 내지 40개의 아미노산을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, ClpB 단편은 4 내지 80개의 아미노산, 또는 4 내지 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, ClpB 단편은 6 내지 100개의 아미노산, 또는 6 내지 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, ClpB 단편은 8 내지 100개의 아미노산, 또는 8 내지 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 또는 10 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, ClpB 단편은 10 내지 100 아미노산, 또는 10 내지 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 또는 15개의 아미노산을 포함한다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산이다. 또 다른 실시형태에서, ClpB 단편은 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 또는 100개의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어진다.

또 다른 실시형태에서, ClpB 단편은 100 내지 500개 이상의 아미노산, 100 내지 400개의 아미노산, 100 내지 300개의 아미노산, 100 내지 200개의 아미노산, 또는 100 내지 150개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, ClpB 단편은 150 내지 500개 이상의 아미노산, 150 내지 400개의 아미노산, 150 내지 300개의 아미노산, 또는 150 내지 200개의 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, ClpB 단편은 100 내지 350개의 아미노산, 150 내지 300개의 아미노산, 또는 200 내지 250개의 아미노산을 포함한다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 100, 125, 150, 175, 200, 250, 또는 300개의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어진다. 또 다른 실시형태에서, ClpB 단편은 220개의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, ClpB 단편은 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 또는 230개의 아미노산을 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100개 이상의 아미노산 잔기를 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100개 이상의 인접 아미노산 잔기를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100개 이상의 비인접 아미노산 잔기를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 5개의 비인접 아미노산 잔기를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 6개의 비인접 아미노산 잔기를 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, 본 발명의 ClpB 단편은 음으로 하전된 잔기 및 2개의 연속 Arg 및 Trp 잔기를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 ClpB 단편은 연속 Arg 및 Trp 잔기 및 연속 Arg 및 Trp 잔기 상류의 음으로 하전된 잔기를 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 ClpB 단편은 적어도 연속 Arg 및 Trp 잔기의 상류의 음으로 하전된 잔기를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은, 용어 "연속 Arg 및 Trp 잔기의 상류"는 Arg 잔기로부터의 위치 -1, -2, -3, -4 또는 -5를 의미한다. 즉, 일 실시형태에서, 연속 Arg 및 Trp 서열의 Arg 잔기는 음으로 하전된 잔기로부터의 위치 +1, +2, +3, +4 또는 +5이다.

일 실시형태에서, 음으로 하전된 잔기는 Glu 또는 Asp 잔기이다. 특정 실시형태에서, 음으로 하전된 잔기는 Glu 잔기이다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 아미노산 잔기 E538을 포함한다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 아미노산 잔기 R542 및/또는 W543을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 아미노산 잔기 R542 및 W543을 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1의 적어도 아미노산 잔기 E538, R542 및 W543을 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 2를 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 2

E/D-X_2-4-R-W

여기서, X는 임의의 아미노산이고, X_2-4는 2, 3 또는 4개의 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 E/D는 E이다.

또 다른 특정 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 3을 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 3

E/D-V-X-X-R-W

여기서, X는 임의의 아미노산, 바람직하게는 E/D는 E이다.

또 다른 특정 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 4를 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 4

E/D-V-L-A-R-W

바람직한 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 5를 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 5

E-V-L-A-R-W

특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 아미노산 서열 서열번호 2, 3, 4 또는 5를 포함하고, 적어도 15개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산의 길이를 갖는다.

일 실시형태에서, 본 발명의 ClpB 단편은 서열 GKPV와 적어도 75% 서열 상동성을 갖는 서열을 추가로 포함한다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 아미노산 잔기 G545, P547 및/또는 V548을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 아미노산 잔기 G545, I546, P547 및/또는 V548을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 아미노산 잔기 G545, I546, P547 및 V548을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 아미노산 잔기 E538, R542, W543, G545, P547 및 V548을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 ClpB 단편은 서열번호 1 또는 그의 변이체의 적어도 아미노산 잔기 E538, R542, W543, G545, I546, P547 및 V548을 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 6을 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 6

E/D-X_2-4-R-W-X-G-X-P-V

여기서, X는 임의의 아미노산이고, X_2-4는 2, 3 또는 4개의 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 E/D는 E이다이다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 7을 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 7

E/D-X_2-4-R-W-X-G-I/K-P-V

여기서, X는 임의의 아미노산이고, X_2-4는 2, 3 또는 4개의 임의의 아미노산이다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 8을 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 8

E-X_2-4-R-W-X-G-I/K-P-V

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 9를 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 9

E-X_2-4-R-W-X-G-I-P-V

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 10을 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 10

E-X_2-4-R-W-T-G-I-P-V

여기서, X_2-4는 2, 3 또는 4개의 임의의 아미노산이다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 11을 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 11

E-V-X-X-R-W-T-G-I-P-V

여기서, X는 임의의 아미노산이다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 12를 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 12

E-V-L-A-R-W-T-G-I-P-V

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 13을 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 13

E-X_2-4-R-W-X-G-K-P-V

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 14를 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 14

E-X_2-4-R-W-T-G-K-P-V

여기서, X_2-4는 2, 3 또는 4개의 임의의 아미노산이다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 15를 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 15

E-V-X-X-R-W-T-G-K-P-V

여기서, X는 임의의 아미노산이다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 16을 포함하거나, 이로 이루어진다.

서열번호 16

E-V-L-A-R-W-T-G-K-P-V

특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 아미노산 서열 서열번호 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16을 포함하고, 적어도 15개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 20개의 아미노산의 길이를 갖는다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열 538 내지 548 (EVLARWTGIPV, 서열번호 12)과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 12를 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열 536 내지 548 (IAEVLARWTGIPV, 서열번호 18)과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 18을 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 21의 아미노산 서열 534 내지 548 (AEIAEVLARWTGIPV, 서열번호 19)과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 19를 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 1의 아미노산 서열 534 내지 548 (VEIAEVLARWTGIPV, 서열번호 17)과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 17을 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, ClpB 단편은 서열번호 21의 아미노산 서열 537 내지 756 (서열번호 22)과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, ClpB 단편은 아미노산 서열 서열번호 22를 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질은 ClpB 단백질의 아미노산 서열로 이루어지지 않는다. 즉, 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질은 전장 ClpB 단백질이 아니다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열은 ClpB 서열과 100% 동일하지 않다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호1과 100% 동일하지 않고/거나, 서열번호21과 100% 동일하지 않다.

일 실시형태에서, 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질은 α-MSH의 아미노산 서열로 이루어지지 않는다. 특정 실시형태에서, 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질은 서열번호20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열로 이루어지지 않는다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체는 α-MSH (서열번호 20)와 상동성을 갖는다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체는 α-MSH와 입체형태적 상동성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체는 α-MSH와 서열 상동성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체는 α-MSH와 입체형태적 및 서열 상동성을 갖는다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체는 항-α-MSH 항체에 의해 인식된다. 즉, 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체는 항-α-MSH 항체의 에피토프로서 기능한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체는 항-α-MSH 항체의 입체형태적 에피토프로서 기능한다.

일 실시형태에서, 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질은 폴리펩타이드 유도체이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체는 당 업계에 널리 공지된 수단, 예를 들어 포스페이트, 아세테이트, 지질 또는 탄수화물 기와 같은 하나 이상의 작용기를 첨가하고/거나, 하나 이상의 보호기를 첨가함으로써 변형된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체는 포스페이트, 아세테이트 또는 다양한 지질 및 탄수화물과 같은 하나 이상의 작용기의 첨가에 의해 변형될 수 있다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체는 당 업계에 널리 공지된 바와 같이 화학적 합성 또는 효소 합성에 의한 합성에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 단백질 발현 벡터에 도입시켜, 적합한 숙주 유기체 (예를 들어, 박테리아, 곤충 세포 등)에서 생성시킨 후 정제할 수 있다. 일 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체는 예를 들어, 당 업계에 공지된 임의의 생성 시스템, 예를 들어 E. 콜라이, 효모, 바큘로바이러스-곤충 세포, 또는포유류 세포, 예컨대 HEK 또는 CHO 발현 시스템을 사용하여 클로닝 방법에 의해 획득된다.

폴리펩타이드를 정제 또는 동정 또는 정제하기 위해 추가 폴리펩타이드 ("태그")가 첨가될 수 있다. 단백질 태그에 의해, 예를 들어, 폴리펩타이드를 높은 친화도로 매트릭스에 흡착시킬 수 있고, 이어서 임의의 상당한 정도로 복합체가 용리되지 않도록 하면서 매트릭스를 적합한 완충액으로 엄격하게 세척할 수 있고, 후속하여, 흡착된 복합체를 선택적으로 용리시킬 수 있다. 당업자에 공지된 단백질 태그의 예는 (His)₆ 태그, Myc 태그, FLAG 태그, 헤마글루티닌 (hemagglutinin) 태그, 글루타티온 트랜스퍼라제 (glutathione transferase) (GST) 태그, 친화도 키틴 결합 태그를 갖는 인테인 (intein) 또는 말토스-결합 단백질 (MBP) 태그이다. 이들 단백질 태그는 N-말단, C-말단 및/또는 내부에 위치할 수 있다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 DNA이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 예를 들어, 전령 RNA (mRNA)의 형태의 RNA이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 단일 가닥이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산은 이중 가닥이다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하거나, 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산을 포함하는 벡터이다.

벡터의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 플라스미드, 박테리오파지, 바이러스, 양이온 소포 또는 임의의 다른 유형의 벡터를 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 발현 벡터이다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 조성물이다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 의약품이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 조성물 또는 의약품은 본 발명 폴리펩타이드, 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 또는 벡터의 치료 유효량을 포함한다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 그의 변이체, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터를 포함하는 백신이다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 백신은 과체중 및/또는 비만 관련 질병 및 장애의 예방에 사용하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ClpB 단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 아미노산 서열 서열번호2를 포함하는 ClpB 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 식이 보충제 또는 단백질 식이 보충제이다.

본 발명의 또 다른 대상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 ClpB 단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 아미노산 서열 서열번호2를 포함하는 ClpB 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 식품 조성물이다.

일 실시형태에서, 식이 보충제 또는 식품 조성물은 본 발명에 따른 ClpB 단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질의 약 1% 내지 약 80중량%를 포함하거나, 이로 이루어진다. 일 실시형태에서, 식이 보충제 또는 식품 조성물은 본 발명에 따른 ClpB 단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 또는 단백질의 약 1% 내지 약 50중량%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 25중량%를 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, 식이 보충제 또는 식품 조성물은 본 발명에 따른 ClpB 단백질의 단편을 포함하는 폴리펩타이드의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80중량% 이상을 포함하거나, 이로 이루어진다.

일 실시형태에서, 본 발명의 식이 보충제 또는 식품 조성물은 특히 단순 및/또는 복합 탄수화물, 지질, 섬유, 또는 미네랄로부터 선택되는 적어도 하나의 추가의 구성성분을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 식이 보충제 또는 식품 조성물은 적어도 하나의 필수 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 상기 적어도 하나의 필수 아미노산는 단리되거나 유리되어 있으며, 즉 단백질 사슬에 결합되어 있지 않다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 식이 보충제 또는 식품 조성물은 무수 분말 또는 물 또는 수분을 포함하는 분말의 형태이다.

일 실시형태에서, 식이 보충제 또는 식품 조성물은 담체 또는 비히클을 추가로 포함한다. "담체" 또는 "비히클"은 투여에 적합한 물질을 의미하고, 예를 들어, 비 독성이고, 조성물의 임의의 성분, 특히 박테리아 균주와 유해한 방식으로 상호작용하지 않는 임의의 액체, 겔, 용매, 액체 희석제, 가용화제 등과 같은 당 업계에 공지된 이러한 임의의 물질을 포함한다. 영양적으로 허용 가능한 담체의 예는 예를 들어 물, 염 용액, 알콜, 실리콘, 왁스, 페트로리움 젤리, 식물성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 리포솜, 당, 젤라틴, 락토스, 아밀로스, 스테아르산마그네슘, 탈크, 계면활성제, 규산, 점성 파라핀, 향유, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세리드, 페트로에트랄 지방산 에스테르, 하이드록시메틸-셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 식이 보충제 또는 식품 조성물은 일정량의 식이 섬유를 포함한다. 식이 섬유는 효소에 의해 분해되지 않은 소장을 통과하고, 천연 증량제 및 완하제로서 기능한다. 식이 섬유는 가용성 또는 불용성일 수 있으며, 일반적으로 두 유형의 블렌드가 바람직하다. 식이 섬유의 적합한 공급원은 대두, 완두콩, 귀리, 펙틴, 구아검, 아라비아검, 프락토올리고당, 갈락토 올리고당, 시알릴 락토스 및 동물성 우유로부터 유래된 올리고당을 포함한다. 일부 실시형태에서, 식이 섬유는 만난 중에서 선택된다. 구아검, 메뚜기콩검, 곤약 및 잔탄검과 같은 만난 (예를 들어, 글루코만난 및 갈락토만난)은 일부 식물 세포벽에 존재한다. 글루코만난은 일반적으로 (1-4)-β-연결된 글루코스 및 만노스 단위로 구성되며, 갈락토만난은 일반적으로 (1-6)-α-갈락토스의 단일 단위로 치환된 (1-4)-β-만난 백본으로 구성된다. 구아 및 메뚜기콩과 같은 많은 배젖 콩과 식물은 종자 발달 중에 배젖에 갈락토만난을 포함한다. 글루코만난은 또한 곡물 알곡의 소량의 성분으로 존재한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 식이 보충제 또는 식품 조성물은 USRDA와 같은 정부 기관의 권고에 따라 미네랄 및 미량 영양소, 예컨대 미량 원소 및 비타민을 포함한다. 예를 들어, 조성물은 1일 투여량당 다음의 소정 범위의 미량 영양소 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 300 내지 500 mg 칼슘, 50 내지 100 mg 마그네슘, 150 내지 250 mg 인, 5 내지 20 mg 철, 1 내지 7 mg 아연, 0.1 내지 0.3 mg 구리, 50 내지 200 μg 요오드, 5 내지 15 μg 셀레늄, 1000 내지 3000 μg 베타 카로틴, 10 내지 80 mg 비타민 C, 1 내지 2 mg 비타민 B1, 0.5 내지 1.5 mg 비타민 B6, 0.5 내지 2 mg 비타민 B2, 5 내지 18 mg 니아신, 0.5 내지 2.0 μg 비타민 B12, 100 내지 800 μg 엽산, 30 내지 70 μg 비오틴, 1 내지 5 μg 비타민 D, 3 내지 10 μg 비타민 E.

일 실시형태에서, 본 발명의 식이 보충제 또는 식품 조성물은 유화제를 추가로 포함한다. 식품 등급 유화제의 예는 통상적으로 모노- 및 디-글리세리드, 레시틴 및 모노- 및 디-글리세리드의 디아세틸 타르타르산 에스테르을 포함한다. 유사하게, 적합한 염 및 안정화제가 포함될 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 식이 보충제 또는 식품 조성물은 식이 식품의 제조에 사용될 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 식이 보충제 또는 식품 조성물은 1일 식사에 도입시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 염증을 치료하기 위한 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 백신, 약제학적 조성물 또는 의약품에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 대상은 이를 필요로 하는 대상체에서 염증을 치료하기 위한 방법으로서, 대상체에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 백신, 약제학적 조성물 또는 의약품의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 의미 내에서, "염증"은 문헌[Dorland's Medical Dictionary, "a localized protective response, elicited by injury or destruction of tissues, which serves to destroy, dilute or wall off both the injurious agent and the injured tissue"]에 규정된 바와 같은 의미이다. 이는 미세혈관계의 천공, 간질성 공간으로의 혈액 요소의 누출 및 염증 조직으로의 백혈구의 이동을 특징으로 한다. 거시적 수준에서 이는 일반적으로 홍반, 부종, 통각과민 (압통) 및 통증의 보편적인 임상 징후를 동반한다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 백신, 약제학적 조성물 또는 의약품은 염증의 치료에 사용하기 위한 것이며, 상기 염증은 비만, 비만 관련 질병 또는 장애, 신경염증, 다발성 경화증, 죽상경화증, 알레르기, 강직성 척추염, 관절염 (골관절염, 류머티스 관절염 또는 건선성 관절염), 천식, 이식편대숙주 질병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 크론병, 대장염, 피부염, 게실염, 섬유근육통, 간염, 과민성 대장 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 신염 및 궤양성 대장염을 포함하는 군으로부터 선택된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 염증은 급성 염증이다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 염증은 만성 염증이다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 백신, 약제학적 조성물 또는 의약품은 염증의 치료에 사용하기 위한 것이며, 상기 염증은 비만, 비만 관련 질병 또는 장애, 신경염증, 다발성 경화증, 건선, 알레르기성 비염, 골관절염 및 신경염증성 질병을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 백신, 약제학적 조성물 또는 의약품은 염증의 치료에 사용하기 위한 것이며, 상기 염증은 비만, 신경염증, 다발성 경화증, 건선, 알레르기성 비염, 골관절염 및 신경염증성 질병을 포함하거나 이로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 대상은 이를 필요로 하는 대상체에서 비만의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명에 따른 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 백신, 약제학적 조성물 또는 의약품에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 대상은 이를 필요로 하는 대상체에서 비만을 치료하거나, 예방하기 위한 방법으로서, 대상체에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 백신, 약제학적 조성물 또는 의약품의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 과체중 및/또는 비만 관련 질병 및 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 백신, 약제학적 조성물 또는 의약품에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 과체중 및/또는 비만 관련 질병 및 장애를 치료하거나, 예방하기 위한 방법으로서, 대상체에 본 명세서의 상기에 기재된 바와 같은 적어도 ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하거나, 이로 이루어진 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 백신, 약제학적 조성물 또는 의약품의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

과체중 및/또는 비만 관련 질병 및 장애는 다음에 제한되는 것은 아니나, 고혈압, 당뇨병 (특히, 제2형 당뇨병), 글루코스 불내성, 인슐린 저항성, 심혈관계 질병 (예컨대, 동맥경화증, 관상동맥 질병, 협착 동맥, 협심증, 심장마비, 혈전), 고콜레스테롤, 지방간 질병, 간 지방증, 담석증, 관절 문제, 골관절염, 정형외과적 문제, 균형 장애, 피부 질환, 수면 무호흡증, 호흡기 문제, 천식, 심한 코골이, 암 (유방암, 결장암, 담낭암, 자궁암, 결장암 및 전립선암 포함), 대사 증후군, 생리 이상 및 사회심리적 영향을 포함한다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 포만 상태를 유도하기 위한 방법으로서, 대상체에 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 포만 상태를 유도하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 대상체에서 포만 상태를 유도하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 비 치료적 용도에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 포만감을 연장시키기 위한 방법으로서, 대상체에 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 포만감을 연장시키기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 대상체에서 포만감을 연장시키기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 비치료적 용도에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 포만감의 연장은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 특정 실시형태에서, 포만감의 연장은 식사 사이의 경과 시간, 바람직하게는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전에 식사 사이의 경과 시간의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 일 실시형태에서, 포만감의 연장은 적어도 15%, 20% 또는 25%이다. 특정 실시형태에서, 포만감의 연장은 식사 사이의 경과 시간, 바람직하게는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전에 식사 사이의 경과 시간의 적어도 15%, 20% 또는 25%이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 식사 규모를 감소시키기 위한 방법으로서, 대상체에 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 식사 규모를 감소시키기 위해 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 대상체에서 식사 규모를 감소시키기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 비치료적 용도에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 식사 규모의 감소는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 특정 실시형태에서, 식사 규모의 감소는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전의 식사 규모의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 일 실시형태에서, 식사 규모의 감소는 적어도 15%, 20% 또는 25%이다. 특정 실시형태에서, 식사 규모의 감소는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전의 식사 규모의 적어도 15%, 20% 또는 25%이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 식품 섭취를 감소시키기 위한 방법으로서, 대상체에 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 식품 섭취를 감소시키기 위해 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 대상체에서 식품 섭취를 감소시키기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 비치료적 용도에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 식품 섭취의 감소는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 특정 실시형태에서, 식품 섭취의 감소는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전의 식품 섭취의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 일 실시형태에서, 식품 섭취의 감소는 적어도 15%, 20% 또는 25%이다. 특정 실시형태에서, 식품 섭취의 감소는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전의 식품 섭취의 적어도 15%, 20% 또는 25%이다.

본 발명의 일 양상은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 중량 증가를 제어, 특히 감소시키기 위한 방법으로서, 대상체에 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 중량 증가를 제어, 특히 감소시키기 위해 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 대상체에서 중량 증가를 제어, 특히 감소시키기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 비치료적 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 일 양상은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 중량 손실을 자극하기 위한 방법으로서, 대상체에 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 중량 손실을 자극하기 위해 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 대상체에서 중량 손실을 자극하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 비치료적 용도에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 중량 손실의 자극은 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 특정 실시형태에서, 중량 손실의 자극은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전의 대상체의 중량 손실의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 일 실시형태에서, 중량 손실의 자극은 적어도 15%, 20% 또는 25%이다. 특정 실시형태에서, 중량 손실의 자극은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전의 대상체의 중량 손실의 적어도 15%, 20% 또는 25%이다.

본 발명의 추가의 일 양상은 또한 이를 필요로 하는 대상체에서 중량을 감소시키기 위한 방법으로서, 대상체에 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 중량을 감소시키기 위해 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 대상체의 중량을 감소시키기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 비치료적 용도에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 중량의 감소는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 특정 실시형태에서, 중량의 감소는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전의 대상체의 체중의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 일 실시형태에서, 중량의 감소는 적어도 15%, 20% 또는 25%이다. 특정 실시형태에서, 중량의 감소는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전의 대상체의 체중의 적어도 15%, 20% 또는 25%이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체에서 지방 중량 대 제지방 중량 비율을 감소시키기 위한 방법으로서, 대상체에 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 이를 필요로 하는 대상체, 특히 비만 대상체에서 지방 중량 대 제지방 중량 비율을 감소시키기 위해 사용하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 양상은 대상체, 특히 정상 중량 또는 합병증을 수반하지 않는 과체중인 대상체에서 지방 중량 대 제지방 중량 비율을 감소시키기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 조성물, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 비치료적 용도에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 지방 중량 대 제지방 중량 비율의 감소는 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 특정 실시형태에서, 지방 중량 대 제지방 중량 비율의 감소는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전의 대상체의 지방 중량 대 제지방 중량 비율의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% 또는 10%이다. 일 실시형태에서, 지방 중량 대 제지방 중량 비율의 감소는 적어도 15%, 20% 또는 25%이다. 특정 실시형태에서, 지방 중량 대 제지방 중량 비율의 감소는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 전의 대상체의 지방 중량 대 제지방 중량 비율의 적어도 15%, 20% 또는 25%이다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 용도는 미용 용도이다.

일 실시형태에서, 대상체는 여성이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 남성이다.

일 실시형태에서, 대상체는 소아, 예컨대 18세 미만의 각각의 연령의 소아이다 (인간의 연령). 또 다른 실시형태에서, 대상체는 성인, 예컨대 18세 이상의 각각의 연령의 성인이다 (인간의 연령).

일 실시형태에서, 대상체는 비만이다. 일 실시형태에서, 대상체는 30 초과의 체질량 지수 (BMI)를 갖는다.

일 실시형태에서, 대상체는 중등도의 비만이다. 일 실시형태에서, 대상체는 약 30 내지 약 35의 범위의 BMI를 갖는다. 일 실시형태에서, 대상체는 중증 비만이다. 일 실시형태에서, 대상체는 약 35 내지 약 40의 범위의 BMI를 갖는다. 일 실시형태에서, 대상체는 질병 동반 비만이다. 일 실시형태에서, 대상체는 약 40 내지 약 50 이상의 범위의 BMI를 갖는다.

일 실시형태에서, 대상체는 비만이 아니다. 일 실시형태에서, 대상체는 30 미만의 BMI를 갖는다. 일 실시형태에서, 대상체는 과체중이다. 따라서, 일 실시형태에서, 대상체는 약 25 내지 약 30의 범위의 BMI를 갖는다.

일 실시형태에서, 대상체는 건강한 과체중 대상체이다. 일 실시형태에서, 대상체는 건강하지 않은 과체중 대상체이다.

일 실시형태에서, 대상체는 정상 체중이다. 일 실시형태에서, 대상체는 약 18.5 내지 25의 범위의 BMI를 갖는다.

일 실시형태에서, 대상체는 체중 감량 식이 중이고/거나, 중량 손실을 원한다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 체중 감량 식이 중이 아니고/거나, 중량 손실을 원하지 않는다.

일 실시형태에서, 대상체는 중량 증가의 위험이 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 과도한 지방 축적의 위험이 있다.

일 실시형태에서, 대상체는 과체중 및/또는 비만이 발생할 위험이 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 과체중 및/또는 비만 관련 질병 및 장애가 발생할 위험이 있다.

일 실시형태에서, 대상체는 폭식증이다. 일 실시형태에서, 대상체는 폭식 또는 강박 식이 장애를 앓고 있다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 또는 벡터는 대상체에 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신의 형태로 투여되어야 한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 또는 벡터는 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 및 선택적으로 지속 방출 매트릭스, 예컨대 생체내 분해 가능 중합체와 조합되어, 약제학적 조성물을 형성한다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신은 경구, 주사, 국소, 비강, 협측, 직장, 질, 기관내, 내시경, 경점막 또는 경피 투여에 의해 투여되어야 한다.

개시된 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신은 다양한 방식으로 표적 세포에 전달될 수 있다. 선택된 전달 메커니즘은 부분적으로, 표적화된 세포의 유형 및 전달이 예를 들어 생체내 또는 시험관내에서 이루어지는지에 따를 것이다. 당업자는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 핵산 서열의 전달을 조정할 수 있을 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신은 경구 투여되어야 한다. 경구 투여에 적합한 제형의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나: 고체 형태, 액체 형태 및 겔을 포함한다. 경구 투여에 적합한 고형 형태의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 환제, 정제, 캡슐, 연질 젤라틴 캡슐, 경질 젤라틴 캡슐, 캐플릿, 압축 정제, 카세, 웨이퍼, 당-코팅 환제, 당 코팅 정제, 또는 분산/또는 붕해성 정제, 분말, 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태, 경구 투여 전의 액체 및 발포성 정제를 포함한다. 경구 투여에 적합한 액체 형태의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 용액, 현탁액, 음용 가능한 용액, 엘릭시르 (elixir), 밀봉된 피알 (phial), 물약, 드렌치 (drench), 시럽 및 주액을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신은 주사, 바람직하게는 전신 주사에 의해 투여되어야 한다. 전신 주사에 적합한 제형의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나: 액체 용액 또는 현탁액, 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태, 주사 전의 액체를 포함한다. 전신 주사의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 피하, 근육내, 피내, 안내 및 복강내 주사, 또는 관류를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 주사시, 본 발명의 조성물, 약제학적 조성물 또는 의약품은 멸균된 것이다. 멸균 약제학적 조성물을 획득하는 방법은 다음에 제한되는 것은 아니나, GMP 합성 (GMP는 "우수 의약품 제조관리 기준"을 의미함)을 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신은 국소 투여되어야 한다. 국소 투여에 적합한 제형의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 스틱, 왁스, 크림, 로션, 연고, 밤, 겔, 마스크, 리브온 워시 (leave-on wash) 및/또는 기타를 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서, 연고는 유성 연고; 예를 들어, 수중유 또는 유중수 연고와 같은 유화 연고; 또는 수용성 연고, 바람직하게는 유성 연고이다.

본 발명의 일 실시형태에서, 유성 연고는 예를 들어 식물 및 동물성 오일; 식물 및 동물성 지방; 왁스; 예컨대 백색 바셀린 또는 바셀린 오일과 같은 바셀린; 및 예를 들어 액체 파라핀 또는 파라핀 오일과 같은 파라핀과 같은 베이스를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신은 또한, 조성물로 함침되고 불투과성 배킹 (backing)에 적층된 수지성 가교제에 의해 접착된 아크릴계 중합체 중 하나와 같은 경피 시스템을 사용하여 국소적으로 적용될 수 있다. 경피 투여에 적합한 제형의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 연고, 페이스트, 크림, 필름, 밤, 패치, 예를 들어 경피 패치, 겔, 리포솜 형태 등을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신은 경피 패치, 더욱 특히 지속 방출 경피 패치로 국소 투여될 수 있다. 경피 패치는 예를 들어 접착성 매트릭스, 중합체 매트릭스, 저장 패치, 매트릭스 또는 모노리식-타입 적층 구조와 같은 임의의 통상적인 형태를 포함할 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 배킹 층, 접착제, 투과 증강제, 선택적 속도 제어 막 및 방출 라이너로 구성되며, 이는 적용하기 전에 접착제를 노출시키기 위해 제거된다. 중합체 매트릭스 패치는 또한 중합체 매트릭스 형성 물질을 포함한다. 적합한 경피 패치는 당 업계에 잘 기재되어 있다 [예를 들어, 미국 특허 제 5262165호, 제 5948433호, 제 6010715호 및 제 6071531호 참조].

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신은 제어 방출, 지연 방출, 연장 방출, 장기간 작용 방출, 변형 방출, 지속 방출 또는 정기 방출 형태로 투여된다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신은 생분해성 중합체와 같은 지속 방출 매트릭스를 추가로 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 식이 보충제 또는 식품 조성물은 경구 투여되어야 한다. 경구 투여에 적합한 제형의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나: 고체 형태, 액체 형태 및 겔을 포함한다. 경구 투여에 적합한 고체 형태의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 환제, 정제, 캡슐, 연질 젤라틴 캡슐, 경질 젤라틴 캡슐, 캐플릿, 압축 정제, 카세, 웨이퍼, 당-코팅 환제, 당 코팅 정제, 또는 분산/또는 붕해성 정제, 분말, 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태, 경구 투여 전의 액체 및 발포성 정제를 포함한다. 경구 투여에 적합한 액체 형태의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 용액, 현탁액, 음용 가능한 용액, 엘릭시르, 밀봉된 피알, 물약, 드렌치, 시럽 및 주액을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 식이 보충제 또는 식품 조성물은 분말, 예를 들어 우유, 주스, 물 또는 소모성 겔 또는 시럽과 같은 소모성 액체와 혼합하여 다른 식이 액체 또는 식품에 혼합하기 위한 분말로서 제형화된다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 식이 보충제 또는 식품 조성물은 예를 들어 단일 서빙 바 (single serving bar)와 같은 소정의 보충 식품을 제공하기 위해 다른 식품 또는 액체와 함께 제형화된다. 향미제, 결합제, 단백질, 복합 탄수화물 등이 필요에 따라 첨가될 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 식이 보충제 또는 식품 조성물은 그의 염을 포함하여 상기 논의된 비타민, 미네랄 및 기타 영양소의 임의의 약제학적적으로 허용 가능한 형태를 사용하여 제형화된다. 바람직한 형태는 탄산칼슘, 수산화마그네슘 또는 황산마그네슘, 소듐 테트라보레이트, 산화제2구리, 황산망간, 황산아연, 콜레칼시페롤, 푸마르산제1철, 피리독신 하이드로클로라이드, 피콜린산크롬, d-알파토코페롤 아세테이트 및 아스코르브산이다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 또는 백신의 치료 유효량은 적어도 1일 1회, 1일 2회 또는 적어도 1일 3회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신의 치료 유효량은 매일, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 투여된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 또는 백신의 치료 유효량은 매주, 1주에 2회, 격주 또는 1개월에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신의 치료 유효량은 적어도 2, 3, 4, 5 또는 6개월의 기간 동안 매월 투여된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 치료 유효량은 약 1 μg 내지 5 g의 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여되는 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 벡터의 치료 유효량은 약 0.1 μg/kg 내지 1 g/kg, 즉, 약 0.1 μg/킬로 체중 내지 1 g/킬로 체중의 범위이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 만성 치료를 위한 것으로, 즉, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 또는 백신은, 예를 들어 적어도 약 1주, 1개월, 1년 이상 동안과 같은 연장된 기간 동안 투여된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 예를 들어 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 또는 백신의 단지 1, 2 또는 3회의 투여와 같은 급성 투여를 위한 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여는, 예를 들어 1일 이상 동안, 일반적으로 적어도 4일 또는 심지어 4 내지 15주의 장기 기간 동안 1일에 2 내지 3회 반복하며, 적절한 경우, 1회 이상의 중단 기간이 존재한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물은 대상체의 1회의 식사와 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 벡터, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물은 대상체의 식사 전에 투여된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 조성물, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 이를 필요로 하는 대상체에 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물을 투여하기 위한 수단을 추가로 포함한다.

폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물을 투여하기 위한 수단은 다음에 제한되는 것은 아니나, 주사기, 바늘 및 다른 재료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물을 투여하기 위한 수단은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 약제학적 조성물, 의약품 또는 백신으로 미리 충전된 주사기를 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 상기 대상체에의 폴리펩타이드 또는 단백질, 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산, 약제학적 조성물, 의약품, 백신, 식이 보충제 또는 식품 조성물의 투여 설명서를 추가로 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 이를 필요로 하는 대상체에서 비만을 치료하거나, 예방하기 위해 사용하기 위한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 이를 필요로 하는 대상체에서 과체중 및/또는 비만 관련 질병 또는 장애를 치료하거나, 예방하기 위해 사용하기 위한 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 키트는 이를 필요로 하는 대상체에서 포만 상태를 유도하고, 포만감을 연장하고, 식사 규모를 감소시키고, 식품 섭취를 감소시키고, 중량 증가를 제어하고, 중량 증가를 감소시키고, 중량 손실을 자극하고, 중량을 감소시키고/거나, 지방 중량 대 제지방 중량 비율을 감소시키기 위해 사용된다.

본 발명은 실시예에 의해 추가로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

도 1은 ClpB의 단백질 동정 동안 2차원 겔 전기영동 (a) 및 항-α-MSH 항체에 의한 면역블롯 (b 및 c, α-MSH에 의해 사전 흡착됨)을 사용한 E. 콜라이 K12 세포질 단백질 분리를 보여주는 사진이다 (스팟 1, 2, 3 및 4). 스팟 5, 6, 7 및 8은 단백질 GroEL에 상응한다 (문헌[Tenunee et al., 2014]).
도 2는 E. 콜라이 및 H. 알베이로부터의 ClpB 단백질과 인간 α-MSH 펩타이드 사이 (A), 및 L. 카세이, B. 아니말리스, E. 페칼리스 및 S. 세레비시아에의 ClpB 단백질 상 동체와 α-MSH 펩타이드 사이 (B)의 상동성을 보여주는 서열의 정렬이다.
도 3은 트립신 0.01% 처리 후 항-α-MSH 항체로 검출된 ClpB 단백질 (좌측 칼럼) 및 ClpB 단백질의 단편 (우측 칼럼)의 웨스턴 블롯을 보여주는 사진이다.
도 4는 항-α-MSH 항체 (a) 및 항-ClpB 항체 (b)로 검출된 마우스 (A) 및 랫트 (B)의 혈장, 시상하부 및 결장 점막의 웨스턴 블롯을 보여주는 사진이다.
도 5는 사전 인큐베이션되지 않은 E. 콜라이 야생형으로부터의 총 단백질 (대조군, 좌측 칼럼)에 대해 정규화된 것으로서, 둘 모두 트립신 0.01%와 함께 사전 인큐베이션된 E. 콜라이 야생형 (중간 칼럼) 및 E. 콜라이 ΔClpB (우측 칼럼)의 총 단백질과 함께 인큐베이션된 1차 배양 장 세포의 PYY 분비를 보여주는 그래프이다. **: 일원 t-검정 p=0.0078; $: 일원 t-검정 p=0.0571 (강도).
도 6은 둘 모두 10 nM의 농도에서 ClpB 단백질 및 약 25 kDa의 ClpB 단편과 함께 인큐베이션한 후 랫트의 결장 및 회장에서 PYY의 분비를 보여주는 막대 그래프이다. 결과는 대조군 (PBS와의 인큐베이션)과 비교한 비율로 제시된다.
도 7은 복강내 (ip) 주사에 의해 200 μL의 전장 ClpB 단백질 (A) 또는 약 25 kDa의 단편 (B)의 부피의 2 pmol이 투여된 마우스의 누적 사료 섭취량을 각각의 대조군 완충액이 투여된 대조군 마우스와 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 8은 경구 투여에 의해 200 μL의 전장 ClpB 단백질 (A) 또는 약 25 kDa의 단편 (B)의 부피의 60 pmol이 투여된 마우스의 누적 사료 섭취량을 각각의 대조군 완충액이 투여된 대조군 마우스와 비교하여 보여주는 그래프이다.

실시예

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.

실시예 1: α-MSH와 상동성인 박테리아 단백질의 동정

이전의 인실리코 분석은 E. 콜라이 및 일부 다른 미생물의 수 종의 단백질이 α-MSH와 아미노산 서열 상동성을 포함함을 보여주며, 이는 이들이 α-MSH 반응성 자가 항체의 생성에 관여할 수 있음을 시사한다 (문헌[Fetissov, in: Neuropsychiatric Disorders and Infection, Fatemi, S. H. (ed.), Taylor & Francis Books Ldt, 2004, pp 253-262; Fetissov et al., 2008. Nutrition. 24:348-359]).

박테리아 단백질이 이론상의 α-MSH 항원-모방체뿐만 아니라, 기능적 α-MSH 항원-모방체일 수 있는지를 확인하기 위해, E. 콜라이 균주 K12를 사용하여 신규한 단백질 분석 접근법을 수행하였다. 이 접근법의 신규성은 웨스턴 블롯과 같은 면역검출 프로토콜에서 일차 항체에 의한 이른바 비특이적 염색의 잘 알려진 현상을 이용하는 것으로 구성되었다. 이 접근법에서, 항체 생성에 사용된 항원 펩타이드 이외의 다른 단백질의 "비특이적 염색"은 α-MSH 펩타이드와 박테리아 단백질 사이의 구조적 입체형태 상동성의 기초로서 연구되었다.

재료 및 방법

본 명세서에서 검토된 단백질 분석 접근법은 원 연구 (문헌[Tennoune et al., 2014, Transl Psychiatry, 4:e458])에서 사용된 것이고, E. 콜라이 K12의 총 단백질을 분리하기 위한 2차원 겔 전기영동으로 구성되었다.

2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동

2차원 (2D) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)의 경우, 400 μg의 E. 콜라이 K12 단백질 추출물을 등전점 포커싱 완충액 (iso-electro focusing buffer) (7 M 우레아, 2 M 티오우레아 및 0.5% 양쪽성 전해질, pH 4-7, 20 mM 디티오트레이톨, 2 mM 트리부틸 포스핀, 2% CHAPS 및 0.005% 브로모페놀 블루)에 첨가하고, 60분 동안 실온에서 가볍게 진탕시키면서 용해시켰다. 1차원 겔 분리는 ReadyStrip IPG 스트립 (18 cm, pH 4-7 NL, Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, France)을 사용하여 수행하였다. 등전점 포커싱 완충액으로 스트립의 수동 재수화 24시간 후, 단백질 샘플을 캐소드로부터 1.5 cm에 배치된 로딩 컵을 통해 스트립에 첨가하였다. 등전점 포커싱을 Ettan IPGphor 3 시스템 (GE Healthcare)을 사용하여 4 단계 (31 500 Vh): 1시간 동안 500 V, 1000 V 구배, 10 000 V 구배 및 2시간 동안 10 000 V로 수행하였다. 각각 2% 디티오트레이톨 및 2.5% 요오도아세트아미드에 의한 2개의 평형화 단계 후에, 2차 치수, 즉 SDS-PAGE (10% 폴리아크릴아미드 겔, 20 cm x 18 cm x 1 mm)를 Ettan Daltsix 수직 전기영동 시스템 (GE Healthcare)에서 겔당 12 mA에서 수행하였다. SDS-PAGE 후, 2D 겔을 실온에서 2% (vol:vol) 오르쏘인산 및 50% (vol:vol) 메탄올에서 2시간 동안 고정시켰다.

이어서 겔을 물로 세정하고, 단백질 스팟을 CBB G-250 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 염색 (34% (vol:vol) 메탄올, 17% (wt:vol) 황산암모늄, 2% (vol:vol) 오르쏘인산 및 0.66 g CBB G-250/리터)에 의해 시각화하였다.

면역블롯팅

2D-PAGE 후, E. 콜라이 세포질 단백질을 건식 운반 방법 (Trans Blot Cell, Bio-Rad) 및 막 규모의 0.8 mA.cm^-2 일정한 전류를 통해 2시간 동안 Hybond-ECL 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (GE Healthcare) 상으로 운반하였다. 운반 후, 막을 0.05% (vol:vol) Tween 20 + 인산염 완충 식염수 (PBS; 10 mmol.L^-1 Tris, pH 8, 및 150 mmol.L^-1 NaCl) 중 5% (wt:vol) 우유 (Regilait, Macon, France)로 블로킹하였다. 세척 후, 막을 다클론 토끼 항-α-MSH IgG (1:1000, Peninsula Laboratories, San Carlos, CA, USA)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 세척하고, 다클론 돼지 항-토끼 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 Ig (1:3000; Dako, Trappes, France)와 함께 인큐베이션하였다. 면역블롯을 ECL 검출 시스템 (GE Healthcare)에 의해 검출하고, ImageScanner II (GE Healthcare)로 스캔하고, Labscan 6.00 소프트웨어 (GE Healthcare)로 디지털화하였다.

토끼 항-α-MSH IgG를 10^-6 M의 α-MSH 펩타이드 (Bachem AG, Bubendorf, Switzerland)로 4℃에서 밤새 흡착시킨 후에 동일한 절차를 수행하였다.

단백질 동정

대상 단백질 스팟을 Ettan Spot Picker (GE Healthcare)를 사용하여 CBB G-250-염색된 2D 겔로부터 절제하고, 단백질의 자동 겔내 분해를 Ettan Digester (GE Healthcare)에서 수행하였다. 이어서, 단백질 추출물을 10 μl의 5% (vol:vol) 아세토니트릴/0.1% (vol:vol) 포름산에 재현탁시키고, HPLC-칩 큐브 인터페이스 (Agilent Technologies, Courtaboeuf, France) 및 나노 스프레이 공급원이 장착된 6340 이온 트랩 질량 분광분석기에 연결된 나노-LC1200 시스템으로 분석하였다. 간단히 말하면, 펩타이드를 40-nl RPC18 트랩 칼럼에서 농축 및 탈염시키고, Zorbax (30-nm 기공 크기, 5-μm 입자 크기) C18 칼럼 (43 mm 길이 x 75 μm 내경; Agilent Technologies)에서 분리하였다. 400 nl.min^-1의 유속에서 9분 선형 구배 (0.1% 포름산 중 3 내지 80% 아세토니트릴)를 사용하였고, 용리액을 이온 트랩 질량 분광분석기로 분석하였다. 단백질 동정을 위해, MS/MS 피크목록을 추출하고, MASCOT Daemon 버전 2.2.2 (Matrix Science, Boston, MA, USA) 검색 엔진을 사용하여 단백질 데이터베이스와 비교하였다. 다음의 특정 매개변수 효소 특이성, 트립신; 하나의 절단 누락 허용; 비 고정 변형; 가변 변형, 메티오닌 산화, 시스테인 카바미도메틸화, 세린, 티로신 및 트레오닌 인산화; 단일 동위원소; 펩타이드 전하, 2+ 및 3+; 전구체 이온당 질량 허용 오차, 1.5 Da; 단편화당 질량 허용 오차, 0.6 Da; 전기분무 이온화 트랩 기구; 분류학, E. 콜라이; 미국 국립 생물정보센터 (NCBI) 데이터베이스 (NCBI Nr 20120531 (18280215 서열, 6265275233 잔기); Bethesda, MD, USA)에 의해 연구를 수행하였다. 다음 기준 중 하나를 충족시키는 경우 단백질 히트가 자동으로 확인되었다: 각각 MASCOT 점수가 454 (Po0.01)인 적어도 2개의 최상위 펩타이드 (적색의 볼드체) 또는 각각 MASCOT 점수가 447 (Po0.05)인 적어도 2개의 최상위 펩타이드에 의한 동정. 위양성 비율을 평가하기 위해, MASCOT의 'decoy' 옵션을 사용하여 모든 초기 데이터베이스 검색을 수행하였다. 위양성 비율이 1%를 초과하지 않은 경우 결과는 적절한 것으로 간주하였다.

결과

E. 콜라이 K12의 총 단백질을 분리하기 위한 2차원 겔 전기영동의 결과가 도 1a에 제시되어 있다. 막으로 운반한 후, 다클론 항-α-MSH IgG의 적용에 의해 확인된 α-MSH-유사 에피토프를 포함하는 단백질의 존재에 의해 수 개의 양성 스팟이 검출되었다 (도 1b). 그러나, α-MSH 펩타이드로의 사전 흡착 후 항-α-MSH IgG의 적용에 의해서는 단지 수 개의 양성 스팟만을 제거되었고 (도 1c), 이는 사라진 스팟 (화살표)만이 α-MSH-유사 에피토프를 포함해야 함을 시사한다. 가장 강하게 염색된 α-MSH-특이적 염색 스팟의 질량 분광분석에 의해, 이는 열 충격 부류의 96 kDa 단백질인 카제인 분해 프로테아제 B (ClpB) 상동체에 상응하는 것으로 나타났다 (도 1a의 스팟 1, 2, 3, 4).

실시예 2: ClpB와 α-MSH 사이의 서열 정렬

엔테로박테리아의 ClpB 단백질은 α-MSH-교차 반응성 항체의 생성을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명자들은 엔테로박테리아의 ClpB 단백질에 α-MSH-유사 에피토프가 존재한다고 가정하였다.

ClpB와 α-MSH 사이의 서열 정렬에 의해, E. 콜라이와 H. 알베이 ClpB의 중심 부분 (서열번호 1의 아미노산 잔기 534 내지 548) 내의 불연속 6-아미노산 서열 상동성이 나타났다 (도 2a). 이러한 서열은 α-MSH 연속 서열 상동성의 검색 알고리즘을 사용한 E. 콜라이 또는 H. 알베이 단백질 데이터베이스에서의 α-MSH에 대한 상동성에 대한 인실리코 분석에 의해 예측된 것이 아니었다. 더욱이, 이러한 연속 서열을 포함하는 E. 콜라이 및 H. 알베이 단백질은 단백질 분석 접근법으로 확인할 수 없었으며 (문헌[Fetissov et al., 2008. Transl Psychiatry, 2014, 4:e458]), 이는 인실리코 접근법을 사용하여, 기능적 유의성을 갖는 거대 단백질 내의 펩타이드-유사 에피토프의 존재를 예측하는 것이 어려움을 강조한다. 더욱이 다른 박테리아 또는 효모, 예컨대 L. 카세이, B. 아니말리스, E. 페칼리스 및 S. 세레비시아에에서는 이러한 서열 상동성이 나타나지 않았다 (도 2b).

α-MSH는 N-말단에서 13개의 아미노산이 아실화된 펩타이드이다. 중심 부분 HFRW (서열번호 2의 아미노산 잔기 6 내지 9)는 가장 중요한 아미노산인 Arg (8) 및 Trp (9)에 의한 MC 수용체 활성화에 필요한 모든 중심 멜라노코르틴 (melanocortin) (MC) 시스템 펩타이드의 공통의 약학적 특징을 나타내며, N- 및 C-말단은 둘 모두 MCR 결합에 상이한 방식으로 관여한다 (문헌[Hruby et al., 1987, J. Med. Chem. 30:2126-2130; Schioeth et al., European Journal of Pharmacology, 1998, 349:359-366; Haskell-Luevano et al., 2001, Journal of Medicinal Chemistry, 44:2247-2252]). 산성 아미노산 Glu (5) (서열번호 2의 아미노산 잔기 5)의 존재는 염기성 Arg (8) (서열번호 2의 아미노산 잔기 8)과 염다리를 형성함으로써, α-MSH 공간 입체형태에 관여할 수 있다. 이러한 α-MSH 접힘은 MCR 활성화에 필요한 펩타이드 코어 서열을 노출시키는 β-턴을 형성한다 (문헌[Li et al., 1999, European Journal of Biochemistry, 265:430-440]).

엔테로박테리아의 ClpB 서열은 α-MSH 펩타이드의 다음 특성을 공유한다:

1. MC 수용체의 활성화에 필요하고, α-MSH 약학적 특징에서 2개의 주요 아미노산인 연속 Arg (서열번호 1의 R542) 및 Trp (서열번호 1의 W543) (서열번호 2의 R8W9)의 존재;

2. β-턴에서의 중심 RW 서열의 노출 및 단백질/펩타이드 접힘에 중요할 수 있고, α-MSH의 Glu (서열번호 2의 E5)에 상동성인 음으로 하전된 Glu (서열번호 1의 E538)의 존재;

3. GKPV10-13 (서열번호 2)과 서열 상동성 (75%)을 갖는 GIPV545-548 (서열번호 1), 즉 α-MSH의 C-말단의 존재.

처음 2개의 특성의 조합이 항원성 및 α-MSH-유사 리간드 상호작용 둘 모두를 포함하는 ClpB의 α-MSH-유사 에피토프 (서열번호 1의 아미노산 잔기 534 내지 548)의 고유한 기능에 필요한 것으로 보인다.

모든 공생 및 병원성 장내세균은 ClpB의 동일한 α-MSH-유사 에피토프를 포함하며, 이는 이 부류에 속하는 박테리아가 α-MSH 신호전달을 방해하는 능력이 있음을 시사한다. 이러한 박테리아는 다음에 제한되는 것은 아니나 에쉐리키아, 살모넬라, 쉬겔라, 클렙시엘라, 엔테로박터, 시트로박터, 크로노박터 및 하프니아 속을 포함한다.

실시예 3: ClpB 단편 동정

재료 및 방법

ClpB 단편화

먼저 상이한 조건에서 단편화를 수행하였다: 0.0025% 트립신을 포함하는 ClpB 1/10 및 1/10로 희석된 ClpB (5 mg/mL의 스톡). 이러한 상이한 조건을 37℃에서 20분 동안 방치하였다. 인큐베이션 후, 얼음 위에 튜브를 놓음으로써, 단편화를 즉시 중지시키고, 웨스턴 블롯을 수행하였다.

웨스턴 블롯

단편화 후, β-머캅토에탄올을 무함유하는 Leamli 용액을 튜브에 첨가하고, 트리스-글리신 완충액 (BioRad, Hercules, USA)에서 20% 아크릴아미드 SDS 겔상에서 웨스턴을 수행하고, 니트로셀룰로스 막 (GE Healthcare, Orsay, France)으로 옮겼다. 이어서, 0.05% (w/v) Tween 20 + TBS (10 mmol/L Tris, pH 8; 150 mmol/L NaCl) 중 5% (w/v) 건조 탈지유에 의해 실온에서 적어도 1시간 동안 막을 블로킹하였다. 블로킹 후, 막을 4℃에서 항-a-MSH 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 토끼 다클론 항-α-MSH 항체 (1:1000, Phoenix Pharmaceuticals)와 함께 막을 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. TBS/0.05% Tween 20 중 5% (w/v) 건조 탈지유의 블로킹 용액으로 3회 세척한 후, 막을 퍼옥시다제-접합된 항 토끼 IgG (1:1000, SantaCruz Biotechnology)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 3회 세척 후, ECL 검출 키트 (GE Healthcare)를 사용하여 퍼옥시다제 반응을 검출하였다. 단백질 밴드를 분자량 표준 (Precision Plus, BioRad)과 비교하고, 필름을 ImageScanner III (GE Healthcare)를 사용하여 스캔하였다.

혈장, 시상하부 및 결장 점막 상의 웨스턴 블롯

모든 동물 관리 및 실험은 미국 국립 보건원에 의해 확립된 지침에 따르고, 프랑스 및 유럽 공동체 규정 (문헌[유럽 공동체의 공식 저널 L358, 18, 18/12/1986])을 둘 모두 준수하였다. 수컷 Sprague-Dawley 랫트 또는 마우스 C57Bl6 (Janvier Labs, Genest-Saint-Isle, France)을 수용 케이지에서 제어된 환경 조건 (22℃ +/-1℃의 12시간 명암주기, a.m. 7:30에 조명을 킴) 하에 유지하였다. 적응 기간 동안, 동물에게 물 및 RM1 표준 사료 (RM1식이; Special Diet Service Ltd, Witham, Essex, UK)에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다.

이러한 랫트 및 마우스로부터 결장 점막을 채취하여 PBS로 세척하였다. 또한 이러한 동일한 동물의 혈장 및 시상하부를 채취하여, -80℃에서 저장하였다.

조직을 추출 완충액 (PBS + 프로테아제 억제제 (1%))과 함께 인큐베이션하였다. 추가되는 부피는 샘플 양에 따라 상이하다. 포터를 사용하여 샘플을 균질화하였다. 이어서, 샘플을 원심분리하였다 (12000 g, 20분, 4℃). 즉시 분석하지 않는 경우, 상청액을 -80℃에 저장하였다.

사용된 프로토콜은 전술한 바와 동일하지만, β-머캅토에탄올 10% (w/v)를 Laemli 용액에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 2분 동안 85℃에서 가열한 후, 겔 상에서 이동시켰다. 2개의 1차 항체 항-E. 콜라이 ClpB 항체 (1:5000, Delphi Genetics) 및 항-alpha-MSH 항체 (1:3000, Phoenix Pharmaceuticals)를 시험하였다. 두 경우 모두에 사용된 이차 항체는 퍼옥시다제-접합된 항-토끼 IgG (1:5000, Dako)였다.

결과

트립신과 사전 인큐베이션된 ClpB 단백질에 대해 수행된 웨스턴 블롯에서, 항-α-MSH 항체로 검출한 경우, 수 개의 밴드가 나타났다 (도 3). 따라서, 트립신 처리 단계에 의해 ClpB의 수 개의 단편이 생성된다. 특히, 약 25 kDa는 다른 단편보다 더 많은 양으로 생성될 수 있다. 또한, 이들 결과는 단편이 항-α-MSH 항체에 의해 인식되므로, 단편은 α-MSH 펩타이드와 유사한 서열을 포함함을 나타낸다.

더욱이, 웨스턴 블롯에 의해 트립신 처리 후 용액에 전장 ClpB (약 96 kDa)가 존재하지 않는 것으로 나타났다.

또한, 도 4의 결과로서 약 25 kDa의 단편이 마우스 (A) 및 랫트 (B)의 결장 점막, 시상하부 및 혈장에서 검출되는 것으로 나타난다. 더욱이, 이 단편은 다클론 항-α-MSH (a) 및 항-ClpB 항체 (b)에 의해 검출되었다.

이러한 약 25 kDa 단편의 서열 분석 후, 이는 아미노산 537 내지 아미노산 756 (서열번호 22)의 ClpB의 서열에 상응하는 것으로 나타난다.

실시예 4: PYY 및 GLP-1 방출에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 효과

랫트 결장에서의 PYY 분비 실험

세포 배양

안락사 후, 랫트 결장을 샘플링하고, 새로운 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하였다. 이어서 장 조직을 생리적 pH를 유지하는 L-15 배지 (Leibovitz-15 배지; Sigma-Aldrich, Mo, US)로 세척하였다. 결장 점막을 긁어내어, 5 내지 10분 동안 37℃에서 고 글루코스 DMEM (Dulbecco 's Modified Eagle Medium; Dominique Dutscher, France - 5.5 mmol/L의 L-글루타민, 100 U/mL의 페니실린, 0.1 mg/mL의 스트렙토마이신 및 비 필수 아미노산이 보충됨) 0.4 mg/mL의 콜라게나제 IX (문헌[Psichas et al., 2015. Int J Obes (Lond). 39(3):424-9])로 분해시켰다. 세포 현탁액을 8분 동안 750 rpm에서 원심분리하고, 장 세포를 10%의 소 태아 혈청이 첨가된 동일한 보충 DMEM 배지에 현탁시켰다. 세포 현탁액을 100 μm (Merck Millipore, Mass, USA)에서 여과하고, 1% Matrigel (Corning, NY, US)로 코팅된 24웰 플레이트로 배양하였다. 마지막으로, 플레이트를 95% O2/5% CO2 대기에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

세포 용해물 제조

이전에, 야생형 (WT) 및 ClpB 고갈된 (ΔClpB) E. 콜라이 K12의 박테리아 배양을 수행하여, 총 단백질 추출을 진행하였다. 1% 프로테아제 억제제 (Sigma-Aldrich, Mo, US)를 포함하는 PBS에서 30초 동안 초음파 처리에 의해 단백질 추출을 수행하였다. 이어서, 4℃에서 30분 동안 10000 rpm에서 원심분리를 수행하였다. 이어서, 단백질을 포함하는 상청액을 37℃에서 20분 동안 0.0025% 트립신과 함께 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 얼음 위에 튜브를 놓음으로써 단편화를 즉시 중지시켰다. 단백질을 포함하는 용액을 샘플링하고, 투여하여, 각 조건에서 총 단백질 농도를 결정하였다.

동시에, 장 세포를 분비 완충액 (pH 7.4) (4.5 mM의 KCl, 138 mM의 NaCl, 4.2 mM의 NaHCO3, 1.2 mM de NaH2PO4, 2.6 mM de CaCl2, 1.2 Mm de MgCl2 및 10 mM HEPES)에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 0.015 μg/μL에서 E. 콜라이 K12 WT 및 E. 콜라이 K12 ΔClpB로부터의 트립신화된 단편을 포함하는 분비 완충액에서 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다 (문헌[Breton et al., 2015. International Journal of Eating Disorders. 49:805-808]; 각 조건에 대해 n=4). 대조군으로서, 세포를 또한 PBS에서 인큐베이션하였다.

인큐베이션 후, 상청액을 샘플링하여, 원심분리 (3분 동안 10000 rpm)하고, -80℃에 즉시 저장하였다. 이어서 세포를 용해 완충액 (50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 1% IGEPAL-CA 630, 0.5% 데옥시콜산 및 EDTA를 무함유하는 프로테아제 억제제 칵테일)으로 처리하여, 세포내 펩타이드를 추출하였다. 세포 용해물을 PYY 측정시까지 -80℃에 즉시 동결시켰다.

PYY 투여

PYY 투여를 세포 배지 및 세포 용해물에 대해 수행하여, (배지 중) PYY 유리, (용해물 중) 생성 및 총 PYY 상대 생성 (배지 및 용해물)을 측정하였다. 이 투여량은 제조사의 지침에 따라 Fluorescent Immunoassay Kit® (Phoenix Pharmaceuticals, Inc.)를 사용하여 수행하였다.

간략하게 말하면, 모든 시약 조제 후, 모두 결합하여, 2개의 웰에 50 μl의 1x 분석 완충액, 50 μl의 제조된 펩타이드 표준 (이중 반복 실험), 50 μl의 재수화된 양성 대조군 (이중 반복 실험) 및 50 μl의 제조된 샘플 (이중 반복 실험)을 면역 플레이트에 충전시켰다. 이어서, 블랭크 웰을 제외하고 25 μl의 재수화된 1차 항체 및 25 μl의 재수화된 비오티닐화 펩타이드를 각각의 웰에 첨가하였다. 마이크로플레이트를 300 내지 400 rpm에서 회전 진탕하에 실온 (20 내지 23℃)에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각 웰을 350 μl의 1x 분석 완충액으로 4회 세척하고, 12 μl의 SA-HRP를 12 ml의 1x 분석 완충액으로 희석시켜 미리 제조된 100 μl의 SA-HRP 항체 용액을 첨가하였다. 면역플레이트를 300 내지 400 rpm에서 회전 진탕하에 실온 (20 내지 23℃)에서 1시간 동안 다시 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 각각의 웰을 이전과 동일한 방식으로 세척하고, 100 μl의 TMB 기질 용액을 첨가하였다. 300 내지 400 rpm에서 회전 진탕하에 실온 (20 내지 23℃)에서 1시간 동안 플레이트를 인큐베이션하고, 광으로부터 보호하였다.

마지막에, 100 μl의 2N HCl을 각각의 웰에 첨가하여, 반응을 중지시키고 (웰의 색상이 청색에서 황색으로 변함), 면역플레이트를 마이크로타이터 플레이트 판독기로 판독하였다. 광학 밀도에서의 흡광도를 450 nm에서 판독하였다.

랫트 결장 및 회장에서의 PYY 분비 실험

결장 및 회장은 수컷 랫트 (Janvier Labs, Genest-Saint-Isle, France)로부터 제거하였다. 이를 빙냉 PBS로 세척한 다음, 빙냉 L-15 (Leibowitz) 배지 (PAA, Yeovil, UK)로 세척하였다. 이어서, 37℃에서 10분 동안 고-글루코스 DMEM (+ 1% L-글루타민 + 1% 페니실린 + 1% 스트렙토마이신 + 1% 비 필수 아미노산)에서 0.4 mg/mL 콜라게나제 XI (Sigma, Poole, UK)로 분해시켰다. 세포 현탁액을 원심분리하고 (400g에서 10분), 펠렛을 고 글루코스 DMEM (이전과 동일하나, 10% 소 태아 혈청 (FBS) 포함)에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 나일론 메쉬 (기공 크기 100 μm) (Merck Millipore, Mass, USA)를 통해 여과하고, 24 웰에 1% Matrigel-코팅된 플레이트 (Corning, NY, US) 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 95% O2 및 5% CO2의 대기에서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

24 시간의 배양 후, 세포를 분비 완충액 (4 mM KCl, 138 mM NaCl, 1.2 mM NaHCO3, 1.2 mM NaH2PO4, 2.6 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2 및 10 mM HEPES) (pH 7.4로 조절됨) 및 10 nM의 농도의 전장 ClpB 또는 약 25 kDa 단편과 함께 수조에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 세포를 분비 완충액 및 PBS와 함께 인큐베이션하였다.

인큐베이션 후, 세포를 용해 완충액 (50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, 1% IGEPAL CA-630, 0.5% 데옥시콜산 + EDTA를 무함유하는 완성된 프로테아제 억제제 정제의 칵테일)으로 처리하여, 세포내 펩타이드를 추출하였다. 세포 스크레퍼로 세포를 수집하고, 용해물을 원심분리하였다 (12000 g에서 20분). 즉시 분석하지 않는 경우, 용해물을 -80℃에 저장하였다.

장 호르몬의 분비를 상기에 기재된 바와 같이 PYY Fluorescent Immunoassay Kit® (Phoenix Pharmaceuticals, Inc.)를 사용하여 분석하였다.

결과

랫트 결장에서의 PYY 방출

상기와 같이 트립신 생성 ClpB 단편과 사전 인큐베이션된 동일한 E. 콜라이 단백질을 랫트 결장으로부터 1차 배양된 장 세포에 대한 실험에 사용하였다. 결과로서 대조군과 비교하여 PYY 방출의 증가가 나타난다 (도 5). 이와 달리, ClpB 고갈 균주는 효과가 관찰되지 않았다 (도 5).

이들 결과에 의해, ClpB의 단편이 PYY의 더욱 효율적인 방출을 야기하는 것으로 나타났으며, 이는 MC4R의 활성화를 시사한다 (문헌[Panaro et al., 2014. Cell Metab. 20(6): 1018-1029] 참조).

랫트 결장 및 회장에서의 PYY 방출

결과는 전장 ClpB 및 약 25 kDa의 단편 둘 모두와 랫트로부터 장 조직의 인큐베이션이 대조군과 비교하여 PYY 분비를 증가시킨다는 것을 보여준다 (도 6).

실시예 5: 사료 섭취에 대한 본 발명의 폴리펩타이드의 효과

재료 및 방법

수컷 C57/Bl6 마우스를 BioDAQ 마우스 케이지 (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ)에 단독 배치하여, 사료 섭취량을 측정하였다. 각각의 마우스에 생리적 혈청 (n=6), 전장 ClpB 또는 약 25 kDa의 단편을 투여하였다.

두 가지 투여 방식을 시험하였다: 200 μL 부피의 2 pmol의 농도의 복강내 (ip) 주사 (n=8), 200 μL 부피의 60 pmol의 농도의 경구 투여 (n=10).

결과

도 7 및 8에 제시된 결과는 약 25 kDa의 단편의 투여가 마우스에서 적어도 90분 동안 적어도 전장 ClpB 단백질과 동일한 정도로 사료 섭취량을 감소시킨다는 것을 보여준다.

특히, 약 25 kDa의 단편의 경구 투여는 사료 섭취량을 감소시키며, 전장 ClpB 단백질의 경구 투여는 이러한 효과가 없다 (도 8).

SEQUENCE LISTING <110> TARGEDYS INSERM(Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale) UNIVERSITE DE ROUEN NORMANDIE <120> PROTEINS DERIVED FROM CLPB AND USES THEREOF <130> IPA191264-FR <150> EP 17305400.8 <151> 2017-04-03 <160> 22 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 857 <212> PRT <213> Hafnia alvei <220> <223> ClpB <400> 1 Met Arg Leu Asp Arg Leu Thr Ser Lys Phe Gln Leu Ala Leu Ala Asp 1 5 10 15 Ala Gln Ser Leu Ala Leu Gly Arg Asp Asn Gln Phe Ile Glu Pro Val 20 25 30 His Leu Met Ser Ala Leu Leu Asn Gln Asp Gly Gly Thr Val Arg Pro 35 40 45 Leu Leu Thr Ser Ala Gly Val Asn Thr Ala Ser Leu Arg Gln Glu Leu 50 55 60 Glu Gln Ala Ile Ser Arg Leu Pro Gln Val Glu Gly Ala Gly Gly Asp 65 70 75 80 Val Gln Pro Ser Asn Glu Leu Ile Arg Val Leu Asn Leu Cys Asp Lys 85 90 95 Leu Ala Gln Lys Arg Asn Asp Thr Phe Ile Ser Ser Glu Leu Phe Val 100 105 110 Leu Ala Val Leu Glu Asp Arg Gly Asn Leu Gly Asp Ile Leu Lys Ala 115 120 125 Ala Gly Ala Asn Val Gln Lys Val Ser Thr Ala Ile Glu Gln Met Arg 130 135 140 Gly Gly Glu Lys Val Asp Asp Ala Asn Ala Glu Asp Gln Arg Gln Ala 145 150 155 160 Leu Lys Lys Tyr Thr Val Asp Leu Thr Glu Arg Ala Glu Gln Gly Lys 165 170 175 Leu Asp Pro Val Ile Gly Arg Asp Glu Glu Ile Arg Arg Thr Ile Gln 180 185 190 Val Leu Gln Arg Arg Thr Lys Asn Asn Pro Val Leu Ile Gly Glu Pro 195 200 205 Gly Val Gly Lys Thr Ala Ile Val Glu Gly Leu Ala Gln Arg Ile Ile 210 215 220 Asn Gly Glu Val Pro Glu Gly Leu Lys Asn Lys Arg Val Leu Ser Leu 225 230 235 240 Asp Met Gly Ser Leu Ile Ala Gly Ala Lys Phe Arg Gly Glu Phe Glu 245 250 255 Glu Arg Leu Lys Ala Val Leu Ser Asp Leu Ser Lys Gln Glu Gly Asn 260 265 270 Val Ile Leu Phe Ile Asp Glu Leu His Thr Met Val Gly Ala Gly Lys 275 280 285 Gly Asp Gly Ala Met Asp Ala Gly Asn Met Leu Lys Pro Ala Leu Ala 290 295 300 Arg Gly Glu Leu His Cys Val Gly Ala Thr Thr Leu Asp Glu Tyr Arg 305 310 315 320 Gln Tyr Ile Glu Lys Asp Ala Ala Leu Glu Arg Arg Phe Gln Lys Val 325 330 335 Phe Val Ala Glu Pro Thr Val Glu Asp Thr Ile Ala Ile Leu Arg Gly 340 345 350 Leu Lys Glu Arg Tyr Glu Leu His His His Val Gln Ile Thr Asp Pro 355 360 365 Ala Ile Val Ala Ala Ala Asn Leu Ser His Arg Tyr Ile Ala Asp Arg 370 375 380 Gln Leu Pro Asp Lys Ala Ile Asp Leu Ile Asp Glu Ala Ala Ser Ser 385 390 395 400 Ile Arg Met Gln Met Asp Ser Lys Pro Glu Ser Leu Asp Arg Leu Glu 405 410 415 Arg Arg Ile Ile Gln Leu Lys Leu Glu Gln Gln Ala Leu Asn Lys Glu 420 425 430 Ser Asp Glu Ala Ser Lys Lys Arg Leu Glu Met Leu Asn Glu Glu Leu 435 440 445 Glu His Lys Glu Arg Glu Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Glu Trp Lys Ala 450 455 460 Glu Lys Ala Ser Leu Ser Gly Thr Gln Asn Ile Lys Ala Glu Ile Glu 465 470 475 480 Gln Ala Lys Ile Ala Leu Glu Gln Ala Arg Arg Val Gly Asp Leu Ala 485 490 495 Lys Met Ser Glu Ile Gln Tyr Gly Lys Leu Pro Gly Leu Glu Lys Gln 500 505 510 Leu Glu Ala Ala Thr Gln Ser Glu Gly Lys Thr Met Lys Leu Leu Arg 515 520 525 Asn Lys Val Thr Asp Val Glu Ile Ala Glu Val Leu Ala Arg Trp Thr 530 535 540 Gly Ile Pro Val Ser Arg Met Leu Glu Ser Glu Arg Ala Lys Leu Leu 545 550 555 560 Arg Met Glu Asp Asp Leu His Glu Arg Val Ile Gly Gln Asn Glu Ala 565 570 575 Val Glu Ala Val Ser Asn Ala Ile Arg Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ser 580 585 590 Asp Pro Asn Arg Pro Ile Gly Ser Phe Leu Phe Leu Gly Pro Thr Gly 595 600 605 Val Gly Lys Thr Glu Leu Cys Lys Ala Leu Ala Asn Phe Leu Phe Asp 610 615 620 Ser Asp Asp Ala Met Val Arg Ile Asp Met Ser Glu Phe Met Glu Lys 625 630 635 640 His Ser Val Ser Arg Leu Val Gly Ala Pro Pro Gly Tyr Val Gly Tyr 645 650 655 Glu Glu Gly Gly Tyr Leu Thr Glu Ala Val Arg Arg Arg Pro Tyr Ser 660 665 670 Val Ile Leu Leu Asp Glu Val Glu Lys Ala His Pro Asp Val Phe Asn 675 680 685 Ile Leu Leu Gln Val Leu Asp Asp Gly Arg Leu Thr Asp Gly Gln Gly 690 695 700 Arg Thr Val Asp Phe Arg Asn Thr Val Val Ile Met Thr Ser Asn Leu 705 710 715 720 Gly Ser Asp Leu Ile Gln Asp Arg Phe Gly Gln Leu Asp Tyr Gly Glu 725 730 735 Met Lys Glu Leu Val Met Ser Val Val Ser His His Phe Arg Pro Glu 740 745 750 Phe Ile Asn Arg Ile Asp Glu Thr Val Val Phe His Pro Leu Asp Gln 755 760 765 Lys Asn Ile Lys Ala Ile Ala Arg Ile Gln Leu Glu Arg Leu Tyr Gln 770 775 780 Arg Leu Glu Glu Lys Gly Tyr Ser Val Thr Ile Thr Asp Ala Ala Leu 785 790 795 800 Glu Gln Leu Ser Lys Ala Gly Phe Asp Pro Val Tyr Gly Ala Arg Pro 805 810 815 Leu Lys Arg Ala Ile Gln Gln Glu Ile Glu Asn Pro Leu Ala Gln Gln 820 825 830 Ile Leu Ser Gly Lys Leu Ile Pro Gly Lys Asp Ile Thr Leu Asp Val 835 840 845 Ala Asp Glu Gln Ile Val Ala Lys Gln 850 855 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 1 <223> X is E or D <220> <221> SITE <222> 2 <223> X is 2, 3 or 4 of any amino acid <400> 2 Xaa Xaa Arg Trp 1 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 1 <223> X is E or D <220> <221> SITE <222> 3 <223> X is any amino acid <220> <221> SITE <222> 4 <223> X is any amino acid <400> 3 Xaa Val Xaa Xaa Arg Trp 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 1 <223> X is E or D <400> 4 Xaa Val Leu Ala Arg Trp 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <400> 5 Glu Val Leu Ala Arg Trp 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 1 <223> X is E or D <220> <221> SITE <222> 2 <223> X is 2, 3 or 4 of any amino acid <220> <221> SITE <222> 5 <223> X is any amino acid <220> <221> SITE <222> 7 <223> X is any amino acid <400> 6 Xaa Xaa Arg Trp Xaa Gly Xaa Pro Val 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 1 <223> X is E or D <220> <221> SITE <222> 2 <223> X is 2, 3 or 4 of any amino acid <220> <221> SITE <222> 5 <223> X is any amino acid <220> <221> SITE <222> 7 <223> X is I or K <400> 7 Xaa Xaa Arg Trp Xaa Gly Xaa Pro Val 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 2 <223> X is 2, 3 or 4 of any amino acid <220> <221> SITE <222> 5 <223> X is any amino acid <220> <221> SITE <222> 7 <223> X is I or K <400> 8 Glu Xaa Arg Trp Xaa Gly Xaa Pro Val 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 2 <223> X is 2, 3 or 4 of any amino acid <220> <221> SITE <222> 5 <223> X is any amino acid <400> 9 Glu Xaa Arg Trp Xaa Gly Ile Pro Val 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 2 <223> X is 2, 3 or 4 of any amino acid <400> 10 Glu Xaa Arg Trp Thr Gly Ile Pro Val 1 5 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 3 <223> X is any amino acid <220> <221> SITE <222> 4 <223> X is any amino acid <400> 11 Glu Val Xaa Xaa Arg Trp Thr Gly Ile Pro Val 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <400> 12 Glu Val Leu Ala Arg Trp Thr Gly Ile Pro Val 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 2 <223> X is 2, 3 or 4 of any amino acid <220> <221> SITE <222> 5 <223> X is any amino acid <400> 13 Glu Xaa Arg Trp Xaa Gly Lys Pro Val 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 2 <223> X is 2, 3 or 4 of any amino acid <400> 14 Glu Xaa Arg Trp Thr Gly Lys Pro Val 1 5 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <220> <221> SITE <222> 3 <223> X is amino acid <220> <221> SITE <222> 4 <223> X is any amino acid <400> 15 Glu Val Xaa Xaa Arg Trp Thr Gly Lys Pro Val 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <400> 16 Glu Val Leu Ala Arg Trp Thr Gly Lys Pro Val 1 5 10 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <400> 17 Val Glu Ile Ala Glu Val Leu Ala Arg Trp Thr Gly Ile Pro Val 1 5 10 15 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <400> 18 Ile Ala Glu Val Leu Ala Arg Trp Thr Gly Ile Pro Val 1 5 10 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <400> 19 Ala Glu Ile Ala Glu Val Leu Ala Arg Trp Thr Gly Ile Pro Val 1 5 10 15 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Alpha-MSH <400> 20 Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys Pro Val 1 5 10 <210> 21 <211> 857 <212> PRT <213> Escherichia coli <220> <223> ClpB <400> 21 Met Arg Leu Asp Arg Leu Thr Asn Lys Phe Gln Leu Ala Leu Ala Asp 1 5 10 15 Ala Gln Ser Leu Ala Leu Gly His Asp Asn Gln Phe Ile Glu Pro Leu 20 25 30 His Leu Met Ser Ala Leu Leu Asn Gln Glu Gly Gly Ser Val Ser Pro 35 40 45 Leu Leu Thr Ser Ala Gly Ile Asn Ala Gly Gln Leu Arg Thr Asp Ile 50 55 60 Asn Gln Ala Leu Asn Arg Leu Pro Gln Val Glu Gly Thr Gly Gly Asp 65 70 75 80 Val Gln Pro Ser Gln Asp Leu Val Arg Val Leu Asn Leu Cys Asp Lys 85 90 95 Leu Ala Gln Lys Arg Gly Asp Asn Phe Ile Ser Ser Glu Leu Phe Val 100 105 110 Leu Ala Ala Leu Glu Ser Arg Gly Thr Leu Ala Asp Ile Leu Lys Ala 115 120 125 Ala Gly Ala Thr Thr Ala Asn Ile Thr Gln Ala Ile Glu Gln Met Arg 130 135 140 Gly Gly Glu Ser Val Asn Asp Gln Gly Ala Glu Asp Gln Arg Gln Ala 145 150 155 160 Leu Lys Lys Tyr Thr Ile Asp Leu Thr Glu Arg Ala Glu Gln Gly Lys 165 170 175 Leu Asp Pro Val Ile Gly Arg Asp Glu Glu Ile Arg Arg Thr Ile Gln 180 185 190 Val Leu Gln Arg Arg Thr Lys Asn Asn Pro Val Leu Ile Gly Glu Pro 195 200 205 Gly Val Gly Lys Thr Ala Ile Val Glu Gly Leu Ala Gln Arg Ile Ile 210 215 220 Asn Gly Glu Val Pro Glu Gly Leu Lys Gly Arg Arg Val Leu Ala Leu 225 230 235 240 Asp Met Gly Ala Leu Val Ala Gly Ala Lys Tyr Arg Gly Glu Phe Glu 245 250 255 Glu Arg Leu Lys Gly Val Leu Asn Asp Leu Ala Lys Gln Glu Gly Asn 260 265 270 Val Ile Leu Phe Ile Asp Glu Leu His Thr Met Val Gly Ala Gly Lys 275 280 285 Ala Asp Gly Ala Met Asp Ala Gly Asn Met Leu Lys Pro Ala Leu Ala 290 295 300 Arg Gly Glu Leu His Cys Val Gly Ala Thr Thr Leu Asp Glu Tyr Arg 305 310 315 320 Gln Tyr Ile Glu Lys Asp Ala Ala Leu Glu Arg Arg Phe Gln Lys Val 325 330 335 Phe Val Ala Glu Pro Ser Val Glu Asp Thr Ile Ala Ile Leu Arg Gly 340 345 350 Leu Lys Glu Arg Tyr Glu Leu His His His Val Gln Ile Thr Asp Pro 355 360 365 Ala Ile Val Ala Ala Ala Thr Leu Ser His Arg Tyr Ile Ala Asp Arg 370 375 380 Gln Leu Pro Asp Lys Ala Ile Asp Leu Ile Asp Glu Ala Ala Ser Ser 385 390 395 400 Ile Arg Met Gln Ile Asp Ser Lys Pro Glu Glu Leu Asp Arg Leu Asp 405 410 415 Arg Arg Ile Ile Gln Leu Lys Leu Glu Gln Gln Ala Leu Met Lys Glu 420 425 430 Ser Asp Glu Ala Ser Lys Lys Arg Leu Asp Met Leu Asn Glu Glu Leu 435 440 445 Ser Asp Lys Glu Arg Gln Tyr Ser Glu Leu Glu Glu Glu Trp Lys Ala 450 455 460 Glu Lys Ala Ser Leu Ser Gly Thr Gln Thr Ile Lys Ala Glu Leu Glu 465 470 475 480 Gln Ala Lys Ile Ala Ile Glu Gln Ala Arg Arg Val Gly Asp Leu Ala 485 490 495 Arg Met Ser Glu Leu Gln Tyr Gly Lys Ile Pro Glu Leu Glu Lys Gln 500 505 510 Leu Glu Ala Ala Thr Gln Leu Glu Gly Lys Thr Met Arg Leu Leu Arg 515 520 525 Asn Lys Val Thr Asp Ala Glu Ile Ala Glu Val Leu Ala Arg Trp Thr 530 535 540 Gly Ile Pro Val Ser Arg Met Met Glu Ser Glu Arg Glu Lys Leu Leu 545 550 555 560 Arg Met Glu Gln Glu Leu His His Arg Val Ile Gly Gln Asn Glu Ala 565 570 575 Val Asp Ala Val Ser Asn Ala Ile Arg Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala 580 585 590 Asp Pro Asn Arg Pro Ile Gly Ser Phe Leu Phe Leu Gly Pro Thr Gly 595 600 605 Val Gly Lys Thr Glu Leu Cys Lys Ala Leu Ala Asn Phe Met Phe Asp 610 615 620 Ser Asp Glu Ala Met Val Arg Ile Asp Met Ser Glu Phe Met Glu Lys 625 630 635 640 His Ser Val Ser Arg Leu Val Gly Ala Pro Pro Gly Tyr Val Gly Tyr 645 650 655 Glu Glu Gly Gly Tyr Leu Thr Glu Ala Val Arg Arg Arg Pro Tyr Ser 660 665 670 Val Ile Leu Leu Asp Glu Val Glu Lys Ala His Pro Asp Val Phe Asn 675 680 685 Ile Leu Leu Gln Val Leu Asp Asp Gly Arg Leu Thr Asp Gly Gln Gly 690 695 700 Arg Thr Val Asp Phe Arg Asn Thr Val Val Ile Met Thr Ser Asn Leu 705 710 715 720 Gly Ser Asp Leu Ile Gln Glu Arg Phe Gly Glu Leu Asp Tyr Ala His 725 730 735 Met Lys Glu Leu Val Leu Gly Val Val Ser His Asn Phe Arg Pro Glu 740 745 750 Phe Ile Asn Arg Ile Asp Glu Val Val Val Phe His Pro Leu Gly Glu 755 760 765 Gln His Ile Ala Ser Ile Ala Gln Ile Gln Leu Lys Arg Leu Tyr Lys 770 775 780 Arg Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Glu Ile His Ile Ser Asp Glu Ala Leu 785 790 795 800 Lys Leu Leu Ser Glu Asn Gly Tyr Asp Pro Val Tyr Gly Ala Arg Pro 805 810 815 Leu Lys Arg Ala Ile Gln Gln Gln Ile Glu Asn Pro Leu Ala Gln Gln 820 825 830 Ile Leu Ser Gly Glu Leu Val Pro Gly Lys Val Ile Arg Leu Glu Val 835 840 845 Asn Glu Asp Arg Ile Val Ala Val Gln 850 855 <210> 22 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ClpB fragment <400> 22 Ala Glu Val Leu Ala Arg Trp Thr Gly Ile Pro Val Ser Arg Met Met 1 5 10 15 Glu Ser Glu Arg Glu Lys Leu Leu Arg Met Glu Gln Glu Leu His His 20 25 30 Arg Val Ile Gly Gln Asn Glu Ala Val Asp Ala Val Ser Asn Ala Ile 35 40 45 Arg Arg Ser Arg Ala Gly Leu Ala Asp Pro Asn Arg Pro Ile Gly Ser 50 55 60 Phe Leu Phe Leu Gly Pro Thr Gly Val Gly Lys Thr Glu Leu Cys Lys 65 70 75 80 Ala Leu Ala Asn Phe Met Phe Asp Ser Asp Glu Ala Met Val Arg Ile 85 90 95 Asp Met Ser Glu Phe Met Glu Lys His Ser Val Ser Arg Leu Val Gly 100 105 110 Ala Pro Pro Gly Tyr Val Gly Tyr Glu Glu Gly Gly Tyr Leu Thr Glu 115 120 125 Ala Val Arg Arg Arg Pro Tyr Ser Val Ile Leu Leu Asp Glu Val Glu 130 135 140 Lys Ala His Pro Asp Val Phe Asn Ile Leu Leu Gln Val Leu Asp Asp 145 150 155 160 Gly Arg Leu Thr Asp Gly Gln Gly Arg Thr Val Asp Phe Arg Asn Thr 165 170 175 Val Val Ile Met Thr Ser Asn Leu Gly Ser Asp Leu Ile Gln Glu Arg 180 185 190 Phe Gly Glu Leu Asp Tyr Ala His Met Lys Glu Leu Val Leu Gly Val 195 200 205 Val Ser His Asn Phe Arg Pro Glu Phe Ile Asn Arg 210 215 220

Claims

음으로 하전된 잔기 및 2개의 연속 Arg 및 Trp 잔기를 포함하는, ClpB 단백질 또는 그의 변이체의 단편을 포함하는 적어도 15개의 아미노산의 폴리펩타이드 또는 단백질로서, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 전장(full-length) ClpB 단백질이 아닌 폴리펩타이드 또는 단백질.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 아미노산 서열 서열번호 2를 포함하는, 폴리펩타이드 또는 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 아미노산 서열 서열번호 3을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 아미노산 서열 서열번호 4를 포함하는, 폴리펩타이드 또는 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 GKPV와 적어도 75% 서열 상동성을 갖는 서열을 추가로 포함하는, 폴리펩타이드 또는 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질은 아미노산 서열 서열번호 6을 포함하는, 폴리펩타이드 또는 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 의약품.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 식이 보충제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 식품 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서; 제8항에 있어서; 또는 제9항에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체에서 비만, 과체중 및/또는 비만 관련 질병 및 장애의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 폴리펩타이드 또는 단백질; 약제학적 조성물; 또는 의약품.
대상체의 중량을 감소시키기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 제10항에 따른 식이 보충제 또는 제11항에 따른 식품 조성물의 용도.
제12항 또는 제13항에 있어서, 대상체는 비만이 아닌, 폴리펩타이드 또는 단백질, 약제학적 조성물, 의약품, 식이 보충제 또는 식품 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드 또는 단백질, 제7항에 따른 조성물, 제8항에 따른 약제학적 조성물, 제9항에 따른 의약품, 제10항에 따른 식이 보충제 또는 제11항에 따른 식품 조성물을 포함하는 키트.