BR112019020779A2

BR112019020779A2 - proteínas derivadas de clpb e seus usos

Info

Publication number: BR112019020779A2
Application number: BR112019020779A
Authority: BR
Inventors: FETISSOV Serguei; Lambert Grégory; Legrand Romain; Lucas Nicolas
Original assignee: Targedys; INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale); Université de Rouen
Priority date: 2017-04-03
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2020-04-28
Also published as: MX2019011891A; CA3058816A1; RU2019135294A; CN111108114A; US20200131495A1; EP3385276A1; IL269751A; KR20200010209A; AU2018247816A1; WO2018185080A1; EP3606943A1; JP2020515647A

Abstract

a presente invenção refere-se a polipeptídeos e proteínas compreendendo um fragmento de uma proteína clpb e suas composições. a presente invenção também se refere ao tratamento e/ou prevenção de inflamação, em particular, excesso de peso e/ou doenças e distúrbios relacionados à obesidade. a presente invenção também se refere a métodos para induzir saciedade, prolongar a saciedade, reduzir o tamanho da refeição, reduzir a ingestão de alimentos, controlar o ganho de peso e estimular a perda de peso.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: PROTEÍNAS DERIVADAS DE CLPB E SEUS USOS

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção se refere ao tratamento ou prevenção de inflamação, como obesidade, sobrepeso e/ou doenças e distúrbios relacionados à obesidade. A presente invenção se refere aos métodos para induzir a saciedade, prolongar a saciedade, reduzir a ingestão de alimentos, controlar o ganho de peso e estimular a perda de peso.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] A obesidade é uma dessas condições crônicas pouco tratáveis, acompanhada de inúmeras comorbidades. A obesidade e o excesso de peso são tipicamente caracterizados pelo aumento da ingestão de alimentos e diminuição do gasto energético, sugerindo papel alterado dos sistemas peptidérgicos que regulam o balanço energético. De fato, a regulação do apetite e do comportamento alimentar envolvem a interação entre os hormônios peptídicos da fome e da saciedade intestinais com os circuitos neuronals do cérebro contendo neuropeptídeos orexigênicos e anorexigênicos (Schwartz et al., 2000. Nature. 404(6778):661-71).

[003] O modelo atual de controle da ingestão de alimentos implica hormônios da fome e saciedade derivados do intestino, sinalizando para vários circuitos cerebrais que regulam aspectos homeostáticos e hedônicos da alimentação

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2/107 (Berthoud H.-R., 2011). Curr. Opin. Neurobiol. 21(6):888896; Murphy et al., 2006. Nature. 444(7121) :854-859) . Entre essas, destacam-se as vias anorexigênicas e orexigênicas originárias do núcleo arqueado hipotalâmico (ARC), que incluem os neurônios pró-opiomelanocortina (POMC) e neuropeptídeo Y (NPY)/proteína relacionada à Agouti (AgRP), respectivamente, retransmitidos no núcleo paraventricular (PVN) (Atasoy et al. , 2012. Nature. 488 (7410) : 172-177; Garfield et al. , 2015. Nat. Neurosci. 18(6) :863-71; Shi et al., 2013. Cell Metab. 17(2):236-248).

[004] O sistema central de melanocortina (MC), composto por peptídeos de melanocortina, incluindo o hormônio estimulador de a-melanócitos (α-MSH), derivado de seu precursor pró-opiomelanocortina (POMC) e atuando nos receptores MC tipo 4 (MC4R) está criticamente envolvido na regulação do balanço energético (Cone R.D., 2006. Endocr. Rev. 27(7):736-49). De fato, o déficit tanto na expressão de POMC quanto na sinalização de MC4R leva à hiperfagia e obesidade em roedores humanos e geneticamente modificados (Huszar et al. , 1997. Cell. 88(1) :131-41; Krude et al. , 1998. Nat. Genet. 19(2):155-7; Farooqi et al., 2003. N. Engl. J. Med. 348(12):1085-95). A estimulação seletiva do MC4R central aparece, portanto, como um alvo muito atraente para o tratamento da hiperfagia e obesidade e vários análogos peptídicos α-MSH foram desenvolvidos e testados

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3/107 clinicamente, como por exemplo setmelanotida como terapia de substituição durante a deficiência de POMC e para o tratamento da hiperfagia em Síndrome de Prader-Willi (Chen et al. , 2015. J. Clin. Endocrinol. Metab. 100(4) :1639-45; Kühnen et al. , 2016. N. Engl. J. Med. 375(3) :240-6) . A penetração de fármacos afins do tipo α-MSH de alta afinidade no cérebro tem, no entanto, o risco de efeitos colaterais indesejados, como aumento da pressão arterial.

[005] Recentemente, a proteína caseinolítica protease B (ClpB) da Escherichia coli (E. coli) comensal do intestino foi identificada como um mimético conformacional do α-MSH, sugerindo o uso potencial de proteínas bacterianas específicas como um novo tipo de drogas peptídicas (Tennoune et al., 2014. Transi. Psychiatry. 4:e458). A proteína ClpB tem um peso molecular superior a 95 kDa, o que gera algumas dificuldades (como, por exemplo, produção, estabilidade e semelhantes).

[006] Foi demonstrado que a ativação do MC4R nas células endócrinas intestinais estimula a liberação dos hormônios da saciedade peptídeo-1 do tipo glucagon (GLP-1) e peptídeo YY (PYY) (Panaro et al. , 2014) . Cell Metab. 20 (6) :1018-1029) .

[007] Um estudo recente mostrou que um fragmento ClpB correspondente aos resíduos de aminoácidos 534-548 da sequência ClpB de E. coli é um agonista micromolar completo

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4/107 do MC1R com atividades parciais no MC3R e MC5R, mas não no MC4R (Ericson et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2015, 25: 5306-5308) . No entanto, a atividade do ClpB completo ou fragmentos maiores contendo epítopo do tipo α-MSH no MCR pode diferir do fragmento curto modificado estudado por Ericson et al.

[008] Sabe-se também que o hormônio α-MSH tem efeitos anti-inflamatórios potentes e efeitos protetores nas células do sistema imunológico e nos tipos de células não imunológicas periféricas que expressam os receptores de melanocortina, como MC1R e MC3R (Brzoska et al. , 2008. Endrocr. Rev. 29(5):581-602). Além disso, estudos recentes mostram que o α-MSH é um alvo interessante para o tratamento de psoríase, rinite alérgica, osteoartrite e doenças neuroinflamatórias (Auriemma et al, 2012. J. Invest. Dermatol. 132 (7) :1814-24 ; Kleiner et al. , Clin. Exp. Allergy. 46(8):1066-74; Bõhm et al., 2016. Biochem. Pharmacol. 116:89-99; Mykicki et al., 2016. Sci. Transl. Med. 8(362) : 362ral46) .

[009] Portanto, ainda é necessário identificar novos polipeptídeos ou proteínas que retenham a atividade biológica de α-MSH, em particular a ligação a receptores de melanocortina.

[010] Os inventores mostraram surpreendentemente que os fragmentos de ClpB compreendendo uma homologia de

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5/107 sequência com epítopo α-MSH têm uma ação direta nas células da mucosa intestinal para estimular a secreção de PYY.

[Oil] A presente invenção se refere, assim, aos polipeptídeos e proteínas compreendendo um fragmento de uma proteína ClpB ou uma variante da mesma e as utilizações dos mesmos.

SUMÁRIO [012] A presente invenção se refere a um polipeptídeo ou proteína de pelo menos 15 aminoácidos compreendendo um fragmento de uma proteína ClpB ou uma variante da mesma, compreendendo um resíduo carregado negativamente e dois resíduos Arg e Trp consecutivos, em que o referido polipeptídeo ou proteína não é uma Proteína ClpB completa.

[013] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4.

[014] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende ainda uma sequência com pelo menos 75% de homologia de sequência com a sequência GKPV. Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

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6/107 [015] A presente invenção também se refere a uma composição compreendendo o polipeptideo ou proteína como aqui descrito.

[016] A presente invenção se refere ainda a uma composição farmacêutica compreendendo o polipeptideo ou proteína como aqui descrito e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[017] Outro objeto da presente invenção é um medicamento que compreende o polipeptideo ou proteína de acordo com a invenção.

[018] A presente invenção também se refere a um suplemento dietético compreendendo o polipeptideo ou proteína como aqui descrito. A presente invenção se refere ainda a uma composição alimentar que compreende o polipeptideo ou proteína, como aqui descrito.

[019] A presente invenção se refere ainda ao polipeptideo ou proteína, à composição farmacêutica ou ao medicamento de acordo com a invenção para uso no tratamento ou prevenção da obesidade, sobrepeso e/ou doenças e distúrbios relacionados à obesidade em um sujeito em necessidade.

[020] Outro objeto da presente invenção é a utilização do polipeptideo ou proteína, o suplemento dietético ou a composição alimentar de acordo com a invenção

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7/107 para reduzir o peso em um sujeito. Em uma modalidade, o sujeito não é obeso.

[021] A presente invenção se refere ainda a um kit compreendendo um polipeptideo ou proteína, uma composição, uma composição farmacêutica, um medicamento, um suplemento dietético ou uma composição alimentar de acordo com a invenção.

DEFINIÇÕES [022] Na presente invenção, os seguintes termos têm os seguintes significados:

[023] Cerca de precedendo uma figura significa mais ou menos 10% do valor da referida figura.

[024] Aminoácidos, como aqui usado, são representados por seu nome completo, seu código de três letras ou seu código de uma letra, bem conhecido na técnica. Os resíduos de aminoácidos nos peptídeos são abreviados da seguinte forma: Fenilalanina é Phe ou F; Leucina é Leu ou L; Isoleucina é lie ou I; Metionina é Met ou M; Valina é Vai ou V; Serina é Ser ou S; Prolina é Pro ou P; Treonina é Thr ou T; Alanina é Ala ou A; A tirosina é Tyr ou Y; Histidina é His ou H; Glutamina é Gin ou Q; Asparagina é Asn ou N; Lisina é Lis ou K; o ácido aspártico é Asp ou D; o ácido glutâmico é Glu ou E; Cisteína é Cys ou C; Triptofano é Trp ou W; Arginina é Arg ou R; e glicina é Gly ou G.

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8/107 [025] O termo aminoácidos inclui aminoácidos naturais e sintéticos e aminoácidos D e L. Aminoácido padrão ou aminoácido que ocorre naturalmente significa qualquer um dos vinte aminoácidos L comuns encontrados em peptídeos de ocorrência natural. Resíduo de aminoácido não padrão significa qualquer aminoácido, exceto os aminoácidos padrão, independentemente de ser preparado sinteticamente ou derivado de uma fonte natural. Por exemplo, naftilalalanina pode ser substituída pelo triptofano para facilitar a síntese. Outros aminoácidos sintéticos que podem ser substituídos incluem, mas não estão limitados a, Lhidroxipropil, L-3,4-di-hidroxifenilalanil, a-aminoácidos como L-a-hidroxilisil e D-a-metilalanil, L-α- metilalanil, β-aminoácidos e isoquinolil.

[026] O termo aminoácido também abrange aminoácidos quimicamente modificados, incluindo, entre outros, sais, derivados de aminoácidos (como amidas) e substituições. Os aminoácidos contidos nos polipeptídeos da presente invenção, e particularmente no terminal carboxi ou amino, podem ser modificados por metilação, amidação, acetilação ou substituição por outros grupos químicos que podem alterar a meia-vida circulante do polipeptídeo sem afetar adversamente sua atividade. Além disso, uma ligação dissulfeto pode estar presente ou ausente nos polipeptídeos da invenção.

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9/107 [027] Anticorpo e imunoglobulina (Ig) são intercambiáveis e incluem anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada.

[028] Compulsão alimentar, transtorno de compulsão alimentar e distúrbio de compulsão alimentar se referem a um distúrbio alimentar que consiste em episódios de uma alimentação incontrolável, mas sem episódios subsequentes de purga (por exemplo, vômitos). Os comedores compulsivos são identificados como experimentando compulsão alimentar ou compulsividade com base em uma lista de verificação da Escala de compulsão alimentar periódica (Gormally et. 1982. Addict Behav. 7 (1) : 47-55) ou uma medida diagnostica equivalente (por exemplo, avaliação profissional). A gravidade da compulsão alimentar é medida pela gravidade de eventos individuais e/ou pela frequência de tais eventos.

[029] Mimético conformacional se refere a um polipeptideo ou proteína que compartilha pelo menos em parte a mesma conformação que outra proteína. Em uma modalidade, um mimético conformacional do peptídeo α-MSH significa um polipeptideo ou proteína que compartilha pelo menos em parte a mesma conformação que o peptídeo α-MSH (SEQ ID NO: 20) . Em uma modalidade específica, o mimético conformacional do

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10/107 peptídeo α-MSH tem resíduos Arg e Trp consecutivos, uma sequência com pelo menos 75% de homologia de sequência com a sequência GKPV e/ou um resíduo carregado negativamente a montante dos Arg e Trp consecutivos.

[030] Substituição conservativa é aquela em que um aminoácido é substituído por outro aminoácido que possui propriedades semelhantes, de modo que um especialista na técnica da química de peptídeos esperaria que a estrutura secundária e a natureza hidropática do polipeptideo permanecessem substancialmente inalteradas. As substituições de aminoácidos são geralmente, portanto, baseadas na similaridade relativa dos substituintes de cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo, sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho e semelhantes. As substituições exemplares que levam em consideração várias das características anteriores são bem conhecidas dos técnicos especialistas no assunto e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina. As substituições de aminoácidos podem ainda ser feitas com base na similaridade em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, os aminoácidos com carga negativa incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos carregados positivamente incluem histidina, lisina e

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11/107 arginina; e aminoácidos com grupos de cabeça polar não carregados com valores de hidrofilicidade semelhantes incluem leucina, isoleucina e valina; glicina e alanina; asparagina e glutamina; e serina, treonina, fenilalanina e tirosina. Outros grupos de aminoácidos que podem representar alterações conservativas incluem:

(D	Ala,	Pro,	Gly,	Glu,	Asp, Gin,	Asn, Ser, Thr;
(2)	Cys,	Ser,	Tyr,	Thr;
(3)	Vai,	lie,	Leu,	Met,	Ala, Phe;
(4)	Lys,	Arg,	His;	e
(5)	Phe,	Tyr,	Trp,	His .
[031		0	termo	subs ti tui ção	conservativa	de
aminoácidos	pode	ainda	ser	definido	como uma troca	de

aminoácidos dentro de um dos cinco grupos a seguir:

(i) pequenos resíduos não polares alifáticos ou levemente polares: Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;

(ii) resíduos polares com carga negativa e suas amidas: Asp, Asn, Glu, Gin;

(iii) resíduos polares carregados positivamente: His, Arg, Lys;

(iv) grandes resíduos não polares alifáticos: Met, Leu, lie, Vai, Cys;

(v) grandes resíduos aromáticos: Phe, Tyr, Trp.

[032] Epítopo se refere a um arranjo específico de aminoácidos localizados em uma proteína ou proteínas às

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12/107 quais um anticorpo se liga. Epítopos geralmente consistem em agrupamento de superfície quimicamente ativa de moléculas, como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e têm características estruturais tridimensionais bem como características de carga específicas. Os epítopos podem ser lineares e/ou conformacionais, isto é, envolvendo duas ou mais sequências de aminoácidos em várias regiões do antígeno que podem não ser necessariamente contíguas.

[033] Fragmento se refere a uma parte ou região de uma proteína, por exemplo, da proteína ClpB, compreendendo menos resíduos de aminoácidos que uma proteína intacta ou completa, por exemplo, a proteína ClpB. O termo fragmento se refere ainda a, por exemplo, pelo menos cerca de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ou mais porções de aminoácido de uma sequência de aminoácidos, por exemplo, da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, cuja porção é clivada de uma sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente por clivagem proteolítica por pelo menos uma protease ou é uma porção da sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente sintetizada por métodos químicos ou usando a tecnologia de DNA recombinante (por exemplo, expressa a partir de uma porção de a sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos que ocorre naturalmente) conhecida por um técnico especialista no assunto. Fragmento também pode se referir a uma porção,

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13/107 por exemplo, de cerca de 5%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% sobre 90% cerca de 95% ou cerca de 99% de uma sequência de aminoácidos específica, por exemplo, da sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

[034] Identidade ou idêntico, quando usados em uma relação entre as sequências de duas ou mais sequências de aminoácidos, se refere ao grau de relação entre as sequências de aminoácidos, conforme determinado pelo número de correspondências entre as cadeias de caracteres de dois ou mais resíduos de aminoácidos. Identidade mede o percentual de correspondências idênticas entre a menor de duas ou mais sequências com alinhamentos de lacunas (se houver) abordados por um modelo matemático específico ou programa de computador (ou seja, algoritmos). Os métodos para comparar a identidade de duas ou mais sequências são bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, entre outros, aqueles descritos em Arthur M. Lesk, Computational Molecular Biology: Sources and Methods for Sequence Analysis (New-York: Oxford University Press, 1988); Douglas W. Smith, Biocomputing: Informatics and Genome Projects (New-York: Academic Press, 1993); Hugh G. Griffin and Annette M. Griffin, Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 (New Jersey: Humana Press, 1994); Gunnar von Heinje, Sequence Analysis in Molecular Biology: Treasure Trove or Trivial

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Pursuit (Academic Press, 1987); Michael Gribskov and John Devereux, Sequence Analysis Primer (New York: M. Stockton Press, 1991); and Carillo et al., 1988. SIAM J. Appl. Math. 48(5) :1073-1082. Os métodos preferenciais para determinar a identidade são projetados para conferir a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Os métodos de programas de computador para determinar a identidade entre duas sequências incluem o pacote de programas GCG, incluindo GAP (Devereux et al. , 1984. Nucl. Acid. Res. 12(1 Pt l):387-395; Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI), BLASTP, BLASTN, TBLASTN and FASTA (Altschul et al., 1990. J. Mol. Biol. 215(3): 403410) . O programa BLASTX está disponível ao público no National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 1990. J. Mol. Biol. 215(3):403-410). O programa needle, que utiliza o algoritmo de alinhamento global Needleman-Wunsch (Needleman S.B. e Wunsch C.D., 1970. J. Mol. Biol. 48: 443-453) para encontrar o alinhamento ideal (incluindo lacunas) de duas sequências quando se considera todo o seu comprimento, pode preferencialmente ser utilizado. O programa Needle está, por exemplo, disponível no site mundial da ebi.ac.uk. O

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15/107 percentual de identidade de acordo com a invenção é preferencialmente calculado usando o programa EMBOSS: needle (global) com um parâmetro Gap Open igual a 10,0, um parâmetro Gap Extend igual a 0,5 e uma matriz Blosum62. O reconhecido algoritmo Smith Waterman também pode ser usado para determinar a identidade.

[035] Obesidade se refere a uma condição médica em que o sujeito tem preferencialmente um IMC> 30. O IMC ou indice de massa corporal é definido como a massa corporal do sujeito dividida pelo quadrado da sua altura. As fórmulas universalmente usadas na medicina produzem uma unidade de medida de kg/m². Um sujeito moderadamente obeso se refere a um sujeito com um IMG entre 30 e 35. Um sujeito não obeso é um sujeito com um IMG <3 0. Um sujeito não obeso pode, portanto, ter um peso corporal normal ou estar acima do peso. Peso corporal normal se refere aqui ao peso corporal, resultando em um IMG entre 18,5 e 25.

[036] Excesso de peso se refere ao peso corporal, resultando em um IMG entre 25 e 30. Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito com excesso de peso saudável ou com sobrepeso sem complicações. Por sujeito com sobrepeso saudável ou sobrepeso sem complicações entende-se aqui um sujeito com sobrepeso que não exibe nenhuma doença ou condição diretamente associada ao seu peso.

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16/107 [037] Farmaceuticamente ou farmaceuticamente aceitável se refere a entidades e composições moleculares que não produzem uma reação adversa, alérgica ou outra reação desagradável quando administradas a um sujeito, especialmente um humano, conforme apropriado. Um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável se refere a um sólido não tóxico, material de enchimento semissólido ou líquido, diluente, material de encapsulamento ou formulação auxiliar de qualquer tipo. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados nas composições da invenção incluem, mas não estão limitados a trocadores de ions, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, como albumina sérica humana, substâncias tampão como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais de glicerídeos de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, silica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias à base de celulose (por exemplo, carboximetilcelulose de sódio), polietileno glicol, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol e gordura de lã. Nas composições farmacêuticas da presente invenção, o ingrediente ativo como abaixo, sozinho ou em combinação com outro ingrediente ativo, pode ser

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17/107 administrado em uma forma de administração unitária, como uma mistura com suportes farmacêuticos convencionais, a animais e seres humanos. As formas de administração de unidade adequadas compreendem formas de via oral, como comprimidos, cápsulas de gel, pós, grânulos e suspensões ou soluções orais, formas de administração sublingual e bucal, aerossóis, implantes subcutâneos, transdérmicos, tópicos, intraperitoneais, intramusculares, intravenosos, subdérmicos, intratecais e formas de administração intranasal e formas de administração retal. Preferencialmente, as composições farmacêuticas contêm veículos que são farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação capaz de ser injetada. Estas podem ser, em particular, as soluções salinas isotônicas, estéreis e salinas (fosfato monossódico ou dissódico, cloreto de sódio, potássio, cálcio ou magnésio e semelhantes ou misturas de tais sais) ou composições secas, especialmente liofilizadas que, por adição, dependendo do caso, de água esterilizada ou soro fisiológico, permitem a constituição de soluções injetáveis. As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem as soluções ou as dispersões aquosas estéreis; as formulações incluindo o óleo de gergelim, o óleo de amendoim ou o propileno glicol aquoso; e os pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou as dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, o

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18/107 formulário deve ser estéril e fluido, na medida em que exista facilidade de seringa. Deve ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservado contra a ação contaminante de micro-organismos, como bactérias e fungos. As soluções compreendendo compostos da invenção como base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em água adequadamente misturada com um surfactante, tal como hidroxipropilcelulose. As dispersões também podem ser preparadas em glicerol, polietileno glicóis líquidos e as misturas dos mesmos e em óleos. Sob condições normais do armazenamento e uso, essas preparações contêm um conservante para impedir o crescimento de micro-organismos. O ingrediente ativo pode ser formulado em uma composição na forma neutra ou salina. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos, como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico ou ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxil livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, como, por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, hidróxido de cálcio ou hidróxido de férrico, e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes. O carreador também pode ser um solvente ou meio

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19/107 de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e semelhantes), as misturas adequadas dos mesmos e os óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessário no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser provocada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, por parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferencial incluir os agentes isotônicos, por exemplo, os açúcares ou o cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina. As soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando os polipeptídeos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dentre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos

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20/107 preferenciais de preparação são as técnicas de secagem a vácuo e de liofilização que produzem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução filtrada anteriormente esterilizada. Após a formulação, as soluções serão administradas de maneira compatível com a formulação de dosagem e na quantidade que for terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, como os tipos de soluções injetáveis descritas acima, mas também podem ser empregadas como cápsulas de liberação de fármacos e semelhantes. Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada, se necessário, e o diluente líquido deve primeiramente se tornar isotônico com a solução salina ou com suficiente glicose. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para a administração intravenosa, administração intramuscular, administração subcutânea e a administração intraperitoneal. A este respeito, os meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão conhecidos dos técnicos especialistas no assunto à luz da presente divulgação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 mL de solução isotônica de NaCl e adicionada em 1000 mL de fluido de hipodermóclise ou injetada no local proposto da infusão. Alguma variação na dosagem ocorrerá necessariamente, dependendo da condição do sujeito a ser

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21/107 tratado. A pessoa responsável pela administração determinará, em qualquer caso, a dose apropriada para o suj eito.

[038] Polipeptídeo é usado em seu significado convencional, isto é, como uma sequência de menos do que 100 aminoácidos. Um polipeptídeo geralmente se refere a uma entidade monomérica. O termo proteína se refere a uma sequência de mais do que 100 aminoácidos e/ou a uma entidade multimérica. As proteínas da invenção não estão limitadas a um comprimento específico do produto. Este termo não se refere ou exclui as modificações pós-expressão da proteína, por exemplo, a glicosilação, a acetilação, a fosforilação e semelhantes, bem como outras modificações conhecidas na técnica, ocorrendo naturalmente e não naturalmente. Uma proteína pode ser uma proteína inteira ou uma subsequência da mesma. Uma proteina isolada é aquela que foi identificada e separada e/ou recuperada de um componente de seu ambiente natural. Em modalidades preferenciais, a proteína isolada será purificada:

(1) a mais de 80, 85, 90, 95% em peso de proteína, conforme determinado pelo método de Lowry, e mais preferencialmente mais de 96, 97, 98 ou 99% em peso;

(2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos da sequência de aminoácidos N-terminal ou interna pela utilização de um sequenciador de copo giratório; ou

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22/107 (3) à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras usando coloração com azul de Coomassie ou, preferencialmente, prata.

[039] A proteína isolada inclui a proteína in sítu nas células recombinantes, uma vez que pelo menos um componente do ambiente natural da proteína não estará presente. Normalmente, no entanto, a proteína isolada será preparada por pelo menos uma etapa de purificação.

[040] Derivado de polipeptídeo ou derivado de proteína se refere ao composto com um grupo amino (--NH--) e, mais particularmente, uma ligação peptídica. Os polipeptídeos e as proteínas podem ser considerados amidas substituídas. Como o grupo amida, a ligação peptídica mostra um alto grau de estabilização por ressonância. A ligação simples C-N na ligação peptídica tem tipicamente cerca de 40 por cento de caráter de ligação dupla e a ligação dupla C=O cerca de 40% de caráter de ligação única. Grupos de proteção são aqueles que impedem as reações indesejáveis (como a proteólise) envolvendo os grupos funcionais desprotegidos. Exemplos específicos de grupos protetores de amino incluem formil; trifluoroacetil; benziloxicarbonil; benziloxicarbonila substituído tal como (orto- ou para-) clorobenziloxicarbonila e (orto- ou para-) bromobenziloxicarbonila; e oxicarbonil alifático como tbutoxicarbonil e t-amiloxicarbonil. Os grupos carboxil de

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23/107 aminoácidos podem ser protegidos através da conversão em grupos éster. Os grupos éster incluem ésteres benzílicos, ésteres benzílicos substituídos tais como éster metoxibenzílico; ésteres alquílicos tais como éster ciclohexilico, éster ciclo-heptil ou éster t-butílico. A porção guanidino pode ser protegida por nitro; ou arilsulfonil como tosil, metoxibenzenossulfonil ou mesitilenossulfonil, mesmo que não precise de um grupo protetor. Os grupos protetores de imidazol incluem tosil, benzil e dinitrofenil. O grupo indol de triptofano pode ser protegido por formil ou pode não ser protegido.

[041] A modificação do polipeptideo ou proteína que compreende ou consiste em pelo menos um fragmento de uma proteína ClpB ou variante do mesmo visa, em particular, melhorar seu tempo de vida ín vivo. Um tipo de modificação é a adição aos terminais N ou C do polipeptideo ou proteína de polietileno glicol (PEG). O PEG é conhecido pelos técnicos especialistas no assunto como tendo muitas propriedades que o tornam um carreador ideal para os polipeptideos, como a alta solubilidade em água, a alta mobilidade na solução e a baixa imunogenicidade. Esta modificação também protege os polipeptideos e as proteínas das exopeptidases e, portanto, aumenta sua estabilidade geral ín vivo.

[042] As outras modificações usadas para evitar a degradação de polipeptideos e proteínas por endopeptidases

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24/107 ou exopeptidases incluem as modificações no terminal N, como a acetilação ou a glicosilação, as modificações no terminal C, como a amidação e o uso de aminoácidos não naturais (aminoácidos β-amino e α-trifluorometil), em particular os sítios dentro dos polipeptídeos ou das proteínas.

[043] Outra alternativa para aumentar o tamanho molecular dos polipeptídeos e das proteínas é a fusão genética dos polipeptídeos ao domínio Fc da imunoglobulina humana (incluindo, por exemplo, IgA, IgM e IgG) ou a fusão dos polipeptídeos à albumina.

[044] Saciedade se refere a um estado essencialmente homeostático em que um sujeito sente que seus desejos são satisfeitos ou minimizados. Acredita-se que muitos fatores fisiológicos afetam a saciedade de um indivíduo. Por exemplo, gustação, ou paladar, olfação ou cheiro, bem como uma sensação de plenitude no estômago podem contribuir para o fato de um sujeito se sentir saciado. Mais particularmente, saciedade é o estado em que mais refeições são inibidas e determinam o tempo entre as refeições e a quantidade de comida consumida na próxima refeição. Um sentimento de saciedade aprimorado ou algo semelhante, isso tem o significado de o sentimento de saciedade ser mais pronunciado e/ou mais prolongado em comparação com uma situação de controle.

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25/107 [045] Saciedade se refere ao estado que termina de comer dentro de uma refeição, geralmente ocorrendo/observado dentro de um período (por exemplo, 20 a 30 minutos) após o início do consumo da refeição. Assim, sempre que for feita referência neste documento a induzir saciedade ou algo semelhante, isso tem o significado de despertar a tendência de um sujeito parar de consumir alimentos durante uma refeição. O efeito sobre a saciedade pode ser determinado pela pontuação do ponto no tempo do término da refeição, ou seja, o tempo decorrido entre o início e o término da refeição. Um efeito de saciedade é observado se a quantidade de calorias consumidas no final da refeição for significativamente menor do que nos controles, como por exemplo pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20% ou mais. Durante um período mais longo (como 1, 2, 3, 4, 5 semanas ou mais), também é possível pontuar a redução do peso corporal ou a alteração do peso corporal em comparação com uma dieta controle. O peso corporal de um sujeito a quem são administradas quantidades regulares das composições de teste (por exemplo, uma vez ao dia, duas vezes ao dia ou mais) é preferencialmente significativamente controlado (reduzido ou menos aumentado) em comparação com os sujeitos do controle. Como aqui utilizado, o sujeito de controle se refere aos sujeitos que não foram administrados com o polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo, vetor,

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26/107 composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina da invenção.

[046] Sujeito se refere a um animal de sangue quente, de preferência, um ser humano, um animal de estimação ou gado. Como usado aqui, os termos animal de estimação e rebanho incluem, mas não estão limitados a, cães, gatos, porquinhos da índia, coelhos, porcos, gado, ovelhas, cabras, cavalos e aves. Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito masculino ou feminino. Em algumas modalidades, o sujeito é um adulto (por exemplo, um sujeito com idade superior a 18 anos [em anos humanos] ou um sujeito após a capacidade reprodutiva ter sido atingida) . Em outra modalidade, o sujeito é uma criança (por exemplo, um sujeito com menos de 18 anos de idade [em anos humanos] ou um sujeito antes que a capacidade reprodutiva tenha sido atingida). Em algumas modalidades, o sujeito pode ser um paciente, isto é, um sujeito que está aguardando o recebimento ou está recebendo cuidados médicos ou foi/é/será o objeto de um procedimento médico, como um procedimento médico de acordo com os métodos da presente invenção, ou é monitorado quanto ao desenvolvimento de uma doença.

[047] Liberação sustentada indica que o agente terapeuticamente ativo pode ser liberado a partir da composição a uma taxa controlada de maneira que os níveis sanguíneos (que ainda estão abaixo dos níveis tóxicos do

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27/107 medicamento) possam ser mantidos em níveis terapeuticamente benéficos por um período prolongado de tempo (por exemplo, 24 horas ou mais, proporcionando assim uma dose única, formulação de dosagem diária).

[048] Quantidade terapeuticamente eficaz se refere a uma quantidade de:

o polipeptídeo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo; ou o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo, como aqui descrito; ou o vetor que codifica um polipeptídeo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo, como aqui descrito;

suficiente para, sem causar efeitos colaterais negativos ou adversos significativos ao sujeito, alcançar o efeito benéfico (por exemplo, estimular a saciedade, prolongar a saciedade, reduzir a ingestão de alimentos, controlar, em particular, a redução, o ganho de peso, a estimulação da perda de peso e/ou a redução da massa gorda na proporção de massa magra) . No contexto da presente invenção, a quantidade de polipeptídeo, de proteína No contexto da presente invenção, a quantidade de polipeptídeo,

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28/107 proteína, polinucleotídeo ou vetor a ser administrada ao sujeito dependerá das características do indivíduo, como saúde geral, idade, sexo, peso corporal, etc. O técnico especialista no assunto será capaz de determinar as dosagens apropriadas, dependendo desses e de outros fatores.

[049] Tratamento, tratando ou alivio se referem ao tratamento terapêutico e às medidas profiláticas ou preventivas em que o objetivo é impedir ou diminuir (reduzir) a condição ou distúrbio alvo. Aqueles que precisam de tratamento incluem aqueles que já estão com o distúrbio, bem como aqueles propensos a ter o distúrbio ou aqueles em quem o distúrbio deve ser prevenido. Um sujeito ou mamífero é tratado com sucesso para a condição ou distúrbio alvo se, após receber uma quantidade terapêutica de um agente de acordo com a presente invenção, o sujeito apresentar observável e/ou mensurável: saciedade, saciedade prolongada, ingestão reduzida de alimentos, controle do ganho de peso, perda de peso estimulada e/ou redução da massa gorda na proporção de massa magra. Esses parâmetros para avaliar o sucesso do tratamento e a melhoria da condição ou distúrbio são facilmente mensuráveis por procedimentos de rotina familiares a um médico.

[050] Variante e mutante são termos intercambiáveis e se referem a um polipeptídeo ou proteína que tipicamente difere de um polipeptídeo ou proteína

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29/107 especificamente divulgados aqui em uma ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções. Tais variantes podem ocorrer naturalmente ou podem ser geradas sinteticamente, por exemplo, modificando uma sequência de polipeptídeo ou proteína e avaliando uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo ou proteína, conforme descrito aqui e/ou utilizando qualquer uma de várias técnicas bem conhecidas na técnica. Modificações podem ser feitas na estrutura de polipeptídeos ou proteínas e ainda obter uma molécula funcional que codifica um polipeptídeo variante ou derivado ou proteína com características desejáveis.

[051] Quando se deseja alterar a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou proteína para criar um equivalente, ou mesmo uma variante ou porção melhorada de um polipeptídeo ou proteína da invenção, um técnico especialista no assunto mudará tipicamente um ou mais dos códons da sequência de DNA codificadora. Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda de função apreciável em comparação com a proteína de tipo selvagem, por exemplo, com a proteína ClpB.

[052] Certas substituições, deleções, adições e/ou inserções de sequência de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de polipeptídeo ou proteína e, é claro, sua sequência codificadora de DNA subjacente e, portanto, obtêm

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30/107 um polipeptídeo ou proteína com propriedades diferentes. É assim contemplado que várias alterações podem ser feitas nas sequências polipeptídicas ou proteicas ou nas sequências correspondentes de DNA que codificam os referidos polipeptídeos ou proteínas com regulação apreciável (isto é, ativação/aprimoramento ou inibição/perda) de sua utilidade ou atividade biológica. Tais mutações incluem, mas não estão limitadas a, mutações nonsense, mutações de deslocamento de quadro e mutações missense não conservativas.

[053] Certas substituições, deleções, adições e/ou inserções de sequência de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de polipeptídeo ou proteína e, é claro, sua sequência codificadora de DNA subjacente e, não obstante, obtêm um polipeptídeo ou proteína com propriedades semelhantes. É assim contemplado que várias alterações podem ser feitas nas sequências polipeptídicas ou proteicas ou nas sequências correspondentes de DNA que codificam os referidos polipeptídeos ou proteínas sem apreciável perda de sua utilidade ou atividade biológica. Tais mutações incluem, mas não estão limitadas a, mutações silenciosas, mutações missense silenciosas e mutações conservativas.

[054] Os termos variante e mutante também abrangem polipeptídeo com uma ou mais das seguintes modificações:

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1) polipeptideos em que uma ou mais das ligações peptidil -C(O)NR- (ligações) foram substituídas por uma ligação não peptidil como uma ligação -CH2-carbamato (CH2OC(O)NR-), uma ligação fosfonato, uma ligação -CH2sulfonamida (-CH2-S (O) 2NR-), uma ligação ureia (-NHC(O)NH-), uma ligação -CH2-amina secundária, ou com uma ligação de peptidil alquilado (-C(O)NR-) em que R é C1-C4 alquil;

ii) Polipeptideos em que o N-terminal é derivado a um grupo -NRRi, a um grupo -NRC(O)R, a um grupo -NRC(O)OR, a um grupo -NRS(O)2R, a um grupo -NHC(O)NHR em que R e Ri são hidrogênio ou um C1-C4 alquil com a condição de que R e Ri não são ambos hidrogênio;

iii) Polipeptideos em que o C-terminal é derivado a C(O)R2 em que R2 é selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C4 alcóxi e -NR3R4 em que R3 e R4 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em hidrogênio e C1-C4 alquil.

[055] Tipo selvagem se refere a um gene ou uma proteína que possui as características desse gene ou proteína isolada de uma fonte que ocorre naturalmente. Um gene ou proteína do tipo selvagem é aquele que é mais frequentemente observado em uma população e, portanto, é arbitrariamente designado como a forma tipo selvagem do gene ou da proteína, em contraste com uma variante ou mutante.

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DESCRIÇÃO DETALHADA [056]

A presente invenção se refere assim a um polipeptideo ou proteína que compreende ou consiste em pelo menos um fragmento de uma proteína ClpB ou uma variante da mesma.

[057]

Em uma modalidade, o polipeptideo ou proteína da invenção compreende ou consiste em pelo menos 15 aminoácidos em comprimento. Em uma modalidade, o polipeptideo ou proteína da invenção compreende ou consiste em pelo menos 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100 ou mais aminoácidos. Em uma modalidade, o polipeptideo da invenção compreende ou consiste em menos do que 100, 75, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17 ou 16 aminoácidos em comprimento.

[058] Em uma modalidade, o polipeptideo ou proteína da invenção compreende de 4 a 100 ou mais aminoácidos, de 10 a 80 aminoácidos, de 15 a 70 aminoácidos, de 20 a 60 aminoácidos, de 25 a 50 aminoácidos, de 30 a 45 aminoácidos ou de 35 a 40 aminoácidos.

[059] Em outra modalidade, o polipeptideo da invenção compreende de 10 a 100 aminoácidos ou de 10 a 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 ou 15 aminoácidos. Em outra modalidade, o polipeptideo da invenção compreende de 15 a 100 aminoácidos ou de 15 a 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25 ou 20 aminoácidos. Em outra modalidade, o polipeptideo

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33/107 da invenção compreende de 20 a 100 aminoácidos ou de 20 a 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30 ou 25 aminoácidos. Em outra modalidade, o polipeptideo da invenção compreende de 25 a 100 aminoácidos, ou de 25 a 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35 ou 30 aminoácidos.

[060] Em uma modalidade, o polipeptideo da invenção compreende ou consiste em 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 aminoácidos. Em outra modalidade, o polipeptideo da invenção compreende ou consiste em 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 aminoácidos.

[061] Em uma modalidade, o polipeptideo da invenção não compreende menos de 15 aminoácidos. Em uma modalidade, o polipeptideo da invenção compreende pelo menos 15 aminoácidos. Em uma modalidade, o polipeptideo da invenção não compreende menos de 20 aminoácidos. Em uma modalidade, o polipeptideo da invenção compreende pelo menos 20 aminoácidos.

[062] Em outra modalidade, a proteína da invenção compreende ou consiste em pelo menos 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ou mais aminoácidos de comprimento.

[063] Em uma modalidade, a proteína da invenção compreende de 100 a 1500 ou mais aminoácidos, de 100 a 1000 aminoácidos, de 100 a 900 aminoácidos, de 100 a 850 aminoácidos, de 100 a 800 aminoácidos, de 100 a 750

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34/107 aminoácidos ou de 100 a 700 aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína da invenção compreende de 150 a 1500, 1000, 900, 850, 800, 750 ou 700 aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína da invenção compreende de 200 a 1500, 1000, 900, 850, 800, 750 ou 700 aminoácidos. Em outra modalidade, a proteína da invenção compreende de 300 a 1500, 1000, 900, 850, 800, 750 ou 700 aminoácidos.

[064] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende de 15 a 1500 ou mais aminoácidos, de 15 a 1000 aminoácidos, de 15 a 900 aminoácidos, de 15 a 800 aminoácidos, de 15 a 800 aminoácidos, de 15 a 700 aminoácidos, de 15 a 600 aminoácidos ou 15 a 500 aminoácidos. Em outra modalidade, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende de 20 a 1500, 1000, 900, 800, 700, 600 ou 500 aminoácidos. Em outra modalidade, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende de 25 a 1500, 1000, 900, 800, 700, 600 ou 500 aminoácidos. Em outra modalidade, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende de 30 a 1500, 1000, 900, 800, 700, 600 ou 500 aminoácidos.

[065] Uma proteína ClpB de acordo com a presente invenção se refere a uma proteína protease caseinolítica B, que é um membro da família HsplOO/ClpB de hexamérica AAA+ATPases.

[066] Em uma modalidade, a proteína ClpB de acordo com a presente invenção é uma proteína bacteriana ClpB. Em

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35/107 uma modalidade, a proteína ClpB de acordo com a presente invenção é uma proteína Enterobacteríaceae. Enterobacteríaceae incluem, entre outras, Arsenophonus, Brennería, Buchnera, Budvícía, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Cosenzaea, Cronobacter, Díckeya, Edwardsiella, Enterobacillus, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Franconibacter, Gibbsiella, Hafnia, Izhakiella, Kosakonia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Lelliottia, Leminorella, Levinea, Lonsdalea, Mangrovibacter, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Phaseolibacter, Photorhabdus, Plesiomonas, Pluralibacter, Pragia, Proteus, Providencia, Pseudocitrobacter, Rahnella, Raoultella, Rosenbergiella, Rouxiella, Saccharobacter, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Shimwellia, Siccibacter, Sodalis, Tatumella, Thorsellia, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia e Yokenella.

[067] Em uma modalidade, a proteína ClpB de acordo com a presente invenção é uma ClpB da Hafnia, preferencialmente da Hafnia alvei (SEQ ID NO: 1) . Em uma modalidade, a proteína ClpB de acordo com a presente invenção é uma ClpB da E. coli, preferencialmente, de E. coll K12 (SEQ ID NO: 21).

[068] Em Hafnia alvei, a proteína chaperona ClpB é uma proteína de 857 aminoácidos. Em uma modalidade, a

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36/107 proteína ClpB tem a sequência de aminoácidos da proteína chaperona ClpB de Hafnia alveí conforme estabelecido na SEQ ID NO: 1 (Número de referência do GenBank: KIC99545.2) . Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de ClpB compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 95 a cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. No contexto do presente pedido, o percentual de identidade é calculado usando um alinhamento global (ou seja, as duas sequências são comparadas em todo o seu comprimento).

[069] SEQ ID NO: 1

MRLDRLTSKFQLALADAQSLALGRDNQFIEPVHLMSALLNQDGGTVRPLLTSAG VNTASLRQELEQAISRLPQVEGAGGDVQPSNELIRVLNLCDKLAQKRNDTFISSELFVL AVLEDRGNLGDILKAAGANVQKVSTAIEQMRGGEKVDDANAEDQRQALKKYTVDLTERA EQGKLDPVIGRDEEIRRTIQVLQRRTKNNPVLIGEPGVGKTAIVEGLAQRIINGEVPEG LKNKRVLSLDMGSLIAGAKFRGEFEERLKAVLSDLSKQEGNVILFIDELHTMVGAGKGD GAMDAGNMLKPALARGELHCVGATTLDEYRQYIEKDAALERRFQKVFVAEPTVEDTIAI LRGLKERYELHHHVQITDPAIVAAANLSHRYIADRQLPDKAIDLIDEAASSIRMQMDSK PESLDRLERRIIQLKLEQQALNKESDEASKKRLEMLNEELEHKEREYSELEEEWKAEKA SLSGTQNIKAEIEQAKIALEQARRVGDLAKMSEIQYGKLPGLEKQLEAATQSEGKTMKL LRNKVTDVEIAEVLARWTGIPVSRMLESERAKLLRMEDDLHERVIGQNEAVEAVSNAIR RSRAGLSDPNRPIGSFLFLGPTGVGKTELCKALANFLFDSDDAMVRIDMSEFMEKHSVS RLVGAPPGYVGYEEGGYLTEAVRRRPYSVILLDEVEKAHPDVFNILLQVLDDGRLTDGQ GRTVDFRNTWIMTSNLGSDLIQDRFGQLDYGEMKELVMSWSHHFRPEFINRIDETW

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FHPLDQKNIKAIARIQLERLYQRLEEKGYSVTITDAALEQLSKAGFDPVYGARPLKRAI

QQEIENPLAQQILSGKLIPGKDITLDVADEQIVAKQ [070] Na E. coll K12, a proteína chaperona ClpB é uma proteína de 857 aminoácidos. Em uma modalidade, a proteína ClpB tem a sequência de aminoácidos da proteína chaperona ClpB de E. coll K12 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 21 (Número de referência do GenBank: BAA16476.1). Em uma modalidade, a sequência de aminoácidos de ClpB compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos pelo menos cerca de 95 a cerca de 100% idêntica à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. No contexto do presente pedido, o percentual de identidade é calculado usando um alinhamento global (ou seja, as duas sequências são comparadas em todo o seu comprimento).

[071] Em uma modalidade, a proteína ClpB de acordo com a presente invenção é uma variante de ClpB.

[072] Em uma modalidade, uma variante de ClpB como aqui utilizada compreende ou consiste em uma sequência que apresenta uma identidade de sequência de pelo menos cerca de 70% com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1, de preferência de pelo menos cerca de 80%, mais preferencialmente de pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais.

[073] Uma variante ClpB também pode, ou alternativamente, conter alterações não conservativas. Em

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38/107 uma modalidade, os polipeptídeos variantes diferem de uma sequência nativa por substituição, exclusão ou adição de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos. As variantes também podem (ou alternativamente) ser modificadas por, por exemplo, a deleção ou adição de aminoácidos que têm influência mínima na imunogenicidade, estrutura secundária e natureza hidropática do polipeptideo.

[074] Em uma modalidade, a variante de SEQ ID NO: 1 é capaz de induzir a saciedade, prolongar a saciedade, reduzir a ingestão de alimentos, controlar o ganho de peso, estimular a perda de peso e/ou reduzir a proporção de massa gorda na massa magra em um sujeito necessitado com uma eficiência pelo menos equivalente à da SEQ ID NO: 1.

[075] Em uma modalidade, a variante de SEQ ID NO: 1 compreende substituições de aminoácidos conservativas em comparação com a sequência da SEQ ID NO: 1, como, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições de aminoácidos conservativas.

[07 6] Em outra modalidade, uma variante de SEQ ID NO: 1 é um polipeptideo em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos da sequência da SEQ ID NO: 1 são/ estão ausentes ou substituídos por qualquer aminoácido, ou em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos (contíguos ou não) é/são adicionado(s).

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39/107 [077] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende ou consiste em pelo menos um fragmento de ClpB, preferencialmente pelo menos um fragmento de ClpB com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

[078] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100 ou mais aminoácidos de uma proteína ClpB, preferencialmente de um ClpB com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1.

[079] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em menos de 100, 75, 60, 50, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 ou menos aminoácidos de comprimento.

[080] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende de 4 a 100 ou mais aminoácidos, de 10 a 80 aminoácidos, de 15 a 70 aminoácidos, de 20 a 60 aminoácidos, de 25 a 50 aminoácidos, de 30 a 45 aminoácidos ou de 35 a 40 aminoácidos.

[081] Em outra modalidade, um fragmento ClpB compreende de 4 a 80 aminoácidos ou de 4 a 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 ou 10 aminoácidos. Em outra modalidade, um fragmento ClpB compreende de 6 a 100 aminoácidos, ou de 6 a 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 ou 10 aminoácidos. Em outra modalidade, um fragmento

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ClpB compreende de 8 a 100 aminoácidos, ou de 8 a 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 ou 10 aminoácidos. Em outra modalidade, um fragmento ClpB compreende de 10 a 100 aminoácidos, ou de 10 a 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 ou 15 aminoácidos.

[082] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos. Em outra modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 ou 100 aminoácidos.

[083] Em outra modalidade, um fragmento ClpB compreende de 100 a 500 ou mais aminoácidos, de 100 a 400 aminoácidos, de 100 a 300 aminoácidos, de 100 a 200 aminoácidos ou de 100 a 150 aminoácidos. Em outra modalidade, um fragmento de ClpB compreende de 10 a 100 aminoácidos, ou de 10 a 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20 ou 15 aminoácidos. Em outra modalidade, um fragmento ClpB compreende de 100 a 350 aminoácidos, de 150 a 300 aminoácidos ou de 200 a 250 aminoácidos.

[084] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em 100, 125, 150, 175, 200, 250 ou 300 aminoácidos. Em outra modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em 220 aminoácidos. Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em 210, 211, 212,

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213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229 ou 230 aminoácidos.

[085] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100 ou mais resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 ou a variante das mesmas.

[086] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100 ou mais resíduos de aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 75, 100 ou mais resíduos de aminoácidos não contíguos da SEQ ID NO: 1 ou a variante das mesmas. Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em pelo menos 5 resíduos de aminoácidos não contíguos da SEQ ID NO: 1 ou a variante das mesmas. Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em pelo menos 6 resíduos de aminoácidos não contíguos da SEQ ID NO: 1 ou a variante das mesmas.

[087] Em uma modalidade, um fragmento ClpB da invenção compreende um resíduo carregado negativamente e dois resíduos Arg e Trp consecutivos. Em uma modalidade, um fragmento ClpB da invenção compreende resíduos Arg e Trp

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consecutivos	e um resíduo carregado	negativamente	a montante
dos resíduos [088]	Arg e Trp consecutivos Em uma modalidade,	um fragmento	ClpB da
invenção compreende pelo menos	um resíduo	carregado
negativamente	: a montante de resíduos Arg e Trp consecutivos.

Como aqui usado, o termo a montante de resíduos Arg e Trp consecutivos significa na posição -1, -2, -3, -4 ou -5 do resíduo Arg. Por outras palavras, em uma modalidade, o resíduo Arg da sequência Arg e Trp consecutiva está na

posição +1,	+ 2,	+ 3,	+ 4	ou	+ 5	do	resíduo	carregado
negativamente.
[089]	Em	uma	modalidade,	o	resíduo	carregado
negativamente	é um	resíduo	Glu	ou	Asp.	Em uma	modalidade

particular, o resíduo carregado negativamente é um resíduo Glu.

[090] Em uma modalidade, o resíduo carregado negativamente é um resíduo Glu ou Asp. Em uma modalidade particular, o resíduo carregado negativamente é um resíduo Glu.

[091] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende pelo menos um resíduo de aminoácido E538 da SEQ ID NO: 1 ou variante da mesma.

[092] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em pelo menos os resíduos de aminoácidos R542 e/ou W543 da SEQ ID NO: 1 ou a variante das

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43/107 mesmas. Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em pelo menos os resíduos de aminoácidos R542 e W543 da SEQ ID NO: 1 ou a variante das mesmas.

[093] Em uma modalidade, um fragmento de ClpB compreende ou consiste em pelo menos resíduo de aminoácido: E538, R542 e W543 de SEQ ID NO: 1.

[094] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 .

[095] SEQ ID NO: 2

E/D-X2-4-R-W em que X é qualquer aminoácido e X2-4 é 2, 3 ou 4 de qualquer aminoácido, preferencialmente em que E/D é E.

[096] Em outra modalidade particular, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3.

[097] SEQ ID NO: 3

E/D-V-X-X-R-W em que X é qualquer aminoácido, de preferência em que E/D é E.

[098] Em outra modalidade particular, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 4.

[099] SEQ ID NO: 4

E/D-V-L-A-R-W

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44/107 [100] Em uma modalidade preferencial, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5.

[101] SEQ ID NO: 5

E-V-L-A-R-W [102] Em uma modalidade particular, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2, 3, 4 ou 5 e tem um comprimento de pelo menos 15 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 20 aminoácidos.

[103] Em uma modalidade, um fragmento ClpB da invenção compreende ainda uma sequência tendo pelo menos 75% de homologia de sequência com a sequência GKPV.

[104] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ainda pelo menos os resíduos de aminoácidos G545, P547 e/ou V548 da SEQ ID NO: 1 ou a variante das mesmas. Em uma modalidade particular, um fragmento ClpB compreende pelo menos os resíduos de aminoácidos G545, 1546, P547 e/ou V548 da SEQ ID NO: 1 ou a variante das mesmas. Em uma modalidade preferencial, um fragmento de ClpB compreende pelo menos os resíduos de aminoácidos G545, 1546, P547 e V548 da SEQ ID NO: 1 ou a variante das mesmas.

[105] Em uma modalidade, um fragmento ClpB de acordo com a invenção compreende ou consiste em pelo menos os resíduos de aminoácidos E538, R542, W543, G545, P547 e V548 da SEQ ID NO: 1 ou a variante das mesmas. Em uma modalidade,

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45/107 um fragmento ClpB de acordo com a invenção compreende ou consiste em pelo menos os resíduos de aminoácidos E538, R542, W543, G545, 1546, P547 e V548 da SEQ ID NO: 1 ou a variante das mesmas.

[106] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6.

[107] SEQ ID NO: 6

E/D-X2-4-R-W-X-G-X-P-V em que X é qualquer aminoácido e X2-4 é 2, 3 ou 4 de qualquer aminoácido, preferencialmente em que E/D é E.

[108]	Em uma modalidade,	um fragmento	ClpB
compreende	ou consiste em sequência	de aminoácidos	SEQ ID
NO: 7 .
[109]	SEQ ID NO: 7
E/D-X2-	-4-R-W-X-G-1/K-P-V

em que X é qualquer aminoácido e X2-4 é 2, 3 ou 4 de qualquer aminoácido.

[110]	Em uma modalidade,	um fragmento	ClpB
compreende NO: 8 . [111] E-X2-4-	ou consiste em sequência SEQ ID NO: 8 R-W-X-G-I/K-P-V	de aminoácidos	SEQ ID

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46/107 [112] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9.

[113] SEQ ID NO: 9

E-X2-4-R-W-X-G-I-P-V em que X é qualquer aminoácido e X2-4 é 2, 3 ou 4 de qualquer aminoácido.

[114] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 10.

[115] SEQ ID NO: 10

E-X2-4-R-W-T-G-I-P-V em que X2-4 é 2, 3 ou 4 de qualquer aminoácido.

[116] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11.

[117] SEQ ID NO: 11

E-V-X-X-R-W-T-G-I-P-V em que X é qualquer aminoácido.

[118] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12.

[119] SEQ ID NO: 12

E-V-L-A-R-W-T-G-I-P-V

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47/107 [120]

Em uma modalidade um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID

NO: 13.

[121]

SEQ ID NO: 13

E-X2-4-R-W-X-G-K-P-V em que X é qualquer aminoácido e X2-4 é 2, 3 ou 4 de qualquer aminoácido.

[122]

Em uma modalidade um fragmento

ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos

SEQ ID

NO: 14.

[123]

SEQ ID NO: 14

E-X2-4-R-W-T-G-K-P-V em que X2-4 é 2, 3 ou 4 de qualquer aminoácido.

[124]

Em uma modalidade um fragmento

ClpB compreende ou consiste em sequencia de aminoácidos

SEQ ID

NO: 15.

[125]

SEQ ID NO: 15

E-V-X-X-R-W-T-G-K-P-V em que X é qualquer aminoácido.

[126]

Em uma modalidade um fragmento

ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos

SEQ ID

NO: 16.

[127]

SEQ ID NO: 16

E-V-L-A-R-W-T-G-K-P-V

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48/107 [128] Em uma modalidade particular, o polipeptídeo ou proteína da invenção compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e tem um comprimento de pelo menos 15 aminoácidos, preferencialmente pelo menos 20 aminoácidos.

[129] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 70% com a sequência de aminoácidos 538-548 da SEQ ID NO: 1 (EVLARWTGIPV, SEQ ID NO: 12), de preferência de pelo menos 80%, mais preferencialmente de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 12.

[130] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 70% com a sequência de aminoácidos 536-548 da SEQ ID NO: 1 (IAEVLARWTGIPV, SEQ ID NO: 18), de preferência de pelo menos 80%, mais preferencialmente de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 18.

[131] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que

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49/107 apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 70% com a sequência de aminoácidos 534-548 da SEQ ID NO: 21 (AEIAEVLARWTGIPV, SEQ ID NO: 19), de preferência de pelo menos 80%, mais preferencialmente de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 19.

[132] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 70% com a sequência de aminoácidos 534-548 da SEQ ID NO: 1 (VEIAEVLARWTGIPV, SEQ ID NO: 17), de preferência de pelo menos 80%, mais preferencialmente de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 17.

[133] Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos que apresenta uma identidade de sequência de pelo menos 70% com a sequência de aminoácidos 537-756 da SEQ ID NO: 21 (SEQ ID NO: 22), de preferência de pelo menos 80%, mais preferencialmente de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais. Em uma modalidade, um fragmento ClpB compreende ou consiste em sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 22.

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50/107 [134] Em uma modalidade, um polipeptideo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento de uma proteína ClpB ou variante do mesmo não consiste na sequência de aminoácidos de uma proteína ClpB. Por outras palavras, em uma modalidade, o polipeptideo ou proteína da invenção não é uma proteína ClpB completa. Por conseguinte, em uma modalidade, a sequência de aminoácidos do polipeptideo ou proteína da invenção não é 100% idêntica a uma sequência de ClpB. Em uma modalidade particular, a sequência de aminoácidos do polipeptideo ou proteína da invenção não é 100% idêntica à SEQ ID NO: 1 e/ou não é 100% idêntica à SEQ ID NO: 21.

[135] Em uma modalidade, um polipeptideo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento de uma proteína ClpB ou variante do mesmo não consiste na sequência de aminoácidos de α-MSH. Em uma modalidade específica, um polipeptideo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento de uma proteína ClpB ou variante do mesmo não consiste na sequência de aminoácidos conforme estabelecido na SEQ ID NO: 20 .

[136] Em uma modalidade, o polipeptideo ou proteína da invenção ou variante do mesmo possui homologia com a-MSH (SEQ ID NO: 20) . Em uma modalidade, o polipeptideo ou proteína da invenção ou variante do mesmo possui homologia

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51/107 conformacional com α-MSH. Em outra modalidade, ο polipeptideo ou proteína da invenção ou variante do mesmo possui homologia de sequência com α-MSH. Em outra modalidade, o polipeptideo ou proteína da invenção ou variante do mesmo possui homologia conformacional e de sequência com a-MSH.

[137] Em uma modalidade, o polipeptideo ou proteína da invenção ou variante do mesmo é reconhecido por um anticorpo anti-a-MSH. Em outras palavras, em uma modalidade, o polipeptideo ou proteína da invenção ou variante do mesmo serve como epítopo para um anticorpo anti-a-MSH. Em uma modalidade, o polipeptideo ou proteína da invenção ou variante do mesmo serve como epítopo conformacional para um anticorpo anti-a-MSH.

[138] Em uma modalidade, um polipeptideo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento de uma proteína ClpB ou variante do mesmo é um derivado de polipeptideo.

[139] Em uma modalidade, o polipeptideo ou proteína da invenção ou variante do mesmo é modificado por meios conhecidos na técnica, por exemplo, pela adição de um ou mais grupos funcionais, como um grupo fosfato, acetato, lipídeo ou carboidrato e/ou pela adição de um ou mais grupos protetores. Por exemplo, o polipeptideo ou proteína da invenção ou variante do mesmo pode ser modificado pela adição

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52/107 de um ou mais grupos funcionais, tais como fosfato, acetato ou vários lipídeos e carboidratos.

[140] O polipeptídeo ou proteína da invenção ou variante do mesmo descrito aqui pode ser produzido sinteticamente por síntese química ou síntese enzimática, como é bem conhecido na técnica. Alternativamente, as sequências de nucleotídeos que codificam o polipeptídeo ou proteína da invenção ou variante do mesmo da invenção podem ser introduzidas em um vetor de expressão de proteínas e produzidas em um organismo hospedeiro adequado (por exemplo, bactérias, células de insetos, etc.), depois purificadas. Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína da invenção ou variante do mesmo é obtido por um método de clonagem, como, por exemplo, o uso de qualquer sistema de produção conhecido na técnica, como, por exemplo, E. coli, levedura, baculovírus - célula de inseto ou células de mamífero, como o sistema de expressão HEK ou CHO.

[141] Um polipeptídeo adicional (tag) pode ser adicionado com a finalidade de purificar ou identificar ou purificar os polipeptídeos. Os tags de proteínas possibilitam, por exemplo, que os polipeptídeos sejam adsorvidos, com alta afinidade, a uma matriz e que a matriz seja lavada rigorosamente com tampões adequados, sem que o complexo seja eluído em uma extensão significativa e para o complexo adsorvido subsequentemente a ser eluído

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53/107 seletivamente. Exemplos de marcadores de proteínas que são conhecidos pelo especialista são um tag (His)s, um tag Myc, um tag FLAG, um tag de hemaglutinina, um tag de glutationa transferase (GST); tag de proteína de ligação (MBP). Estes tags de proteínas podem ser localizados no terminal N, terminal C e/ou internamente.

[142] A presente invenção se refere ainda a um polinucleotídeo ou ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo, como aqui descrito.

[143] Em uma modalidade, o polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção é DNA. Em outra modalidade, o polinucleotídeo ou ácido nucleico da invenção é RNA, por exemplo, na forma de RNA mensageiro (mRNA).

[144] Em uma modalidade, o polinucleotídeo ou ácido nucleico da presente invenção é de fita simples. Em outra modalidade, o polinucleotídeo ou ácido nucleico da presente invenção é de fita dupla.

[145] Outro objeto da presente invenção é um vetor que codifica um polipeptídeo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo, como aqui descrito, ou compreendendo um polinucleotídeo ou ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ou proteína que compreende ou consiste em pelo

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54/107 menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo, como aqui descrito.

[146] Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a, um plasmídeo, um bacteriófago, um vírus, uma vesícula catiônica ou qualquer outro tipo de vetor.

[147] Em uma modalidade, o vetor da invenção é um vetor de expressão.

[148] Outro objeto da presente invenção é uma composição compreendendo um polipeptideo ou proteína ou uma variante do mesmo, conforme descrito aqui, ou um polinucleotídeo ou ácido nucleico, como aqui descrito, ou um vetor como aqui descrito.

[149] Outro objeto da presente invenção é uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptideo ou proteína ou variante do mesmo, conforme descrito aqui, ou um polinucleotídeo ou ácido nucleico como aqui descrito, ou um vetor como aqui descrito, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[150] Outro objeto da presente invenção é um medicamento compreendendo um polipeptideo ou proteína ou uma variante do mesmo, conforme descrito aqui, ou um polinucleotídeo ou ácido nucleico, como aqui descrito, ou um vetor como aqui descrito.

[151] Em uma modalidade, a composição farmacêutica ou o medicamento da invenção compreende uma quantidade

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55/107 terapeuticamente eficaz do polipeptídeo, proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, ou vetor da invenção.

[152] Outro objeto da presente invenção é uma vacina compreendendo um polipeptídeo ou proteína ou uma variante do mesmo, como aqui descrito, ou um polinucleotídeo ou ácido nucleico, como aqui descrito, ou um vetor como aqui descrito.

[153] Em uma modalidade, a vacina de acordo com a presente invenção é para uso na prevenção de doenças e distúrbios relacionados ao sobrepeso e/ou obesidade.

[154] Outro objeto da presente invenção é um suplemento dietético ou suplemento dietético de proteína compreendendo um polipeptídeo que compreende um fragmento de uma proteína ClpB como aqui descrito, preferencialmente um polipeptídeo compreendendo um fragmento ClpB compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2.

[155] Outro objeto da presente invenção é uma composição alimentar compreendendo um polipeptídeo que compreende um fragmento de uma proteína ClpB como aqui descrito, preferencialmente um polipeptídeo compreendendo um fragmento ClpB que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2 .

[156] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou composição alimentar compreende ou consiste em cerca de 1% a cerca de 80% em peso do polipeptídeo ou proteína que compreende um fragmento de uma proteína ClpB de acordo com

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56/107 a invenção. Em uma modalidade, o suplemento dietético ou composição alimentar compreende ou consiste em cerca de 1% a cerca de 50% em peso, preferencialmente de cerca de 2% a cerca de 25% em peso do polipeptídeo ou proteína que compreende um fragmento de uma proteína ClpB de acordo com a invenção.

[157] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar compreende ou consiste em pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20 %, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% em peso ou mais do polipeptídeo compreendendo um fragmento de uma proteína ClpB de acordo com a invenção.

[158] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar da presente invenção compreende pelo menos um ingrediente adicional selecionado dentre carboidratos, lipídeos, fibras ou minerais simples e/ou complexos.

[159] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar da presente invenção compreende pelo menos um aminoácido essencial. De preferência, o referido pelo menos um aminoácido essencial é isolado ou livre, isto é, não está ligado a uma cadeia de proteínas.

[160] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar de acordo com a presente invenção está na forma de pó anidro ou pó contendo água ou umidade.

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57/107 [161] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar compreende ainda carreadores ou veículos. Carreadores ou veículos significam materiais adequados para a administração e incluem qualquer material conhecido na técnica, como, por exemplo, qualquer líquido, gel, solvente, diluente líquido, solubilizante ou semelhante, que não seja tóxico e que não interage com nenhum componente, em particular com a cepa bacteriana, da composição de maneira deletéria. Exemplos de carreadores nutricionalmente aceitáveis incluem, por exemplo, água, soluções salinas, álcool, silicone, ceras, vaselina, óleos vegetais, polietileno glicóis, propileno glicol, lipossomas, açúcares, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, talco, surfactantes, ácido silicico, parafina viscosa, óleo de perfume, monoglicerídeos e diglicerídeos de ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos petroetrais, hidroximetil celulose, polivinilpirrolidona e semelhantes.

[162] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar da presente invenção compreende uma quantidade de fibras alimentares. As fibras alimentares passam pelo intestino delgado, não digeridas por enzimas, e funcionam como um agente de volume natural e laxante. As fibras alimentares podem ser solúveis ou insolúveis e, em geral, é preferencial uma mistura dos dois tipos. As fontes adequadas das fibras alimentares incluem de soja, ervilha,

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58/107 aveia, pectina, goma de guar, goma arábica, frutooligossacarídeos, galacto-oligossacarídeos, sialil-lactose e oligossacarídeos derivados de leites animais. Em algumas modalidades, a fibra alimentar é selecionada entre mananas. Mananas (como glucomananos e galactomananos), como goma de guar, goma de alfarroba, konjac e goma xantana, estão presentes em algumas paredes celulares das plantas. Os glucomananos são geralmente constituídos por unidades de glicose e manose ligadas a (1-4) -β, enquanto os galactomananos são geralmente constituídos por uma estrutura de (1-4) -β-manano substituída por unidades únicas de (1-6) -a -galactose. Muitas leguminosas endospérmicas, como guar e alfarroba, contêm galactomananos no endosperma durante o desenvolvimento das sementes. Os glucomananos também foram encontrados como um componente menor dos grãos de cereais.

[163] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou composição alimentar da presente invenção contém minerais e micronutrientes, como oligoelementos e vitaminas, de acordo com as recomendações de órgãos governamentais, como o USRDA. Por exemplo, a composição pode conter por dose diária um ou mais dos seguintes micronutrientes nas faixas indicadas: 300 a 500 mg de cálcio, 50 a 100 mg de magnésio, 150 a 250 mg de fósforo, 5 a 20 mg de ferro, 1 a 7 mg de zinco, 0,1 a 0,3 mg de cobre, 50 a 200 pg de iodo, 5 a 15 pg de selênio, 1000 a 3000 pg de beta-caroteno, 10 a 80 mg de vitamina C, 1 a 2 mg

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59/107 de vitamina Bl, 0,5 a 1,5 mg de vitamina B6, 0,5 a 2 mg de vitamina B2, 5 a 18 mg de niacina, 0,5 a 2,0 pg de vitamina B12, 100 a 800 pg ácido fólico, 30 a 70 pg de biotina, 1 a 5 pg de vitamina D, 3 a 10 pg de vitamina E.

[164] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar da presente invenção compreende ainda emulsificantes. Exemplos de emulsificantes de qualidade alimentar incluem tipicamente os ésteres de ácido diacetiltartárico de mono e di-glicerídeos, lecitina e mono e diglicerídeos. Da mesma forma, sais e estabilizadores adequados podem ser incluídos.

[165] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para a preparação de alimentos dietéticos.

[166] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para introdução em refeições diárias.

[167] A presente invenção também se refere a um polipeptídeo ou proteína que compreende ou consiste em pelo menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo, um polinucleotídeo ou ácido nucleico, uma vacina, uma composição farmacêutica ou um medicamento conforme descrito acima, para uso no tratamento de inflamação em um sujeito em necessidade do mesmo.

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60/107 [168] Outro objeto da invenção se refere a um método para o tratamento de inflamação em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptídeo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vacina, composição farmacêutica ou medicamento como descrito acima.

[169] Dentro do significado da invenção, por inflamação, entende-se, como definido no Dicionário Médico de Dorland, uma resposta protetora localizada, provocada por lesão ou destruição de tecidos, que serve para destruir, diluir ou isolar o agente prejudicial e o tecido lesionado. É caracterizada pela fenestração da microvasculatura, vazamento dos elementos do sangue para os espaços intersticiais e a migração de leucócitos para o tecido inflamado. No nível macroscópico, isso geralmente é acompanhado pelos sinais clínicos familiares de eritema, edema, hiperalgesia (sensibilidade) e dor.

[170] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vacina, composição farmacêutica ou um medicamento de acordo com a invenção é para uso no tratamento de inflamação, em que a referida inflamação é selecionada do grupo que compreende obesidade, doenças ou distúrbios relacionados à obesidade,

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61/107 neuroinflamação, esclerose múltipla, aterosclerose, alergias, espondilite anquilosante, artrite (osteoartrite, artrite reumatoide ou artrite psoriática), asma, doença do enxerto contra hospedeiro, doença de Parkinson, doença de Alzheimer, doença de Crohn, colite, dermatite, diverticulite, fibromialgia, hepatite, síndrome do intestino irritável, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite e colite ulcerativa.

[171] Em uma modalidade, a inflamação da invenção é uma inflamação aguda. Em outra modalidade, a inflamação da invenção é uma inflamação crônica.

[172] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vacina, composição farmacêutica ou medicamento de acordo com a invenção é para uso no tratamento de inflamação, em que a referida inflamação é selecionada do grupo que compreende ou consiste em obesidade, doenças ou distúrbios relacionados à obesidade, neuroinflamação, esclerose múltipla, psoríase, rinite alérgica, osteoartrite e doenças neuroinflamatórias. Em uma modalidade particular, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vacina, composição farmacêutica ou medicamento de acordo com a invenção é para uso no tratamento de inflamação, em que a referida inflamação é selecionada do grupo que compreende ou consiste em

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62/107 obesidade, neuroinflamação, esclerose múltipla, psoríase, rinite alérgica, osteoartrite e doenças neuroinflamatórias.

[173] Um objeto da presente invenção se refere a um polipeptideo ou proteína que compreende ou consiste em pelo menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vacina, composição farmacêutica ou medicamento de acordo com a invenção para uso no tratamento ou na prevenção da obesidade em um sujeito em necessidade do mesmo.

[174] Outro objeto da presente invenção se refere a um método para o tratamento ou prevenção de obesidade em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptideo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vacina, composição farmacêutica ou medicamento como descrito acima.

[175] Um aspecto da presente invenção se refere a um polipeptideo ou proteína compreendendo ou consistindo em pelo menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vacina, composição farmacêutica ou medicamento conforme descrito acima, para uso no tratamento ou prevenção de sobrepeso e/ou doenças e distúrbios relacionados à obesidade.

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63/107 [176] Outro aspecto da presente invenção se refere a um método para tratar ou prevenir doenças e distúrbios relacionados ao sobrepeso e/ou obesidade em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptídeo ou proteína que compreende ou consiste em pelo menos um fragmento da proteína ClpB ou variante do mesmo, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vacina, composição farmacêutica ou medicamento como descrito acima.

[177] As doenças e os distúrbios relacionados ao sobrepeso e/ou obesidade incluem, mas não estão limitados a pressão alta, diabetes (em particular, diabetes tipo 2), intolerância à glicose, resistência à insulina, doenças cardiovasculares (como aterosclerose, doenças coronárias), doença arterial, artérias estreitadas, angina, ataque cardíaco, coágulos sanguíneos), colesterol alto, doença hepática gordurosa, esteatose hepática, colelitíase, problemas articulares, osteoartrite, problemas ortopédicos, equilíbrio prejudicado, problemas de pele, apneia do sono, problemas respiratórios, asma, ronco pesado, câncer (incluindo câncer de mama, de cólon, da vesícula biliar, do útero, do cólon e da próstata), síndrome metabólica, anormalidades menstruais e efeitos psicossociais.

[178] Um aspecto da presente invenção se refere a um método de indução de saciedade em um sujeito em

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64/107 necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção.

[179] Um aspecto da presente invenção se refere a um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção, para uso na indução de saciedade em um sujeito em necessidade do mesmo.

[180] Um aspecto da presente invenção se refere ao uso não terapêutico de um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção para induzir saciedade em um sujeito.

[181] Um aspecto da presente invenção se refere a um método para prolongar a saciedade em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[182] Um aspecto da presente invenção se refere a um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica,

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65/107 medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição de alimentos de acordo com a invenção para uso para prolongar a saciedade em um sujeito em necessidade do mesmo.

[183] Um aspecto da presente invenção se refere ao uso não terapêutico de um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção para prolongar a saciedade em um sujeito.

[184] Em uma modalidade, o prolongamento da saciedade é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%. Em uma modalidade específica, o prolongamento da saciedade é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% do tempo decorrido entre as refeições, de preferência do tempo decorrido entre as refeições antes da administração do polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o prolongamento da saciedade é de pelo menos 15%, 20% ou 25%. Em uma modalidade específica, o prolongamento da saciedade é de pelo menos 15%, 20% ou 25% do tempo decorrido entre as refeições, de preferência do tempo decorrido entre as refeições antes da administração do polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina,

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66/107 suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[185] Um aspecto da presente invenção se refere a um método para reduzir o tamanho da refeição em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[186] Um aspecto da presente invenção se refere a um polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção, para uso na redução do tamanho da refeição em um sujeito com necessidade do mesmo.

[187] Um aspecto da presente invenção se refere ao uso não terapêutico de um polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção para reduzir o tamanho da refeição em um sujeito.

[188] Em uma modalidade, a redução do tamanho da refeição é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%. Em uma modalidade específica, a redução do tamanho da refeição é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% do tamanho da refeição antes da administração do

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67/107 polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a redução do tamanho da refeição é de pelo menos 15%, 20% ou 25%. Em uma modalidade específica, a redução do tamanho da refeição é de pelo menos 15%, 20% ou 25% do tamanho da refeição antes da administração do polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[189] Um aspecto da presente invenção se refere a um método para reduzir a ingestão de alimentos em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[190] Um aspecto da presente invenção se refere a um polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção para uso na redução da ingestão de alimentos em um sujeito com necessidade do mesmo.

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68/107 [191] Um aspecto da presente invenção se refere ao uso não terapêutico de um polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com

a invenção	para reduzir a ingestão de alimentos em	um
suj eito.
[192]	Em uma modalidade, a redução da ingestão	de
alimentos é	de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%,	9%

ou 10%. Em uma modalidade específica, a redução da ingestão de alimentos é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% da ingestão de alimentos antes da administração do polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a redução da ingestão de alimentos é de pelo menos 15%, 20% ou 25%. Em uma modalidade específica, a redução da ingestão de alimentos é de pelo menos 15%, 20% ou 25% da ingestão de alimentos antes da administração do polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[193] Um aspecto da presente invenção também se refere a um método para controlar, em particular reduzir, o ganho de peso em um sujeito em necessidade do mesmo,

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69/107 compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, farmacêutica composição, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[194] Um aspecto da presente invenção se refere a um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção para uso para controlar, em particular reduzir, o ganho de peso em um sujeito em necessidade do mesmo.

[195] Um aspecto da presente invenção se refere ao uso não terapêutico de um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção para controlar, em particular reduzir o ganho de peso em um sujeito.

[196] Um aspecto adicional da presente invenção também se refere a um método de estimular a perda de peso em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento,

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70/107 vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[197] Um aspecto da presente invenção se refere a um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção, para uso no estímulo à perda de peso em um sujeito com necessidade do mesmo.

[198] Um aspecto da presente invenção se refere ao uso não terapêutico de um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção para estimular a perda de peso em um sujeito.

[199] Em uma modalidade, a estimulação da perda de peso é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%. Em uma modalidade particular, o estímulo da perda de peso é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% da perda de peso do sujeito antes da administração do polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção. Em uma modalidade, o estímulo da perda de peso é de pelo menos 15%, 20% ou 25%. Em uma modalidade específica, o estímulo da perda de peso é de pelo menos 15%, 20% ou 25% da perda de peso do sujeito antes da administração

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71/107 do polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[200] Um aspecto adicional da presente invenção também se refere a um método de redução de peso em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[201] Um aspecto da presente invenção se refere a um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção para uso na redução de peso em um sujeito com necessidade do mesmo.

[202] Um aspecto da presente invenção se refere ao uso não terapêutico de um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção para redução de peso em um sujeito.

[203] Em uma modalidade, a redução de peso é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%. Em uma modalidade particular, a redução de peso é de pelo menos 1%,

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2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% do peso corporal do sujeito antes da administração do polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a redução de peso é de pelo menos 15%, 20% ou 25%. Em uma modalidade específica, a redução de peso é de pelo menos 15%, 20% ou 25% do peso corporal do sujeito antes da administração do polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[204] Um aspecto da presente invenção se refere a um método de redução da proporção de massa gorda para a massa magra em um sujeito em necessidade do mesmo, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de um polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[205] Um aspecto da presente invenção se refere a um polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção para uso na redução da

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73/107 proporção de massa gorda para massa magra em um sujeito em necessidade do mesmo, em particular em um sujeito obeso.

[206] Um aspecto da presente invenção se refere ao uso não terapêutico de um polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo, vetor, composição, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção para reduzir a proporção de massa gorda para a massa magra em um sujeito, em particular em um sujeito com peso normal ou sobrepeso sem complicações.

[207] Em uma modalidade, a redução da proporção de massa gorda para a massa magra é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10%. Em uma modalidade específica, a redução da proporção de massa gorda para a massa magra é de pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% da proporção de massa gorda para a massa magra do sujeito antes da administração do polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção. Em uma modalidade, a redução da proporção de massa gorda para a massa magra é de pelo menos 15%, 20% ou 25%. Em uma modalidade específica, a redução da proporção de massa gorda para a massa magra é de pelo menos 15%, 20% ou 25% da proporção de massa gorda para a massa magra do sujeito antes da administração do polipeptideo ou proteína,

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74/107 polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[208] Em uma modalidade, o uso de um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção é um uso cosmético.

[209] Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito feminino. Em algumas modalidades, o sujeito é um sujeito masculino.

[210] Em uma modalidade, o sujeito é uma criança, como um sujeito com menos de 18 anos (em anos humanos). Em outra modalidade, o sujeito é um adulto, como um sujeito com 18 anos ou mais (em anos humanos).

[211] Em uma modalidade, o sujeito é obeso. Em uma modalidade, o sujeito tem um índice de massa corporal (IMC) acima de 30.

[212] Em uma modalidade, o sujeito é moderadamente obeso. Em uma modalidade, o sujeito tem um IMC que varia de cerca de 30 a cerca de 35. Em uma modalidade, o sujeito é gravemente obeso. Em uma modalidade, o sujeito tem um IMC que varia de cerca de 35 a cerca de 40. Em uma modalidade, o sujeito é morbidamente obeso. Em uma modalidade, o sujeito tem um IMC variando de cerca de 40 a cerca de 50 ou mais.

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75/107 [213] Em uma modalidade, o sujeito não é obeso. Em uma modalidade, o sujeito tem um IMG abaixo de 30. Em uma

modalidade, o	suj eito	é sobrepeso. Por conseguinte, em uma
modalidade, o	suj eito	tem um IMG variando de cerca de 25 a
cerca de 30.
[214]	Em uma	modalidade, o sujeito é um sujeito

saudável com sobrepeso. Em uma modalidade, o sujeito é um sujeito com sobrepeso não saudável.

[215] Em uma modalidade, o sujeito tem um peso corporal normal. Em uma modalidade, o sujeito tem um IMG variando entre cerca de 18,5 e 25.

[216] Em uma modalidade, o sujeito está sob uma dieta de emagrecimento e/ou deseja perder peso. Em outra modalidade, o sujeito não está sob uma dieta de emagrecimento e/ou não deseja perder peso.

[217] Em uma modalidade, o sujeito está em risco de ganhar peso. Em algumas modalidades, o sujeito está em risco de acumular excesso de gordura.

[218] Em uma modalidade, o sujeito está em risco de desenvolver sobrepeso e/ou obesidade. Em uma modalidade, o sujeito está em risco de desenvolver doenças e distúrbios relacionados ao sobrepeso e/ou obesidade.

[219] Em uma modalidade, o sujeito tem compulsão alimentar. Em uma modalidade, o sujeito sofre de transtorno compulsivo ou compulsão alimentar.

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76/107 [220] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico ou vetor de acordo com a invenção é administrado ao sujeito na forma de uma composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina. Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico ou vetor de acordo com a invenção é combinado com excipientes farmaceuticamente aceitáveis e opcionalmente matrizes de liberação sustentada, como polímeros biodegradáveis, para formar composições farmacêuticas.

[221] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção deve ser administrado por via oral, por injeção, por via tópica, por via nasal, por via bucal, por via retal, por via vaginal, por via intratraqueal, por endoscopia, por via transmucosa ou por administração percutânea.

[222] Os polipeptídeos ou proteínas, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetores, composições, composições farmacêuticas, medicamentos ou vacinas divulgados de acordo com a invenção podem ser liberados às células-alvo de várias maneiras. O mecanismo de liberação escolhido dependerá em parte do tipo de célula alvo e se a liberação está ocorrendo, por exemplo, in vivo ou in vitro.

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O técnico especialista no assunto será capaz de adaptar a liberação dos polipeptídeos ou sequências de ácidos nucleicos da invenção.

[223] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção deve ser administrado por via oral. Exemplos de formulações adaptadas à administração oral incluem, mas não estão limitados a: formas sólidas, formas líquidas e géis. Exemplos de formas sólidas adaptadas à administração oral incluem, entre outros, pílula, comprimido, cápsula, cápsula de gelatina mole, cápsula de gelatina dura, cápsula, capsuleta, comprimido, hóstia, bolacha, pílula revestida com açúcar, comprimido revestido com açúcar ou comprimido de dispersão/ou desintegrador, pó, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da administração oral e comprimido efervescente. Exemplos de forma líquida adaptada à administração oral incluem, mas não estão limitados a, soluções, suspensões, soluções potáveis, elixires, frasco vedado, poção, banho, xarope e licor.

[224] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção deve ser administrado por injeção,

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78/107 de preferência injetada sistemicamente. Exemplos de formulações adaptadas às injeções sistêmicas incluem, mas não estão limitados a: soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção. Exemplos de injeções sistêmicas incluem, entre outros, injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intradérmica, injeção intravítrea e injeção intraperitoneal, ou perfusão. Em outra modalidade, quando injetada, a composição, a composição farmacêutica ou o medicamento da invenção é estéril. Os métodos para obter uma composição farmacêutica estéril incluem, entre outros, síntese de GMP (GMP significa Boas práticas de fabricação).

[225] Em outra modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção deve ser administrado por via tópica. Exemplos de formulações adaptadas à administração tópica incluem, mas não estão limitados a tiras, ceras, cremes, loções, unguentos, bálsamos, géis, máscaras, lavagens não aderentes e/ou semelhantes.

[226] Em uma modalidade da invenção, a pomada é uma pomada oleaginosa; uma pomada emulsionada tal como, por exemplo, uma pomada óleo em água ou uma pomada água em óleo;

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79/107 ou uma pomada solúvel em água, de preferência é uma pomada oleaginosa.

[227] Em uma modalidade da invenção, a pomada oleaginosa utiliza bases como, por exemplo, óleos vegetais e animais; gorduras vegetais e animais; ceras; vaselina, como, por exemplo, vaselina branca ou óleo de vaselina; e parafina como, por exemplo, parafina líquida ou óleo de parafina.

[228] Em outra modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção também podem ser aplicados por via tópica usando um sistema transdérmico, como um adesivo polimérico à base de acrílico com um agente reticulante resinoso impregnado com a composição e laminado para um suporte impermeável. Exemplos de formulações adaptadas à administração transdérmica incluem, mas não estão limitados a unguento, pasta, creme, filme, bálsamo, adesivo, como, por exemplo, adesivo transdérmico, gel, formas lipossômicas e semelhantes.

[229] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção podem ser administrados por via tópica como um adesivo transdérmico, mais particularmente

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80/107 como um adesivo transdérmico de liberação sustentada. Os adesivos transdérmicos podem incluir qualquer forma convencional, como, por exemplo, matriz adesiva, matriz polimérica, adesivo de reservatório, matriz ou estrutura laminada do tipo monolítico e geralmente são compostos de uma ou mais camadas de suporte, adesivos, intensificadores de penetração, uma membrana de controle de velocidade opcional e um revestimento de liberação que é removido para expor os adesivos antes da aplicação. Os adesivos de matriz polimérica também compreendem um material formador de matriz polimérica. Os adesivos transdérmicos adequados são bem descritos na técnica [ver, por exemplo, as patentes US No. 5262165, 5948433, 6010715 e 6071531].

[230] Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção é administrado em uma liberação controlada, liberação retardada, liberação prolongada, liberação de ação prolongada, liberação modificada, liberação sustentada ou liberação programada. Portanto, em uma modalidade, a composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção compreende ainda matrizes de liberação sustentada, como polímeros biodegradáveis.

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81/107 [231] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar de acordo com a invenção deve ser administrado por via oral. Exemplos de formulações adaptadas à administração oral incluem, mas não estão limitados a: formas sólidas, formas liquidas e géis. Exemplos de formas sólidas adaptadas à administração oral incluem, entre outros, pílula, comprimido, cápsula, cápsula de gelatina mole, cápsula de gelatina dura, cápsula, capsuleta, comprimido, hóstia, bolacha, pílula revestida com açúcar, comprimido revestido com açúcar ou comprimido de dispersão/ou desintegrador, pó, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da administração oral e comprimido efervescente. Exemplos de forma líquida adaptada à administração oral incluem, mas não estão limitados a, soluções, suspensões, soluções potáveis, elixires, frasco vedado, poção, banho, xarope e licor.

[232] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar de acordo com a invenção é formulado como pós, por exemplo, para misturar com líquidos consumíveis, como leite, suco, água ou géis ou xaropes consumíveis, para misturar com outros líquidos alimentares ou alimentos. Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar de acordo com a invenção é formulado com outros alimentos ou líquidos para fornecer alimentos suplementares previamente medidos, como barras de servir

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82/107 únicas, por exemplo. Aromas, aglutinantes, proteínas, carboidratos complexos e semelhantes podem ser adicionados conforme necessário.

[233] Em uma modalidade, o suplemento dietético ou a composição alimentar de acordo com a invenção é formulado usando quaisquer formas farmaceuticamente aceitáveis de vitaminas, minerais e outros nutrientes discutidos acima, incluindo seus sais. As formas preferenciais são carbonato de cálcio, hidróxido de magnésio ou sulfato de magnésio, tetraborato de sódio, óxido cúprico, sulfato de manganês, sulfato de zinco, colecalciferol, fumarato ferroso, cloridrato de piridoxina, picolinato de cromo, acetato de dalpatocoferol e ácido ascórbico.

[234] Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção é administrada pelo menos uma vez ao dia, duas vezes ao dia ou pelo menos três vezes ao dia. Em outra modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção é administrada todos os dias, a cada dois, três, quatro, cinco, seis, ou sete dias.

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83/107 [235] Em outra modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção é administrada toda semana, duas vezes por semana, a cada duas semanas ou uma vez por mês. Em outra modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção é administrada todos os meses durante um período de pelo menos 2, 3, 4, 5 ou 6 meses.

[236] Em outra modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou vetor de acordo com a presente invenção varia de cerca de 1 pg a 5 g. Em outra modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou vetor de acordo com a presente invenção a ser administrada varia de cerca de 0,1 pg/kg a 1 g/kg, isto é, de cerca de 0,1 pg por guilo de peso corporal a 1 g por quilo de peso corporal.

[237] Em uma modalidade, o método da invenção é para um tratamento crônico, ou seja, o polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção, é administrado por um período prolongado de

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84/107 tempo, como, por exemplo, por pelo menos 1 semana, 1 mês, 1 ano ou mais.

[238] Em outra modalidade, o método da invenção é para um tratamento agudo, como, por exemplo, um tratamento com apenas 1, 2 ou 3 administrações do polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento ou vacina de acordo com a invenção.

[239] Em uma modalidade, a administração do polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção é repetida, por exemplo, 2 a 3 vezes por dia, por um dia ou mais e geralmente por um período prolongado de pelo menos 4 dias ou mesmo de 4 a 15 semanas, com, quando apropriado, um ou mais períodos de interrupção. Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção é administrado simultaneamente ou sequencialmente com uma refeição do sujeito. Em uma modalidade, o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, vetor, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina,

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85/107 suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção é administrado antes da refeição do sujeito.

[240] A presente invenção também se refere a um kit compreendendo um polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, composição, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar de acordo com a invenção.

[241] Em uma modalidade, o kit da invenção compreende ainda meios para administrar o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar a um sujeito em necessidade do mesmo.

[242] Os meios para administrar o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar incluem, entre outros, seringas, agulhas e outros materiais. Em algumas modalidades, um meio para administrar o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar inclui seringas pré-envasadas com o polipeptídeo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, composição farmacêutica, medicamento ou vacina da invenção.

[243] Em uma modalidade, o kit da invenção compreende ainda instruções para a administração do

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86/107 polipeptideo ou proteína, polinucleotídeo ou ácido nucleico, composição farmacêutica, medicamento, vacina, suplemento dietético ou composição alimentar ao referido sujeito.

[244] Em uma modalidade, o kit da invenção é para uso no tratamento ou prevenção da obesidade em um sujeito em necessidade do mesmo. Em uma modalidade, o kit da invenção é para uso no tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios relacionados ao sobrepeso e/ou obesidade em um sujeito em necessidade do mesmo.

[245] Em uma modalidade, o kit da invenção é usado para induzir saciedade, prolongar a saciedade, reduzir o tamanho da refeição, reduzir a ingestão de alimentos, controlar o ganho de peso, reduzir o ganho de peso, estimular a perda de peso, reduzir o peso e/ou reduzir a proporção de massa gorda para a massa magra em um sujeito em necessidade do mesmo.

[246] A invenção será ainda ilustrada pelos exemplos. No entanto, estes exemplos não devem ser interpretados de forma alguma como limitativos do escopo da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [247] A Figura 1 é uma fotografia que mostra a separação das proteínas citoplasmáticas de E. coll K12 através de eletroforese em gel bidimensional (a) e immunoblot com anticorpos anti-a-MSH (b e c, pré-adsorvido por a-MSH)

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87/107 durante a identificação do proteoma em ClpB (pontos 1, 2, 3 e 4) . As manchas 5, 6, 7 e 8 correspondem à proteína GroEL (de Tennoune et al., 2014).

[248]

A Figura 2 é um alinhamento de sequências mostrando homologia entre o peptídeo α-MSH humano e as proteínas ClpB de E. coll e H. alvei (A) e entre o peptídeo α-MSH e os homólogos da proteína ClpB de L. casei, B. anlmalls, E. fecalis e S. cerevisiae (B) .

[249]

A Figura 3 é uma fotografia que mostra

Western Blot da proteína ClpB (coluna da esquerda) e fragmentos de proteínas ClpB após tratamento com tripsina a 0,01% (coluna da direita), revelada com um anticorpo antia-MSH.

[250]

A Figura 4 é uma fotografia mostrando Western

Blots de plasma, hipotálamo e mucosa cólica de camundongos (A) e ratos (B) , revelados com um anticorpo anti-a-MSH (a) e anticorpo anti-ClpB (b).

[251]

A Figura 5 é um gráfico que mostra a secreção

PYY de células intestinais cultivadas primárias incubadas com proteínas totais de E. coll do tipo selvagem (coluna do meio) e de AClpB de E. coli (coluna da direita), ambas préincubadas com tripsina 0,01%, normalizada para proteínas totais de E. coll do tipo selvagem sem pré-incubação (controle, coluna da esquerda). **: teste t não pareado p = 0,0078; $: teste t não pareado p = 0,0571 (tendência).

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88/107 [252] A Figura 6 é um histograms mostrando a secreção de PYY em dois pontos e íleo de ratos após a incubação com proteína ClpB e o fragmento ClpB de ~ 25kDa, ambos a uma concentração de 10 nM. Os resultados são apresentados como uma proporção comparada ao controle (incubação com PBS).

[253] A Figura 7 é um gráfico que mostra a ingestão cumulativa de alimentos de camundongos administrados com 2 pmol em um volume de 200 pL de proteína ClpB (A) completa ou fragmento de ~ 25kDa (B) por injeção intraperitoneal (i.p.) em comparação com camundongos de controle administrados com o respectivo tampão de controle.

[254] A Figura 8 é um gráfico que mostra a ingestão cumulativa de alimentos de camundongos administrados com 60 pmol em um volume de 200 pL de proteína ClpB de comprimento total (A) ou fragmento de ~ 25kDa (B) por administração oral em comparação com camundongos de controle administrados com o respectivo tampão de controle.

EXEMPLOS [255] A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos:

Exemplo 1: Identificação de proteína bacteriana com homologia com g-MSH [256] Análises ín sílíco anteriores mostraram que várias proteínas de E. coli e alguns outros micro-organismos

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89/107 contêm homologia de sequência de aminoácidos com a-MSH, sugerindo que eles podem ser responsáveis pela produção de autoanticorpos reativos a α-MSH (Fetissov, em: Neuropsychiatric Disorders and Infection, Fatemi, S. H. (ed.), Taylor & Francis Books Ldt, 2004, pp 253-262; Fetissov et al., 2008. Nutrition. 24:348-359) .

[257] Para descobrir quais proteínas bacterianas podem não ser apenas miméticos de antígeno de α-MSH teóricos, mas também funcionais, uma nova abordagem proteômica foi realizada utilizando a cepa de E. coll K12. A novidade desta abordagem consistiu em explorar o fenômeno bem conhecido da coloração não específica por anticorpos primários em protocolos de imunodetecção, como Western blot. Nesta abordagem, a coloração não específica de outras proteínas além do peptídeo antigênico usado para a produção de anticorpos foi pesquisada como base de uma homologia conformacional estrutural entre o peptídeo α-MSH e as proteínas bacterianas.

Materiais e métodos [258] A abordagem proteômica revisada aqui foi usada no estudo original (Tennoune et al., 2014, Transi Psychiatry, 4: e458) e consistiu em eletroforese em gel bidimensional para separar as proteínas totais de E. coll K12 .

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90/107 [259] Eletroforese bidimensional em gel de polia cri 1 ami da [260] Para eletroforese bidimensional (2D) em gel de poliacrilamida (PAGE), 400 pg de extrato de proteína de E. coll K12 foram adicionados ao tampão de foco isoelétrico (ureia 7 M, tioureia 2 M e anfólitos a 0,5%, pH 4-7, 20 mM de ditiotreitol, 2 mM de tributil fosfina, CHAPS a 2% e azul de bromofenol a 0,005%) e solubilizados durante 60 minutos em temperatura ambiente com ligeira agitação. A separação gel unidimensional foi realizada usando Tira ReadyStrip IPG (18 cm, pH 4-7 NL, Bio-Rad, Marnes-la-Coquette, França). Depois de 24 h de reidratação passiva da tira com tampão de focagem isoelétrica, a amostra de proteína foi adicionada às tiras através de um copo de carregamento colocado a 1,5 cm do catodo. A focagem isoelétrica foi realizada com o sistema Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare) em quatro etapas (31 500 Vh): 500 V por 1 h, gradiente de 1000 V, gradiente de 10 000 V e 10 000 V por 2 h. Após duas etapas de equilíbrio com ditiotreitol a 2% e iodoacetamida a 2,5%, respectivamente, a segunda dimensão, ou seja, uma SDS-PAGE, (gel de poliacrilamida a 10%, 20 cm χ 18 cm χ 1 mm) foi realizada em eletroforese vertical em um sistema Ettan Daltsix (GE Healthcare) com 12 mA por gel. Após SDS-PAGE, o gel 2D foi fixado por 2 horas em ácido ortofosfórico a 2% (vol: vol) e em metanol a 50% (vol: vol) em temperatura ambiente.

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91/107 [261] Os géis foram então lavados com água e as manchas de proteína foram visualizadas por CBB G-250 (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA), coloração (34% (vol: vol) metanol, 17% (p: vol) de sulfato de amônio, 2% (vol: vol) ácido ortofosfórico e 0,66 g de CBB G-250 por litro).

[262] Immunoblottíng [263] Após 2D-PAGE, as proteínas citoplasmáticas de E. coli foram transferidas para a membrana de difluoreto de polivinilideno Hybond-ECL (GE Healthcare) através de um método de transferência a seco (Trans Blot Cell, Bio-Rad) e uma corrente constante de 0,8 mA.cm-2 do tamanho da membrana por 2 horas. Após a transferência, as membranas foram bloqueadas com 5% (peso: vol) de leite (Regilait, Macon, França) em solução salina tamponada com fosfato (PBS; 10 mmol.L-1 de Tris, pH 8 e 150 mmol.L-1 de NaCl) mais Tween 20 a 0,05 % (vol: vol) . Após as lavagens, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 °C com IgG policlonal de coelho anti-a-MSH (1: 1000, Península Laboratories, San Carlos, CA, EUA) , seguido de lavagens e incubação com Igs anti-peroxidase de rábano policlonal de coelho conjugadas (1: 3000; Dako, Trappes, França). Os imunoblots foram revelados pelo sistema de detecção ECL (GE Healthcare) e foram escaneados com o ImageScanner II (GE Healthcare) e digitalizados com o software Labscan 6.00 (GE Healthcare).

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92/107 [264] O mesmo procedimento foi realizado após a adsorção de IgG anti-a-MSH de coelho com ICC⁶ M de peptídeo α-MSH (Bachem AG, Bubendorf, Suíça) durante a noite a 4 °C.

[265] Identificação de proteínas [266] As manchas de proteína de interesse foram excisadas dos géis 2D corados com CBB G-250 usando o Ettan Spot Picker (GE Healthcare), e a digestão automática de proteínas em gel foi realizada no Ettan Digester (GE Healthcare). Os extratos de proteínas foram ressuspensos em 10 μΐ de ácido fórmico a 5% (vol: vol)/0,1% (vol: vol) e depois analisados com um sistema nano-LC1200 acoplado a um espectrômetro de massa 6340 Ion Trap equipado com uma fonte de nanospray e uma interface de cubo de chip HPLC (Agilent Technologies, Courtaboeuf, França). Em resumo, os peptídeos foram enriquecidos e dessalinizados em uma coluna de armadilha RPC18 de 40 nl e separados em uma coluna C18 Zorbax (tamanho de poro de 30 nm, tamanho de partícula de 5 pm) (diâmetro interno de 43 mm χ 75 pm; Agilent Technologies). Foi utilizado um gradiente linear de 9 minutos (3-80% de acetonitrila em ácido fórmico a 0,1%) a uma vazão de 400 nl.min-1 e o eluente foi analisado com um espectrômetro de massa Ion Trap. Para a identificação das proteínas, as listas de pico de MS/MS foram extraídas e comparadas com os bancos de dados de proteínas usando o mecanismo de busca MASCOT Daemon versão 2.2.2 (Matrix Science, Boston, MA, EUA) . As

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93/107 buscas foram realizadas com os seguintes parâmetros específicos: especificidade enzimática, tripsina; uma divagem perdida permitida; sem modificações fixas; modificações variáveis, oxidação da metionina, carbamidometilação da cisteína, fosforilação da serina, tirosina e treonina; monoisotópico; carga peptídica, 2+ e 3+; tolerância de massa para ions precursores, 1,5 Da; tolerância de massa para fragmentações, 0,6 Da; ionização por eletropulverização-Trap como instrumento; taxonomia, E. coll; Base de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) (NCBI Nr 20120531 (sequências 18280215, 6265275233 resíduos); Bethesda, MD, EUA) . Os hits proteicos foram validados automaticamente se eles satisfizessem um dos seguintes critérios: identificação com pelo menos dois peptídeos de ranqueamento superior (negrito e vermelho), cada um com uma pontuação MASCOT de 454 (PoO.Ol) ou pelo menos dois peptídeos de ranqueamento superior cada com uma pontuação MASCOT de 447 (Po0.05). Para avaliar as taxas de falsos positivos, todas as pesquisas iniciais no banco de dados foram realizadas usando a opção 'chamariz' do MASCOT. Os resultados foram considerados relevantes se a taxa de falsos positivos nunca exceder 1%.

Resultados [267] Os resultados da eletroforese em gel bidimensional para separar as proteínas totais de E. coli

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K12 são apresentados na Figura la. Após a transferência para uma membrana, a presença de proteínas contendo epítopos do tipo α-MSH verificados pela aplicação de IgG policlonal antiα-MSH revelou vários pontos positivos (Figura 1b). No entanto, a aplicação de IgG anti-a-MSH após a sua préadsorção com peptídeo α-MSH aboliu apenas vários pontos positivos (Figura 1c) , sugerindo que apenas os pontos que desaparecem (setas) devem conter epítopos do tipo α-MSH. A identificação por espectrometria de massa da manchas coradas especificamente com α-MSH mais fortemente coradas revelou que eles correspondem ao homólogo da protease caseinolítica B (ClpB), uma proteína de 96 kDa da família de choque térmico (pontos 1, 2, 3, 4 da Figura la).

Exemplo 2: Alinhamento de sequência entre ClpB e α-MSH [268] Foi demonstrado que a proteína ClpB de Enterobacteria estimula a produção de anticorpos reativos cruzados α-MSH. Os inventores levantaram a hipótese da presença de um epítopo do tipo α-MSH na proteína ClpB de Enterobacteria.

[269] O alinhamento da sequência entre ClpB e a-MSH revelou uma homologia de sequência de 6 aminoácidos descontínuos na parte central (resíduos de aminoácidos 534548 da SEQ ID NO: 1) de E. coli e H. alvei ClpB (Figura 2A). Essa sequência não foi prevista por uma análise in silico da homologia com α-MSH no banco de dados de proteínas de E.

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95/107 coll ou H. alvei usando um algoritmo de busca da homologia de sequência consecutiva de α-MSH. Além disso, as proteínas E. coll e de H. alvei contendo essas sequências consecutivas não puderam ser identificadas por uma abordagem proteômica (Fetissov et al. , 2008. Transi Psychiatry, 2014, 4: e458), destacando a dificuldade em prever a presença de epítopos do tipo peptídeo em grandes proteínas com significado funcional utilizando a abordagem in silico. Além disso, essa homologia de sequência não foi encontrada em outras bactérias ou leveduras, como L. casei, B. animalis, E. fecalis e S. cerevisiae (Figura 2B).

[270] O α-MSH é um peptídeo de 13 aminoácidos acilados em N-terminal. A parte central HFRW (resíduos de aminoácido 6 a 9 da SEQ ID NO: 2) representa o farmacóforo comum de todos os peptídeos do sistema central de melanocortina (MC), necessários para a ativação do receptor MC com os aminoácidos mais importantes Arg (8) e Trp (9), enquanto que os terminais N e C participam de maneira diferente na ligação ao MCR (Hruby et al. , 1987, J. Med. Chem. 30:2126-2130; Schiõth et al. , European Journal of Pharmacology, 1998, 349:359-366; Haskell-Luevano et al. , 2001, Journal of Medicinal Chemistry, 44:2247-2252) . A presença de um aminoácido ácido Glu (5) (resíduo de aminoácido 5 da SEQ ID NO: 2) pode participar da conformação espacial de α-MSH via formação de uma ponte de sal com o Arg

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96/107 (8) básico (resíduo de aminoácido 8 da SEQ ID NO: 2) . Essa dobragem de α-MSH forma uma curva β, expondo a sequência central do peptídeo necessária para a ativação de MCRs (Li et al., 1999, European Journal of Biochemistry, 265: 430440) .

[271] A sequência ClpB de Enterobacteria compartilha as seguintes propriedades do peptídeo a-MSH:

1. presença de Arg consecutivo (R542 na SEQ ID NO: 1) e Trp (W543 na SEQ ID NO: 1) que são dois aminoácidos críticos no farmacóforo α-MSH (R8W9 na SEQ ID NO: 2) necessário para ativação dos receptores MC;

2. presença de uma Glu negativamente carregada (E538 em SEQ ID NO: 1) homólogo a Glu (E5 em SEQ ID NO: 2) em aMSH que pode ser importante para dobrar proteínas/peptídeos e expor a sequência RW central na curva β;

3. presença do GIPV545-548 (na SEQ ID NO: 1) homologia de sequência (75%) com GKPV10-13 (na SEQ ID NO: 2), isto é, o terminal C de a-MSH.

[272] É provável que a combinação das 2 primeiras propriedades seja necessária para a funcionalidade exclusiva do epítopo de ClpB do tipo α-MSH (resíduos de aminoácidos 534-548 da SEQ ID NO: 1), incluindo interações antigênicas e ligantes do tipo a-MSH.

[273] Todas as Enterobacteríacea comensais e patogênicas continham o epítopo idêntico do tipo α-MSH de

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ClpB, sugerindo a capacidade das bactérias pertencentes a essa família de interferirem na sinalização de α-MSH. Tais bactérias incluem, mas não estão limitadas aos gêneros Escherichia , Salmonella , Shigella_r Klebsiella_r Enterobacter_rCitrobacter_r Cronobacter e Hafnia.

Exemplo 3: Identificação de fragmentos ClpB

Material e métodos [274] Fragmentação ClpB [275] Primeiro, a fragmentação foi realizada em diferentes condições: ClpB diluído a 1/10 (do estoque a 5 mg/mL) e ClpB 1/10 com 0,0025% de tripsina. Essas diferentes condições foram colocadas durante 20 minutos a 37 °C. Após a incubação, a fragmentação foi imediatamente interrompida colocando tubos no gelo e foi realizada a Western blot.

[276] Western Blot [277] Após a fragmentação, a solução de Leamli sem β-mercaptoetanol foi adicionada aos tubos para realizar western em gel SDS de acrilamida a 20% em tampão Tris-Glicina (BioRad, Hercules, EUA) e transferida para uma membrana de nitrocelulose (GE Healthcare, Orsay, França). Em seguida, a membrana foi bloqueada por pelo menos 1 hora em temperatura ambiente com leite seco sem gordura a 5% (p/v) em TBS (10 mmol/L Tris, pH 8; 150 mmol/L NaCl) mais Tween 20 a 0,05% (p/v) . Após o bloqueio, a membrana foi incubada durante a noite a 4 °C com anticorpo anti-a-MSH. A membrana foi

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98/107 incubada durante a noite a 4 °C com anticorpos policlonais anti-a-MSH de coelho (1: 1000, Phoenix Pharmaceuticals) . Após três lavagens em uma solução de bloqueio de leite seco sem gordura a 5% (p/v) em TBS/Tween 20 a 0,05%, as membranas foram incubadas por 1 hora com anti-IgG de coelho conjugada com peroxidase (1: 1000, SantaCruz Biotechnology) . Após três lavagens, a reação da peroxidase foi revelada usando o kit de detecção de ECL (GE Healthcare) . As bandas de proteínas foram comparadas com o padrão de peso molecular (Precision Plus, BioRad) e os filmes foram escaneados usando o ImageScanner III (GE Healthcare).

[278] Western Blot no plasma, hipotálamo e mucosa cólica [279] Todos os cuidados e experimentação com animais estavam em conformidade com as diretrizes estabelecidas pelo National of Health, EUA, e estavam em conformidade com os regulamentos da Comunidade Francesa e Européia (Official Journal of the European Community L358, 18, 18/12/1986). Ratos Sprague-Dawley machos ou camundongos C57B16 (Janvier Labs, Genest-Saint-Isle, França) foram mantidos em gaiolas e em condições ambientais controladas (22 °C + /- 1 °C em um ciclo claro-escuro de 12 horas com luzes acesas às 7:30 da manhã) . Durante o período de aclimatação, os animais tiveram acesso ad libitum à água e

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99/107 ração padrão RM1 (dieta RM1; Special Diet Service Ltd, Witham, Essex, Reino Unido).

[280] A mucosa do cólon foi retirada desses ratos e camundongos e lavada com PBS. O plasma e o hipotálamo desses mesmos animais também foram coletados e armazenados a - 80 °C.

[281] Os tecidos foram incubados com tampão extraído (PBS + inibidor de protease (1%)). O volume adicionado depende da quantidade da amostra. As amostras foram homogeneizadas usando oleiro. Em seguida, as amostras foram centrifugadas (12000g, 20 min, 4 °C) . O sobrenadante foi armazenado em - 80 °C se não for analisado imediatamente.

[282] O protocolo utilizado é o mesmo que o descrito anteriormente, mas foi adicionado p-mercaptoetanol a 10% (p/v) em solução de Laemli. Em seguida, as amostras foram aquecidas a 85 °C durante 2 minutos antes da migração no gel. Dois anticorpos primários foram testados: anticorpos policlonais de coelho anti- ClpB de E. coll (1: 5000, Delphi Genetics) e anticorpos anti-alfa-MSH (1: 3000, Phoenix Pharmaceuticals). O anticorpo secundário utilizado para ambos foi anti- IgG de coelho conjugado com peroxidase (1: 5000, Dako).

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Resultados [283] O Western blot realizado na proteína ClpB préincubada com tripsina mostrou várias bandas quando revelado com anticorpos anti-a-MSH (Figura 3) . Portanto, a etapa de tripsinização produz vários fragmentos de ClpB. Em particular, um~25 kDa parece ser produzido em maiores quantidades que outros fragmentos. Além disso, estes resultados demonstram que os fragmentos contêm uma sequência com semelhança com o peptídeo α-MSH, uma vez que são reconhecidos por anticorpos anti-a-MSH.

[284] Além disso, o Western blot mostrou que não existe ClpB completo (~ 96 kDa) na solução após a tripsinização.

[285] Além disso, os resultados da Figura 4 mostram que o fragmento de ~ 25 kDa é detectado na mucosa cólica, no hipotálamo e no plasma de camundongos (A) e ratos (B). Além disso, este fragmento é revelado com anticorpos policlonais anti-a-MSH (a) e anti-ClpB (b).

[286] Após o sequenciamento deste fragmento de ~ 25 kDa, parece que este corresponde à sequência de ClpB a partir do aminoácido 537 ao aminoácido 756 (SEQ ID NO: 22).

Exemplo 4: Efeitos dos polipeptideos da invenção na liberação de PYY e GLP-1 [287] Experimento de secreção de PYY em cólon de rato

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Cultura de células [288] Após a eutanásia, o cólon de rato foi amostrado e lavado com solução salina tamponada com fosfato (PBS) . O tecido intestinal foi então lavado com meio L-15 (meio Leibovitz-15; Sigma-Aldrich, Mo, US) mantendo um pH fisiológico. A mucosa cólica foi raspada e digerida com 0,4 mg/mL de colagenase IX (Psichas et al. , 2015. Int J Obes (Lond) . em DMEM de alta glicose (meio de Eagle modificado por Dulbecco; Dominique Dutscher, França - suplementado com

5,5 mmol/L de L-glutamina, 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina e aminoácidos não essenciais) a 37 °C durante 5-10 minutos. As suspensões celulares foram centrifugadas a 750 rpm durante 8 minutos e as células intestinais foram suspensas no mesmo meio DMEM suplementado no qual foram adicionados 10% do soro bovino fetal. As suspensões celulares foram filtradas a 100 pm (Merck Millipore, Mass, EUA) e cultivadas em placas de 24 poços revestidas com 1% de Matrigel (Corning, NY, EUA) . Finalmente, as placas foram incubadas durante a noite a 37 °C em uma atmosfera de 95% de 02/5% de CO2.

Preparação de lisado celular [289] Anteriormente, foram realizadas culturas de bactérias do tipo selvagem (WT) e E. coll K12 depletadas com ClpB (ΔΟΙρΒ) para prosseguir para a extração total de proteínas. A extração de proteínas foi realizada em PBS

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102/107 contendo inibidor de protease a 1% (Sigma-Aldrich, Mo, US) por sonicação durante 30 segundos. Então, foi realizada uma centrifugação a 10000 rpm durante 30 minutos a 4 °C. O sobrenadante contendo proteínas foi então incubado com 0, 0025% de tripsina durante 20 minutos a 37 °C. Após a incubação, a fragmentação foi imediatamente interrompida colocando tubos no gelo. A solução contendo proteínas foi amostrada e dosada para determinar a concentração total de proteínas em cada condição.

[290] Concomitantemente, as células intestinais foram incubadas em tampão de secreção pH 7,4 (4,5 mM de KC1, 138 mM de NaCl, 4,2 mM de NaHCO3, l,2mM de NaH2PO4, 2,6 mM de CaC12, 1,2 mM de CaC12, 1,2 mM de MgC12 e 10 mM de HEPES) . Em seguida, as células foram incubadas durante 20 minutos a 37 °C em tampão de secreção contendo fragmentos de proteínas tripsinizadas de E. coll K12 WT e E. coll K12 AClpB a 0,015 pg/pL (Breton et al., 2015. International Journal of Eating Disorders. 49: 805-808; η = 4 para cada condição) . Como controle, as células também foram incubadas em PBS.

[291] Após a incubação, os sobrenadantes foram amostrados, centrifugados (10000 rpm durante 3 minutos) e imediatamente armazenados a -80 °C. Em seguida, as células foram tratadas com um tampão de lise (Tris-HCl 50 mmol/L, NaCl 150 mmol/L, IGEPAL-CA 630 a 1%, ácido desoxicólico a 0,5% e coquetel inibidor de protease sem EDTA) para extrair

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103/107 peptídeos intracelulares. Os lisados celulares foram imediatamente congelados a -80 °C para medições PYY.

Dosagem de PYY [292] A dosagem de PYY foi realizada no meio celular e nos lisados celulares para medir a liberação de PYY (no meio), a produção (dentro dos lisados) e a produção relativa total de PYY (meio e lisados) . Esta dosagem foi realizada usando o Fluorescent Immunoassay Kit® (Phoenix Pharmaceuticals, Inc.) de acordo com as instruções do fabricante .

[293] Resumidamente, após toda a reconstituição do reagente, 50 μΐ de lx tampão de ensaio em 2 poços como ligação total, 50 μΐ de padrões peptídicos preparados (em duplicata), 50 μΐ de controle positivo reidratado (em duplicata) e 50 μΐ de amostras preparadas (em duplicata) foram carregados na imunoplaca. Em seguida, 25 μΐ de anticorpo primário reidratado e 25 μΐ de peptídeo biotinilado reidratado foram adicionados a cada poço, exceto o poço em branco. A microplaca foi incubada por 2 horas em temperatura ambiente (20-23 °C) sob agitação orbital a 300-400 rpm. Após a incubação, cada poço foi lavado quatro vezes com 350 μΐ de Ix tampão de ensaio e foram adicionados 100 μΐ de solução de anticorpo SA-HRP previamente preparada diluindo 12 μΐ de SAHRP em 12 ml de Ix tampão de ensaio. A imunoplaca foi incubada novamente por 1 hora em temperatura ambiente (20-23 °C) sob

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104/107 agitação orbital a 300-400 rpm. Após a incubação, cada poço foi lavado da mesma maneira que antes e foram adicionados 100 μΐ de solução de substrato TMB. A placa foi incubada e protegida da luz por 1 hora em temperatura ambiente (20 — 23 °C) sob agitação orbital a 300-400 rpm.

[294] No final, 100 μΐ de HC1 2N foram adicionados a cada poço para interromper a reação (a cor no poço mudou de azul para amarelo) e a imunoplaca é lida em um leitor de placas de microtitulação. A absorbância na densidade óptica foi lida a 450 nm.

[295] Experimento de secreção PYY em cólon e íleo de rato [296] Os cólons e íleos foram removidos de ratos machos (Janvier Labs, Genest-Saint-Isle, França). Eles foram lavados com BBS gelado, depois com meio L-15 (Leibowitz) gelado (PAA, Yeovil, Reino Unido). Em seguida, foram digeridos com 0,4 mg/mL de colagenase XI (Sigma, Poole, Reino Unido) em DMEM de alto teor de glicose (+ 1% de L-glutamina + 1% de penicilina + 1% de estreptomicina + 1% e aminoácidos não essenciais) a 37 °C durante 10 min. As suspensões das células foram centrifugadas (10 min a 400 g) e os sedimentos foram ressuspensos em DMEM de alto teor de Glicose (a mesma que anteriormente, mas com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) . As suspensões celulares foram filtradas através de uma malha de náilon (tamanho de poro 100 pm) (Merck Millipore, Mass,

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EUA) e plaqueadas em 24 poços, placas revestidas com Matrigel a 1% (Corning, NY, EUA) . As placas foram incubadas durante a noite a 37 °C em uma atmosfera de 95% de 02 e 5% de C02.

[297] Após 24 horas de cultura, as células foram incubadas por 20 min em banho-maria com tampão de secreção (4 mM de KC1, 138 mM de NaCl, 1,2 mM de NaHCO3, 1,2 mM de NaH2PO4, 1,2 mM de NaH2PO4, 2,6 mM de CaC12, 1,2 mM de MgC12 e 10 mM de HEPES) ajustados em pH 7,4) e ClpB de comprimento total ou o fragmento ~ 25 kDa a uma concentração de 10 nM. Como controle, as células foram incubadas com tampão de secreção e PBS.

[298] Após a incubação, as células foram tratadas com tampão de lise (50 mmol/L de Tris-HCl, 150 mmol/L de NaCl, 1% de IGEPAL CA-630, 0,5% de ácido desoxicólico + coquetel de comprimidos inibidores de protease completos sem EDTA) para extrair peptídeos intracelulares. As células foram coletadas com um raspador de células e os lisados foram centrifugados (20 min a 12000g). Os lisados foram armazenados a -80 °C se não fossem analisados imediatamente.

[299] A secreção de hormônios intestinais foi testada usando o PYY Fluorescent Immunoassay Kit® (Phoenix Pharmaceuticals, Inc.) como descrito acima.

Resultados [300] Liberação PYY em cólons de rato

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106/107 [301] As mesmas proteínas de E. coli pré-incubadas com fragmentos de ClpB produtores de tripsina como acima foram usadas para experimentos em células intestinais primárias cultivadas a partir de cólon de rato. Os resultados mostram um aumento da liberação do PYY em comparação ao controle (Figura 5) . Pelo contrário, nenhum efeito foi observado com a cepa depletada de ClpB (Figura 5).

[302] Esses resultados demonstram que os fragmentos de ClpB levam a uma liberação mais eficiente de PYY, demonstrando assim uma ativação do MC4R (ver Panaro et al., 2014). Cell Metab. 20(6):1018-1029).

[303] Liberação PYY em cólons e ileos de ratos [304] Os resultados mostram que a incubação de tecidos intestinais de ratos com ClpB de comprimento total e com o fragmento de ~ 25 kDa aumenta a secreção de PYY em comparação com o controle (Figura 6).

Exemplo 5: Efeitos dos polipeptideos da invenção na ingestão de alimentos

Material e métodos [305] Os ratos machos C57/B16 foram colocados nas gaiolas de camundongos BioDAQ (Research Diets, Inc., New Brunswick, NJ) sozinhos para medir a ingestão de alimentos. Cada camundongo foi administrado com soro fisiológico (n = 6), ClpB completo ou fragmento de ~ 25 kDa.

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107/107 [306] Dois modos de administração foram testados: injeção intraperitoneal (i.p.) na concentração de 2 pmol em um volume de 200 pL (n = 8) e administração oral em uma concentração de 60 pmol em um volume de 200 pL (n = 10).

Resultados [307] Os resultados apresentados nas Figuras 7 e 8 mostram que a administração do fragmento de ~ 25 kDa diminui a ingestão de alimentos em camundongos pelo menos tanto quanto a proteína ClpB de comprimento total durante pelo menos 90 min.

[308] Em particular, a administração oral do fragmento de ~ 25 kDa diminui a ingestão de alimentos, enquanto a administração oral da proteína ClpB completa não tem esse efeito (Figura 8).

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Polipeptídeo ou proteína de pelo menos 15 aminoácidos caracterizado(a) pelo fato de que compreende um fragmento de uma proteína ClpB ou uma variante da mesma, compreendendo um resíduo negativamente carregado e dois resíduos Arg e Trp consecutivos, em que o referido (a) polipeptídeo ou proteína não é uma proteína ClpB completa.
2. Polipeptídeo ou proteína, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado(a) pelo fato de que o referido(a) polipeptídeo ou proteína compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:2.
3. Polipeptídeo ou proteína, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado (a) pelo fato de que o referido(a) polipeptídeo ou proteína compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:3.
4. Polipeptídeo ou proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado(a) pelo fato de que o referido(a) polipeptídeo ou proteína compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:4.
5. Polipeptídeo ou proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado(a) pelo fato de que compreende, adicionalmente, uma sequência com pelo menos 75% de homologia com a sequência GKPV.
6. Polipeptídeo ou proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado(a) pelo fato de

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2/3 que o referido(a) polipeptídeo ou proteína compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:6.
7. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo ou proteína conforme definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
8. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo ou proteína conforme definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
9. Medicamento caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo ou proteína conforme definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
10. Suplemento dietético caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo ou proteína conforme definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
11. Composição alimentar caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo ou proteína conforme definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
12. Polipeptídeo ou proteína, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, medicamento de acordo com a reivindicação 9, caracterizado (a) pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de obesidade, sobrepeso e/ou doenças e distúrbios relacionados à obesidade em um indivíduo em necessidade do mesmo.

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3/3
13. Uso do polipeptideo ou proteína conforme definido (a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, do suplemento dietético conforme definido na reivindicação 10 ou da composição alimentar conforme definida na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é para a redução de peso em um indivíduo.
14. Polipeptideo ou proteína, composição farmacêutica, medicamento, suplemento dietético ou composição alimentar, caracterizado(a) pelo fato de que é para uso como definido na reivindicação 12 ou 13, em que o indivíduo não é obeso.
15. Kit caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptideo ou proteína conforme definido(a) em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, uma composição conforme definida na reivindicação 7, uma composição farmacêutica conforme definida na reivindicação 8, um medicamento conforme definido na reivindicação 9, um suplemento dietético conforme definido na reivindicação 10 ou uma composição alimentar conforme definida na reivindicação 11.