KR20190091281A - 항인간 cd73 항체 - Google Patents

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하나에 도요나가
후미오 오사키
도모히로 에구치
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아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

[과제] 종래의 항체보다 증강된, AMP 의존적으로 억제된 인간 T 세포 기능의 회복능을 갖는 항인간 CD73 항체를 제공하는 것에 있다. [해결 수단] 서열 번호 2의 아미노산 번호 31로부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50으로부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99로부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24로부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50으로부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 89로부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 CD73 항체를 제공한다.

Description

항인간 CD73 항체
본 발명은, 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용한 항인간 CD73 항체에 관한 것이다.
CD73(엑토 5' 뉴클레오티다제)은 AMP(아데노신 일인산)를 아데노신으로 분해하는 효소이다. CD73은 GPI 앵커형 단백질로서 세포막 표면에 있어서 2량체로서 존재하고, 림프구 세포, 내피 세포를 비롯하여 대장, 뇌, 신장, 간장, 폐, 심장 등 다양한 조직에 발현하고 있다. 또한 CD73은, 림프구 세포의 세포막 표면으로부터 절단되어 가용형 CD73으로서 존재하고, 가용형 CD73도 AMP를 분해하는 효소 활성을 가짐이 보고되어 있다. AMP의 분해에 의해 산생된 아데노신은 T 세포를 비롯한 면역계 세포의 기능을 억제하기 때문에, CD73은 면역 응답의 조절에 중요한 역할을 하고 있다. (Arterioscler Thromb Vasc Biol., 2008, Vol. 28, p. 18-26)(Trends Mol Med., 2013, Vol. 19, p. 355-367)(Eur J Immunol., 2015, Vol. 45, p. 562-573)
병태와의 관련성으로서는, CD73의 발현이 대장암 세포주에서 확인되고 있다(Mediators Inflamm., 2014, Article ID 879895). 또한 대장암 환자는 정상 조직보다 암조직에 있어서 CD73 발현이 상승되고 있고, CD73 발현이 높은 환자는 발현이 낮은 환자보다 전체 생존율이 낮음이 보고되어 있다(J Surg Oncol., 2012, Vol. 106, p. 130-137).
다른 종류의 암에 관해서는, 부신암, 유방암, 악성 흑색종, 다형성 교아종, 난소암, 수아종, 방광암의 세포주에 있어서 CD73 발현이, 유방암, 위암, 췌암, 만성 골수성 백혈병, 피부 T 세포 림프종, 교아종에 있어서 CD73 활성의 상승이 확인된다(Pharmacol Ther., 2000, Vol. 87, p. 161-173)(Biomed Res Int., 2014, Article ID 460654). 또한 두경부암, 갑상선암에 있어서의 CD73 발현 상승이나, CD73의 발현이 전립선암에 있어서 암세포의 증식을 촉진함도 보고되어 있다(Trends Mol Med., 2013, Vol. 19, p. 355-367).
AMP를 분해하는 CD73의 효소 활성을 저해하는 것은, 억제된 T 세포 등 면역계 세포의 기능을 회복시켜, 항종양 면역의 활성화로 연결되기 때문에, CD73은 암의 치료 표적으로서 연구되고 있다. 또한, 그와 같은 효소 저해 활성을 갖는 항CD73 항체가, 동물 모델에서 항종양 활성을 나타냄이 알려져 있다. (비특허문헌 1)
인간 CD73 효소 활성을 저해하는 항체에 대한 복수의 연구가 행해지고 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2, 특허문헌 3, 비특허문헌 1). 특허문헌 1 및 비특허문헌 1에서 보고되어 있는 MEDI9447은 가용형 CD73에 대해서 벨셰이프형의 저해를 나타낸다고 하는 특징을 갖고 있다. MEDI9447은 고형암을 적응증으로 한 제1상 시험을 개시하고 있지만, 특허문헌 2 및 특허문헌 3에서 보고되어 있는 항체도 포함하여, 임상에 있어서의 치료 효과는 아직 확인되어 있지 않다.
이뮤노사이토카인이라고 칭해지는, 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트와 사이토카인의 융합체가 알려져 있고, 항종양 면역을 활성화시킬 목적으로 복수의 연구가 행해지고 있다(Curr Opinion in Immunol., 2016, Vol. 40, p. 96-102).
항종양 면역을 활성화시킬 가능성이 있는 사이토카인의 예로서는 IL-7 및 IL-21의 연구가 행해지고 있지만, 인간에 대한 고용량의 투여로 독성을 나타낼 가능성이 보고되고 있다(Clin Cancer Res., 2010, Vol. 16, p. 727-735)(Clin Cancer Res., 2007, Vol. 13, p. 3630-3636).
국제 공개 번호 2016/075176호 국제 공개 번호 2016/055609호 국제 공개 번호 2016/081748호
「마브스(mAbs)」, (미국), 2016;8(3):454-467
본 발명의 과제는, 항인간 CD73 항체를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 항인간 CD73 항체의 제작에 있어서 상당한 창의 검토를 거듭한 결과, 서열 번호 2의 아미노산 번호 31로부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50으로부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99로부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24로부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50으로부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 89로부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항인간 CD73 항체 CDS-1을 제작하고(실시예 1), 당해 항체가 인간 CD73에 결합하여(실시예 2), 인간 CD73의 효소 활성을 저해하는 것(실시예 3및 4), AMP 의존적으로 억제된 인간 T 세포 기능을 회복하는 것(실시예 5)을 발견했다. 이들 결과, 본 발명의 항인간 CD73 항체를 제공하여, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은, 이하의 [1]∼[31]에 관한 것이다.
[1]
서열 번호 2의 아미노산 번호 31로부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50으로부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99로부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24로부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50으로부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 89로부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
[2]
서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, [1]에 기재된 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
[3]
하기 (a)∼(b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 [1] 또는 [2]에 기재된 항인간 CD73 항체:
(a) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체; 및,
(b) (a)에 기재된 항인간 CD73 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체인 항인간 CD73 항체.
[4]
하기 (a)∼(b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 [3]에 기재된 항인간 CD73 항체:
(a) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체; 및,
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 452까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체.
[5]
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, [4]에 기재된 항인간 CD73 항체.
[6]
서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 452까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, [4]에 기재된 항인간 CD73 항체.
[7]
[1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트와 다른 펩티드나 단백질이 융합한 융합체.
[8]
[1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트와 수식제가 결합한 수식체.
[9]
하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 [7]에 기재된 융합체:
(a) 서열 번호 7에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체;
(b) 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체;
(c) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체;
(d) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 15에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체; 및,
(e) (a)∼(d)에 기재된 융합체의 번역 후 수식에 의해 생긴 융합체.
[10]
하기 (a)∼(b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드:
(a) [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및,
(b) [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
[11]
하기 (a)∼(b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [10]에 기재된 폴리뉴클레오티드:
(a) [5]에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및
(b) [5]에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
[12]
하기 (a)∼(b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [11]에 기재된 폴리뉴클레오티드:
(a) [9]에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및
(b) [9]에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
[13]
하기 (a) 및/또는 (b)를 포함하는, 발현 벡터:
(a) [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및,
(b) [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
[14]
하기 (a) 및/또는 (b)를 포함하는, [13]에 기재된 발현 벡터:
(a) [5]에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및,
(b) [5]에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
[15]
하기 (a) 및/또는 (b)를 포함하는, [14]에 기재된 발현 벡터:
(a) [9]에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및,
(b) [9]에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
[16]
하기 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 숙주 세포:
(a) [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및,
(d) [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및, [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[17]
하기 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [16]에 기재된 숙주 세포:
(a) [5]에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [5]에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) [5]에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 [5]에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및,
(d) [5]에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및, [5]에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[18]
하기 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, [17]에 기재된 숙주 세포:
(a) [9]에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [9]에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) [9]에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 [9]에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및,
(d) [9]에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및, [9]에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[19]
이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 CD73 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트 또는 그들 중 어느 것의 융합체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 CD73 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트 또는 그들 중 어느 것의 융합체를 생산하는 방법:
(a) [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, [2]에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[20]
이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 CD73 항체 또는 그의 융합체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 CD73 항체 또는 그의 융합체를 생산하는 방법:
(a) [5]에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 [5]에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [5]에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 [5]에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) [5]에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, [5]에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[21]
이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 CD73 항체의 융합체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 CD73 항체의 융합체를 생산하는 방법:
(a) [9]에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 [9]에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) [9]에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 [9]에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) [9]에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, [9]에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
[22]
[3]에 기재된 항인간 CD73 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
[23]
암의 예방 또는 치료용 의약 조성물인, [22]에 기재된 의약 조성물.
[24]
[3]에 기재된 항인간 CD73 항체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법.
[25]
암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, [3]에 기재된 항인간 CD73 항체.
[26]
암의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, [3]에 기재된 항인간 CD73 항체의 사용.
[27]
[9]에 기재된 융합체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
[28]
암의 예방 또는 치료용 의약 조성물인, [27]에 기재된 의약 조성물.
[29]
[9]에 기재된 융합체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법.
[30]
암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, [9]에 기재된 융합체.
[31]
암의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, [9]에 기재된 융합체의 사용.
본 발명의 항인간 CD73 항체는, 인간 CD73 효소 저해 활성을 가져, 암의 예방 또는 치료제로서 사용할 수 있다.
도 1은, CDS-1, MEDI9447, 6E1 및 CD73.4IgG2CS-IgG1.1f에 의한, 인간 CD73 효소 저해 활성을 나타낸 도면이다.
도 2는, CDS-1, MEDI9447, 6E1 및 CD73.4IgG2CS-IgG1.1f에 의한, 인간 T 세포로부터의 IFNγ 산생량을 지표로 하여 인간 T 세포 기능의 회복을 나타낸 도면이다.
도 3은, CDS-1, MEDI9447, 6E1 및 CD73.4IgG2CS-IgG1.1f에 의한, 인간 T 세포의 증식을 지표로 하여 인간 T 세포 기능의 회복을 나타낸 도면이다.
이하에, 본 발명에 대해 상술한다.
항체에는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 5개의 클래스가 존재한다. 항체 분자의 기본 구조는, 각 클래스 공통으로, 분자량 5만∼7만의 중쇄와 2만∼3만의 경쇄로부터 구성된다. 중쇄는, 통상 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄로 이루어지고, 클래스마다 특징적인 구조를 가지고, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 Igγ, Igμ, Igα, Igδ, Igε라고 불린다. 더욱이 IgG에는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 서브클래스가 존재하고, 각각에 대응하는 중쇄는 Igγ1, Igγ2, Igγ3, Igγ4라고 불리고 있다. 경쇄는, 통상 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드쇄로 이루어지고, L형과 K형의 2종이 알려져 있으며, 각각 Igλ, Igκ라고 불린다. 항체 분자의 기본 구조의 펩티드 구성은, 각각 상동인 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄가, 다이설파이드 결합(S-S 결합) 및 비공유 결합에 의해 결합되고, 분자량 15만∼19만이다. 2종의 경쇄는, 어느 중쇄와도 짝을 이룰 수 있다. 개개의 항체 분자는, 항상 동일한 경쇄 2개와 동일한 중쇄 2개로 이루어져 있다.
쇄내 S-S 결합은, 중쇄에 4개(μ, ε쇄에는 5개), 경쇄에는 2개 있고, 아미노산 100∼110잔기마다 하나의 루프를 이루며, 이 입체 구조는 각 루프간에 유사하고, 구조 단위 또는 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 아미노 말단(N말단)에 위치하는 도메인은, 동종 동물의 동일 클래스(서브클래스)로부터의 표품이어도, 그 아미노산 서열이 일정하지 않아, 가변 영역이라고 불리고 있고, 각 도메인은, 각각, 중쇄 가변 영역(혹은 VH) 및 경쇄 가변 영역(혹은 VL)이라고 불리고 있다. 가변 영역보다 카복시 말단(C말단)측의 아미노산 서열은, 각 클래스 또는 각 서브클래스에서 거의 일정하여 정상 영역이라고 불리고 있다. 정상 영역의 각 도메인은, 각각, 가변 영역측으로부터 순차로 CH1, CH2, CH3 또는 CL로 표시된다.
항체의 항원 결합 부위는 VH 및 VL에 의해 구성되고, 결합의 특이성은 이 부위의 아미노산 서열에 의하고 있다. 한편, 보체나 각종 이펙터 세포와의 결합이라고 하는 생물학적 활성은 각 클래스 Ig의 정상 영역의 구조의 차이를 반영하고 있다. 경쇄와 중쇄의 가변 영역의 가변성은, 어느 쪽의 쇄에도 존재하는 3개의 작은 초가변 영역에 거의 한정되는 것을 알 수 있어, 이들 영역을 상보성 결정 영역(CDR; 각각 N말단측으로부터 CDR1, CDR2, CDR3)이라고 부르고 있다. 가변 영역의 나머지의 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리고, 비교적 일정하다.
항체의 VH 및 VL을 포함하는 각종 항원 결합 프래그먼트도 항원 결합 활성을 갖고, 이와 같은 대표적인 항원 결합 프래그먼트로서, 1본쇄 가변 영역 프래그먼트(scFv), Fab, Fab', F(ab')2를 들 수 있다. Fab는, 경쇄와, VH, CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로부터 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이다. Fab'는, 경쇄와, VH, CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 중쇄 프래그먼트로부터 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이며, 이 힌지 영역의 부분에는 중쇄간 S-S 결합을 구성하고 있던 시스테인 잔기가 포함된다. F(ab')2 프래그먼트는, 2개의 Fab' 프래그먼트가 힌지 영역 중의 중쇄간 S-S 결합으로 결합한 2가의 항체 프래그먼트이다. scFv는, 링커로 연결된 VH와 VL로부터 구성되는, 1가의 항체 프래그먼트이다.
본 명세서 중에서 사용되는 항체의 아미노산 잔기 번호는, Kabat 넘버링 또는 EU 인덱스(Kabat 등, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242)를 지정함으로써, 그들의 넘버링 시스템에 따라 규정할 수 있다.
＜본 발명의 항인간 CD73 항체＞
본 발명의 항인간 CD73 항체에는, 이하의 특징을 갖는 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트가 포함된다:
서열 번호 2의 아미노산 번호 31로부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50으로부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99로부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24로부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50으로부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 89로부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 CD73 항체는, 이하의 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트이다:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄 정상 영역으로서는, Igγ, Igμ, Igα, Igδ 또는 Igε의 어느 정상 영역도 선택 가능하다. Igγ로서는, 예를 들어, Igγ1, Igγ2, Igγ3 또는 Igγ4로부터 선택하는 것이 가능하다. 하나의 실시형태로서, 중쇄 정상 영역은 Igγ1 정상 영역이며, 예를 들어, 인간 Igγ1 정상 영역이다.
본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄 정상 영역은, 항체의 항체 의존성 세포 상해 활성이나 보체 의존성 상해 활성을 저하시키는 것을 목적으로 한 변이를 갖고 있어도 된다. L234A란, 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 234위의 류신의 알라닌으로의 치환이다. L235A란, 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 235위의 류신의 알라닌으로의 치환이다. P331S란, 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 EU 인덱스에 따르는 아미노산 331위의 프롤린의 세린으로의 치환이다. L234A, L235A 및 P331S의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역으로서는, 예를 들어, 서열 번호 2의 아미노산 번호 124로부터 453까지의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 Igγ1 정상 영역을 들 수 있다. 당해 변이는, 항체의 항체 의존성 세포 상해 활성이나 보체 의존성 상해 활성을 저하시킴이 알려져 있다(Mol Immunol., 1992, Vol. 29, p. 633-639)(J Immunol., 2000, Vol. 164, p. 4178-4184).
본 발명의 항인간 CD73 항체의 경쇄 정상 영역으로서는, Igλ 또는 Igκ의 어느 정상 영역도 선택 가능할 수 있다. 하나의 실시형태로서, 경쇄 정상 영역은 Igκ 정상 영역이며, 예를 들어, 인간 Igκ 정상 영역이다. 인간 Igκ 정상 영역의 예로서, 서열 번호 4의 아미노산 번호 110으로부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 Igκ 정상 영역을 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 CD73 항체는, scFv, Fab, Fab', 또는 F(ab')2인 항원 결합 프래그먼트이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 CD73 항체는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 CD73 항체이다.
항체를 세포 내에서 발현시키는 경우, 항체가 번역 후에 수식을 받음이 알려져 있다. 번역 후 수식의 예로서는, 중쇄 C말단의 리신의 카복시펩티다제에 의한 절단, 중쇄 및 경쇄 N말단의 글루타민 또는 글루타민산의 파이로글루타밀화에 의한 파이로글루타민산으로의 수식, 글리코실화, 산화, 탈아마이드화, 당화 등을 들 수 있고, 여러 가지 항체에 있어서, 이와 같은 번역 후 수식이 생김이 알려져 있다(J Pharm Sci., 2008, Vol. 97, p. 2426-2447).
본 발명의 항인간 CD73 항체에는, 번역 후 수식에 의해 생긴 항체인 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트도 포함된다. 번역 후 수식에 의해 생긴 항체란, 번역 후 수식에 의해 생긴 항체의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 항체가 포함된다. 번역 후 수식에 의해 생긴 항체인 본 발명의 항인간 CD73 항체의 예로서는, 중쇄 가변 영역 N말단의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄 C말단의 리신 결실을 받은 항인간 CD73 항체를 들 수 있다. 이와 같은 N말단의 파이로글루타밀화 또는 C말단 리신 결실에 의한 번역 후 수식이 항체의 활성에 영향을 미치지는 않음은 당해 분야에서 알려져 있다(Anal Biochem., 2006, Vol. 348, p. 24-39).
하나의 실시형태에 있어서, 번역 후 수식에 의해 생긴 항체인 본 발명의 항인간 CD73 항체는, 이하의 항인간 CD73 항체이다:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 452까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체.
본 명세서에 있어서의 「항인간 CD73 항체」란, 인간 CD73에 결합하는 항체를 의미한다. 인간 CD73에 결합하는지 여부는, 공지된 결합 활성 측정 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들어, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA) 등의 방법을 들 수 있다. ELISA를 이용하는 경우는, 예를 들어, 인간 CD73 단백질(예를 들어, BPS Bioscience사, 71184)을 ELISA 플레이트에 고상화하고, 이것에 대해서 피험 항체를 첨가하여 반응시킨 후, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 등의 효소로 표지한 항IgG 항체 등의 2차 항체를 반응시킨다. 반응 후에 세정 조작을 행하고, 그 활성을 검출하는 시약(예를 들어, HRP 표지의 경우, TMB+substrate-chromogen(Dako사)) 등을 이용한 활성 측정에 의해, 2차 항체의 결합을 동정함으로써, 피험 항체가 인간 CD73에 결합하는지 여부를 확인할 수 있다. 구체적인 평가 방법으로서는, 예를 들어 후기 실시예 2에 기재되는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 항인간 CD73 항체에는, 인간 CD73에 결합하는 항체이면, 인간 CD73으로의 결합에 더하여, 다른 동물 유래의 CD73(예를 들어, 원숭이 CD73)에도 결합하는 항체도 포함된다.
본 발명의 항인간 CD73 항체의 활성을 평가하는 방법으로서, 인간 CD73의 효소 저해 활성을 평가해도 된다. 이와 같은 활성의 평가 방법으로서는, 예를 들어 후기 실시예 3 및 4에 기재되는 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 항인간 CD73 항체에는, 인간 CD73에 결합하여, 인간 CD73의 효소 저해 활성을 갖는 항체가 포함된다.
또한, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 활성을 평가하는 방법으로서, AMP 의존적으로 억제된 인간 T 세포의 기능을 회복시키는 활성을 평가해도 된다. 이와 같은 활성의 평가 방법으로서는, 후기 실시예 5에 기재되는 바와 같은 방법을 이용할 수 있다. 본 발명의 항인간 CD73 항체에는, 인간 CD73에 결합하여, AMP 의존적으로 억제된 인간 T 세포의 기능을 회복시키는 활성을 갖는 항체가 포함된다.
본 발명의 항인간 CD73 항체는, 본 명세서에 개시되는, 본 발명의 항체의 VH 및 VL의 서열 정보에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 본 발명의 항인간 CD73 항체는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 후술하는 ＜본 발명의 항인간 CD73 항체 또는 본 발명의 융합체를 생산하는 방법 및 해당 방법에 의해 생산할 수 있는 항인간 CD73 항체 또는 그의 융합체＞에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
본 발명의 항인간 CD73 항체는, 필요에 따라 추가로 정제된 후, 정해진 방법에 따라 제제화되어, 암의 예방 또는 치료에 이용할 수 있다. 본 발명에 의한 예방 또는 치료의 대상이 되는 암은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 폐암, 대장암, 부신피질암, 유방암, 악성 흑색종, 교아종, 난소암, 수아종, 방광암, 위암, 췌암, 만성 골수성 백혈병, 피부 T 세포 림프종, 글리어아종, 두경부암, 갑상선암, 또는 전립선암 등을 들 수 있다.
＜본 발명의 융합체 및 수식체＞
당업자이면, 본 발명의 항인간 CD73 항체를 이용하여, 본 발명의 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트와 다른 펩티드나 단백질이 융합한 융합체를 제작하는 것이나, 수식제가 결합한 수식체를 제작하는 것도 가능하다. 본 발명의 융합체 및 수식체는, 인간 CD73에 결합하는 한, 본 발명의 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트와 다른 펩티드나 단백질이 융합한 융합체 또는 수식제가 결합한 수식체를 포함한다. 융합에 이용되는 다른 펩티드나 단백질은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 각종 태그 펩티드, 인공 헬릭스 모티프 펩티드, 말토스 결합 단백질, 글루타티온 S 트랜스페라제, 각종 독소, 사이토카인, 케모카인, 그 외 다량체화를 촉진할 수 있는 펩티드 또는 단백질 등을 들 수 있다. 수식에 이용되는 수식제는 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 당쇄, 인지질, 리포솜, 저분자 화합물 등을 들 수 있다. 당해 융합 또는 수식은, 직접 융합 또는 수식해도 되고, 또한, 임의의 링커를 개재하여 융합 또는 수식해도 된다. 본 발명의 융합체는, 본 발명의 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에 사이토카인이 융합한 융합체를 포함한다. 본 발명의 융합체에 사용되는 사이토카인은, 천연에 존재하는 사이토카인에 한정되지 않고, 그 기능을 갖는 개변체여도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 융합체에 포함되는 사이토카인은, 인터류킨 7(IL-7), 인터류킨 21(IL-21) 또는 그들의 개변체이다. 또한, 본 발명의 융합체에 사용되는 사이토카인은, IL-7 혹은 IL-21의 생리 활성을 저하시킨 개변체여도 된다.
본 발명의 융합체에 있어서 중쇄란, 융합체에 포함되는 항체의 중쇄 및 해당 중쇄에 융합한 다른 펩티드나 단백질을 포함한다. 본 발명의 융합체에 있어서 경쇄란, 융합체에 포함되는 항체의 경쇄 및 해당 경쇄에 융합한 다른 펩티드나 단백질을 포함한다.
IL-7은, IL-7 수용체에 대해서 리간드로서 기능하는 사이토카인이다. IL-7은 T 세포나 B 세포 등의 생존, 증식 및 분화에 기여함이 보고되어 있다(Curr Drug Targets., 2006, Vol. 7, p. 1571-1582). 본 발명에 있어서, IL-7에는, 천연에 존재하는 IL-7 및 그 기능을 갖는 개변체가 포함된다. 하나의 실시형태에 있어서, IL-7은, 인간 IL-7이다. 본 발명에 있어서, 인간 IL-7에는, 천연에 존재하는 인간 IL-7 및 그 기능을 갖는 개변체가 포함된다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간 IL-7은, 이하의 (1)∼(3)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: (1) Accession No. NP＿000871.1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 IL-7의 기능을 갖는 폴리펩티드, (2) Accession No. NP＿000871.1에 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 인간 IL-7의 기능을 갖는 폴리펩티드, 및 (3) Accession No. NP＿000871.1에 나타나는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 IL-7의 기능을 갖는 폴리펩티드. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 인간 IL-7은 Accession No. NP＿000871.1에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드이다. 여기에서, 인간 IL-7의 기능이란, 각종 인간 면역 세포에 대해서의 생존, 증식 및 분화 작용을 말한다.
IL-21은, IL-21 수용체에 대해서 리간드로서 기능하는 사이토카인이다. IL-21은 T 세포나 B 세포 등의 생존, 증식 및 분화에 기여함이 보고되어 있다(Cancer Lett., 2015, Vol. 358, p. 107-114). 본 발명에 있어서, IL-21에는, 천연에 존재하는 IL-21 및 그 기능을 갖는 개변체가 포함된다. 하나의 실시형태에 있어서, IL-21은, 인간 IL-21이다. 본 발명에 있어서, 인간 IL-21에는, 천연에 존재하는 인간 IL-21 및 그 기능을 갖는 개변체가 포함된다. 하나의 실시형태에 있어서, 인간 IL-21은, 이하의 (1)∼(3)으로 이루어지는 군으로부터 선택된다: (1) Accession No. NP＿068575.1에 나타나는 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 IL-21의 기능을 갖는 폴리펩티드, (2) Accession No. NP＿068575.1에 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 인간 IL-21의 기능을 갖는 폴리펩티드, 및 (3) Accession No. NP＿068575.1에 나타나는 아미노산 서열과의 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열을 포함하고, 또한 인간 IL-21의 기능을 갖는 폴리펩티드. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용되는 인간 IL-21은 Accession No. NP＿068575.1에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드이다. 여기에서, 인간 IL-21의 기능이란, 각종 인간 면역 세포에 대해서의 생존, 증식 및 분화 작용을 말한다.
본 발명의 융합체에는, 번역 후 수식에 의해 생긴 융합체도 포함된다. 번역 후 수식의 예로서는, ＜본 발명의 항인간 CD73 항체＞에 있어서 기재한 여러 가지 번역 후 수식을 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 융합체는, 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 융합체이다:
(a) 서열 번호 7에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체;
(b) 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체;
(c) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체;
(d) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 15에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체; 및,
(e) (a)∼(d)에 기재된 융합체의 번역 후 수식에 의해 생긴 융합체.
하나의 실시형태에 있어서, 번역 후 수식에 의해 생긴 융합체인 본 발명의 융합체는, 이하의 융합체이다:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 452까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체.
하나의 실시형태에 있어서, 번역 후 수식에 의해 생긴 융합체인 본 발명의 융합체는, 이하의 융합체이다:
서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 452까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 15에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체.
＜본 발명의 폴리뉴클레오티드＞
본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 1의 염기 서열 1로부터 369까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 3의 염기 서열 1로부터 327까지의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 1 또는 11에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 3 또는 8에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드에는, 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및, 본 발명의 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 7에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 7에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 5 또는 6에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 3 또는 8에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 9 또는 16에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 1 또는 11에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 12에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 서열 번호 15에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드이다.
서열 번호 15에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서는, 예를 들어, 서열 번호 14에 나타나는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 그의 염기 서열에 기초하여, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 당해 분야에서 공지된 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이와 같은 유전자 합성 방법으로서는, WO90/07861에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지된 여러 가지 방법이 사용될 수 있다.
＜본 발명의 발현 벡터＞
본 발명의 발현 벡터에는, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항체의 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
본 발명의 발현 벡터에는, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
본 발명의 발현 벡터에는, 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 본 발명의 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 포함된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위해서 이용하는 발현 벡터로서는, 진핵 세포(예를 들어, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모) 및/또는 원핵 세포(예를 들어, 대장균)의 각종의 숙주 세포 중에서 본 발명의 항인간 CD73 항체 혹은 그의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 본 발명의 항인간 CD73 항체 혹은 그의 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하여, 이것들에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 산생할 수 있는 것인 한, 특별히 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 발현 벡터로서는, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스) 등을 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, pEE6.4나 pEE12.4(Lonza Biologics사)를 발현 벡터로서 사용할 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 동작 가능하도록 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 동물 세포에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, CMV, RSV, SV40 등의 바이러스 유래 프로모터, 액틴 프로모터, EF(elongation factor) 1α 프로모터, 히트쇽 프로모터 등을 들 수 있다. 세균(예를 들어, 에시리키아속균)에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터,λPL 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 효모에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들어, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서, 동물 세포, 곤충 세포 또는 효모를 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈 및 종지 코돈을 포함할 수 있다. 이 경우, 인핸서 서열, 본 발명의 항체 또는 그의 중쇄 혹은 경쇄를 코딩하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 분비 시그널 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 혹은 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 된다. 숙주 세포로서 대장균을 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈, 종지 코돈, 터미네이터 영역, 및 복제 가능 단위를 포함할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는, 목적에 따라 통상 이용되는 선택 마커(예를 들어, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 다이하이드로엽산 환원 효소 유전자)를 포함하고 있어도 된다.
＜본 발명의 형질 전환된 숙주 세포＞
본 발명의 형질 전환된 숙주 세포에는, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포가 포함된다:
(a) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항체의 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
본 발명의 형질 전환된 숙주 세포에는, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포가 포함된다:
(a) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
본 발명의 형질 전환된 숙주 세포에는, 이하의 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 본 발명의 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포가 포함된다:
(a) 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(c) 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(d) 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 해당 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
본 발명의 형질 전환된 숙주 세포의 예로서는, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 들 수 있다.
형질 전환하는 숙주 세포로서는, 사용하는 발현 벡터에 적합하고, 해당 발현 벡터로 형질 전환되어, 항체 또는 융합체를 발현할 수 있는 것인 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 형질 전환하는 숙주 세포로서는, 예를 들어, 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 천연 세포 또는 인공적으로 수립된 세포 등 여러 가지 세포(예를 들어, 동물 세포(예를 들어, CHOK1SV 세포), 곤충 세포(예를 들어, Sf9), 세균(에시리키아속균 등), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등) 등)를 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, CHOK1SV 세포, CHO-DG44 세포, HEK293 세포, NS0 세포 등의 배양 세포를 숙주 세포로서 사용할 수 있다.
숙주 세포를 형질 전환하는 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 인산 칼슘법, 일렉트로포레이션법 등을 이용할 수 있다.
＜본 발명의 항인간 CD73 항체 또는 본 발명의 융합체를 생산하는 방법 및 해당 방법에 의해 생산할 수 있는 항인간 CD73 항체 또는 그의 융합체＞
본 발명의 항인간 CD73 항체 또는 본 발명의 융합체를 생산하는 방법에는, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 CD73 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트 또는 그들 중 어느 것의 융합체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 CD73 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트 또는 그들 중 어느 것의 융합체를 생산하는 방법이 포함된다:
(a) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항체의 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 VH를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 해당 항체의 VL을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
본 발명의 항인간 CD73 항체 또는 본 발명의 융합체를 생산하는 방법에는, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 CD73 항체 또는 그의 융합체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 CD73 항체 또는 그의 융합체를 생산하는 방법이 포함된다:
(a) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) 본 발명의 항인간 CD73 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 해당 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
본 발명의 융합체를 생산하는 방법에는, 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 CD73 항체의 융합체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 CD73 항체의 융합체를 생산하는 방법이 포함된다:
(a) 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 해당 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
(b) 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 해당 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
(c) 본 발명의 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 해당 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
본 발명의 항인간 CD73 항체 또는 본 발명의 융합체를 생산하는 방법은, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 항인간 CD73 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트 또는 그들 중 어느 것의 융합체를 발현시키는 공정을 포함하고 있는 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 해당 방법에서 사용되는 숙주 세포의 예로서는, 전술한 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 들 수 있다.
형질 전환된 숙주 세포의 배양은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 배양 조건, 예를 들어, 온도, 배지의 pH 및 배양 시간은, 적절히 선택된다. 숙주 세포가 동물 세포인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 약 5∼20%의 태아 소 혈청을 포함하는 MEM 배지(Science, 1959, Vol. 130, p. 432-437), DMEM 배지(Virol., 1959, Vol. 8, p. 396), RPMI1640 배지(J Am Med Assoc., 1967, Vol. 199, p. 519), 199 배지(Exp Biol Med., 1950, Vol. 73, p. 1-8) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는, 예를 들어, 약 6∼8이며, 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 30∼40℃에서 약 15∼336시간 행해진다. 숙주 세포가 곤충 세포인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 태아 소 혈청을 포함하는 Grace's 배지(Proc Natl Acad Sci USA., 1985, Vol. 82, p. 8404) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는, 예를 들어, 약 5∼8이며, 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 20∼40℃에서 약 15∼100시간 행해진다. 숙주 세포가 대장균 또는 효모인 경우, 배지로서는, 예를 들어, 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 영양 배지는, 예를 들어, 형질 전환된 숙주 세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원, 또는 유기 질소원을 포함하고 있다. 탄소원으로서는, 예를 들어, 글루코스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등을, 무기 질소원 또는 유기 질소원으로서는, 예를 들어, 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘 스티프 리커, 펩톤, 카제인, 고기 추출물, 대두박, 감자 추출액 등을 들 수 있다. 소망에 따라 다른 영양소(예를 들어, 무기염(예를 들어, 염화 칼슘, 인산 이수소 나트륨, 염화 마그네슘), 비타민류), 항생 물질(예를 들어, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신) 등을 포함하고 있어도 된다. 배지의 pH는, 예를 들어, 약 5∼8이다. 숙주 세포가 대장균인 경우, 배지로서는, 예를 들어, LB 배지, M9 배지(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 3, A2.2) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 14∼43℃에서 약 3∼24시간 행해진다. 숙주 세포가 효모인 경우, 배지로서는, 예를 들어, Burkholder 최소 배지(Proc Natl Acad Sci USA., 1980, Vol. 77, p. 4505) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 20∼35℃에서 약 14∼144시간 행해진다. 전술과 같은 배양에 의해, 본 발명의 항인간 CD73 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 항인간 CD73 항체 또는 본 발명의 융합체를 생산하는 방법은, 본 발명의 형질 전환된 숙주 세포를 배양하여, 항인간 CD73 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트 또는 그들 중 어느 것의 융합체를 발현시키는 공정에 더하여, 추가로, 해당 형질 전환된 숙주 세포로부터 항인간 CD73 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트 또는 그들 중 어느 것의 융합체를 회수, 단리 또는 정제하는 공정을 포함할 수 있다. 단리 또는 정제 방법으로서는, 예를 들어, 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 겔 여과 등의 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 하이드록실 아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 배양 상청 중에 축적된 항체는, 각종 크로마토그래피, 예를 들어, 프로테인 A 컬럼 또는 프로테인 G 컬럼을 이용한 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
본 발명의 항인간 CD73 항체 또는 본 발명의 융합체에는, 본 발명의 항인간 CD73 항체 또는 본 발명의 융합체를 생산하는 방법으로 생산된 항인간 CD73 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트 또는 그들 중 어느 것의 융합체도 포함된다.
＜본 발명의 의약 조성물＞
본 발명의 의약 조성물에는, 본 발명의 항인간 CD73 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트 또는 본 발명의 융합체, 및, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이 포함된다. 본 발명의 의약 조성물은, 당해 분야에 있어서 통상 이용되고 있는 부형제, 즉, 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 이용하여, 통상 사용되는 방법에 따라 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물의 제형의 예로서는, 예를 들어, 주사제, 점적용제 등의 비경구제를 들 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 제제화에 임해서는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 부형제, 담체, 첨가제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 복수종의 본 발명의 항인간 CD73 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, C말단 리신의 결실 및 N말단의 파이로글루타밀화를 받고 있지 않은 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 및/혹은, C말단 리신의 결실 및/또는 N말단의 파이로글루타밀화를 받은 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 의약 조성물은, 복수종의 본 발명의 융합체를 포함할 수 있다. 예를 들어, C말단 리신의 결실 및 N말단의 파이로글루타밀화를 받고 있지 않은 융합체, 및/혹은, C말단 리신의 결실 및/또는 N말단의 파이로글루타밀화를 받은 융합체를 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 및, 해당 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 번역 후 수식에 의해 생긴 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 함유한다.
본 발명의 의약 조성물에는, 중쇄 C말단 리신의 결실 항체, N말단의 파이로글루타밀화를 받은 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 중쇄 C말단 리신을 결실 해 N말단의 파이로글루타밀화를 받은 항체, 및/혹은 중쇄 C말단 리신을 갖고 N말단의 파이로글루타밀화를 받고 있지 않은 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 함유하는 의약 조성물도 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체, 해당 항인간 CD73 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 항인간 CD73 항체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 서열 번호 7에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체의 융합체, 해당 융합체의 번역 후 수식에 의해 생긴 융합체의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 융합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체의 융합체, 해당 융합체의 번역 후 수식에 의해 생긴 융합체의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 융합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체의 융합체, 해당 융합체의 번역 후 수식에 의해 생긴 융합체의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 융합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 서열 번호 15에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체의 융합체, 해당 융합체의 번역 후 수식에 의해 생긴 융합체의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드를 포함하는 융합체, 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물이다.
제제화에 있어서의 본 발명의 항인간 CD73 항체, 융합체 및 수식체의 첨가량은, 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 혹은 항체의 결합 역가 등에 따라 상이하지만, 예를 들어 0.001mg/kg∼100mg/kg 정도를 이용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 암의 치료제로서 이용할 수 있다.
본 발명에는, 본 발명의 항인간 CD73 항체, 융합체 또는 수식체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 본 발명의 항인간 CD73 항체, 융합체 또는 수식체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 암을 치료 또는 예방하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 항인간 CD73 항체, 융합체 및 수식체가 포함된다. 또한, 본 발명에는, 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, 본 발명의 항인간 CD73 항체, 융합체 및 수식체의 사용이 포함된다. 본 발명에 의한 예방 또는 치료의 대상이 되는 암은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 폐암, 대장암, 부신피질암, 유방암, 악성 흑색종, 교아종, 난소암, 수아종, 방광암, 위암, 췌암, 만성 골수성 백혈병, 피부 T 세포 림프종, 글리어아종, 두경부암, 갑상선암, 또는 전립선암 등을 들 수 있다.
본 발명에 대해 더욱 이해를 얻기 위해서 참조하는 특정한 실시예를 여기에 제공하지만, 이것들은 예시 목적으로 하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
특별히 예고가 없는 경우는, 공지된 방법에 따라 실시 가능하다. 또한, 시판되는 시약이나 키트 등을 이용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 실시 가능하다.
[실시예 1: 항인간 CD73 항체의 제작]
인간 모노클로날 항체 개발 기술 「벨로시뮨」(VelocImmune antibody technology; Regeneron사(미국 특허 6596541호)) 마우스를 이용하여 항인간 CD73 항체를 제작했다. 당해 기술에 의해 취득되는 항체는, 가변 영역이 인간 유래, 정상 영역이 마우스 유래인 키메라 항체이다. 벨로시뮨 마우스에, 면역 반응을 야기하는 아주반트와 함께, 인간 CD73 단백질을 면역했다. 인간 CD73 단백질은 이하의 수법에 따라 조제했다. 유전자 공학적 수법에 의해 인간 CD73 유전자(ORIGENE사RC209568)의 염기 번호 1로부터 1641까지의 염기 서열의 3'말단에 대해 HisTag 서열(His×6) 및 종지 코돈을 코딩하는 염기 서열을 부가하고, 포유류 세포 발현용 벡터에 삽입한 것을 발현 벡터로 했다. 발현 벡터를 Expi293FTM 세포(Thermo Fisher Scientific사)에 트랜스펙션하고, 회수한 상청으로부터 인간 CD73 및 HisTag의 융합 단백질(인간 CD73-His 단백질)을 정제했다. 정제한 인간 CD73-His 단백질을 마우스에 수회 면역한 후에, 정해진 방법에 따라 하이브리도마를 제작했다. 그리고 하이브리도마 상청으로부터 정제한 항체를 이용하여, 인간 CD73 효소 활성을 저해하는 기능을 갖는 항체를 산생하는 하이브리도마 클론을 선발했다. 그 후 하이브리도마 클론으로부터 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 클로닝했다. 유전자 클로닝은 정해진 방법에 따라, 하이브리도마의 추출 RNA로부터 제작한 cDNA의 항체 유전자 서열을 해석하여 서열 결정을 행했다. 추가로 아미노산 서열을 해석하여, Kabat 등의 데이터베이스(Kabat 등, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242)를 참조하여 CDR 서열 및 FR 서열을 결정했다. 일부의 클론은 물성 및 안정성 향상을 위해, 중쇄 및 경쇄 FR을 각각 다른 인간 항체 중쇄 및 경쇄의 FR로 치환했다. 치환한 항체 서열의 VH 및 VL을 각각 PCR법에 따라 인간 Igγ1 정상 영역(일부의 클론에는, L234A, L235A 및 P331S의 아미노산 변이를 갖는 인간 Igγ1 정상 영역), 인간 Igκ 정상 영역과 연결하고, 포유류 세포 발현용 벡터인 GS 벡터(LonzaBiologics사)에 삽입하여 발현 벡터를 구축했다. 구체적으로는 항체의 중쇄 가변 영역 유전자의 5'측에 시그널 서열(ProteinEng., 1987, Vol. 1, p. 499-505)을 코딩하는 유전자를, 그리고 3'측에 인간 Igγ1 정상 영역을 코딩하는 유전자를 각각 연결하고, 이 중쇄 유전자를 GS 벡터 pEE6.4에 삽입했다. 또한 경쇄 가변 영역 유전자의 5'측에 시그널 서열(ProteinEng., 1987, Vol. 1, p. 499-505)을 코딩하는 유전자를, 그리고 3'측에 인간 κ쇄의 정상 영역 유전자를 각각 연결하고, 이 경쇄 유전자를 GS 벡터 pEE12.4에 삽입했다.
이들 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 포함하는 발현 벡터를 이용하여 일과성 발현 혹은 안정 발현주에 의해 정제 항체를 취득했다. 일과성 발현에 관해서 구체적으로는 MaxCyte STX(상품명)(MaxCyte사)를 이용하여 전술한 항체 중쇄 및 항체 경쇄의 양 발현 벡터를 CHOK1SV 세포(LonzaBiologics사)에 트랜스펙션하고, 약 7일간 배양했다. 일과성 발현 혹은 안정 발현주의 배양 상청을 MabSelect SuRe(GEHealthcare사), Vivapure(상품명) Q Maxi H(Sartorius사) 등을 이용하여 정제하여, 정제 항체를 얻었다.
복수의 정제 항체 중으로부터 인간 CD73 효소 활성을 저해하는 기능을 갖는 클론을 선발한 바, CDS-1이라고 명명한 항인간 CD73 항체가 가장 강하게 효소 활성을 저해함이 분명해졌다.
CDS-1의 중쇄의, Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 1에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 2에, 해당 항체의 경쇄의, Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 3에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다.
CDS-1의 VH는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 중쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 2의 아미노산 번호 31로부터 35, 50으로부터 66, 99로부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어진다. 당해 항체의 VL은, 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지고, 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은, 각각 서열 번호 4의 아미노산 번호 24로부터 34, 50으로부터 56, 89로부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어진다.
CDS-1의 중쇄의 C말단측에 인간 IL-7을 융합한 융합체를 취득하여, CDS-3이라고 명명했다. CDS-3의 중쇄의, Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지와 링커를 개재한 인간 IL-7을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 5 및 6에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 7에, 해당 융합체의 경쇄의, Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 3 및 8에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다. CDS-3의 중쇄는, 서열 번호 7의 아미노산 번호 464로부터 615까지의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 IL-7의 아미노산 서열을, 해당 서열 번호의 아미노산 번호 454로부터 463까지의 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 개재하여 CDS-1의 중쇄의 C말단측에 융합한 아미노산 서열로 이루어진다.
CDS-1의 중쇄의 C말단측에 인간 IL-7 개변체를 융합한 융합체를 취득하여, CDS-6이라고 명명했다. CDS-6의 중쇄의, Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지와 링커를 개재한 인간 IL-7 개변체를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 9 및 16에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 10에, 해당 융합체의 경쇄의, Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 3 및 8에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 4에 각각 나타낸다. CDS-6의 중쇄는, 서열 번호 10의 아미노산 번호 464로부터 615까지의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 IL-7 개변체의 아미노산 서열을, 해당 서열 번호의 아미노산 번호 454로부터 463까지의 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 개재하여 CDS-1의 중쇄의 C말단측에 융합한 아미노산 서열로 이루어진다.
CDS-1의 경쇄의 C말단측에 인간 IL-21을 융합한 융합체를 취득하여, CDS-7이라고 명명했다. CDS-7의 중쇄의, Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 11에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 2에, 해당 융합체의 경쇄의, Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지와 링커를 개재한 인간 IL-21을 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 12에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 13에 각각 나타낸다. CDS-7의 경쇄는, 서열 번호 13의 아미노산 번호 226으로부터 358까지의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 IL-21의 아미노산 서열을, 해당 서열 번호의 아미노산 번호 216으로부터 225까지의 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 개재하여 CDS-1의 경쇄의 C말단측에 융합한 아미노산 서열로 이루어진다.
CDS-1의 경쇄의 C말단측에 인간 IL-21 개변체를 융합한 융합체를 취득하여, CDS-8이라고 명명했다. CDS-8의 중쇄의, Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 11에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 2에, 해당 융합체의 경쇄의, Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지와 링커를 개재한 인간 IL-21 개변체를 코딩하는 염기 서열을 서열 번호 14에, 그것에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 서열 번호 15에 각각 나타낸다. CDS-8의 경쇄는, 서열 번호 15의 아미노산 번호 226으로부터 358까지의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 IL-21 개변체의 아미노산 서열을, 해당 서열 번호의 아미노산 번호 216으로부터 225까지의 아미노산 서열로 이루어지는 링커를 개재하여 CDS-1의 경쇄의 C말단측에 융합한 아미노산 서열로 이루어진다.
정제 CDS-3, CDS-6, CDS-7및 CDS-8은, 전술한 방법에 따라 취득되었다.
특허문헌 1의 Fig. 1C 및 Fig. 1D에 나타나는 정보를 기초로, MEDI9447이라고 명명된 항체를 발현하는 발현 벡터를 제작했다. 특허문헌 2의 서열 번호 21 및 서열 번호 22로 나타나는 정보를 기초로, 6E1이라고 명명된 항체를 발현하는 발현 벡터를 제작했다. 특허문헌 3의 서열 번호 133 및 서열 번호 102로 나타나는 정보를 기초로, CD73.4IgG2CS-IgG1.1f라고 명명된 항체를 발현하는 발현 벡터를 제작했다. 이들 발현 벡터에는, 정해진 방법에 따라 시그널 서열을 코딩하는 유전자를 삽입했다.
MEDI9447, CD73.4IgG2CS-IgG1.1f 및 6E1은, 정해진 방법에 따라 정제 항체를 취득하여, 비교 대조로서 이용했다.
정제한 CDS-1, CDS-7및 CDS-8의 아미노산 수식을 분석한 결과, 정제 항체의 대부분에 있어서, 중쇄 C말단의 리신의 결실이 생기고 있었다.
정제한 CDS-3의 아미노산 수식을 분석한 결과, 중쇄는 서열 번호 7에, 경쇄는 서열 번호 4에 상당하는 서열이었다.
정제한 CDS-6의 아미노산 수식을 분석한 결과, 경쇄는 서열 번호 4에 상당하는 서열이었다. 중쇄는 완전하게 당쇄 절단을 할 수 없었기 때문에 아미노산 수식의 종류는 특정되어 있지 않다.
[실시예 2: 항인간 CD73 항체의 인간 CD73 단백질에 대한 결합 활성의 평가]
실시예 1에서 취득한 CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 및 CDS-8의 인간 CD73에 대한 결합 활성을 평가하기 위해서, 인간 CD73 단백질을 이용하여 ELISA를 행했다. 맥시소프 384웰 플레이트 클리어(Thermo Fisher Scientific사)에 PBS(라이프 테크놀로지스사)로 4μg/mL의 농도로 희석한 인간 CD73 단백질(BPS Bioscience사, 71184)을 20μL/웰 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 고상화했다. 다음날 세정액(0.05% Tween-20 함유 트리스 완충 생리 식염수(TBS))으로 1회 웰을 세정하고, Blocking One(나카라이테스크사)을 100μL/웰 첨가하고 실온에서 30분 블로킹을 행했다. 다시 세정액으로 1회 세정하고, 실시예 1에서 제작한 정제 CDS-1, 정제 CDS-3, 정제 CDS-6, 정제 CDS-7 및 정제 CDS-8을 각각 20μL/웰 첨가했다. 이들 정제 항체의 희석은 PBS 및 Blocking One을 등량 혼합한 반응 완충액을 이용하여 행하여, 10μg/mL로부터 56pg/mL까지 12단계로 희석했다. 실온에서 1시간 반응시킨 후에 세정액으로 3회 세정을 행했다. Human IgG-heavy and light chain cross-adsorbed Antibody(Bethyl Laboratories사, A80-219P)를 4000배로 반응 완충액으로 희석한 것을 20μL/웰 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 세정액으로 3회 세정하고, TMB+substrate-chromogen(DAKO사, S1599)을 20μL/웰 첨가했다. 5분 후에 1M 황산(와코순약공업사)을 20μL/웰 첨가하여 반응을 정지했다. Infinite M200 PRO(TECAN사)로 흡광도 450nm 및 540nm를 측정하여, CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 및 CDS-8의 인간 CD73 단백질에 대한 EC50치를 산출했다. EC50치 산출에 임해서는, 세로축을 흡광도 450nm와 540nm의 측정치의 차, 가로축을 항체 농도치로 하여, 그래프 상에 그린 시그모이드 곡선의 형상으로부터, 항체 농도의 상승에 수반하여 측정치가 수렴치에 이르렀다고 판단할 수 있는 측정치를 100%, 항체 농도의 하강에 수반하여 측정치가 수렴치에 이르렀다고 판단할 수 있는 측정치를 0%로 설정했다. 본 어세이는 독립하여 시행을 행하여, EC50치를 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 산출했다(표 1).
Figure pct00001
그 결과, CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 및 CDS-8은 인간 CD73 단백질에 결합함이 분명해졌다.
[실시예 3: 항인간 CD73 항체의 인간 CD73 단백질에 대한 효소 저해 활성의 평가]
실시예 1에서 취득한 CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 및 CDS-8이, 인간 CD73이 가지는 효소 활성을 저해하는 것을 평가하기 위해, 인간 CD73 단백질을 이용한 효소 어세이를 실시했다. 본 실시예에서는, 비교 대조로서 MEDI9447, CD73.4IgG2CS-IgG1.1f 및 6E1을 이용했다. 5mM 염화 마그네슘 함유 25mM 트리스 완충 생리 식염수를 염산으로 pH 7.5로 조제하여, 어세이 버퍼로 했다. 96웰 어세이 플레이트 클리어(Corning사)에 어세이 버퍼로 종농도 15ng/mL가 되도록 조제한 인간 CD73 단백질(R＆Dsystems사, 5795-EN)과, 어세이 버퍼로 희석한 정제 CDS-1, 정제 CDS-3, 정제 CDS-6, 정제 CDS-7, 정제 CDS-8, 정제 MEDI9447, 정제 CD73.4IgG2CS-IgG1.1f 및 정제 6E1을 각각 20μL/웰 첨가하고 실온에서 30분 반응시켰다. 이들 정제 항체의 희석은 어세이 버퍼를 이용하여 행하여, 종농도 20μg/mL로부터 0.339ng/mL가 되도록 11단계로 희석했다. 어세이 버퍼로 희석한 AMP(Sigma-Aldrich사, A1752-1G)를 종농도 30μM이 되도록 20μL/웰 첨가하고 실온에서 45분 반응시켰다. 아세토나이트릴을 60μL/웰 첨가함으로써 반응을 정지하고, LC/MS(LC: 시마즈제작소사 SIL-HTc 혹은 Waters사 Acquity UPLC I-Class, 컬럼: Agilent Technologies사, ZORBAXSB-Aq 1.8μm 2.1×30mm, MS: ABSciex사 API4000)에 의해 아데노신 농도를 측정했다. 측정한 아데노신 농도를 바탕으로 CDS-1 등의 인간 CD73 효소 활성에 대한 저해를, 산출한 EC50치에 기초하여 평가했다. EC50치 산출에 임해서는, 세로축을 측정한 아데노신 농도치, 가로축을 항체 농도치로 하여, 그래프 상에 그린 시그모이드 곡선의 형상으로부터, 항체 농도의 상승에 수반하여 아데노신 농도치가 수렴치에 이르렀다고 판단할 수 있는 아데노신 농도치를 0%, 항체 농도의 하강에 수반하여 아데노신 농도치가 수렴치에 이르렀다고 판단할 수 있는 아데노신 농도치를 100%로 설정했다. 본 어세이는 독립하여 시행을 행하고, EC50치를 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 산출했다(표 2). 비특허문헌 1에서 보고되어 있었던 대로, MEDI9447은 벨셰이프형의 저해를 나타낸다고 하는 특징을 갖고 있었다(도 1). 또한, CDS-1의 항체 농도의 상승에 수반하는 아데노신 농도치의 수렴치와 비교하여 CD73.4IgG2CS-IgG1.1f의 수렴치는 높은 값을 나타냈다.
Figure pct00002
그 결과, CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 및 CDS-8은 인간 CD73 단백질의 효소 활성을 저해함이 분명해졌다.
[실시예 4: 항인간 CD73 항체의 인간 CD73 발현 세포에 있어서의 효소 저해 활성의 평가]
실시예 1에서 취득한 CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 및 CDS-8의 인간 CD73이 가지는 효소 활성을 저해하는 것을 평가하기 위해, 인간 CD73을 내재적으로 발현하는 암 세포주 NCI-H1373(ATCC: CRL-5866)을 이용한 효소 어세이를 실시했다. NCI-H1373 세포를 PBS(라이프 테크놀로지스사)로 현탁하고, 최종적인 세포 밀도가 4×104cells/웰이 되도록 96웰 V저 플레이트(스미토모 베이클라이트사)에 30μL/웰로 파종했다. 그 후 곧바로 정제 CDS-1, 정제 CDS-3, 정제 CDS-6, 정제 CDS-7 및 정제 CDS-8을 각각 10μL/웰 첨가했다. 이들 정제 항체의 희석은 PBS를 이용하여 행하여, 종농도 50.0μg/mL로부터 0.847ng/mL가 되도록 11단계로 희석했다. 실온에서 30분 반응시킨 후에, AMP(Sigma-Aldrich사)를 종농도 180μM가 되도록 10μL/웰 첨가했다. 실온에서 30분 반응시킨 후에, 플레이트를 4℃, 340×g로 2분간 원심했다. 원심한 플레이트로부터 새롭게 준비한 96웰 V저 플레이트(스미토모 베이클라이트사)에 상청을 15μL/웰 옮기고, 아세토나이트릴을 15μL/웰 첨가했다. LC/MS(실시예 3에 기재)에 의해 아데노신 농도를 측정하여, CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 및 CDS-8의 인간 CD73 효소 활성에 대한 저해를, 산출한 EC50치에 기초하여 평가했다. 본 어세이는 독립하여 시행을 행하고, 실시예 3에 기재된 산출 방법에 의해 EC50치를 산출했다(표 3).
Figure pct00003
그 결과, CDS-1, CDS-3, CDS-6, CDS-7 및 CDS-8은 NCI-H1373 세포에 있어서의 인간 CD73의 효소 활성을 저해함이 분명해졌다.
[실시예 5: 항인간 CD73 항체의 AMP 의존적으로 억제된 인간 T 세포 기능 회복의 평가]
실시예 1에서 취득한 CDS-1에 의한 AMP 의존적으로 억제된 인간 T 세포 기능 회복을 평가하기 위해, 인간 CD73을 발현하는 인간 T 세포를 이용한 어세이를 실시했다. 본 어세이는, 인간 T 세포 기능의 회복을 지표로 하여, AMP에 의해 억제되고 있던 면역계 세포의 기능을 회복시킴으로써 항종양 면역을 활성화시키는 항체의 평가가 가능하다. 본 실시예에서는, 비교 대조로서 MEDI9447, 6E1 및 CD73.4IgG2CS-IgG1.1f를 이용했다. 인간 말초혈 단핵 세포(AllCells사, PB003F)로부터 Pan T Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec사, 130-096-535)를 이용하여 인간 T 세포를 단리하고, TexMACSTM 배지(Miltenyi Biotec사, 130-097-196)로 현탁 후, 최종적인 세포 밀도가 1×105cells/웰이 되도록 96웰 평저 플레이트(AGC TECHNO GLASS사)에 50μL/웰로 파종했다. 그 후 곧바로 정제 CDS-1, 정제 MEDI9447, 정제 6E1 및 정제 CD73.4IgG2CS-IgG1.1f를 각각 25μL/웰 첨가했다. 이들 정제 항체의 희석은 TexMACSTM 배지를 이용해 행하여, 종농도 15μg/mL로부터 0.05ng/mL가 되도록 12단계로 희석했다. 추가로 AMP(Sigma-Aldrich사)를 종농도 250μM이 되도록 50μL/웰 첨가했다. 그 후 곧바로 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Thermo Fisher Scientific사, 11131D)을 종농도 1×105dynabeads/웰이 되도록 50μL/웰 첨가했다. 그리고 각 웰의 반응 용액이 200μL가 되도록 TexMACSTM 배지를 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 3일간 배양했다. 3일 후의 배양 상청을 100μL 회수하여, AlphaLISA(상품명) IFNγ Immunoassay kit(PerkinElmer사, AL217C)의 프로토콜에 기초하여, 상청 중의 인터페론γ(IFNγ) 농도를 측정했다. 또한 인간 T 세포의 증식을 해석하기 위해, CellTiter-Blue(상품명) Cell Viability Assay(Promega사, G8081)의 프로토콜에 기초하여, 상청 100μL를 제외한 전술한 플레이트에 CellTiter-Blue Reagent를 20μL/웰 첨가했다. EnVisionTM(PerkinElmer사)을 이용하여 4시간 후에 각 웰의 형광을 측정했다(여기 파장 560nm/형광 파장 590nm). AMP 의존적으로 억제된 인간 T 세포의 기능을 CDS-1이 회복시키는 것을, IFNγ의 농도 및 인간 T 세포의 증식을 지표로 산출한 EC50치에 기초하여 평가했다. EC50치 산출에 임해서는, 세로축을 측정치로부터 산출한 IFNγ 농도치 혹은 형광치, 가로축을 항체 농도치로 하여, 그래프 상에 그린 시그모이드 곡선의 형상으로부터, 항체 농도의 상승에 수반하여 IFNγ 농도치 혹은 형광치가 수렴치에 이르렀다고 판단할 수 있는 측정치를 100%, 항체 농도의 하강에 수반하여 IFNγ 농도치 혹은 형광치가 수렴치에 이르렀다고 판단할 수 있는 측정치를 0%로 설정했다. IFNγ 및 인간 T 세포의 증식을 지표로 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 EC50치를 산출했다(표 4). 비교 대상 중, CDS-1의 항체 농도의 상승에 수반하는 IFNγ 농도치 및 인간 T 세포의 증식치의 수렴치에 대해 CD73.4IgG2CS-IgG1.1f의 수렴치가 낮았기 때문에, 또한, MEDI9447은 시그모이드 곡선을 그리지 않았기 때문에, CD73.4IgG2CS-IgG1.1f와 MEDI9447의 CDS-1과 비교 가능한 EC50치는 산출할 수 없었다(도 2 및 도 3).
Figure pct00004
그 결과, CDS-1은 비교 대조로서 이용한 MEDI9447, 6E1 및 CD73.4IgG2CS-IgG1.1f의 어느 항체보다도, AMP 의존적으로 억제된 인간 T 세포 기능을 강력하게 회복시킴이 나타나, 항종양 면역을 활성화할 수 있음이 분명해졌다.
[실시예 6: CDS-3 및 CDS-6의 IL-7 생리 활성의 평가]
실시예 1에서 취득한 CDS-3 및 CDS-6에 의한 IL-7 생리 활성을 평가하기 위해, 인간 IL-7 첨가에 의해 용량 의존적인 세포 증식 활성을 나타내는 2E8 세포주(ATCC: TIB-239)를 이용한 어세이를 실시했다. 본 실시예에서는, Human IgG1 Isotype Control(Enzo Life Sciences사, ALX-804-133-C100)를 네거티브 컨트롤로서 이용했다. 배지는, L-글루타민 용액(Sigma-Aldrich사), 2-머캅토에탄올(Thermo Fisher Scientific사) 및 비동화한 20% 소 태아 혈청(HyClone사)을 함유한 Iscove's Modified Dulbecco's Medium(Sigma-Aldrich사, I3390)을 이용했다. 정제 CDS-3, 정제 CDS-6 및 리컴비넌트 인간 IL-7(Peprotech사, 200-07)을 384웰 평저 플레이트(Thermo Fisher Scientific사)에 각각 10μL/웰 첨가했다. 정제 CDS-3, 정제 CDS-6 및 리컴비넌트 인간 IL-7의 희석은 배지를 이용하여 행하고, 정제 CDS-3 및 정제 CDS-6의 분자량은 180000으로 하여, 종농도 100nM로부터 0.001nM이 되도록 11단계로 희석했다. 2E8 세포를 배지로 현탁하고, 최종적인 세포 밀도가 2×104cells/웰이 되도록 40μL/웰로 파종했다. 그 후 곧바로 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 3일간 배양했다. 3일 후의 세포 증식을 해석하기 위해, CellTiter-Glo(상품명) Luminescent Cell Viability Assay(Promega사, G7573)의 프로토콜에 기초하여, 전술한 플레이트에 CellTiter-Glo Reagent를 50μL/웰 첨가한 후, ARVO-HTS(PerkinElmer사)를 이용하여 각 웰의 발광 강도를 측정했다. 측정한 발광 강도를 바탕으로 정제 CDS-3, 정제 CDS-6 및 리컴비넌트 인간 IL-7의 세포 증식 활성을, 산출한 EC50치에 기초하여 평가했다. EC50치 산출에 임해서는, 세로축을 측정한 발광 강도, 가로축을 약제 농도치로 하고, 100nM 리컴비넌트 인간 IL-7의 발광 강도치를 100%, 네거티브 컨트롤의 발광 강도치를 0%로 설정하여 시그모이드 곡선을 묘화했다. 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 산출한 정제 CDS-3, 정제 CDS-6 및 리컴비넌트 인간 IL-7의 EC50치는 0.050nM, 1.8nM 및 0.051nM이었다.
그 결과, CDS-3 및 CDS-6은 IL-7 생리 활성을 가짐이 분명해졌다. 또한, CDS-3과 비교하여 CDS-6의 IL-7 생리 활성이 저하되고 있음이 밝혀졌다.
[실시예 7: CDS-7 및 CDS-8의 IL-21 생리 활성의 평가]
실시예 1에서 취득한 CDS-7 및 CDS-8의 IL-21 생리 활성을 평가하기 위해, 인간 IL-21 농도 의존적으로 STAT3 인산화가 유도되는 인간 세포주 Ramos(ATCC: CRL-1596)를 이용한 어세이를 실시했다. RPMI 배지(Sigma-Aldrich사, R8758)를 이용하여 Ramos 세포를 디시에 파종하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내에서 16시간 배양했다. Ramos 세포를 회수 후, 전술한 배지로 현탁하고, 최종적인 세포 밀도가 2×105cells/웰이 되도록 96웰 플레이트(닛폰제네틱스사, 35800)에 45μL/웰로 파종하고, 정제 CDS-7, 정제 CDS-8 또는 리컴비넌트 인간 IL-21(Peprotech사, 200-21)을 각각 5μL/웰 첨가하여 반응시켰다. 정제 CDS-7, 정제 CDS-8 및 리컴비넌트 인간 IL-21의 희석은 PBS(라이프 테크놀로지스사)를 이용하여 행하고, 정제 CDS-7 및 정제 CDS-8의 분자량은 180000으로 하여, 종농도 1200nM로부터 0.02nM이 되도록 11단계, 또는 400nM로부터 0.02nM이 되도록 10단계로 희석했다. 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 전량을, 미리 Fix Buffer I(BD Biosciences사, 557870)을 200μL/웰 첨가해 둔 96웰 환저 플레이트(Corning사, 351177)로 옮기고, 37℃에서 10분간 반응시켜 세포를 고정했다. 염색 버퍼로 세정 후, Perm Buffer III(BD Biosciences사, 558050)을 200μL/웰 첨가하고, 얼음 상에서 30분간 반응시켜 세포를 투과 처리했다. 염색 버퍼로서는, Stain Buffer(FBS)(BD Biosciences사, 554656)를 이용했다. 전술한 염색 버퍼로 세정하고 현탁한 후, PE Mouse Anti-Stat3(pY705)(BD Biosciences사, 562072)을 이용하여 인산화 STAT3을 염색한 후, FACSArrayTM(BD Biosciences사)를 이용하여 세포의 형광 강도를 측정했다. 형광 강도로서는 Geometric MFI치를 이용했다. 측정한 형광 강도를 바탕으로 정제 CDS-7, 정제 CDS-8 및 리컴비넌트 인간 IL-21의 EC50치를 산출하여, STAT3 인산화 유도 활성을 평가했다. EC50치 산출에 임해서는, 세로축을 측정한 형광 강도, 가로축을 약제 농도치로 하여, 그래프 상에 그린 시그모이드 곡선의 형상으로부터, 약제 농도의 상승에 수반하여 수렴치에 이르렀다고 판단할 수 있는 형광 강도치를 100%, 약제 농도의 하강에 수반하여 수렴치에 이르렀다고 판단할 수 있는 형광 강도치를 0%로 설정했다. 4 파라미터 로지스틱 곡선 회귀에 의해 산출한 정제 CDS-7, 정제 CDS-8 및 리컴비넌트 인간 IL-21의 EC50치는 1.3nM, 28.3nM 및 8.0nM이었다.
그 결과, CDS-7 및 CDS-8은 IL-21 생리 활성을 가짐이 분명해졌다. 또한, CDS-7과 비교하여 CDS-8의 IL-21 생리 활성이 저하되고 있음이 밝혀졌다.
본 발명의 항인간 CD73 항체 및 그의 융합체는, 암의 예방 또는 치료에 유용하다라고 기대된다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 발현 벡터, 형질 전환된 숙주 세포, 및 항체를 생산하는 방법은, 상기 항인간 CD73 항체 및 그의 융합체를 산생하는 데 유용하다.
이하의 서열목록의 숫자 표제＜223＞에는, 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 구체적으로는, 서열목록의 서열 번호 1 및 3으로 나타나는 염기 서열은, 각각 CDS-1의 중쇄 및 경쇄의 Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지를 코딩하는 염기 서열이며, 서열목록의 서열 번호 2 및 4로 나타나는 아미노산 서열은, 각각 서열 번호 1 및 3에 의해 코딩되는 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열목록의 서열 번호 5 또는 6으로 나타나는 염기 서열은, CDS-3의 중쇄의 Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지와 링커를 개재한 인간 IL-7을 코딩하는 염기 서열이며, 서열목록의 서열 번호 7로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 5 또는 6에 의해 코딩되는 중쇄의 아미노산 서열이다. 서열목록의 서열 번호 8로 나타나는 염기 서열은, CDS-3의 경쇄의 Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지를 코딩하는 염기 서열이다. 서열목록의 서열 번호 9 또는 16으로 나타나는 염기 서열은, CDS-6의 중쇄의 Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지와 링커를 개재한 인간 IL-7 개변체를 코딩하는 염기 서열이며, 서열목록의 서열 번호 10으로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 9 또는 16에 의해 코딩되는 중쇄의 아미노산 서열이다. 서열목록의 서열 번호 11로 나타나는 염기 서열은, CDS-7의 중쇄의 Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지를 코딩하는 염기 서열이다. 서열목록의 서열 번호 12로 나타나는 염기 서열은, CDS-7의 경쇄의 Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지와 링커를 개재한 인간 IL-21을 코딩하는 염기 서열이며, 서열목록의 서열 번호 13으로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 12에 의해 코딩되는 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열목록의 서열 번호 14로 나타나는 염기 서열은, CDS-8의 경쇄의 Kabat 넘버링에 따르는 가변 영역의 잔기 번호 1로부터 정상 영역의 C말단까지와 링커를 개재한 인간 IL-21 개변체를 코딩하는 염기 서열이며, 서열목록의 서열 번호 15로 나타나는 아미노산 서열은, 서열 번호 14에 의해 코딩되는 경쇄의 아미노산 서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. <120> anti-human CD73 antibody <130> A17013A00 <150> JP2016-241503 <151> 2016-12-13 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain of anti-human CD73 antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(1362) <400> 1 gag gtg cag ttg gtc gaa agt ggc gga gga ctc gta cag cca ggt ggg 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tca ctg cgt ctg tcc tgt gct gca tct ggg ttt acc ttc gat gac tat 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 gcc atg cac tgg gtt cga caa gct cct ggc aaa ggc ctt gaa tgg gtg 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 agt ggg atc aac tgg aat agc gac aac atc gac tat gcc gac tct gtg 192 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Asp Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aaa ggc cgc ttt acc att agc cgg gat aac tcc aag aac act ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg cag atg aat agc ctc aga gca gag gat aca gcc gtc tac tac tgc 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc aag gat agg agg aag tac tcc aat tct ccc ggt gct ttc gac ata 336 Ala Lys Asp Arg Arg Lys Tyr Ser Asn Ser Pro Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 tgg ggt cag gga aca ctg gtt act gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc 384 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 cca tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc 432 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 aca gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg 480 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 acg gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc 528 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 ccg gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg 576 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 acc gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg 624 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 aat cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa 672 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 tct tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc 720 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 225 230 235 240 gct ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc 768 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 ctc atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg 816 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 agc cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg 864 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 gag gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc 912 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg 960 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 aat ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc 1008 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 agc atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca 1056 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc cgg gat gag ctg acc aag aac cag 1104 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc 1152 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 gtg gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg 1200 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc 1248 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 acc gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc 1296 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 gtg atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc 1344 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 ctg tct ccg ggt aaa tga 1362 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 2 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Asp Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Arg Lys Tyr Ser Asn Ser Pro Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 225 230 235 240 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 Leu Ser Pro Gly Lys 450 <210> 3 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain of anti-human CD73 antibody <220> <221> CDS <222> (1)..(648) <400> 3 gac ata cag atg act cag tca ccc agt tcc ctt tct gcc agt gtg gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gat agg gtc act atc acc tgt aga gcc agc cag atc att ggc cca tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp 20 25 30 ttg gct tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gca ccc aag ctg ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat cga gct tcc tct ctg gaa tcc ggt gtt cct tcc cgc ttt agc ggt 192 Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 tca ggg agt gga acc gac ttc aca ctg acc att agc tct ctg caa cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gag gat ttc gcc acg tac tac tgc cag cag tac aac agc tat tct ccc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 tgg aca ttt ggc caa ggc aca aag gtg gag atc aag cgg act gtg gct 336 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag ttg aaa tct 384 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat ccc aga gag 432 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc 480 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc tac agc ctc 528 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa cac aaa gtc 576 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc gtc aca aag 624 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 agc ttc aac agg gga gag tgt tag 648 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 4 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 5 <211> 1848 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain of fused form of anti-human CD73 antibody and IL-7 <400> 5 gaagtacagt tggtcgaaag cggaggaggg ctggttcagc ctggcggctc actcagactg 60 tcatgcgctg cctctgggtt tacattcgac gattatgcca tgcattgggt acgacaggca 120 ccaggcaaag ggctggagtg ggtttctggg attaactgga atagcgataa tatcgactat 180 gccgactctg taaaggggcg ctttactatc agtcgggaca atagtaagaa tacgctctat 240 ctgcagatga atagcctgag agcagaagat accgctgtgt actactgtgc caaagaccgg 300 cgtaagtaca gtaactctcc tggtgccttt gacatctggg gacagggcac tcttgttacc 360 gtgagcagcg catctaccaa aggtccctca gtctttcccc tcgctcctag ttctaagtcc 420 acatcaggtg gaactgccgc tttgggttgc ctggtaaagg actactttcc cgagcctgtt 480 acagtgagct ggaactccgg agctctgaca tccggtgtgc acacatttcc tgccgttctt 540 cagtcctcag ggctgtattc cttgtcctca gtggttacag tgcccagcag tagtctgggg 600 acacagacat acatttgcaa tgtgaatcac aagccaagta acactaaggt cgataagaag 660 gtcgagccca aaagttgcga taagacccat acttgtccac cttgtcctgc tcctgaggcc 720 gcaggaggcc cttctgtgtt cctgtttcca cccaaaccca aggacactct gatgattagc 780 cggacgccag aggtgacctg tgttgtggtt gatgtctctc acgaggaccc agaagtgaaa 840 ttcaactggt acgtcgacgg cgtggaagtg cacaatgcca aaaccaagcc acgcgaggag 900 cagtacaaca gcacctatcg ggtggtgagc gtgttgactg tgctgcatca agattggctg 960 aatggaaagg agtacaagtg taaggtgtct aacaaggcac tgcccgcaag catcgaaaag 1020 accatcagta aggctaaggg ccagcccagg gaaccacagg tctacaccct gccaccttcc 1080 cgtgacgagt tgaccaagaa ccaggtgtca cttacgtgct tggtgaaagg cttctatccc 1140 tccgacattg ccgtagaatg ggaaagcaat gggcaacccg agaataacta caaaacaact 1200 ccacccgtcc ttgattctga cggttccttc ttcctctatt ccaaactgac tgtcgataaa 1260 tctcgatggc aacagggcaa tgtcttttct tgtagtgtga tgcatgaagc attgcataac 1320 cactacaccc agaagtccct gtctttgtcc cctgggaaag gaggcggtgg atccggtggt 1380 ggcggctcag attgcgacat agaaggcaag gacggcaaac agtatgagtc cgtcctgatg 1440 gtgtccattg atcagctgct ggattctatg aaggaaatcg gaagcaactg cctgaacaat 1500 gagtttaact tcttcaaacg acacatctgt gatgccaaca aagagggcat gtttctcttc 1560 agagccgcta ggaaactgag gcagtttctc aagatgaact ccactggcga cttcgatctg 1620 caccttctga aggtatcaga ggggaccaca atactgctga actgcaccgg ccaagtcaag 1680 ggtcgcaagc ccgctgccct tggagaagct caacccacca aaagcctgga agagaacaaa 1740 tccctcaagg agcagaagaa actcaacgac ctgtgctttc tcaagaggct ccttcaggag 1800 attaagacct gttggaataa gatccttatg gggacaaaag agcactga 1848 <210> 6 <211> 1848 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain of fused form of anti-human CD73 antibody and IL-7 <220> <221> CDS <222> (1)..(1848) <400> 6 gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 tct ctg aga ctg tct tgt gcc gcc tcc ggc ttc acc ttc gac gac tac 96 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 gct atg cac tgg gtg cga cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg 144 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 tcc ggc atc aac tgg aac tcc gac aac atc gac tac gcc gac tcc gtg 192 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Ser Asp Asn Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 aag ggc cgg ttc acc atc tcc cgg gac aac tcc aag aac acc ctg tac 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg cag atg aac tcc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc aag gac cgg cgg aag tac tcc aac tct cct ggc gcc ttc gac atc 336 Ala Lys Asp Arg Arg Lys Tyr Ser Asn Ser Pro Gly Ala Phe Asp Ile 100 105 110 tgg ggc cag ggc aca ctc gtg acc gtg tcc tct gct tcc acc aag ggc 384 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 ccc tcc gtg ttt cct ctg gcc cct tcc agc aag tcc acc tct ggc gga 432 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 aca gcc gct ctg ggc tgc ctc gtg aag gac tac ttc ccc gag ccc gtg 480 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 aca gtg tct tgg aac tct ggc gcc ctg act tct ggc gtg cac acc ttc 528 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 cct gct gtg ctg cag tct agc ggc ctg tac tcc ctg tcc tcc gtc gtg 576 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu 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Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 aca gtg gac aag tcc cgg tgg cag cag ggc aac gtg ttc tcc tgc agc 1296 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac acc cag aag tcc ctg tcc 1344 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 ctg tct ccc gga aaa ggc ggc gga gga tcc ggc gga ggc gga tct gat 1392 Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp 450 455 460 tgt gac atc gag ggc aag gac ggc aag cag tac gag agc gtg ctg atg 1440 Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met 465 470 475 480 gtg tcc atc gac cag ctg ctg gac agc atg aag gaa atc ggc tcc aac 1488 Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn 485 490 495 tgc ctg aac aac gag ttc aac ttc ttc aag cgg cac atc tgc gac gcc 1536 Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala 500 505 510 aac aaa gaa ggc atg ttc ctg ttt aga gcc gcc aga 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agggacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgacctgtc tcgtgaaagg cttctacccc 1140 tccgatatcg ccgtggaatg ggagagcaac ggccagcccg agaacaacta taagaccacc 1200 ccccctgtgc tggactccga cggctcattc tttctgtact ccaagctgac agtggacaag 1260 tcccggtggc agcagggcaa cgtgttctcc tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac 1320 cactacaccc agaagtccct gtccctgagc cccggcaagt ga 1362 <210> 12 <211> 1077 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain of fused form of anti-human CD73 antibody and IL-21 <220> <221> CDS <222> (1)..(1077) <400> 12 gat atc cag atg aca cag tct cct agt tcc ttg tcc gct agc gtt ggt 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtg acc ata acc tgt cga gct agc cag att att ggg cca tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp 20 25 30 ctt gcc tgg tat cag cag aag cct ggt aaa gca ccc aag ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat aga gcc agc tct ctg gaa tcc ggg gtg cca tca cgg ttc tct gga 192 Tyr 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528 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 tca tct aca ctg acc ctc tca aaa gca gac tac gaa aag cac aaa gtg 576 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 tat gcc tgt gag gtc aca cac caa ggc ctc agc agt ccc gtc acc aag 624 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 agc ttc aac aga ggg gag tgt ggc ggt gga gga tcc gga ggc ggt ggc 672 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 agt cag gga cag gat cgc cac atg atc cgt atg agg caa ctg att gat 720 Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp 225 230 235 240 atc gtt gac cag ctg aag aac tac gtg aac gat ctt gtc ccc gag ttt 768 Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe 245 250 255 ctt cct gct cct gag gac gtg gag aca aac tgt gaa tgg agc gca ttt 816 Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe 260 265 270 tcc tgc ttc cag aaa gca cag ctg aaa tct gct aat acg ggc aat aac 864 Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn 275 280 285 gag cgg ata atc aac gtg tca atc aag aaa ctg aaa cgc aaa cct cca 912 Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro 290 295 300 tca acg aat gca ggg agg cga cag aag cat agg ctg aca tgt ccc tct 960 Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser 305 310 315 320 tgc gac tcc tat gag aag aag cct ccc aag gag ttc ttg gaa cga ttc 1008 Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe 325 330 335 aag agt ttg ctg cag aag atg att cac cag cat ctg agt agc cgg act 1056 Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr 340 345 350 cat gga agc gaa gat agc tga 1077 His Gly Ser Glu Asp Ser 355 <210> 13 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp 225 230 235 240 Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe 245 250 255 Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe 260 265 270 Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn 275 280 285 Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Arg Lys Pro Pro 290 295 300 Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser 305 310 315 320 Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe 325 330 335 Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr 340 345 350 His Gly Ser Glu Asp Ser 355 <210> 14 <211> 1077 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L-chain of fused form of anti-human CD73 antibody and IL-21 mutant <220> <221> CDS <222> (1)..(1077) <400> 14 gat atc cag atg aca cag tct cct agt tcc ttg tcc gct agc gtt ggt 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 gac cgt gtg acc ata acc tgt cga gct agc cag att att ggg cca tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp 20 25 30 ctt gcc tgg tat cag cag aag cct ggt aaa gca ccc aag ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 tat aga gcc agc tct ctg gaa tcc ggg gtg cca tca cgg ttc tct gga 192 Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 tct ggc tct ggc acc gac ttt acc ctg aca att tcc tcc ctt caa ccc 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 gag gac ttt gcc aca tac tac tgc cag cag tac aac tcc tac agt ccc 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 tgg acc ttt ggc caa ggc acc aaa gtg gag atc aag cgc acc gta gct 336 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 gcc cct tcc gtg ttc atc ttt cca cca agt gat gaa cag ctc aag tca 384 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 ggg act gcc tct gtt gta tgc ctg ctc aat aac ttc tat ccc aga gaa 432 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 gcc aag gtc caa tgg aag gtg gac aat gct ctg cag tct ggg aat agc 480 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 cag gaa tcc gtt act gag caa gat tcc aaa gac tcc act tac tcc ttg 528 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 tca tct aca ctg acc ctc tca aaa gca gac tac gaa aag cac aaa gtg 576 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 tat gcc tgt gag gtc aca cac caa ggc ctc agc agt ccc gtc acc aag 624 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 agc ttc aac aga ggg gag tgt ggc ggt gga gga tcc gga ggc ggt ggc 672 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 agt cag gga cag gat cgc cac atg atc cgt atg agg caa ctg att gat 720 Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp 225 230 235 240 atc gtt gac cag ctg aag aac tac gtg aac gat ctt gtc ccc gag ttt 768 Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe 245 250 255 ctt cct gct cct gag gac gtg gag aca aac tgt gaa tgg agc gca ttt 816 Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe 260 265 270 tcc tgc ttc cag aaa gca cag ctg aaa tct gct aat acg ggc aat aac 864 Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn 275 280 285 gag cgg ata atc aac gtg tca atc aag aaa ctg aaa gcc aaa cct cca 912 Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Ala Lys Pro Pro 290 295 300 tca acg aat gca ggg agg cga cag aag cat agg ctg aca tgt ccc tct 960 Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser 305 310 315 320 tgc gac tcc tat gag aag aag cct ccc aag gag ttc ttg gaa cga ttc 1008 Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe 325 330 335 aag agt ttg ctg cag aag atg att cac cag cat ctg agt agc cgg act 1056 Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr 340 345 350 cat gga agc gaa gat agc tga 1077 His Gly Ser Glu Asp Ser 355 <210> 15 <211> 358 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Pro Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gln Gly Gln Asp Arg His Met Ile Arg Met Arg Gln Leu Ile Asp 225 230 235 240 Ile Val Asp Gln Leu Lys Asn Tyr Val Asn Asp Leu Val Pro Glu Phe 245 250 255 Leu Pro Ala Pro Glu Asp Val Glu Thr Asn Cys Glu Trp Ser Ala Phe 260 265 270 Ser Cys Phe Gln Lys Ala Gln Leu Lys Ser Ala Asn Thr Gly Asn Asn 275 280 285 Glu Arg Ile Ile Asn Val Ser Ile Lys Lys Leu Lys Ala Lys Pro Pro 290 295 300 Ser Thr Asn Ala Gly Arg Arg Gln Lys His Arg Leu Thr Cys Pro Ser 305 310 315 320 Cys Asp Ser Tyr Glu Lys Lys Pro Pro Lys Glu Phe Leu Glu Arg Phe 325 330 335 Lys Ser Leu Leu Gln Lys Met Ile His Gln His Leu Ser Ser Arg Thr 340 345 350 His Gly Ser Glu Asp Ser 355 <210> 16 <211> 1848 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H-chain of fused form of anti-human CD73 antibody and IL-7 mutant <400> 16 gaagtacagt tggtcgaaag cggaggaggg ctggttcagc ctggcggctc actcagactg 60 tcatgcgctg cctctgggtt tacattcgac gattatgcca tgcattgggt acgacaggca 120 ccaggcaaag ggctggagtg ggtttctggg attaactgga atagcgataa tatcgactat 180 gccgactctg taaaggggcg ctttactatc agtcgggaca atagtaagaa tacgctctat 240 ctgcagatga atagcctgag agcagaagat accgctgtgt actactgtgc caaagaccgg 300 cgtaagtaca gtaactctcc tggtgccttt gacatctggg gacagggcac tcttgttacc 360 gtgagcagcg catctaccaa aggtccctca gtctttcccc tcgctcctag ttctaagtcc 420 acatcaggtg gaactgccgc tttgggttgc ctggtaaagg actactttcc cgagcctgtt 480 acagtgagct ggaactccgg agctctgaca tccggtgtgc acacatttcc tgccgttctt 540 cagtcctcag ggctgtattc cttgtcctca gtggttacag tgcccagcag tagtctgggg 600 acacagacat acatttgcaa tgtgaatcac aagccaagta acactaaggt cgataagaag 660 gtcgagccca aaagttgcga taagacccat acttgtccac cttgtcctgc tcctgaggcc 720 gcaggaggcc cttctgtgtt cctgtttcca cccaaaccca aggacactct gatgattagc 780 cggacgccag aggtgacctg tgttgtggtt gatgtctctc acgaggaccc agaagtgaaa 840 ttcaactggt acgtcgacgg cgtggaagtg cacaatgcca aaaccaagcc acgcgaggag 900 cagtacaaca gcacctatcg ggtggtgagc gtgttgactg tgctgcatca agattggctg 960 aatggaaagg agtacaagtg taaggtgtct aacaaggcac tgcccgcaag catcgaaaag 1020 accatcagta aggctaaggg ccagcccagg gaaccacagg tctacaccct gccaccttcc 1080 cgtgacgagt tgaccaagaa ccaggtgtca cttacgtgct tggtgaaagg cttctatccc 1140 tccgacattg ccgtagaatg ggaaagcaat gggcaacccg agaataacta caaaacaact 1200 ccacccgtcc ttgattctga cggttccttc ttcctctatt ccaaactgac tgtcgataaa 1260 tctcgatggc aacagggcaa tgtcttttct tgtagtgtga tgcatgaagc attgcataac 1320 cactacaccc agaagtccct gtctttgtcc cctgggaaag gaggcggtgg atccggtggt 1380 ggcggctcag attgcgacat agaaggcaag gacggcaaac agtatgagtc cgtcctgatg 1440 gtgtccattg atcagctgct ggattctatg aaggaaatcg gaagcaactg cctgaacaat 1500 gagtttaact tcttcaaacg acacatctgt gatgccaaca aagagggcat gtttctcttc 1560 agagccgcta ggaaactgag gcagtttctc aagatgaact ccactggcga cttcgatctg 1620 caccttctgg ccgtatcaga ggggaccaca atactgctga actgcaccgg ccaagtcaag 1680 ggtcgcaagc ccgctgccct tggagaagct caacccacca aaagcctgga agagaacaaa 1740 tccctcaagg agcagaagaa actcaacgac ctgtgctttc tcaagaggct ccttcaggag 1800 attgccacct gttggaataa gatccttatg gggacaaaag agcactga 1848

Claims (31)

  1. 서열 번호 2의 아미노산 번호 31로부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50으로부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99로부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24로부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 50으로부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 89로부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1로부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    하기 (a)∼(b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항인간 CD73 항체:
    (a) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체; 및,
    (b) (a)에 기재된 항인간 CD73 항체의 번역 후 수식에 의해 생긴 항체인 항인간 CD73 항체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    하기 (a)∼(b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항인간 CD73 항체:
    (a) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체; 및,
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 452까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 항인간 CD73 항체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 CD73 항체.
  6. 제 4 항에 있어서,
    서열 번호 2의 아미노산 번호 1로부터 452까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는, 항인간 CD73 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트와 다른 펩티드나 단백질이 융합한 융합체.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 항인간 CD73 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트와 수식제가 결합한 수식체.
  9. 제 7 항에 있어서,
    하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 융합체:
    (a) 서열 번호 7에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체;
    (b) 서열 번호 10에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 4에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체;
    (c) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 13에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체;
    (d) 서열 번호 2에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄, 및 서열 번호 15에 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄를 포함하는 융합체; 및,
    (e) (a)∼(d)에 기재된 융합체의 번역 후 수식에 의해 생긴 융합체.
  10. 하기 (a)∼(b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드:
    (a) 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및,
    (b) 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 10 항에 있어서,
    하기 (a)∼(b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드:
    (a) 제 5 항에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및
    (b) 제 5 항에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 11 항에 있어서,
    하기 (a)∼(b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 폴리뉴클레오티드:
    (a) 제 9 항에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및
    (b) 제 9 항에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  13. 하기 (a) 및/또는 (b)를 포함하는, 발현 벡터:
    (a) 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및,
    (b) 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  14. 제 13 항에 있어서,
    하기 (a) 및/또는 (b)를 포함하는, 발현 벡터:
    (a) 제 5 항에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및,
    (b) 제 5 항에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  15. 제 14 항에 있어서,
    하기 (a) 및/또는 (b)를 포함하는, 발현 벡터:
    (a) 제 9 항에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드; 및,
    (b) 제 9 항에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오티드.
  16. 하기 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 숙주 세포:
    (a) 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (c) 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및,
    (d) 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및, 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  17. 제 16 항에 있어서,
    하기 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 숙주 세포:
    (a) 제 5 항에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 5 항에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (c) 제 5 항에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 제 5 항에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및,
    (d) 제 5 항에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및, 제 5 항에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  18. 제 17 항에 있어서,
    하기 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 숙주 세포:
    (a) 제 9 항에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 9 항에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (c) 제 9 항에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 제 9 항에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및,
    (d) 제 9 항에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 및, 제 9 항에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  19. 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 CD73 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트 또는 그들 중 어느 것의 융합체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 CD73 항체, 그의 항원 결합 프래그먼트 또는 그들 중 어느 것의 융합체를 생산하는 방법:
    (a) 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (c) 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 제 2 항에 기재된 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  20. 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 CD73 항체 또는 그의 융합체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 CD73 항체 또는 그의 융합체를 생산하는 방법:
    (a) 제 5 항에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 제 5 항에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 5 항에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 제 5 항에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (c) 제 5 항에 기재된 항체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 제 5 항에 기재된 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  21. 이하의 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포를 배양하여, 항인간 CD73 항체의 융합체를 발현시키는 공정을 포함하는, 항인간 CD73 항체의 융합체를 생산하는 방법:
    (a) 제 9 항에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드와 제 9 항에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포;
    (b) 제 9 항에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터와 제 9 항에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포; 및
    (c) 제 9 항에 기재된 융합체의 중쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포, 및, 제 9 항에 기재된 융합체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
  22. 제 3 항에 기재된 항인간 CD73 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서,
    암의 예방 또는 치료용 의약 조성물인, 의약 조성물.
  24. 제 3 항에 기재된 항인간 CD73 항체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  25. 제 3 항에 있어서,
    암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 항인간 CD73 항체.
  26. 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, 제 3 항에 기재된 항인간 CD73 항체의 사용.
  27. 제 9 항에 기재된 융합체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서,
    암의 예방 또는 치료용 의약 조성물인, 의약 조성물.
  29. 제 9 항에 기재된 융합체의 치료 유효량을 투여하는 공정을 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법.
  30. 제 9 항에 있어서,
    암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, 융합체.
  31. 암의 예방 또는 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, 제 9 항에 기재된 융합체의 사용.
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