KR20230171465A - 항cldn4-항cd137 이중특이성 항체 - Google Patents

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요시키 사타케
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히로키 시라이
히로키 사사키
후미코 지와키
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아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명의 과제는, 암의 치료에 이용할 수 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체를 제공하는 것이다. CLDN4에 결합하는 항CLDN4 항체와 CD137에 결합하는 항CD137 항체를 이용하여 제작한 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, CD137에 대한 아고니스트 작용을 갖고, T 세포의 인터페론 γ 산생을 촉진하여, 세포 표면에 CLDN4를 발현하는 암 세포에 대해서 세포 상해 활성을 나타냈다. 나아가, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는 원숭이에게 안전하게 투여할 수 있는 것이 나타났다. 따라서, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는 인간의 암의 치료에 이용할 수 있다.

Description

항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체
본 발명은, 암의 치료에 이용하는 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용할 것으로 기대되는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 관한 것이다.
Claudin-4(CLDN4)는 클라우딘 패밀리에 속하는 4회 막관통 단백질이다. 상피 세포나 내피 세포에 발현하고 있으며, 타이트 정션을 구성하는 주요 분자로서 중요한 역할을 하고 있다. CLDN4는 대장암, 방광암, 난소암 등의 암 조직에서도 고발현이 인정되고 있어, 항CLDN4 항체는 암의 치료 또는 진단에 응용할 수 있을 가능성이 시사되고 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 1). 나아가, 동물 모델에 있어서, 항CLDN4 항체와 항Epidermal growth factor receptor(EGFR) 항체의 병용에 의한 항종양 효과가 나타나 있다(비특허문헌 2).
Cluster of Differentiation 137(CD137, 별명 4-1BB)은, Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily(TNFRSF)에 속하는 분자이며, T 세포, B 세포, natural killer(NK) 세포, 수상 세포, 호산구, 마스트 세포 등의 면역 세포 표면에 발현하고 있는 것이 보고되어 있다. 특히, T 세포 상의 CD137은 항원 제시 세포 상의 CD137 리간드와 결합하여, 공자극 분자로서 T 세포의 활성화와 생존에 관여하고 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 3). 항CD137 아고니스트 항체는, 동물 모델에 있어서 종양 미소 환경 내의 면역 세포의 활성화를 통한 항종양 효과를 나타내고 있다(비특허문헌 4). 항CD137 아고니스트 항체인 우렐루맙은 임상 시험에서 치료 효과를 나타냈지만, 간 장애의 부작용을 야기하는 것도 보고되어 있다(비특허문헌 5).
낮은 항체 농도에서 암 세포 선택적인 세포 상해 활성을 얻을 수 있는 획기적인 방법으로서, 여러 가지 항체 포맷의 이중특이성 T 세포 리크루트 항체(bispecific T-cell-recruiting antibodies)가 보고되어 있다. 이중특이성 T 세포 리크루트 항체는, 암 세포 표면에 발현하는 종양 관련 항원(Tumor-Associated Antigens; TAA)에 대한 항체와, T 세포에 결합하는 항체를 포함하는 이중특이성 항체이며, T 세포 매개성 면역 요법에 대한 그들 항체의 효과가 검토되고 있다(비특허문헌 6). T 세포에 결합하는 항체로서 항CD3 항체가 많이 이용되고 있으며, 현재도 여러 가지 TAA에 대한 이중특이성 T 세포 리크루트 항체의 연구 개발이 이루어지고 있다.
나아가, 근년에는, CD137 및 TAA에 대한 이중특이성 T 세포 리크루트 항체의 연구도 활발히 행해지고 있다. TAA인 Glypican 3(GPC3), Human Epidermal Growth Factor Receptor Type 2(HER2), Programmed Cell Death-Ligand 1(PD-L1), Fibroblast Activation Protein(FAP)을 인식하는 항GPC3-항CD137 이중특이성 항체, 항HER2-항CD137 이중특이성 항체, 항PDL1-항CD137 이중특이성 항체, 항FAP-항CD137 이중특이성 항체 등의 연구가 이루어지고 있다(특허문헌 2 및 3, 비특허문헌 7∼9).
그러나, 현재까지, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 대한 보고는 없다.
국제 공개 번호 2008/114733호 국제 공개 번호 2015/156268호 국제 공개 번호 2016/177802호
Cancer Science, 2009: 100(9): p.1623-1630 Oncotarget, 2018: 9(100): p.37367-37378 Cancer Science, 2020: 111(5): p.1461-1467 Cancer Immunology Immunotherapy, 2012: 61(5): p.1721-1733 Clinical Cancer Research, 2017: 23(8): p.1929-1936 mAbs, 2017: 9(2): p.182-212 Clinical Cancer Research, 2019: 25(19): p.5878-5889 Clinical Cancer Research, 2020: 26(15): p.4154-4167 Journal for Immunotherapy of Cancer, 2020; 8(2): e000238
본 발명의 과제는, 암의 치료에 이용할 수 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은, 복막 파종암 세포에 발현하는 항원에 선택적으로 결합하는 항체의 탐색을 행하여, 항CLDN4 항체인 3D11을 취득했다(실시예 1 및 2). 3D11 및 항CD3 항체를 이용한 이중특이성 T 세포 리크루트 항체는 암 환자의 치료에는 사용할 수 없는 것이 판명되었다(참고예). 그래서, 3D11 및 공지된 항CLDN4 항체인 KM3900 항체를 이용하여, 항CD137 항체와의 이중특이성 T 세포 리크루트 항체의 취득을 시도했다(실시예 3 및 4). 취득한 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, CLDN4 및 CD137에 결합하고(실시예 5), in vitro에 있어서 T 세포의 인터페론 γ 산생을 촉진하여, 세포 표면에 CLDN4를 발현하는 암 세포에 대해서 세포 상해 활성을 나타냈다(실시예 6). 나아가, 취득한 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는 in vivo 마우스 모델에 있어서 항종양 작용을 발휘하고(실시예 7-1), 필리핀원숭이(cynomolgus monkey)에 있어서도 안전하게 사용할 수 있는 것이 확인되었다(실시예 7-2). 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는 암의 치료에 유용한 것이 시사되었다.
즉, 본 발명은, 이하의 [1]∼[32]에 관한 것이다.
[1] 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체로서, 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 이하의 (a) 또는 (b)의 어느 하나인, 이중특이성 항체:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99부터 114까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 서열 번호 6의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 99부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
[2] 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 이하의 (a) 또는 (b)의 어느 하나인, [1]에 기재된 이중특이성 항체:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역.
[3] 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 IgG 항체(항CLDN4 IgG 항체)를 포함하는, [1] 또는 [2]에 기재된 이중특이성 항체.
[4] 항CLDN4 IgG 항체의 Fc 영역에 LALA 변이(L234A 및 L235A(여기에서, 상기 변이 위치는 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 EU 인덱스에 따른 아미노산 위치이다))를 포함하는, [3]에 기재된 이중특이성 항체.
[5] 항CLDN4 IgG 항체의 Fc 영역에 P331G 변이(여기에서, 상기 변이 위치는 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 EU 인덱스에 따른 아미노산 위치이다)를 포함하는, [3]에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체.
[6] 항CLDN4 IgG 항체의 Fc 영역에 LALA 변이 및 P331G 변이를 포함하는, [3]에 기재된 이중특이성 항체.
[7] 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 이하의 (a)∼(d)의 어느 하나인, [1]∼[6] 중 어느 하나에 기재된 이중특이성 항체:
(a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 99부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 24부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 12의 아미노산 번호 50부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 89부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 14의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 18의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 18의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 18의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(d) 서열 번호 22의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 22의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 22의 아미노산 번호 98부터 110까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
[8] 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 이하의 (a)∼(i)의 어느 하나인, [1]∼[7] 중 어느 하나에 기재된 이중특이성 항체:
(a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(d) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(f) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(g) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역;
(h) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 또는
(i) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역.
[9] 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 1본쇄 가변 영역 프래그먼트(항CD137 scFv)를 포함하는, [7] 또는 [8]에 기재된 이중특이성 항체.
[10] 항CD137 scFv가 이하의 (a)∼(e)의 어느 하나인, [9]에 기재된 이중특이성 항체:
(a) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(b) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(c) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(d) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv; 또는
(e) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv.
[11] 항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 scFv를 포함하고, 항CLDN4 IgG 항체의 중쇄 또는 경쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는, [9] 또는 [10]에 기재된 이중특이성 항체.
[12] 이하의 (a)∼(j)의 어느 하나의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(d) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(e) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(f) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(g) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(h) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(i) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체; 또는
(j) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체.
[13] 링커가 GS 링커인, [11] 또는 [12]에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체.
[14] GS 링커가 서열 번호 54의 아미노산 서열로 이루어지는 링커인, [13]에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체.
[15] 이하의 (a) 또는 (b)의 어느 하나의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 포함하는 이중특이성 항체; 또는
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 포함하는 이중특이성 항체.
[16] 번역 후 수식된, [1]∼[15] 중 어느 하나에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체.
[17] 번역 후 수식이, 중쇄 가변 영역 N 말단의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄 C 말단 리신 결실인, [16]에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체.
[18] 하기 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(d) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[19] 하기 (a)∼(r)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
(a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(e) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(f) 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(g) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(h) 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(i) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(j) 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(k) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(l) 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(m) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(n) 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(o) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(p) 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(q) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(r) 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[20] 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
(a) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(e) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[21] [15]에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 생산에 이용하는, 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(e) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[22] [18]∼[21] 중 어느 하나에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 발현 벡터.
[23] [22]에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
[24] 이하의 (a)∼(dd)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(e) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(f) 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(g) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(h) 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(i) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(j) 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(k) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(l) 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(m) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(n) 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(o) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(p) 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(q) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(r) 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(s) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(t) 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(u) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(v) 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(w) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(x) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(y) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(z) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(aa) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(bb) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(cc) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(dd) 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[25] 이하의 (a) 또는 (b)의 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 숙주 세포:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
[26] 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 생산 방법으로서, [23]∼[25] 중 어느 하나에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
[27] [1]∼[17] 중 어느 하나에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
[28] 암의 치료에 사용하기 위한, [1]∼[17] 중 어느 하나에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체.
[29] 암의 치료에 이용하기 위한, [27]에 기재된 의약 조성물.
[30] [1]∼[17] 중 어느 하나에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 치료 유효량을 대상에게 투여하는 공정을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
[31] 암의 치료에 이용하는 의약 조성물의 제조에 있어서의, [1]∼[17] 중 어느 하나에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 사용.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 암 항원인 CLDN4와 T 세포 등의 면역 세포의 표면에 발현하고 있는 CD137의 양쪽에 결합하여, 암 세포 주변의 면역 세포를 활성화하는 것에 의해 암 세포에 대한 살상 작용을 증강시키는 것이다. 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 또는 상기 항체를 포함하는 의약 조성물은, 각종 암의 치료를 위해서 사용할 수 있다.
[도 1a] 도 1a는 ELISA법에 의해 측정 평가한 피험 항체의 CD137에의 결합 활성을 나타낸다. 도면의 세로축은 450nm의 흡광도부터 570nm의 흡광도를 그은 값을, 가로축은 피험 항체의 농도를 나타낸다. 심볼은 각각의 피험 항체 첨가 시의 흡광도의 평균치를, 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
[도 1b] 도 1b는 ELISA법에 의해 측정 평가한 피험 항체의 CD137에의 결합 활성을 나타낸다. 도면의 세로축은 450nm의 흡광도부터 570nm의 흡광도를 그은 값을, 가로축은 피험 항체의 농도를 나타낸다. 심볼은 각각의 피험 항체 첨가 시의 흡광도의 평균치를 나타낸다.
[도 1c] 도 1c는 ELISA법에 의해 측정 평가한 피험 항체의 CD137에의 결합 활성을 나타낸다. 도면의 세로축은 450nm의 흡광도부터 570nm의 흡광도를 그은 값을, 가로축은 피험 항체의 농도를 나타낸다. 심볼은 각각의 피험 항체 첨가 시의 흡광도의 평균치를 나타낸다.
[도 1d] 도 1d는 ELISA법에 의해 측정 평가한 피험 항체의 CD137에의 결합 활성을 나타낸다. 도면의 세로축은 450nm의 흡광도부터 570nm의 흡광도를 그은 값을, 가로축은 피험 항체의 농도를 나타낸다. 심볼은 각각의 피험 항체 첨가 시의 흡광도의 평균치를 나타낸다.
[도 2a] 도 2a는 CLDN4 발현 암 세포(NCI-H322 세포)와 4-1BB Effector Cells의 공(共)배양 시험에 있어서의 피험 항체의 CD137 아고니스트 활성을 나타낸다. 도면의 세로축은 상대 발광량, 가로축은 피험 항체의 농도를 나타낸다. 심볼은 각각의 피험 항체 첨가 시의 상대 발광량의 평균치를, 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
[도 2b] 도 2b는 CLDN4 발현 암 세포(NCI-H322 세포)와 4-1BB Effector Cells의 공배양 시험에 있어서의 피험 항체의 CD137 아고니스트 활성을 나타낸다. 도면의 세로축은 상대 발광량, 가로축은 피험 항체의 농도를 나타낸다. 심볼은 각각의 피험 항체 첨가 시의 상대 발광량의 평균치를 나타낸다.
[도 2c] 도 2c는 CLDN4 발현 암 세포(NCI-H322 세포)와 4-1BB Effector Cells의 공배양 시험에 있어서의 피험 항체의 CD137 아고니스트 활성을 나타낸다. 도면의 세로축은 상대 발광량, 가로축은 피험 항체의 농도를 나타낸다. 심볼은 각각의 피험 항체 첨가 시의 상대 발광량의 평균치를, 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
[도 2d] 도 2d는 4-1BB Effector Cells의 단독 배양 시험에 있어서의 피험 항체의 CD137 아고니스트 활성을 나타낸다. 도면의 세로축은 상대 발광량, 가로축은 피험 항체의 농도를 나타낸다. 심볼은 각각의 피험 항체 첨가 시의 상대 발광량의 평균치를, 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
[도 2e] 도 2e는 4-1BB Effector Cells의 단독 배양 시험에 있어서의 피험 항체의 CD137 아고니스트 활성을 나타낸다. 도면의 세로축은 상대 발광량, 가로축은 피험 항체의 농도를 나타낸다. 심볼은 각각의 피험 항체 첨가 시의 상대 발광량의 평균치를 나타낸다.
[도 2f] 도 2f는 4-1BB Effector Cells의 단독 배양 시험에 있어서의 피험 항체의 CD137 아고니스트 활성을 나타낸다. 도면의 세로축은 상대 발광량, 가로축은 피험 항체의 농도를 나타낸다. 심볼은 각각의 피험 항체 첨가 시의 상대 발광량의 평균치를, 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
[도 3a] 도 3a는 60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded pan T 세포의 공배양계에 있어서의 각 피험 항체 첨가 시의 인터페론-γ 산생 촉진 기능을 나타낸다. 세로축은 항체 첨가 6일 후에 있어서의 인터페론-γ 산생량(pg/mL)을, 가로축은 항체 농도를 나타낸다. 심볼은 항체의 각 농도에 있어서의 인터페론-γ 산생량의 평균치를 나타낸다.
[도 3b] 도 3b는 60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded pan T 세포의 공배양계에 있어서의 각 피험 항체 첨가 시의 인터페론-γ 산생 촉진 기능을 나타낸다. 도면의 세로축은 항체 첨가 4일 후에 있어서의 인터페론-γ 산생량(pg/mL)을, 가로축은 항체 농도를 나타낸다. 심볼은 항체의 각 농도에 있어서의 인터페론-γ 산생량의 평균치를, 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
[도 3c] 도 3c는 Expanded pan T 세포의 단(單)배양계에 있어서의 각 피험 항체 첨가 시의 인터페론-γ 산생량을 나타낸다. 도면의 세로축은 항체 첨가 6일 후에 있어서의 인터페론-γ 산생량(pg/mL)을, 가로축은 항체 농도를 나타낸다. 심볼은 항체의 각 농도에 있어서의 인터페론-γ 산생량의 평균치를 나타낸다.
[도 3d] 도 3d는 Expanded pan T 세포의 단배양계에 있어서의 각 피험 항체 첨가 시의 인터페론-γ 산생량을 나타낸다. 도면의 세로축은 항체 첨가 5일 후에 있어서의 인터페론-γ 산생량(pg/mL)을, 가로축은 항체 농도를 나타낸다. 심볼은 항체의 각 농도에 있어서의 인터페론-γ 산생량의 평균치를, 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
[도 4] 도 4는 60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded pan T 세포의 공배양계에 있어서의 각 피험 항체에 의한 암 세포 상해 활성(암 세포의 증식 억제 작용)을 나타낸다. 도면의 세로축은 측정 개시 0시간부터 168시간에 증가한 형광 면적에 있어서 피험 항체 비첨가 웰을 100%로 했을 때의 세포 증식률을 나타낸다. 가로축은 항체 농도를 나타낸다. 심볼은 각 항체에 있어서의 암 세포 증식률의 평균치를 나타낸다.
[도 5] 도 5는 60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded pan T 세포의 공배양계에 있어서의 각 피험 항체 첨가 시의 암 세포 상해 활성을 나타낸다. 도면의 세로축은 항체 첨가 6일 후에 있어서의 60As6-Luc/GFP 세포의 화학 발광의 측정치에 있어서, 항체 비첨가의 평균치를 살상률 0%, Triton-X100 첨가의 평균치를 살상률 100%로 했을 때의, 암 세포 살상률(%)을 나타낸다. 가로축은 항체 농도를 나타낸다. 심볼은 항체의 각 농도에 있어서의 암 세포 살상률의 평균치를, 에러 바는 표준 편차를 나타낸다.
[도 6] 도 6은 NCI-H322 세포를 피하 담암(擔癌)한 PBMC 이입 마우스에 있어서의 종양 체적 변화를 나타낸다. 도면의 가로축은 초회 투여 후 일수를, 세로축은 종양 체적의 평균치를, 에러 바는 표준 오차를 나타낸다.
이하에, 본 발명에 대하여 상술한다.
<정의>
본 명세서의 용어는, 이하에서 특별히 정의되지 않는 한, 당해 기술 분야에서 당업자에게 일반적으로 사용되고 있는 의미로 사용된다.
항체(또는 면역글로불린)는, 단일의 서열을 갖는 중쇄 2본과, 단일의 서열을 갖는 경쇄 2본으로 이루어지는 좌우 대칭 Y자형의 구조를 갖는 4본쇄 구조를 기본 구조로 하는 당단백질이다. 항체에는 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE의 5개의 클래스가 존재한다. 항체 분자의 기본 구조는 각 클래스 공통이며, 분자량 5만∼7만의 중쇄 2본과 2만∼3만의 경쇄 2본이 다이설파이드 결합 및 비공유 결합에 의해 결합하여, 분자량 15만∼19만의 Y자형의 4본쇄 구조로 이루어지는 항체 분자를 형성한다. 중쇄는, 통상 약 440개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드쇄로 이루어지고, 클래스마다 특징적인 구조를 가지며, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE에 대응하여 각각, Igγ, Igμ, Igα, Igδ, Igε이라고 불린다. 나아가 IgG에는, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 서브클래스가 존재하고, 각각에 대응하는 중쇄는 Igγ1, Igγ2, Igγ3, Igγ4라고 불린다. 경쇄는, 통상 약 220개의 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드쇄로 이루어지고, λ형과 κ형의 2종이 알려져 있으며, 각각 Igλ, Igκ라고 한다. 상기 2종의 경쇄는, 어느 종류의 중쇄와도 쌍을 이룰 수 있다.
항체 분자의 쇄내 다이설파이드 결합은, 중쇄에는 4개(Igμ, Igε에는 5개), 경쇄에는 2개 존재하고, 아미노산 100∼110잔기마다 1개의 루프를 이루고 있다. 그들의 입체 구조는 각 루프 간에서 유사하고, 구조 단위 또는 도메인이라고 불린다. 중쇄, 경쇄 모두 N 말단에 위치하는 도메인은 가변 영역이라고 불리며, 동종 동물의 동일 클래스(또는 서브클래스)로부터 산생된 항체이더라도 다양한 아미노산 서열을 갖고, 항체와 항원의 결합 특이성 결합에 관여하는 것이 알려져 있다. 가변 영역보다도 하류의 C 말단 측의 도메인의 아미노산 서열은 각 클래스 또는 서브클래스마다 거의 일정하며, 정상 영역이라고 불리고 있다. 중쇄는, N 말단으로부터 C 말단을 향하여 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 정상 영역(CH)을 갖는다. CH는 N 말단 측으로부터 CH1 도메인, CH2 도메인, 및 CH3 도메인의 3개의 도메인으로 더 나뉜다. 경쇄는, N 말단으로부터 C 말단을 향하여 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 정상 영역(CL)을 갖는다.
VH 및 VL에 존재하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열은 변화가 매우 크고, 가변 영역의 가변성에 기여하고 있다. CDR은 5∼10 아미노산 잔기로 이루어지는 영역으로서, 중쇄와 경쇄의 각각의 N 말단에 CDR1, CDR2, CDR3의 순번으로 존재하고, 항원에 접촉하여 항체 결합 부위를 형성한다. 경쇄의 CDR보다도 중쇄의 CDR이 항원 결합에의 기여가 크고, CDR1∼3 중에서는 CDR3의 기여가 가장 높은 것이 알려져 있다. 한편, 가변 영역의 CDR 이외의 부분은 프레임워크 영역(FR)이라고 불리며, FR1∼4로 이루어지고, 아미노산 서열의 변화는 비교적 적다.
항체를 단백질 분해 효소인 파파인으로 처리하면, 3개의 항체 단편이 얻어진다. N 말단 측의 2개의 단편은 Fab(항원 결합 단편, Fragment, antigen binding) 영역이라고 불리고 있다. Fab 영역이란, 중쇄의 VH, CH1 도메인 및 힌지 영역의 일부, 및 경쇄(VL과 CL)로 이루어지는 영역을 가리키고, 당해 Fab 영역이 구성하는 VH 및 VL(항원 결합 부위)에서 항원과 결합한다. 또한, C 말단 측의 단편은 Fc(결정화 가능 단편, Fragment, crystallizable) 영역이라고 불리고 있다.
본 명세서에 있어서 「IgG 항체」란, 2개의 Fab 영역과 Fc 영역으로 이루어지는 Y자형의 구조를 갖는 항체를 말한다. 하나의 실시형태에 있어서, IgG 항체의 2개의 Fab 영역은, 동일한 서열로 이루어지는 Fab 영역이다. 하나의 실시형태에 있어서, IgG 항체의 2개의 Fab 영역은, 상이한 서열로 이루어지는 Fab 영역이다.
본 명세서에 있어서 「항원 결합 프래그먼트」 및 「프래그먼트 항체」는 상호 호환적으로 사용할 수 있으며, 면역글로불린 분자의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 항원 결합 활성을 갖는, 적어도 1개의 폴리펩타이드쇄를 포함하는 분자를 말한다. 대표적인 항원 결합 프래그먼트로서는, 1본쇄 가변 영역 프래그먼트(scFv), Fab 프래그먼트, Fab' 프래그먼트, F(ab')2 프래그먼트를 들 수 있다. 본 명세서에 있어서, 「scFv」란, 링커로 연결된 VH와 VL로 구성되는 1가의 항원 결합 프래그먼트를 말한다. Fab 프래그먼트는, 경쇄와, 중쇄의 VH, CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 프래그먼트로 구성되는 1가의 항원 결합 프래그먼트이다. Fab' 프래그먼트는, 경쇄와, 중쇄의 VH, CH1 도메인과 힌지 영역의 일부를 포함하는 프래그먼트로 구성되는 1가의 항원 결합 프래그먼트이며, 이 힌지 영역의 부분에는 중쇄간 다이설파이드 결합을 구성하고 있던 시스테인 잔기가 포함된다. F(ab')2 프래그먼트는, Fab' 프래그먼트가 다이설파이드 결합으로 연결되어 있는 2가의 항원 결합 프래그먼트이다. 1가란, 항원 결합 부위를 1개 포함하는 것을, 2가란, 항원 결합 부위를 2개 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에 있어서, 「이중특이성 항체」란, 상이한 항원에 특이적으로 결합하는 2개의 항체 또는 항원 결합 프래그먼트로 구성되고, 각 항원에 대한 결합 활성을 갖는 항체 분자를 말한다. 이중특이성 항체로서는, 다양한 구조의 이중특이성 항체가 당업자에게 공지되어 있다(비특허문헌 6). 본 명세서에서 사용되는 용어 「항체」에는, 문맥상 특별히 한정되지 않는 한, 완전 길이의 항체(각종 면역글로불린, 특히 IgG 항체), 항원 결합 프래그먼트, 및 모든 구조의 이중특이성 항체가 포함된다.
본 명세서에 있어서, IgG형의 항CLDN4 항체를 「항CLDN4 IgG 항체」라고 칭한다.
본 명세서에 있어서 「인간 항체」란 인간 면역글로불린 아미노산 서열을 갖는 항체를 나타낸다. 본 명세서에 있어서 「인간화 항체」는, CDR 이외의 아미노산 잔기의 일부, 대부분, 또는 전부가 인간 면역글로불린 분자에서 유래하는 아미노산 잔기로 치환된 항체를 나타낸다. 인간화의 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 미국 특허 제5225539호, 미국 특허 제6180370호 등을 참조하여 인간화 항체를 제작할 수 있다.
본 명세서 중에서 사용되는 항체의 아미노산 잔기 번호는 Kabat 넘버링 또는 EU 인덱스(Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed, 1991, NIH Publication No. 91-3242)를 지정함으로써, 그들의 넘버링 시스템에 따라 규정할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 「연결」 또는 「연결된」이란, 복수의 성분(예를 들면, Fab 영역 및 Fc 영역)이, 직접 또는 중개물(예를 들면, 펩타이드 링커)을 개재시켜 결합하고 있는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서 「펩타이드 링커」란, 복수의 성분을 연결하기 위해서 이용되는, 유전자 공학적 수법에 의해 도입될 수 있는 1 이상의 임의의 아미노산 서열을 의미한다. 본 발명에서 사용되는 펩타이드 링커의 길이는 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라서 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하다.
본 명세서에 있어서, 「동일성」이란, EMBOSS Needle(Nucleic Acids Res., 2015, Vol. 43, pW580-W584)을 이용하여, 디폴트로 준비되어 있는 파라미터에 의해 얻어진 Identity의 값을 의미한다. 상기의 파라미터는 이하와 같다.
Gap Open Penalty = 10
Gap Extend Penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62
End Gap Penalty = false
<본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체>
본 발명은, CLDN4 및 CD137에 결합하는 이중특이성 항체(「항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체」라고도 칭한다)를 제공한다. 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에는, 항CLDN4 IgG 항체와 항CD137 항체의 scFv(「항CD137 scFv」라고도 칭한다)를 포함하는 이중특이성 항체가 포함된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체와 항CD137 scFv를 포함하는 이중특이성 항체이다.
본 명세서에 있어서, 「항CLDN4 항체」는 인간 CLDN4에 결합 가능한 항체이며, 「항CD137 항체」는 인간 CD137에 결합 가능한 항체이다. 인간 CLDN4 또는 인간 CD137에 결합하는지 여부는, 공지된 결합 활성 측정 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(ELISA)법, 플로 사이토메트리법 등의 방법을 들 수 있다. ELISA법 또는 플로 사이토메트리법은, 당업자가 통상 이용하는 방법으로 실시할 수 있고, 예를 들면 실시예 3 또는 5에 기재되는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, CLDN4 및 CD137에 결합하는 한에 있어서 어떠한 구조여도 되고, 예를 들면, 비특허문헌 6에 기재되어 있는 구조를 갖는 이중특이성 항체를 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 항체의 Fab 영역과 항CD137 항체의 Fab 영역이 연결된 연결체, 항CLDN4 IgG 항체 및 IgG형의 항CD137 항체(「항CD137 IgG 항체」라고도 칭한다)의 연결체, 항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 항체의 항원 결합 프래그먼트의 연결체, 항CLDN4 항체의 항원 결합 프래그먼트 및 항CD137 IgG 항체의 연결체, 또는 항CLDN4 항체의 항원 결합 프래그먼트 및 항CD137 항체의 항원 결합 프래그먼트의 연결체여도 된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 완전 길이의 항CLDN4 항체 및 완전 길이의 항CD137 항체를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 IgG 항체를 포함한다. 2개의 항체는 링커를 개재시켜 연결되어 있어도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 완전 길이의 항CLDN4 항체 및 항CD137 항체의 항원 결합 프래그먼트를 포함한다. 2개의 항체의 연결 부위는 특별히 한정되지 않고, 직접 또는 링커를 개재시켜 연결되어 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 항체의 scFv(본 명세서에 있어서 「항CD137 scFv」라고 칭한다)를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 scFv를 포함하고, 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv의 아미노 말단이 연결되어 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 scFv를 포함하고, 항CLDN4 항체의 경쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv의 아미노 말단이 연결되어 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 scFv를 포함하고, 항CLDN4 항체의 중쇄의 아미노 말단에 항CD137 scFv의 카복시 말단이 연결되어 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 scFv를 포함하고, 항CLDN4 항체의 경쇄의 아미노 말단에 항CD137 scFv의 카복시 말단이 연결되어 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 항체의 항원 결합 프래그먼트 및 항CD137의 항원 결합 프래그먼트를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 항체의 scFv 및 항CD137의 scFv를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CD137 scFv를 포함한다.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 있어서, 항CLDN4 항체 및 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은, 인간 항체 유래, 인간화 항체 유래, 또는 그들의 조합이어도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 그의 조합으로 이루어지는 항체이다.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체로서, 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 이하의 (a) 또는 (b)의 어느 하나인 이중특이성 항체이다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99부터 114까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 서열 번호 6의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 99부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 이하의 (a) 또는 (b)에 기재된 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 또는
(b) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 항체로서, IgG 항체 등의 완전 길이의 항체를 포함해도 되고, Fab 프래그먼트, Fab' 프래그먼트, F(ab')2 프래그먼트 또는 scFv 등의 항원 결합 프래그먼트를 포함해도 된다.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 포함되는 항CLDN4 항체에 포함되는 중쇄 정상 영역으로서는, Igγ, Igμ, Igα, Igδ 또는 Igε의 어느 정상 영역도 선택 가능하다. Igγ로서는, 예를 들면, Igγ1, Igγ2, Igγ3 또는 Igγ4로부터 선택하는 것이 가능하다. 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 포함되는 항CLDN4 항체에 포함되는 경쇄 정상 영역으로서는, Igλ 또는 Igκ의 어느 정상 영역도 선택 가능하다. 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 포함되는 항CLDN4 항체가 IgG 항체인 경우, 하나의 실시형태에 있어서, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 및 경쇄는, 각각, 인간 Igγ1 및 Igκ이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는 완전 길이의 항CLDN4 항체를 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 포함되는 항CLDN4 항체는, 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 IgG 항체(항CLDN4 IgG 항체)이다.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 해당 이중특이성 항체에 있어서의 Fc 영역은, 항체 의존성 세포 상해 활성(ADCC)이나 보체 의존성 상해 활성(CDC)을 저하시키는 변이를 포함해도 된다. L234A란, 인간 Igγ1 정상 영역의 아미노산 234위의 류신의 알라닌으로의 치환이다. L235A란, 인간 Igγ1 정상 영역의 아미노산 235위의 류신의 알라닌으로의 치환이다. 인간 Igγ1 정상 영역 L234A 및 L235A의 아미노산 변이를 「LALA 변이」라고 한다. 여기에서, 상기 234위 및 235위는 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 EU 인덱스에 따른 아미노산 위치이다. 당해 변이는, 항체의 ADCC나 CDC를 저하시키는 것이 알려져 있다(Mol. Immunol., 1992, Vol. 29, p. 633-639; J. Immunol., 2000, Vol. 164, p. 4178-4184). P331G 또는 P331S란, 인간 Igγ1 정상 영역의 아미노산 331위의 프롤린의 글리신 또는 세린으로의 치환이다. 여기에서, 상기 331위는 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 EU 인덱스에 따른 아미노산 위치이다. 당해 변이는, 항체의 CDC를 저하시키는 것이 알려져 있다(J. Immunol., 2000, Vol. 164(8), p. 4178-4184).
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 포함되는 항CLDN4 IgG 항체는, L234A 및 L235A의 아미노산 변이(LALA 변이)를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 항CLDN4 IgG 항체는 P331G 또는 P331S 변이의 어느 하나를 포함하는 Fc 영역을 포함한다. 하나의 실시형태에 있어서, 항CLDN4 IgG 항체는, LALA 변이 및 P331G 또는 P331S 변이의 어느 하나의 변이를 포함하는 Fc 영역을 포함한다.
본 발명자들은, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 창출의 과정에 있어서, 신규한 항CD137 항체 또는 그의 결합 프래그먼트(scFv)를 창출했다. 본 발명자들은, CD137에만 결합하는 경우에는 CD137 시그널을 전달하지 않고, CD137과 CLDN4에 동시에 결합한 경우에만 CD137 시그널을 전달하는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체를 동정했다. 이들 항체는, CLDN4에 결합하고 있지 않는 경우에는 아고니스트 활성을 나타내지 않는다. 한편으로, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 의한 CLDN4 및 CD137에의 결합에 의해, CD137 시그널 전달 및 T 세포의 활성화를 가져온다. 이 작용은, 우렐루맙의 임상 시험에 있어서 보였던 간독성 등을 경감할 수 있을 것으로 기대되기 때문에, 이중특이성 항체에 이용하는 항CD137 항체로서 바람직한 프로파일일 것으로 기대된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 이하의 (a)∼(d)의 어느 하나에 기재된 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 99부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 24부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 12의 아미노산 번호 50부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 89부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 14의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 18의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 18의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 18의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(d) 서열 번호 22의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 22의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 22의 아미노산 번호 98부터 110까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 이하의 (a)∼(i)의 어느 하나에 기재된 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다:
(a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(d) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(f) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(g) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역;
(h) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 또는
(i) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CD137 항체로서, IgG 항체 등의 완전 길이의 항체를 포함해도 되고, 또는 Fab 프래그먼트, Fab' 프래그먼트, F(ab')2 프래그먼트, scFv 등의 항원 결합 프래그먼트를 포함해도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 포함되는 항CD137 항체는, 항CD137 항체의 항원 결합 프래그먼트이다. 하나의 실시형태에 있어서, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 포함되는 항CD137 항체의 항원 결합 프래그먼트는, 항CD137 scFv이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 이하의 (a)∼(m)에 기재된 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함한다:
(a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 99부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 24부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 12의 아미노산 번호 50부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 89부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 14의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 18의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 18의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 18의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(d) 서열 번호 22의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 22의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 22의 아미노산 번호 98부터 110까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(f) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(g) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(h) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(i) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(j) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(k) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역;
(l) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 또는
(m) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역.
항CD137 scFv에 있어서, 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 연결하는 링커의 종류 및 길이는 특별히 한정되지 않고, 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하다. 링커로서는, 펩타이드 링커를 이용해도 된다. 바람직한 길이는 5 아미노산 이상(상한은 특별히 한정되지 않지만, 통상, 30 아미노산 이하, 바람직하게는 20 아미노산 이하)이며, 특히 바람직하게는 15 아미노산이다. 링커로서, 예를 들면, 글리신-세린 링커(GS 링커)나, 글리신-리신-프롤린-글리신-세린 링커(GKPGS 링커)를 사용할 수 있다. 이와 같은 링커로서는, 예를 들면, 이하를 들 수 있다.
Ser
Gly-Ser
Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 46)
Ser-Gly-Gly-Gly (서열 번호 47)
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 48)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (서열 번호 49)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 50)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (서열 번호 51)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 52)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (서열 번호 53)
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 54)
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n
Gly-Lys-Pro-Gly-Ser (서열 번호 55)
(Gly-Lys-Pro-Gly-Ser)n
상기의 n은 1 이상의 정수를 나타낸다. 또한, 어떤 태양에서는, 상기의 n은 1∼10, 2∼8, 또는 2∼6이다. 링커의 길이나 서열은 목적에 따라서 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 항CD137 scFv에 있어서 사용되는 링커는, GS 링커이다. 하나의 실시형태에 있어서, 항CD137 scFv에 있어서 사용되는 링커는, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n의 GS 링커이며, n은 3 또는 4의 어느 하나다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 이하의 (a)∼(e)의 어느 하나의 항CD137 scFv를 포함한다:
(a) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(b) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(c) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(d) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv; 또는
(e) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 있어서, 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트와 항CD137 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는 링커로 연결되어 있어도 된다. 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트와 항CD137 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 연결하는 링커의 종류 및 길이는 특별히 한정되지 않고, 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하다. 링커로서는, 펩타이드 링커를 이용해도 된다. 바람직한 길이는 5 아미노산 이상(상한은 특별히 한정되지 않지만, 통상, 30 아미노산 이하, 바람직하게는 20 아미노산 이하)이며, 특히 바람직하게는 10 아미노산이다. 펩타이드 링커로서, 예를 들면, 글리신-세린-링커(GS 링커)나, 글리신-리신-프롤린-글리신-세린 링커(GKPGS 링커)를 사용할 수 있다. 이와 같은 링커로서는, 예를 들면, 이하를 들 수 있다.
Ser
Gly-Ser
Gly-Gly-Ser
Ser-Gly-Gly
Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 46)
Ser-Gly-Gly-Gly (서열 번호 47)
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 48)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (서열 번호 49)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 50)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (서열 번호 51)
Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 52)
Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (서열 번호 53)
Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (서열 번호 54)
(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n
(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)n
Gly-Lys-Pro-Gly-Ser (서열 번호 55)
(Gly-Lys-Pro-Gly-Ser)n
상기의 n은 1 이상의 정수를 나타낸다. 또한, 어떤 태양에서는, 상기의 n은 1∼10, 2∼8, 또는 2∼6이다. 펩타이드 링커의 길이나 서열은 목적에 따라서 당업자가 적절히 선택할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트와 항CD137 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 연결하는 링커로서 사용되는 링커는, GS 링커 또는 GKPGS 링커이며, 하나의 실시형태에 있어서, 서열 번호 54의 아미노산 서열로 이루어지는 링커이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 scFv를 포함하고, 항CLDN4 IgG 항체와 항CD137 scFv가 링커를 개재시켜 연결되어 있는 구조를 갖는다. 항CLDN4 IgG 항체와 항CD137 scFv의 연결 부위는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CD137 scFv의 카복시 말단에 항CLDN4 IgG 항체의 중쇄 아미노 말단이 연결되어 있거나, 항CD137 scFv의 카복시 말단에 항CLDN4 IgG 항체의 경쇄 아미노 말단이 연결되어 있거나, 항CLDN4 IgG 항체의 중쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv의 아미노 말단이 연결되어 있거나, 항CLDN4 IgG 항체의 경쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv의 아미노 말단이 연결되어 있는 등의 여러 가지 구조를 취할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체의 중쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv의 아미노 말단이 연결되어 있거나, 또는 항CLDN4 IgG 항체의 경쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv의 아미노 말단이 연결되어 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체의 중쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv의 아미노 말단이 연결되어 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 scFv를 포함하고, 항CLDN4 IgG 항체의 중쇄 또는 경쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있고, 항CD137 scFv의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 이하의 (a)∼(m)의 어느 하나인, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체이다:
(a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 99부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 24부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 12의 아미노산 번호 50부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 89부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 14의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 18의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 18의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 18의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(d) 서열 번호 22의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 22의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 22의 아미노산 번호 98부터 110까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(f) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(g) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(h) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(i) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(j) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(k) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역;
(l) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 또는
(m) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 scFv를 포함하고, 항CLDN4 IgG 항체의 중쇄 또는 경쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있고, 항CD137 scFv가 이하의 (a)∼(e)의 어느 하나인, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체이다:
(a) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(b) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(c) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(d) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv; 또는
(e) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 이하의 (a)∼(h)의 어느 하나의 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체이다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99부터 114까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 99부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 24부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 12의 아미노산 번호 50부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 89부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99부터 114까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 14의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99부터 114까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 18의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 18의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 18의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(d) 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99부터 114까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 22의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 22의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 22의 아미노산 번호 98부터 110까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(e) 서열 번호 6의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 99부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 서열 번호 8의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 99부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 24부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 12의 아미노산 번호 50부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 89부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(f) 서열 번호 6의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 99부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 서열 번호 8의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 14의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(g) 서열 번호 6의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 99부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 서열 번호 8의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 18의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 18의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 18의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체; 또는
(h) 서열 번호 6의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 99부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 서열 번호 8의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 22의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 22의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 22의 아미노산 번호 98부터 110까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 이하의 (a)∼(j)의 어느 하나의 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체이다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(d) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(e) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(f) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(g) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(h) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(i) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(j) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(k) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 경쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(l) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 경쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(m) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 경쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(n) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 경쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(o) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 경쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(p) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 경쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(q) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 경쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(r) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 경쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
(s) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 경쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체; 또는
(t) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 경쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 이하의 (a) 또는 (b)의 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체이다:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 이중특이성 항체; 또는
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 포함하는 이중특이성 항체.
본 명세서에 있어서 「번역 후 수식」이란, 항체를 세포 내에서 발현시킨 경우에 항체가 번역 후에 수식을 받는 것을 말한다. 번역 후 수식의 예로서, 중쇄 N 말단의 글루타민 또는 글루탐산의 파이로글루타밀화, 글리코실화, 산화, 탈아마이드화, 당화 등의 수식이나, 중쇄 C 말단의 리신의 카복시펩티다아제에 의한 절단에 의한 리신 결실을 들 수 있다. 여러 가지 항체에 있어서, 이와 같은 번역 후 수식이 생기는 것이 알려져 있다(J. Pharm. Sci., 2008, Vol. 97, p. 2426-2447).
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 번역 후 수식되어 있어도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 번역 후 수식이, 중쇄 가변 영역 N 말단의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄 C 말단 리신 결실이다. N 말단의 파이로글루타밀화 또는 C 말단 리신 결실에 의한 번역 후 수식이 항체의 활성에 영향을 미치는 것은 아님은 당해 분야에서 알려져 있다(Analytical Biochemistry, 2006, Vol. 348, p. 24-39).
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 인간 CLDN4 및 인간 CD137에 결합한다. 인간 CLDN4 및 인간 CD137에 결합하는지 여부는, 공지된 결합 활성 측정 방법을 이용하여 확인할 수 있다. 결합 활성을 측정하는 방법으로서는, 예를 들면, ELISA법, 플로 사이토메트리법 등의 방법을 들 수 있다. ELISA법 또는 플로 사이토메트리법은, 당업자가 통상 이용하는 방법으로 실시할 수 있고, 예를 들면 실시예 3 또는 5에 기재되는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 인간 CLDN4 및 인간 CD137을 항원으로서 이용하고 당해 분야에서 공지된 항체 제작 기술을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있거나, 혹은, 본 명세서에 개시되는 항CLDN4 항체 및 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열 정보 등에 기초해서, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 후술하는 <본 발명의 이중특이성 항체를 생산하는 방법>에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
<본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드>
본 발명은 또한, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 생산에 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드(「본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드」라고도 칭한다)를 제공한다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드는, 하기 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(d) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드는, 하기 (a) 또는 (b)로부터 선택되는, 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(b) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드는, 하기 (a)∼(r)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다:
(a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(e) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(f) 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(g) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(h) 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(i) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(j) 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(k) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(l) 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(m) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(n) 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(o) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(p) 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(q) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(r) 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드는, 하기 (a)∼(i)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다:
(a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(e) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(f) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(g) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(h) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(i) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드는, 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다:
(a) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(e) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드는, 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드이다:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(e) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드는, 그의 염기 서열에 기초해서, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자에 의해 용이하게 제작될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드는, 당해 분야에서 공지된 유전자 합성 방법을 이용하여 합성하는 것이 가능하다. 이와 같은 유전자 합성 방법으로서는, 국제 공개 번호 90/07861호에 기재된 항체 유전자의 합성 방법 등의 당업자에게 공지된 여러 가지 방법이 사용될 수 있다.
<본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터>
본 발명은 또한, 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터(「본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터」라고도 칭한다)를 제공한다. 이들 폴리뉴클레오타이드는, 각각이 별개의 벡터에 포함되어 있어도 되고, 또는 복수의 폴리뉴클레오타이드가 1개의 벡터에 포함되어 있어도 된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터는, 하기 (a)∼(aa)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(e) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(f) 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(g) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(h) 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(i) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(j) 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(k) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(l) 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(m) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(n) 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(o) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(p) 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(q) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(r) 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(s) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(t) 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(u) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(v) 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(w) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(x) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(y) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(z) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(aa) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터는, 하기 (a)∼(k)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(e) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(f) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(g) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(h) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(i) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(j) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(k) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터는, 하기 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(c) 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터는, 하기 (a) 또는 (b)로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터는, 진핵 세포(예를 들면, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모) 및/또는 원핵 세포(예를 들면, 대장균) 등의 각종 숙주 세포 중에 있어서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 산생할 수 있는 것인 한, 특별히 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 발현 벡터로서는, 예를 들면, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 들 수 있다. 플라스미드 벡터로서는, 예를 들면, pcDNA 시리즈(Thermo Fisher Scientific사), pALTER(등록상표)-MAX(프로메가), pHEK293 Ultra Expression Vector(다카라 바이오사), pEE6.4 또는 pEE12.4(Lonza Biologics사) 등을 사용할 수 있다. 바이러스 벡터로서는, 예를 들면, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 아데노 수반 바이러스를 사용할 수 있다. 예를 들면, 세포에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위해서 렌티바이러스를 사용하는 경우, 당해 렌티바이러스는, pLVSIN-CMV/EF1α 벡터(다카라 바이오사), pLenti 벡터(Thermo Fisher Scientific사) 등을 이용할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터에 사용되는 벡터는, pcDNA3.4-TOPO(등록상표)(Thermo Fisher Scientific사) 및 pcDNA3.1(Thermo Fisher Scientific사)이다.
본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터는, 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드에 동작 가능하도록 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 동물 세포에서 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들면, CMV, RSV, SV40 등의 바이러스 유래 프로모터, 액틴 프로모터, EF(elongation factor) 1α 프로모터, 히트 쇼크 프로모터 등을 들 수 있다. 세균(예를 들면, 에셰리키아속 균)에서 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들면, trp 프로모터, lac 프로모터, λPL 프로모터, tac 프로모터 등을 들 수 있다. 효모에서 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위한 프로모터로서는, 예를 들면, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, PH05 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등을 들 수 있다.
숙주 세포로서, 동물 세포, 곤충 세포 또는 효모를 이용하는 경우, 본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터는, 개시 코돈 및 종지 코돈을 포함할 수 있다. 이 경우, 인핸서 서열, 본 발명의 항체 또는 그의 중쇄 혹은 경쇄를 코딩하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 분비 시그널 서열, 스플라이싱 접합부, 폴리아데닐레이션 부위, 혹은 복제 가능 단위 등을 포함하고 있어도 된다. 숙주 세포로서 대장균을 이용하는 경우, 본 발명의 발현 벡터는, 개시 코돈, 종지 코돈, 터미네이터 영역, 및 복제 가능 단위를 포함할 수 있다. 본 발명의 발현 벡터는, 목적에 따라서 통상 이용되는 약제 선택 마커 유전자(예를 들면, 테트라사이클린 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 다이하이드로엽산 환원 효소 유전자)를 포함하고 있어도 된다.
<본 발명의 숙주 세포>
본 발명은 또한, 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드 또는 본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터(「본 발명의 폴리뉴클레오타이드 등」이라고도 칭한다)에 의해 형질 전환된 숙주 세포(「본 발명의 숙주 세포」라고도 칭한다)를 제공한다. 본 발명의 숙주 세포는, 세포 내에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 등을 포함한다. 도입된 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 등은 숙주 세포의 게놈 DNA에 편입되어 있어도 되고, 편입되어 있지 않아도 된다. 숙주 세포로서 이용하는 세포는, in vitro에서 배양 가능한 세포 또는 생체 내의 세포의 어느 것이어도 된다. 숙주 세포가 in vitro에서 배양 가능한 세포인 경우, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 등을 in vitro에서 세포에 도입함으로써, 본 발명의 숙주 세포를 제작할 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환하는 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 인산 칼슘법, 일렉트로포레이션법, 또는 리포펙션법 등의 당업자에게 일반적으로 이용되는 방법을 사용할 수 있다. 숙주 세포가 생체 내의 세포인 경우, 숙주 세포에 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 등을 도입하는 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 핵산 송달용 캐리어(양이온성 캐리어 또는 비양이온성 캐리어(예를 들면, 리포솜, 지질 나노입자(LNP)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다) 등)를 이용할 수 있다.
in vitro에서 배양 가능한 세포로서는, 사용하는 발현 벡터 또는 일렉트로포레이션 등의 방법에 의해 형질 전환되어, 항체 또는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 것인 한 특별히 한정되는 것은 아니다. in vitro에서 배양 가능한 세포로서는, 예를 들면, 본 발명의 기술 분야에 있어서 통상 사용되는 종래 세포 또는 인공적으로 수립된 세포 등 여러 가지 세포(예를 들면, 동물 세포(예를 들면, CHO-K1 세포, ExpiCHO-S(등록상표) 세포, CHOK1SV 세포, CHO-DG44 세포, HEK293 세포, Expi293F 세포, NS0 세포), 곤충 세포(예를 들면, Sf9), 세균(에셰리키아속 균 등), 효모(사카로마이세스속, 피키아속 등) 등)를 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 숙주 세포는 Expi293F 세포, CHO-K1 세포, 또는 ExpiCHO-S 세포이다.
in vitro에서 형질 전환된 숙주 세포의 선별은, 당업자에게 일반적으로 사용되고 있는 방법으로 행할 수 있다. 선별 방법으로는, 예를 들면, 약제 선택 마커 유전자와 테트라사이클린, 암피실린, 네오마이신 또는 하이그로마이신 등의 약제를 이용한 약제 선택법이나, 한외 희석법, 싱글 셀 소팅법, 또는 콜로니 픽업법 등의 세포 단리법을 이용할 수 있다.
본 발명의 숙주 세포의 하나의 실시형태에 있어서, 해당 숙주 세포는, 하기 (a)∼(aa)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(e) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(f) 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(g) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(h) 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(i) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(j) 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(k) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(l) 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(m) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(n) 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(o) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(p) 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(q) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(r) 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(s) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(t) 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(u) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(v) 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(w) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(x) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(y) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(z) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(aa) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
하나의 실시형태에 있어서, 해당 숙주 세포는, 하기 (a)∼(k)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(e) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(f) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(g) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(h) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(i) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(j) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(k) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 숙주 세포의 하나의 실시형태에 있어서, 해당 숙주 세포는, 하기 (a)∼(c)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(c) 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
하나의 실시형태에 있어서, 해당 숙주 세포는, 하기 (a) 또는 (b)로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 숙주 세포의 하나의 실시형태에 있어서, 해당 숙주 세포는 하기의 (a)∼(j)의 폴리펩타이드를 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(d) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(e) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(f) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(g) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(h) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
(i) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
(j) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
본 발명의 숙주 세포의 하나의 실시형태에 있어서, 해당 숙주 세포는, 하기의 (a) 또는 (b)의 숙주 세포이다:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 숙주 세포; 또는
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 숙주 세포.
본 발명의 숙주 세포의 하나의 실시형태에 있어서, 해당 숙주 세포는, 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 숙주 세포이다.
<본 발명의 이중특이성 항체를 생산하는 방법>
본 발명은 또한, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체를 생산하는 방법(「본 발명의 생산 방법」이라고도 칭한다)을 제공한다. 본 발명의 생산 방법에는, 전술한 본 발명의 이중특이성 항체의 폴리뉴클레오타이드의 생산 방법, 본 발명의 이중특이성 항체의 발현 벡터의 생산 방법 및 본 발명의 숙주 세포의 생산 방법이 포함될 수 있다. 추가로, 본 발명의 생산 방법에는, 전술한 <본 발명의 숙주 세포>에 기재된 숙주 세포를 배양하여 해당 세포 또는 해당 배양 상청 중에 해당 항체를 발현시키는 공정, 해당 항체를 회수, 단리 및 정제하는 방법 등도 포함될 수 있다. 그러나, 본 발명의 생산 방법은, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체가 생산되는 한에 있어서, 이들 방법에 한정되는 것은 아니다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 생산 방법은, 하기의 (a)∼(j)의 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포;
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포;
(d) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포;
(e) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포;
(f) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포;
(g) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포;
(h) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포;
(i) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포; 또는
(j) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 생산 방법은, 하기의 (a) 또는 (b)의 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함한다:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포; 또는
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포.
본 발명의 숙주 세포의 배양은 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 배양 조건, 예를 들면, 온도, 배지의 pH 및 배양 시간은, 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다. 숙주 세포가 동물 세포인 경우, 배지로서는, 예를 들면, 약 5∼20%의 태아 소 혈청을 포함하는 MEM 배지(Science, 1959, Vol. 130, p. 432-437), D-MEM 배지(Virol., 1959, Vol. 8, p. 396), RPMI-1640 배지(J. Am. Med. Assoc., 1967, Vol. 199, p. 519), 199 배지(Exp. Biol. Med., 1950, Vol. 73, p. 1-8) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는, 예를 들면, 약 6∼8이며, 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 30∼40℃에서 약 15∼336시간 행해진다. 숙주 세포가 곤충 세포인 경우, 배지로서는, 예를 들면, 태아 소 혈청을 포함하는 Grace's 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1985, Vol. 82, p. 8404) 등을 이용할 수 있다. 배지의 pH는, 예를 들면, 약 5∼8이며, 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 20∼40℃에서 약 15∼100시간 행해진다. 숙주 세포가 대장균 또는 효모인 경우, 배지로서는, 예를 들면, 영양원을 함유하는 액체 배지가 적당하다. 영양 배지는, 예를 들면, 형질 전환된 숙주 세포의 생육에 필요한 탄소원, 무기 질소원, 또는 유기 질소원을 포함하고 있다. 탄소원으로서는, 예를 들면, 글루코스, 덱스트란, 가용성 전분, 자당 등을, 무기 질소원 또는 유기 질소원으로서는, 예를 들면, 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘 스티프 리커, 펩톤, 카제인, 고기 엑기스, 대두박, 감자 추출액 등을 들 수 있다. 소망에 따라 다른 영양소(예를 들면, 무기염(예를 들면, 염화 칼슘, 인산이수소 나트륨, 염화 마그네슘), 비타민류), 항생 물질(예를 들면, 테트라사이클린, 네오마이신, 암피실린, 카나마이신) 등을 포함하고 있어도 된다. 배지의 pH는, 예를 들면, 약 5∼8이다. 숙주 세포가 대장균인 경우, 배지로서는, 예를 들면, LB 배지, M9 배지(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Vol. 3, A2.2) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 14∼43℃에서 약 3∼24시간 행해진다. 숙주 세포가 효모인 경우, 배지로서는, 예를 들면, Burkholder 최소 배지(Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1980, Vol. 77, p. 4505) 등을 이용할 수 있다. 배양은, 필요에 따라 통기나 교반하면서, 통상 약 20∼35℃에서 약 14∼144시간 행해진다. 전술한 바와 같은 배양에 의해, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명의 생산 방법은, 본 발명의 숙주 세포를 배양하여, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체를 발현시키는 공정에 더하여, 해당 숙주 세포로부터 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체를 회수, 단리 또는 정제하는 공정을 포함할 수 있다. 단리 또는 정제 방법으로서는, 예를 들면, 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외 여과, 겔 여과 등의 분자량의 차를 이용하는 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기영동 등의 등전점의 차를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 배양 상청 중에 분비된 항체는, 각종 크로마토그래피, 예를 들면, 프로테인 A 칼럼 또는 프로테인 G 칼럼을 이용한 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
본 발명의 생산 방법에 의해 생산되는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체는 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 포함된다.
<본 발명의 의약 조성물 등>
본 발명은 또한, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체를 포함하는 의약 조성물 등(「본 발명의 의약 조성물」이라고도 칭한다)을 제공한다. 본 발명의 의약 조성물에는, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물이 포함된다. 본 발명의 의약 조성물은, 당해 분야에 있어서 통상 이용되고 있는 부형제, 즉, 약제용 부형제나 약제용 담체 등을 이용하여, 통상 사용되는 방법에 의해 조제할 수 있다. 이들 의약 조성물의 제형의 예로서는, 예를 들면, 주사제, 점적용제 등의 비경구제를 들 수 있고, 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 종양내 투여 등의 적절한 방법에 의해 투여할 수 있다. 제제화에 있어서는, 약학적으로 허용되는 범위에서, 이들 제형에 따른 부형제, 담체, 첨가제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물에는, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 번역 후 수식체를 포함할 수 있다. 예를 들면, C 말단 리신의 결실이나 N 말단의 파이로글루타밀화의 양쪽 또는 한쪽을 받은 항체 등을 함유하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 이하의 (a)∼(j)의 어느 하나의 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체를 함유하는 의약 조성물이다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체;
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체;
(c) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체;
(d) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체;
(e) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체;
(f) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체;
(g) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체;
(h) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체;
(i) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체; 또는
(j) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 의약 조성물은, 이하의 (a) 또는 (b)의 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체를 함유하는 의약 조성물이다:
(a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 포함하는, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체; 또는
(b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 포함하는, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체.
제제화에 있어서의 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및/또는 당해 항체의 번역 후 수식체의 첨가량은, 환자의 증상의 정도나 연령, 사용하는 제제의 제형, 혹은 항체의 결합 역가 등에 따라 상이하지만, 예를 들면, 0.001mg/kg∼100mg/kg 정도를 이용할 수 있다.
<본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 의약 용도>
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체, 및 그들을 함유하는 의약 조성물은, 대상의 암의 치료를 위해서 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에는, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 치료 유효량을 대상에게 투여하는 공정을 포함하는, 암을 치료하는 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는, 암의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체를 포함한다. 또한, 본 발명에는, 암의 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의, 본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 사용이 포함된다. 본 발명에 의한 치료의 대상이 되는 암은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 여러 가지 복막 파종암, 위암, 폐암, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, B 세포 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종 등의 혈액암, 골수 이형성 증후군, 선암, 편평상피암, 선편평상피암, 미분화암, 대세포암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 중피종, 피부암, 피부 T 세포 림프종, 유방암, 전립선암, 방광암, 질암, 경부암, 두경부암, 자궁암, 자궁경부암, 간장암, 담낭암, 담관암, 신장암, 췌장암, 결장암, 대장암, 직장암, 소장암, 위암, 식도암, 정소암, 난소암, 뇌종양 등의 고형암, 및 골 조직, 연골 조직, 지방 조직, 근 조직, 혈관 조직 및 조혈 조직의 암 외에, 연골 육종, 유잉 육종, 악성 혈관 내피종, 악성 슈반종, 골육종, 연부 조직 육종 등의 육종이나, 교아종, 다형성 교아종, 간아종, 수아종, 신아종, 신경아종, 췌아종, 흉막폐아종, 망막아종 등의 아종 등을 들 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에 의한 치료의 대상이 되는 암은, 대장암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 방광암, 난소암, 유방암, 전립선암이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명에 의한 치료의 대상이 되는 암은, 정상 조직과 비교하여 CLDN4가 고발현하고 있는 암이다. 본 발명에 의한 치료의 대상이 되는 암은, 바람직하게는, 정상 조직과 비교하여 CLDN4가 고발현하고 있는 암, 또는 대장암, 직장암, 폐암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 방광암, 난소암, 유방암, 전립선암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암이다.
<본 발명의 항CLDN4 항체>
본 발명은 또한, 이하의 (a)∼(c)의 어느 하나의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 제공한다:
(a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99부터 114까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트;
(b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트; 또는
(c) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 또는 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트이다.
본 발명의 항CLDN4 항체의 중쇄 정상 영역으로서는, Igγ, Igμ, Igα, Igδ 또는 Igε의 어느 정상 영역도 선택 가능하다. Igγ로서는, 예를 들면, Igγ1, Igγ2, Igγ3 또는 Igγ4로부터 선택하는 것이 가능하다. 하나의 실시형태에 있어서, 중쇄 정상 영역은 Igγ1 정상 영역이며, 예를 들면, 인간 Igγ1 정상 영역이다. 또한, 본 발명의 항CLDN4 항체의 중쇄 정상 영역은, ADCC나 CDC를 저하시키기 위해서 LALA 변이, P331G 또는 P331S 변이 등의 아미노산 변이를 포함해도 된다. 본 발명의 항CLDN4 항체의 경쇄 정상 영역으로서는, Igλ 또는 Igκ의 어느 정상 영역도 선택 가능할 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 경쇄 정상 영역은 Igκ 정상 영역이며, 예를 들면, 인간 Igκ 정상 영역이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4 항체의 항원 결합 프래그먼트는, scFv, Fab, Fab', 또는 F(ab')2이다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4 항체는, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항CLDN4 항체, 또는 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항CLDN4 항체이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4 항체는, 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항CLDN4 항체이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4 항체는, 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는, 항CLDN4 항체이다.
본 발명은 또한, 당질, 지질, 금속(방사성 동위체를 포함한다), 유기 화합물(독소, 근적외 형광 색소, 킬레이트제를 포함한다) 등(「수식제」라고도 한다)이 결합한, 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트(「본 발명의 복합체」라고도 한다)를 제공한다. 본 명세서에 있어서, 「수식제」란 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에 직접 또는 링커 등을 개재시켜 결합하고 있는, 비펩타이드성의 물질을 가리킨다. 본 발명의 복합체에 이용되는 수식제는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 폴리에틸렌 글라이콜, 당쇄, 인지질, 방사선 동위체(예를 들면, 지르코늄-89(89Zr), 이트륨-90(90Y), 인듐-111(111In), 아스타틴-211(211At), 악티늄-225(225Ac)), 유기 화합물, 독소, 근적외 형광 색소(예를 들면 IRDye(등록상표)), 킬레이트제 등을 들 수 있다. 당해 복합체에 이용되는 수식제는, 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트에 직접 결합하고 있어도 되고, 또한 임의의 링커를 개재시켜 결합하고 있어도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 복합체는, 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 약물 복합체(Antibody Drug Conjugate; ADC)이다. ADC에 이용되는 약물 및 링커는, 당업자가 일반적으로 이용하는 약제 및 링커 중에서 선정될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 세포 표면에 발현시킨 세포(예를 들면, Chimeric antigen receptor-T cell; CAR-T 세포)를 제공한다. 이와 같은 세포는, 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 이용하여, 당업자라면 제작할 수 있다. 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 발현시키는 세포로서는, 각종 면역 세포(T 세포, NK 세포, NKT 세포 등)를 이용할 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 본 발명의 복합체, 및 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 세포 표면에 발현시킨 세포에 있어서의 항체 또는 항원 결합 프래그먼트 부분은, 번역 후 수식되어 있어도 된다. 하나의 실시형태에 있어서, 번역 후 수식이, 중쇄 가변 영역 N 말단의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄 C 말단 리신 결실이다.
본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 본 발명의 복합체, 및 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 세포 표면에 발현시킨 세포는, 본 명세서에 개시되는 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트의 VH 및 VL의 서열 정보, 본 발명의 복합체에 이용되는 수식제의 정보에 기초해서, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용하여, 당업자라면 제작할 수 있다. 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, <본 발명의 이중특이성 항체를 생산하는 방법>의 항에 기재된 방법에 따라 생산할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트, 본 발명의 복합체 및 본 발명의 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 세포 표면에 발현시킨 세포(통틀어 이하 본 항에 있어서 「본 발명의 항CLDN4 항체 등」이라고 칭한다), 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 당해 의약 조성물은, 암의 치료를 위해서 이용할 수 있다. 본 발명은 또한, 본 발명의 항CLDN4 항체 등의 치료 유효량을 대상에게 투여하는 공정을 포함하는 암을 치료하는 방법, 암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 항CLDN4 항체 등, 암의 치료용 의약 조성물의 제조에 있어서의 본 발명의 항CLDN4 항체 등의 사용을 제공한다. 본 발명의 항CLDN4 항체 등의 의약 용도는, 전술한 <본 발명의 의약 조성물 등>의 기재에 준하여 당업자라면 실시할 수 있다. 본 발명의 항CLDN4 항체 등의 의약 용도의 치료의 대상이 되는 암은, 전술한 <본 발명의 의약 조성물 등>에 기재된 암을 들 수 있다.
<본 발명의 항CD137 항체>
본 발명은 또한, 이하의 (a)∼(d)의 어느 하나의 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 제공한다:
(a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 99부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 24부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 12의 아미노산 번호 50부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 89부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 14의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 18의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 18의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 18의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
(d) 서열 번호 22의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 22의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 22의 아미노산 번호 98부터 110까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CD137 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 이하의 (a)∼(i)의 어느 하나의 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다;
(a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(b) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(c) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(d) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(e) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(f) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
(g) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역;
(h) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 또는
(i) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CD137 항체의 항원 결합 프래그먼트는, scFv이다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항CD137 항체의 항원 결합 프래그먼트는, 이하의 (a)∼(e)의 어느 하나이다;
(a) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(b) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(c) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(d) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv; 또는
(e) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv.
본 발명의 항CD137 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, <본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체> 등의 본 명세서 중의 기재를 참조하여, 당업자라면 제작할 수 있다. 본 발명의 항CD137 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트는, 예를 들면, 암의 치료에 있어서 사용되는, 임의의 TAA에 대한 항체(항TAA 항체)와의 이중특이성 항체에 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 또한, 본 발명의 항CD137 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트 및 항TAA 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 포함하는 이중특이성 항체(「본 발명의 항TAA-항CD137 이중특이성 항체」라고도 칭한다)를 제공한다. TAA로서는, 종양의 세포 표면에 발현하고 있는 한에 있어서 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 HER2, EGFR, EpCAM, CEA, BCMA, PSMA, CD19, CD20, CD22, CD33, CD37, CD38, CD123, CD276(B7-H3), GPC2, GPC3, GPRC5D, WT-1, NY-ESO-1, CLDN4, CLDN6, CLDN18.2, TSPAN8이 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항TAA-항CD137 이중특이성 항체는, 항CD137 항체의 scFv를 포함하고, 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항TAA-항CD137 이중특이성 항체는, 이하의 (a)∼(e)의 어느 하나인 항CD137 항체의 scFv를 포함한다;
(a) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(b) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(c) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
(d) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv; 또는
(e) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv.
하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항TAA-항CD137 이중특이성 항체는 항CLDN4 항체 또는 그의 항원 결합 프래그먼트를 포함하고, 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 항TAA-항CD137 이중특이성 항체는 IgG형의 항CLDN4 항체를 포함한다.
본 발명에 대하여 더 이해를 얻기 위해서 참조하는 특정 실시예를 여기에 제공하지만, 이들은 예시 목적으로 하는 것이며, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1: 복막 파종암 세포에 발현하는 항원에 선택적으로 결합하는 항체의 취득]
[1-1. 환자 유래의 복막 파종암 세포의 취득]
환자로부터의 복막 파종암 세포의 취득은, 지와키 후미코, 사사키 히로키에 의한 문헌 「복막 전이암(위, 췌, 난소암 등) 세포주의 수립」(사사키 히로키 편집 『환자 유래 암 모델을 이용한 암 연구 실천 가이드』 요도샤, 2019년, p. 28-37)에 기재된 방법에 준하여 행했다.
환자로부터 채취한 복수를 실온, 430×g로 3분간 원심하고, 상청을 제거한 후에, 침전에 용혈 완충액을 첨가하여 용혈시켰다. 원심 후에 상청을 제거하고, 둘베코 PBS(-)(닛스이 제약사, 05913, 이하 「PBS(-)라고 칭한다」)를 50mL 가하여 세포를 세정했다. 그 후, 실온, 430×g로 3분간 원심하여 세포를 회수했다. 회수한 복수 중의 전체 세포를 10% FBS(Thermo Fisher Scientific사, 10270-106), ×1 Antibiotic-Antimycotic(Thermo Fisher Scientific사, 15240062)을 포함하는 RPMI-1640(L-글루타민 함유) 배지(후지필름 와코 준야쿠사, 189-02025)(이하, 실시예 1에 있어서 FBS 등을 첨가한 후의 배지를 「RPMI-1640 배지」라고 칭한다)에 재현탁했다. 현탁액을 희석하고, 100mm 콜라겐 코트 디시(이하 「디시」라고 칭한다)(IWAKI사, 4020-010)에 세포를 5×106∼1×107개/10mL씩 파종하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양했다.
복수 중의 세포에는, 접착계 세포와 부유계 세포가 존재하고, 접착계 세포에는 암 세포뿐만 아니라 암 세포 이외의 세포(섬유 아세포, 복막 중피 세포 등)도 포함되어 있다. 암 세포 이외의 세포는 암 세포보다 단시간에 박리되는 성질을 갖기 때문에, 이들 세포를 복수 중의 전체 세포로부터 분리하여 제거했다. 암 세포 이외의 세포를 제거한 후, 암 세포가 디시 면적의 80% 컨플루언트 정도까지 증식한 후에, 전 세포의 1/2을 새로운 디시에 계대하는 작업을 반복하고, 5회 이상 계대한 것을 접착계 암 세포로 했다. 부유계 세포에 대해서는, 배양 디시로부터 배양 상청 5mL와 RPMI-1640 배지 5mL를 새로운 100mm 디시에 파종하여 계대하고, 5회 이상 계대한 것을 부유계 암 세포로 했다. 1인의 환자에서 유래하는 복막 파종암 세포가 접착계 암 세포와 부유계 암 세포의 양쪽을 포함한 채로 증식하는 경우는, 그들을 혼합계 암 세포로 했다.
본 명세서에 있어서, 상기 방법으로 단리한 접착계 암 세포, 부유계 암 세포 또는 혼합계 암 세포를 총칭하여 「복막 파종암 세포」라고 칭한다. 취득한 6세포(NSC-9C, NSC-15CF, NSC-16C, NSC-20C, NSC-22C, NSC-32C(이하 「6종의 복막 파종암 세포」라고도 칭한다))를 이후의 검토에 이용했다.
[1-2: 항위암 항원 항체 산생 하이브리도마의 제작]
인간 모노클로날 항체 개발 기술 「벨로시뮨」(VelocImmune(등록상표) antibody technology; Regeneron(미국 특허 제6596541호))을 이용하여 제작된 벨로시뮨 마우스에 복막 파종암 세포를 면역하여 항복막 파종암 세포에 발현하는 암 항원에 대한 항체를 취득했다.
실시예 1-1에서 취득한 복막 파종암 세포 중 NSC-9C, NSC-15CF, NSC-16C의 3세포 또는 NSC-20C, NSC-22C, NSC-32C의 3세포를 혼합하고, TiterMax(등록상표) Gold ADJUVANT(Merck사, T2684) 또는 PBS(-)에 현탁하여, 복막 파종암 세포 현탁액을 조제했다. 이 현탁액을 벨로시뮨 마우스에 수회 투여하여 면역을 행했다. 통상적 방법에 따라, 면역한 마우스의 림프절로부터 림프구를 회수하여, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0(ATCC, CRL-1581)과 세포 융합함으로써 하이브리도마를 제작했다. 자동 피킹 장치로 하이브리도마의 단(單)콜로니를 단리하여, 모노클론화 하이브리도마 세포(이하 「클론」이라고 칭한다)를 취득했다. 단리한 클론을 37℃, 8% CO2 인큐베이터에서 배양하고, 약 14일 후의 상청을 96웰 플레이트에 회수하여, 이하의 실험에 이용했다.
[1-3: 복막 파종암 세포에 선택적으로 결합하는 항체의 선별]
(1) 복막 파종암 세포 및 EpCAM 발현 세포에의 결합 확인
실시예 1-2에서 얻어진 클론의 세포 상청에는 항체(이하 「클론 상청에 포함되는 항체」라고 칭한다)가 포함되어 있다.
우선, 클론 상청에 포함되는 항체와 실시예 1-1에서 취득한 6종의 복막 파종암 세포의 결합을 플로 사이토메트리법으로 측정하여, 복막 파종암 세포에 강하게 결합하는 항체를 산생하는 클론을 선발했다. 플로 사이토메트리에는 BV421 Goat Anti-Mouse Ig(Becton, Dickinson and Company사, 563846)를 이용했다.
또한, 암 항원인 EpCAM에 결합하는 항체를 제공하는 클론을 제외하기 위해서, 클론 상청에 포함되는 항체와 인간 EpCAM-Myc-DDK 발현 CHO-K1 세포의 결합을 측정했다. 인간 EpCAM-Myc-DDK 발현 CHO-K1 세포는, EPCAM(Myc-DDK-tagged)-Human epithelial cell adhesion molecule(EPCAM)(ORIGENE사, RC201989)을 CHO-K1 세포(ATCC, CCL-61)에 트랜스펙션하는 것에 의해 제작했다. 당해 세포와 클론 상청에 포함되는 항체의 결합을 플로 사이토메트리법으로 측정했다. 플로 사이토메트리에는, BV421 Goat Anti-Mouse Ig를 이용했다. EpCAM 발현 세포에 결합 활성을 나타내지 않는 상청을 제공하는 클론을 선택하기 위해서, 당해 세포에 결합하는 클론을 제외했다. 양성 컨트롤로서, CD326(EpCAM) Monoclonal Antibody(1B7)(eBioscience사, 14-9326)를 사용했다.
추가로, 복막 파종암 세포에 선택적으로 결합하는 클론을 선발하기 위해서, 배양 인간 복막 중피 세포에 결합하는 클론을 제외했다. 배양 인간 복막 중피 세포로서 Human Mesothelial Cells(Zenbio사, MES-F, Lot. MESM050311A)(이하 「배양 인간 복막 중피 세포」라고도 칭한다)를 이용하고, Mesothelial Cell Growth Medium(Zenbio사, MSO-1)에서 배양한 배양 인간 복막 중피 세포와 클론의 결합의 측정에는 플로 사이토메트리법을 이용했다. 플로 사이토메트리법에는, BV421 Goat Anti-Mouse Ig를 이용했다. 배양 인간 복막 중피 세포에 결합하지 않는 클론만을 선별했다.
상기 실험에 의해, 6종의 복막 파종암 세포 중의 5종 이상에 결합하고, 또한 인간 EpCAM 및 배양 복막 중피 세포에는 결합하지 않는 항체를 제공하는 클론으로서 3D11 클론을 취득했다.
(2) 하이브리도마 상청으로부터의 항체 정제
3D11 클론을 CD 하이브리도마 미디엄(Thermo Fisher Scientific사, 11279023)에서 배양했다. 배양 상청으로부터, MabSelectSuRe(GE 헬스케어사, 17-5438-02)를 이용하여, 3D11 항체를 정제했다(이하 「3D11」이라고 칭한다). 항체의 정제는 통상적 방법에 따랐다.
[1-4: 3D11이 인식하는 항원 분자의 동정]
(1) LC-MS/MS 측정에 의한 항원 후보 분자의 동정
3D11의 항원 후보 분자의 동정을 행했다. 본 실험에 있어서의 컨트롤 항체로서, 1D10, 10B5를 사용했다. 이들 항체는, 3D11을 취득하는 과정에서 3D11과 상이한 복막 파종암 세포에의 결합 패턴을 나타냈다.
NSC-15CF의 세포 파쇄액을 제작했다. 세포 파쇄액에, 3D11 및 컨트롤 항체 2종(1D10, 10B5) 중의 어느 1 항체를 첨가하고, 추가로 Dynabeads Protein G(Life Technologies사, 10003D)를 가하여 교반 및 세정을 행했다. Dynabeads Protein G에 결합한 단백질을 Trypsin/LysC(Promega사, V5072)를 이용해서 소화하여, 펩타이드 혼합물을 얻었다. 펩타이드 혼합물을 포함하는 용액을 UltiMate3000RSLCnano(Thermo Fisher Scientific사) 및 Orbitrap Fusion(Thermo Fisher Scientific사)을 이용한 LC-MS/MS 측정에 제공했다. 얻어진 LC-MS/MS 데이터에 대하여, Progenesis QI for Proteomics(Waters사) 및 Mascot(Matrix Science사) 소프트웨어를 이용해서 비교 정량 해석 및 펩타이드/단백질 동정을 행하여, 결합 단백질을 동정했다. 3D11과 컨트롤 항체의 결합 단백질을 비교하여, 3D11의 항원 후보 분자로서 CLDN4를 동정했다.
(2) 3D11의 항원 결정
(1)에서 동정한 CLDN4가 3D11의 항원인지 여부를 결정하기 위해서, 인간 CLDN4-Myc-DDK 발현 CHO-K1 세포에 대한 결합 실험을 행했다. 인간 CLDN4-Myc-DDK 발현 CHO-K1 세포는, CHO-K1 세포에 CLDN4(Myc-DDK-tagged)-Human claudin 4(CLDN4)(ORIGENE사, RC200490)를 트랜스펙션하는 것에 의해 제작했다. 그 결과, 3D11은 인간 CLDN4-Myc-DDK 발현 CHO-K1 세포에 결합했기 때문에, CLDN4를 항원으로서 인식하는 것이 확인되었다.
[실시예 2: 3D11의 서열 결정 및 인간 항체의 제작]
통상적 방법에 따라 3D11의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 클로닝하여, 3D11의 염기 서열 및 아미노산 서열을 결정했다. 3D11의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 2에, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 4에 나타낸다. 벨로시뮨 마우스에 의해 제작되는 항체는 내인성의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 가변 영역이 대응하는 인간 가변 영역으로 치환된 항체이다. 즉, 벨로시뮨 기술을 이용하여 얻어진 항체는, 인간 항체의 가변 영역과 마우스 항체의 정상 영역을 갖는 항체(「키메라 항체」라고도 칭한다)이다.
[참고예: 암 복막 파종 치료에 이용하는 항CLDN4-항CD3 이중특이성 항체]
암 세포에 선택적으로 발현하는 TAA에 대한 치료약으로서, 항체, 항체-약물 복합체(ADC) 항체, Chimeric Antigen Receptor T-cell Therapy(CAR-T) 등의 다양한 종류의 약제가 알려져 있다. 그 중에서도 낮은 항체 농도에서 암 세포 선택적인 세포 상해 활성을 얻을 수 있는 획기적인 방법으로서, 이중특이성 T 세포 리크루트 항체(T-cell-recruiting antibody)가 알려져 있다. 그래서, 3D11을 이용한 이중특이성 T 세포 리크루트 항체의 제작을 검토했다.
(1) 인간화 항CLDN4 항체의 제작
인간형 항CLDN4-항CD3 scFv 이중특이성 항체의 제작을 이하의 방법으로 행했다.
인간형 항CLDN4 항체 부분은, 통상적 방법에 따라 3D11의 중쇄 가변 영역에 인간 중쇄의 IgG1의 정상 영역을, 경쇄 가변 영역에 인간 경쇄 κ쇄의 정상 영역을 각각 연결하여 설계했다. 추가로 중쇄의 아미노산 번호 238 및 239(EU 인덱스: 234 및 235)의 아미노산을 각각 류신(L)으로부터 알라닌(A)으로 치환한 LALA 변이(L234A 및 L235A), 아미노산 번호 370, 372 및 411(EU 인덱스: 366, 368 및 407)의 아미노산을 각각 트레오닌(T)으로부터 세린(S), L로부터 A, 티로신(Y)으로부터 발린(V)으로 치환하는 노브즈 인투 홀즈(Knobs into holes) 변이, 및 아미노산 번호 301(EU 인덱스: 297)의 아미노산을 아스파라긴(N)으로부터 A로 치환하는 변이를 도입했다. 제작한 인간화 항CLDN4 항체를 3D11.1이라고 칭한다. 3D11.1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 통상적 방법에 따라 합성하여, pcDNA3.4 TOPO 벡터(Thermo Fisher scientific사)에 삽입했다.
(2) 항CD3 scFv의 제작
항CD3 scFv 부분은, 일본 특허 제5686953호에 기재된 마우스 항CD3 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열에 기초하여 제작했다. 항CD3 scFv의 인간화는, 문헌(Front Biosci., 2008, Vol. 13, p. 1619-1633)에 기재된 방법에 준하여 행했다. 이때에, 백 뮤테이션(back mutation)을 도입했다. 입체 구조 정보(PDB Code: 5FCS)를 MOLSIS Inc.사가 제공하는 통합 계산 화학 시스템 MOE로 해석하여, 프레임워크 영역 내의 백 뮤테이션 도입 위치를 결정했다. 인간화 항CD3 scFv의 아미노산 서열을 서열 번호 41에 나타낸다. 서열 번호 41에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 통상적 방법에 따라 합성하여, pcDNA3.1(+) 벡터(Thermo Fisher scientific사, V79020)에 삽입했다.
(3) 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체의 제작
3D11.1과 항CD3 scFv를 코딩하는 벡터를 이용해서, PCT/JP2021/41839의 실시예 7에 기재된 방법에 준하여, 항CLDN4 항체의 Fab 영역과 항CD3 항체의 scFv 영역과 Fc 영역에 의해 구성되는 이중특이성 항체를 제작했다. 제작한 이중특이성 항체를, 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체라고 칭한다.
(4) 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체의 약효 평가
항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체의 in vitro에 있어서의 redirected T cell cytotoxicity(RTCC) 활성을 PCT/JP2021/41839의 실시예 9에 기재된 방법에 준하여 측정했다. 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체가 RTCC 활성을 갖는 것을 확인했다. 또한 PCT/JP2021/41839의 실시예 11에 기재된 방법에 준하여 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체의 in vivo에 있어서의 항종양 활성을 평가했다. 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체는 위암 복막 파종 in vivo 마우스 모델에 있어서 항종양 효과를 나타냈다. 이들 결과로부터, 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체는 암의 치료에 유효한 것이 시사되었다.
추가로, 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체의 안전성에 대하여 검토를 하기 위해, 필리핀원숭이의 정맥내에 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체를 단회 투여했다. 그 결과, 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체를 투여한 원숭이에 있어서 사망예 및 빈사예가 확인되었다. 사망한 원숭이에 있어서는 투여 1시간 후 및 6시간 후, 빈사의 원숭이에 있어서는 투여 1시간 후, 6시간 후 및 24시간 후에 있어서 혈중의 IL-6 양이 현저히 증가하고 있었다. 이들 결과로부터, 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체는 in vitro 및 in vivo에 있어서 약효를 발휘하는 한편으로, 사이토카인의 증가에 의한다고 생각되는 위중한 부작용의 염려가 생겼다. 따라서, 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체는, 인간의 암의 치료에 이용하는 항체로서는 부적격이라고 판단했다.
[실시예 3: 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 제작]
3D11을 이용하여 항CD137 scFv와의 이중특이성 항체(이하 「항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체」라고 칭한다)를 제작하여, 검토를 실시했다.
[3-1. 항CD137 항체의 취득]
(1) CD137-Fc 융합 단백질의 제작
서열 번호 42의 아미노산 번호 1부터 186까지의 아미노산 서열로 이루어지는 인간 CD137 세포외 영역 또는 서열 번호 43의 아미노산 번호 1부터 186까지의 아미노산 서열로 이루어지는 원숭이 CD137 세포외 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를, 각각 pFUSE-hIgG1-Fc1 벡터(InvivoGen사, pfuse-hg1fc1)에 삽입하여, CD137의 세포외 영역과 인간 Fc의 융합 단백질(이하 각각, 「인간 CD137-인간 Fc 융합 단백질」 및 「원숭이 CD137-인간 Fc 융합 단백질」이라고 칭한다)을 코딩하는 발현용 벡터를 제작했다. 제작한 벡터를 Expi293 Expression System Kit(Thermo Fisher Scientific사, A14635) 또는 ExpiCHO Expression System Kit(Thermo Fisher Scientific사, A29133)를 이용해서 Expi293F 세포(Thermo Fisher Scientific사, A14527) 또는 ExpiCHO-S 세포(Thermo Fisher Scientific사, A29133)에 도입하여, 배양을 행했다. 배양 상청 중에 분비된 단백질을 MabSelect SuRe 또는 HiTrap MabSelect SuRe(GE 헬스케어사, 11-0034-94)를 이용해서 정제하여, 인간 CD137-인간 Fc 융합 단백질 및 원숭이 CD137-인간 Fc 융합 단백질을 취득했다.
(2) 원숭이 CD137-His 태그-3×FLAG 태그 융합 단백질의 제작
서열 번호 43의 아미노산 번호 1부터 183까지의 아미노산 서열로 이루어지는 원숭이 CD137 세포외 영역, 서열 번호 44의 His 태그, 및 서열 번호 45의 3×FLAG 태그를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 pcDNA3.4 TOPO 벡터에 탠덤으로 삽입하여 벡터를 제작했다. 제작한 벡터를, ExpiFectamine CHO Transfection Kit(Thermo Fisher Scientific사, A29129)를 이용해서 ExpiCHO-S 세포에 도입하여, 배양을 행했다. 배양 상청 중에 분비된 단백질을 HisTrap excel(GE 헬스케어 bioscience사, 17-3712-06)을 이용하여 정제했다. 얻어진 융합 단백질을 「원숭이 CD137-His 태그-3×FLAG 태그 융합 단백질」이라고 칭한다.
(3) 항CD137 항체 산생 하이브리도마 클론의 제작 및 스크리닝
벨로시뮨 마우스, 또는 AlivaMab 마우스(Ablexis사, 미국 특허 제9346873호)에, 인간 CD137-인간 Fc 융합 단백질 또는 인간 CD137-His 태그 단백질(R&D SYSTEMS사, 9220-4B)과 면역 애주번트를 수회 투여하여 면역을 행했다. 통상적 방법에 따라, 면역한 마우스의 림프절로부터 림프구를 회수하여, 마우스 미엘로마 세포 SP2/0에 세포 융합함으로써 하이브리도마를 제작했다. 자동 피킹 장치로 하이브리도마의 단콜로니를 단리하여, 모노클론화 하이브리도마 세포(이하 「클론」이라고 칭한다)를 취득했다. 각 클론을 수일간 배양하여, 배양 상청을 얻었다. 배양 상청에 포함되는 항체의 CD137에 대한 결합의 확인을 이하의 방법으로 행했다.
CD137에 대한 결합은, ELISA법으로 평가했다. 평가에는, 인간 CD137-His 태그 단백질, 인간 CD137-인간 Fc 융합 단백질, 원숭이 CD137-인간 Fc 융합 단백질 또는 인간 Fc 단백질의 어느 하나로 코팅한 플레이트를 이용하고, 이차 항체로는 Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP(SouthernBiotech사, 1030-05)를 이용했다. 상기 방법에 의해 인간 CD137 및 원숭이 CD137 모두에 결합하는 클론을 복수 취득했다.
(4) 항CD137 항체의 취득과 아고니스트 활성의 확인
(3)에서 취득한 클론을 Hybridoma-SFM(Thermo Fisher Scientific사, 12045-076)에서 배양하고, 배양 상청으로부터 MabSelect SuRe를 이용하여 항CD137 항체를 정제했다. 정제한 항CD137 항체에 대하여, CD137에의 결합 및 CD137 아고니스트 활성의 확인을 행했다.
항CD137 항체의 CD137에의 결합의 확인은, (3)에 기재한 ELISA법을 이용하여 행했다. 항CD137 항체의 CD137 아고니스트 활성의 측정은, 4-1BB Bioassay 키트(Promega사, JA2351)를 이용하여, 이하의 방법으로 행했다. FcγRIIb CHO-K1 Cells(Promega사, JA2251)를 384웰 플레이트(Greiner Bio-One사, 781080)에 파종하여, 37℃, 5% CO2에서 종야 배양했다. 배양 상청을 제거하고, 전술한 각 클론의 정제 항체와 4-1BB Effector Cells(Promega사, JA2351)를 가하고, 37℃, 5% CO2에서 6시간 정치했다. Bio-Glo Reagent(Promega사, JA2351)를 가하여, CD137 아고니스트 활성에 응답하는 루시페라아제의 발현 유도에 의한 화학 발광을 측정했다. FcγRIIb CHO-K1 Cells의 비존재하에 있어서의 CD137 아고니스트 활성을 평가하기 위해서, FcγRIIb CHO-K1 Cells 비함유 조건에서 상기와 마찬가지의 실험을 행했다.
평가를 행한 항CD137 항체 중, 벨로시뮨 마우스 유래의 3-34, 및 AlivaMab 마우스 유래의 A2-32, A2-48 및 A2-73이 인간 및 원숭이 CD137에의 강한 결합 활성을 갖고, 또한 FcγRIIb CHO-K1 Cells의 존재에 의존한 CD137 아고니스트 활성을 나타냈다.
(5) 항CD137 항체의 유전자 서열의 동정
통상적 방법에 따라, 항CD137 항체(3-34, A2-32, A2-48, A2-73)를 제공하는 클론으로부터 세포 용해액을 조제하고 cDNA를 합성하여, 항체 염기 서열을 동정했다. 동정한 염기 서열의 서열 번호를 표 1에 나타낸다.
[3-2. 항CLDN4(3D11)-항CD137(3-34) scFv 이중특이성 항체의 제작]
3D11 및 3-34의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열에 기초하여, 항CLDN4(3D11)-항CD137(3-34) scFv 이중특이성 항체(이하 「3D11_3-34-j6_S」라고도 칭한다)의 설계를 행했다. 제작한 3D11_3-34-j6_S는, 인간 IgG1κ형의 항CLDN4(3D11) 항체의 중쇄 카복시 말단(「C 말단」이라고도 칭한다)에 GS 링커가 연결되어 있고, GS 링커의 C 말단에 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137(3-34) scFv(서열 번호 26)의 아미노 말단이 결합하고 있다. 추가로, 3D11의 인간 IgG1 정상 영역에 L234A, L235A 및 P331S의 아미노산 변이를 도입했다. 설계한 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제작하여, 통상적 방법에 따라 pcDNA3.4 TOPO 벡터에 삽입했다. 상기 발현 벡터를 ExpiCHO-S 세포에 유전자 도입하고, 배양 상청으로부터 3D11_3-34-j6_S를 정제했다. 제작한 3D11_3-34-j6_S는, in vitro에서 항CD137 결합 활성 및 CD137 아고니스트 작용을 갖는 것이 확인되어, 암 치료약으로서의 유효성을 기대할 수 있는 것이 시사되었다.
[실시예 4: 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 제작]
[4-1. 인간화 항CLDN4(hKM3900) 항체의 제작]
항CLDN4 항체인 KM3900은 다른 클라우딘 패밀리 분자인 CLDN6 등에 비해 CLDN4에 선택적으로 결합하는 것이 보고되어 있다(특허문헌 1). 그래서, 보고에 기초하여 KM3900의 인간화 항체의 제작을 행했다. 구체적으로는, KM3900의 가변 영역의 인간화 아미노산 서열에 기초하여, 인간 Igγ1의 정상 영역 및 인간 Igκ의 정상 영역의 서열로부터 인간화 항체의 설계를 행했다. 인간 Igγ1 정상 영역에는, L234A, L235A, 및 P331G의 아미노산 변이, 또는 L234A, L235A, 및 P331S의 아미노산 변이를 도입했다. 통상적 방법에 따라 인간화 항CLDN4(hKM3900) 항체를 제작하여, 이후의 검토에 사용했다. L234A, L235A, 및 P331G의 아미노산 변이를 갖는 항체를 「hKM3900」이라고, L234A, L235A, 및 P331S의 아미노산 변이를 갖는 항체를 「hKM3900_S」라고 칭한다. hKM3900의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 6에, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 서열 번호 8에 기재한다.
[4-2. 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 제작]
실시예 3에서 취득한 항CD137 항체(3-34, A2-32, A2-48, A2-73)로부터 항CD137 scFv를 설계하여, hKM3900과 항CD137 scFv의 이중특이성 항체의 제작을 행했다(표 2). 제작한 항체를 총칭하여 「항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv」라고 칭한다.
(1) 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체를 코딩하는 벡터의 제작
항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체를, hKM3900의 서열 및 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역의 서열에 기초하여 설계했다. 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는, IgG1형의 항CLDN4 항체(hKM3900)의 중쇄 또는 경쇄 C 말단에 GS 링커가 연결되어 있고, GS 링커의 C 말단에 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv의 아미노 말단이 결합하고 있다. 추가로, hKM3900의 인간 IgG1 정상 영역에 L234A, L235A 및 P331G 또는 P331S의 아미노산 변이를 도입했다. 설계한 항체의 정보를 표 2에 기재한다. 설계한 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제작하여, 통상적 방법에 따라 pcDNA3.4 TOPO 벡터에 삽입했다. 제작한 벡터를 총칭하여, 「항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체 발현 벡터」라고 칭한다.
(2) 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 제작
항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체 발현 벡터를 이용하여, 표 2에 기재된 11종의 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체를 제작했다. 구체적으로는, ExpiFectamine CHO Transfection Kit를 이용해서 ExpiCHO-S 세포에 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체 발현 벡터를 도입하여, 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체를 배양 상청 중에 분비시켰다. 얻어진 배양 상청으로부터 MabSelect SuRe를 이용한 어피니티 정제법에 의해 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체를 정제했다. 추가로, 일부의 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는 HiLoad 26/600 superdex 200 pg(GE 헬스케어사, 28-9893-36) 또는 Superdex 200 Increase 10/300 GL(GE 헬스케어사, 28-9909-44)을 이용한 사이즈 배제 크로마토그래피 정제법에 의한 추가의 정제를 행했다.
이후, 실시예 3 및 4에서 제작한 항CLDN4(3D11)-항CD137(3-34) scFv 이중특이성 항체 및 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체를 총칭하여 「항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체」라고 칭하는 경우도 있다.
[실시예 5: 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 결합 활성 및 아고니스트 활성 평가]
항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 CLDN4 및 CD137에 대한 결합 활성, 및 CD137 아고니스트 활성을 평가했다.
[5-1. 플로 사이토메트리법에 의한 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 CLDN4에 대한 결합 활성 평가]
항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 CLDN4에의 결합 활성을, 플로 사이토메트리법을 이용하여 평가했다. CLDN4(Myc-DDK-tagged)-Human claudin 4로부터 조제한 CLDN4 유전자를 pCMV6-AC-GFP Mammalian Expression Vector(ORIGENE사, PS100010)에 삽입하여, 인간 CLDN4의 발현 벡터를 제작했다. 인간 CLDN4의 발현 벡터를 CHO-K1 세포에 도입하여, 인간 CLDN4 발현 CHO-K1을 취득했다.
피험 항체로서, hKM3900 및 2종류의 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체(hKM3900_tA2-32LH 및 hKM3900_3-34-j6)를 이용했다. 피험 항체를 Stain Buffer(FBS)(BD Bioscience, 554656)로 최고 농도 100μg/mL부터 5.08ng/mL까지 공비 3배로 단계 희석하고, 각각의 피험 항체 희석액으로 인간 CLDN4 발현 CHO-K1을 염색했다. 이차 항체로서, Allophycocyanin (APC) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific(Jackson ImmunoResearch, 109-136-170)을 이용했다. FACS Canto II(BD Bioscience)로 형광 강도를 측정했다. 측정 결과를 GraphPad Prism을 이용해서 해석하여, 인간 CLDN4와 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 겉보기 해리 상수(KD)를 산출했다. 표 3에 겉보기 KD의 값을 나타낸다.
2종류의 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는, 인간화 항CLDN4(hKM3900) 항체와 마찬가지의 인간 CLDN4에의 결합 활성을 나타냈다. 다른 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체도 동등한 CLDN4 결합 활성을 나타낸다고 생각된다.
[5-2. ELISA법에 의한 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 CD137에 대한 결합 활성 평가]
항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 CD137에의 결합 활성을, ELISA법을 이용하여 검출했다. ELISA는, 통상적 방법에 따라 행했다. 20ng/20μL/well의 인간 CD137-His 태그 단백질(R&D SYSTEMS, 9220-4B)을 384웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific사, 464718)에 고상화했다. 피험 항체로서 표 2에 기재된 11종의 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체 및 ctrl IgG_L-3-34-j6 항체를 이용했다. ctrl IgG_L-3-34-j6 항체는 아이소타입 컨트롤 항체의 경쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv(3-34-j6) 항체를 연결한 항체이다. 피험 항체를 5% 블로킹 원(나칼라이 테스크사, 03953-95) 함유 TBS-T(닛폰 진사, 310-07375)로 단계 희석하여, 20μL/well 첨가했다. 항체의 종농도는 도 1a∼1d에 나타내는 바와 같다. 이차 항체로는 Goat Anti-Human IgG Fc, Multi-Species SP ads-HRP(SouthernBiotech사, 2014-05)를 이용했다. 컨트롤 항체로는 hKM3900을 이용했다. Infinite M200PRO(TECAN사)를 이용하여 450nm와 570nm의 흡광도를 측정했다. 결과를 도 1a∼1d에 나타낸다. 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는 모두 농도 의존적으로 인간 CD137-His 태그 단백질에 결합했다. 이 결과로부터, 항CD137 scFv의 연결 위치는 인간 CD137에의 결합 활성에 영향을 미치지 않는 것이 분명해졌다.
[5-3. 표면 플라즈몬 공명법에 의한 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 CD137에 대한 결합 활성 평가]
항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 CD137에의 결합 활성을, 표면 플라즈몬 공명(SPR)법을 이용하여 검출했다. SPR 해석에는, Biacore T200(GE 헬스케어 재팬사)을 이용했다. 리간드로서 2종의 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체(hKM3900-3-34-j6, hKM3900_tA2-32LH)를 Series S Sensor Chip Protein A(GE 헬스케어사, 29-1275-56)에 고정한 것을 사용했다. 애널라이트로서 인간 CD137-His 태그 또는 3-1(2)에서 제작한 원숭이 CD137-His 태그-3×FLAG 태그 융합 단백질을 HBS-EP+를 이용하여 최고 농도 200nM부터 0.0977nM까지 공비 2배로 단계 희석한 것을 이용했다. 애널라이트를 리간드가 결합되어 있는 유로에 50μL/분으로 2분간 첨가한 후, HBS-EP+를 50μL/분으로 10분간 첨가하는 것에 의해, 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 CD137에의 결합과 해리를 측정했다. 이 실험에 의해 얻어진 결과를 이용하여 인간 CD137과 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 결합 속도 상수(ka), 해리 속도 상수(kd), 및 해리 상수(KD)를, 데이터 해석 소프트웨어(BIA Evaluation)를 이용하여 계산했다. 표 4에 ka, kd 및 KD의 값을 나타낸다.
이 결과, 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는 인간 CD137 및 원숭이 CD137 항체 모두에 동등한 결합 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.
[5-4. 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 CLDN4 발현 암 세포의 공존하에서의 CD137 아고니스트 활성의 평가]
항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 CLDN4 발현 암 세포를 통한 특이적인 CD137 아고니스트 활성을 4-1BB Bioassay 키트를 이용하여 평가했다.
10% FBS(Cytiva사, SH30070.03) 함유 RPMI-1640 배지(Thermo Fisher Scientific사, 11875-093)에 NCI-H322 세포(ECACC, 95111734)를 현탁하여, 현탁액을 조제했다. NCI-H322는 CLDN4를 발현하고 있다. 384웰 플레이트(Greiner Bio-One사, 781080)에 NCI-H322의 현탁액을 1×104개/well이 되도록 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 종야 배양했다. 다음날, 배지를 제거했다. 1% FBS 함유 RPMI-1640 배지로 희석한 피험 항체를 12.5μL/well씩 첨가했다. 항체의 종농도는 도 2a∼도 2c에 나타내는 바와 같다. 피험 항체로는, 3D11_3-34-j6_S, 표 2에 기재된 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체를 이용했다. 컨트롤 항체로서, hKM3900, ctrl IgG_L-3-34-j6 항체 및 우렐루맙(BMS, 국제 공개 번호 2005/035584호에 기재되는 서열 번호 3 및 서열 번호 6)을 이용했다.
4-1BB Bioassay 키트에 부속되어 있는 4-1BB Effector Cells의 바이알 1개에 대해 7mL의 1% FBS 함유 RPMI-1640에 현탁하여, 각 웰에 12.5μL씩 가하고, 37℃, 5% CO2에서 6시간 정치했다. 플레이트에 Bio-Glo Reagent를 25μL/well 가하고, EnVision 2103(Perkin Elmer사)을 이용하여 화학 발광을 측정했다. 결과를 도 2a∼도 2c에 나타낸다. 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체는, CLDN4 발현 암 세포의 공존하에서 4-1BB Effector Cells에 대한 현저한 CD137 아고니스트 활성을 나타냈다.
CLDN4 발현 암 세포의 비존재하에 있어서의 CD137 아고니스트 활성을 평가하기 위해서, NCI-H322 비존재 조건에서 상기와 같은 실험을 행했다. 그 결과, CLDN4 발현 암 세포의 비존재하에서는 CD137 아고니스트 활성을 나타내지 않았다(도 2d∼도 2f). 이 결과로부터, 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체는 CLDN4 발현 암 세포가 공존하는 경우에만 CD137 아고니스트 작용을 발휘하는 것이 나타났다.
한편, 우렐루맙은 CLDN4 발현 암 세포의 공존하에서 CD137 아고니스트 활성을 나타냈지만, 그 작용은 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 비하면 약했다. 또한, 우렐루맙은 CLDN4 발현 암 세포의 비존재하에서도 CD137 아고니스트 활성을 나타냈다.
이들 결과로부터, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는 우렐루맙보다 독성의 염려가 낮으며, CLDN4가 고발현하고 있는 종양 조직에서 특이적이고 또한 강력한 CD137 아고니스트 작용을 나타낸다고 기대할 수 있다.
[실시예 6: 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 in vitro 약효 평가]
항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 인터페론-γ 산생 촉진 기능 및 암 세포 상해 활성의 평가를 실시했다.
[6-1. Expanded Pan T 세포의 제작 및 동결 보존]
(1) Expanded Pan T 세포의 조제
실시예 6에 있어서, RPMI-1640(Sigma사, R8758)에 종농도 10%의 FBS(Cytiva사, SH30084.03)와, 종농도 1%의 페니실린 스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific사, 15070-063)을 가한 것을 「배양 배지」라고 칭한다. 배양 배지에는 각각 종농도 1%로 MEM Non-essential Amino Acid(Merck사, M7145), Sodium pyruvate(Merck사, S8636), GlutaMAX I(Thermo Fisher Scientific사, 35050-061), HEPES(Thermo Fisher Scientific사, 15630-080)를 가하는 경우도 있다. 종농도 1-3μg/mL가 되도록 희석한 항CD3 항체(BioLegend사, 317325)를 디시에 첨가하여, 항CD3 항체를 고상화했다. Pan T Cell Isolation Kit, human(Miltenyi Biotec사, 130-096-535)을 이용하여, 메이커 추장 프로토콜에 따라 인간 말초혈 단핵 세포(human peripheral blood mononuclear cells)(LONZA사, CC-2702)로부터 Pan T 세포(CD4T 세포 및 CD8T 세포의 양쪽을 포함한다, 이하 「Pan T 세포」라고 칭한다)를 단리했다. 단리한 Pan T 세포를 원심 분리하고, 상청을 제거한 후에 배양 배지에 현탁했다. 전술한 항CD3 항체를 고상화한 디시에, 배양 배지에 현탁한 Pan T 세포를 전량 파종했다. 추가로 종농도 100-200U/mL의 인간 IL-2(PeproTech사, 200-2) 및 종농도 1-4μg/mL의 항CD28 항체(BioLegend사, 302923)를 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양을 행했다. 3일 후에 세포를 회수하고, 회수한 세포를 배양 배지에 현탁하여 디시에 파종했다. 추가로 종농도 100-200U/mL의 인간 IL-2를 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양을 행했다. 4일 후, 세포를 전량 회수하여 원심 분리하고, 상청을 제거한 후에 셀 뱅커(Takara사, CB011) 또는 밤뱅커(GS 림포테크사, CS-02-001)에 재현탁하고, 튜브에 분취하여 -80℃에서 동결 보존했다. 여기에서 동결 보존한 세포를, 본 명세서에 있어서 「Expanded Pan T 세포」라고 칭한다.
[6-2. 60As6-Luc/GFP 발현 세포의 제작]
Luc/GFP를 포함하는 렌티바이러스 용액의 조제는, L293T 세포(Thermo Fisher Scientific사, K4975-00)를 이용하여, 통상적 방법에 따라 실시했다. L293T 세포에의 pCDH-CMV-GL3-EF1a-GFP-T2A-puro 개변 벡터(히로시마대학 의계과학연구과 세포분자생물학연구실 다카하시 료우우 준교수로부터 기증(PLoS One, 2015, Vol. 10, e0123407))의 도입에는, Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement(Thermo Fisher Scientific사, 51985-034), MISSION(등록상표) Lentiviral Packaging Mix(SIGMA사, SHP001), Lipofectamin LTX(Thermo Fisher Scientific사, 15338100)를 사용했다. L293T 세포에서 증식한 GFP 발현 렌티바이러스의 회수에는, 45μm Millex(등록상표)-HV 필터(Merck Millipore사, SLHV033RS)를 사용했다. 바이러스 용액은 크라이오바이알(Nalgene사, 5000-0020)에 1mL씩 분주하여, -80℃에서 동결 보존했다.
통상적 방법에 따라, 60As6-Luc/GFP 발현 렌티바이러스를 CLDN4 발현 암 세포주인 60As6 세포(바이오머티리얼 연구소 야나기하라 가즈요시 선생으로부터 양수)에 감염시켜, 60As6-Luc/GFP 발현 세포를 제작했다. 감염 효율을 높이기 위해서 Polybrene(SantaCruz사, sc-134220)을 이용했다. 배지로서, 10% FBS, 2μg/mL Puromaycin(Thermo Fisher Scientific사, A-11138-02) 포함하는 RPMI-1640을 사용했다. 본 명세서에 있어서, 수립한 세포를, 「60As6-Luc/GFP 세포」라고 칭한다. 60As6-Luc/GFP 세포는 내인성으로 CLDN4가 고발현하고 있는 것을 플로 사이토메트리법에 의해 확인했다. 구축한 세포는 후의 실험에서 사용했다.
[6-3. 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 암 세포와 T 세포의 공배양계에 있어서의 인터페론-γ 산생 촉진 기능 평가]
60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded Pan T 세포의 공배양계에 있어서의 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 인터페론-γ 산생 촉진 기능을 평가했다. 0.1μg/100μL/well의 항CD3 항체를 평저 96웰 플레이트(IWAKI사, 3860-096)에 첨가하여 항CD3 항체를 플레이트에 고상화했다. 플레이트에 60As6-Luc/GFP 세포를 5×104개/50μL/well이 되도록 파종하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양했다. 다음날, 상기 플레이트에, 2×104개/30μL/well의 Expanded Pan T 세포를 파종했다. 피험 항체 및 아이소타입 컨트롤을 배양 배지로 최고 농도 50000ng/mL부터 5배 공비로 단계 희석하고, 20μL씩 첨가했다. 피험 항체로서 우렐루맙 및 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체(3D11_3-34-j6_S)를, 아이소타입 컨트롤로서 IgG(리소자임)-scFv(CD137)(사내 조제)를 이용했다. 6일 후, AlphaLISA 인터페론-γ 측정 키트(Perkin Elmer사, AL217C)를 이용하여 메이커 추장 프로토콜에 따라 상청 중의 인터페론-γ 산생량을 측정했다. 도 3a에 인터페론-γ 산생량과 항체 농도의 반응 곡선을 나타낸다. 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는 CLDN4 발현 암 세포주인 60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded Pan T 세포의 공배양계에 있어서 인터페론-γ 산생 촉진 작용을 나타냈다. 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 인터페론-γ 산생 촉진 기능은 우렐루맙보다 현저히 강했다.
[6-4. 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 암 세포와 T 세포의 공배양계에 있어서의 인터페론-γ 산생 촉진 기능 평가]
60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded Pan T 세포의 공배양계에 있어서의 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 인터페론-γ 산생 촉진 기능을 6-3과 마찬가지의 방법으로 평가했다. 항CD3 항체는 0.03μg/100μL/well이 되도록 96웰 플레이트에 고상화했다. 60As6-Luc/GFP 세포를 2×104개/50μL/well로 파종했다. 또한 Expanded Pan T 세포는 8×104개/30μL/well로 파종했다. 피험 항체로서, 최고 농도 5000ng/mL부터 2배 공비로 단계 희석한 우렐루맙 또는 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체(hKM3900_3-34-j6 또는 hKM3900_tA2-32LH)를 사용했다. 피험 항체 및 아이소타입 컨트롤(리소자임 항체)을 각각 20μL씩 첨가했다. 4일 후에 상청 중의 인터페론-γ 산생량을 측정했다. 도 3b에 인터페론-γ 산생량과 항체 농도의 반응 곡선을 나타낸다. 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는 60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded Pan T 세포의 공배양계에 있어서 인터페론-γ 산생 촉진 기능을 나타냈다. 이들 이중특이성 항체의 인터페론-γ 산생 촉진 기능은 우렐루맙보다 현저히 강했다.
[6-5. 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 T 세포의 단배양계에 있어서의 인터페론-γ 산생 촉진 기능 평가]
Expanded Pan T 세포의 단배양계에 있어서의 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 인터페론-γ 산생 촉진 기능을 평가했다. 평저 96웰 플레이트에 항CD3 항체를 0.1μg/100μL/well로 첨가하여 항CD3 항체를 플레이트에 고상화했다. 고상화한 플레이트에 2×105개/80μL/well의 Expanded Pan T 세포를 파종했다. 피험 항체로서 우렐루맙, 항CLDN4(3D11)-항CD3 scFv 이중특이성 항체(3D11_3-34-j6_S)를, 아이소타입 컨트롤로서 IgG(리소자임)-scFv(CD137)(사내 조제)를 이용했다. 피험 항체 및 아이소타입 컨트롤을 배양 배지로 최고 농도 50000ng/mL부터 5배 공비로 단계 희석하고, 20μL씩 첨가했다. 6일 후, AlphaLISA 인터페론-γ 측정 키트를 이용하여, 6-3과 마찬가지의 방법으로 상청 중의 인터페론-γ 산생량을 측정했다. 도 3c에 인터페론-γ 산생량과 항체 농도의 반응 곡선을 나타낸다. 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는, T 세포의 단배양계에 있어서는 인터페론-γ 산생 촉진 기능을 나타내지 않았지만, 우렐루맙은 인터페론-γ 산생 촉진 작용을 나타냈다. 본 결과는, CLDN4 발현 암 세포주가 존재하지 않는 환경에서는 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는 T 세포 활성 증강 작용을 나타내지 않는 것을 의미한다.
[6-6. 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 T 세포의 단배양계에 있어서의 인터페론-γ 산생 촉진 기능 평가]
Expanded Pan T 세포의 단배양계에 있어서의 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 인터페론-γ 산생 촉진 기능을 6-5와 마찬가지의 방법으로 평가했다. 항CD3 항체는 0.03μg/100μL/well이 되도록 96웰 플레이트에 고상화했다. Expanded Pan T 세포를 8×104개/80μL/well 파종했다. 피험 항체로서 우렐루맙, 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체(hKM3900_3-34-j6, hKM3900_tA2-32LH)를 이용했다. 피험 항체 및 아이소타입 컨트롤(리소자임 항체)은 최고 농도 5000ng/mL부터 2배 공비로 단계 희석하고, 20μL씩 첨가했다. 도 3d에 인터페론-γ 산생과 항체 농도의 반응 곡선을 나타낸다. 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는, T 세포의 단배양계에 있어서는 인터페론-γ 산생 촉진 기능을 나타내지 않았지만, 우렐루맙은 인터페론-γ 산생 촉진 기능을 나타냈다.
6-5 및 6-6의 결과로부터, CLDN4 발현 암 세포주가 존재하지 않는 환경에서는 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체는 T 세포 활성 증강 작용을 나타내지 않는 것을 의미하여, 항CD137 항체의 부작용으로서 보고되어 있는 전신적인 면역 부활화(賦活化) 작용이 저감될 가능성을 시사한다.
[6-7. 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 암 세포와 T 세포의 공배양계에 있어서의 암 세포 상해 활성 평가]
60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded Pan T 세포의 공배양계에서 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 암 세포 상해 활성(암 세포의 증식 억제 작용)을 평가했다. 60As6-Luc/GFP 세포를 평저 96웰 플레이트에 1×104개/50μL/well씩 파종하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양했다. 2시간 후, 상기 96웰 플레이트에 Expanded pan T 세포를 1×105개/50μL/well씩 파종했다. 피험 항체로서, 우렐루맙 및 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체를 이용했다. 이들 항체를 배양 배지로 최고 농도 40000ng/mL부터 10배 공비로 단계 희석하고, 50μL씩 첨가했다. 추가로, 40ng/mL의 항CD3 항체를 50μL씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 내의 IncuCyte(등록상표) ZOOM(자르토리우스사)을 이용하여, 각 웰의 형광(GFP) 면적의 측정을 개시했다. 측정 개시 0시간부터 증가한 형광 면적을 세포 증식의 지표로 했다. 도 4에 피험 항체의 암 세포 상해 작용(암 세포 증식률)을 나타낸다. 도 4의 세로축은, 0시간부터 168시간에 증가한 형광 면적에 있어서 피험 항체 비첨가 웰을 100%로 했을 때의 상대치를 나타낸다. 도 4에 나타내는 바와 같이, 항CLDN4(3D11)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는 60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded Pan T 세포의 공배양계에 있어서 세포 상해 작용을 나타냈다. 본 이중특이성 항체의 세포 상해 활성은 우렐루맙보다 현저히 강했다.
[6-8. 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 암 세포와 T 세포의 공배양계에 있어서의 암 세포 상해 활성 평가]
항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 암 세포 살상 작용을 60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded Pan T 세포의 공배양계에서 평가했다. 항CD3 항체를 평저 96웰 플레이트(Perkin Elmer사, 6005680)에 1ng/100μL/well씩 첨가하여, 플레이트에 고정화했다. 플레이트를 PBS(-)로 2번 세정한 후에, 2×104개/50μL/well의 60As6-Luc/GFP 세포를 파종하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양했다. 다음날, 96웰 플레이트에, 4.0×104개/30μL/well의 Expanded Pan T 세포를 파종했다. 추가로, 5000ng/mL 내지 0.844ng/mL의 농도의 피험 항체 및 아이소타입 컨트롤을 20μL씩 첨가했다. 피험 항체로는, 우렐루맙 및 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체(hKM3900_3-34-j6, hKM3900_tA2-32LH)를 사용했다. 6일 후에 측정을 행했다. 일부의 웰에 대하여, 세포를 살상하기 위해서, 측정 30분 전에 1% Triton-X100(Sigma-Aldrich사, T-9284)을 11μL씩 첨가했다. ONE-Glo 루시페라아제 측정 키트(Promega사, E6120)를 이용하여, 메이커 추장 프로토콜에 따라, 각 웰의 60As6-Luc/GFP 세포의 루시페라아제 활성을 ARVO X-3(Perkin Elmer사)을 이용하여 측정했다. 암 살상률은, 항체 비첨가 웰의 루시페라아제 화학 발광의 평균치를 0%, Triton-X100을 첨가한 웰의 평균치를 100%로 했을 때의 상대치로 나타낸다. 아이소타입 컨트롤로서 항리소자임 항체(사내 조제)를 이용했다. 도 5에 60As6-Luc/GFP 세포의 세포 살상률 곡선을 나타낸다. 60As6-Luc/GFP 세포와 Expanded Pan T 세포의 공배양계에 있어서 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 첨가에 의해 60As6-Luc/GFP 세포 살상률이 현저히 증가했다. 한편, 항CD137 특이성 항체인 우렐루맙에 의한 60As6-Luc/GFP 세포주에 대한 세포 살상률의 증가는 보이지 않았다.
[실시예 7: 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 in vivo 평가]
[7-1. 항CLDN4-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 in vivo 항종양 효과]
NCI-H322 세포를 PBS(-)(WAKO사, 045-29795)에 현탁하고, 5.0×106세포/100μL의 세포 현탁액을 7주령의 자성 마우스(NOG, 인비보 사이언스사)의 피하에 접종했다. 접종 6일 후, 3.4×106세포/200μL의 인간 말초혈 단핵 세포(Lonza, CC-2702)를 꼬리 정맥으로부터 주입했다. 인간 말초혈 단핵 세포 이식 15일 후에 군 나누기를 행하여 피험 항체의 투여를 개시했다. 1군은 10마리씩으로 하고, 각 군 간의 종양 체적이 거의 동등해지도록 마우스를 분배했다(day 0). 피험 항체로서 hKM3900_tA2-32LH를 이용했다. 피험 항체 및 아이소타입 컨트롤(항리소자임 항체)은 PBS에 혼합하여 정맥내에 투여했다. 투여는 day 0, 4 및 8에 행하고, 투여 시에 종양 직경 및 체중을 측정했다. 종양 체적의 산출에는 이하의 식을 이용했다.
[종양 체적(mm3)] = [종양의 장경(mm)] x [종양의 단경(mm)]2 × 0.5
도 6에 나타내는 바와 같이, hKM3900_tA2-32LH를 0.1, 1 또는 10mg/kg 투여한 군에 있어서는, 유의한 종양 체적 축소 작용이 나타났다. 세로축은 종양 체적을, 가로축은 초회 투여 후 일수를 나타낸다. 실선 및 파선은 각 군의 종양 체적의 평균치의 추이를, 에러 바는 평균치의 표준 오차를 나타낸다. 유의 확률 P값(*: P<0.05, **: P<0.01)은, 던네트의 다중 비교 검정에 의해, 아이소타입 컨트롤 투여군과 hKM3900_tA2-32LH 투여군의 12일째의 종양 체적을 비교하는 것에 의해 산출했다. hKM3900_tA2-32LH 0.1mg/kg 투여군의 12일째의 예 수는 9였다.
[7-2. 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체의 필리핀원숭이에 있어서의 안전성 시험]
항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체(hKM3900_3-34-j6 및 hKM3900_tA2-32LH)의 안전성을 검토하기 위해, 필리핀원숭이의 정맥내에 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체를 단회 투여했다. 그 결과, 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체를 투여한 원숭이에 있어서, 혈청 중의 IL-6, TNF-α 등의 사이토카인 농도에 특단의 이상은 확인되지 않았다. 따라서, 항CLDN4(hKM3900)-항CD137 scFv 이중특이성 항체는, 안전성의 관점에 있어서, 암의 치료에 이용하는 항체로서 적격이라는 판단을 행했다.
[실시예 8: 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체에 의한 암의 치료]
[8-1. CLDN4의 발현량의 확인]
CLDN4의 암 치료 표적으로서의 범용성을 조사하기 위해서, The Cancer Genome Atlas(TCGA)로, 암 조직에 있어서의 CLDN4의 RNA의 발현량을 조사했다. 그 결과, 대장암, 방광암, 폐암 등의 암 조직에서 CLDN4의 발현이 항진하고 있는 것이 확인되었다. 이에 의해, CLDN4는 복막 파종암뿐만 아니라 다른 암종에 있어서도 치료 표적이 될 가능성이 시사되었다. 추가로 The Genotype-Tissue Expression(GTEx)으로, 정상 조직에 있어서의 CLDN4의 RNA의 발현량의 조사를 행했다. 그 결과, 몇몇의 정상 조직에 있어서 CLDN4가 발현하고 있는 것이 인정되었다. 그러나, 정상 조직에 있어서는 암 조직보다도 CLDN4의 발현량이 낮았다. 따라서, CLDN4를 치료 표적으로 하는 암 치료약은, 넓은 안전역을 확보할 수 있어, 부작용의 염려가 낮은 치료약이 될 가능성이 있는 것이 시사되었다.
본 발명의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체는, 암의 치료에 유용할 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터, 형질 전환된 숙주 세포, 및 항체를 생산하는 방법은, 상기 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체를 산생하기 위해서 유용하다.
이하의 서열목록의 숫자 표제 <223>에는, 「Artificial Sequence」의 설명을 기재한다. 구체적으로는, 서열목록의 서열 번호 1은 3D11의 중쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 2는 3D11의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 3은 3D11의 경쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 4는 3D11의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 5는 hKM3900의 중쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 6은 hKM3900의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 7은 hKM3900의 경쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 8은 hKM3900의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 9는 3-34의 중쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 10은 3-34의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 11은 3-34의 경쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 12는 3-34의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 13은 A2-32의 중쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 14는 A2-32의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 15는 A2-32의 경쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 16은 A2-32의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 17은 A2-48의 중쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 18은 A2-48의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 19는 A2-48의 경쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 20은 A2-48의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 21은 A2-73의 중쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 22는 A2-73의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 23은 A2-73의 경쇄 가변 영역의 염기 서열이고, 서열 번호 24는 A2-73의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열이다. 서열 번호 25는 3-34-j6 scFv의 염기 서열이고, 서열 번호 26은 3-34-j6 scFv의 아미노산 서열이다. 서열 번호 27은 tA2-32 scFv의 염기 서열이고, 서열 번호 28은 tA2-32 scFv의 아미노산 서열이다. 서열 번호 29는 tA2-32LH scFv의 염기 서열이고, 서열 번호 30은 tA2-32LH scFv의 아미노산 서열이다. 서열 번호 31은 tA2-48 scFv의 염기 서열이고, 서열 번호 32는 tA2-48 scFv의 아미노산 서열이다. 서열 번호 33은 tA2-73 scFv의 염기 서열이고, 서열 번호 34는 tA2-73 scFv의 아미노산 서열이다. 서열 번호 35는 hKM3900_3-34-j6의 중쇄의 염기 서열이고, 서열 번호 36은 hKM3900_3-34-j6의 중쇄의 아미노산 서열이다. 서열 번호 37은 hKM3900_tA2-32LH의 중쇄의 염기 서열이고, 서열 번호 38은 hKM3900_tA2-32LH의 중쇄의 아미노산 서열이다. 서열 번호 39는 hKM3900의 경쇄의 염기 서열이고, 서열 번호 40은 hKM3900의 경쇄의 아미노산 서열이다. 서열 번호 41은 항CD3 scFv-인간 Fc 융합 단백질의 아미노산 서열이다. 서열 번호 42는 인간 CD137의 아미노산 서열이다. 서열 번호 43은 원숭이 CD137의 아미노산 서열이다. 서열 번호 44는 His 태그 단백질의 아미노산 서열이다. 서열 번호 45는 3×FLAG 태그의 아미노산 서열이다. 서열 번호 46∼54는 GS 링커의 아미노산 서열이다. 서열 번호 55는 GKPGS 링커의 아미노산 서열이다.
SEQUENCE LISTING <110> Astellas Pharma Inc. NATIONAL CANCER CENTER <120> anti-CLDN4-anti-CD137 bispecific antibody <130> FA1535-21350 <150> JP2021-72429 <151> 2021-04-22 <160> 55 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 375 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D11 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(375) <400> 1 cag gtt cag ttg gga cag tct ggc ccc gaa gtg aag aaa cct ggc gcc 48 Gln Val Gln Leu Gly Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tct gtg aag gtg tcc tgc aag gct tcc ggc tac tcc ttt atc tcc tac 96 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr 20 25 30 ggc atc tcc tgg gtc cga cag gct cct gga caa ggc ttg gaa tgg atg 144 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 ggc tgg tcc tcc gtg tac aac ggc aac acc aac tac gtg cag aaa ttc 192 Gly Trp Ser Ser Val Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Val Gln Lys Phe 50 55 60 cag ggc aga gtg acc atg acc acc gac acc tct gcc tcc acc gcc tac 240 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctg cgg tcc ctg aga tct gat gac gcc gcc gtg tac tac tgc 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc aga gac tct tac tcc tcc ggc tgg tct tac tac tac tcc ggc atg 336 Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Trp Ser Tyr Tyr Tyr Ser Gly Met 100 105 110 gat gtg tgg ggc cag ggc aca aca gtg acc gtg tcc tcc 375 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 2 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Gln Val Gln Leu Gly Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ile Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ser Ser Val Tyr Asn Gly Asn Thr Asn Tyr Val Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Trp Ser Tyr Tyr Tyr Ser Gly Met 100 105 110 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Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 tac tct ttt ggc cag ggc acc aag ctg gaa atc aag cgg 327 Tyr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Tyr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 369 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hKM3900 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(369) <400> 5 gaa gtg cag ctg gtt cag tct ggc gcc gaa gtg aag aaa cct ggc gcc 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 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Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 9 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-34 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 9 cag gtc cag ctg cag cag tct gag gct gag ctg gtg agg cct ggg gcc 48 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag att tcc tgc aag gct ttt ggc tac acc ttc aca aac cat 96 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His 20 25 30 cat ata aac tgg gtg aag cag agg cct gga cag ggc ctg gac tgg att 144 His Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 gga tat att aat cct tat aat gat tat act acc ttc aac cgg aag ttc 192 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Thr Phe Asn Arg Lys Phe 50 55 60 aag gac aag gcc aca ttg act gta cac aaa tcc tcc agc aca gcc tat 240 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val His Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gag ctt agc ggc ctg aca tct gac gac tct gca gtc tat tac tgt 288 Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aga acc tgg ggt cac tgg tat ttc gat ctc tgg ggc cgt ggc acc 336 Ala Arg Thr Trp Gly His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 gtg gtc act gtc tcc tca 354 Val Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Glu Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His 20 25 30 His Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Thr Phe Asn Arg Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val His Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Gly Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Trp Gly His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Val Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 327 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3-34 VL <220> <221> CDS <222> (1)..(327) <400> 11 gaa ata gtg atg acg cag tct cca gcc acc ctg tct gtg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc acc ctc tcc tgt agg gcc agt cag agt gtt agc agc aac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 tta gcc tgg tac cag cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 tat gat tca tcc acc agg gcc act ggt atc cca gcc agg ttc agt ggc 192 Tyr Asp Ser Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag tct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt cag cag tat aat aac tgg cct ccg 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro 85 90 95 tgg acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa cgg 327 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 12 Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 13 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A2-32 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(354) <400> 13 cag gtg cag ctg cag gaa tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggc ggc tcc atc agt ggt tat 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 tac tgg agc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag ggc ctg gag tgg att 144 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga tat atc tat tac agt gga ttc acc aac tac aac ccc tcc ctc aag 192 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 agt cga gtc acc ata tca gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg 240 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 aaa ctg agc tct gtg acc gct gcg gac acg gcc gtg tat tat tgt acg 288 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 aga gat cac tcc cac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc 336 Arg Asp His Ser His Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 acg gtc acc gtc tcc tca 354 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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tgg tac cag cag ttc cca gga acg gcc ccc aaa ctc ctc 144 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tat agt aat aat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc tct 192 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc agt ggg ctc cag 240 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 tct gag gat gag gct gat tat tac tgt gca gga tgg gat gac agc ctg 288 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Gly Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 aat ggt ccg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt 333 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 16 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 16 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 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tca gta gac acg tcc cag aac cag ttc tcc ctg 240 Ser Arg Val Asn Ile Ser Val Asp Thr Ser Gln Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 aag ctg aat tct ctg acc gct gcg gac acg gcc gtt tat tac tgt gcg 288 Lys Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 aga aca cac tcc tat tac tac ggt atg gac gtc tgg ggc caa ggg acc 336 Arg Thr His Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 acg gtc acc gtc tcc tca 354 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 18 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Asn Ile Ser Val Asp Thr Ser Gln Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 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Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 aat ggt ccg gta ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta ggt 333 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 20 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ala Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 21 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A2-73 VH <220> <221> CDS <222> (1)..(363) <400> 21 cag gtg cag ctg cag gag tcg ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag 48 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agt agt tac 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 tac tgg acc tgg atc cgg cag ccc cca ggg aag gga ctg gaa ttg gtt 144 Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Leu Val 35 40 45 gga tat atc tat tac agt ggt tac acc agc tac aac ccc tcc ctc aag 192 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 agt cga gtc acc ata tca att gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg 240 Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 cag ctg aac tct gtg acc gct gcg gac acg gcc gtg tat ttc tgt gcg 288 Gln Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 cga gat gac tat ggt ggt aac ggc tac tac ggt gtg gac gtc tgg ggc 336 Arg Asp Asp Tyr Gly Gly Asn Gly Tyr Tyr Gly Val Asp Val Trp Gly 100 105 110 caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 363 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 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Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Tyr Thr Thr Phe Asn Asp Lys Phe 50 55 60 aag gac cgg ttc acc ctg tcc gtg gat aag tcc aag agc acc gct tac 240 Lys Asp Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 ctg cag atg aac tcc ctg aga gcc gag gat aca gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc cgg acc tgg ggc cac tgg tac ttt gat ttg tgg ggc cag gga acc 336 Ala Arg Thr Trp Gly His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 ctc gtg aca gtc tct tct ggc ggc gga gga agc gga ggc gga ggt tca 384 Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 ggc ggc ggt gga tct aac atc cag atg acc cag tct cca tcc agc ctg 432 Gly Gly Gly Gly Ser Asn Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu 130 135 140 tct gcc tct gtg ggc gac aga gtg aca att acc tgt cgg gcc tct cag 480 Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln 145 150 155 160 tcc gtg tcc agc aat ctg gct tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gct 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Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 acc gtg aca gtc tct tca ggc ggt ggt gga tca ggc ggc gga gga agt 384 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 ggt ggc gga ggt tct cag tct gtg ctg acc caa cct cct tcc gct tct 432 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser 130 135 140 ggc aca cct ggc cag aga gtg aca atc tct tgc tcc ggc tcc tcc tcc 480 Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 aac atc ggc tct aac acc gtg aac tgg tat cag cag ttc ccc ggc acc 528 Asn Ile Gly Ser Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr 165 170 175 gct cct aag ctg ctg atc tac tcc aac aac cag cgg cct tcc ggc gtg 576 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val 180 185 190 ccc gat aga ttc tct ggc tct aag tcc ggc acc tct gcc agc ctg gct 624 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala 195 200 205 att tct gga ctg cag agc gag gac gag gcc gac tat tat tgt gcc ggc 672 Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Gly 210 215 220 tgg gac gac tct ctg aac ggc cct gtt ttt ggc tgc ggc acc aaa ctg 720 Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 act gtg ctg ggc 732 Thr Val Leu Gly <210> 28 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 28 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr 85 90 95 Arg Asp His Ser His Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser 130 135 140 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Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tac tcc aac aac cag cgg cct tcc ggc gtg ccc gat aga ttc tct 192 Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc tct aag tcc ggc acc tct gcc agc ctg gct att tct gga ctg cag 240 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 agc gag gac gag gcc gac tat tat tgt gcc ggc tgg gac gac tct ctg 288 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Gly Trp Asp Asp Ser Leu 85 90 95 aac ggc cct gtt ttt ggc ggt ggc acc aaa ctg aca gtg ctt gga ggc 336 Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly 100 105 110 ggt ggt gga tca ggc ggc ggt gga agt ggt ggt ggt ggt agc gga ggt 384 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 ggt gga tct cag gtg cag ctc caa gag tct gga cct ggc ctc gtg aag 432 Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys 130 135 140 cct tcc gag aca ctg tct ctg acc tgc aca gtg tcc ggc ggc tct atc 480 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile 145 150 155 160 tct ggc tac tac tgg tcc tgg atc aga cag cct cct ggc aag gga ctc 528 Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 gag tgg atc ggc tac atc tac tac tct ggc ttc acc aac tac aac ccc 576 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Pro 180 185 190 agc ctg aag tcc cgc gtg acc atc agc gtg gac acc tct aag aac cag 624 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 195 200 205 ttc tct ctg aag ctg tcc tcc gtg acc gcc gct gat acc gct gtg tat 672 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 210 215 220 tac tgc acc cgg gac cac agc cac tac tac tac atg gac gtg tgg gga 720 Tyr Cys Thr Arg Asp His Ser His Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly 225 230 235 240 cag gga aca acc gtg aca gtg tcc tcc 747 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 30 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 30 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 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288 Lys Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 cgg acc cac agc tac tac tat ggc atg gac gtg tgg gga caa ggg aca 336 Arg Thr His Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 acc gtg aca gtc tct tca ggc ggt ggt gga tca ggc ggc gga gga agt 384 Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 ggt ggc gga ggt tct cag tct gtg ctg acc caa cct cct tcc gct tct 432 Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser 130 135 140 ggc aca cct ggc cag aga gtg acc atc agc tgt agc ggc tcc tcc tcc 480 Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser 145 150 155 160 aac atc ggc aac aac ccc gtg aac tgg tat cag cag ttc ccc ggc aca 528 Asn Ile Gly Asn Asn Pro Val Asn Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr 165 170 175 gcc cct aag ctg ctg atc tac tcc aac aac cag cgg cct tcc ggc gtg 576 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val 180 185 190 ccc gat aga ttc tct ggc tct aag tcc ggc acc tct gcc agc ctg gct 624 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala 195 200 205 att tct gga ctg cag agc gag gac gag gcc gac tac tat tgc gag gct 672 Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Glu Ala 210 215 220 tgg gac gac tct ctg aac ggc cct gtg ttt ggc tgt ggc acc aaa ctg 720 Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Pro Val Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu 225 230 235 240 act gtg ctg ggc 732 Thr Val Leu Gly <210> 32 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 32 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Asn Ile Ser Val Asp Thr Ser Gln Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Thr His Ser Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 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Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro 130 135 140 tct gcc tct ggc aca cct ggc cag aga gtg aca atc tct tgc tcc ggc 480 Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly 145 150 155 160 tcc tcc tcc aac atc ggc aac aac ccc gtg aac tgg tac aga cag ctg 528 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn Pro Val Asn Trp Tyr Arg Gln Leu 165 170 175 cca ggc aca gcc cct aag ctg ctg atc tac tcc aac aac cag cgg cct 576 Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asn Asn Gln Arg Pro 180 185 190 tcc ggc gtg ccc gat aga ttc tct gga tct aag tcc ggc acc agc gcc 624 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala 195 200 205 agc ctg gct att tct gga ctg cag agc gag gac gag gcc gac tac tac 672 Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 210 215 220 tgt gcc gct tgg gac gat tct ctg aac gga tgg gtg ttc ggc tgc ggc 720 Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Trp Val Phe Gly Cys Gly 225 230 235 240 acc aaa ctg act gtg ctg gga 741 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 245 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acc tcc acc gcc tac 240 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 atg gaa ctg cgg agc ctg aga tct gag gac acc gcc gtg tac tac tgc 288 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 gcc aga cct cac tac tac tac gcc ggc aga tct ggc gcc atg gat tat 336 Ala Arg Pro His Tyr Tyr Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Ala Met Asp Tyr 100 105 110 tgg gga cag ggc acc ctg gtc acc gtg tcc tct gct agc aca aag ggc 384 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 ccc tct gtg ttc cct ctg gct cct agc tct aag tcc acc tct ggc gga 432 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 130 135 140 aca gct gct ctg ggc tgt ctg gtc aag gac tac ttc cct gag cct gtg 480 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 acc gtg tct tgg aac tct ggc gct ctg aca tcc ggc gtg cac aca ttt 528 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 cca gct gtg ctg cag tcc tcc ggc ctg tac tct ctg tcc tct gtc gtg 576 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 acc gtg cct tcc agc tct ctg gga acc cag acc tac atc tgc aat gtg 624 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 aac cac aag cct tcc aac acc aag gtg gac aag aag gtg gaa ccc aag 672 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys 210 215 220 tcc tgc gac aag acc cac acc tgt cct cca tgt cct gct cca gaa gct 720 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala 225 230 235 240 gct ggc gga cct tcc gtg ttc ctg ttt cct cca aag cct aag gac acc 768 Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 ctg atg atc tct cgg acc cct gaa gtg acc tgc gtg gtg gtg gat gtg 816 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 260 265 270 tct cac gag gac cca gaa gtg aag ttc aat tgg tac gtg gac ggc gtg 864 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 275 280 285 gaa gtg cac aac gcc aag acc aag cct aga gag gaa cag tac aac tcc 912 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 acc tac aga gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gat tgg ctg 960 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg cct gcc 1008 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 ggc atc gaa aag acc atc tcc aag gcc aag ggc cag cct agg gaa ccc 1056 Gly Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 cag gtt tac acc ttg cca cct tct cgg gac gag ctg acc aag aac cag 1104 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aag ggc ttc tac ccc tcc gat atc gcc 1152 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 gtg gaa tgg gag tct aat ggc cag cct gag aac aac tac aag aca acc 1200 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 cct cct gtg ctg gac tcc gac ggc tca ttc ttc ctg tac tcc aag ctg 1248 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 405 410 415 aca gtg gac aag tcc aga tgg cag cag ggc aac gtg ttc tcc tgc agc 1296 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 420 425 430 gtg atg cac gag gcc ctg cac aat cac tac aca cag aag tct ctg tct 1344 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 435 440 445 ctg agc ccc ggc aaa ggt ggc gga gga tct ggc gga ggc gga tcc gaa 1392 Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu 450 455 460 gtt cag ctg ttg gaa agt ggt ggc gga ctg gtc cag cct ggc gaa tct 1440 Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Glu Ser 465 470 475 480 ctg aga ctg agc tgc aag gcc ttc ggg tat acc ttt acc aac cac cac 1488 Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His His 485 490 495 atc aat tgg gtt cga caa gcc cct ggc aag tgc ctg gaa tgg gtc gga 1536 Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val 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gag gaa cag tac aac tcc 912 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 290 295 300 acc tac aga gtg gtg tcc gtg ctg acc gtg ctg cac cag gat tgg ctg 960 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 305 310 315 320 aac ggc aaa gag tac aag tgc aag gtg tcc aac aag gcc ctg cct gcc 1008 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 325 330 335 ggc atc gaa aag acc atc tcc aag gcc aag ggc cag cct agg gaa ccc 1056 Gly Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 340 345 350 cag gtt tac acc ttg cca cct tct cgg gac gag ctg acc aag aac cag 1104 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln 355 360 365 gtg tcc ctg acc tgt ctc gtg aag ggc ttc tac ccc tcc gat atc gcc 1152 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 370 375 380 gtg gaa tgg gag tct aat ggc cag cct gag aac aac tac aag aca acc 1200 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 385 390 395 400 cct cct gtg ctg gac 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60 gga tct ggc tct gga acc gac tat acc ctg aca atc tcc agc ctg cag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 cct gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cac cag tac cac aga tcc cca 288 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 cct acc ttt ggc cag ggc acc aag ctg gaa atc aag cgt acg gtg gcc 336 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 gct cct tcc gtg ttc atc ttc cca cct tcc gac gag cag ctg aag tcc 384 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 ggc aca gct tct gtc gtg tgc ctg ctg aac aac ttc tac cct cgg gaa 432 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aat gcc ctg cag tcc ggc aac tcc 480 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 caa gag tct gtg acc gag cag gac tcc aag gac agc acc tac agc ctg 528 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 tcc tcc aca ctg acc ctg tcc aag gcc gac tac gag aag cac aag gtg 576 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 tac gcc tgc gaa gtg acc cat cag ggc ctg tct agc cct gtg acc aag 624 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 tct ttc aac cgg ggc gag tgc 645 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 40 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 40 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Thr Val Ser Ser Thr 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 41 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3 scFv-human Fc fusion protein <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(486) <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Pro 115 120 125 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly 130 135 140 Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly 145 150 155 160 Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr 165 170 175 Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 180 185 190 Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg 195 200 205 Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly 210 215 220 Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser 225 230 235 240 Asn Leu Trp Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Glu Pro 245 250 255 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 260 265 270 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 275 280 285 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 290 295 300 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 305 310 315 320 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala 325 330 335 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 340 345 350 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 355 360 365 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 370 375 380 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 385 390 395 400 Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 405 410 415 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 420 425 430 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 435 440 445 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 450 455 460 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 465 470 475 480 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 42 <211> 255 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(255) <400> 42 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu 195 200 205 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 210 215 220 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 225 230 235 240 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 255 <210> 43 <211> 254 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(254) <400> 43 Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Leu Cys Ser Asn Cys Pro 20 25 30 Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Ser Gln Ile Cys Ser Pro Cys 35 40 45 Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile 50 55 60 Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Lys Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser 65 70 75 80 Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Ile Ser Gly Tyr His Cys Leu Gly 85 90 95 Ala Glu Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu 100 105 110 Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln 115 120 125 Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys 130 135 140 Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro 145 150 155 160 Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Ala Thr Pro Pro Ala 165 170 175 Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Phe Phe Leu Ala 180 185 190 Leu Thr Ser Thr Val Val Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Val Leu Arg 195 200 205 Phe Ser Val Val Lys Arg Ser Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys 210 215 220 Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys 225 230 235 240 Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 245 250 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His tag protein <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <400> 44 His His His His His His 1 5 <210> 45 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3xFLAG tag proteinE <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(26) <400> 45 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp 1 5 10 15 Lys Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 20 25 <210> 46 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <400> 46 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(4) <400> 47 Ser Gly Gly Gly 1 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <400> 48 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <400> 49 Ser Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 50 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <400> 50 Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 51 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(6) <400> 51 Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 52 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <400> 53 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 54 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS linker <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(10) <400> 54 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 55 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GKPGS linker <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <400> 55 Gly Lys Pro Gly Ser 1 5

Claims (31)

  1. 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역, 및 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체로서, 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 이하의 (a) 또는 (b)의 어느 하나인, 이중특이성 항체:
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 2의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 2의 아미노산 번호 99부터 114까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 4의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역; 또는
    (b) 서열 번호 6의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 6의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 6의 아미노산 번호 99부터 112까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 24부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 8의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 90부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 이하의 (a) 또는 (b)의 어느 하나인, 이중특이성 항체:
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 또는
    (b) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 IgG 항체(항CLDN4 IgG 항체)를 포함하는, 이중특이성 항체.
  4. 제 3 항에 있어서,
    항CLDN4 IgG 항체의 Fc 영역에 LALA 변이(L234A 및 L235A(여기에서, 상기 변이 위치는 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 EU 인덱스에 따른 아미노산 위치이다))를 포함하는, 이중특이성 항체.
  5. 제 3 항에 있어서,
    항CLDN4 IgG 항체의 Fc 영역에 P331G 변이(여기에서, 상기 변이 위치는 인간 Igγ1 정상 영역에 있어서의 EU 인덱스에 따른 아미노산 위치이다)를 포함하는, 이중특이성 항체.
  6. 제 3 항에 있어서,
    항CLDN4 IgG 항체의 Fc 영역에 LALA 변이 및 P331G 변이를 포함하는, 이중특이성 항체.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 이하의 (a)∼(d)의 어느 하나인, 이중특이성 항체:
    (a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 10의 아미노산 번호 50부터 66까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 10의 아미노산 번호 99부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 24부터 34까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 12의 아미노산 번호 50부터 56까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 89부터 98까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (b) 서열 번호 14의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 14의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 14의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 16의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역;
    (c) 서열 번호 18의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 18의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 18의 아미노산 번호 98부터 107까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 20의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
    (d) 서열 번호 22의 아미노산 번호 31부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 22의 아미노산 번호 50부터 65까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 22의 아미노산 번호 98부터 110까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 23부터 35까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR1, 서열 번호 24의 아미노산 번호 51부터 57까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR2 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 90부터 100까지의 아미노산 서열로 이루어지는 CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역이 이하의 (a)∼(i)의 어느 하나인, 이중특이성 항체:
    (a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
    (b) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
    (c) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
    (d) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
    (e) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
    (f) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역;
    (g) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역;
    (h) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역; 또는
    (i) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역.
  9. 제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,
    항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 1본쇄 가변 영역 프래그먼트(항CD137 scFv)를 포함하는, 이중특이성 항체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    항CD137 scFv가 이하의 (a)∼(e)의 어느 하나인, 이중특이성 항체:
    (a) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
    (b) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
    (c) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv;
    (d) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv; 또는
    (e) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    항CLDN4 IgG 항체 및 항CD137 scFv를 포함하고, 항CLDN4 IgG 항체의 중쇄 또는 경쇄 카복시 말단에 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는, 이중특이성 항체.
  12. 이하의 (a)∼(j)의 어느 하나의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체:
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
    (b) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
    (c) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
    (d) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
    (e) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
    (f) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
    (g) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
    (h) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체;
    (i) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체; 또는
    (j) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CLDN4 항체의 경쇄, 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 영역 및 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항CD137 scFv를 포함하고, 해당 항CLDN4 항체의 중쇄 카복시 말단에 해당 항CD137 scFv의 아미노 말단이 링커를 개재시켜 연결되어 있는 이중특이성 항체.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    링커가 GS 링커인, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체.
  14. 제 13 항에 있어서,
    GS 링커가 서열 번호 54의 아미노산 서열로 이루어지는 링커인, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체.
  15. 이하의 (a) 또는 (b)의 어느 하나의 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체:
    (a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 포함하는 이중특이성 항체; 또는
    (b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 포함하는 이중특이성 항체.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    번역 후 수식된, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체.
  17. 제 16 항에 있어서,
    번역 후 수식이, 중쇄 가변 영역 N 말단의 파이로글루타밀화 및/또는 중쇄 C 말단 리신 결실인, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체.
  18. 하기 (a)∼(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (c) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (d) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  19. 하기 (a)∼(r)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (a) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (b) 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (c) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (d) 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (e) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (f) 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (g) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (h) 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (i) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (j) 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (k) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (l) 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (m) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (n) 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (o) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (p) 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (q) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (r) 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  20. 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드:
    (a) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (b) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (c) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (d) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (e) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제 15 항에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 생산에 이용하는, 하기 (a)∼(e)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드:
    (a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (c) 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (d) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (e) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  22. 제 18 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 발현 벡터.
  23. 제 22 항에 기재된 발현 벡터로 형질 전환된, 숙주 세포.
  24. 이하의 (a)∼(dd)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포:
    (a) 서열 번호 2의 아미노산 번호 1부터 125까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (b) 서열 번호 4의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (c) 서열 번호 6의 아미노산 번호 1부터 123까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (d) 서열 번호 8의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (e) 서열 번호 10의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (f) 서열 번호 12의 아미노산 번호 1부터 109까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (g) 서열 번호 14의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (h) 서열 번호 16의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (i) 서열 번호 18의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (j) 서열 번호 20의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (k) 서열 번호 22의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (l) 서열 번호 24의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (m) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (n) 서열 번호 26의 아미노산 번호 134부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (o) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (p) 서열 번호 28의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (q) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 111까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (r) 서열 번호 30의 아미노산 번호 132부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (s) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 118까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (t) 서열 번호 32의 아미노산 번호 134부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (u) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 121까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 중쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (v) 서열 번호 34의 아미노산 번호 137부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 항체의 경쇄 가변 영역을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (w) 서열 번호 26의 아미노산 번호 1부터 242까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (x) 서열 번호 28의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (y) 서열 번호 30의 아미노산 번호 1부터 249까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (z) 서열 번호 32의 아미노산 번호 1부터 244까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (aa) 서열 번호 34의 아미노산 번호 1부터 247까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CD137 scFv를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (bb) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드;
    (cc) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (dd) 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  25. 이하의 (a) 또는 (b)의 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 숙주 세포:
    (a) 서열 번호 36의 아미노산 번호 1부터 705까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 또는
    (b) 서열 번호 38의 아미노산 번호 1부터 712까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 중쇄 및 항CD137 scFv를 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 서열 번호 40의 아미노산 번호 1부터 215까지의 아미노산 서열로 이루어지는 항CLDN4 항체의 경쇄를 코딩하는 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
  26. 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 생산 방법으로서, 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정을 포함하는, 상기 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    암의 치료에 사용하기 위한, 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체.
  29. 제 27 항에 있어서,
    암의 치료에 이용하기 위한, 의약 조성물.
  30. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 치료 유효량을 대상에게 투여하는 공정을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  31. 암의 치료에 이용하는 의약 조성물의 제조에 있어서의, 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 항CLDN4-항CD137 이중특이성 항체의 사용.
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