WO2023249425A1 - 항-cd73 항체 및 il-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 - Google Patents

항-cd73 항체 및 il-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도 Download PDF

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WO2023249425A1
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fusion protein
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장명호
고영준
하단비
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㈜지아이이노베이션
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Definitions

  • Cancer immunotherapy is a method of treating cancer using the body's immune system. Cancer immunotherapy can cause the immune system to attack cancer cells using antigens such as cancer cell surface proteins as targets, and can increase the activity of immune cells by controlling the tumor microenvironment that causes immune evasion of cancer cells.
  • the tumor microenvironment is an environment in which cancer cells, including fibroblasts, blood vessels, lymphatic vessels, immune cells, extracellular matrix, and adipocytes present within cancer tissues, proliferate and evolve in addition to cancer cells.
  • cancer cells including fibroblasts, blood vessels, lymphatic vessels, immune cells, extracellular matrix, and adipocytes present within cancer tissues, proliferate and evolve in addition to cancer cells.
  • ATP-AMP-adenosine-A2AR/A2BR signaling pathway can regulate the activity of immune cells in the tumor microenvironment (S. Vigano et al ., Front Immunol ( 2019) 10:925).
  • adenosine binds to the A2AR/A2BR receptor on the surface of tumor cells or immune cells
  • immune suppressor cells such as regulatory T cells and TAM (tumor associated macrophages) are activated, and cytotoxic T cells and The activity of NK cells is suppressed.
  • the corresponding signal is generated by processing substances targeting CD39, an ectonucleotidase that converts ATP to AMP, CD73, an ectonucleotidase that converts AMP to adenosine, or the A2AR/A2BR receptor that binds to adenosine.
  • IL-2 interleukin 2
  • T-cell growth factors TCGF
  • IL-2 mediates various immune functions by binding to the IL-2 receptor, which is individually composed of three subunits.
  • IL-2 is mainly synthesized by activated T cells, especially CD4+ helper T cells.
  • IL-2 stimulates the proliferation and differentiation of T cells, the production of cytotoxic T lymphocytes (CTL), cytotoxic cells of peripheral blood lymphocytes, and lymphokine-activated killer cells (LAK). induces differentiation into cells.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • LAK lymphokine-activated killer cells
  • the present inventors studied to develop a new combination of fusion proteins that enhance the activity of immune cells by controlling the tumor microenvironment.
  • the results included anti-CD73 antibody or antigen-binding fragment thereof; It was confirmed that the fusion protein dimer containing IL-2 controls the tumor microenvironment and effectively activates immune cells. Based on this, the present invention was completed by confirming that the fusion protein dimer is effective as an anticancer agent.
  • one aspect of the present invention is an antibody or fragment thereof that specifically binds to CD73; and IL-2.
  • Another aspect of the present invention provides a fusion protein dimer in which the two fusion proteins are combined.
  • Another aspect of the present invention provides a polynucleotide encoding the fusion protein, an expression vector loaded with the polynucleotide, and a transformed cell into which the expression vector is introduced.
  • Another aspect of the present invention includes culturing the transformed cells; and ii) obtaining a fusion protein dimer; an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73; and a method for producing a fusion protein dimer containing IL-2.
  • Another aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the fusion protein or the fusion protein dimer as an active ingredient.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering the fusion protein or the fusion protein dimer to a subject.
  • Another aspect of the present invention provides the use of the fusion protein or the fusion protein dimer for the prevention or treatment of cancer.
  • an anti-CD73 antibody or antigen-binding fragment thereof according to the invention; And the fusion protein containing IL-2 or its dimer binds to CD73 of cancer cells and inhibits adenosine production (ATP ⁇ AMP ⁇ adenosine), thereby controlling the micro-tumor environment by blocking the A2AR and A2BR signaling pathways. You can. Additionally, it can activate immune cells (CD8+ T cells and CD4+ T cells) with less activation of immunosuppressive cells such as regulatory T cells (Treg). In addition, IL-2 or a variant thereof in the fusion protein of the present invention can activate immune cells. Therefore, the fusion protein of the present invention and its dimer can be usefully used in the prevention or treatment of cancer.
  • Figure 1 is a diagram schematically illustrating the structure of a fusion protein dimer (GI-108A1), which is an example.
  • Figure 2 is a diagram schematically illustrating the structure of a fusion protein dimer (GI-108B1), which is an example.
  • Figure 3 is a graph showing the results of treating HEK-Blue TM IL-2 reporter cells with two types of GI-108A1, GI-108B1, and Proleukin® and measuring the activity of the JAK-STAT signaling pathway.
  • Figure 4 is a graph showing the results of treating CTLL-2 cells with two types of GI-108A1, GI-108B1, and Proleukin® and confirming the degree of cell proliferation.
  • Figure 5 is a graph showing the results of confirming the ability of two types of GI-108A1, GI-108B1, and Oleclumab to inhibit membrane-bound human CD73 enzyme activity in human TNBC cell line (MDA-MB-231).
  • Figure 6 is a graph showing the results of confirming the ability of two types of GI-108A1, GI-108B1, and Oleclumab to inhibit Soluble CD73 enzyme activity.
  • Figure 7 shows Vehicle (hIgG4), GI-108B1 alone, Proleukin® alone, IgG4 Fc-IL-2v alone, anti-CD73 antibody (GI- ⁇ CD73) alone, anti-CD8+ T cells whose activity was inhibited by CD73-adenosine.
  • GI- ⁇ CD73 CD73 antibody
  • IgG4 Fc-IL-2v IgG4 Fc-IL-2v
  • Oleclumab alone
  • Oleclumab and IgG4 Fc-IL-2v in combination.
  • Figure 8 shows Vehicle (hIgG4), GI-108B1 alone, Proleukin® alone, IgG4 Fc-IL-2v alone, anti-CD73 antibody (GI- ⁇ CD73) alone, anti-CD8+ T cells whose activity was inhibited by CD73-adenosine.
  • GI- ⁇ CD73 CD73 antibody
  • IgG4 Fc-IL-2v IgG4 Fc-IL-2v
  • Oleclumab alone
  • IgG4 Fc-IL-2v adenosine
  • Figure 9 shows CD4+ T cells whose activity was inhibited by CD73-adenosine with Vehicle (hIgG4), GI-108B1 alone, Proleukin® alone, IgG4 Fc-IL-2v alone, anti-CD73 antibody (GI- ⁇ CD73) alone, anti -This is a graph showing the proliferation of CD4+ T cells after treatment with CD73 antibody (GI- ⁇ CD73) and IgG4 Fc-IL-2v, Oleclumab alone, or Oleclumab and IgG4 Fc-IL-2v in combination.
  • Figure 10 shows Vehicle (hIgG4), GI-108B1 alone, Proleukin® alone, IgG4 Fc-IL-2v alone, anti-CD73 antibody (GI- ⁇ CD73) alone, anti-CD4+ T cells whose activity was inhibited by CD73-adenosine.
  • GI- ⁇ CD73 CD73 antibody
  • IgG4 Fc-IL-2v IgG4 Fc-IL-2v
  • Oleclumab alone
  • IgG4 Fc-IL-2v adenosine
  • Figure 11 shows human PBMCs treated alone with various concentrations of Proleukin®, GI-108B1, anti-CD73 antibody (GI- ⁇ CD73), or IgG4 Fc-IL-2v, or treated with anti-CD73 antibody (GI- ⁇ CD73) and IgG4 Fc- This is a graph measuring pSTAT5 of the CD8+ T cell population after combined treatment with IL-2v.
  • Figure 12 is a graph showing EC 50 values by measuring pSTAT5 of CD8+ T cell population after treating human PBMC with various concentrations of Proleukin® or GI-108B1.
  • Figure 13 shows human PBMCs treated alone with various concentrations of Proleukin®, GI-108B1, anti-CD73 antibody (GI- ⁇ CD73), or IgG4 Fc-IL-2v, or treated with anti-CD73 antibody (GI- ⁇ CD73) and IgG4 Fc- This is a graph measuring pSTAT5 of the Treg cell population after combined treatment with IL-2v.
  • Figure 14 is a graph showing the EC 50 value by measuring pSTAT5 of the Treg cell population after treating human PBMC with various concentrations of Proleukin® or GI-108B1.
  • Figure 16 is a diagram illustrating STAT5 phosphorylation induced when GI-108B1 cis-binds to the CD73 and IL-2 receptors of CD8+ T cells and CTV+CD8+ T cells pretreated with anti-CD73 antibody.
  • Figure 17 shows samples co-cultured with CTV+CD8+ T cells and CD8+ T cells pretreated with anti-CD73 antibody, and samples co-cultured with CTV+CD8+ T cells and CD8+ T cells after treatment with GI-108B1, respectively.
  • This is a graph showing the results of measuring pSTAT5+(CTV+/-)CD8+ T cells.
  • Figure 18 is a graph of flow cytometry analysis of hCD73+CD8+ T cells in purified CD8+ T cells from human PBMC.
  • Figure 20 is a graph showing the results of measuring tumor volume after administering Vehicle (PBS) or GI-108B1 to mice implanted with mouse-derived colon cancer cells (MC38).
  • PBS Vehicle
  • GI-108B1 mouse-derived colon cancer cells
  • Figure 21 is a graph showing the tumor growth inhibition rate after administering Vehicle (PBS) or GI-108B1 to mice implanted with mouse-derived colon cancer cells (MC38).
  • PBS Vehicle
  • GI-108B1 mouse-derived colon cancer cells
  • Figure 22 is a graph showing the survival rate up to the 25th day after administering Vehicle (PBS) or GI-108B1 to mice implanted with mouse-derived colon cancer cells (MC38).
  • PBS Vehicle
  • GI-108B1 mouse-derived colon cancer cells
  • Figure 23 is a schematic diagram of an experimental plan using mice implanted with human-derived breast cancer cells (MDA-MB-231) to confirm the anticancer effect of GI-108A1 and GI-108B1.
  • Figure 25 shows individual experimental animals in each treatment group after administration of Vehicle (hIgG4), GI-108A1 (AHP04167), GI-108B1, or anti-PD-1 antibody to mice implanted with human-derived breast cancer cells (MDA-MB-231). This is a graph showing the tumor volume.
  • Vehicle hIgG4
  • GI-108A1 AHP04167
  • GI-108B1 GI-108B1
  • MDA-MB-231 human-derived breast cancer cells
  • the term “antigen” refers to a molecule that can selectively bind to an antibody.
  • the target antigen may be a polypeptide, carbohydrate, nucleic acid, lipid, hapten, or other naturally occurring or synthetic compound.
  • the antigen is a polypeptide and may be a protein present on the cell surface or within the cell.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73 may collectively refer to molecules capable of antigen-antibody binding specifically to CD73. Additionally, the antibody or antigen-binding fragment thereof may be used in any form as long as it contains an antigen-binding site that can specifically bind to CD73. The antibody or antigen-binding fragment thereof may contain other amino acids that are not directly involved in binding, or amino acids whose effects are blocked by amino acid residues in the antigen-binding site.
  • the single-domain antibody is also called a nanobody and refers to an antibody fragment composed of a single monomeric variable antibody domain.
  • the single-domain antibody can specifically bind to a specific antigen in the same way as a whole antibody.
  • the single-domain antibody has a molecular weight of 12 to 15 kDa, which is smaller than that of common antibodies (150 to 160 kDa), Fab fragments ( ⁇ 50 kDa), and scFv ( ⁇ 25 kDa).
  • the single-domain antibody may be, for example, a dimeric variable domain of a common human or mouse immunoglobulin G (IgG) split into monomers, such as VHH, a heavy chain antibody of Camelids, or Cartilaginous fishes. ) may be a VNAR fragment obtained from IgNAR.
  • IgG immunoglobulin G
  • the IL-2 may be in a mature form. Specifically, the mature IL-2 may not contain a signal sequence and may have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. At this time, the IL-2 can be used as a concept comprising a fragment in which part of the N-terminus or C-terminus of wild-type IL-2 is deleted (truncated).
  • the term “IL-2 variant” refers to a form in which some amino acids of the full-length IL-2 or the above-mentioned fragment of IL-2 are substituted. That is, the IL-2 variant may have an amino acid sequence that is different from wild-type IL-2 or a fragment thereof. However, the IL-2 variant may have equivalent or similar activity to wild-type IL-2.
  • “IL-2 activity” may mean, for example, specific binding to the IL-2 receptor, and the specific binding can be measured using methods known to those skilled in the art.
  • the IL-2 variant may be one in which some amino acids of wild-type IL-2 have been substituted.
  • One specific example of an IL-2 variant resulting from amino acid substitution may be one in which at least one of the 38th, 42nd, 45th, 61st, and 72nd amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 is substituted.
  • the IL-2 variant may be one in which at least one of the 38th, 42nd, 45th, 61st, and 72nd amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 is substituted with another amino acid.
  • the amino acid at the complementary position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 may be replaced with another amino acid.
  • 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids may be substituted as long as IL-2 activity is maintained. there is.
  • from 1 to 5 amino acids may be substituted.
  • the IL-2 variant may have the 42nd and 45th amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 42nd and 61st amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 42nd and 72nd amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 45th and 61st amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 45th and 72nd amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 61st and 72nd amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
  • the IL-2 variant may have three amino acids substituted. Specifically, the IL-2 variant may have the 38th, 42nd, and 45th amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 38th, 42nd, and 61st amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 38th, 42nd, and 72nd amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 38th, 45th, and 61st amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
  • the IL-2 variant may have the 38th, 45th, and 72nd amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 38th, 61st, and 72nd amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 are substituted. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 42nd, 45th, and 61st amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have the 42nd, 45th, and 72nd amino acids substituted in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which the 45th, 61st, and 72nd amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 are substituted.
  • the “other amino acids” introduced through the substitution include alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, Histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenyl alanine, proline, serine, threonine, tryptophan ), it may be any one selected from the group consisting of tyrosine and valine.
  • the amino acid substitution of the IL-2 variant in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, position 38 cannot be substituted with arginine, position 42 cannot be substituted with phenylalanine, and position 45 cannot be substituted with tyrosine. , the 61st position cannot be substituted with glutamic acid, and the 72nd position cannot be substituted with leucine.
  • arginine the 38th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, may be replaced with an amino acid other than arginine.
  • arginine, the 38th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 may be substituted with alanine (R38A).
  • tyrosine the 45th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, may be replaced with an amino acid other than tyrosine.
  • tyrosine the 45th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40, may be replaced with alanine (Y45A).
  • glutamic acid which is the 61st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40
  • glutamic acid which is the 61st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40
  • glutamic acid which is the 61st amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40
  • leucine, the 72nd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 may be replaced with an amino acid other than leucine.
  • leucine, the 72nd amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 may be replaced with glycine (L72G).
  • the IL-2 variant may have at least one substitution selected from the group consisting of R38A, F42A, Y45A, E61R, and L72G in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40.
  • the IL-2 variant may have two amino acids substituted. Specifically, the IL-2 variant may be one in which substitution has occurred with R38A and F42A. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which substitution has occurred with R38A and Y45A. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions R38A and E61R. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions R38A and L72G. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which substitution has occurred with F42A and Y45A. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions F42A and E61R. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions F42A and L72G. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions E61R and L72G.
  • the IL-2 variant may have three amino acids substituted. Specifically, the IL-2 variant may have substitutions R38A, F42A, and Y45A. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions R38A, F42A, and E61R. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions R38A, F42A, and L72G. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may be one in which substitution has occurred with R38A, Y45A, or E61R. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions R38A, Y45A, and L72G. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions F42A, Y45A, and E61R.
  • the IL-2 variant may have substitutions F42A, Y45A, and L72G. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions F42A, E61R, and L72G. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions Y45A, E61R, and L72G.
  • the IL-2 variant may have four amino acids substituted. Specifically, the IL-2 variant may have substitutions R38A, F42A, Y45A, and E61R. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions R38A, F42A, Y45A, and L72G. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions R38A, F42A, E61R, and L72G. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions R38A, Y45A, E61R, and L72G. Additionally, in one embodiment, the IL-2 variant may have substitutions F42A, Y45A, E61R, and L72G.
  • the fusion protein of the present invention may include a single-domain antibody that specifically binds to CD73, an Fc region, and IL-2 or a variant thereof. At this time, the Fc region and IL-2 or a variant thereof may be combined through a linker.
  • the fusion protein may contain the following structural formula (I).
  • N' is the N terminus
  • X is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73
  • Y is IL-2
  • the o and p are each independently O or 1.
  • the antigen-binding fragment comprises a single-domain antibody, in which case the antibody or antigen-binding fragment thereof, specifically the single-domain antibody, has SEQ ID NOs: 15, 18, and 21.
  • a CDR1 region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of;
  • a CDR2 region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 16, 19, and 22; and
  • a CDR3 region comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 17, 20, and 23.
  • the antigen-binding fragment includes CDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, CDR2 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16, and CDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17; CDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18, CDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and CDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20; Alternatively, it may include CDR1 including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, CDR2 including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, and CDR3 including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23.
  • the antigen-binding fragment may include any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID Nos: 2, 3, and 4.
  • the peptide linker (1) may be composed of 1 to 50 consecutive amino acids, or 3 to 30 consecutive amino acids, or 5 to 15 amino acids. In one specific example, the peptide linker (1) may be composed of 12 amino acids. Additionally, the peptide linker 1 may include at least one cysteine. Specifically, it may contain one, two or three cysteines. Additionally, the peptide linker (1) may be derived from the hinge of immunoglobulin. For example, the hinge can be selected from the hinge regions of various IgG subtype antibodies. Additionally, the hinge may be a form in which some amino acids in the hinge region derived from immunoglobulin are replaced with other amino acids, or may be a sequence in which some amino acid sequences are added. In one embodiment, the peptide linker (1) may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5.
  • the peptide linker (2) may be composed of 1 to 30 consecutive amino acids, or 2 to 20 consecutive amino acids, or 2 to 10 amino acids.
  • the peptide linker (2) may be (G4S)n (where n is an integer of 1 to 10). At this time, n in (G4S)n may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • the peptide linker (2) may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
  • the immunoglobulin Fc region is a protein that includes the heavy chain constant region 2 (CH2) and heavy chain constant region 3 (CH3) of an immunoglobulin, but does not include the variable regions of the heavy and light chains and the light chain constant region (CL) of the immunoglobulin. it means.
  • the immunoglobulin Fc region may be derived from IgG, IgA, IgE, IgD or IgM.
  • the immunoglobulin Fc region may be IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4, which are subclasses of IgG, and preferably may be derived from IgG4.
  • the Fc region of the immunoglobulin may be not only a wild-type Fc region, but also an Fc region variant.
  • the term "Fc region variant" used herein refers to a variant that has a glycosylation pattern that is different from that of the wild-type Fc region, has an increased sugar chain compared to the wild-type Fc region, has a decreased sugar chain compared to the wild-type Fc region, or has a sugar chain removed (deglycosylated). It may be in a given form. Additionally, an aglycosylated Fc region is also included.
  • the Fc region or variant may have an adjusted number of sialic acids, fucosylation, and glycosylation through culture conditions or genetic manipulation of the host.
  • the sugar chain of the Fc region of immunoglobulin can be modified by conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms.
  • the Fc region variant may be a mixture of the Fc regions of immunoglobulins IgG, IgA, IgE, IgD, or IgM.
  • the Fc region variant may be a form in which some amino acids in the Fc region are replaced with other amino acids.
  • the Fc region may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • the fusion protein of the present invention may be a polypeptide comprising the heavy chain variable region (VH), heavy chain constant region 1 (CH1), Fc region, and IL-2 or a variant thereof of an anti-CD73 antibody.
  • VH heavy chain variable region
  • CH1 heavy chain constant region 1
  • Fc region and IL-2 or a variant thereof may be combined through a linker.
  • the fusion protein may contain the following structural formulas (II) and (III):
  • N' is the N terminus
  • the X is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73, and includes a heavy chain variable region (VH) and a heavy chain constant region 1 (CH1),
  • the X' is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73, and includes a light chain variable region (VL) and a light chain constant region (CL),
  • Y is IL-2
  • linker (3) and linker (4) are peptide linkers
  • the q and r are each independently O or 1.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof includes HCDR1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, HCDR2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, and HCDR3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26. area; and
  • LCDR1 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 27
  • LCDR2 containing the amino acid sequence (Asp-Ala-Ser, DAS) of SEQ ID NO: 28
  • LCDR3 containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29. You can.
  • the heavy chain variable region may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9.
  • the light chain variable region may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the peptide linker (3) may be composed of 1 to 50 consecutive amino acids, or 3 to 30 consecutive amino acids, or 5 to 15 amino acids. In one specific example, the peptide linker 3 may be composed of 12 amino acids. Additionally, the peptide linker 3 may include at least one cysteine. Specifically, it may contain one, two or three cysteines. Additionally, the peptide linker 3 may be derived from the hinge of immunoglobulin. For example, the hinge can be selected from the hinge regions of various IgG subtype antibodies. Additionally, the hinge may be a form in which some amino acids in the hinge region derived from immunoglobulin are replaced with other amino acids, or may be a sequence in which some amino acid sequences are added. In one embodiment, the peptide linker 3 may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the peptide linker 4 may be composed of 1 to 30 consecutive amino acids, or 2 to 20 consecutive amino acids, or 2 to 10 amino acids.
  • the peptide linker 4 may be (G4S)n (where n is an integer of 1 to 10). At this time, n in (G4S)n may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • the peptide linker 4 may be a peptide linker consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12.
  • Another aspect of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73; and IL-2 or a variant thereof.
  • a dimer in which two fusion proteins are combined is provided.
  • An antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to the CD73; and IL-2 are the same as described above.
  • the bond between the fusion proteins constituting the dimer may be formed by a disulfide bond through the cysteine present in the linker, but is not limited to this.
  • the fusion protein constituting the dimer may be a homodimer composed of the same thing.
  • the dimer may be a dimer in which two fusion proteins including a single-domain antibody that specifically binds to CD73, an Fc region, and IL-2 or a variant thereof are disulfide bonded by cysteine.
  • the dimer is a polypeptide comprising the heavy chain variable region (VH), heavy chain constant region 1 (CH1), Fc region, and IL-2 or a variant thereof of the anti-CD73 antibody.
  • VH heavy chain variable region
  • CH1 heavy chain constant region 1
  • CL light chain constant region
  • Another aspect of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73; and a polynucleotide encoding a fusion protein comprising IL-2 or a variant thereof.
  • an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73; and IL-2 or variants thereof are the same as described above.
  • polynucleotide encoding a fusion protein comprising a single-domain antibody that specifically binds to CD73, an Fc region, and IL-2 or a variant thereof is the group consisting of SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, and SEQ ID NO: 35. It may include any one base sequence selected from.
  • the polynucleotide is at least about 70%, at least about 75%, at least about 80%, and each of the base sequences of SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, and SEQ ID NO: 39. at least about 85%, at least about 86%, at least about 87%, at least about 88%, at least about 89%, at least about 90%, at least about 91%, at least about 92%, at least about 93%, at least about 94%, It may include a base sequence having an identity of at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%, or at least about 100%.
  • the polynucleotide may additionally include a signal sequence or leader sequence.
  • signal sequence used herein refers to a nucleic acid encoding a signal peptide that directs secretion of a target protein.
  • the signal peptide is cleaved after translation in the host cell.
  • the signal sequence of the present invention is a polynucleotide encoding an amino acid sequence that initiates the movement of a protein across the ER (endoplasmic reticulum) membrane.
  • the signal sequence is cleaved within the lumen of the ER by cellular enzymes commonly known as signal peptidases.
  • the signal sequence may be tPa (tissue Plasminogen Activation), HSV gDs (signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), IgG signal sequence, or growth hormone secretion signal sequence.
  • a secretion signal sequence used in higher eukaryotic cells, including mammals can be used.
  • Signal sequences useful in the present invention include antibody light chain signal sequences, such as antibody 14.18 (Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989. 125: 191-202), and antibody heavy chain signal sequences, such as MOPC141 antibody heavy chain signal.
  • the signal sequence may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Another aspect of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73; and an expression vector loaded with a polynucleotide encoding a fusion protein containing IL-2 or a variant thereof.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73, the antigen-binding site, IL-2, and variants thereof are the same as described above.
  • the term “vector” can be introduced into a host cell and recombined and inserted into the host cell genome.
  • the vector is understood as a nucleic acid vehicle containing a nucleotide sequence capable of spontaneous replication as an episome.
  • the vectors include linear nucleic acids, plasmids, phagemids, cosmids, RNA vectors, viral vectors, mini-chromosomes and analogs thereof.
  • viral vectors include, but are not limited to, retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses.
  • plasmids pUB110, pTP5, etc.
  • yeast-derived plasmids yeast-derived plasmids
  • phage DNA Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.
  • animal virus vectors retroviruses
  • adenovirus vaccinia virus
  • insect virus vectors baculovirus, etc.
  • the term “gene expression” or “expression” of a protein of interest is understood to mean transcription of a DNA sequence, translation of an mRNA transcript, and secretion of a fusion protein product or fragment thereof.
  • a useful expression vector may be RcCMV (Invitrogen, Carlsbad) or variants thereof.
  • the expression vector may include a human CMV (cytomegalovirus) promoter to promote continuous transcription of the target gene in mammalian cells and a bovine growth hormone polyadenylation signal sequence to increase the steady-state level of RNA after transcription. You can.
  • Another aspect of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73; and a transformed cell into which an expression vector loaded with a polynucleotide encoding a fusion protein containing IL-2 or a variant thereof is introduced.
  • the expression vector loaded with the polynucleotide is the same as described above.
  • transformed cell refers to prokaryotic cells and eukaryotic cells into which a recombinant expression vector can be introduced.
  • the transformed cells can be produced by introducing a vector into a host cell and transforming it.
  • the fusion protein of the present invention can be produced by expressing the polynucleotide contained in the vector.
  • the host cell used to produce the transformed cell is not particularly limited as long as it is capable of producing the antibody of the present invention.
  • the host cells may include, but are not limited to, cells of prokaryotic, eukaryotic, mammalian, plant, insect, fungal or cellular origin.
  • An example of the prokaryotic cell may be Escherichia coli.
  • yeast can be used as an example of a eukaryotic cell.
  • the mammalian cells include CHO cells, F2N cells, COS cells, BHK cells, Bowes melanoma cells, HeLa cells, 911 cells, AT1080 cells, A549 cells, SP2/0 cells, and human lymphoblastoids.
  • the glycosylation-related genes of the host cell are manipulated through methods known to those skilled in the art to manipulate the antibody's sugar chain pattern (e.g., sialic acid, fucosylation, glycosylation, etc.). ) can be adjusted.
  • Another aspect of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73; and a method for producing a fusion protein dimer containing IL-2 or a variant thereof.
  • the fusion protein and fusion protein dimer are the same as described above.
  • the method for producing the fusion protein dimer includes the steps of i) culturing the transformed cell; and ii) obtaining a fusion protein dimer.
  • culture refers to a method of growing microorganisms under appropriately artificially controlled environmental conditions.
  • the method of culturing the transformed cells can be performed using methods well known in the art.
  • the culture is not particularly limited as long as it can be produced by expressing the antibody of the present invention.
  • the culture may be continuously cultured in a batch process or fed batch or repeated fed batch process.
  • the step of obtaining the antibody from the culture may be performed by methods known in the art.
  • the obtaining method is not particularly limited as long as the produced fusion protein of the present invention can be obtained.
  • the obtaining method includes centrifugation, filtration, extraction, spraying, drying, evaporation, precipitation, crystallization, electrophoresis, fractional dissolution (e.g. ammonium sulfate precipitation), chromatography (e.g. ion exchange, It may be a method such as affinity, hydrophobicity, and size exclusion).
  • Another aspect of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73; and a fusion protein containing IL-2 or a variant thereof or a dimer of the fusion protein as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer. At this time, the fusion protein and fusion protein dimer are the same as described above.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising a fusion protein comprising an anti-CD73 single-domain antibody and IL-2 or a variant thereof, or a dimer of the fusion protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing a fusion protein containing an anti-CD73 antibody and IL-2 or a variant thereof, or a dimer of the fusion protein as an active ingredient.
  • cancer is classified as a disease in which normal tissue cells proliferate indefinitely for some reason and continue to grow rapidly regardless of the living phenomenon of the living body or the condition of surrounding tissues, etc.
  • Cancer in the present invention is Various cancers of the human body, such as stomach cancer, liver cancer, lung cancer, colon cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreas cancer, cervical cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer, acute myeloid leukemia, brain tumor, neuroblastoma, retinoblastoma, head and neck cancer, salivary gland cancer, and It may be any cancer selected from the group consisting of lymphoma, but is not limited thereto.
  • the preferred dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the patient's condition and weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but can be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the fusion protein may be included in any amount (effective amount) depending on the use, formulation, purpose of formulation, etc., as long as it exhibits anti-cancer activity or, in particular, can exhibit a cancer treatment effect.
  • a typical effective amount will be determined within the range of 0.001% by weight to 20.0% by weight based on the total weight of the composition.
  • “effective amount” refers to the amount of an active ingredient that can improve the condition of a disease or induce a treatment effect, especially an improvement in the condition of cancer or a treatment effect. Such effective amounts can be determined experimentally within the scope of the ordinary ability of those skilled in the art.
  • treatment can be used to include both therapeutic treatment and preventive treatment, and includes both application and any form of medication to treat diseases in mammals, including humans.
  • the term also includes inhibiting or slowing the progression of a disease; Restoring or repairing damaged or missing function, thereby partially or completely relieving a disease; or stimulating inefficient processes; It includes the meaning of alleviating serious diseases.
  • prevention may be used to mean alleviating or reducing the pathological condition or disease of an individual.
  • “enhanced efficacy” e.g., improvement in efficacy
  • improved efficacy measured by comparing parameters such as clearance rate and treatment or amelioration of cancer disease in test animals or human subjects. It can be.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a “therapeutically effective amount.”
  • administration means introducing a predetermined substance into an individual by an appropriate method, and the composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. It may be administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, orally, topically, intranasally, intrapulmonaryly, or rectally, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be any carrier that is a non-toxic material suitable for delivery to a patient. Distilled water, alcohol, fats, waxes and inert solids may be included as carriers. Pharmacologically acceptable adjuvants (buffers, dispersants) may also be included in the pharmaceutical composition.
  • the subjects to which the pharmaceutical composition can be applied are mammals and humans, and humans are particularly preferred.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include any compounds or natural extracts known to have cancer treatment effects.
  • Another aspect of the present invention is an antibody or antigen-binding fragment thereof that specifically binds to CD73; and administering to a subject a fusion protein or fusion protein dimer containing IL-2 or a variant thereof.
  • the subject may be a mammal, preferably a human. Additionally, the individual may be a patient suffering from cancer or an individual with a high risk of suffering from cancer.
  • a signal peptide SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 2 an anti-CD73 single domain antibody
  • SEQ ID NO: 3 an anti-CD73 single domain antibody
  • linker (1) SEQ ID NO: 5
  • IgG4 Fc region SEQ ID NO: 6
  • linker (2) SEQ ID NO: 7
  • an IL-2 variant with three amino acids substituted SEQ ID NO: 8
  • the polynucleotide SEQ ID NO: 30, 32 or 34) encoding number 8
  • the buffer containing the three collected fusion protein dimers (GI-108A1 (AHF10235), GI-108A1 (AHF10240), and GI-108A1 (AHP04167)) was dialyzed into PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4). changed it Using NanoDrop equipment (Thermo Fisher Scientific), it was confirmed that fusion protein dimers were included at concentrations of 3.86 mg/mL, 4.12 mg/mL, and 12.86 mg/mL, respectively.
  • GI-108A1 Peak Name RT Area %Area Height One Peak 1 12.067 24947 0.90 762 2 Peak 2 14.015 124244 4.50 2122 3 Peak 3 14.980 377981 13.68 6230 4 Monomer 17.022 1983970 71.81 48598 GI-108A1 (AHF10240) Peak Name RT Area %Area Height One Peak 1 11.962 198392 6.85 7601 2 Peak 2 13.697 138199 4.77 2536 3 Peak 3 14.694 351133 12.12 6847 4 Monomer 16.739 2183777 75.36 60301 GI-108A1(AHP04167) Peak Name RT Area %Area Height One Peak 1 12.111 21365 0.41 331 2 Peak 2 14.769 295396 5.72 5156 3 Monomer 16.682 4849570 93.87 140556
  • a signal peptide SEQ ID NO: 1
  • a variable region of the anti-CD73 antibody heavy chain SEQ ID NO: 9 and Constant region
  • linker (1) SEQ ID NO: 11
  • IgG4 Fc region SEQ ID NO: 6
  • linker (2) SEQ ID NO: 12
  • IL-2 variant with three amino acids substituted SEQ ID NO: 8
  • a polynucleotide encoding SEQ ID NO: 36) and a signal peptide (SEQ ID NO: 1)
  • pCGS3 vector Sigma-Aldrich®
  • the GI-108B1 was purified using chromatography containing Protein A resin. After filtering the collected culture, the filtered culture was flowed through the column and combined. Afterwards, the fusion protein dimer was harvested with 50 mM glycine, pH 3.4.
  • the buffer containing the collected fusion protein dimer was changed to PBS (pH 7.4) using dialysis, and it was confirmed that the fusion protein dimer was contained at a concentration of 4.55 mg/mL using NanoDrop equipment (Thermo Fisher Scientific).
  • SEC size exclusion chromatography
  • the polynucleotide (SEQ ID NO: 38) was loaded into the pCGS3 vector (Sigma-Aldrich®) using BioXPTM 3250 SYSTEM.
  • the vector was introduced into CHO cells (Expi-CHOTM, Thermo Fisher Scientific) to express the control antibody, anti-CD73 antibody. After introducing the vector and culturing at 37°C, 125 rpm, 8% CO 2 conditions, the culture medium was collected and the control anti-CD73 antibody was purified. Purification was performed in the same manner as Example 1.
  • the vector was introduced into CHO cells (Expi-CHOTM, Thermo Fisher Scientific) to express the fusion protein. After introducing the vector, it was cultured for 7 days at 37°C, 127 rpm, 5% CO 2 , and 80% humidity. Afterwards, the culture medium was collected and the IgG4 Fc-IL-2v fusion protein was purified.
  • GI-108A1 (AHF04167), GI-108A1 (AHP10240) and GI-108B1 combined with anti-CD73 antibodies and IL-2 variants that specifically bind to CD73 and CD73 and IL from Aldesleukin (Proleukin®, Novartis)
  • SPR Surface plasmon resonance
  • GI-108A1 AHF10240
  • GI-108A1 AHP04167
  • GI-108B1 Oleclumab
  • HBS-EP+ buffer Cytiva, USA
  • human antibody It was reversibly fixed to the Sensor Chip CM5 (Cytiva, USA) treated with a capture kit (Cytiva, USA).
  • CD73 was diluted in HBS-EP+ buffer and analyzed for association and dissociation at a flow rate of 30 ⁇ L/min for 5 minutes each.
  • This experiment is to confirm the activity of the IL-2 variant portion of GI-108. Specifically, the experiment was conducted using HEK-Blue TM IL-2 reporter cells (InvivoGen Inc.) expressing IL-2R ⁇ . HEK-Blue TM IL-2 reporter cells are induced to produce the reporter protein SEAP (secreted embryonic alkaline phosphatase) protein when the JAK-STAT pathway is activated by IL-2. In this experiment, the activation ability by IL-2 was confirmed by detecting SEAP protein.
  • SEAP secreted embryonic alkaline phosphatase
  • HEK-Blue TM IL-2 reporter cells were incubated with 10% FBS (GibcoTM), 100 U/mL penicillin (Welgene Inc.), 100 ⁇ g/mL streptomycin (Welgene Inc.), and 100 ⁇ g/mL Normocin TM (cat. ant. -nr-1, InvivoGen Inc.) were cultured in DMEM medium (GibcoTM) containing HEK-Blue TM IL-2 reporter cells were subcultured and stabilized, and then harvested using trypsin (GibcoTM). Afterwards, dead cells were removed by washing with PBS. The separated cells were made into a cell suspension in the culture medium so that the concentration was about 2.8 ⁇ 10 5 cells/mL.
  • GI-108A1 (AHF10240), GI-108A1 (AHP04167), GI-108B1 and the control group Proleukin® were diluted with PBS and dispensed at 20 ⁇ L per well in a 96-well plate (cat. 30096, SPL). 180 ⁇ L of the cell suspension prepared in this treated 96-well plate was added to each well to make the number of cells about 3 ⁇ 10 4 and cultured in an incubator at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours.
  • the absorbance increased in a concentration-dependent manner by GI-108A1 (AHF10240), GI-108A1 (AHP04167), GI-108B1, and Proleukin®.
  • the JAK-STAT signaling pathway is activated by the IL-2 variant regions of the two types of GI-108A1 and GI-108B1 ( Figure 3).
  • the EC 50 values of GI-108A1 (AHF10240) and GI-108A1 (AHP04167) were confirmed to be 2.63 pM and 3.94 pM, respectively, and the EC 50 value of GI-108B1 was confirmed to be 1.28 pM.
  • the lower EC 50 value of Proleukin® than that of GI-108A1 and GI-108B1 is due to CTLL-2 cells expressing hIL-2R ⁇ , and since GI-108A1 and GI-108B1 do not bind to IL-2R ⁇ , Proleukin® It was confirmed that the EC 50 value was more than 20 times higher than that of ®.
  • GI-108A1 (AHF10240), GI-108A1 (AHP04167), GI-108B1, and Oleclumab as a control group were added at 300 ⁇ g/mL to a 96-well plate containing 1 ⁇ 10 4 MDA-MB-231 (human breast cancer cells). Finally, the concentration was diluted to 0.002 ⁇ g/mL and 50 ⁇ L of each was treated in a 96-well plate. Afterwards, 100 ⁇ L of 200 ⁇ M AMP (Sigma-Aldrich®) was added to each well and cultured at 37°C for 6 hours.
  • the 96-well plate was centrifuged and the supernatant was transferred to a new 96-well plate. Afterwards, the adenosine concentration of the supernatant was measured using an Adenosine Assay kit (Cell Biolabs, Inc) according to the manufacturer's protocol. IC 50 values were calculated using GraphPad Prism software.
  • GI-108A1 As a result, the degree of luminescence was reduced in a concentration-dependent manner by GI-108A1 (AHF10240), GI-108A1 (AHP04167), GI-108B1, and Oleclumab.
  • the IC 50 values of GI-108A1 (AHF10240) and GI-108A1 (AHP04167) were confirmed to be 2.75 nM and 5.58 nM, respectively, and the IC 50 value of GI-108B1 was confirmed to be 3.37 nM.
  • Proleukin®, GI-108B1, IgG4 Fc-IL-2v and anti-CD73 antibody were treated alone, or anti-CD73 antibody (GI- ⁇ CD73) and IgG4 Fc -pSTAT5 of T cell populations (CD8+ T cells and Treg cells) in healthy human PBMC treated with IL-2v was measured.
  • human PBMCs were treated with Proleukin®, GI-108B1, IgG4 Fc-IL-2v, and anti-CD73 antibody alone, or treated with anti-CD73 antibody and IgG4 Fc-IL-2v at various concentrations and incubated at 37°C for 20 minutes. Incubated for minutes.
  • the EC 50 value of GI-108B1 against pSTAT5 in CD8+ T cells was significantly higher when treated with Proleukin®, IgG4 Fc-IL-2v or anti-CD73 antibody alone, or combined with anti-CD73 antibody and IgG4 Fc-IL-2v. It was confirmed that it was significantly lower than the treated group. Through this, it was confirmed that GI-108B1 exhibits a superior effect on STAT5 activation of CD8+ T cells than Proleukin® (FIGS. 11 and 12).
  • the EC 50 value of GI-108B1 against pSTAT5 in Treg cells was slightly lower than that of the group treated with IgG4 Fc-IL-2v or anti-CD73 antibody alone or in combination with anti-CD73 antibody and IgG4 Fc-IL-2v. It was confirmed to be high and significantly higher than the EC 50 value of the group treated with Proleukin®. Through this, it was confirmed that GI-108B1 was much less effective in activating STAT5 in Treg cells compared to Proleukin® ( Figures 13 and 13 14).
  • Human PBMC were suspended in 4Cell® Nutri-T GMP medium (Sartorius), and cells were distributed at 5X105 per well in a 96-well plate. Afterwards, cells were treated with GI-108B1 or Proleukin® at a final concentration of 10 nM in the presence of ⁇ CD3/CD28 dynabeads (ratio 1:1, Thermo Fisher Scientific). Every 2-3 days, the medium was replaced with new medium containing each drug. Cell numbers were counted on days 3, 5, 7, 10, and 12 using the ADAMTM-MC2 Cell Counter (Nanoentek).
  • 2x106 cells from each group were stained with the following antibodies: anti-CD3-BV510 (Clone SP34-2, BD Biosciences), anti-CD4 (Clone OKT-4, Biolegend Inc.), anti-CD8- AF700 (Clone RPA-T8, Biolegend Inc.), anti-CD25-BV421 (Clone M-A251, BD Biosciences), anti-CD45-APC (Clone HI30, eBioscience), and Fixable Viability Dye eFluor 780 (Invitrogen Inc.).
  • anti-CD3-BV510 Clone SP34-2, BD Biosciences
  • anti-CD4 Clone OKT-4, Biolegend Inc.
  • anti-CD8- AF700 Clone RPA-T8, Biolegend Inc.
  • anti-CD25-BV421 Clone M-A251, BD Biosciences
  • anti-CD45-APC Clone HI30, eBioscience
  • the number of CD8+ T cells in the GI-108B1-treated group was higher than that of the Proleukin®-treated group, and the number of Treg cells in the Proleukin®-treated group was approximately twice that of the GI-108B1-treated group. There were about a lot.
  • the group treated with GI-108B1 was approximately 2.46 times higher than the group treated with Proleukin®. Through this, it was confirmed that GI-108B1 exhibits a superior effect on CD8+ T cell proliferation over Treg cell proliferation compared to Proleukin® (FIG. 15).
  • CD8+ T cells express both CD73 and the IL-2 receptor complex
  • signaling by combining CD73 and IL-2 ⁇ with GI-108B1 in the same CD8+ T cell may have a synergistic effect on the activation of CD8+ T cells. Therefore, to confirm whether GI-108B1 cis-binds with CD73 and IL-2 ⁇ in the same CD8+ T cells, CTV-CD8+ T cells (anti-CD73 antibody treated/untreated group) and CTV+CD8+ T Cis-linkage analysis was performed using cells ( Figure 16). Specifically, CD8+ T cells were isolated from human PBMC using EasySepTM Human CD8+ T Cell Isolation Kit (STEMCELL technologies).
  • CTV Cell TraceTM Violet, Thermo Fisher Scientific.
  • Cells that were not labeled with CTV were divided into two groups, and only one group was treated with anti-CD73 antibody at a saturating concentration (1,000 nM) and pretreated at 4°C for 2 hours to block all CD73 on the cell surface. Unbound anti-CD73 antibody was washed away.
  • CTV unlabeled cells pretreated or untreated with anti-CD73 antibody were co-cultured with CTV labeled cells at a ratio of 1:1.
  • the co-cultured cells were treated with 0.5 nM GI-108B1 and incubated at 37°C for 20 minutes.
  • the cells were treated with Cytofix fixation buffer (BD Biosciences) and fixed for 12 minutes, then treated with Phosflow Perm buffer III (BD Biosciences) and reacted for 30 minutes.
  • cells were stained with anti-pSTAT5-AF647 (Clone 47/Stat5, BD Biosciences). Data on stained cells were measured using Cytek Aurora and analyzed using FlowJo software.
  • CTV-CD8+ T cells and CTV+CD8+ T cells showed similar levels of STAT5 phosphorylation.
  • the level of STAT5 phosphorylation in CTV-CD8+ T cells was reduced by 40-60%, and STAT5 phosphorylation in CTV+CD8+ T cells was reduced by 40-60%. It was confirmed that the level remained the same ( Figure 17).
  • PBMC is a subsidiary of Zen-bio Inc. Alternatively, it was purchased from STEMCELL Technologies.
  • the group in which target cells were co-cultured with PBMC treated with anti-CD3/CD28 dynabeads, AMP, and GI-108B1 showed a higher apoptosis rate than the isotype control group (+AMP).
  • MC38-hCD73 cells were transplanted, morbidity and mortality were checked daily, and the tumor volume was measured for mice in good health.
  • the average tumor size was 90-120 mm 3 , 16 mice were randomly selected. Subjects were selected considering their physiological state, weight change, and tumor growth rate. The selected animals were divided into groups of 8 as evenly as possible based on tumor volume and body weight. The test group was formed as shown in Table 10 below, and the test substance was administered.
  • Tumor volume was measured twice a week during the observation period using a caliper (Digital caliper, Mitutoyo, Japan) to measure the long axis (maximum length, L) and short axis (perpendicular width, W) of the tumor, using Equation I below: By substituting into , tumor volume (TV) and tumor growth inhibition (TGI) were measured.
  • V0 Tumor volume of negative control group at the time of first administration
  • NOG-B2m female mice were purchased from The Jackson Laboratory. NOG-B2m female mice were maintained in individually ventilated cages housed in an animal biosafety level 3 facility at 19-25°C and 30-70% humidity.
  • MDA-MB-231 human triple-negative breast cancer (TNBC) cell line was purchased from ATCC and cultured in DMEM medium (ThermoFisher Scientific) containing 10% FBS (ThermoFisher Scientific) and 1% antibiotic/antimycotic (GibcoTM). . Cultured MDA-MB-231 cells were harvested using trypsin (GibcoTM) and suspended in PBS. To establish a xenograft mouse tumor model, healthy mice 5 days after human peripheral blood cell transplantation were treated with MDA-MB-231 cell suspension (5 ⁇ 10 6 cells/0.025 mL) and 0.025 mL Matrigel matrix phenol red-free (cat.
  • Example 17 Vascular permeability analysis of GI-108B1
  • HUVEC cells (Lonza) were added to a collagen-coated trans-well using a trans-well insert (9321012, cellQART®) and cultured for 3 days. A confluent monolayer was created. After distributing PBMCs to 1 ⁇ 10 5 in a 96-well plate, they were treated with Proleukin® (5 nM) or GI-108B1 (5 nM) and cultured at 37°C and 5% CO 2 for 24 hours.
  • Proleukin® 5 nM
  • GI-108B1 5 nM
  • HUVEC cells cultured in a trans-well were treated with the drug and the supernatant of the PBMC culture and cultured for 24 hours at 37°C and 5% CO 2 conditions.
  • 100 ng/ml of TNF- ⁇ (PeproTech) was treated.
  • the upper chamber was treated with Dextran-FITC (70 kDa) and incubated for 1 hour and 30 minutes.
  • the fluorescence of Dextran-FITC moved to the lower chamber was measured at a wavelength of 485 nm / 500-550 nm (Ex / Em) using GloMax® Discover (promega).
  • Statistical calculations were analyzed using one-way ANOVA using Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc.), and Dunnett's test was performed based on the negative control.

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Abstract

본 발명은 항-CD73 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2가 결합된 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항-CD73 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2를 포함하는 융합단백질또는 이의 이량체는 암세포의 CD73에 결합하여 아데노신 생성을 저해하고, 이를 통해 A2AR 및 A2BR 신호전달경로를 차단함으로써 미세 종양환경을 제어할 수 있다. 또한, 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg)와 같은 면역억제세포는 덜 활성화시키면서 면역세포(CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포)를 활성화시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 융합단백질 내 IL-2 및 이의 변이체는 면역세포를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합단백질 및 이의 이량체는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

항-CD73 항체 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 및 이의 용도
본 발명은 항-CD73 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2가 결합된 융합단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
암 면역요법(cancer immunotherapy)은 체내 면역 작용을 이용하여 암을 치료하는 방법이다. 암 면역요법은 면역계가 암세포 표면 단백질과 같은 항원들을 표적으로 이용하여 암세포를 공격하도록 유발할 수 있으며, 암세포의 면역 회피를 초래하는 종양 미세환경을 제어하여 면역세포들의 활성을 높일 수 있다.
종양 미세환경은 암세포 외에도 암 조직 내에 존재하는 섬유아세포(fibroblast), 혈관, 림프관, 면역세포, 세포외기질(extracellular matrix), 지방세포 등을 포함한 암세포가 증식하고 진화하는 환경이다. 이와 관련하여, ATP-AMP-아데노신(adenosine)-A2AR/A2BR 신호전달 경로가 종양 미세환경에서 면역세포의 활성을 조절할 수 있다는 연구결과가 보고된 바 있다(S. Vigano et al., Front Immunol(2019) 10:925). 구체적으로, 아데노신이 종양세포나 면역세포 표면에 있는 A2AR/A2BR 수용체에 결합하게 되면 조절 T 세포나 TAM(tumor associated macrophage)과 같은 면역억제세포(immune suppressor cell)가 활성화되고, 세포독성 T 세포 및 NK 세포의 활성이 억제된다. 이때, ATP를 AMP로 전환해주는 엑토뉴클레오티다제(ectonucleotidase)인 CD39, AMP를 아데노신으로 전환해주는 엑토뉴클레오티다제인 CD73 또는 아데노신과 결합하는 A2AR/A2BR 수용체를 표적으로 하는 물질을 처리하여 해당 신호전달 경로를 억제함으로써, 종양 미세환경 내의 면역을 활성화하는 방법이 연구되고 있다.
한편, IL-2(interleukin 2)는 T 세포 성장 인자(T-cell growth factors, TCGF)로도 불리며, 림프구 생성, 생존 및 항상성에서 중심 역할을 하는 구형의 당단백질이다. IL-2는 개별적 3개의 서브유닛으로 구성된 IL-2 수용체(IL-2 receptor)에 결합함으로써 각종 면역 작용을 매개한다.
또한, IL-2는 활성화된 T 세포 중 특히, CD4+ 헬퍼 T 세포(helper T cell)에 의해 주로 합성된다. IL-2는 T 세포의 증식 및 분화를 자극하고, 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)의 생성 및 말초혈 림프구의 세포독성 세포 및 림포카인-활성화 살해 세포(lymphokine activated killer cell, LAK cell)로의 분화를 유도한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
이에, 본 발명자들은 종양 미세환경을 제어하여 면역세포의 활성을 증진시키는 새로운 조합의 융합단백질을 개발하기 위해 연구한 결과, 항-CD73 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 이량체가 종양 미세환경을 제어하고, 면역세포를 효과적으로 활성화시킴을 확인하였다. 이를 기반으로, 상기 융합단백질 이량체가 항암제로 효과가 있다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면은, CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편; 및 IL-2를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ⅱ) 융합단백질 이량체를 수득하는 단계;를 포함하는 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 이량체의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질 이량체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질 이량체를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질 이량체 의 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 항-CD73 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 또는 이의 이량체는 암세포의 CD73에 결합하여 아데노신 생성(ATP→AMP→adenosine)을 저해하고, 이를 통해 A2AR 및 A2BR 신호전달 경로를 차단함으로써 미세 종양환경을 제어할 수 있다. 또한, 조절 T 세포(regulatory T cell, Treg)와 같은 면역억제세포는 덜 활성화하면서 면역세포(CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포)를 활성화할 수 있다. 그뿐만 아니라, 본 발명의 융합단백질 내 IL-2 또는 이의 변이체는 면역세포를 활성화할 수 있다. 따라서, 본 발명의 융합단백질 및 이의 이량체는 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 일 실시예인 융합단백질 이량체(GI-108A1)의 구조를 도식화한 도면이다.
도 2는 일 실시예인 융합단백질 이량체(GI-108B1)의 구조를 도식화한 도면이다.
도 3은 2종의 GI-108A1, GI-108B1 및 Proleukin®을 HEK-BlueTM IL-2 리포터 세포에 각각 처리하고 JAK-STAT 신호 전달 경로의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 2종의 GI-108A1, GI-108B1 및 Proleukin®을 CTLL-2 세포에 각각 처리하고 세포의 증식 정도를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 인간 TNBC 세포주(MDA-MB-231)에서 2종의 GI-108A1, GI-108B1 및 Oleclumab의 Membrane-bound human CD73 효소 활성 억제능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 2종의 GI-108A1, GI-108B1 및 Oleclumab의 Soluble CD73 효소 활성 억제능을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 CD73-아데노신에 의해 활성이 저해된 CD8+ T 세포에 Vehicle(hIgG4), GI-108B1 단독, Proleukin® 단독, IgG4 Fc-IL-2v 단독, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 단독, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 및 IgG4 Fc-IL-2v 병용, Oleclumab 단독 또는 Oleclumab 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 후, CD8+ T 세포의 증식을 나타낸 그래프이다.
도 8은 CD73-아데노신에 의해 활성이 저해된 CD8+ T 세포에 Vehicle(hIgG4), GI-108B1 단독, Proleukin® 단독, IgG4 Fc-IL-2v 단독, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 단독, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 및 IgG4 Fc-IL-2v 병용, Oleclumab 단독 또는 Oleclumab 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 후, IFN-γ+CD8+ T 세포의 수를 나타낸 그래프이다.
도 9는 CD73-아데노신에 의해 활성이 저해된 CD4+ T 세포에 Vehicle(hIgG4), GI-108B1 단독, Proleukin® 단독, IgG4 Fc-IL-2v 단독, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 단독, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 및 IgG4 Fc-IL-2v 병용, Oleclumab 단독 또는 Oleclumab 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 후, CD4+ T 세포의 증식을 나타낸 그래프이다.
도 10은 CD73-아데노신에 의해 활성이 저해된 CD4+ T 세포에 Vehicle(hIgG4), GI-108B1 단독, Proleukin® 단독, IgG4 Fc-IL-2v 단독, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 단독, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 및 IgG4 Fc-IL-2v 병용, Oleclumab 단독 또는 Oleclumab 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 후, IFN-γ+CD4+ T 세포의 수를 나타낸 그래프이다.
도 11은 인간 PBMC에 다양한 농도의 Proleukin®, GI-108B1, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 또는 IgG4 Fc-IL-2v를 단독 처리하거나, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 후, CD8+ T 세포 집단의 pSTAT5를 측정한 그래프이다.
도 12는 인간 PBMC에 다양한 농도의 Proleukin® 또는 GI-108B1을 처리한 후, CD8+ T 세포 집단의 pSTAT5를 측정하여 EC50값을 나타낸 그래프이다.
도 13은 인간 PBMC에 다양한 농도의 Proleukin®, GI-108B1, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 또는 IgG4 Fc-IL-2v를 단독 처리하거나, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 후, Treg 세포 집단의 pSTAT5를 측정한 그래프이다.
도 14는 인간 PBMC에 다양한 농도의 Proleukin® 또는 GI-108B1 처리한 후, Treg 세포 집단의 pSTAT5를 측정하여 EC50값을 나타낸 그래프이다.
도 15는 인간 PBMC에 Proleukin® 또는 GI-108B1을 처리하여 12일 동안 배양한 후, CD8+ T 세포수, Treg 세포수 및 CD8+ T/Treg 비율을 측정하여 나타낸 도면이다.
도 16은 항-CD73 항체가 전처리된 CD8+ T 세포 및 CTV+CD8+ T 세포의 CD73 및 IL-2 수용체에 GI-108B1이 cis-결합할 경우 유도되는 STAT5 인산화를 도식화한 도면이다.
도 17은 CTV+CD8+ T 세포와 항-CD73 항체가 전처리된 CD8+ T 세포를 공배양한 샘플 및 CTV+CD8+ T 세포와 CD8+ T 세포를 공배양한 샘플에 GI-108B1을 처리한 후, 각 샘플의 pSTAT5+(CTV+/-)CD8+ T 세포를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 인간 PBMC로부터의 정제된 CD8+ T 세포에서 hCD73+CD8+ T 세포를 유세포 분석한 그래프이다.
도 19는 항-CD3/CD28 dynabeads 및/또는 AMP 존재 하에 hIgG4 또는 GI-108B1를 단독 처리하거나, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용처리한 PBMC와 MDA-MB-231 세포를 공동 배양한 후, 세포사멸률을 측정한 그래프이다.
도 20은 마우스 유래 대장암 세포(MC38) 식립 마우스에 Vehicle(PBS) 또는 GI-108B1을 투여한 후, 종양 부피를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 마우스 유래 대장암 세포(MC38) 식립 마우스에 Vehicle(PBS) 또는 GI-108B1을 투여한 후, 종양 성장 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 22는 마우스 유래 대장암 세포(MC38) 식립 마우스에 Vehicle(PBS) 또는 GI-108B1을 투여한 후, 25일차까지의 생존율을 나타낸 그래프이다.
도 23은 GI-108A1 및 GI-108B1의 항암 효과를 확인하기 위한 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 마우스를 이용한 실험계획을 도식화한 도면이다.
도 24는 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 마우스에 Vehicle(hIgG4), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 또는 항-PD-1 항체를 투여한 후, 18일째까지 종양 부피를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 마우스에 Vehicle(hIgG4), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 또는 항-PD-1 항체 투여 후, 각 처리군의 개별 실험동물에 대한 종양 부피를 나타낸 그래프이다.
도 26은 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 마우스에 Vehicle(hIgG4), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 또는 항-PD-1 항체를 투여한 후, 18일째의 종양 성장 억제율을 나타낸 그래프이다.
도 27은 Vehicle(hIgG4), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 또는 항-PD-1 항체를 각각 투여한 인간 유래 유방암 세포(MDA-MB-231) 식립 마우스 군의 18일째까지 체중을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 28은 trans-well에 배양시킨 HUVEC 세포에 PBMC 배양액의 상층액과 TNF-α, Proleukin® 또는 GI-108B1을 처리하여 배양한 후, 각 약물들의 혈관투과성을 측정한 그래프이다.
CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2를 포함하는 융합단백질
본 발명의 일 측면은, CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
CD73 및 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편
본 명세서에서 사용하는 용어, "CD73(Cluster of Differentiation 73)"은 5' 뉴클레오티드의 탈인산화를 촉매하는 엑토뉴클레오티다아제(ectonucleotidase)로 주로 AMP(adenosine monophosphate)를 아데노신으로 변환시키는 역할을 한다. CD73은 GPI 앵커(anchor)를 통해 세포막에 호모다이머(homodimer) 형태로 존재한다. 모노머(monomer)는 65 kDa이고, N-말단과 C-말단 도메인이 유동성 있는 나선형의 링커로 연결되어 있다.
CD73은 아데노신의 생성에 관여하며 암세포에서 과발현되고 면역억제작용을 유도하는 것으로 알려져 있다. 백혈병, 방광암, 신경교종, 교모세포종, 난소암, 흑색종, 전립선암, 갑상선암, 식도암 및 유방암이 포함된 많은 종양세포에 발현된다. 또한, 면역억제세포(조절 T세포(Treg) 및 골수유래억제세포(MDSC) 포함)의 표면에도 CD73가 발현되는 것으로 알려져 있다. 특히 CD73의 과발현은 유방암과 흑색종이 포함된 다양한 종양의 혈관 생성, 침윤, 화학요법에 대한 내성, 종양의 전이 및 암 환자의 짧은 생존기간과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다.
본 발명에서 상기 CD73은 포유류의 CD73이라면 제한없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 인간 CD73일 수 있다. 또한, 본 발명에서 상기 CD73 단백질은 천연형 또는 변이체 CD73 단백질을 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 천연형 CD73 단백질이란 천연형 CD73 단백질의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 일반적으로 지칭하며, 상기 천연형 CD73 단백질의 아미노산 서열이란 천연 발생 CD73에서 발견되는 아미노산 서열을 일반적으로 지칭한다. 상기 CD73에 대한 정보는 미국국립보건원의 GenBank 등 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 예를 들어 Genbank accession number NP_002517.1의 아미노산 서열(서열번호 41)을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "항원"은 항체에 선택적으로 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 표적 항원은 폴리펩타이드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 기타 자연적으로 발생된 화합물이거나 합성된 화합물일 수 있다. 구체적으로, 항원은 폴리펩타이드이며, 세포 표면 또는 세포 내에 존재하는 단백질일 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "특이적으로 결합하는"은 비-특이적 상호작용과 측정 가능하게 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 결합 활성을 갖지 않는 표적과 유사한 대조군 분자와 경쟁함으로써 결정될 수 있다.
상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD73에 특이적으로 항원-항체 결합을 할 수 있는 분자를 총칭할 수 있다. 또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD73과 특이적으로 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 한 어떠한 형태로도 이용될 수 있다. 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 결합에 직접적으로 수반되지 않는 다른 아미노산, 또는 항원 결합 부위의 아미노산 잔기에 의해 효과가 차단되는 아미노산을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "항체"는, 항원 결합 부위를 함유하는 분자, 및 항원 결합 부위를 함유하는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편을 지칭한다. 면역글로불린 분자는 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, IgY 또는 이의 하위부류(subclass)의 면역글로불린 분자일 수 있다. 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄는 각각 불변 영역(constant region) 및 가변 영역(variable region)을 포함할 수 있다. 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)이라 불리는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region, FR)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위이다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 단일클론 항체, 다클론 항체, 합성 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 비인간 항체, 및 이의 임의의 단편 뿐만 아니라 면역접합체를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "항체의 항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조 중 항원이 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부를 의미하며, 예를 들어 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 이중특이적 Fab 이량체(Fab2), 삼중특이적 Fab 삼량체(Fab3), Fv, 단일 쇄 Fv 단백질("scFv"), 비스-scFv(scFv)2, 미니바디, 다이아바디, 트라이아바디, 테트라바디, 이황화 안정화 Fv 단백질("dsFv"), 단일-도메인 항체(single domain antibody, sdAb), 및 항원 결합을 담당하는 전장 항체의 부분을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항체의 단편은 구조와 상관없이, 온전한(intact) 항체에 의해 인지되는 동일한 항원과 결합할 수 있다.
상기 단일-도메인 항체는 나노바디(nanobody)로도 불리며, 단일 단량체 가변 항체 도메인(single monomeric variable antibody domain)으로 구성된 항체 단편을 의미한다. 상기 단일-도메인 항체는 전장의 항체(whole antibody)와 동일하게 특정 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 단일-도메인 항체는 분자량이 12~15 kDa으로, 일반적인 항체(150~160 kDa), Fab 단편(~50 kDa), scFv(~25kDa)보다 작다. 상기 단일-도메인 항체는 예를 들어, 인간 또는 마우스의 일반적인 면역글로불린 G(IgG)의 이량체 가변 도메인을 단량체로 분할한 것일 수 있으며, 낙타과(Camelids)의 중쇄 항체인 VHH, 연골어류(Cartilaginous fishes)의 IgNAR로부터 얻은 VNAR 단편일 수 있다.
IL-2 또는 이의 변이체
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2" 또는 "인터루킨-2"는 달리 언급되지 않는 한, 포유동물, 예를 들어, 영장류(예, 인간) 및 설치류(예, 마우스 및 래트)를 포함하여 임의의 척추동물 공급원으로부터 수득한 임의의 야생형 IL-2를 의미한다. IL-2의 단백질 크기는 15.5 kDa 내지 16 kDa이며, 133개 아미노산으로 이루어져 있다. 상기 IL-2는 동물 세포에서 수득된 것일 수도 있으나, IL-2를 생산할 수 있는 재조합 세포로부터 수득된 것도 포함한다. 또한, 상기 IL-2는 야생형 IL-2 또는 이의 변이체일 수 있다.
본 명세서에서는 IL-2 혹은 이의 변이체를 총칭하여 "IL-2 단백질" 혹은 "IL-2 폴리펩타이드"의 용어로 표현하기도 한다. IL-2, IL-2 단백질, IL-2 폴리펩타이드, 및 IL-2 변이체는 예를 들어 IL-2 수용체(receptor)에 특이적으로 결합한다. 이 특이적인 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 확인할 수 있다.
상기 IL-2는 성숙된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 성숙된 IL-2는 신호서열을 포함하지 않는 것일 수 있으며, 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 이때, 상기 IL-2는 야생형 IL-2의 N-말단 또는 C-말단의 일부가 결실된(truncated) 단편을 포함하는 개념으로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "IL-2 변이체"는 전장(full-length) IL-2 또는 상술한 IL-2의 단편의 아미노산 일부가 치환된 형태를 의미한다. 즉, IL-2 변이체는 야생형 IL-2 또는 이의 단편과 다른 아미노산 서열을 가질 수 있다. 그러나, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2와 동등하거나 유사한 활성을 가질 수 있다. 여기에서, "IL-2 활성"은 예를 들어 IL-2 수용체에 특이적으로 결합하는 것을 의미할 수 있으며, 상기 특이적 결합은 당업자에게 알려진 방법을 통해 측정할 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 야생형 IL-2의 아미노산 일부가 치환된 것일 수 있다. 아미노산 치환에 의한 IL-2 변이체의 일 구체예로는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산 중 적어도 하나가 치환된 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째, 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산 중 적어도 어느 하나가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 그뿐만 아니라, IL-2가 서열번호 40의 아미노산 서열의 N 말단의 일부분이 결실된 형태일 경우, 서열번호 40의 아미노산 서열에서 상보적으로 대응되는 위치의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 일 구체예에 따르면, IL-2 활성이 유지되는 한, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 혹은 10개의 아미노산이 치환될 수 있다. 또 다른 구체예에 따르면, 1개에서 5개까지의 아미노산이 치환될 수 있다.
일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째 및 42번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 45번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 61번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 42번째, 45번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 45번째, 61번째 및 72번째 아미노산이 치환된 것일 수 있다.
이때, 상기 치환으로 도입되는 "다른 아미노산"은 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine), 아스파라긴(asparagine), 아스파르트산(aspartic acid), 시스테인(cysteine), 글루탐산(glutamic acid), 글루타민(glutamine), 히스티딘(histidine), 이소루신(isoleucine), 루신(leucine), 리신(lysine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenyl alanine), 프롤린(proline), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 트립토판(tryptophan), 티로신(tyrosine) 및 발린(valine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 단, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 상기 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째는 아르기닌으로 치환될 수 없으며, 42번째는 페닐알라닌으로 치환될 수 없고, 45번째는 티로신으로 치환될 수 없으며, 61번째는 글루탐산으로 치환될 수 없고, 72번째는 루신으로 치환될 수 없다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 아르기닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째 아미노산인 아르기닌은 알라닌으로 치환(R38A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 40의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 페닐알라닌을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 40의 아미노산 서열에서 42번째 아미노산인 페닐알라닌은 알라닌으로 치환(F42A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 40의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 티로신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 40의 아미노산 서열에서 45번째 아미노산인 티로신은 알라닌으로 치환(Y45A)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 40의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 글루탐산을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 40의 아미노산 서열에서 61번째 아미노산인 글루탐산은 아르기닌으로 치환(E61R)될 수 있다.
상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 40의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 루신을 제외한 다른 아미노산으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 상기 IL-2 변이체의 아미노산 치환에 있어서, 서열번호 40의 아미노산 서열에서 72번째 아미노산인 루신은 글리신으로 치환(L72G)될 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 치환이 일어난 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 구성된 군에서 선택되는 위치에서 두 군데 또는 세 군데의 위치에서 아미노산 치환이 일어날 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 두 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 F42A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
나아가, 상기 IL-2 변이체는 세 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 Y45A로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A, E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 네 군데의 아미노산이 치환된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A 및 E61R로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 R38A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다. 또한, 일 구체예로 상기 IL-2 변이체는 F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
나아가 상기 IL-2 변이체는 R38A, F42A, Y45A, E61R 및 L72G로 치환이 일어난 것일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 R38A, F42A 및 E61R로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 치환이 일어난 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 R38A, F42A 및 E61R의 치환이 일어난 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 IL-2 변이체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 IL-2 변이체는 생체 내에서 낮은 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다. 이때, 상기 생체 내에서 낮은 독성이란, IL-2가 IL-2 수용체의 알파체인(IL-2Rα)과 결합하여 유발되는 부작용일 수 있다. 본 출원에서 기술되는 IL-2의 변이체는 IL-2 수용체의 알파체인(IL-2Rα)과 결합력이 낮아 생체내 독성이 야생형 IL-2에 비해 낮다.
CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질의 구조
본 발명의 융합단백질은 CD73에 특이적으로 결합하는 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fc 영역 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함할 수 있다. 이때, 상기 Fc 영역 및 IL-2 또는 이의 변이체는 링커를 통해 결합할 수 있다.
구체적으로, 상기 융합단백질은 하기 구조식 (I)을 포함하는 것일 수 있다.
N'-X-[링커(1)]o-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]p-Y-C'(I)
이때, 상기 구조식 (I)에 있어서,
상기 N'은 N 말단이고,
상기 C'는 C 말단이며,
상기 X는 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
상기 Y는 IL-2이며,
상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
상기 o 및 p는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
이때, CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편; IL-2는 상술한 바와 동일하다.
일 실시예에서, 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody)를 포함하며, 이 경우 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 구체적으로는 단일-도메인 항체는 서열번호 15, 18 및 21로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역; 서열번호 16, 19 및 22로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역; 및 서열번호 17, 20 및 23으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 항원 결합 단편은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3; 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1, 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2, 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 항원 결합 단편은 서열번호 2, 3 및 4로 구성된 군으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 펩타이드 링커(1)은 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(1)은 12개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(1)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 하나, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(1)은 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 힌지는 다양한 IgG 하위 유형 항체의 힌지 영역으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 힌지는 면역글로불린 유래의 힌지 영역의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태이거나, 일부 아미노산 서열이 추가된 서열일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(1)이 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(2)는 1 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 2 내지 20개의 연속된 아미노산, 또는 2 내지 10개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(2)는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수)일 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예로, 상기 펩타이드 링커(2)는 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 면역글로불린 Fc 영역은 면역글로불린의 중쇄 불변 영역 2(CH2) 및 중쇄 불변 영역 3(CH3)을 포함하며, 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 및 경쇄 불변 영역(CL)은 포함하지 않는 단백질을 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM 유래일 수 있다. 구체적으로, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG의 하위 부류인 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4일 수 있으며, 바람직하게는 IgG4 유래일 수 있다.
또한, 상기 면역글로불린의 Fc 영역은 야생형 Fc 영역뿐만 아니라, Fc 영역 변이체일 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 용어 "Fc 영역 변이체"는 야생형 Fc 영역의 당쇄 형태(glycosylation pattern)와 다르거나, 야생형 Fc 영역보다 증가된 당쇄, 야생형 Fc 영역보다 감소한 당쇄, 또는 당쇄가 제거(deglycosylated)된 형태일 수 있다. 또한, 무당쇄(aglycosylated) Fc 영역도 포함된다. Fc 영역 혹은 변이체는 배양조건 혹은 호스트의 유전자 조작을 통해 조정된 숫자의 시알산(sialic acid), 퓨코실화(fucosylation), 당화(glycosylation)를 갖도록 한 것일 수 있다.
또한, 화학적 방법, 효소적 방법 및 미생물을 사용한 유전공학적 엔지니어링 방법 등과 같이 통상적인 방법으로 면역글로불린의 Fc 영역의 당쇄를 변형시킬 수 있다. 또한, 상기 Fc 영역 변이체는 면역글로불린 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM의 Fc 영역이 혼합된 형태일 수 있다. 또한, 상기 Fc 영역 변이체는 상기 Fc 영역의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태일 수 있다. 일 실시예에서 상기 Fc 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 융합단백질은 항-CD73 항체의 중쇄 가변 영역(VH), 중쇄 불변 영역 1(CH1), Fc 영역 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 이때, 상기 Fc 영역 및 IL-2 또는 이의 변이체는 링커를 통해 결합할 수 있다.
또한, 상기 융합단백질은 하기 구조식 (Ⅱ) 및 (Ⅲ)을 포함하는 것일 수 있다:
N'-X-[링커(3)]q-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(4)]r-Y-C' (Ⅱ) 및
N'-X'-C' (Ⅲ)
이때, 상기 구조식 (Ⅱ) 및 (Ⅲ)에 있어서,
상기 N'은 N 말단이고,
상기 C'는 C 말단이며,
상기 X는 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로써, 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역 1(CH1)을 포함하며,
상기 X'는 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로써, 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하고,
상기 Y는 IL-2이며,
상기 링커(3) 및 링커(4)는 펩타이드 링커이고,
상기 q 및 r은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
일 실시예에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 28의 아미노산 서열(Asp-Ala-Ser, DAS)을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
상기 펩타이드 링커 (3)은 1 내지 50개의 연속된 아미노산, 또는 3 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 5 내지 15개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(3)은 12개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 펩타이드 링커(3)은 적어도 하나의 시스테인을 포함할 수 있다. 구체적으로, 하나, 두 개 또는 세 개의 시스테인을 포함할 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 링커(3)은 면역글로불린의 힌지에서 유래된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 힌지는 다양한 IgG 하위 유형 항체의 힌지 영역으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 힌지는 면역글로불린 유래의 힌지 영역의 일부 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 형태이거나, 일부 아미노산 서열이 추가된 서열일 수 있다. 일 구체예에서는, 상기 펩타이드 링커(3)이 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
상기 펩타이드 링커(4)는 1 내지 30개의 연속된 아미노산, 또는 2 내지 20개의 연속된 아미노산, 또는 2 내지 10개의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 일 구체예로 상기 펩타이드 링커(4)는 (G4S)n(이때, n은 1 내지 10의 정수)일 수 있다. 이때, (G4S)n에서 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10일 수 있다. 일 실시예로, 상기 펩타이드 링커(4)는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있다.
본 실시예에서 이용되는“Fc 영역 단편 또는 이의 변이체”는 상술한 바와 동일하다.
융합단백질 이량체
본 발명의 다른 측면은, 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 두 개가 결합된 이량체를 제공한다. 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2는 상술한 바와 동일한다. 이때, 이량체를 구성하는 융합단백질 간의 결합은 링커 내에 존재하는 시스테인을 통해 이황화 결합으로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이량체를 구성하는 융합단백질은 동일한 것으로 구성된 동형이량체(homodimer)인 것일 수 있다.
구체적으로, 일 실시예에서 상기 이량체는 CD73에 특이적으로 결합하는 단일-도메인 항체, Fc 영역 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 두 개가 시스테인에 의해 이황화 결합된 이량체일 수 있다. 또한, 일 실시예에서 상기 이량체는 항-CD73 항체의 중쇄 가변 영역(VH), 중쇄 불변 영역 1(CH1), Fc 영역 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 및 항-CD73 항체의 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 융합단백질 두 개가 시스테인에 의해 이황화 결합된 이량체일 수 있다.
융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드
본 발명의 또 다른 측면은, CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이때, 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2 또는 이의 변이체는 상술한 바와 동일하다.
구체적으로, 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 단일-도메인 항체, Fc 영역 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 31, 서열번호 33 및 서열번호 35로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항-CD73 항체의 중쇄 가변 영역(VH), 중쇄 불변영역 1(CH1), Fc 영역 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드 및 항-CD73 항체의 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 융합단백질은 각각의 서열번호 37의 염기서열 및 서열번호 39의 염기서열에 의해 암호화 할 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 동일한 폴리펩타이드를 암호화한다면, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성하여 제조하는 경우, 당업계에 널리 공지된 합성법, 예를 들어 문헌(Engels and Uhlmann, Angew Chem IntEd Engl., 37:73-127, 1988)에 기술된 방법을 이용할 수 있으며, 트리에스테르, 포스파이트, 포스포르아미다이트 및 H-포스페이트 방법, PCR 및 기타 오토프라이머 방법, 고체 지지체상의 올리고뉴클레오티드 합성법 등을 들 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 31, 서열번호 33, 서열번호 35, 서열번호 37 및 서열번호 39의 각각의 염기서열과 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 적어도 약 100%의 동일성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 신호서열(signal sequence) 또는 리더 서열(leader sequence)을 추가적으로 포함할 수 있다. 여기에서 사용하는 용어 "신호서열"은 목적 단백질의 분비를 지시하는 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산을 의미한다. 상기 신호 펩타이드는 숙주 세포에서 번역된 후에 절단된다. 구체적으로, 본원 발명의 신호서열은 ER(endoplasmic reticulum) 막을 관통하는 단백질의 이동을 개시하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드이다.
신호서열은 당업계에 그 특징이 잘 알려져 있으며, 통상 16 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함하나, 그보다 더 많거나 적은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 통상적인 신호 펩타이드는 기본 N 말단 영역, 중심의 소수성 영역 및 보다 극성인(polar) C 말단 영역의 세 영역으로 구성된다. 중심 소수성 영역은 미성숙 폴리펩타이드가 이동하는 동안 막지질 이중층을 통하여 신호서열을 고정시키는 4 내지 12개의 소수성 잔기를 포함한다.
개시 이후에, 신호서열은 흔히 신호 펩티다아제(signal peptidases)로 알려진 세포 효소에 의하여 ER의 루멘(lumen) 내에서 절단된다. 이때, 상기 신호서열은 tPa(tissue Plasminogen Activation), HSV gDs(signal sequence of Herpes simplex virus glycoprotein D), IgG 신호서열 또는 성장 호르몬(growth hormone)의 분비신호서열일 수 있다. 바람직하게, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵세포에서 사용되는 분비 신호서열을 사용할 수 있다. 본 발명에서 유용한 신호서열은 항체 경쇄 신호서열, 예를 들면 항체 14.18(Gillies et al., J. Immunol. Meth 1989. 125: 191-202), 항체 중쇄 신호서열, 예를 들면, MOPC141 항체 중쇄 신호서열(Sakano et al., Nature, 1980. 286: 676-683) 및 당업계에 알려진 다른 신호서열(예, Watson et al., Nucleic Acid Research, 1984. 12:5145-5164를 참조)을 포함한다. 일 구체예로 상기 신호서열은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드가 적재된 벡터
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현 벡터를 제공한다. 이때, 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항원 결합 부위, IL-2 및 이의 변이체는 상술한 바와 동일하다.
구체적으로 상기 항-CD73 단일-도메인 항체 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 30, 서열번호 32 및 서열번호 34로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염기서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 항-CD73 항체 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 항-CD73 항체의 중쇄 영역을 암호화하는 서열번호 37의 염기서열 및 경쇄 영역을 암호화하는 서열번호 39의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 각각의 염기서열에 신호서열을 포함할 한 일 구체예는 중쇄 영역을 암호화하는 서열을 서열번호 36의 염기서열 및 경쇄 영역을 암호화하는 서열번호 38의 염기서열일 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 각각의 발현 벡터에 적재될 수도 있고, 하나로 바이시스트로닉 발현 벡터에 적재될 수도 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "벡터"는 숙주 세포에 도입되어 숙주 세포 유전체 내로 재조합 및 삽입될 수 있다. 또는 상기 벡터는 에피좀으로서 자발적으로 복제될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 수단으로 이해된다. 상기 벡터는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터, 미니-염색체 및 이의 유사체들을 포함한다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 벡터는 플라스미드 DNA, 파아지 DNA 등이 될 수 있고, 상업적으로 개발된 플라스미드(pUC18, pBAD, pIDTSAMRT-AMP 등), 대장균 유래 플라스미드(pYG601BR322, pBR325, pUC118, pUC119 등), 바실러스 서브틸리스 유래 플라스미드(pUB110, pTP5 등), 효모-유래 플라스미드(YEp13, YEp24, YCp50 등), 파아지 DNA(Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP 등), 동물 바이러스 벡터(레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 등), 곤충 바이러스 벡터(배큘로바이러스(baculovirus) 등) 등이 될 수 있다. 상기 벡터는 숙주 세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주 세포를 선택하여 사용함이 바람직하다.
또한, 상기 플라스미드는 항생제 내성 유전자와 같은 선별 마커를 포함할 수 있고, 플라스미드를 유지하는 숙주세포는 선택적인 조건하에서 배양될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, 목적 단백질의 "유전자 발현" 또는 "발현"은 DNA 서열의 전사, mRNA 전사체의 번역 및 융합단백질 생산물 또는 이의 단편의 분비를 의미하는 것으로 이해된다. 유용한 발현 벡터는 RcCMV(Invitrogen, Carlsbad) 또는 이의 변이체일 수 있다. 상기 발현 벡터는 포유류 세포에서 목적 유전자의 연속적인 전사를 촉진하기 위한 인간 CMV(cytomegalovirus) 프로모터 및 전사 후 RNA의 안정상태 수준을 높이기 위한 우태 성장 인자(bovine growth hormone) 폴리아데닐레이션 신호서열을 포함할 수 있다.
형질전환 세포
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포를 제공한다. 이때, 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현 벡터는 상술한 바와 동일하다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "형질전환 세포"는 재조합 발현 벡터가 도입될 수 있는 원핵세포 및 진핵세포를 나타낸다. 상기 형질전환 세포는 벡터를 숙주 세포에 도입하여 형질전환시킴으로써 제작할 수 있다. 또한, 상기 벡터에 포함된 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있다.
상기 형질전환은 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 본 발명의 융합단백질을 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다, 구체적으로, 상기 형질전환 방법은 CaCl2 침전법, CaCl2 침전법에 DMSO(dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 사용될 수 있다. 또한, 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시킬 수 있다. 또한, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 도입할 수 있다.
또한, 상기 형질전환 세포의 제작에 사용되는 숙주 세포 역시 본 발명의 항체를 생산할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 숙주 세포는 원핵세포, 진핵세포, 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 상기 원핵세포의 일 예로는 대장균을 사용할 수 있다. 또한, 진핵세포의 일 예로는 효모를 사용할 수 있다. 또한, 상기 포유동물 세포로 CHO 세포, F2N 세포, COS 세포, BHK 세포, 바우스(Bowes) 흑색종 세포, HeLa 세포, 911 세포, AT1080 세포, A549 세포, SP2/0 세포, 인간 림프아구(human lymphoblastoid), NSO 세포, HT-1080 세포, PERC.6 세포, HEK293 세포 또는 HEK293T 세포 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 당업자에게 알려진 포유동물 숙주 세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
또한, 항체의 치료제로서의 특성을 최적화하거나 다른 목적을 위해, 호스트 세포가 가진 당화(glycosylation) 관련 유전자를 당업자에게 알려진 방법을 통해 조작하여 항체의 당쇄 패턴(예를 들어, 시알산, 퓨코실화, 당화)을 조정할 수 있다.
융합단백질 이량체의 생산방법
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 이량체의 제조방법을 제공한다. 이때, 상기 융합단백질 및 융합단백질 이량체는 상술한 바와 동일하다.
구체적으로, 상기 융합단백질 이량체의 제조 방법은 i) 상기 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및 ⅱ) 융합단백질 이량체를 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.
상기 형질전환 세포를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려진 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 본 발명의 항체를 발현시켜서 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다.
또한, 배양물로부터 상기 항체를 수득하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 수득 방법은 생산된 본 발명의 융합단백질을 수득할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 수득 방법은 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면, 암모늄설페이트 침전), 크로마토그래피(예를 들면, 이온교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법일 수 있다.
융합단백질(이량체)의 용도
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질 이량체를 유효성분으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 이때, 상기 융합단백질 및 융합단백질 이량체는 상술한 바와 동일하다.
구체적으로 본 발명은 항-CD73 단일-도메인 항체 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질의 이량체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 항-CD73 항체 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 또는 상기 융합단백질의 이량체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "암"은 정상인 조직세포가 어떤 원인으로 무제한 증식하여 그 생체의 생활현상이나 주위의 조직상태 등과 관계없이 급속한 발육을 계속하는 질환으로 구분되며, 본 발명에서의 암은 인체의 각종 암, 예컨대 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에서 상기 융합단백질은 항암 활성을 나타내거나, 특히, 암의 치료 효과를 나타낼 수 있는 한, 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함될 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량% 내지 20.0 중량% 범위 내에서 결정될 것이다. 여기서 "유효량"이란 질환의 상태 개선 또는 치료(treatment) 효과, 특히 암의 상태 개선 또는 치료 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용하는 용어, "치료"는 치료학적 처리 및 예방적 처리를 모두 포함하는 의미로 사용될 수 있으며, 인간을 포함한 포유류에서 질환을 치료하기 위한 적용이나 어떠한 형태의 투약을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 질환의 진행을 억제하거나 늦추는 것을 포함하며; 손상되거나, 결손된 기능을 회복시키거나, 수리하여, 질환을 부분적이거나 완전하게 완화시키거나; 또는 비효율적인 프로세스를 자극하거나; 심각한 질환을 완화하는 의미를 포함한다. 상기 "예방"은 개체의 병리학적 상태 또는 질환을 완화시키거나 감소시키는 의미로 사용될 수 있다.
생체이용률과 같은 약동학적 파라미터(pharmacokinetic parameters) 및 클리어런스율(clearance rate)과 같은 기본적인 파라미터(underlying parameters)도 효능에 영향을 줄 수 있다. 따라서, "향상된 효능"(예를 들어, 효능의 개선)은 향상된 약동학적 파라미터 및 향상된 효능에 기인할 수 있으며, 시험동물 또는 인간 대상체에서 클리어런스율 및 암 질환 치료 또는 개선과 같은 파라미터를 비교하여 측정될 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물은 "치료학적으로 유효한 양"으로 투여한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 사용하는 용어 "치료학적으로 유효한 양" 또는 "약학적으로 유효한 양"이란 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 화합물 또는 조성물의 양으로서, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 구현예에서 치료학적으로 유효한 양은 암을 치료하는데 효과적인 약물의 양을 의미한다.
이때, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 환자에게 전달하기에 적절한 비-독성 물질이면 어떠한 담체라도 가능하다. 증류수, 알코올, 지방, 왁스 및 비활성 고체가 담체로 포함될 수 있다. 약물학적으로 허용되는 애쥬번트(완충제, 분산제) 또한 약학 조성물에 포함될 수 있다.
구체적으로, 상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약제학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 약제학적 조성물의 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 구체적으로 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주된다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.0001 ㎍/㎏ 내지 100 g/㎏ 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.
상기 약학 조성물이 적용(처방)될 수 있는 대상은 포유동물 및 사람이며, 특히 사람인 경우가 바람직하다. 본 발명의 약학 조성물은 암 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 임의의 화합물이나 천연 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암의 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 또는 융합단백질 이량체의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질 또는 융합단백질 이량체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 개체는 포유동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간일 수 있다. 또한, 상기 개체는 암을 앓는 환자이거나 암을 앓을 가능성이 큰 개체일 수 있다.
상기 융합단백질의 투여경로, 투여량 및 투여횟수는 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여방법, 투여량 및 투여횟수는 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 상기 CD73에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위 및 IL-2 또는 이의 변이체를 포함하는 융합단백질의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 성별, 연령, 환자의 중증도, 투여 경로에 따라 1일 0.0001 ㎍/kg 내지 100 g/kg 범위일 수 있다. 투여는 1일 1회 또는 수회로 나누어 이루어질 수 있다. 이러한 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
I. 융합단백질 및 이의 이량체의 제조
실시예 1. GI-108A1의 제조: 항-CD73 sdAb-hIgG4 Fc-hIL2v3
CD73에 특이적으로 결합하는 항-CD73 단일 도메인 항체(AHF10235, AHF10240, AHP04167) 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질을 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), 항-CD73 단일 도메인 항체(서열번호 2, 3 또는 4)와 링커(1)(서열번호 5), IgG4 Fc 영역(서열번호 6), 링커(2)(서열번호 7) 및 세 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(서열번호 8)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 30, 32 또는 34)를 BioxpTM 3250 SYSTEM을 이용해 pCGS3 벡터(Sigma-Aldrich®)에 적재하였다(표 1 내지 표 3).
구분 아미노산 서열 서열번호
mIgG signal MEWSWVFLFFLSVTTGVHS 1
항-hCD73 sdAb
(AHF10235)		 QVQVQESGGGLVQAGDSLRLSCAASGRSISRYNMGWFRQAPGKEREFVAAISRSGGVTYYADSVKGRLTISRDNAKSAVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADWRNSDSPSPLIIVYDYWGQGTQVTVSS 2
링커(1) GGGGS AESKYGPPCPPCP 5
hIgG4 Fc(F01) APEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG 6
링커(2) GGGGSGGGGSGGGGS 7
hIL2v3 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLERELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 8
구분 아미노산 서열 서열번호
mIgG signal MEWSWVFLFFLSVTTGVHS 1
항-hCD73 sdAb
(AHF10240)		 EVQLVESGGGVVQTGGSLRLSCAASGRTFTHLAMGWFRQAPGKEREFVAAISNSGAGTQFADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAADWGTRDSPSKLNAVYDYWGRGTQVTVSS 3
링커(1) GGGGS AESKYGPPCPPCP 5
hIgG4 Fc(F01) APEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG 6
링커(2) GGGGSGGGGSGGGGS 7
hIL2v3 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLERELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 8
구분 아미노산 서열 서열번호
mIgG signal MEWSWVFLFFLSVTTGVHS 1
항-hCD73 sdAb
(AHP04167)		 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVVSGRTFSNYHMGWFRQAPGKEREFVAVIGRSGGPTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAGDWRNSDSPSKLKPVYDYWGQGTQVTVSS 4
링커(1) GGGGS AESKYGPPCPPCP 5
hIgG4 Fc(F01) APEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG 6
링커(2) GGGGSGGGGSGGGGS 7
hIL2v3 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLERELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 8
또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 rpm, 8% CO2 조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액을 수거하여 융합단백질 이량체를 정제하였다. 상기 정제한 3종의 융합단백질 이량체를 각각 “GI-108A1(AHF10235)”, “GI-108A1(AHF10240)” 및 “GI-108A1(AHP04167)”로 명명하였다. 구체적으로, 상기 3종의 융합단백질 이량체에 대하여 각각 Protein A resin이 포함된 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 수거한 배양액을 여과시킨 후, 여과된 배양액을 컬럼(column)에 흘려주며 결합시켰다. 그 후, 50 mM 글리신(glycine), pH 3.4로 융합단백질 이량체를 수거하였다.
수거된 3종의 융합단백질 이량체(GI-108A1(AHF10235), GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167))가 포함된 버퍼를 투석을 이용하여 PBS(phosphate buffered saline, pH 7.4)로 바꾸어 주었다. NanoDrop 장비(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 각각 3.86 mg/mL, 4.12 mg/mL 및 12.86 mg/mL의 농도로 융합단백질 이량체가 포함된 것을 확인하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석을 통해 순도를 확인한 결과, 분리 정제된 3종의 융합단백질 이량체의 순도가 각각 71.81%, 75.36% 및 93.87%임을 확인하였다(표 4 및 표 5).
GI-108A1
(AHF10235)		 Peak Name RT Area %Area Height
1 Peak 1 12.067 24947 0.90 762
2 Peak 2 14.015 124244 4.50 2122
3 Peak 3 14.980 377981 13.68 6230
4 Monomer 17.022 1983970 71.81 48598
GI-108A1
(AHF10240)		 Peak Name RT Area %Area Height
1 Peak 1 11.962 198392 6.85 7601
2 Peak 2 13.697 138199 4.77 2536
3 Peak 3 14.694 351133 12.12 6847
4 Monomer 16.739 2183777 75.36 60301
GI-108A1(AHP04167) Peak Name RT Area %Area Height
1 Peak 1 12.111 21365 0.41 331
2 Peak 2 14.769 295396 5.72 5156
3 Monomer 16.682 4849570 93.87 140556
ID 제형화 후 농도 (mg/mL) 최종 단백질(mg) 정제 수율*
(μg/mL)		 최종 순도 응집
GI-108A1
(AHF10235)		 3.86 14.66 146.57 71.81 X
GI-108A1
(AHF10240)		 4.12 38.76 387.56 75.36 X
GI-108A1
(AHP04167)		 12.86 41.14 411.39 93.87 X
*정제 수율(Purification Yield): 정제 μg / 배양액 mL, 100 mL Scale
실시예 2. GI-108B1의 제조: 항-CD73 Ab-hIgG4 Fc-hIL2v3
CD73에 특이적으로 결합하는 항-CD73 항체 및 IL-2 변이체를 포함하는 융합단백질 이량체를 생산하기 위해, 시그널 펩타이드(서열번호 1), 항-CD73 항체 중쇄의 가변 영역(서열번호 9)과 불변 영역(서열번호 10), 링커(1)(서열번호 11), IgG4 Fc 영역(서열번호 6), 링커(2)(서열번호 12) 및 세 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(서열번호 8)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 36)와 시그널 펩타이드(서열번호 1), 항-CD73 항체 경쇄의 가변 영역(서열번호 13)과 불변 영역(서열번호 14)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 38)를 BioxpTM 3250 SYSTEM을 이용해 pCGS3 벡터(Sigma-Aldrich®)에 적재하였다(표 6).
또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질 이량체를 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 rpm, 8% CO2 조건에서 배양하였다. 그 후, 배양액을 수거하여 융합단백질 이량체를 정제하였다. 상기 정제한 융합단백질 이량체를“GI-108B1”으로 명명하였다.
구분 아미노산 서열 서열
번호
항-hCD73 HC-hIgG4Fc-
hIL2v3		 mIgG signal MEWSWVFLFFLSVTTGVHS 1
항-hCD73 VH
(CSA0060)		 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKFSGGSFTSYSFSWVRQAPGQGLEWMGRIIPVLTTTDYAQKFRDRVTITADESTSTAYMELSGLRSEDTAVYYCASGLKKNWYFDLWGRGALITVSS 9
항-hCD73 CH1
(CSA0060)		 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV 10
링커(1) ESKYGPPCPPCP 11
hIgG4 Fc(F01) APEAAGGPSVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSLSLG 6
링커(2) GGGGSGGGGS 12
hIL2v3 APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTAMLTAKFYMPKKATELKHLQCLERELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT 8
항-hCD73 LC(kappa) mIgG signal MEWSWVFLFFLSVTTGVHS 1
항-hCD73 VL
(CSA0060)		 DIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCQASQDISHYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASSLETGVPSRFSGSGSGTSFTLTISSLQPEDFATYYCQQYDDFPLTFGGGTKVDIK 13
항-hCD73 kappa CL
(CSA0060)		 RSVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 14
항-hCD73 VL-LCDR2
(CSA0060)		 DAS 28
구체적으로, 상기 GI-108B1에 대하여 Protein A resin이 포함된 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 수거한 배양액을 여과시킨 후, 여과된 배양액을 컬럼에 흘려주며 결합시켰다. 그 후, 50 mM 글리신, pH 3.4로 융합단백질 이량체를 수거하였다.
수거된 융합단백질 이량체가 포함된 버퍼를 투석을 이용하여 PBS(pH 7.4)로 바꾸어 주고, NanoDrop 장비(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 4.55 mg/mL의 농도로 융합단백질 이량체가 포함된 것을 확인하였다. 또한, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석을 통해 순도를 확인한 결과, 분리 정제된 융합단백질 이량체의 순도가 83.63%임을 확인하였다(표 7 및 표 8).
GI-108B1 Peak Name RT Area %Area Height
1 Peak 1 11.969 340915 11.45 6998
2 Peak 2 13.806 121831 4.09 1863
3 Monomer 15.656 2489084 83.63 57175
4 Peak 3 17.726 24509 0.82 547
ID 제형화 후 농도(mg/mL) 최종 단백질(mg) 정제 수율*
(μg/mL)		 최종 순도 응집
GI-108B1 4.55 27.28 272.82 83.63 X
*정제 수율(Purification Yield): 정제 μg / 배양액 mL, 100mL Scale
실시예 3. 항-CD73 항체의 제조: GI-αCD73
항-CD73 항체를 생산하기 위하여, 시그널 펩타이드(서열번호 1), 항-CD73 항체 중쇄의 가변 영역(서열번호 9)과 불변 영역(서열번호 10), 링커(1)(서열번호 11), IgG4 Fc 영역(서열번호 6)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 42)와 시그널 펩타이드(서열번호 1), 항-CD73 항체 경쇄의 가변 영역(서열번호 13)과 불변 영역(서열번호 14)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 38)를 BioXPTM 3250 SYSTEM을 이용해 pCGS3 벡터(Sigma-Aldrich®)에 적재하였다.
또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 대조항체 항-CD73 항체를 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 125 rpm, 8% CO2 조건에서 배양 후, 배양액을 수거하여 상기 대조항체 항-CD73 항체를 정제하였다. 정제는 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 4. IgG4 Fc-IL-2v의 제조
시그널 펩타이드(서열번호 1), 링커(1)(서열번호 11), IgG4 Fc 영역(서열번호 6), 링커(2)(서열번호 12) 및 세 개의 아미노산이 치환된 IL-2 변이체(서열번호 8)를 포함하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 43)를 BioXPTM 3250 SYSTEM을 이용해 pCGS3 벡터(Sigma-Aldrich®)에 적재하였다.
또한, 상기 벡터를 CHO 세포(Expi-CHOTM, Thermo Fisher Scientific)에 도입하여 융합단백질을 발현시켰다. 벡터를 도입한 후 37℃, 127 rpm, 5% CO2, 80% 습도 조건에서 7일간 배양하였다. 그 후, 배양액을 수거하여 IgG4 Fc-IL-2v 융합단백질을 정제하였다.
Ⅱ. 융합단백질 이량체의 특성 확인
실시예 5. GI-108의 각 절편의 타겟 단백질에 대한 결합력 측정
CD73에 특이적으로 결합하는 항-CD73 항체 및 IL-2 변이체가 결합된 GI-108A1(AHF04167), GI-108A1(AHP10240) 및 GI-108B1과 Aldesleukin(상품명: Proleukin®, Novartis)의 CD73 및 IL-2 수용체에 대한 결합력을 정량적으로 분석하기 위해, SPR(Surface plasmon resonance)을 이용하여 결합력을 측정하였다. Biacore™ T200 기기(Cytiva)를 이용하여 GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167) 및 GI-108B1의 hCD73, cyCD73, mCD73, hIL-2Rα, hIL-2Rβ, hIL-2Rβγ에 대한 결합력을 분석하였다. 와이바이오로직스(Ybiologics)사에 주문 의뢰하여 제작한 Oleclumab(Astrazeneca)을 대조군으로 이용하였다.
구체적으로, hCD73, cyCD73, mCD73의 결합력 분석을 위해, 상기 GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 및 Oleclumab을 각각 HBS-EP+ buffer(Cytiva, USA)에 희석하여 human antibody capture kit(Cytiva, USA)를 처리한 Sensor Chip CM5(Cytiva, USA)에 가역적으로 고정하였다. CD73은 HBS-EP+ buffer에 희석 후 30 μL/min 유속으로 결합 및 해리를 각 5분간 분석하였다.
hIL-2Rα와의 결합력 분석을 위해 hIL-2Rα를 His capture kit(Cytiva, USA)가 처리된 Sensor Chip CM5에 가역적으로 처리한 후 HBS-EP+ buffer에 희석된 GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 및 Proleukin®을 각각 1분간 처리하여 결합 및 해리를 확인하였다. 또한, hIL-2Rβ, hIL-2Rβγ와의 결합력은 비오틴화한 CD73을 Sensor Chip SA(Cytiva, USA) 위에 처리한 후, GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 및 Proleukin®을 CD73 위에 결합시키고 그 위에 HBS-P+ buffer (Cytiva, USA)에 희석한 hIL-2Rβ, hIL-2Rβγ를 처리하는 3단계 분석법을 통해 측정하였다. hIL-2Rβ는 결합 1분, 해리 1분 수행되었으며 hIL-2Rβγ는 단회주기결합력분석(single cycle kinetics analysis)으로 결합은 각 농도별 5분, 해리 2시간 수행되었다. 각 센서그램(sensorgram)은 공백 칸(blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(subtraction) 하여 친화도를 계산하였다.
Biacore™ T200 기기(Cytiva)를 이용한 상기 GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1의 CD73 및 IL-2 수용체에 대한 결합력 측정 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
KD(M) hCD73 cyCD73 mCD73 hIL-2Rα hIL-2Rβ hIL-2Rβγ
GI108B1 8.941E-11 1.13E-10 N.B. N.B. 2.29E-06 2.00E-10
GI108 A1(AHF10240) 5.02E-11 8.41E-11 2.62E-09 N.B. 2.50E-06 4.17E-10
GI108 A1(AHP04167) 8.80E-11 7.08E-11 3.45E-09 N.B. 2.07E-06 3.27E-10
Oleclumab 1.01E-10 3.49E-10 N/A N/A N/A N/A
Proleukin® N/A N/A N/A 4.96E-08 2.08E-06 1.00E-11
N.B.: 결합하지 않음(not binding), N/A: 해당없음(not applicable)
실시예 6. GI-108의 IL-2 변이체에 의해 유도되는 JAK-STAT 경로 활성화 능력 확인
본 실험은 GI-108의 IL-2 변이체 부위의 활성을 확인하기 위한 실험이다. 구체적으로, IL-2Rβγ를 발현하는 HEK-BlueTM IL-2 리포터(reporter) 세포(InvivoGen Inc.)를 이용하여 실험을 진행하였다. HEK-BlueTM IL-2 리포터 세포는 IL-2에 의해 JAK-STAT 경로가 활성화될 경우 리포터 단백질인 SEAP(secreted embryonic alkaline phosphatase) 단백질 생산이 유도된다. 본 실험에서는 SEAP 단백질을 검출함으로써 IL-2에 의한 활성화 능력을 확인하였다.
HEK-BlueTM IL-2 리포터 세포는 10% FBS(Gibco™)와 100 U/mL 페니실린(Welgene Inc.), 100 μg/mL 스트렙토마이신(Welgene Inc.), 100μg/mL NormocinTM (cat. ant-nr-1, InvivoGen Inc.)을 포함하는 DMEM 배지(Gibco™)에서 배양하였다. HEK-BlueTM IL-2 리포터 세포를 계대배양하여 안정화시킨 후, 트립신(Gibco™)을 이용하여 수확하였다. 그 후, PBS로 세척하여 죽은 세포를 제거하였다. 분리된 세포는 배양 배지에 약 2.8×105세포/mL이 되도록 세포 현탁액을 만들었다.
GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 및 대조군인 Proleukin®은 PBS를 이용하여 희석하여 96-웰-플레이트(cat. 30096, SPL)에 각 웰당 20 μL씩 분주하였다. 이 처리된 96-웰-플레이트에 준비해둔 세포 현탁액을 약 3×104세포수가 되도록 각 웰당 180 μL씩 넣어주고 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
24시간 후, 배양기에서 96-웰-플레이트를 꺼내 300Хg에서 5분간 원심 분리하여 상층액 20μL씩을 새로운 96-웰-플레이트로 옮겼다. 상층액이 담긴 각 웰에 상온에서 녹인 QUANTI-BlueTM solution(cat. Rep-qbs, InvivoGen Inc.)을 180μL씩 분주하고, 이후 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후, 분광광도계(VersaMaxTM Absorbance Microplate Reader)를 이용하여 630 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 데이터는 Graphpad prism 8.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
그 결과, GI-108A1(AHF10240) 및 GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 및 Proleukin®에 의해 농도 의존적으로 흡광도가 증가하였다. 이를 통해, 2종의 GI-108A1 및 GI-108B1의 IL-2 변이체 부위에 의해 JAK-STAT 신호 전달 경로가 활성화되는 것을 확인하였다(도 3). GI-108A1(AHF10240) 및 GI-108A1(AHP04167)의 EC50값은 각각 2.63 pM 및 3.94 pM로 확인되었으며, GI-108B1의 EC50값은 1.28 pM로 확인되었다. 양성 대조군인 Proleukin®의 EC50값은 10.3 pM로 확인되었다.
실시예 7. GI-108의 IL-2 변이체에 의해 유도되는 세포 증식 유도능 확인
hIL-2Rαβγ를 발현하는 CTLL-2 세포를 이용한 증식 실험을 통해 GI-108A1 및 GI-108B의 IL-2 변이체에 대한 생물학적 활성을 확인하였다. CTLL-2 세포는 0.2 mM L-글루타민, T-STIM™ 배양 보충물(ConA(콘카나발린-A) 포함), 0.2 mM 피루브산 나트륨, 10% FBS가 보충된 완전 RPMI 1640 배지(Thermo Fisher Scientific)에서 배양하였다.
GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 및 대조군인 Proleukin®은 PBS로 희석하여 96-웰-플레이트(cat. 30096, SPL)에 각 웰당 50 μL씩 분주하였다. 상기 약물들이 처리된 96-웰-플레이트에 준비해둔 CTLL-2 세포를 각 웰당 1.2×105 세포수가 되도록 넣어주고, 증식을 분석하기 위해 WST-1 10 μL를 각 웰에 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 배양한 후 흡광도를 측정하였다.
분광광도계(VersaMaxTM Absorbance Microplate Reader)를 450nm 및 690nm(기준)파장에서 흡광도를 측정하였다. CTLL-2 세포 증식 데이터는 450nm의 흡광도 값에서 690nm의 흡광도 값을 빼서 분석하였다.
그 결과, GI-108A1(AHF10240) 및 GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 및 Proleukin®에 의해 농도 의존적으로 흡광도가 증가하였다. 이를 통해, 2종의 GI-108A1 및 GI-108B1의 IL-2 변이체 부위에 의해 CTLL-2 세포의 증식이 유도되는 것을 확인하였다(도 4). GI-108A1(AHF10240) 및 GI-108A1(AHP04167)의 EC50값은 각각 2.02 nM 및 3.93 nM로 확인되었으며, GI-108B1의 EC50값은 1.70 nM로 확인되었다. 양성 대조군인 Proleukin®의 EC50값은 0.08 nM로 확인되었다.
Proleukin®의 EC50값이 GI-108A1 및 GI-108B1보다 낮은 것은 CTLL-2 세포가 hIL-2Rαβγ를 발현한 것에 기인한 것으로, GI-108A1 및 GI-108B1이 IL-2Rα에 결합하지 않기 때문에 Proleukin®보다 EC50값이 20배 이상 높은 것을 확인하였다.
실시예 8. GI-108의 membrane-bound CD73 효소 활성 억제 능력 확인
1×104개의 MDA-MB-231(인간 유방암 세포)가 분주된 96-웰-플레이트에 GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 및 대조군인 Oleclumab을 300μg/mL에서 최종적으로 농도가 0.002 μg/mL가 되도록 희석하여 96-웰-플레이트에 50μL씩 각각 처리하였다. 그 후, 200μM의 AMP(Sigma-Aldrich®)를 각 웰당 100μL씩 첨가한 후, 37℃에서 6시간 동안 배양하였다.
96-웰-플레이트를 원심분리하고, 상층액을 새로운 96-웰-플레이트에 옮겼다. 그 후, Adenosine Assay kit(Cell Biolabs, Inc)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 상층액의 아데노신 농도를 측정하였다. IC50값은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
그 결과, GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 및 Oleclumab에 의해 농도 의존적으로 발광 정도가 감소되었다. 이를 통해, 상기 2종의 GI-108A1 및 GI-108B1이 membrane-bound CD73 효소 활성을 억제하는 것을 확인하였다(도 5). GI-108A1(AHF10240) 및 GI-108A1(AHP04167)의 IC50값은 각각 2.75 nM 및 5.58 nM로 확인되었으며, GI-108B1의 IC50값은 3.37 nM로 확인되었다. 대조군인 Oleclumab의 IC50값은 1.47 nM로 확인되었다. GI-108B1의 IC50값이 GI-108A1(AHF10240) 및 Oleclumab의 IC50값보다 높지만, 효소 억제 효능에서 최대 잠재력을 나타내었다.
실시예 9. GI-108의 Soluble CD73 효소 활성 억제 능력 확인
GI-108의 soluble CD73 효소 활성 억제능력을 평가하기 위해, AMP-Glo™ Assay kit(Promega, V5012)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. 구체적으로, GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 및 대조군인 Oleclumab을 0.05 ng/mL가 되도록 희석하여 96-웰-플레이트에 각 웰당 2.5 μL씩 처리하고, 10 μM의 AMP를 각 웰당 12.5 μL씩 첨가하였다. 그 후, 2.5 ng/mL의 재조합 인간 CD73 단백질을 각 웰당 10 μL씩 첨가하고, 상온에서 10분 동안 배양하였다.
각 웰에 25 μL의 AMP-Glo™ Reagent(Promega)를 처리하여 반응을 종료시키고, 2분 동안 흔들어 준 후, 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 각 웰에 AMP Detection solution을 처리하고 2분 동안 흔들어 준 후, 상온에서 1시간 동안 배양하였다. GloMax®-Multi Detection System(Promega)을 사용하여 발광 정도를 측정하였으며, IC50값은 GraphPad Prism 8.0 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
그 결과, GI-108A1(AHF10240), GI-108A1(AHP04167) 및 GI-108B1에 의해 농도 의존적으로 발광 정도가 감소되었다. 이를 통해, 2종의 GI-108A1 및 GI-108B1가 Soluble CD73 효소 활성을 억제하는 것을 확인하였다(도 6). 한편, Oleclumab의 처리 농도가 높을수록 효소 억제 효능이 낮아지는 hook effect가 나타났다. GI-108A1(AHF10240) 및 GI-108A1(AHP04167)의 IC50값은 각각 0.060 nM 및 0.102 nM로 확인되었으며, GI-108B1 및 Oleclumab의 IC50값은 각각 0.126 nM 및 0.03 nM로 확인되었다. GI-108B1의 IC50값이 2종의 GI-108A1 및 Oleclumab의 IC50값보다 높지만, 효소 억제 효능에서 최대 잠재력을 나타내었다.
실시예 10. GI-108B1의 CD73-아데노신에 의해 억제된 T 세포의 활성 회복(reinvigoration) 확인
GI-108B1이 CD73-아데노신에 의해 저해된 CD8+ T 세포 활성을 회복시키는지 확인하기 위해, 인간 PBMC를 5% 인간 혈청(Sigma-Aldrich®), 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 5mM β-메르캅토에탄올(ThermoFisher Scientific)을 포함하는 TexMACS™ medium(Miltenyi Biotec)에서 37℃, 5% CO2의 습한 조건으로 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날, 세포를 CTV로 표지하고 1 x 106개 세포/ml로 96-웰 플레이트에 분주하였다. αCD3/CD28 dynabeads(비율 1:1)를 사용하여 세포를 자극하였다.
Vehicle(hIgG4), Proleukin®, GI-108B1, 항-CD73 항체(GI-αCD73), IgG4 Fc-IL-2v 및 Oleclumab을 단독으로 처리하고, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 및 IgG4 Fc-IL-2v, Oleclumab 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리하였다. 처리된 약물들의 최종 농도가 50 nM가 되도록 각 웰에 첨가하였다. 그 후, 500μM의 AMP를 각 웰에 첨가하고, 세포를 37℃, 5% CO2의 습한 조건에서 3일 동안 배양하였다.
T 세포 기능 활성화를 평가하기 위해, 세포를 αCD3/CD28 dynabeads(비율 1:1), 50nM 또는 500μM의 AMP를 Brefeldin A 존재 하에 37℃, 5% CO2의 습한 조건에서 4시간 동안 재자극하였다. Teff 세포의 증식을 FACS 분석하기 위해, 다음 항체들을 사용하여 세포의 표면 마커를 염색하였다: 항-CD3-PerCP-Cy5.5(Clone: UCHT1, BD Biosciences), 항-CD8-Alexa Fluor700(Clone: RPA-T8, Biolegend Inc.) 및 Fixable Viability Dye eFluor 780(Invitrogen Inc.). 세포 내 IFN-γ를 염색하기 위해, 세포에 고정/투과 완충액을 처리한 후 항-IFNγ-APC(Clone: 4S.B3, Biolegend Inc.) 항체로 염색하였다. 염색된 세포에 대한 데이터는 Symphony A3 기기를 사용하여 수득하였으며, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
그 결과, AMP를 처리하고 Vehicle(hIgG4)을 처리한 경우, CD8+ T 세포의 증식이 감소되었다. 반면, GI-108B1를 처리한 경우, CD8+ T 세포의 증식이 유의미하게 증가하였다. 또한, 항-CD73 항체를 단독 처리하거나, 항-CD73 항체 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 경우에도 CD8+ T 세포의 증식이 증가하는 것을 확인하였다. 한편, Proleukin®, Oleclumab 또는 IgG4 Fc-IL-2v를 단독 처리하거나, Oleclumab과 IgG4 Fc-IL-2v를 병용투여한 경우에는 CD8+ T 세포의 증식이 증가하는 경향이 나타나지 않았다(도 7). 또한, AMP를 처리하고 Vehicle(hIgG4)을 처리한 경우, CD8+ T 세포의 IFN-γ의 생산이 감소되었다. 반면, GI-108B1를 처리한 경우, CD8+ T 세포의 IFN-γ의 생산이 유의미하게 증가하였다(도 8).
나아가, AMP를 처리하고 Vehicle(hIgG4)을 처리한 경우, CD4+ T 세포의 증식이 감소되었다. 반면, GI-108B1를 처리한 경우, CD4+ T 세포의 증식이 유의미하게 증가하였다. 또한, 항-CD73 항체를 단독 처리하거나, 항-CD73 항체 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 경우에도 CD4+ T 세포의 증식이 증가하였다. 한편, Proleukin®, Oleclumab 또는 IgG4 Fc-IL-2v를 단독 처리하거나, Oleclumab과 IgG4 Fc-IL-2v를 병용투여한 경우에는 CD4+ T 세포의 증식이 증가하는 경향이 나타나지 않았다(도 9). 또한, AMP를 처리하고 Vehicle(hIgG4)을 처리한 경우, CD4+ T 세포의 IFN-γ의 생산이 감소되었다. 반면, GI-108B1를 처리한 경우, CD4+ T 세포의 IFN-γ의 생산이 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다(도 10). 이를 통해, GI-108B1이 CD73-아데노신에 의해 저해된 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 활성을 회복시키는 것을 확인하였다.
실시예 11. pSTAT5 분석을 이용한 GI-108B1의 활성 확인
GI-108B1의 활성을 확인하기 위해, Proleukin®, GI-108B1, IgG4 Fc-IL-2v 및 항-CD73 항체(GI-αCD73)를 단독 처리하거나, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 건강한 인간 PBMC 내 T 세포 집단(CD8+ T 세포 및 Treg 세포)의 pSTAT5를 측정하였다. 구체적으로, 인간 PBMC에 Proleukin®, GI-108B1, IgG4 Fc-IL-2v 및 항-CD73 항체를 단독 처리하거나, 항-CD73 항체 및 IgG4 Fc-IL-2v를 다양한 농도로 처리하고 37℃에서 20분 동안 배양하였다. 세포 표면 염색을 위해 세포를 다음 항체로 염색하였다: 항-CD3-BV510(Clone SP34-2, BD Biosciences), 항-CD4-PE-Cy7(Clone OKT-4, Biolegend Inc.), 항-CD8-AF700(Clone RPA-T8, Biolegend Inc.), 항-CD25-BV421(Clone M-A251, BD Biosciences), 항-CD56-BV605(Clone NCAM16.2, BD Biosciences), 항-CD127-BV650(Clone A019DS, Biolegend Inc.) 및 Fixable Viability Dye eFluor 780(Invitrogen Inc.).
세포 내 염색을 위해 TFP Fix/Perm buffer(BD Biosciences)를 처리하여 12분 동안 세포를 고정시키고, Perm buffer Ⅲ(BD Biosciences)를 처리하여 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 세포를 항-pSTAT5-AF647(Clone 47/Stat5, BD Biosciences)로 염색하였다. 염색된 세포에 대한 데이터는 Cytek Aurora(Cytek Biosciences)를 사용하여 측정하였고, FlowJo 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, CD8+ T 세포에서 pSTAT5에 대한 GI-108B1의 EC50값이 Proleukin®, IgG4 Fc-IL-2v 또는 항-CD73 항체를 단독 처리하거나, 항-CD73 항체 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 군보다 현저하게 낮은 것을 확인하였다. 이를 통해, GI-108B1이 Proleukin® 보다 CD8+ T 세포의 STAT5 활성화에 대해 우수한 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다(도 11 및 도 12).
또한, Treg 세포에서 pSTAT5에 대한 GI-108B1의 EC50값이 IgG4 Fc-IL-2v 또는 항-CD73 항체를 단독 처리하거나, 항-CD73 항체 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 군보다 약간 높았으며, Proleukin®을 처리한 군의 EC50값보다는 현저하게 높은 것을 확인하였다, 이를 통해, Treg 세포에서는 GI-108B1이 Proleukin®과 비교하여 STAT5 활성화에 훨씬 덜 효과적인 것을 확인하였다(도 13 및 도 14).
실시예 12. GI-108B1의 T세포 증식 능력 확인
인간 PBMC를 4Cell® Nutri-T GMP 배지(Sartorius)에 현탁시키고, 96-웰 플레이트에 각 웰당 5X105개씩 세포를 분주하였다. 그 후, αCD3/CD28 dynabeads(비율 1:1, Thermo Fisher Scientific)의 존재 하에 최종 농도 10 nM의 GI-108B1 또는 Proleukin®을 처리하였다. 2-3일마다 각 약물을 포함하는 새로운 배지로 교체해주었다. ADAM™-MC2 Cell Counter(Nanoentek)를 사용하여 3, 5, 7, 10 및 12일차에 세포 수를 계수하였다. 12일차에 각 그룹의 세포 2x106개를 다음 항체로 염색하였다: 항-CD3-BV510(Clone SP34-2, BD Biosciences), 항-CD4(Clone OKT-4, Biolegend Inc.), 항-CD8-AF700(Clone RPA-T8, Biolegend Inc.), 항-CD25-BV421(Clone M-A251, BD Biosciences), 항-CD45-APC(Clone HI30, eBioscience) 및 Fixable Viability Dye eFluor 780(Invitrogen Inc.). 세포 내 염색을 위해 세포에 고정/투과 완충액(BD Biosciences)을 처리하고 항-Foxp3-PE(Clone PCH101, Invitrogen Inc.) 항체로 염색하였다. 염색된 세포에 대한 데이터는 Cytek Aurora 장비를 사용하여 측정하였고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
그 결과, Proleukin®을 처리한 군보다 GI-108B1을 처리한 군의 CD8+ T 세포의 수가 많았고, Treg 세포의 수는 GI-108B1을 처리한 군보다 Proleukin®을 처리한 군의 세포수가 약 2배가량 많았다. 상기 CD8+ T 세포수와 Treg 세포수의 비율(CD8+ T/Treg)을 계산한 결과, GI-108B1을 처리한 군이 Proleukin®을 처리한 군보다 약 2.46배 정도 높은 것을 확인하였다. 이를 통해, GI-108B1은 Proleukin®과 비교하여 Treg 세포 증식보다 CD8+ T 세포 증식에 있어서 우위효과를 나타내는 것을 확인하였다(도 15).
실시예 13. CD8+ T 세포에서의 GI-108B1의 cis-결합 분석
CD8+ T 세포는 CD73과 IL-2 수용체 복합체를 모두 발현하기 때문에 동일한 CD8+ T 세포에서 CD73 및 IL-2βγ와 GI-108B1의 결합에 의한 신호전달은 CD8+ T 세포의 활성화에 시너지 효과를 나타낼 수 있다. 이에, GI-108B1이 동일한 CD8+ T 세포에서 CD73 및 IL-2βγ와 cis 결합(cis-binding)을 하는지 확인하기 위해, CTV-CD8+ T 세포(항-CD73 항체 처리/미처리군)와 CTV+CD8+ T 세포를 이용하여 cis-결합 분석을 수행하였다(도 16). 구체적으로, EasySep™ Human CD8+ T Cell Isolation Kit(STEMCELL technologies)를 이용하여 인간 PBMC로부터 CD8+ T 세포를 분리하였다. 분리된 CD8+ T 세포의 절반을 0.5 μM CTV(Cell Trace™ Violet, Thermo Fisher Scientific)로 표지하였다. CTV가 표지되지 않은 세포를 다시 두 그룹으로 나누고, 그 중 한 그룹에만 포화 농도(1,000 nM)의 항-CD73 항체를 처리하고 4℃에서 2시간 동안 전처리하여 세포 표면의 모든 CD73을 차단한 후, 결합하지 않은 항-CD73 항체를 세척하였다.
그 후, 항-CD73 항체를 전처리 또는 미처리한 CTV 비표지 세포를 CTV 표지 세포와 각각 1:1의 비율로 공동 배양하였다. 공동 배양된 세포를 0.5 nM의 GI-108B1을 처리하고 37℃에서 20분 동안 반응시켰다. 그 후, 세포에 Cytofix fixation buffer(BD Biosciences)을 처리하고 12분 동안 고정시킨 후, Phosflow Perm buffer Ⅲ(BD Biosciences)를 처리하고 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 세포를 항-pSTAT5-AF647(Clone 47/Stat5, BD Biosciences)로 염색하였다. 염색된 세포에 대한 데이터는 Cytek Aurora를 사용하여 측정하였고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 항-CD73 항체가 전처리되지 않은 CTV-CD8+ T 세포와 공동 배양한 CTV+CD8+ T 세포의 경우, CTV-CD8+ T 세포와 CTV+CD8+ T 세포는 유사한 수준의 STAT5 인산화 수준을 나타낸 반면, 항-CD73 항체가 전처리된 CTV-CD8+ T 세포와 공동 배양한 CTV+CD8+ T 세포의 경우, CTV-CD8+ T 세포의 STAT5 인산화 수준이 40-60% 감소되었으며, CTV+CD8+ T 세포에서의 STAT5 인산화 수준은 동일하게 유지되는 것을 확인하였다(도 17). PBMC로부터의 정제된 CD8+ T 세포에서 hCD73을 발현하는 hCD73+CD8+ T 세포가 약 70%인 점(도 18)과 상기 결과를 통해 GI-108B1이 CD73을 발현하는 CD8+ T 세포에서 우선적으로 cis-결합함을 확인하였다.
Ⅲ. 융합단백질 이량체의 항암 효과 확인
실시예 14. GI-108B1의 면역세포-매개 종양 살해능 확인
GI-108B1의 면역세포-매개 종양 살해능을 확인하기 위해, 항-CD3/CD28 dynabeads 및/또는 AMP가 있는 상태에서 MDA-MB-231 세포 및 건강한 인간 PBMC와의 공동 배양 시스템을 이용하여 GI-108B1의 항암효과를 확인하였다. 구체적으로, MDA-MB-231 야생형 세포에 대한 PBMC의 세포독성은 유세포 분석 기반 Annexin V/7-AAD 분석을 사용하여 평가하였다. PBMC는 Zen-bio Inc. 또는 STEMCELL Technologies사에서 구입하였다.
PBMC는 hIgG4(5 nM), 항-CD73 항체(GI-αCD73, 5 nM)와 IgG4 Fc-IL-2v(5 nM)의 병용 또는 GI-108B1(5 nM)을 단독으로 처리하였고, 이와 함께 αCD3/CD28 dynabeads(비율 1:1) 또는 500 μM의 AMP를 처리하여 표적 세포(MDA-MB-231 야생형 세포)와의 공동 배양 전으로부터 2일 동안 배양하였다. 표적 세포를 CTV로 표지하고 각 웰당 1x105세포수가 되도록 24-웰 플레이트에 분주하였다. 하룻밤 동안 배양한 후, 미리 자극시킨 PBMC를 효과기 세포(effector cell) 대 표적세포의 비율을 10:1로 하여 표적 세포에 첨가하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 공동 배양하였다. 세포를 Annexin V 및 7-AAD(Biolegend Inc.)로 염색하였고, CTV 표지된 표적세포의 사멸률을 Symphony A3 기기를 사용하여 측정하였고, FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 항-CD3/CD28 dynabead 및 hIgG4만을 처리한 PBMC와 표적세포를 공동배양한 군(이소타입 대조군(-AMP))에서 항-CD3/CD28 dynabead, AMP 및 hIgG4를 처리한 PBMC와 표적세포를 공동배양한 군(이소타입 대조군(+AMP))보다 세포사멸률이 높은 것을 확인하였다. 이를 통해, AMP를 처리하여 아데노신이 풍부한 조건에서 면역세포의 활성(세포 살해능)이 저해되는 것을 확인하였다.
한편, AMP를 처리하였음에도 불구하고 항-CD3/CD28 dynabeads, AMP 및 GI-108B1을 처리한 PBMC와 표적세포를 공동배양한 군과 항-CD3/CD28 dynabeads, AMP, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 PBMC와 표적세포를 공동배양한 군 모두 이소타입 대조군(+AMP)보다 높은 세포사멸률을 나타내었다. 특히, 항-CD3/CD28 dynabeads, AMP 및 GI-108B1을 처리한 PBMC와 표적세포를 공동배양한 군이 항-CD3/CD28 dynabeads, AMP, 항-CD73 항체(GI-αCD73) 및 IgG4 Fc-IL-2v를 병용 처리한 PBMC와 표적세포를 공동배양한 군 대비 유의하게 표적세포의 세포사멸률을 높여 가장 높은 세포사멸률을 나타내었다(도 19).
실시예 15. 마우스 유래 대장암 세포 식립 마우스에서 GI-108B1 투여에 의한 항암 효과 확인
마우스 CD73 유전자를 사람 CD73 유전자로 교체시킨 C57BL/6 마우스 유래 대장암 세포주(murine colon cancer cell)인 MC38 세포주(MC38-hCD73)를 이식한 종양 모델에 시험물질 GI-108B1을 투여한 후 종양의 성장 억제효과를 평가하였다. 먼저, 암세포주가 이식된 마우스 모델을 제작하기 위해, C57BL/6J-hCD73 암컷 마우스(6-8주령, SMOC, 중국)에 MC38-hCD73 세포(SMOC, 중국) 부유액을 1×106세포/100 μL씩 동물의 우측 등 부위의 피하에 투여하였다.
MC38-hCD73 세포를 이식하고 매일 이환율과 사망률을 확인하였으며 건강상태에 이상이 없는 마우스에 대해 종양의 부피를 측정하여, 평균 종양크기가 90-120 mm3일때 무작위로 16마리를 선별하였다. 개체 선정은 개체의 생리적 상태, 체중 변화 및 종양 성장속도를 고려하여 선발하였다. 선별된 동물은 종양의 부피 및 체중을 기초로 하여 가능한 균등하도록 군당 8마리씩 분리하였다. 하기 표 10과 같이 시험군을 구성하고 시험물질을 투여하였다.
군 투여물질 투여경로 투여 주기 투여용량 개체수(n)
G1 vehicle(PBS) i.v QW(3회/3주) - 8
G2 GI-108B1 i.v. QW(3회/3주) 6 mg/kg 8
시험기간 동안 정기적으로 종양, 몸무게, 식이량의 변화를 관찰하였으며, 주 2회 몸무게 변화와 외형적 변화(털/눈 멍에)를 확인하였다. 종양의 부피 측정은 관찰기간 동안 주 2회, 캘리퍼스(Digital caliper, Mitutoyo, Japan)를 사용하여 종양의 장축(maximum length, L)과 단축(perpendicular width, W)을 측정하였고, 아래의 수학식 I에 대입하여 종양의 부피(tumor volume, TV)와 종양 성장 저해율(tumor growth inhibition, TGI)을 측정하였다.
<수학식 I>
TV(mm3)=(W2×L)/2
TGI=(1-(Ti-T0)/(Vi-V0))×100
Ti: 시험종료 시점에서 시험물질 투여군의 종양 부피
T0: 첫 투여 시점에서 시험물질 투여군의 종양 부피
Vi: 시험종료 시점에서 음성대조군의 종양 부피
V0: 첫 투여 시점에서 음성대조군의 종양 부피
각 개체의 투여 전 종양의 부피는 군 분리 시 측정된 값으로 설정하였으며, 항종양 효능은 대조군(vehicle(PBS), G1)과 비교하여 평가하였다. 그 결과, 대조군(vehicle(PBS))에 비해 GI-108B1 투여군의 종양 부피가 감소되었다(도 20). 또한, 종양 성장 억제율을 살펴보면, 대조군(vehicle(PBS))에서 종양성장 억제율이 50% 이상인 마우스는 1마리였고, 80% 이상인 마우스는 없었다. 반면, GI-108B1 투여군에서는 종양성장 억제율이 30% 이상인 마우스는 5마리였으며, 50% 이상인 마우스는 3마리였다(도 21). 나아가, 각 군의 마우스의 생존율을 확인한 결과, 대조군(vehicle(PBS))의 경우 25일차에 2마리가 사망하였지만, GI-108B1 투여군의 경우 25일차에 모두 생존하였다(도 22).
실시예 16. 인간 유래 유방암세포 식립 마우스에서 GI-108 투여에 의한 항암 효과 확인
인간면역시스템이 도입된 마우스에 MDA-MB-231(human breast cancer cells) 세포를 이식한 종양 모델에서 시험물질 GI-108A1(AHP04167), GI-108B1, 항-PD-1 항체인 Pembrolizumab(상품명: Keytruda, MSD)을 각각 투여한 후 종양의 성장 억제효과를 평가하였다. 먼저, 인간 면역시스템이 도입된 마우스 모델을 제작하기 위해, NOG-B2m(NOD.Cg-B2mtm1UncPrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ) 암컷 마우스(7주령, The jackson laboratory, USA)에 사람 말초혈액 세포(Stemexpress, USA) 부유액을 마리당 1×107세포/200 μL씩 일회용 주사기(31G, cat. 328820, BD, USA)에 충진하여 꼬리 미정맥을 통해 투여하였다. 세포 이식 후, 매일 1회 일반증상을 관찰하였다.
NOG-B2m 암컷 마우스는 The Jackson Laboratory에서 구입하였으며, NOG-B2m 암컷 마우스는 19-25℃ 및 30-70% 습도에서 동물 생물안전 레벨 3 시설에 배치된 개별 환기 케이지에서 유지하였다.
MDA-MB-231 인간 TNBC(triple-negative breast cancer) 세포주는 ATCC에서 구입하였으며, 10% FBS(ThermoFisher Scientific) 및 1% 항생제/항진균제(Gibco™)를 포함하는 DMEM 배지(ThermoFisher Scientific)에서 배양하였다. 배양한 MDA-MB-231 세포는 트립신(Gibco™)을 이용하여 수확한 후 PBS에 현탁하였다. 이종이식 마우스 종양 모델을 확립하기 위해 사람 말초혈액 세포 이식 후 5일차의 건강한 마우스에 MDA-MB-231 세포 부유액(5×106세포/0.025 mL) 및 0.025 mL Matrigel matrix phenol red-free(cat. 356237, BD, USA)를 혼합하여 조제한 용액을 일회용 주사기(31G, cat. 328820, BD, USA)에 충진하여 동물의 우측 등 부위의 피하에 마리당 0.05 mL씩 투여하여 이식하였다. MDA-MB-231 세포 이식 후, 생착 및 성장기간 동안 매일 1회 일반증상을 관찰하였다.
MDA-MB-231 세포를 이식하고 약 20일 후에 건강상태에 이상이 없는 마우스에 대해 종양의 부피를 측정하여, 각 군의 평균이 80~100 mm3에 도달하도록 32마리를 선별하였다. 개체 선정은 개체의 생리적 상태(호흡, 털, 행동, 꼬리, 자세, 체액, 식이, 형태변형, 대사 등), 체중 변화, FACS 분석 결과 및 종양 성장속도를 고려하여 선발하였다. 선별된 동물은 종양의 부피 및 체중을 기초로 하여 가능한 균등하도록 군당 8마리씩 분리하였다. 마우스는 그룹 분리 전 마우스 말초 혈액에서 전체 림프구 중 인간 CD45+ 세포가 80% 이상인 것으로 확인하였다. 표 11과 같이 시험군을 구성하고 시험물질을 투여하였다(도 23).
군 투여물질 투여경로 투여주기 투여용량 개체수
G1 vehicle(hIgG4) i.v. QW (3회/2.5주) 6 mg/kg 8
G2 GI-108A1(AHP04167) i.v. QW (3회/2.5주) 6 mg/kg 8
G3 GI-108B1 i.v. QW (3회/2.5주) 6 mg/kg 8
G4 Anti-PD-1(pembrolizumab) i.v. BIW (5회/2.5주) 5 mg/kg 8
시험기간 동안 매일 1회 외관, 행동 및 배설물 등의 일반증상을 관찰하여 개체별로 기록하였으며, 사망동물을 확인하였다. 체중 측정과 종양의 부피 측정은 관찰기간 동안 주 2회, 캘리퍼스를 사용하여 종양의 장축과 단축을 측정하였고, 실시예 15의 수학식 I에 대입하여 종양의 부피(tumor volume, TV)와 종양 성장 저해율(tumor growth inhibition, TGI)을 측정하였다. 각 개체의 투여 전 종양의 부피는 군분리 시 측정된 값으로 설정하였으며, 항종양 효능은 대조군(vehicle, G1)과 비교하여 평가하였다.
모든 통계 계산은 Prism 8.0(Graph Pad Software Inc, USA)을 사용하여 수행하였다. 종양 부피 측정의 비교는 비대응 t-검정(unpaired t-test)를 통해 이루어졌다. 0.05 미만의 p 값은 유의미한 것으로 간주되었다.
그 결과, 대조군(vehicle)에 비하여 GI-108A1(AHP04167), GI-108B1 및 항-PD-1 항체투여군의 종양 성장이 저해되는 것을 확인하였다. 특히, GI-108B1 투여군에서 GI-108A1(AHP04167) 또는 항-PD-1 항체 투여군보다 종양 성장이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다(도 24 및 도 25). 또한, 18일차에 종양 성장 억제율을 측정한 결과, 대조군의 종양성장 억제율 30% 이상 마우스는 1마리였으며, 50% 이상 및 80% 이상 마우스는 없었다. 항-PD-1 항체 투여군의 종양성장 억제율이 30% 이상인 마우스는 4마리, 50% 이상 2마리였으며, 80% 이상 마우스는 없었다. 반면, GI-108A1 투여군은 종양성장 억제율 30% 이상 5마리, 50% 이상 3마리, 80% 이상 1마리였으며, GI-108B1 투여군은 종양성장 억제율 30% 이상 5마리, 50% 이상 4마리, 80% 이상 3마리였다(도 26).
한편, 대조군 및 시험군 모두에서 체중감소는 나타나지 않았으며, 각 군간의 유의미한 차이도 나타나지 않았다(도 27).
실시예 17. GI-108B1의 혈관투과성 분석
GI-108B1의 혈관투과성(Vascular permeability)을 분석하기 위해 trans-well insert(9321012, cellQART®)를 이용하여 콜라겐을 코팅한 trans-well에 HUVEC 세포(Lonza)를 1×105 개 넣고 3일간 배양하여 confluent monolayer를 만들었다. 96-웰-플레이트에 PBMC를 1×105 개가 되도록 분주한 후, Proleukin®(5 nM) 또는 GI-108B1(5 nM)을 처리하고 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다.
trans-well에 배양시켜둔 HUVEC 세포에 상기 약물과 PBMC 배양된 것의 상층액을 처리하여 37℃ 및 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 양성 대조군으로 TNF-α(PeproTech) 100 ng/ml를 처리하였다. 그 후, upper chamber에 Dextran-FITC(70 kDa)를 처리하고, 1시간 30분 동안 배양하였다. lower chamber로 이동한 Dextran-FITC의 형광을 GloMax® Discover(promega)를 이용하여 485 nm / 500-550 nm (Ex /Em) 파장에서 측정하였다. 통계 계산은 Prism 8.0(Graph Pad Software Inc.)을 이용하여 One way ANOVA로 분석하였고, 음성 대조군(negative control)을 기준으로 Dunnett's 테스트로 진행하였다.
그 결과, TNF-α를 처리한 양성 대조군의 혈관투과성이 증가한 것을 확인하였다. 반면, GI-108B1을 처리한 군의 경우, 아무것도 처리하지 않은 음성 대조군과 유사한 수준의 혈관투과성을 나타내는 것을 확인하였다(도 28).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (23)

  1. CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2를 포함하는 융합단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 하기 구조식 (I)을 포함하는 것인, 융합단백질:
    N'-X-[링커(1)]o-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(2)]p-Y-C' (I)
    이때, 상기 구조식 (I)에 있어서,
    상기 N'은 N 말단이고,
    상기 C'는 C 말단이며,
    상기 X는 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고,
    상기 Y는 IL-2이며,
    상기 링커(1) 및 링커(2)는 펩타이드 링커이고,
    상기 o 및 p는 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody)를 포함하는 것인, 융합단백질.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 항원 결합 단편은
    서열번호 15, 18 및 21로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR1 영역; 서열번호 16, 19 및 22로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR2 영역; 서열번호 17, 20 및 23으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 CDR3 영역;
    을 포함하는 것인, 융합단백질.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 항원 결합 단편은 서열번호 2, 서열번호 3 및 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 링커(1)은 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  7. 제2항에 있어서,
    상기 링커(2)는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 융합단백질은 하기 구조식 (Ⅱ) 및 (Ⅲ)을 포함하는 것인, 융합단백질:
    N'-X-[링커(3)]q-Fc 영역 단편 또는 이의 변이체-[링커(4)]r-Y-C' (Ⅱ) 및
    N'-X'-C' (Ⅲ)
    이때, 상기 구조식 (Ⅱ) 및 (Ⅲ)에 있어서,
    상기 N'은 N 말단이고,
    상기 C'는 C 말단이며,
    상기 X는 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로써, 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역 1(CH1)을 포함하며,
    상기 X'는 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로써, 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역(CL)을 포함하고,
    상기 Y는 IL-2이며,
    상기 링커(3) 및 링커(4)는 펩타이드 링커이고,
    상기 q 및 r은 각각 독립적으로, O 또는 1이다.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR1, 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR2 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및
    서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR1, 서열번호 28의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR2 및 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 것인, 융합단백질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 중쇄 가변 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 경쇄 가변 영역은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 링커(3)은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 링커(4)는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  13. 제2항 또는 제8항에 있어서,
    상기 Fc는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 융합단백질.
  14. 제2항 또는 제8항에 있어서,
    상기 IL-2는 IL-2 변이체인 것인, 융합단백질.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 38번째, 42번째 및 61번째 위치의 아미노산 중 적어도 하나가 치환된 것인, 융합단백질.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 IL-2 변이체는 서열번호 40의 아미노산 서열에서 R38A, F42A 및 E61R으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 어느 하나의 치환이 일어난 것인, 융합단백질.
  17. 제1항의 융합단백질 두 개가 결합된 융합단백질 이량체.
  18. 제1항의 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제18항의 폴리뉴클레오티드가 적재된 발현 벡터.
  20. 제19항의 발현 벡터가 도입된 형질전환 세포.
  21. i) 제20항의 형질전환 세포를 배양하는 단계; 및
    ii) 융합단백질 이량체를 수득하는 단계;를 포함하는 CD73에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 및 IL-2를 포함하는 융합단백질 이량체의 제조 방법.
  22. 제1항의 융합단백질; 또는 제17항의 융합단백질 이량체;를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인, 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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