KR20190066616A - 유도성 카스파제 및 사용 방법 - Google Patents

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데본 셰드록
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Abstract

본 발명은 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 및 상기를 코딩하는 서열을 포함하는 조성물, 본 발명의 폴리펩티드 및 조성물을 발현하도록 변형된 세포, 및 상기를 제조하는 방법 및 입양 세포 요법에 사용하는 방법을 제공한다.

Description

유도성 카스파제 및 사용 방법
관련 출원
본 출원은 2016년 10월 6일 출원된 가출원 USSN 62/405,184호의 이익을 청구하며, 그 내용은 본원에서 그 전문으로 참고로 포함된다.
서열 목록의 포함
"POTH-011_001WO_SeqList.txt"로 명명된 텍스트 파일은 2017년 10월 6일에 생성되었으며 크기가 61KB이며 그 내용은 이로써 그 전문으로 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 분자 생물학, 더 구체적으로는 유도성 카스파제 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 서열을 함유하는 조성물, 및 상기의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
유전자 변형된 세포, 특히 예를 들어, 양자 세포 요법(adoptive cell therapy)으로서 대상체에게 투여하기 위해 변형된 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도하는 방법에 대해 당 업계에서 오랫동안 느껴왔지만 충족되지 않은 요구가 있어왔다. 본 발명은 오랫동안 느껴왔지만 충족되지 않은 상기 요구에 대한 해결책을 제공한다.
요약
본 발명은 이량체화의 화학 유도제에 결합하도록 최적화될 수 있는 리간드 결합 영역에 작동 가능하게 연결된 유도성 프로아폽토시스성(proapoptotic) 폴리펩티드를 제공한다. 리간드 결합 영역이 유도제에 특이적으로 결합할 때, 프로아폽토시스성 표적 분자는 가교 결합되고, 결과적으로, 활성화되어 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드를 함유하는 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도한다. 본 발명의 바람직한 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 유도성 카스파제 폴리펩티드는 유도성 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 유도성 카스파제 9 폴리펩티드는 절두된(truncated) 또는 변형된 아미노산 및/또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 면역원성이 훨씬 작기 때문에 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드가 기존의 유도성 폴리펩티드보다 우수하다. 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이므로 비자연 발생적이지만, 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드를 생산하기 위해 재조합된 서열은 숙주 인간 면역계가 "비-자기(non-self)"로서 인식할 수 있는 비인간 서열을 포함하지 않으며, 결과적으로, 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드를 포함하는 세포, 또는 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드 또는 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 받은 대상체에서 면역 반응을 유도한다. 링커 서열은 인공 서열이지만, 링커 서열은 비인간 서열을 포함하지 않는다. 예를 들어, 링커 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
본 발명은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 프로아폽토시스성 폴리펩티드를 포함하는 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드를 제공하며, 상기 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체 리간드 결합 영역일 수 있다.
본 발명은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 제공하며, 상기 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체 리간드 결합 영역일 수 있다.
본 발명은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 제공하며, 상기 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체 리간드 결합 영역일 수 있다.
유도성 카스파제 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 유도제에 특이적으로 결합할 수 있으며 본 발명의 프로아폽토시스성 폴리펩티드(예를 들어, 카스파제 폴리펩티드)의 전사를 활성화할 수 있다. 예를 들어, 리간드 결합 영역은 치료제에 결합하지 않을 것이다. 본 발명의 유도성 폴리펩티드의 리간드 결합 영역에 특이적으로 결합된 유도제는 내인성 유전자의 전사를 직접적으로 유도하지 않는다.
본 발명의 유도성 프로아폽토시스성(예를 들어, 카스파제) 폴리펩티드는 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 함유하도록 변형된 세포에서 카스파제 폴리펩티드의 전사를 개시할 수 있는 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 전사 조절 요소의 조절하에 있을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드는 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 함유하도록 변형된 포유동물 세포에서 카스파제 폴리펩티드의 전사를 개시할 수 있는 포유동물 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 전사 조절 요소의 조절하에 있을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드는 본 발명의 카스파제 폴리펩티드를 함유하도록 변형된 포유동물 세포에서 카스파제의 전사를 개시할 수 있는 이종 또는 외인성 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는 하나 이상의 전사 조절 요소의 조절하에 있을 수 있다. 바람직한 포유동물 세포는 인간 세포를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 제공하며, 상기 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체 리간드 결합 영역일 수 있다.
본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함하는 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함할 수 있다. 변형은 위치 36에서 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)일 수 있다. 특정 실시양태에서, FKBP12 폴리펩티드는
Figure pct00001
를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, FKBP12 폴리펩티드는
Figure pct00002
를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역에 특이적인 유도제는 위치 36에서 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)을 갖는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12)를 포함할 수 있으며, 둘 다 합성 약물인 AP20187 및/또는 AP1903(리미듀시드: Rimiducide)을 포함한다.
본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 링커 영역은 GGGGS (서열 번호 5)를 포함하는 아미노산 또는 GGAGGAGGAGGATCC (서열 번호 6)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
본 발명의 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 87에 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 282에서 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는
Figure pct00003
를 포함하는 아미노산 또는
Figure pct00004
를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
폴리펩티드가 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는
Figure pct00005
를 포함하는 아미노산 서열 또는
Figure pct00006
를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 트랜스포존을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 트랜스포존을 제공한다. 본 발명의 트랜스포존의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 자연 발생적이다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 내인성 단백질이다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 외인성 단백질이다.
본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 트랜스포존을 제공한다. 본 발명의 트랜스포존의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 비자연 발생적이다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 내인성 단백질이다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 외인성 단백질이다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 합성 단백질이다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 키메라 또는 재조합 단백질이다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 융합 단백질이다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 인간 단백질, 야생형 단백질 또는 이의 서열 변이체이다.
본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 트랜스포존을 제공한다. 본 발명의 트랜스포존의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 세포 표면 단백질, 막 결합 단백질, 세포외 막 결합 단백질, 세포내 막 결합 단백질, 세포내 단백질, 핵 편재 단백질, 핵 단백질, 세포질 단백질, 시토졸 단백질, 분비 단백질, 리소좀 단백질, 엔도솜 단백질, 소포 관련 단백질, 미토콘드리아 단백질, 소포체 단백질, 세포 골격 단백질, 세포내 신호 전달에 관여하는 단백질 및/또는 세포외 신호 전달에 관여하는 단백질을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 트랜스포존을 제공한다. 본 발명의 트랜스포존의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 치료 단백질은 항원 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 T 세포 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 T 세포 수용체로부터 단리 또는 유래된 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 야생형 T 세포 수용체와 비교하여 하나 이상의 서열 변이(들) 및/또는 돌연변이(들)를 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 수용체는 재조합 T 세포 수용체이다.
본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 트랜스포존을 제공한다. 본 발명의 트랜스포존의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 치료 단백질을 코딩하는 서열을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR: Chimeric Antigen Receptor)이다. 특정 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 센티린(Centyrin) 서열(들)을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR은 카르티린(CARTyrin)이다. 특정 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR은 VCAR이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 트랜스포존은 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 트랜스포존은 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 자가 절단 펩티드는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드와 트랜스포존 내 또 다른 서열 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 트랜스포존은 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 자가 절단 펩티드는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 하류에 위치한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 트랜스포존은 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 자가 절단 펩티드는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 바로 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 바로 하류에 위치한다. 적어도 하나의 자가 절단 펩티드는 T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, T2A 펩티드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 11)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GSG-T2A 펩티드는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 12)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, E2A 펩티드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP (서열 번호 13)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GSG-E2A 펩티드는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (서열 번호 14)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, F2A 펩티드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (서열 번호 15)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GSG-F2A 펩티드는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (서열 번호 16)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, P2A 펩티드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열 번호 17)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GSG-P2A 펩티드는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 트랜스포존을 포함하는 조성물의 특정 실시양태에서, 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열일 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백(piggyBac) 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이고 트랜스포사제는 슈퍼 피기백(Super piggyBac) 트랜스포사제이다.
본 발명의 트랜스포존은 피기백 트랜스포존을 포함할 수 있다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자(insulator element)가 측면에 위치한 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 본 발명의 트랜스포사제 효소는 피기백 트랜스포사제 또는 상용성 효소를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 특히 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제이다. 특정 실시양태에서, 특히 트랜스포사제가 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제인 실시양태에서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 피기백™(PB) 트랜스포사제 효소이다. 피기백(PB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00007
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 하기 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백™(PB) 트랜스포사제 효소이다:
Figure pct00008
특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 2개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 3개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 하기 위치 30, 165, 282, 및 538 각각에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 30에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 165에서 아미노산 치환은 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 282에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 538에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 위치 30에서 아미노산 치환이 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 165에서 아미노산 치환이 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이고, 위치 282에서 아미노산 치환이 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 538에서 아미노산 치환이 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환인 서열 번호 1의 서열의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00009
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 위치 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 3에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 82에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 119에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 185에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 187에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 200에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 207에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 209에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 226에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 235에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 240에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 241에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 243에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 258에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 발린으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 315에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 319에서 아미노산 치환은 트레오닌(T)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 327에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 328에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 421에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 436에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 456에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 470에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 485에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 552에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 570에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다.
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 194에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 372에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 375에서 아미노산 치환은 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 450에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 509에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 570에서 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함할 수 있다. 피기백™ 트랜스포사제 효소가 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 372, 375 및 450에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 및 서열 번호 1의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환 및 서열 번호 1의 위치 450에서 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 트랜스포존을 포함하는 조성물의 특정 실시양태에서, 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열일 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존이고 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제이다.
본 발명의 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 실시양태에서, 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제를 코딩하는 서열이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00010
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00011
본 발명은 본 발명의 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 트랜스포존을 포함하는 조성물의 특정 실시양태에서, 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열일 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 헬레이저(Helraiser) 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존이고 트랜스포사제는 헬리트론(Helitron) 트랜스포사제이다.
본 발명의 트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존을 포함할 수 있다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 헬레이저 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히 트랜스포존이 헬레이저 트랜스포존인 실시양태에서, 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 헬리트론 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 헬리트론 트랜스포사제이다. 헬리트론 트랜스포사제는 300 내지 360만 년 전에 활성이 있던 박쥐 게놈의 고대 요소인 헬레이저 트랜스포존을 동원한다. 본 발명의 예시적인 헬레이저 트랜스포존은 Helibat1을 포함하며, 이는 하기를 포함하는 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
다른 트랜스포사제와 달리, 헬리트론 트랜스포사제는 RN아제 H 유사 촉매 도메인을 함유하지 않지만, 대신에 복제 개시 도메인(Rep) 및 DNA 헬리카제 도메인으로 구성된 RepHel 모티프를 포함한다. Rep 도메인은 HUH 슈퍼 패밀리 뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인이다.
본 발명의 예시적인 헬리트론 트랜스포사제는 하기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00015
Figure pct00016
헬리트론 전위(transposition)에서, 트랜스포존의 3 '말단에 가까운 헤어핀은 종결 인자로서 기능을 한다. 그러나 이 헤어핀은 트랜스포사제에 의해 우회되어, 측면 서열의 형질도입을 초래할 수 있다. 또한, 헬레이저 전위는 공유적으로 폐쇄된 원형의 중간체를 생성한다. 또한, 헬리트론 전위는 표적 부위 중복(duplication)이 없을 수 있다. 헬레이저 서열에서, 트랜스포사제는 LTS 및 RTS라고 명명된 좌측 및 우측 말단 서열이 측면에 위치한다. 이들 서열은 보존된 5'-TC/CTAG-3' 모티프로 종결된다. 헤어핀 종결 구조를 형성할 잠재력을 가진 19 bp 회문 염기 서열은 RTS의 11개 뉴클레오티드 상류에 위치하며, 서열
Figure pct00017
(서열 번호 23)로 이루어진다.
본 발명은 본 발명의 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 트랜스포존을 포함하는 조성물의 특정 실시양태에서, 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열일 수 있다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이고 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제이다.
본 발명의 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존을 포함할 수 있다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히 트랜스포존이 Tol2 트랜스포존인 실시양태에서, 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 Tol2 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
Tol2 트랜스포존은 메다카 어류의 게놈으로부터 단리 또는 유래될 수 있으며, hAT 패밀리의 트랜스포존과 유사할 수 있다. 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포존은 약 4.7 킬로베이스를 포함하는 서열에 의해 코딩되고, 4개의 엑손을 함유하는 Tol2 트랜스포사제 코딩 유전자를 함유한다. 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포사제는 하기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00018
역전된 반복 서열, 말단 가까운(subterminal) 서열 및 Tol2 트랜스포사제를 포함하는 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포존은 하기를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다.
본 발명의 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV: adeno-associated virus) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 레트로바이러스는 감마레트로바이러스이다. 특정 실시양태에서, 레트로바이러스는 렌티바이러스이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 재조합 벡터일 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, AAV는 혈청형 AV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11의 AAV를 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 중 하나 이상으로부터의 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11중 하나 이상으로부터 단리, 유래 또는 재조합된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV2로부터 단리, 유래 또는 재조합된 서열을 포함한다. 벡터가 혈액 뇌 장벽(BBB: blood brain barrier)을 가로지르는 것을 포함하는 특정 실시양태에서, AAV는 AAV9로부터 단리, 유래 또는 재조합된 서열을 포함한다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 하나의 혈청형의 게놈 및 다른 혈청형(예를 들어, AAV2/5, AAV-DJ 및 AAV-DJ8)의 캡시드를 함유하는 AAV 혼성체 및 자가 상보적 AAV(scAAV: self-complementary AAV)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 rAAV-LK03, rAAV-NP59 및 rAAV-NP84를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, AAV는 rAAV-LK03, rAAV-NP59 또는 rAAV-NP84로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 재조합 벡터일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 나노입자 벡터이다.
본 발명의 나노입자 벡터는 핵산, 아미노산, 중합체, 미셀, 지질, 유기 분자, 무기 분자 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 나노입자는 예를 들어 국제 특허 공보 WO 2012/094679호, 국제 특허 공보 WO 2016/022805호, 국제 특허 공보 WO/2011/133635호, 국제 특허 공보 WO/2016/090111호, 국제 특허 공보 WO/2017/004498호, WO/2017/004509호, 국제 특허 출원 PCT/US2017/030271호, 미국 특허 제6,835,394호, 미국 특허 제7,217,427호 및 미국 특허 제7,867,512호에 개시된 중합체로 구성될 수 있다.
본 발명의 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 자가 절단 펩티드는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드와 나노입자에 연결된 다른 서열 사이에 위치한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 자가 절단 펩티드는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 하류에 위치한다. 적어도 하나의 자가 절단 펩티드는 T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, T2A 펩티드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 11)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GSG-T2A 펩티드는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 12)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, E2A 펩티드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP (서열 번호 13)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GSG-E2A 펩티드는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (서열 번호 14)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, F2A 펩티드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (서열 번호 15)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GSG-F2A 펩티드는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (서열 번호 16)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, P2A 펩티드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열 번호 17)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, GSG-P2A 펩티드는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드, 유도성 카스파제 9 폴리펩티드, 및/또는 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 트랜스포존을 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 유도제와의 접촉 후에 본 발명의 유도성 카스파제 단백질을 발현한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 인간 세포일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 면역 세포일 수 있다. 면역 세포의 예로는 T 세포, 자연 살해(NK: Natural Killer) 세포, 자연 살해(NK) 유사 세포, 조혈 기원 세포(progenitor cell), 말초 혈액(PB: peripheral blood) 유래 T 세포 및 제대혈(UCB: umbilical cord blood) 유래 T 세포가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 T 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 활성화된 T 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 본 발명의 iC9 서열을 발현하는 활성화된 T 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 인공 항원 제시 세포(APC: antigen presenting cell)일 수 있다. 본 발명의 면역 세포는 수지상 세포, B 세포, 대식세포 및 단핵 세포의 세포주를 포함하나 이에 제한되지 않는 임의의 상업적으로 이용 가능한 세포주 또는 변형된 세포주를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 면역 세포일 수 있다. 면역 세포의 예로는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해(NK) 유사 세포, 조혈 기원 세포, 말초 혈액(PB) 유래 T 세포 및 제대혈 (UCB) 유래 T 세포가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 T 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포는 인공 항원 제시 세포이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 줄기세포일 수 있다. 본 발명의 줄기세포는 인간 줄기세포일 수 있다. 본 발명의 줄기세포는 배아 또는 성체 줄기세포일 수 있다. 본 발명의 줄기세포는 전능성, 만능성 또는 다능성일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 줄기세포는 유도된 만능성 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 폴리펩티드, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 세포는 체세포일 수 있다. 본 발명의 체세포는 인간 심장; 골격근 또는 평활근; 혈관, 정맥 또는 모세 혈관; 비장; 갑상선; 림프절 또는 림프관; 뼈 또는 골수; 피부 또는 내피; 부신; 식도; 후두; 뇌 또는 척수; 말초 신경계; 눈; 시상 하부; 간; 후각 조직; 전립선; 위; 대장 또는 소장; 폐 또는 기관지; 신장; 췌장; 흉선; 요관 또는 요도; 방광; 청각 조직; 방광; 부갑상선; 침샘; 또는 기관을 포함하지만 이에 제한되지 않는 신체, 바람직하게는 인체의 임의의 부분으로부터 단리 또는 유래될 수 있다. 본 발명의 체세포는 인간 심장; 골격근 또는 평활근; 혈관, 정맥 또는 모세 혈관; 비장; 갑상선; 림프절 또는 림프관; 뼈 또는 골수; 피부 또는 내피; 부신; 식도; 후두; 뇌 또는 척수; 말초 신경계; 눈; 시상 하부; 간; 후각 조직; 전립선; 위; 대장 또는 소장; 폐 또는 기관지; 신장; 췌장; 흉선; 요관 또는 요도; 방광; 청각 조직; 방광; 부갑상선; 침샘; 또는 기관을 포함하지만 이에 제한되지 않는 신체, 바람직하게는 인체의 임의의 부분으로 분화할 수 있는 전구 세포(precursor cell) 또는 줄기세포로부터 단리 또는 유래될 수 있다. 본 발명의 체세포는 전환분화된 세포로부터 단리 또는 유도될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 본 발명의 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 양자 세포 요법을 위한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물의 세포는 자가 유래일 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물의 세포는 동종 이계일 수 있다.
본 발명은 생체 외 유전자 요법을 위한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물의 세포는 자가 유래일 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물의 세포는 동종 이계일 수 있다.
본 발명은 생체 외 유전자 요법을 위한 본 발명의 세포를 포함하는 조성물에 대한 용도를 제공한다. 본 발명의 세포를 포함하는 조성물의 용도의 특정 실시양태에서, 세포는 자가 유래이다. 특정 실시양태에서, 세포는 동종 이계이다.
본 발명은 세포 요법을 이를 필요로 하는 대상체에서 변형시키는 방법으로서, 치료제 및 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있는 것인 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포 요법을 이를 필요로 하는 대상체에서 변형시키는 방법으로서, 치료제 및 본 발명의 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있는 것인 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포 요법을 이를 필요로 하는 대상체에서 변형시키는 방법으로서, 치료제, 본 발명의 트랜스포존 및 본 발명의 트랜스포사제를 포함하는 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있는 것인 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 세포 요법을 이를 필요로 하는 대상체에서 변형시키는 방법으로서, 치료제 및 본 발명의 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있는 것인 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 세포 요법을 변형시키는 방법의 특정 실시양태에서, 조성물의 세포는 자가 유래일 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물의 세포는 동종 이계일 수 있다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 세포 요법은 양자 세포 요법이다. 특정 실시양태에서, 치료제는 생체 외 유전자 요법에 의해 도입되었다. 특정 실시양태에서, 치료제는 변형된 내인성 유전자, 외인성 유전자 또는 이의 일부를 코딩하는 서열이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 세포 요법의 변형은 세포 요법의 종결이다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 세포 요법의 변형은 세포 요법에서 제공된 세포의 일부분의 제거이다. 이 제거는 일시적일 수 있거나, 일정 기간, 예를 들어 질환 또는 장애의 완화 기간 동안 유지될 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 유도제의 억제제를 투여하여 세포 요법의 변형을 억제함으로써 세포 요법의 기능 및/또는 효능을 회복시키는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 완화 후에 질환 또는 장애가 회복되거나 대상체의 이상 반응이 가라앉으면, 유도제의 억제제를 대상체에게 투여함으로써 세포 요법이 재개될 수 있다.
본 발명의 세포 요법의 변형 방법은 예를 들어, 회복의 징후 또는 질환의 중증도/진행의 감소의 징후, 질환 완화/중지의 징후 및/또는 이상 반응의 발생에 반응하여 요법을 종료시키거나 약화시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 세포 요법은 질환의 징후 또는 증상이 다시 나타나거나 중증도 및/또는 이상 반응에서 증가가 분석되는 경우 유도제를 억제함으로써 재개될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물은 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 2x105 내지 5x108 세포 또는 이의 임의의 범위, 값 또는 분율을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물은 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.2x106 내지 20x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.2x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 2x106 세포, 투여당 환자의 체중 kg 당 20x106 세포, 또는 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물은 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 ㎏당 1x106 세포 또는 약 1x106 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물은 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 3x106 세포 또는 약 3x106 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물은 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 내지 6.7x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 6.7x106 세포, 또는 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물은 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 내지 16x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 2x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 6x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 10.7x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 16x106 세포, 또는 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물은 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 1.2x106 내지 7.1x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 1.2x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 7.1x106 세포, 또는 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 개수의 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 2x106 내지 3x106 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물은 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 1x106 내지 2x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 1x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 2x106 세포 또는 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 개수의 세포를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 변형된 세포는 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 전달된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 내지 1.3x106 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 투여당 환자 체중 kg당 0.7x106 세포, 투여당 환자 체중 kg당 1.3x106 세포, 또는 투여당 환자 체중 kg당 이들 사이의 임의의 개수의 세포를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 세포 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물은 주사 또는 정맥 내 주입을 통해 환자에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 일회 또는 다회 용량을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 분할된 용량을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 변형된 세포를 포함하는 조성물의 치료 유효량은 초기 용량 및 유지 용량을 포함한다.
본 발명은 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법으로서, 카이네틱 제제 및 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계로 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있으며, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 대상체의 표적 조직 내에서 국소 조직 독성을 유도하는 것인 단계, 및 대상체의 비표적 조직에서 독성을 유도하기 전에 카이네틱 제제를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도함으로써, 표적 조직을 제거하고, 비표적 조직을 보존하고, 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 카이네틱 제제는 표적 조직에 대한 특이성 및 비표적 조직에 대한 공지된/의도적인 또는 미지의/비의도적인 독성을 갖는 치료제를 기술하는 것을 의미하며, 어느 경우에든 독성이 비표적 조직에 유의한 영향을 미치지 않도록 제어되거나 제한될 수 있다. 카이네틱 제제는 특이적으로 조직을 표적화하고, 특이적이고 국소적으로 독성을 유도하지만, 카이네틱 제제가 비표적 조직에 유의한 독성 또는 손상을 유도할 수 있기 전에 본 발명의 유도제를 투여하여 비표적 조직 독성을 감소 또는 예방할 수 있다. 임의의 독성이 오프-표적(off-target) 조직에 영향을 미치는 정도(예를 들어, 비표적 조직에 대한 손상의 정도)는 유도제의 투여에 의해 제한될 수 있고, 비표적 조직이 카이네틱 제제에 노출되는 기간에 상응할 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 치료제를 포함하는 세포는 온-표적(on-target) 온-종양(on-tumor) 세포 및 온-표적 오프-종양(off-tumor) 세포 모두에 대해 동시에 다수의 상이한 조직에서 반응할 수 있다. 예를 들어, 종양이 제거된 후에, 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 세포를 제거하기 위해서 치료제를 포함하는 세포에서 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드의 활성화를 통해 온-표적 오프-종양이 보존된다. 특정 실시양태에서, 오프-종양 오프-표적 효과는 카이네틱 제제의 교차 반응성에 기인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 오프 표적 효과가 너무 크면, 카이네틱 제제로부터의 독성은 대상체의 질환의 치료가 완전하기 전에 유도제의 투여에 의해 제한되거나 제거될 수 있다.
본 발명은 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법으로서, 카이네틱 제제 및 본 발명의 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계로 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있으며, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 대상체의 표적 조직 내에서 국소 조직 독성을 유도하는 것인 단계, 및 대상체의 비표적 조직에서 유의한 독성을 유도하기 전에 카이네틱 제제를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도함으로써, 표적 조직을 제거하고, 비표적 조직을 보존하고, 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법으로서, 카이네틱 제제, 본 발명의 트랜스포존 및 본 발명의 트랜스포사제를 포함하는 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계로 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있으며, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 대상체의 표적 조직 내에서 국소 조직 독성을 유도하는 것인 단계, 및 대상체의 비표적 조직에서 유의한 독성을 유도하기 전에 카이네틱 제제를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도함으로써, 표적 조직을 제거하고, 비표적 조직을 보존하고, 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법으로서, 카이네틱 제제 및 본 발명의 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계로 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있으며, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 대상체의 표적 조직 내에서 국소 조직 독성을 유도하는 것인 단계, 및 대상체의 비표적 조직에서 유의한 독성을 유도하기 전에 카이네틱 제제를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도함으로써, 표적 조직을 제거하고, 비표적 조직을 보존하고, 대상체의 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
용어 "비표적 조직에서 유의한 독성"은 조직의 세포가 사멸되고(예를 들어, 괴사 또는 아폽토시스의 결과로 사멸되고), 그 외 생존할 수 없게 되거나 하나 이상의 필수 생리 기능(들)의 수행을 중단하게 되는 독성 수준을 기술할 수 있다. 특정 실시양태에서, 유의한 독성은 세포 또는 조직에 대한 영구적인 손상을 의미한다. 특정 실시양태에서, 유의한 독성은 세포 또는 조직의 기능의 일시적인 손실을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 유의한 독성은 대상체에서 당업자가 증상과 같이 인식할 수 있는 증상을 유발한다. 특정 실시양태에서, 유의한 독성은 대상체의 사망, 수명 감소 또는 삶의 질의 감소로 이어진다.
본 발명의 질환 또는 장애의 치료 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 증식성 장애 또는 암이다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 종양을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양은 양성이다. 특정 실시양태에서, 종양은 악성이다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 절제된 종양의 노출된 조직 또는 경계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 전이될 가능성이 있는 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 전이 부위는 림프절, 림프액, 말초 순환 혈액, 국소 순환 혈액, 뼈, 골수 및 뇌 척수액(CSF: cerebral spinal fluid) 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 질환 또는 장애의 치료 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 염증성 질환 또는 장애이다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 염증 부위를 포함한다.
본 발명의 질환 또는 장애의 치료 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 면역 또는 자가 면역 질환 또는 장애이다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 노출되거나 감염된 조직의 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 화상 또는 상처 조직을 포함한다.
본 발명의 질환 또는 장애의 치료 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 감염성 질환 또는 장애이다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 감염된 조직을 포함한다.
본 발명의 질환 또는 장애의 치료 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 유전적 또는 후성적 질환 또는 장애이다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 야생형 세포와 비교할 때 유전적 또는 후성적 변형을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함한다.
본 발명의 질환 또는 장애의 치료 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 대사 장애이다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 대사 장애를 갖는 하나 이상의 세포를 포함한다.
본 발명의 질환 또는 장애의 치료 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 혈관 장애이다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 정맥, 혈관, 모세 혈관 또는 순환 혈액 성분의 하나 이상의 세포를 포함한다.
본 발명의 질환 또는 장애의 치료 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 호흡계 장애이다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 비도, 식도 또는 폐의 하나 이상의 세포를 포함한다.
본 발명의 질환 또는 장애의 치료 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 섬유증 장애이다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 섬유양 종괴 또는 섬유양 종괴에 근접한 세포를 포함한다.
본 발명의 질환 또는 장애의 치료 방법의 특정 실시양태에서, 양자 세포 요법은 카이네틱 제제를 포함하는 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 자가 유래이다. 특정 실시양태에서, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 동종 이계이다. 특정 실시양태에서, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 T 세포이다. 특정 실시양태에서, 카이네틱 제제는 비자연 발생 수용체이다. 특정 실시양태에서, 비자연 발생 수용체는 합성, 변형, 재조합 또는 키메라 수용체이다. 특정 실시양태에서, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
본 발명의 질환 또는 장애의 치료 방법의 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 증식성 장애 또는 암이다. 특정 실시양태에서, 표적 조직은 종양을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양의 치료는 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 세포를 포함하는 조성물은 키메라 항원 수용체(CAR)를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR)는 종양의 세포 상에 발현된 서열에 특이적으로 결합함으로써 종양 세포에 대한 CAR의 특이성을 부여한다. 특정 실시양태에서, 종양 세포에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현하는 세포는 T 세포이며, 이에 따라 종양 세포에 특이적으로 결합하는 CAR-T를 만든다. 특정 실시양태에서, 종양 세포를 특이적으로 표적화하는 CAR-T 세포를 포함하는 조성물은 항원 서열을 발현하는 종양 세포만을 선택적으로 사멸시킬 것이다. 그러나 특정 실시양태에서, 종양 항원은 비표적 조직에서 CAR-T 세포의 온-표적 오프-종양 활성을 유도하는 다른 정상 조직에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 항원은 CD19일 수 있으며 CD19는 B 세포에서 거의 독점적으로 발현된다. CD19의 경우, 항-CD19 CAR-T 세포의 오프-표적 활성은 미약하다. 그러나 예를 들어 항원이 PSMA(엽산 히드롤라아제 1)이고 PSMA가 몇 가지 정상 세포 유형에서 발현되는 경우, 항-PSMA CAR-T 세포는 온-표적 오프 종양 독성이라고 불리는 활성으로 병리학적 표적 세포 이외에 정상 세포를 표적화할 수 있다. 특정 실시양태에서, 일단 본 발명의 병리학적 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)가 항-PSMA CAR-T 세포에 의해 박멸되면, 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 사용하여 항-PSMA CAR-T 세포에서 예정된 세포 사멸을 유도하는 본 발명의 유도제를 대상체에 처리하면 온-표적 오프-종양 효과가 제거된다.
입양 세포 요법이 카이네틱 제제를 포함하는 세포를 포함하는 방법을 포함하여 본 발명의 특정 방법에서, 카이네틱 제제는 항암제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항암제는 항-CD19 약물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항암제는 항-BCMA 약물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항암제는 항-PSMA 약물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항암제는 항-Muc1 약물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 카이네틱 제제는 비자연 발생 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 비자연 발생 수용체는 합성, 변형된, 재조합 또는 키메라 수용체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 특정 실시양태에서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함한다. 특정 실시양태에서, CAR은 VCAR이다. 특정 실시양태에서, 카이네틱 제제는 무형성증을 유도한다. 특정 실시양태에서, 무형성증은 치명적이지 않다. 특정 실시양태에서, 유도제는 카이네틱 제제를 포함하는 세포를 제거한다. 특정 실시양태에서, 세포는 T 세포이다. 특정 실시양태에서, 유도제는 무형성증의 징후 또는 증상을 제거하거나 감소시킨다. 특정 실시양태에서, CAR-T 요법은 악성 종양을 제거하지만 건강한 B 세포를 계속 표적화하여 대상체가 IVIG 주입으로 치료받아야 한다. 특정 실시양태에서, 항-BCMA CAR-T 요법은 대상체의 자신의 변이되지 않은 형질 세포를 제거하여 대상체는 또한 IVIG로 치료받아야 한다. 특정 실시양태에서, 무형성증를 유발하는 CAR-T는 본 발명의 카스파제 9 폴리펩티드 및 유도제를 통해 제거될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 유도제로 대상체를 치료하면 무형성증의 징후 또는 증상이 경감된다.
[도 1]은 본 발명의 예시적인 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 도시하는 개략도이다.
[도 2]는 뉴클레오펙션 후 제12일에 치료제(카르티린)를 단독으로 또는 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드(피기백(PB) 트랜스포사제에 의해 세포에 도입된 iC9 구조물("안전 스위치"로도 공지됨)에 의해 코딩됨)와 함께 발현하도록 변형된 세포에서 유도제(AP1903, 리미듀시드로도 지칭함)의 투여량 증가의 함수로서 생존 세포의 영역(게이트된 우측 하부 사분면)에서 아폽토시스 세포에 의해 점유된 영역(좌측 상부 사분면)으로 이동하는 세포의 존재량을 도시하는 일련의 유동 세포 측정 플롯이다.
[도 3]은 뉴클레오펙션 후 제19일에 치료제(카르티린)를 단독으로 또는 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드(피기백(PB) 트랜스포사제에 의해 세포에 도입된 iC9 구조물("안전 스위치"로도 공지됨)에 의해 코딩됨)와 함께 발현하도록 변형된 세포에서 유도제(AP1903, 리미듀시드로도 지칭함)의 투여량 증가의 함수로서 생존 세포의 영역(게이트된 우측 하부 사분면)에서 아폽토시스 세포에 의해 점유된 영역(좌측 상부 사분면)으로 이동하는 세포의 존재량을 도시하는 일련의 유동 세포 측정 플롯이다.
[도 4]는 [도 2](좌측 그래프) 또는 [도 3](우측 그래프)에 나타난 결과를 집계하여 정량화하여 도시하는 한 쌍의 그래프이다. 구체적으로, 이 그래프는 제12일(도 2, 좌측 그래프) 또는 제19일(도 3, 우측 그래프)에 각각의 변형된 세포 유형에 대해 iC9 스위치의 유도제(AP1903, 리미듀시드로도 지칭함)의 농도의 함수로서 세포 생존율(%)에 대한 iC9 안전 스위치의 영향을 보여준다.
[도 5]는 생체 내 연구의 연구 일정과 개요를 나타내는 도표이다. NSG 마우스에 MM.1S/루시퍼라제+ 세포를 IV 주사하고, 제8일에 단계를 결정하고, 제9일에 T 세포를 주사하고, 제12일에 명시된 용량의 AP1903(리미듀시드)으로 처리하였다. 24시간 후, 마우스를 안락사시키고 혈액, 비장, 및 골수 세포를 수집하고 huCD45+ 세포의 존재에 대해 염색하였다.
[도 6]은 생체 내에서 리미듀시드(AP1903)를 사용한 P-BCMA-101 포함 세포의 매우 효율적인 사멸을 입증하는 그래프이다. [도 6]은 AP1903 처리 후 혈액, 비장 및 골수에서 카르티린+ 세포의 존재를 보여준다. 혈액, 비장 및 골수 세포를 huCD45+ 세포의 존재에 대해 유동 세포 측정법으로 분석하였다. 상대 생존율은 각 샘플에 대해 1,500 비드 이벤트당 (huCD45 세포 수/msCD45 세포 수)/(미처리군에서 huCD45/msCD45의 평균))* 100%에 의해 결정하였다. 각 데이터 지점은 상이한 마우스를 나타낸다. x 축에 상대적인 CAR-T 생존율(%)을 25의 증가로 0에서 175까지 플롯팅한다. y 축에는 각 패널에 대해 좌측에서 우측으로 AP1903(리미듀시드) 처리 후 혈액, 비장 및 골수. AP1903(리미듀시드)은 하기 순서로 좌측에서 우측으로 패널에 따라 증가한다: 0 mg/kg, 0.005 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.5 mg/kg, 5 mg/kg 및 iC9 유전자가 없는 경우에서의 5 mg/kg.
본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드뿐만 아니라 트랜스포존, 벡터, 및 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드 포함 세포를 제공한다. 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 치료제와 동시에 또는 순차적으로 세포내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 하나 이상의 서열과 동시에 또는 순차적으로 세포내로 도입되어 본 발명의 변형된 세포를 생산할 수 있다. 본 발명의 변형된 세포는 세포 기반 요법에서 사용될 수 있다. 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드, 및 경우에 따라 치료제를 포함하는 본 발명의 변형된 세포의 활성을 조절하기 위해, 세포 및/또는 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 리간드 결합 영역에 특이적으로 결합하고 궁극적으로 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드를 포함하는 세포에서 아폽토시스의 개시를 유발하는 유도제와 접촉할 수 있다. 본 발명의 변형된 세포가 세포 요법으로 사용될 때, 유도제는 세포 요법을 받은 대상체에게 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다. 유도제의 억제제는 세포 요법 및 유도제를 받은 대상체에게 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료제"는 세포 요법을 위한 세포내로 도입될 때, 활성, 신호 전달 경로, 신호 전달 결과, 및/또는 세포의 내부 또는 외부 환경(인접 세포, 세포외 리간드 및 신호 분자를 포함하나 이에 한정되지 않음)과 세포의 상호 작용, 세포의 숙주의 면역계 또는 이의 성분, 숙주의 감염, 숙주의 질환 세포(예를 들어, 암세포), 세포내 리간드 및 신호 전달 분자, 후성적 조절, 유전자 전사, 유전자 조절, 트랜스크립톰, DNA/RNA 번역, 단백질 프로세싱 또는 분비 과정, 및 프로테옴을 변형시키는 유기 또는 무기의 임의의 분자를 지칭할 수 있다. 치료제는 재조합 및/또는 키메라 세포 표면 수용체, 재조합 및/또는 키메라 막 횡단 수용체, 재조합 및/또는 키메라 이온 통로, 및 재조합 및/또는 키메라 항원 수용체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 치료제는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 경우에 따라, 항원 인식 영역이 적어도 하나의 센티린을 포함하는 키메라 항원 수용체이다. 본 발명의 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 센티린을 포함하는 CAR은 카르티린이라 지칭한다.
본 발명은 리간드 결합 영역, 링커, 및 프로아폽토시스성 펩티드를 포함하는 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드를 제공하며, 상기 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 유도제와 상호 작용을 통해 이량체화한다. 제1 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드 및 제2 유도성 아폽토시스성 폴리펩티드의 이량체화는 카스파제 폴리펩티드의 상호 작용, 가교 결합, 교차 활성화 또는 활성화를 촉진 또는 활성화한다. 카스파제 폴리펩티드의 상호 작용, 가교 결합, 교차 활성화 또는 활성화는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드 또는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 세포에서 아폽토시스를 개시한다. 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드가 유도제와 접촉하지 않는 한 아폽토시스를 개시하지 않는다. 유도제와 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드 사이의 접촉은 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 발생할 수 있다. 유도제와 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드 사이의 접촉은 세포내에서 발생할 수 있다.
세포 요법과 관련하여, 본 발명은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드 또는 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 양자 세포 요법을 위한 변형된 T 세포를 제공한다.
입양 세포 요법을 위한 변형된 T 세포는 자가 유래 또는 동종 이계일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "동종 이계"는 항원 상 구별되는 HLA 또는 MHC 유전자좌를 의미한다. 동일한 종으로부터 전달된 세포 또는 조직은 항원 상으로 구별될 수 있다. 유전적 동계 마우스는 하나 이상의 유전자좌에서 상이할 수 있으며(유전적 유사(congenics)) 동종 이계 마우스는 동일한 배경을 가질 수 있다.
입양 세포 요법을 위한 변형된 T 세포는 활성화된 T 세포를 포함할 수 있다. T 세포(T 림프구라고도 지칭함)는 림프구로 지칭되는 백혈구 그룹에 속한다. 림프구는 일반적으로 세포 매개 면역에 관여한다. "T 세포"에서 "T"는 흉선(thymus)으로부터 유래하거나 그 성숙이 흉선에 의해 영향을 받는 세포를 의미한다. T 세포는 T 세포 수용체로 알려진 세포 표면 단백질의 존재에 의해 B 세포 및 자연 살해(NK) 세포와 같은 다른 림프구 유형과 구별될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "활성화된 T 세포"는 II형 주요 조직 적합성(MHC: major histocompatibility) 마커과 관련하여 제시된 항원 결정기의 인식에 의해 면역 반응(예를 들어, 활성화된 T 세포의 클론 증식)을 생성하도록 자극된 T 세포를 지칭한다. T 세포는 항원 결정기, 사이토카인 및/또는 림포카인 및 분화 세포 표면 단백질 무리(예를 들어, CD3, CD4, CD8 등 및 이들의 조합)의 존재에 의해 활성화된다. 차별적인 단백질 무리를 발현하는 세포는 종종 T 세포의 표면에서 해당 단백질의 발현에 대해 "양성"이라고 한다(예를 들어, CD3 또는 CD4 발현에 양성인 세포를 CD3+ 또는 CD4+라고 지칭함). CD3 및 CD4 단백질은 T 세포에서 신호 전달에 직접 및/또는 간접적으로 관여할 수 있는 세포 표면 수용체 또는 보조 수용체이다.
입양 세포 요법을 위한 변형된 T 세포는 "범(pan) T 세포"를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 범 T 세포는 아형, 활성화 상태, 성숙 상태 또는 세포 표면 마커 발현에 의한 분류 없이 생물학적 샘플로부터 단리된 모든 T 림프구를 포함한다.
입양 세포 요법을 위한 변형된 T 세포는 예를 들어 전혈, 말초 혈액, 제대혈, 림프액, 림프절 조직, 골수 및 뇌척수액(CSF)으로부터 얻거나 제조될 수 있다, 예를 들어 세포의 경우에서와 같이 "얻거나 제조된다"는 세포 또는 세포 배양물이 공급원으로부터 단리, 정제되거나 부분적으로 정제됨을 의미하며, 여기서 공급원은 예를 들어 제대혈, 골수 또는 말초 혈액일 수 있다. 이 용어는 본래 공급원 또는 세포 배양물이 배양되고 세포가 복제한 경우와 자손 세포가 본래 공급원에서 방금 유래하는 경우에도 적용될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "말초 혈액"은 순환 혈액 풀로부터 얻거나 제조되며 림프계, 비장, 간 또는 골수 내에 격리되지 않은 혈액의 세포 성분(예를 들어, 적혈구, 백혈구 및 혈소판)을 지칭한다. 제대혈은 림프계, 비장, 간 또는 골수 내에 격리된 혈액 및 말초 혈액과 구별된다. 용어 "제대혈", "태혈" 또는 "탯줄 혈액"은 호환적으로 사용될 수 있으며, 출산 후 태반에, 그리고 부착된 제대에 남아있는 혈액을 말한다. 탯줄 혈액은 종종 조혈 세포를 포함한 줄기세포를 포함한다.
본 발명은 리간드 결합 영역, 링커 및 프로아폽토시스성 펩티드를 포함하는 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드를 제공하며, 상기 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 프로아폽토시스성 펩티드는 카스파제 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 카스파제 폴리펩티드는 카스파제 9 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 카스파제 9 폴리펩티드는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드이다. 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 비자연 발생적일 수 있다.
본 발명의 카스파제 폴리펩티드는 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 11, 카스파제 12, 및 카스파제 14를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 카스파제 폴리펩티드는 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9 및 카스파제10을 포함하여, 아폽포시스와 관련된 카스파제 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 카스파제 폴리펩티드는 카스파제 2, 카스파제 8, 카스파제 9 및 카스파제10을 포함하여, 아폽토시스를 개시하는 카스파제 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 카스파제 폴리펩티드는 카스파제 3, 카스파제 6 및 카스파제 7을 포함하여, 아폽토시스를 실행하는 카스파제 폴리펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 카스파제 폴리펩티드는 야생형 아미노산 또는 핵산 서열과 비교하여 하나 이상의 변형을 갖는 아미노산 또는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명의 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 코돈이 최적화될 수 있다. 본 발명의 카스파제 폴리펩티드의 아미노산 및/또는 핵산 서열에 대한 하나 이상의 변형은 야생형 아미노산 또는 핵산 서열과 비교하여 본 발명의 카스파제 폴리펩티드의 상호 작용, 가교 결합, 교차 활성화 또는 활성화를 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 본 발명의 카스파제 폴리펩티드의 아미노산 및/또는 핵산 서열에 대한 하나 이상의 변형은 야생형 아미노산 또는 핵산 서열과 비교하여 본 발명의 카스파제 폴리펩티드의 면역원성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 카스파제 폴리펩티드는 야생형 카스파제 폴리펩티드와 비교하여 절두될 수 있다. 예를 들어, 카스파제 폴리펩티드를 절두하여 카스파제 활성화 및 동원 도메인(CARD: Caspase Activation and Recruitment Domain)을 코딩하는 서열을 제거하여, 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 개시하는 것뿐만 아니라 국소 염증 반응을 활성화할 가능성을 제거하거나 최소화할 수 있다. 본 발명의 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 야생형 카스파제 폴리펩티드와 비교하여 본 발명의 카스파제 폴리펩티드의 변이 아미노산 서열을 형성하도록 스플라이싱될 수 있다. 본 발명의 카스파제 폴리펩티드는 재조합 및/또는 키메라 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명의 재조합 및/또는 키메라 카스파제 폴리펩티드는 하나 이상의 상이한 카스파제 폴리펩티드로부터의 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 본 발명의 재조합 및/또는 키메라 카스파제 폴리펩티드는 하나 이상의 종(예를 들어, 인간 서열 및 비인간 서열)으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 카스파제 폴리펩티드는 비자연 발생적일 수 있다.
본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 리간드 결합 영역은 본 발명의 제1 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 본 발명의 제2 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드와의 이량체화를 용이하게 하거나 촉진하는 임의의 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 상기 이량체화는 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 가교 결합 및 세포에서 아폽토시스의 개시를 활성화하거나 유도한다.
리간드 결합("이량체화") 영역은 천연 또는 비천연 리간드(즉, 유도제), 예를 들어 비천연 합성 리간드를 사용하여 유도를 가능하게 하는 임의의 폴리펩티드 또는 이의 기능성 도메인을 포함할 수 있다. 리간드 결합 영역은 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 성질 및 리간드(즉, 유도제)의 선택에 따라 세포막의 내부 또는 외부에 있을 수 있다. 수용체를 포함한 다양한 리간드 결합 폴리펩티드 및 이의 기능적 도메인은 공지되어있다. 본 발명의 리간드 결합 영역은 수용체로부터의 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 특히 관심 있는 것은 리간드(예를 들어, 작은 유기 리간드)가 공지되어 있거나 쉽게 생산될 수 있는 리간드 결합 영역이다. 이러한 리간드 결합 영역 또는 수용체는 FKBP 및 사이클로필린 수용체, 스테로이드 수용체, 테트라사이클린 수용체 등뿐만 아니라 항체, 특히 중쇄 또는 경쇄 서브유닛, 이의 변이된 서열, 추계학적 절차에 의해 얻은 무작위 아미노산 서열, 조합 합성 등으로부터 얻을 수 있는 "비천연" 수용체를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FKBP 리간드 결합 영역, 사이클로필린 수용체 리간드 결합 영역, 스테로이드 수용체 리간드 결합 영역, 사이클로필린 수용체 리간드 결합 영역, 및 테트라사이클린 수용체 리간드 결합 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나 이상의 수용체 도메인(들)을 포함하는 리간드 결합 영역은 천연 도메인 또는 이의 절두된 활성 부분으로서 적어도 약 50개의 아미노산, 약 350개 미만의 아미노산, 통상적으로 200개 미만의 아미노산일 수 있다. 결합 영역은 예를 들어, 작고(바이러스 벡터에서 효율적인 형질감염을 가능하게 하기 위해, 25 kDa 미만), 단량체성이고, 비면역원성이며, 이량체화를 위해 배치될 수 있는 합성적으로 접근 가능하고, 세포 투과성이고, 비독성인 리간드를 가질 수 있다.
하나 이상의 수용체 도메인(들)을 포함하는 리간드 결합 영역은 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 설계 및 적절한 리간드(즉, 유도제)의 이용 가능성에 따라 세포내 또는 세포외에 있을 수 있다. 소수성 리간드 경우, 결합 영역은 막의 양쪽 어디에든 있을 수 있지만, 친수성 리간드, 특히 단백질 리간드 경우, 리간드를 결합에 이용 가능한 형태로 내재화하기 위한 수송 시스템이 없다면, 결합 영역은 일반적으로 세포막 외부에 있을 것이다. 세포내 수용체 경우, 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드 또는 유도성 아폽토시스성 폴리펩티드를 포함하는 트랜스포존 또는 벡터는 수용체 도메인 서열의 5' 또는 3'에 신호 펩티드 및 막 횡단 도메인을 코딩할 수 있거나 수용체 도메인 서열의 5'에 지질 부착 신호 서열을 가질 수 있다. 수용체 도메인이 신호 펩티드와 막 횡단 도메인 사이에 있는 경우, 수용체 도메인은 세포외에 있을 것이다.
고친화성 결합을 생성하기 위하여 항체 및 항체 서브유닛, 예를 들어, 중쇄 또는 경쇄, 특히 단편, 더 구체적으로 가변 영역의 전부 또는 일부, 또는 중쇄와 경쇄의 융합체가 본 발명의 리간드 결합 영역으로서 사용될 수 있다. 고려되는 항체는 면역 반응을 유발하지 않고 일반적으로 말초(즉, CNS/뇌 영역 외부)에서 발현되지 않는 세포외 도메인과 같은 이소성으로(ectopically) 발현된 인간 산물인 것들을 포함한다. 이러한 예로는, 저친화성 신경 성장 인자 수용체(LNGFR: low affinity nerve growth factor receptor) 및 배아 표면 단백질(즉, 암 배아 항원)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 그러나 또한, 항체는 생리학적으로 허용 가능한 합텐 분자에 대해 제조될 수 있고, 개별 항체 서브유닛은 결합 친화성에 대해 스크리닝될 수 있다. 서브유닛을 코딩하는 cDNA는 리간드에 대한 적절한 친화성을 갖는 결합 단백질 도메인을 얻기 위해 단리되거나, 불변 영역, 가변 영역의 일부분의 결실, 가변 영역의 돌연변이 유발 등에 의해 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 거의 모든 생리학적으로 허용 가능한 합텐 화합물을 리간드로서 사용할 수 있거나 이를 이용하여 리간드에 대한 에피토프를 제공할 수 있다. 항체 단위 대신에, 결합 영역 또는 도메인이 공지되거나 결합에 유용하거나 공지된 리간드가 있는 경우, 천연 수용체가 사용될 수 있다.
수용체를 다량체화하는 경우, 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 리간드 결합 영역/수용체 도메인에 대한 리간드는 리간드가 결합 부위 각각이 리간드 수용체 영역에 결합할 수 있는 적어도 2개의 결합 부위를 가질 수 있다는 점에서 다량체일 수 있다(즉, 리간드는 제1 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 리간드 결합 영역에 결합할 수 있는 제1 결합 부위 및 제2 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 리간드 결합 영역에 결합할 수 있는 제2 결합 부위를 가지며, 상기 제1 및 제2 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 리간드 영역은 동일하거나 상이함). 따라서, 본원에 사용되는 용어 "다량체 리간드 결합 영역"은 다량체 리간드에 결합하는 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 리간드 결합 영역을 나타낸다. 본 발명의 다량체 리간드는 이량체 리간드를 포함한다. 본 발명의 이량체 리간드는 리간드 수용체 도메인에 결합할 수 있는 2개의 결합 부위를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 다량체 리간드는 이량체 또는 고차 올리고머, 일반적으로 대략 사량체 이하의 작은 합성 유기 분자이고, 개개의 분자는 전형적으로 적어도 약 150 Da이고 약 5 kDa 미만이며, 통상적으로 약 3 kDa 미만이다. 다양한 쌍의 합성 리간드 및 수용체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 천연 수용체를 포함하는 실시양태에서, 이량체 FK506은 FKBP12 수용체와 함께 사용될 수 있고, 이량체화된 사이클로스포린 A는 사이클로필린 수용체와 함께 사용될 수 있고, 이량체화된 에스트로겐은 에스트로겐 수용체와 함께, 이량체화된 글루코코르티코이드는 글루코코르티코이드 수용체와 함께, 이량체화된 테트라사이클린은 테트라사이클린 수용체와 함께, 이량체화된 비타민 D은 비타민 D 수용체와 함께 등등 사용될 수 있다. 대안적으로, 고차의 리간드, 예를 들어 삼량체가 사용될 수 있다. 비천연 수용체, 예를 들어, 항체 서브유닛, 변형된 항체 서브유닛, 가요성 링커에 의해 분리된 직렬의 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 구성된 단쇄 항체, 또는 변형된 수용체 및 이들의 변이된 서열 등을 포함하는 실시양태 경우, 임의의 다양한 화합물이 사용될 수 있다. 본 발명의 다량체 리간드를 포함하는 단위의 중요한 특징은 각각의 결합 부위가 수용체에 높은 친화성으로 결합할 수 있고, 바람직하게는 이들이 화학적으로 이량체화될 수 있다는 것이다. 또한, 리간드가 기능 수준에서 혈청에 용해될 수 있으나, 대부분의 적용에서 원형질막을 통과하여 확산할 수 있도록 하기 위해 리간드의 소수성/친수성의 균형을 맞추는 방법이 이용 가능하다.
본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 활성화는 예를 들어 조건적으로 제어되는 단백질 또는 폴리펩티드를 생산하기 위해 유도제에 의해 매개되는 화학적으로 유도된 이량체화(CID: chemically induced dimerization)를 통해 달성될 수 있다. 본 발명의 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 유도성일뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드의 유도는 불안정한 이량화제의 분해 또는 단량체의 경쟁적 억제제의 투여로 인해 가역적이다.
특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 위치 36에서 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)을 갖는 FKBP12 폴리펩티드를 포함한다. 리간드 결합 영역이 위치 36에서 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)을 갖는 FKBP12 폴리펩티드를 포함하는 특정 실시양태에서, 유도제는 합성 약물인 AP1903(리미듀시드)(CAS 인덱스 명칭: 2-피페리딘카르복실산, 1-[(2S)-1-옥소-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부틸]-, 1,2-에탄디일비스[이미노(2-옥소-2,1-에탄디일)옥시-3,1-페닐렌[(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)프로필리덴]]에스테르, [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS 등록 번호: 195514-63-7; 분자식: C78H98N4O20, 분자량 : 1411.65))을 포함할 수 있다. 리간드 결합 영역이 위치 36에서 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)을 갖는 FKBP12 폴리펩티드를 포함하는 특정 실시양태에서, 유도제는 AP20187(CAS 등록 번호: 195514-80-8 및 분자식: C82H107N5O20)을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 유도제는 예를 들어 AP1510과 같은 AP20187 유사체이다. 본원에서 사용되는 유도제 AP20187, AP1903(리미듀시드) 및 AP1510은 호환적으로 사용될 수 있다.
AP1903(리미듀시드) API는 알포라 리서치(Alphora Research Inc.)에서 제조되고, AP1903(리미듀시드) 주사용 완제 의약품은 포르마테크(Formatech Inc.)에서 제조된다. 이는 25% 용액 비이온성 용해제인 솔루톨(Solutol) HS 15(250 mg/mL, BASF) 중 5 mg/mL AP1903(리미듀시드) 용액으로 제제화된다. 실온에서, 이 제제는 투명한 연황색 용액이다. 냉동시, 이 제제는 가역적인 상 전이를 거쳐 유백색 용액이 된다. 이 상 전이는 실온으로 재가온 시 역전된다. 충전물은 3 mL 유리 바이알에 2.33 mL(주사용 바이알당 총 약 10 mg AP1903(리미듀시드))이다. AP1903(리미듀시드)를 투여할 필요가 있다고 결정되면, 환자는 예를 들어 비-DEHP, 비-에틸렌옥시드 멸균된 주입 세트를 사용하여 2시간에 걸쳐 IV 주입을 통해 주사용 AP1903(리미듀시드)(0.4mg/kg)의 단일 고정 용량을 투여받을 수 있다. AP1903(리미듀시드)의 용량은 모든 환자에게 개별적으로 계산되며 체중이 10% 이상 변동하지 않는 한 다시 계산되지 않는다. 계산된 용량을 주입 전에 0.9% 생리 식염수 100 mL로 희석한다. AP1903(리미듀시드)에 대한 이전 1 상 연구에서, 24명의 건강한 지원자가 2시간에 걸쳐 IV 주입되는 0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1.0 mg/kg의 용량 수준으로 단일 용량의 주사용 AP1903(리미듀시드)으로 치료받았다. AP1903(리미듀시드) 혈장 수준은 용량에 직접 비례하였으며 평균 Cmax 값은 0.01 내지 1.0 mg/kg 용량 범위에 대해 약 10 내지 1275 ng/mL 범위였다. 초기 주입 기간 후, 혈액 농도는 혈장 농도가 투여 후 0.5, 2 및 10시간에 최대 농도의 약 18, 7 및 1%로 각각 감소하면서 신속한 분포 단계를 나타냈다. 주사용 AP1903(리미듀시드)은 모든 용량 수준에서 안전하고 내약성이 우수한 것으로 나타났으며 유리한 약동학적 프로파일을 입증하였다(Iuliucci J D, et al., J Clin Pharmacol. 41: 870-9, 2001).
사용된 주사용 AP1903(리미듀시드)의 고정 용량은 예를 들어, 2시간에 걸쳐 정맥 내 주입되는 경우 0.4 ㎎/㎏일 수 있다. 세포의 효과적인 신호 전달을 위해 시험관 내에서 필요한 AP1903(리미듀시드)의 양은 10 내지 100 nM(1600 Da MW)이다. 이는 16 내지 160 μg/L 또는 ~0.016 내지 1.6 μg/kg(1.6 내지 160 μg/kg)과 동일하다. 1 mg/kg까지의 용량은 위에서 설명한 AP1903(리미듀시드)의 1상 연구에서 내약성이 우수하였다. 그러므로 0.4 mg/kg은 치료용 세포와 병용된 이 1 상 연구에서 AP1903(리미듀시드)의 안전하고 유효한 용량일 수 있다.
본 발명의 리간드 결합을 코딩하는 아미노산 및/또는 핵산 서열은 야생형 아미노산 또는 핵산 서열과 비교하여 서열의 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 리간드 결합 영역을 코딩하는 아미노산 및/또는 핵산 서열은 코돈이 최적화된 서열일 수 있다. 하나 이상의 변형은 야생형 폴리펩티드와 비교하여 본 발명의 리간드 결합 영역에 대한 리간드(예를 들어, 유도제)의 결합 친화성을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 또는 부가적으로, 하나 이상의 변형은 야생형 폴리펩티드와 비교하여 본 발명의 리간드 결합 영역의 면역원성을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 리간드 결합 영역 및/또는 본 발명의 유도제는 비자연 발생적일 수 있다.
본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 리간드 결합 영역, 링커 및 프로아폽토시스성 펩티드를 포함하며, 상기 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 링커는 리간드 결합 영역의 이량체화 시, 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 상호 작용, 가교 결합, 교차 활성화 또는 활성화를 가능하게 하여 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 상호 작용 또는 활성화가 세포내에서 아폽토시스를 개시하도록 하는 임의의 유기 또는 무기 물질을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 링커는 G/S가 풍부한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드("GS" 링커)이다. 특정 실시양태에서, 링커는 아미노산 서열 GGGGS (서열 번호 5)를 포함하는 폴리펩티드이다. 바람직한 실시양태에서, 링커는 폴리펩티드이고, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 제한 엔도뉴클레아제를 위한 제한 부위를 함유하지 않는다. 본 발명의 링커는 비자연 발생적일 수 있다.
세포에서 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 그 세포에서 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 발현을 개시 및/또는 조절할 수 있는 임의의 프로모터의 전사 조절하에서 발현될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "프로모터"는 유전자를 전사하는 RNA 폴리머라제의 초기 결합 부위로서 작용하는 프로모터를 의미한다. 예를 들어, 포유동물 세포에서 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 포유동물 세포에서 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 발현을 개시 및/또는 조절할 수 있는 임의의 프로모터의 전사 조절하에서 발현될 수 있으며, 상기 프로모터는 천연, 내인성, 외인성 및 이종성 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직한 포유동물 세포는 인간 세포를 포함한다. 따라서, 인간 세포에서 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드는 인간 세포에서 본 발명의 유도 가능한 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 발현을 개시 및/또는 조절할 수 있는 임의의 프로모터의 전사 조절하에서 발현될 수 있으며, 상기 프로모터는 인간 프로모터 또는 바이러스 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 인간 세포에서의 발현을 위한 예시적인 프로모터는 인간 거대세포바이러스(CMV: cytomegalovirus) 전초기(immediate early) 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터, 라우스(Rous) 육종 바이러스 긴 말단 반복, β-액틴 프로모터, 래트 인슐린 프로모터 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나아제 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 고수준 발현을 얻는데 사용될 수 있다. 발현 수준이 세포에서 아폽토시스를 개시하기에 충분하다면, 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 발현을 달성하기 위해 당 업계에 잘 공지되어있는 다른 바이러스 또는 포유동물 세포 또는 박테리아 파지 프로모터의 사용도 고려된다. 잘 알려진 특성을 갖는 프로모터를 사용함으로써, 형질감염 또는 형질전환 후에 관심 단백질 발현의 수준 및 양상을 최적화할 수 있다.
특이적 생리 또는 합성 신호에 반응하여 조절되는 프로모터를 선택하여 본 발명의 유도성 프로아폽토시스성 폴리펩티드의 유도성 발현을 가능하게 할 수 있다. 에크디손(ecdysone) 시스템(Invitrogen, 캘리포니아주 칼즈배드 소재)은 이러한 시스템 중 하나이다. 이 시스템은 포유동물 세포에서 관심 유전자의 발현 조절을 가능하게 하도록 설계되어있다. 이는 실질적으로 전이유전자의 기저 발현을 전혀 허용하지 않지만 200배 이상의 유도능을 허용하는 정확하게 조절되는 발현 기전으로 이루어진다. 이 시스템은 초파리(Drosophila)의 이종이량체 에크디손 수용체를 기반으로 하며, 에크디손 또는 유사체, 예를 들어 무리스테론 A가 수용체에 결합하면 수용체가 하류 전이유전자의 발현을 작동시키는 프로모터를 활성화하여 높은 수준의 mRNA 전사체를 얻는다. 이 시스템에서, 이종이량체 수용체의 단량체는 둘 다 하나의 벡터에서 구성적으로 발현되는 반면에, 관심 유전자의 발현을 유도하는 엑크디손 반응성 프로모터는 다른 플라스미드에 있다. 따라서 이 유형의 시스템을 관심 벡터로 조작하는 것이 유용할 수 있다. 유용할 수 있는 또 다른 유도성 시스템은 원래 고센과 부자드(Gossen and Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551, 1992; Gossen et al., Science, 268:1766-1769, 1995)가 개발한 Tet-Off™ 또는 Tet-On™ 시스템(Clontech, 캘리포니아주 팔로 알토 소재)이다. 이 시스템도 높은 수준의 유전자 발현이 테트라사이클린 또는 테트라사이클린 유도체, 예를 들어 독시사이클린에 반응하여 조절되도록 한다. Tet-On ™ 시스템에서는 독시사이클린이 존재하는 경우에 유전자 발현이 활성화되는 반면, Tet-Off ™ 시스템에서는 독시사이클린이 없는 경우에 유전자 발현이 활성화된다. 이 시스템은 이. 콜라이(E. coli)의 테트라사이클린 내성 오페론으로부터 유래된 두 가지 조절 요소인 테트라사이클린 작동유전자(operator) 서열(테트라사이클린 억제인자가 결합함) 및 테트라사이클린 억제인자 단백질을 기반으로 한다. 관심 유전자는 테트라사이클린 반응 요소가 존재하는 플라스미드로 프로모터 뒤에 클로닝된다. 두 번째 플라스미드는 Tet-Off ™ 시스템에서 단순 포진 바이러스로부터 VP16 도메인과 야생형 테트라사이클린 억제인자로 구성된 테트라사이클린-조절 트랜스 활성화 인자로 불리는 조절 인자를 함유한다. 따라서 독시시클린이 없는 경우, 전사는 구성적으로 일어난다. Tet-On™ 시스템에서 테트라사이클린 억제인자는 야생형이 아니며 독시시클린의 존재하에서 전사를 활성화한다. 유전자 요법 벡터 생산을 위해, 테트라사이클린 또는 독시시클린의 존재하에서 생산 세포가 배양될 수 있고 잠재적 독성 전이유전자의 발현을 막을 수 있지만 벡터가 환자에 도입되면 유전자 발현이 구성적으로 일어나도록 하기 위해 Tet-Off™ 시스템을 사용할 수 있다.
일부 경우에서, 유전자 요법 벡터에서 전이유전자의 발현을 조절하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 다양한 활성 강도를 가진 상이한 바이러스 프로모터가 원하는 발현 수준에 따라 이용된다. 포유동물 세포에서 강한 전사 활성화를 제공하기 위해 CMV의 전초기 프로모터가 종종 사용된다. CMV 프로모터는 문헌[Donnelly, J. J., et al., 1997. Annu. Rev. Immunol. 15:617-48p]에 리뷰되어 있다. 또한, 전이유전자의 발현 수준 감소가 요구될 때 효능이 더 낮은 변형된 형태의 CMV 프로모터가 사용되었다. 조혈 세포에서 전이유전자의 발현이 요구될 때, MLV 또는 MMTV로부터의 LTR과 같은 레트로바이러스 프로모터가 종종 사용된다. 원하는 효과에 따라 사용되는 다른 바이러스 프로모터는 SV40, RSV LTR, HIV-1 및 HIV-2 LTR, 아데노바이러스 프로모터, 예를 들어 E1A, E2A 또는 MLP 영역, AAV LTR, HSV-TK 및 조류 육종 바이러스를 포함한다.
다른 예로, 발생적으로 조절되고 특이적으로 분화된 세포에서 활성인 프로모터가 선택될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 프로모터는 만능성 줄기세포에서 활성적이지 않을 수 있지만, 예를 들어 만능성 줄기세포가 더 성숙한 세포로 분화하면 프로모터가 활성화될 수 있다.
유사하게, 비표적화된 조직에 잠재적 독성 또는 바람직하지 않은 영향을 감소시키기 위해 조직 특이적 프로모터를 사용하여 특정 조직 또는 세포에서 전사를 수행한다. 이러한 프로모터는 CMV 프로모터와 같이 더 강한 프로모터와 비교하여 발현이 감소할 수 있지만, 더 제한된 발현 및 면역원성을 또한 초래할 수 있다(Bojak, A., et al., 2002. Vaccine. 20:1975-79; Cazeaux., N., et al., 2002. Vaccine 20:3322-31). 예를 들어, PSA 관련 프로모터 또는 전립선 특이적 샘(glandular) 칼리크레인, 또는 근육 크레아틴 키나아제 유전자와 같은 조직 특이적 프로모터가 적절한 곳에서 사용될 수 있다.
조직 특이적 또는 분화 특이적 프로모터의 예는 하기를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: B29(B 세포); CD14(단핵 세포); CD43(백혈구 및 혈소판); CD45(조혈 세포); CD68(대식세포); 데스민(근육); 엘라스타아제-1(췌장 선포 세포); 엔도글린(내피 세포); 피브로넥틴(분화 세포, 치유 조직); 및 Flt-1(내피 세포); GFAP(성상 세포).
특정 징후에서, 유전자 요법 벡터의 투여 후 특정 시간에 전사를 활성화하는 것이 바람직하다. 이것은 호르몬 또는 사이토카인 조절 가능한 것과 같은 프로모터로 수행된다. 사용될 수 있는 사이토카인 및 염증 단백질 반응성 프로모터는 K 및 T 키니노겐(Kageyama et al., (1987) J. Biol. Chem., 262, 2345-2351), c-fos, TNF-알파, C-반응성 단백질(Arcone, et al., (1988) Nucl. Acids Res., 16(8), 3195-3207), 합토글로빈(Oliviero et al., (1987) EMBO J., 6, 1905-1912), 혈청 아밀로이드 A2, C/EBP 알파, IL-1, IL-6(Poli and Cortese, (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 86, 8202-8206), 보체 C3(Wilson et al., (1990) Mol. Cell. Biol., 6181-6191), IL-8, 알파-1 산 당단백질(Prowse and Baumann, (1988) Mol Cell Biol, 8, 42-51), 알파-1 항트립신, 지방 단백질 리파아제(Zechner et al., Mol. Cell. Biol., 2394-2401, 1988), 안지오텐시노겐(Ron, et al., (1991) Mol. Cell. Biol., 2887-2895), 피브리노겐, c-jun(포르볼 에스테르, TNF-알파, UV 조사, 레티노산, 및 과산화 수소에 의한 유도성), 콜라게나아제(포르볼 에스테르 및 레티노산에 의한 유도성), 메탈로티오네인(중금속 및 글루코코르티코이드 유도성), 스트로멜리신(포르볼 에스테르, 인터류킨-1 및 EGF에 의한 유도성), 알파-2 마크로글로불린 및 알파-1 항-키모트립신을 포함한다. 다른 프로모터는 예를 들어 SV40, MMTV, 인간 면역 결핍 바이러스(MV), 몰로니 바이러스, ALV, 엡스타인 바 바이러스, 라우스 육종 바이러스, 인간 액틴, 미오신, 헤모글로빈 및 크레아틴을 포함한다.
단독으로 또는 다른 것과 조합된 상기 임의의 프로모터는 원하는 작용에 따라 유용할 수 있다고 생각된다. 프로모터 및 다른 조절 요소가 원하는 세포 또는 조직에서 기능적이 되도록 선택된다. 또한, 이 프로모터 목록은 총망라하거나 제한하는 것으로 해석해서는 안 된다. 다른 프로모터가 본원에 개시된 프로모터 및 방법과 함께 사용된다.
핵산 분자
본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태와 같은 RNA 형태일 수 있거나, 클로닝에 의해 얻거나 또는 합성 생산된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 DNA의 형태, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA는 삼중 가닥, 이중 가닥 또는 단일 가닥 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 적어도 하나의 가닥의 DNA 또는 RNA의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 알려진 코딩 가닥일 수 있거나, 안티 센스 가닥으로도 지칭되는 비코딩 가닥일 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산 분자는, 경우에 따라 하나 이상의 인트론과 함께 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame)을 포함하는 핵산 분자, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 서열의 적어도 하나의 특정 부분; 본 발명의 유도성 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 상기한 것들과 실질적으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 본원에 기재된 바와 같고/거나 당 업계에 공지된 바와 같이 유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 여전히 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전자 암호는 당 업계에 잘 공지되어 있다. 따라서, 당업자가 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 이러한 축퇴성 핵산 변이체를 생성하는 것은 일상적일 것이다. 예를 들어, 상기 문헌[Ausubel, et al.]을 참조하며, 이러한 핵산 변이체는 본 발명에 포함된다.
본원에서 지시된 바와 같이, 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는 유도성 폴리펩티드 또는 단편 자체의 아미노산 서열을 코딩하는 것; 전체 유도성 폴리펩티드 또는 이의 일부분에 대한 코딩 서열; 본 발명의 유도성 폴리펩티드, 단편 또는 일부분에 대한 코딩 서열뿐만 아니라 추가의 서열, 예를 들어 적어도 하나의 인트론과 같은 상기한 추가의 코딩 서열을 포함하거나 포함하지 않으면서, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 리보솜 결합 및 mRNA의 안정성)를 포함하는 mRNA 프로세싱, 전사에 역할을 하는 전사되는 비번역 서열과 같은 비코딩 5' 및 3' 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는 추가적인 비코딩 서열을 함께 포함하는 융합 펩티드 또는 적어도 하나의 신호 리더(leader)의 코딩 서열; 추가적인 아미노산, 예를 들어 추가적인 기능을 제공하는 아미노산을 코딩하는 추가의 코딩 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 단백질 스캐폴드 단편 또는 일부분을 포함하는 융합된 단백질 스캐폴드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 코딩하는 서열과 같은 마커 서열에 융합될 수 있다,
핵산의 제작
본 발명의 단리된 핵산은 당 업계에 잘 공지된 바와 같이, (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 및/또는 (d) 이들의 조합을 사용하여 제조될 수 있다.
핵산은 편의상 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 서열 이외의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중 클로닝 부위를 핵산에 삽입하여 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 단리를 도울 수 있다. 또한, 번역 가능한 서열을 삽입하여 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오티드의 단리를 도울 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 카스파제 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 발명의 핵산은 경우에 따라, 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 서열 또는 본 발명의 유도성 폴리펩티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터 또는 링커이다.
클로닝 및/또는 발현에서 기능을 최적화하기 위해, 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 단리를 돕기 위해, 또는 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 세포내로의 도입을 향상시키기 위해, 추가의 서열이 상기 클로닝 및/또는 발현 서열에 첨가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 당 업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 상기 문헌[Ausubel; 또는 Sambrook] 참조).
핵산을 제작하기 위한 재조합 방법
RNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합과 같은 본 발명의 단리된 핵산 조성물은 당업자에게 공지된 많은 클로닝 방법론을 사용하여 생물학적 공급원으로부터 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 엄격한 조건하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 동정한다. RNA의 단리, cDNA 및 게놈 라이브러리의 제작은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, 상기 문헌[Ausubel; 또는 Sambrook] 참조).
핵산 스크리닝 및 단리 방법
cDNA 또는 게놈 라이브러리는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 단편의 서열에 기초한 프로브를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 프로브는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화하여 동일한 또는 상이한 생물체에서 상동 유전자를 단리하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 혼성화의 다양한 엄격도 정도가 분석에서 사용될 수 있음을 인식할 것이다; 혼성화 또는 세척 매질 중 어느 하나가 엄격할 수 있다. 혼성화를 위한 조건이 더욱 엄격해짐에 따라, 이중체 형성이 일어나는 프로브와 표적 간의 상보성 정도가 더 커져야 한다. 엄격도 정도는 온도, 이온 강도, pH 및 포름아미드와 같은 부분적 변성 용매의 존재 중 하나 이상에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 혼성화의 엄격도는, 예를 들어, 0% 내지 50%의 범위 내의 포름아미드 농도의 조작을 통해 반응물 용액의 극성을 변화시킴으로써 편리하게 변화된다. 검출 가능한 결합에 필요한 상보성(서열 동일성)의 정도는 혼성화 매질 및/또는 세척 매질의 엄격도에 따라 변할 것이다. 상보성의 정도는 최적으로 100%, 또는 70 내지 100%, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값일 것이다. 그러나 프로브 및 프라이머에서의 약간의 서열 변화는 혼성화 및/또는 세척 매질의 엄격도를 감소시킴으로써 상쇄될 수 있음을 이해해야 한다.
RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 당 업계에 잘 공지되어 있으며, 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 불필요한 실험 없이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
DNA 또는 RNA 증폭의 공지된 방법은 중합 효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction) 및 관련 증폭 공정을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188호(Mullis et al.); 제4,795,699호 및 4,921,794호4(Tabor, et al.); 제5,142,033 호(Innis); 제5,122,464호(Wilson, et al.); 제5,091,310호(Innis); 제5,066,584호(Gyllensten, et al.); 제4,889,818호(Gelfand, et al.); 제4,994,370호(Silver, et al.); 제4,766,067호(Biswas); 제4,656,134호(Ringold) 및 이중 가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 표적 서열에 대한 안티센스 RNA를 사용하는 RNA 매개 증폭법(미국 특허 제5,130,238호)(Malek, et al, 상표명 NASBA)을 참조하며, 상기 참고 문헌의 전체 내용은 본원에서 참고로 포함된다(예를 들어, 상기 문헌[Ausubel; 또는 Sambrook] 참조).
예를 들어, 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열 및 관련 유전자를 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접 증폭시키는데 사용될 수 있다. PCR 및 다른 시험관 내 증폭 방법은 또한, 예를 들어, 발현되는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하고, 핵산이 샘플에서 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위한, 핵산 서열분석을 위한, 또는 다른 목적을 위한 프로브로서 사용하는 핵산을 제조하는데 유용할 수 있다. 시험관 내 증폭 방법을 당업자에게 안내하기에 충분한 기술의 예는 상기 문헌[Berger; Sambrook;, 및 Ausubel], 및 미국 특허 제4,683,202호 (1987)(Mullis et al); 및 문헌[Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)]에서 확인된다. 게놈 PCR 증폭용으로 시판되는 키트는 당 업계에 공지되어있다. 예를 들어, 어드밴티지-GC 게놈 PCR 키트(Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech))를 참조한다. 또한, 예를 들어, T4 유전자 32 단백질(Boehringer Mannheim)을 사용하여 긴 PCR 산물의 수율을 향상시킬 수 있다.
핵산 제작을 위한 합성 방법
본 발명의 단리된 핵산은 또한 공지된 방법(예를 들어, 상기 문헌(Ausubel, et al.) 참조)에 의한 직접적인 화학 합성에 의해 제조될 수 있다. 화학 합성은 일반적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생산하며, 이는 상보 서열과의 혼성화 또는 단일 가닥을 주형으로 사용하는 DNA 중합 효소로의 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학 합성이 약 100, 500 및 1000개 이상의 염기 서열로 제한될 수 있지만, 더 긴 서열은 더 짧은 서열의 결찰에 의해 얻을 수 있음을 인식할 것이다.
재조합 발현 카세트
본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 제공한다. 본 발명의 핵산 서열, 예를 들어, 본 발명의 유도성 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 cDNA 또는 게놈 서열을 사용하여 적어도 하나의 원하는 숙주 세포에 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 제작할 수 있다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 의도하는 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시할 전사 개시 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 이종 및 비이종(즉, 내인성) 프로모터 모두가 본 발명의 핵산의 발현을 지시하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향 또는 하향 조절하기 위해서 프로모터, 인핸서 또는 다른 요소로서 작용하는 단리된 핵산을 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 비이종 형태의 적절한 위치(상류, 하류 또는 인트론)에 도입할 수 있다. 예를 들어, 내인성 프로모터는 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의해 생체 내 또는 시험관 내에서 변경될 수 있다.
벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 당 업계에 잘 공지된 바와 같이, 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 벡터, 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 적어도 하나의 유도성 폴리펩티드의 생산에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 문헌[Sambrook, et al.; [Ausubel, et al.]을 참조하며, 이들 각각은 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 경우에 따라 숙주에서의 증식을 위한 선별 가능한 마커를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산칼슘 침전물과 같은 침전물 또는 하전된 지질과의 복합체로 도입된다. 벡터가 바이러스일 경우, 적절한 패키징 세포주를 사용하여 시험관 내에서 패키징된 다음 숙주 세포로 형질도입될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열일 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 에피솜으로 유지되거나 재조합/변형된 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 트랜스포존은 비바이러스 유전자 전달을 향상시키기 위해 트랜스포존 및 트랜스포사제를 이용하는 2가지 성분 피기백 시스템의 일부일 수 있다. 상기 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제이다.
본 발명의 트랜스포존은 피기백 트랜스포존을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스 조절 격리 인자가 측면에 위치한 본 발명의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제이다. 특정 실시양태에서, 특히 트랜스포사제가 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제인 실시양태에서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 피기백™(PB) 트랜스포사제 효소이다. 피기백(PB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00022
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 하기 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백™(PB) 트랜스포사제 효소이다:
Figure pct00023
특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 2개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 3개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 하기 위치 30, 165, 282, 및 538 각각에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 30에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 165에서 아미노산 치환은 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 282에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 538에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 위치 30에서 아미노산 치환이 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 165에서 아미노산 치환이 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이고, 위치 282에서 아미노산 치환이 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 538에서 아미노산 치환이 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환인 서열 번호 1의 서열의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
Figure pct00024
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 위치 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 3에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 82에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 119에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 185에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 187에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 200에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 207에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 209에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 226에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 235에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 240에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 241에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 243에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 258에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 발린으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 315에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 319에서 아미노산 치환은 트레오닌(T)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 327에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 328에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 421에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 436에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 456에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 470에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 485에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 552에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 570에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다.
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 194에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 372에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 375에서 아미노산 치환은 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 450에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 509에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 570에서 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함할 수 있다. 피기백™ 트랜스포사제 효소가 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함할 수 있는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 372, 375 및 450에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 및 서열 번호 1의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환 및 서열 번호 1의 위치 450에서 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티 트랜스포존이다. 특정 실시양태, 특히 트랜스포존이 슬리핑 뷰티 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티 트랜스포존 (SB100X)이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
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본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 과활성 슬리핑 뷰티(SB100X) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00026
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 헬리트론 트랜스포사제이다. 헬리트론 트랜스포사제는 300 내지 360만 년 전에 활성이 있던 박쥐 게놈의 고대 요소인 헬레이저 트랜스포존을 동원한다. 본 발명의 예시적인 헬레이저 트랜스포존은 Helibat1을 포함하며, 이는 하기를 포함하는 핵산 서열을 포함한다:
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
다른 트랜스포사제와 달리, 헬리트론 트랜스포사제는 RN아제 H 유사 촉매 도메인을 함유하지 않지만, 대신에 복제 개시 도메인(Rep) 및 DNA 헬리카제 도메인으로 구성된 RepHel 모티프를 포함한다. Rep 도메인은 HUH 슈퍼 패밀리 뉴클레아제의 뉴클레아제 도메인이다.
본 발명의 예시적인 헬리트론 트랜스포사제는 하기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00030
Figure pct00031
헬리트론 전위에서, 트랜스포존의 3 '말단에 가까운 헤어핀은 종결 인자로서 기능을 한다. 그러나 이 헤어핀은 트랜스포사제에 의해 우회되어, 측면 서열의 형질도입을 초래할 수 있다. 또한, 헬레이저 전위는 공유적으로 폐쇄된 원형의 중간체를 생성한다. 또한, 헬리트론 전위는 표적 부위 중복이 없을 수 있다. 헬레이저 서열에서, 트랜스포사제는 LTS 및 RTS라고 명명된 좌측 및 우측 말단 서열이 측면에 위치한다. 이들 서열은 보존된 5'-TC/CTAG-3' 모티프로 종결된다. 헤어핀 종결 구조를 형성할 잠재력을 가진 19 bp 회문 염기 서열은 RTS의 11개 뉴클레오티드 상류에 위치하며, 서열
Figure pct00032
(서열 번호 23)로 이루어진다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제는 Tol2 트랜스포사제이다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, Tol2 트랜스포존은 메다카 어류의 게놈으로부터 단리 또는 유래될 수 있으며, hAT 패밀리의 트랜스포존과 유사할 수 있다. 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포존은 약 4.7 킬로베이스를 포함하는 서열에 의해 코딩되고, 4개의 엑손을 함유하는 Tol2 트랜스포사제 코딩 유전자를 함유한다. 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포사제는 하기를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pct00033
역전된 반복 서열, 말단 가까운 서열 및 Tol2 트랜스포사제를 포함하는 본 발명의 예시적인 Tol2 트랜스포존은 하기를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다:
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
DNA 삽입물은 적절한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어야 한다. 발현 구조물은 전사 개시, 종결을 위한 부위 및 전사되는 영역 내에 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 포함할 것이다. 구조물에 의해 발현되는 성숙한 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 번역되는 mRNA의 시작 부위에 번역 개시 코돈 및 말단에 적절하게 위치된 종결 코돈(예를 들어, UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 것이며, 포유동물 또는 진핵 세포 발현에서 UAA 및 UAG가 선호된다.
발현 벡터는 바람직하게는 그러나 경우에 따라 적어도 하나의 선별 가능한 마커를 포함할 것이다. 이러한 마커로는 예를 들어, 진핵 세포 배양을 위한 암피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 미코페놀산, 또는 글루타민 신테타아제(GS, 미국 특허 제5,122,464호; 제5,770,359호; 제5,827,739호), 블라스티시딘(bsd 유전자) 내성 유전자뿐만 아니라 이. 콜라이 및 기타 박테리아 또는 원핵생물에서 배양하기 위한 암피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 카나마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 카르베니실린, 블레오마이신, 에리트로마이신, 폴리믹신 B, 또는 테트라사이클린 내성 유전자가 포함되나 이에 제한되지는 않는다(상기 특허는 이로써 전체가 참고로 포함됨). 상기한 숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 조건은 당 업계에 공지되어있다. 적합한 벡터는 당업자에게 기꺼이 명백할 것이다. 숙주 세포내로 벡터 구조물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질 매개 형질감염, 전기 천공, 형질도입, 감염 또는 다른 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 상기 문헌[Sambrook, Chapter 1-4 and 16-18; Ausubel, Chapters 1, 9, 13, 15, 16]에서와 같이 당 업계에 기술되어 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 그러나 경우에 따라 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포를 단리하기 위한 적어도 하나의 선별 가능한 세포 표면 마커를 포함할 것이다. 본 발명의 선별 가능한 세포 표면 마커는 세포 또는 세포의 서브세트를 세포의 정의된 또 다른 서브세트와 구별하는 표면 단백질, 당단백질 또는 단백질 군을 포함한다. 바람직하게는 선별 가능한 세포 표면 마커는 본 발명의 조성물 또는 방법에 의해 변형된 세포를 본 발명의 조성물 또는 방법에 의해 변형되지 않은 세포와 구별한다. 이러한 세포 표면 마커는 예를 들어 절두되거나 전체 길이 형태의 CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52, 또는 이들의 임의의 조합과 같은 "세포 표면 항원 무리(cluster of designation)" 또는 "분류 결정 인자(classification of determinant)" 단백질(종종 "CD"로 약칭됨)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 세포 표면 마커는 자살 유전자 마커 RQR8을 추가로 포함한다(Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87).
발현 벡터는 바람직하게는 그러나 경우에 따라, 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포를 단리하기 위한 적어도 하나의 선별 가능한 약물 내성 마커를 포함할 것이다. 본 발명의 선별 가능한 약물 내성 마커는 야생형 또는 돌연변이 Neo, DHFR, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 유도성 폴리펩티드는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있으며, 추가적인 이종의 기능성 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포에서, 정제 중에, 또는 후속적인 취급 및 저장 중에 안정성 및 지속성을 향상시키기 위해 단백질 스캐폴드의 N-말단에 추가의 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역이 첨가될 수 있다. 또한, 정제를 용이하게 하기 위해 본 발명의 단백질 스캐폴드에 펩티드 모이어티가 첨가될 수 있다. 이러한 영역은 유도성 폴리펩티드 또는 이의 적어도 하나의 단편의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 이러한 방법은 상기 문헌[Sambrook, Chapters 17.29-17.42 and 18.1-18.74; Ausubel, Chapters 16, 17 and 18]과 같은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어있다.
당업자는 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산의 발현에 이용 가능한 다수의 발현 시스템에 대해 잘 알고 있다. 다르게는, 본 발명의 핵산은 본 발명의 유도성 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 함유하는 숙주 세포에서 (조작에 의해) 작동시킴으로써 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,580,734호, 제5,641,670호, 제5,733,746호 및 제5,733,761호에 기재된 바와 같이 당 업계에 잘 공지되어 있다.
변형된 세포를 위한 발현 벡터는 하기와 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 하기 발현 조절 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 복제 기점; 프로모터(예를 들어, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터(미국 특허 제5,168,062호; 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk(포스포글리세레이트 키나아제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(미국 특허 제5,266,491호), 적어도 하나의 인간 프로모터, 인핸서, 및/또는 프로세싱 정보 부위, 예를 들어 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40 거대 T Ag 폴리 A 첨가 부위) 및 전사 종결 서열. 예를 들어, 상기 문헌[Ausubel et al.; Sambrook, et al.]을 참조한다. 본 발명의 핵산 또는 단백질의 생산에 유용한 다른 세포는 공지되어 있고/거나, 예를 들어 세포주 및 하이브리도마의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 카탈로그(American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas)(www.atcc.org) 또는 기타 공지된 또는 상용 공급처로부터 이용 가능하다.
진핵 숙주 세포가 사용되는 경우, 폴리아데닐화 또는 전사 종결 서열이 전형적으로 벡터에 혼입된다. 종결 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자의 폴리아데닐화화 서열이다. 전사체의 정확한 스플라이싱을 위한 서열도 포함될 수 있다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40의 VP1 인트론이다(Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). 또한, 숙주 세포에서 복제를 조절하기 위한 유전자 서열은 당 업계에 공지된 바와 같이 벡터에 혼입될 수 있다.
아미노산 코드
본 발명의 단백질 스캐폴드를 구성하는 아미노산은 종종 약칭된다. 아미노산 표기는 당해 분야에서 잘 이해되는 바와 같이 단일 문자 코드, 3문자 코드, 명칭 또는 3개의 뉴클레오티드 코돈(들)에 의해 아미노산을 지정하여 나타낼 수 있다(문헌[Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994] 참조). 본 발명의 유도성 폴리펩티드는 본원에서 명시된 바와 같은 자연 돌연변이 또는 인간 조작으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 본 발명의 유도성 폴리펩티드에서 기능에 필수적인 아미노산은 부위 지정 돌연변이 유발 또는 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 상기 문헌[Ausubel, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]). 후자의 절차는 분자 내의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이어서, 생성된 돌연변이 분자를 생물학적 활성, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 적어도 하나의 중화 활성에 대해 시험한다. 기능(즉, 아폽토시스 유도)에 결정적인 부위는 또한 결정화, 핵자기 공명 또는 광친화성 표지와 같은 구조 분석에 의해 확인될 수 있다(Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) 및 de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).
생물학적으로 활성인 본 발명의 유도성 폴리펩티드는 세포의 천연(비합성적), 내인성 또는 관련 및 공지된 단백질 또는 효소의 발현 또는 유도와 비교하여 적어도 20%, 30% 또는 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 60% 또는 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80%, 90% 또는 95% 내지 99% 이상 효과적인 효능으로 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있는 하나 이상의 단백질 또는 효소(예를 들어, 카스파제 9와 같은 카스파제)를 포함한다. 단백질 결합 및 효소 활성의 측정값을 분석 및 정량하는 방법은 당 업계에 잘 공지되어 있다.
입양 세포 요법으로서 변형된 세포의 주입
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 유도성 폴리펩티드를 발현하는 변형된 세포를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 선별된 상기 변형된 세포를 제공한다. 본 발명의 변형된 세포는 실온 및 체온을 포함하는 임의의 온도에서 저장을 위해 제제화될 수 있다. 본 발명의 변형된 세포는 동결 보존 및 후속 해동을 위해 제제화될 수 있다. 본 발명의 변형된 세포는 멸균 포장으로부터 대상체에게 직접 투여하기 위해 약학적으로 허용 가능한 담체에 제제화될 수 있다.
실시예
실시예 1: 인간 범 T 세포로 피기백 통합된 iC9 안전 스위치의 발현과 기능
인간 범 T 세포를 4개의 피기백 트랜스포존 중 하나로 아막사 4D 뉴클레오펙터(Amaxa 4D nucleofector)를 사용하여 뉴클레오펙션시켰다. "모의" 조건을 받은 변형된 T 세포는 공(empty) 피기백 트랜스포존으로 뉴클레오펙션시켰다. 변형된 T 세포는 치료제(카르티린을 코딩하는 서열)를 단독으로 함유하는 피기백 트랜스포사제 또는 통합된 iC9 서열과 치료제(카르티린을 코딩하는 서열)를 함유하는 피기백 트랜스포사제를 받았다.
[도 1]은 리간드 결합 영역, 링커 및 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 함유하는 iC9 안전 스위치의 개략도를 제공한다. 구체적으로, iC9 폴리펩티드는 위치 36에서 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)을 포함하는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함하는 리간드 결합 영역을 함유한다. iC9 폴리펩티드의 FKBP12 폴리펩티드는
Figure pct00037
를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. iC9 폴리펩티드의 FKBP12 폴리펩티드는
Figure pct00038
를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. iC9 폴리펩티드의 링커 영역은 GGGGS (서열 번호 5)를 포함하는 아미노산 및 GGAGGAGGAGGATCC (서열 번호 6)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. iC9 폴리펩티드를 코딩하는 아미노산 서열은
Figure pct00039
를 포함하는 아미노산에 의해 코딩된다. iC9 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은
Figure pct00040
를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
iC9 안전 스위치를 시험하기 위해, 4개의 변형된 T 세포 각각을 0, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM 또는 1000 nM AP1903(유도제, 리미듀시드로도 공지된 AP1903)와 24시간 인큐베이션하였다. 아폽토시스를 겪는 세포에 대한 마커로서 형광 인터킬레이터인 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD)를 사용한 유동 세포 측정법에 의해 생존율을 평가하였다.
세포 생존율을 제12일에 평가하였다(도 2 참조). 데이터는 iC9 구조물을 함유하는 세포에서 유도제의 농도가 증가함에 따라 우측 하부에서 좌측 상부 사분면으로 세포 집단이 이동하는 것을 보여준다. 그러나 이러한 효과는 유도제의 농도에 관계없이 이 두 영역 사이에 세포가 균등하게 분포되어있는 iC9 구조물이 없는 세포(카르티린을 단독으로 받은 세포)에서는 관찰되지 않는다. 또한, 세포 생존율을 제19일에 평가하였다(도 3 참조). 데이터는 [도 2](뉴클레오펙션 후 제12일)에서와 동일한 경향을 나타낸다. 그러나 좌측 상단 사분면으로의 집단 이동은 이 더 뒤의 시점(뉴클레오펙션 후 제19일)에서 더 두드러진다.
집계된 결과의 정량화를 수행하여 [도 4]에 제공하며, 이는 제12일(도 2, 좌측 그래프) 또는 제19일(도 3, 우측 그래프)에 각각의 변형된 세포 유형에 대해 iC9 스위치의 유도제(AP1903, 리미듀시드로도 공지됨)의 농도의 함수로서 iC9 안전 스위치가 세포 생존율(%)에 유의하게 영향을 미침을 나타낸다. iC9 안전 스위치의 존재는 제12일까지 세포의 상당 부분에서 아폽토시스를 유도하고 그 효과는 제19일까지 훨씬 더 극적이다.
이 연구의 결과는 AP1903(리미듀시드)이 연구의 최저 농도(0.1 nM)에서도 아폽토시스를 유도하기 때문에, iC9 안전 스위치가 유도제(예를 들어 AP1903, 리미듀시드로도 공지됨)와 접촉시 활성 세포를 제거하는데 매우 효과적임을 보여준다. 또한, iC9 안전 스위치는 트리시스트론(tricistronic) 벡터의 일부로서 기능적으로 발현될 수 있다.
실시예 2: 생체 내 NGS 마우스에서 iC9 안전 스위치를 사용한 P- BCMA -101 포함 세포의 매우 효율적인 사멸
NSG 마우스에 MM.1S/루시퍼라제+ 세포를 IV 주사하고, 제8일에 단계를 결정하고, 제9일에 T 세포를 주사하고, 제12일에 명시된 용량의 AP1903(리미듀시드)으로 처리하였다. 24시간 후, 마우스를 안락사시키고 혈액, 비장 및 골수 세포를 수집하고 huCD45+ 세포의 존재에 대해 염색하였다(도 5). 혈액, 비장 및 골수 세포를 huCD45+ 세포의 존재에 대해 유동 세포 측정법으로 분석하였다. 상대 생존율은 각 샘플에 대한 1,500 이벤트에 대해 huCD45 세포 수를 msCD45 세포 수로 나누고 미처리 군에서 huCD45/msCD45의 평균 곱하기 100%로 정규화하여 결정하였다. 각 데이터 지점은 상이한 마우스를 나타낸다(도 6).
참고의 포함
임의의 상호 참조된 또는 관련된 특허 또는 출원을 포함하여 본원에 인용된 모든 문헌은 명백히 배제되거나 달리 제한되지 않는 한 이로써 본원에 그 전문으로 참고로 포함된다. 어떤 문헌의 인용도 이것이 본원에 개시 또는 청구된 어떤 발명에 관한 선행 기술임을 인정하거나 이것이 단독으로 또는 임의의 다른 참고 문헌 또는 문헌들과의 임의의 조합으로 상기 어떤 발명을 교시, 시사 또는 개시하는 것임을 인정하는 것은 아니다. 또한, 이 문서에서 용어의 어떤 의미 또는 정의가 참조로 포함된 문서에서 동일한 용어의 어떤 의미 또는 정의와 상충하는 정도까지 이 문서의 해당 용어에 지정된 의미 또는 정의가 적용될 것이다.
다른 실시양태
본 발명의 특정 실시양태가 예시되고 기술되었지만, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고서 다양한 다른 변경 및 변형이 이루어질 수 있다. 첨부된 청구항의 범위는 본 발명의 범위 내에 있는 이러한 모든 변경 및 변형을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> POSEIDA THERAPEUTICS, INC OSTERTAG, Eric SHEDLOCK, Devon <120> INDUCIBLE CASPASES AND METHODS FOR USE <130> POTH-012/001WO <150> 62/405,184 <151> 2016-10-06 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 594 <212> PRT <213> Trichoplusia ni <400> 1 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys 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Ile Val 355 360 365 Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn 370 375 380 Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro 385 390 395 400 Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu 405 410 415 Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys 420 425 430 Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr 435 440 445 Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg 450 455 460 Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn 465 470 475 480 Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val 485 490 495 Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser 500 505 510 Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu 515 520 525 Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Asn Glu Val Pro Gly Thr Ser 530 535 540 Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr 545 550 555 560 Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys 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ctgtctgatc attaacaatg tgaacttctg cagagaaagc 120 ggactgcgaa cacggactgg ctccaatatt gactgtgaga agctgcggag aaggttctct 180 agtctgcact ttatggtcga agtgaaaggg gatctgaccg ccaagaaaat ggtgctggcc 240 ctgctggagc tggctcagca ggaccatgga gctctggatt gctgcgtggt cgtgatcctg 300 tcccacgggt gccaggcttc tcatctgcag ttccccggag cagtgtacgg aacagacggc 360 tgtcctgtca gcgtggagaa gatcgtcaac atcttcaacg gcacttcttg ccctagtctg 420 gggggaaagc caaaactgtt ctttatccag gcctgtggcg gggaacagaa agatcacggc 480 ttcgaggtgg ccagcaccag ccctgaggac gaatcaccag ggagcaaccc tgaaccagat 540 gcaactccat tccaggaggg actgaggacc tttgaccagc tggatgctat ctcaagcctg 600 cccactccta gtgacatttt cgtgtcttac agtaccttcc caggctttgt ctcatggcgc 660 gatcccaagt cagggagctg gtacgtggag acactggacg acatctttga acagtgggcc 720 cattcagagg acctgcagag cctgctgctg cgagtggcaa acgctgtctc tgtgaagggc 780 atctacaaac agatgcccgg gtgcttcaat tttctgagaa agaaactgtt ctttaagact 840 tcc 843 <210> 9 <211> 394 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> inducible proapoptotic polypeptide 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cctgaggacg aatcaccagg gagcaaccct gaaccagatg caactccatt ccaggaggga 900 ctgaggacct ttgaccagct ggatgctatc tcaagcctgc ccactcctag tgacattttc 960 gtgtcttaca gtaccttccc aggctttgtc tcatggcgcg atcccaagtc agggagctgg 1020 tacgtggaga cactggacga catctttgaa cagtgggccc attcagagga cctgcagagc 1080 ctgctgctgc gagtggcaaa cgctgtctct gtgaagggca tctacaaaca gatgcccggg 1140 tgcttcaatt ttctgagaaa gaaactgttc tttaagactt cc 1182 <210> 11 <211> 18 <212> PRT <213> Thosea asigna virus <400> 11 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSG-T2A <400> 12 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 13 <211> 20 <212> PRT <213> Equine rhnitis A virus <400> 13 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 14 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GSG-E2A <400> 14 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn 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gcaaagtaat agctaaaatt 2280 catgtcattg aatttcagaa acgcggactg cctcacgctc acatattatt gatattagat 2340 agtgagtcca aattacgttc agaagatgac attgaccgta tagttaaggc agaaattcca 2400 gatgaagacc agtgtcctcg actttttcaa attgtaaaat caaatatggt acatggacca 2460 tgtggaatac aaaatccaaa tagtccatgt atggaaaatg gaaaatgttc aaagggatat 2520 ccaaaagaat ttcaaaatgc gaccattgga aatattgatg gatatcccaa atacaaacga 2580 agatctggta gcaccatgtc tattggaaat aaagttgtcg ataacacttg gattgtccct 2640 tataacccgt atttgtgcct taaatataac tgtcatataa atgttgaagt ctgtgcatca 2700 attaaaagtg tcaaatattt atttaaatac atctataaag ggcacgattg tgcaaatatt 2760 caaatttctg aaaaaaatat tatcaatcat gacgaagtac aggacttcat tgactccagg 2820 tatgtgagcg ctcctgaggc tgtttggaga ctttttgcaa tgcgaatgca tgaccaatct 2880 catgcaatca caagattagc tattcatttg ccaaatgatc agaatttgta ttttcatacc 2940 gatgattttg ctgaagtttt agatagggct aaaaggcata actcgacttt gatggcttgg 3000 ttcttattga atagagaaga ttctgatgca cgtaattatt attattggga gattccacag 3060 cattatgtgt ttaataattc tttgtggaca aaacgccgaa 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270 Ile Asn Glu Leu Thr Lys Ser Tyr Lys Met Leu His Glu Val Glu Lys 275 280 285 Glu Ala Gln Ser Glu Ala Ala Ala Lys Gly Ile Ala Pro Thr Glu Val 290 295 300 Thr Met Ala Ile Lys Tyr Asp Arg Asn Ser Asp Pro Gly Arg Tyr Asn 305 310 315 320 Ser Pro Arg Val Thr Glu Val Ala Val Ile Phe Arg Asn Glu Asp Gly 325 330 335 Glu Pro Pro Phe Glu Arg Asp Leu Leu Ile His Cys Lys Pro Asp Pro 340 345 350 Asn Asn Pro Asn Ala Thr Lys Met Lys Gln Ile Ser Ile Leu Phe Pro 355 360 365 Thr Leu Asp Ala Met Thr Tyr Pro Ile Leu Phe Pro His Gly Glu Lys 370 375 380 Gly Trp Gly Thr Asp Ile Ala Leu Arg Leu Arg Asp Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Asp Asn Asn Thr Arg Gln Asn Val Arg Thr Arg Val Thr Gln Met Gln 405 410 415 Tyr Tyr Gly Phe His Leu Ser Val Arg Asp Thr Phe Asn Pro Ile Leu 420 425 430 Asn Ala Gly Lys Leu Thr Gln Gln Phe Ile Val Asp Ser Tyr Ser Lys 435 440 445 Met Glu Ala Asn Arg Ile Asn Phe Ile Lys Ala Asn Gln Ser Lys Leu 450 455 460 Arg Val Glu Lys Tyr Ser Gly Leu Met Asp Tyr Leu Lys Ser Arg Ser 465 470 475 480 Glu Asn Asp Asn Val Pro Ile Gly Lys Met Ile Ile Leu Pro Ser Ser 485 490 495 Phe Glu Gly Ser Pro Arg Asn Met Gln Gln Arg Tyr Gln Asp Ala Met 500 505 510 Ala Ile Val Thr Lys Tyr Gly Lys Pro Asp Leu Phe Ile Thr Met Thr 515 520 525 Cys Asn Pro Lys Trp Ala Asp Ile Thr Asn Asn Leu Gln Arg Trp Gln 530 535 540 Lys Val Glu Asn Arg Pro Asp Leu Val Ala Arg Val Phe Asn Ile Lys 545 550 555 560 Leu Asn Ala Leu Leu Asn Asp Ile Cys Lys Phe His Leu Phe Gly Lys 565 570 575 Val Ile Ala Lys Ile His Val Ile Glu Phe Gln Lys Arg Gly Leu Pro 580 585 590 His Ala His Ile Leu Leu Ile Leu Asp Ser Glu Ser Lys Leu Arg Ser 595 600 605 Glu Asp Asp Ile Asp Arg Ile Val Lys Ala Glu Ile Pro Asp Glu Asp 610 615 620 Gln Cys Pro Arg Leu Phe Gln Ile Val Lys Ser Asn Met Val His Gly 625 630 635 640 Pro Cys Gly Ile Gln Asn Pro Asn Ser Pro Cys Met Glu Asn Gly Lys 645 650 655 Cys Ser Lys Gly Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Asn Ala Thr Ile Gly Asn 660 665 670 Ile Asp Gly Tyr Pro Lys Tyr Lys Arg Arg Ser Gly Ser Thr Met Ser 675 680 685 Ile Gly Asn Lys Val Val Asp Asn Thr Trp Ile Val Pro Tyr Asn Pro 690 695 700 Tyr Leu Cys Leu Lys Tyr Asn Cys His Ile Asn Val Glu Val Cys Ala 705 710 715 720 Ser Ile Lys Ser Val Lys Tyr Leu Phe Lys Tyr Ile Tyr Lys Gly His 725 730 735 Asp Cys Ala Asn Ile Gln Ile Ser Glu Lys Asn Ile Ile Asn His Asp 740 745 750 Glu Val Gln Asp Phe Ile Asp Ser Arg Tyr Val Ser Ala Pro Glu Ala 755 760 765 Val Trp Arg Leu Phe Ala Met Arg Met His Asp Gln Ser His Ala Ile 770 775 780 Thr Arg Leu Ala Ile His Leu Pro Asn Asp Gln Asn Leu Tyr Phe His 785 790 795 800 Thr Asp Asp Phe Ala Glu Val Leu Asp Arg Ala Lys Arg His Asn Ser 805 810 815 Thr Leu Met Ala Trp Phe Leu Leu Asn Arg Glu Asp Ser Asp Ala Arg 820 825 830 Asn Tyr Tyr Tyr Trp Glu Ile Pro Gln His Tyr Val Phe Asn Asn Ser 835 840 845 Leu Trp Thr Lys Arg Arg Lys Gly Gly Asn Lys Val Leu Gly Arg Leu 850 855 860 Phe Thr Val Ser Phe Arg Glu Pro Glu Arg Tyr Tyr Leu Arg Leu Leu 865 870 875 880 Leu Leu His Val Lys Gly Ala Ile Ser Phe Glu Asp Leu Arg Thr Val 885 890 895 Gly Gly Val Thr Tyr Asp Thr Phe His Glu Ala Ala Lys His Arg Gly 900 905 910 Leu Leu Leu Asp Asp Thr Ile Trp Lys Asp Thr Ile Asp Asp Ala Ile 915 920 925 Ile Leu Asn Met Pro Lys Gln Leu Arg Gln Leu Phe Ala Tyr Ile Cys 930 935 940 Val Phe Gly Cys Pro Ser Ala Ala Asp Lys Leu Trp Asp Glu Asn Lys 945 950 955 960 Ser His Phe Ile Glu Asp Phe Cys Trp Lys Leu His Arg Arg Glu Gly 965 970 975 Ala Cys Val Asn Cys Glu Met His Ala Leu Asn Glu Ile Gln Glu Val 980 985 990 Phe Thr Leu His Gly Met Lys Cys Ser His Phe Lys Leu Pro Asp Tyr 995 1000 1005 Pro Leu Leu Met Asn Ala Asn Thr Cys Asp Gln Leu Tyr Glu Gln 1010 1015 1020 Gln Gln Ala Glu Val Leu Ile Asn Ser Leu Asn Asp Glu Gln Leu 1025 1030 1035 Ala Ala Phe Gln Thr Ile Thr Ser Ala Ile Glu Asp Gln Thr Val 1040 1045 1050 His Pro Lys Cys Phe Phe Leu Asp Gly Pro Gly Gly Ser Gly Lys 1055 1060 1065 Thr Tyr Leu Tyr Lys Val Leu Thr His Tyr Ile Arg Gly Arg Gly 1070 1075 1080 Gly Thr Val Leu Pro Thr Ala Ser Thr Gly Ile Ala Ala Asn Leu 1085 1090 1095 Leu Leu Gly Gly Arg Thr Phe His Ser Gln Tyr Lys Leu Pro Ile 1100 1105 1110 Pro Leu Asn Glu Thr Ser Ile Ser Arg Leu Asp Ile Lys Ser Glu 1115 1120 1125 Val Ala Lys Thr Ile Lys Lys Ala Gln Leu Leu Ile Ile Asp Glu 1130 1135 1140 Cys Thr Met Ala Ser Ser His Ala Ile Asn Ala Ile Asp Arg Leu 1145 1150 1155 Leu Arg Glu Ile Met Asn Leu Asn Val Ala Phe Gly Gly Lys Val 1160 1165 1170 Leu Leu Leu Gly Gly Asp Phe Arg Gln Cys Leu Ser Ile Val Pro 1175 1180 1185 His Ala Met Arg Ser Ala Ile Val Gln Thr Ser Leu Lys Tyr Cys 1190 1195 1200 Asn Val Trp Gly Cys Phe Arg Lys Leu Ser Leu Lys Thr Asn Met 1205 1210 1215 Arg Ser Glu Asp Ser Ala Tyr Ser Glu Trp Leu Val Lys Leu Gly 1220 1225 1230 Asp Gly Lys Leu Asp Ser Ser Phe His Leu Gly Met Asp Ile Ile 1235 1240 1245 Glu Ile Pro His Glu Met Ile Cys Asn Gly Ser Ile Ile Glu Ala 1250 1255 1260 Thr Phe Gly Asn Ser Ile Ser Ile Asp Asn Ile Lys Asn Ile Ser 1265 1270 1275 Lys Arg Ala Ile Leu Cys Pro Lys Asn Glu His Val Gln Lys Leu 1280 1285 1290 Asn Glu Glu Ile Leu Asp Ile Leu Asp Gly Asp Phe His Thr Tyr 1295 1300 1305 Leu Ser Asp Asp Ser Ile Asp Ser Thr Asp Asp Ala Glu Lys Glu 1310 1315 1320 Asn Phe Pro Ile Glu Phe Leu Asn Ser Ile Thr Pro Ser Gly Met 1325 1330 1335 Pro Cys His Lys Leu Lys Leu Lys Val Gly Ala Ile Ile Met Leu 1340 1345 1350 Leu Arg Asn Leu Asn Ser Lys Trp Gly Leu Cys Asn Gly Thr Arg 1355 1360 1365 Phe Ile Ile Lys Arg Leu Arg Pro Asn Ile Ile Glu Ala Glu Val 1370 1375 1380 Leu Thr Gly Ser Ala Glu Gly Glu Val Val Leu Ile Pro Arg Ile 1385 1390 1395 Asp Leu Ser Pro Ser Asp Thr Gly Leu Pro Phe Lys Leu Ile Arg 1400 1405 1410 Arg Gln Phe Pro Val Met Pro Ala Phe Ala Met Thr Ile Asn Lys 1415 1420 1425 Ser Gln Gly Gln Thr Leu Asp Arg Val Gly Ile Phe Leu Pro Glu 1430 1435 1440 Pro Val Phe Ala His Gly Gln Leu Tyr Val Ala Phe Ser Arg Val 1445 1450 1455 Arg Arg Ala Cys Asp Val Lys Val Lys Val Val Asn Thr Ser Ser 1460 1465 1470 Gln Gly Lys Leu Val Lys His Ser Glu Ser Val Phe Thr Leu Asn 1475 1480 1485 Val Val Tyr Arg Glu Ile Leu Glu 1490 1495 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> helraiser transposon palindromic sequence <400> 23 gtgcacgaat ttcgtgcacc gggccactag 30 <210> 24 <211> 649 <212> PRT <213> Oryzias latipes <400> 24 Met Glu Glu Val Cys Asp Ser Ser Ala Ala Ala Ser Ser Thr Val Gln 1 5 10 15 Asn Gln Pro Gln Asp Gln Glu His Pro Trp Pro Tyr Leu Arg Glu Phe 20 25 30 Phe Ser Leu Ser Gly Val Asn Lys Asp Ser Phe Lys Met Lys Cys Val 35 40 45 Leu Cys Leu Pro Leu Asn Lys Glu Ile Ser Ala Phe Lys Ser Ser Pro 50 55 60 Ser Asn Leu Arg Lys His Ile Glu Arg Met His Pro Asn Tyr Leu Lys 65 70 75 80 Asn Tyr Ser Lys Leu Thr Ala Gln Lys Arg Lys Ile Gly Thr Ser Thr 85 90 95 His Ala Ser Ser Ser Lys Gln Leu Lys Val Asp Ser Val Phe Pro Val 100 105 110 Lys His Val Ser Pro Val Thr Val Asn Lys Ala Ile Leu Arg Tyr Ile 115 120 125 Ile Gln Gly Leu His Pro Phe Ser Thr Val Asp Leu Pro Ser Phe Lys 130 135 140 Glu Leu Ile Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Ser Val Ile Thr Arg Pro 145 150 155 160 Thr Leu Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ala Ala Leu Ile Met Lys Gln Lys 165 170 175 Val Thr Ala Ala Met Ser Glu Val Glu Trp Ile Ala Thr Thr Thr Asp 180 185 190 Cys Trp Thr Ala Arg Arg Lys Ser Phe Ile Gly Val Thr Ala His Trp 195 200 205 Ile Asn Pro Gly Ser Leu Glu Arg His Ser Ala Ala Leu Ala Cys Lys 210 215 220 Arg Leu Met Gly Ser His Thr Phe Glu Val Leu Ala Ser Ala Met Asn 225 230 235 240 Asp Ile His Ser Glu Tyr Glu Ile Arg Asp Lys Val Val Cys Thr Thr 245 250 255 Thr Asp Ser Gly Ser Asn Phe Met Lys Ala Phe Arg Val Phe Gly Val 260 265 270 Glu Asn Asn Asp Ile Glu Thr Glu Ala Arg Arg Cys Glu Ser Asp Asp 275 280 285 Thr Asp Ser Glu Gly Cys Gly Glu Gly Ser Asp Gly Val Glu Phe Gln 290 295 300 Asp Ala Ser Arg Val Leu Asp Gln Asp Asp Gly Phe Glu Phe Gln Leu 305 310 315 320 Pro Lys His Gln Lys Cys Ala Cys His Leu Leu Asn Leu Val Ser Ser 325 330 335 Val Asp Ala Gln Lys Ala Leu Ser Asn Glu His Tyr Lys Lys Leu Tyr 340 345 350 Arg Ser Val Phe Gly Lys Cys Gln Ala Leu Trp Asn Lys Ser Ser Arg 355 360 365 Ser Ala Leu Ala Ala Glu Ala Val Glu Ser Glu Ser Arg Leu Gln Leu 370 375 380 Leu Arg Pro Asn Gln Thr Arg Trp Asn Ser Thr Phe Met Ala Val Asp 385 390 395 400 Arg Ile Leu Gln Ile Cys Lys Glu Ala Gly Glu Gly Ala Leu Arg Asn 405 410 415 Ile Cys Thr Ser Leu Glu Val Pro Met Phe Asn Pro Ala Glu Met Leu 420 425 430 Phe Leu Thr Glu Trp Ala Asn Thr Met Arg Pro Val Ala Lys Val Leu 435 440 445 Asp Ile Leu Gln Ala Glu Thr Asn Thr Gln Leu Gly Trp Leu Leu Pro 450 455 460 Ser Val His Gln Leu Ser Leu Lys Leu Gln Arg Leu His His Ser Leu 465 470 475 480 Arg Tyr Cys Asp Pro Leu Val Asp Ala Leu Gln Gln Gly Ile Gln Thr 485 490 495 Arg Phe Lys His Met Phe Glu Asp Pro Glu Ile Ile Ala Ala Ala Ile 500 505 510 Leu Leu Pro Lys Phe Arg Thr Ser Trp Thr Asn Asp Glu Thr Ile Ile 515 520 525 Lys Arg Gly Met Asp Tyr Ile Arg Val His Leu Glu Pro Leu Asp His 530 535 540 Lys Lys Glu Leu Ala Asn Ser Ser Ser Asp Asp Glu Asp Phe Phe Ala 545 550 555 560 Ser Leu Lys Pro Thr Thr His Glu Ala Ser Lys Glu Leu Asp Gly Tyr 565 570 575 Leu Ala Cys Val Ser Asp Thr Arg Glu Ser Leu Leu Thr Phe Pro Ala 580 585 590 Ile Cys Ser Leu Ser Ile Lys Thr Asn Thr Pro Leu Pro Ala Ser Ala 595 600 605 Ala Cys Glu Arg Leu Phe Ser Thr Ala Gly Leu Leu Phe Ser Pro Lys 610 615 620 Arg Ala Arg Leu Asp Thr Asn Asn Phe Glu Asn Gln Leu Leu Leu Lys 625 630 635 640 Leu Asn Leu Arg Phe Tyr Asn Phe Glu 645 <210> 25 <211> 4682 <212> DNA <213> Oryzias latipes <400> 25 cagaggtgta aagtacttga gtaattttac ttgattactg tacttaagta ttatttttgg 60 ggatttttac tttacttgag tacaattaaa aatcaatact tttactttta cttaattaca 120 tttttttaga aaaaaaagta ctttttactc cttacaattt tatttacagt caaaaagtac 180 ttattttttg gagatcactt cattctattt tcccttgcta ttaccaaacc aattgaattg 240 cgctgatgcc cagtttaatt taaatgttat ttattctgcc tatgaaaatc gttttcacat 300 tatatgaaat tggtcagaca tgttcattgg tcctttggaa gtgacgtcat gtcacatcta 360 ttaccacaat gcacagcacc ttgacctgga aattagggaa attataacag tcaatcagtg 420 gaagaaaatg gaggaagtat gtgattcatc agcagctgcg agcagcacag tccaaaatca 480 gccacaggat caagagcacc cgtggccgta tcttcgcgaa ttcttttctt taagtggtgt 540 aaataaagat tcattcaaga tgaaatgtgt cctctgtctc ccgcttaata aagaaatatc 600 ggccttcaaa agttcgccat caaacctaag gaagcatatt gaggtaagta cattaagtat 660 tttgttttac tgatagtttt tttttttttt tttttttttt tttttgggtg tgcatgtttt 720 gacgttgatg gcgcgccttt tatatgtgta gtaggcctat tttcactaat gcatgcgatt 780 gacaatataa ggctcacgta ataaaatgct aaaatgcatt tgtaattggt aacgttaggt 840 ccacgggaaa tttggcgcct attgcagctt tgaataatca ttatcattcc gtgctctcat 900 tgtgtttgaa ttcatgcaaa acacaagaaa accaagcgag aaattttttt ccaaacatgt 960 tgtattgtca aaacggtaac actttacaat gaggttgatt agttcatgta ttaactaaca 1020 ttaaataacc atgagcaata catttgttac tgtatctgtt aatctttgtt aacgttagtt 1080 aatagaaata cagatgttca ttgtttgttc atgttagttc acagtgcatt aactaatgtt 1140 aacaagatat aaagtattag taaatgttga aattaacatg tatacgtgca gttcattatt 1200 agttcatgtt aactaatgta gttaactaac gaaccttatt gtaaaagtgt taccatcaaa 1260 actaatgtaa tgaaatcaat tcaccctgtc atgtcagcct tacagtcctg tgtttttgtc 1320 aatataatca gaaataaaat taatgtttga ttgtcactaa atgctactgt atttctaaaa 1380 tcaacaagta tttaacatta taaagtgtgc aattggctgc aaatgtcagt tttattaaag 1440 ggttagttca cccaaaaatg aaaataatgt cattaatgac tcgccctcat gtcgttccaa 1500 gcccgtaaga cctccgttca tcttcagaac acagtttaag atattttaga tttagtccga 1560 gagctttctg tgcctccatt gagaatgtat gtacggtata ctgtccatgt ccagaaaggt 1620 aataaaaaca tcaaagtagt ccatgtgaca tcagtgggtt agttagaatt ttttgaagca 1680 tcgaatacat tttggtccaa aaataacaaa acctacgact ttattcggca ttgtattctc 1740 ttccgggtct gttgtcaatc cgcgttcacg acttcgcagt gacgctacaa tgctgaataa 1800 agtcgtaggt tttgttattt ttggaccaaa atgtattttc gatgcttcaa ataattctac 1860 ctaacccact gatgtcacat ggactacttt gatgttttta ttacctttct ggacatggac 1920 agtataccgt acatacattt tcagtggagg gacagaaagc tctcggacta aatctaaaat 1980 atcttaaact gtgttccgaa gatgaacgga ggtgttacgg gcttggaacg acatgagggt 2040 gagtcattaa tgacatcttt tcatttttgg gtgaactaac cctttaatgc tgtaatcaga 2100 gagtgtatgt gtaattgtta catttattgc atacaatata aatatttatt tgttgttttt 2160 acagagaatg cacccaaatt acctcaaaaa ctactctaaa ttgacagcac agaagagaaa 2220 gatcgggacc tccacccatg cttccagcag taagcaactg aaagttgact cagttttccc 2280 agtcaaacat gtgtctccag tcactgtgaa caaagctata ttaaggtaca tcattcaagg 2340 acttcatcct ttcagcactg ttgatctgcc atcatttaaa gagctgatta gtacactgca 2400 gcctggcatt tctgtcatta caaggcctac tttacgctcc aagatagctg aagctgctct 2460 gatcatgaaa cagaaagtga ctgctgccat gagtgaagtt gaatggattg caaccacaac 2520 ggattgttgg actgcacgta gaaagtcatt cattggtgta actgctcact ggatcaaccc 2580 tggaagtctt gaaagacatt ccgctgcact tgcctgcaaa agattaatgg gctctcatac 2640 ttttgaggta ctggccagtg ccatgaatga tatccactca gagtatgaaa tacgtgacaa 2700 ggttgtttgc acaaccacag acagtggttc caactttatg aaggctttca gagtttttgg 2760 tgtggaaaac aatgatatcg agactgaggc aagaaggtgt gaaagtgatg acactgattc 2820 tgaaggctgt ggtgagggaa gtgatggtgt ggaattccaa gatgcctcac gagtcctgga 2880 ccaagacgat ggcttcgaat tccagctacc aaaacatcaa aagtgtgcct gtcacttact 2940 taacctagtc tcaagcgttg atgcccaaaa agctctctca aatgaacact acaagaaact 3000 ctacagatct gtctttggca aatgccaagc tttatggaat aaaagcagcc gatcggctct 3060 agcagctgaa gctgttgaat cagaaagccg gcttcagctt ttaaggccaa accaaacgcg 3120 gtggaattca acttttatgg ctgttgacag aattcttcaa atttgcaaag aagcaggaga 3180 aggcgcactt cggaatatat gcacctctct tgaggttcca atgtaagtgt ttttcccctc 3240 tatcgatgta aacaaatgtg ggttgttttt gtttaatact ctttgattat gctgatttct 3300 cctgtaggtt taatccagca gaaatgctgt tcttgacaga gtgggccaac acaatgcgtc 3360 cagttgcaaa agtactcgac atcttgcaag cggaaacgaa tacacagctg gggtggctgc 3420 tgcctagtgt ccatcagtta agcttgaaac ttcagcgact ccaccattct ctcaggtact 3480 gtgacccact tgtggatgcc ctacaacaag gaatccaaac acgattcaag catatgtttg 3540 aagatcctga gatcatagca gctgccatcc ttctccctaa atttcggacc tcttggacaa 3600 atgatgaaac catcataaaa cgaggtaaat gaatgcaagc aacatacact tgacgaattc 3660 taatctgggc aacctttgag ccataccaaa attattcttt tatttattta tttttgcact 3720 ttttaggaat gttatatccc atctttggct gtgatctcaa tatgaatatt gatgtaaagt 3780 attcttgcag caggttgtag ttatccctca gtgtttcttg aaaccaaact catatgtatc 3840 atatgtggtt tggaaatgca gttagatttt atgctaaaat aagggatttg catgatttta 3900 gatgtagatg actgcacgta aatgtagtta atgacaaaat ccataaaatt tgttcccagt 3960 cagaagcccc tcaaccaaac ttttctttgt gtctgctcac tgtgcttgta ggcatggact 4020 acatcagagt gcatctggag cctttggacc acaagaagga attggccaac agttcatctg 4080 atgatgaaga ttttttcgct tctttgaaac cgacaacaca tgaagccagc aaagagttgg 4140 atggatatct ggcctgtgtt tcagacacca gggagtctct gctcacgttt cctgctattt 4200 gcagcctctc tatcaagact aatacacctc ttcccgcatc ggctgcctgt gagaggcttt 4260 tcagcactgc aggattgctt ttcagcccca aaagagctag gcttgacact aacaattttg 4320 agaatcagct tctactgaag ttaaatctga ggttttacaa ctttgagtag cgtgtactgg 4380 cattagattg tctgtcttat agtttgataa ttaaatacaa acagttctaa agcaggataa 4440 aaccttgtat gcatttcatt taatgttttt tgagattaaa agcttaaaca agaatctcta 4500 gttttctttc ttgcttttac ttttacttcc ttaatactca agtacaattt taatggagta 4560 cttttttact tttactcaag taagattcta gccagatact tttactttta attgagtaaa 4620 attttcccta agtacttgta ctttcacttg agtaaaattt ttgagtactt tttacacctc 4680 tg 4682

Claims (171)

  1. (a) 리간드 결합 영역,
    (b) 링커, 및
    (c) 절두된 카스파제 9 폴리펩티드
    를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드로서, 비인간 서열을 포함하지 않는 유도성 카스파제 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 비인간 서열은 제한 부위인 폴리펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함하는 것인 폴리펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함하는 것인 폴리펩티드.
  5. 제4항에 있어서, 변형은 위치 36에서 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환 (F36V)인 폴리펩티드.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, FKBP12 폴리펩티드는
    Figure pct00041
    를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, FKBP12 폴리펩티드는
    Figure pct00042
    를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 링커 영역은 GGGGS (서열 번호 5)를 포함하는 아미노산에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 링커 영역은 GGAGGAGGAGGATCC (서열 번호 6)를 포함하는 핵산에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 87에 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 282에 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는
    Figure pct00043
    를 포함하는 아미노산에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  13. 제12항에 있어서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는
    Figure pct00044
    를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는
    Figure pct00045
    를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  15. 제14항에 있어서, 폴리펩티드는
    Figure pct00046

    를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인 폴리펩티드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 트랜스포존.
  18. 제17항에 있어서, 치료 단백질을 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 트랜스포존.
  19. 제18항에 있어서, 치료 단백질은 자연 발생적인 것인 트랜스포존.
  20. 제18항에 있어서, 치료 단백질은 비자연 발생적인 것인 트랜스포존.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 단백질은 세포 표면 단백질, 막 결합 단백질, 세포외 막 결합 단백질, 세포내 막 결합 단백질, 세포내 단백질, 핵 편재 단백질, 핵 단백질, 세포질 단백질, 시토졸 단백질, 분비 단백질, 리소좀 단백질, 엔도솜 단백질, 소포 관련 단백질, 미토콘드리아 단백질, 소포체 단백질, 세포 골격 단백질, 세포내 신호 전달에 관여하는 단백질 및/또는 세포외 신호 전달에 관여하는 단백질을 포함하는 것인 트랜스포존.
  22. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 단백질은 항원 수용체를 포함하는 것인 트랜스포존.
  23. 제22항에 있어서, 항원 수용체는 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 것인 트랜스포존.
  24. 제23항에 있어서, 항원 수용체는 변이체 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 포함하는 것인 트랜스포존.
  25. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 트랜스포존.
  26. 제26항에 있어서, CAR은 하나 이상의 센티린(Centyrin) 서열(들)을 포함하는 것인 트랜스포존.
  27. 제26항에 있어서, CAR은 카르티린(CARTyrin)인 트랜스포존.
  28. 제25항에 있어서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함하는 것인 트랜스포존.
  29. 제28항에 있어서, CAR은 VCAR인 트랜스포존.
  30. 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함하는 트랜스포존.
  31. 제30항에 있어서, 트랜스포존은 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함하며 자가 절단 펩티드는 유도성 카스파제 폴리펩티드와 트랜스포존 내 다른 서열 사이에 위치하는 것인 트랜스포존.
  32. 제30항에 있어서, 트랜스포존은 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함하며 제1 자가 절단 펩티드는 유도성 카스파제 폴리펩티드의 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 유도성 카스파제 폴리펩티드의 하류에 위치하는 것인 트랜스포존.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자가 절단 펩티드는 T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함하는 것인 트랜스포존.
  34. 제33항에 있어서, T2A 펩티드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 11)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  35. 제33항에 있어서, GSG-T2A 펩티드는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 12)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  36. 제33항에 있어서, E2A 펩티드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP (서열 번호 13)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  37. 제33항에 있어서, GSG-E2A 펩티드는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (서열 번호 14)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  38. 제33항에 있어서, F2A 펩티드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (서열 번호 15)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  39. 제33항에 있어서, GSG-F2A 펩티드는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (서열 번호 16)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  40. 제33항에 있어서, P2A 펩티드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열 번호 17)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  41. 제44항에 있어서, GSG-P2A 펩티드는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 트랜스포존.
  42. 제17항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포존은 피기백(piggyBac) 트랜스포존인 트랜스포존.
  43. 제17항 내지 제42항 중 어느 한 항의 트랜스포존을 포함하는 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이고 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함하는 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열인 조성물.
  46. 제44항 또는 제45항에 있어서, 트랜스포사제는 피기백 트랜스포사제인 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 피기백 트랜스포사제는 서열 번호 1을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 피기백 트랜스포사제는 과활성 변이체이고, 과활성 변이체는 서열 번호 1의 위치 30, 165, 282 및 538 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함하는 것인 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 30에서의 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환(I30V)인 조성물.
  50. 제48항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 165에서의 아미노산 치환은 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환(G165S)인 조성물.
  51. 제48항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 282에서의 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환(M282V)인 조성물.
  52. 제48항에 있어서, 서열 번호 1의 위치 538에서의 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환(N538K)인 조성물.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포사제는 슈퍼 피기백(SPB) 트랜스포사제인 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 슈퍼 피기백(sPBo) 트랜스포사제는 서열 번호 2를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  55. 제43항에 있어서, 트랜스포존은 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 트랜스포존이고 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함하는 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 슬리핑 뷰티 트랜스포사제 또는 과활성 슬리핑 뷰티 트랜스포사제(SB100X)를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 조성물.
  57. 제43항에 있어서, 트랜스포존은 헬레이저(Helraiser) 트랜스포존이고 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함하는 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 헬리트론(Helitron) 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 조성물.
  59. 제43항에 있어서, 트랜스포존은 Tol2 트랜스포존이고 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함하는 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 Tol2 트랜스포사제를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 조성물.
  61. 제56항, 제58항 또는 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열인 조성물.
  62. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 벡터.
  63. 제62항에 있어서, 벡터는 바이러스 벡터인 벡터.
  64. 제63항에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스(AAV) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 단리 또는 유도된 서열을 포함하는 벡터.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함하는 벡터.
  66. 제65항에 있어서, 레트로바이러스는 감마레트로바이러스인 벡터.
  67. 제65항에 있어서, 레트로바이러스는 렌티바이러스인 벡터.
  68. 제63항 또는 제64항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 단리 또는 유도된 서열을 포함하는 벡터.
  69. 제68항에 있어서, AAV는 혈청형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11의 AAV를 포함하는 것인 벡터.
  70. 제68항에 있어서, AAV는 rAAV-LK03, rAAV-NP59 또는 rAAV-NP84로부터 단리 또는 유도된 서열을 포함하는 것인 벡터.
  71. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스 벡터는 재조합 벡터인 벡터.
  72. 제62항에 있어서, 벡터는 나노입자 벡터인 벡터.
  73. 제72항에 있어서, 나노입자 벡터는 핵산, 아미노산, 중합체, 미셀, 지질, 유기 분자, 무기 분자 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 벡터.
  74. 제62항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함하는 벡터.
  75. 제62항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함하고 자가 절단 펩티드는 유도성 카스파제 폴리펩티드와 벡터 내의 다른 서열 사이에 위치하는 것인 벡터.
  76. 제62항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함하고 제1 자가 절단 펩티드는 유도성 카스파제 폴리펩티드의 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 유도성 카스파제 폴리펩티드의 하류에 위치하는 것인 벡터.
  77. 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 자가 절단 펩티드는 T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함하는 것인 벡터.
  78. 제77항에 있어서, T2A 펩티드는 EGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 11)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  79. 제77항에 있어서, GSG-T2A 펩티드는 GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP (서열 번호 12)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  80. 제77항에 있어서, E2A 펩티드는 QCTNYALLKLAGDVESNPGP (서열 번호 13)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  81. 제77항에 있어서, GSG-E2A 펩티드는 GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP (서열 번호 14)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  82. 제77항에 있어서, F2A 펩티드는 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (서열 번호 15)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  83. 제77항에 있어서, GSG-F2A 펩티드는 GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP (서열 번호 16)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  84. 제77항에 있어서, P2A 펩티드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열 번호 17)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  85. 제77항에 있어서, GSG-P2A 펩티드는 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP (서열 번호 18)를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 것인 벡터.
  86. 제62항 내지 제85항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 조성물.
  87. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 세포.
  88. 제17항 내지 제42항 중 어느 한 항의 트랜스포존을 포함하는 세포.
  89. 제16항 또는 제43항 내지 제61항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포.
  90. 제62항 내지 제85항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포.
  91. 제87항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 유도제와의 접촉 후에 유도성 카스파제 단백질을 발현하는 세포.
  92. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인간 세포인 세포.
  93. 제87항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 면역 세포인 세포.
  94. 제93항에 있어서, 면역 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해(NK) 유사 세포, 조혈 기원 세포(progenitor cell), 말초 혈액(PB) 유래 T 세포 또는 제대혈(UCB) 유래 T 세포인 세포.
  95. 제94항에 있어서, 면역 세포는 T 세포인 세포.
  96. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 인공 항원 제시 세포인 세포.
  97. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 줄기세포인 세포.
  98. 제97항에 있어서, 줄기세포는 배아 줄기세포인 세포.
  99. 제97항에 있어서, 줄기세포는 성체 줄기세포인 세포.
  100. 제97항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 줄기세포는 전능성, 만능성 또는 다능성인 세포.
  101. 제97항 또는 제99항에 있어서, 줄기세포는 유도된 만능성 줄기세포(iPSC)인 세포.
  102. 제87항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 체세포인 세포.
  103. 제102항에 있어서, 세포는 인간 심장; 골격근 또는 평활근; 혈관, 정맥 또는 모세 혈관; 비장; 갑상선; 림프절 또는 림프관; 뼈 또는 골수; 피부 또는 내피; 부신; 식도; 후두; 뇌 또는 척수; 말초 신경계; 눈; 시상 하부; 간; 후각 조직; 전립선; 위; 대장 또는 소장; 폐 또는 기관지; 신장; 췌장; 흉선; 요관 또는 요도; 방광; 청각 조직; 방광; 부갑상선; 침샘; 또는 기관으로부터 단리 또는 유도된 세포.
  104. 제87항 내지 제103항 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 조성물.
  105. 양자 세포 요법을 위한 제104항의 조성물의 용도.
  106. 제105항에 있어서, 세포는 자가 유래인 것인 용도.
  107. 제105항에 있어서, 세포는 동종 이계인 것인 용도.
  108. 생체 외 유전자 요법을 위한 제104항의 조성물의 용도.
  109. 제108항에 있어서, 세포는 자가 유래인 것인 용도.
  110. 제108항에 있어서, 세포는 동종 이계인 것인 용도.
  111. 세포 요법을 이를 필요로 하는 대상체에서 변형시키는 방법으로서,
    치료제 및 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있는 것인 단계를 포함하는 방법.
  112. 세포 요법을 이를 필요로 하는 대상체에서 변형시키는 방법으로서,
    치료제 및 제16항, 제43항 내지 제61항 또는 제86항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있는 것인 단계를 포함하는 방법.
  113. 세포 요법을 이를 필요로 하는 대상체에서 변형시키는 방법으로서,
    치료제, 제17항 내지 제42항 중 어느 한 항의 트랜스포존 및 제43항 내지 제61항 중 어느 한 항의 트랜스포사제를 포함하는 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있는 것인 단계를 포함하는 방법.
  114. 세포 요법을 이를 필요로 하는 대상체에서 변형시키는 방법으로서,
    치료제 및 제62항 내지 제85항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있는 것인 단계를 포함하는 방법.
  115. 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 자가 유래인 것인 방법.
  116. 제111항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 동종 이계인 것인 방법.
  117. 제111항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 요법은 양자 세포 요법인 방법.
  118. 제111항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 치료제는 생체 외 유전자 요법에 의해 도입된 것인 방법.
  119. 제118항에 있어서, 치료제는 변형된 내인성 유전자, 외인성 유전자 또는 이의 일부를 코딩하는 서열인 방법.
  120. 제111항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 세포 치료의 종료인 방법.
  121. 제111항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 변형은 세포 요법에서 제공된 세포의 일부분의 제거인 방법.
  122. 제111항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 유도제의 억제제를 투여하여 세포 요법의 변형을 억제함으로써 세포 요법의 기능 및/또는 효능을 회복시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  123. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법으로서,
    카이네틱 제제(kinetic agent) 및 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항의 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계로서, 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있으며, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 대상체의 표적 조직 내에서 국소 조직 독성을 유도하는 것인 단계, 및
    대상체의 비표적 조직에서 유의한 독성을 유도하기 전에 카이네틱 제제를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도함으로써,
    대상체에서 표적 조직을 제거하고, 비표적 조직을 보존하고, 질환 또는 장애를 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  124. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법으로서,
    카이네틱 제제 및 제16항, 제43항 내지 제61항 또는 제86항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계로서, 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있으며, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 대상체의 표적 조직 내에서 국소 조직 독성을 유도하는 것인 단계, 및
    대상체의 비표적 조직에서 유의한 독성을 유도하기 전에 카이네틱 제제를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도함으로써,
    대상체에서 표적 조직을 제거하고, 비표적 조직을 보존하고, 질환 또는 장애를 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  125. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법으로서,
    카이네틱 제제, 제17항 내지 제42항 중 어느 한 항의 트랜스포존, 및 제43항 내지 제61항 중 어느 한 항의 트랜스포사제를 포함하는 조성물을 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계로서, 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있으며, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 대상체의 표적 조직 내에서 국소 조직 독성을 유도하는 것인 단계, 및
    대상체의 비표적 조직에서 유의한 독성을 유도하기 전에 카이네틱 제제를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도함으로써,
    대상체에서 표적 조직을 제거하고, 비표적 조직을 보존하고, 질환 또는 장애를 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  126. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이의 치료 방법으로서,
    카이네틱 제제 및 제62항 내지 제85항 중 어느 한 항의 벡터를 포함하는 세포를 포함하는 조성물을 대상체에 투여하는 단계로서, 상기 세포를 유도제와 접촉시켜 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도할 수 있으며, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 대상체의 표적 조직 내에서 국소 조직 독성을 유도하는 것인 단계, 및
    대상체의 비표적 조직에서 유의한 독성을 유도하기 전에 카이네틱 제제를 포함하는 세포에서 아폽토시스를 선택적으로 유도함으로써,
    대상체에서 표적 조직을 제거하고, 비표적 조직을 보존하고, 질환 또는 장애를 치료하는 단계
    를 포함하는 방법.
  127. 제123항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 증식성 장애 또는 암인 방법.
  128. 제127항에 있어서, 표적 조직은 종양을 포함하는 것인 방법.
  129. 제128항에 있어서, 종양은 양성인 방법.
  130. 제128항에 있어서, 종양은 악성인 방법.
  131. 제127항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 조직은 절제된 종양의 노출된 조직 또는 경계를 포함하는 것인 방법.
  132. 제127항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 조직은 전이될 가능성이 있는 부위를 포함하는 것인 방법.
  133. 제132항에 있어서, 전이 부위는 림프절, 림프액, 말초 순환 혈액, 국소 순환 혈액, 뼈, 골수 및 뇌 척수액(CSF) 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  134. 제123항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 염증성 질환 또는 장애인 방법.
  135. 제134항에 있어서, 표적 조직은 염증 부위를 포함하는 것인 방법.
  136. 제123항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 면역 또는 자가 면역 질환 또는 장애인 방법.
  137. 제136항에 있어서, 표적 조직은 노출된 또는 감염된 조직의 부위를 포함하는 것인 방법.
  138. 제136항에 있어서, 표적 조직은 화상 또는 상처 조직을 포함하는 것인 방법.
  139. 제123항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 감염성 질환 또는 장애인 방법.
  140. 제139항에 있어서, 표적 조직은 감염된 조직을 포함하는 것인 방법.
  141. 제123항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 유전적 또는 후성적 질환 또는 장애인 방법.
  142. 제141항에 있어서, 표적 조직은 야생형 세포와 비교할 때 유전적 또는 후성적 변형을 포함하는 하나 이상의 세포를 포함하는 것인 방법.
  143. 제123항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 대사 장애인 방법.
  144. 제141항에 있어서, 표적 조직은 대사 장애를 갖는 하나 이상의 세포를 포함하는 것인 방법.
  145. 제123항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 혈관 장애인 방법.
  146. 제145항에 있어서, 표적 조직은 정맥, 혈관, 모세 혈관 또는 순환 혈액 성분의 하나 이상의 세포를 포함하는 방법.
  147. 제123항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 호흡계 장애인 방법.
  148. 제147항에 있어서, 표적 조직은 비도, 식도 또는 폐의 하나 이상의 세포를 포함하는 것인 방법.
  149. 제123항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애는 섬유증 장애인 방법.
  150. 제149항에 있어서, 표적 조직은 섬유양 종괴 또는 섬유양 종괴에 근접한 세포를 포함하는 것인 방법.
  151. 제123항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 양자 세포 요법은 카이네틱 제제를 포함하는 세포를 포함하는 것인 방법.
  152. 제123항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 자가 유래인 것인 방법.
  153. 제123항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 동종 이계인 것인 방법.
  154. 제123항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 카이네틱 제제를 포함하는 세포는 T 세포인 방법.
  155. 제123항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 카이네틱 제제는 비자연 발생 수용체인 방법.
  156. 제155항에 있어서, 비자연 발생 수용체는 합성, 변형, 재조합 또는 키메라 수용체인 방법.
  157. 제156항에 있어서, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 방법.
  158. 제151항 내지 제154항 중 어느 한 항에 있어서, 카이네틱 제제는 항암제를 포함하는 것인 방법.
  159. 제158항에 있어서, 항암제는 항-CD19 제제를 포함하는 것인 방법.
  160. 제158항에 있어서, 항암제는 항-BCMA 제제를 포함하는 것인 방법.
  161. 제158항에 있어서, 항암제는 항-PSMA 제제를 포함하는 것인 방법.
  162. 제158항에 있어서, 항암제는 항-Muc1 제제를 포함하는 것인 방법.
  163. 제158항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 카이네틱 제제는 비자연 발생 수용체를 포함하는 것인 방법.
  164. 제163항에 있어서, 비자연 발생 수용체는 합성, 변형, 재조합 또는 키메라 수용체를 포함하는 것인 방법.
  165. 제164항에 있어서, 키메라 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인 방법.
  166. 제165항에 있어서, CAR은 하나 이상의 VHH 서열(들)을 포함하는 것인 방법.
  167. 제166항에 있어서, CAR은 VCAR인 것인 방법.
  168. 제158항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 카이네틱 제제는 무형성증을 유도하는 것인 방법.
  169. 제168항에 있어서, 무형성증은 치명적이지 않은 것인 방법.
  170. 제158항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 유도제는 카이네틱 제제를 포함하는 세포를 제거하는 것인 방법.
  171. 제158항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 유도제는 무형성증의 징후 또는 증상을 제거하거나 감소시키는 것인 방법.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102447083B1 (ko) 2016-10-06 2022-09-26 포세이다 테라퓨틱스, 인크. 유도성 카스파제 및 사용 방법
JP2022513507A (ja) 2018-12-20 2022-02-08 ポセイダ セラピューティクス，インコーポレイティド ナノトランスポゾン組成物および使用方法
CA3149892A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Eric M. Ostertag Allogeneic cell compositions and methods of use
US20230079955A1 (en) 2019-12-20 2023-03-16 Poseida Therapeutics, Inc. Anti-muc1 compositions and methods of use
EP4118107A1 (en) 2020-03-11 2023-01-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric stimulatory receptors and methods of use in t cell activation and differentiation
EP4298205A1 (en) 2021-02-23 2024-01-03 Poseida Therapeutics, Inc. Genetically modified induced pluripotent stem cells and methods of use thereof
AU2022360244A1 (en) 2021-10-04 2024-04-11 Poseida Therapeutics, Inc. Transposon compositions and methods of use thereof
CN113999873B (zh) * 2021-12-31 2022-05-20 北京市疾病预防控制中心 一种基因修饰的非人动物的构建方法及其应用
CN114736306B (zh) * 2022-03-01 2024-04-19 中国科学院深圳先进技术研究院 一种受化学调控的蛋白酶工具及其配套底物
WO2023173137A1 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 Yale University Compositions and methods for efficient and stable genetic modification of eukaryotic cells

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015134877A1 (en) * 2014-03-07 2015-09-11 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Caspase polypeptides having modified activity and uses thereof
WO2016135470A1 (en) * 2015-02-24 2016-09-01 Ucl Business Plc Chimeric protein

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6835394B1 (en) 1999-12-14 2004-12-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Polymersomes and related encapsulating membranes
EA009956B1 (ru) * 2001-09-04 2008-04-28 Йеда Рисерч Энд Дивелопмент Ко. Лтд. Внутриклеточный полипептид (cari) и способы его применения
WO2006133398A2 (en) 2005-06-08 2006-12-14 Invitrogen Corporation In vitro activated donor t-cells to promote transplant engraftment
US8808748B2 (en) 2010-04-20 2014-08-19 Vindico NanoBio Technology Inc. Biodegradable nanoparticles as novel hemoglobin-based oxygen carriers and methods of using the same
US9089520B2 (en) 2010-05-21 2015-07-28 Baylor College Of Medicine Methods for inducing selective apoptosis
PT2661275T (pt) 2011-01-07 2019-04-24 Poseida Therapeutics Inc Composições e métodos para a entrega a tumores de agentes ligantes de elevada afinidade para o oxigénio
AU2014274916B2 (en) 2013-06-05 2019-10-31 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for inducing partial apoptosis using caspase polypeptides
JP6764864B2 (ja) 2014-08-08 2020-10-07 ポセイダ セラピューティクス， インコーポレイテッド 腫瘍のナノ粒子媒介微小血管塞栓形成を誘導するための組成物および方法
US20170360706A1 (en) 2014-12-05 2017-12-21 Vindico Nanobiotechnology, Llc Compositions and methods for inducing nanoparticle-mediated microvascular embolization of tumors
US20170000743A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Vindico NanoBio Technology Inc. Compositions and Methods for Delivery of Gene Editing Tools Using Polymeric Vesicles
US10456452B2 (en) 2015-07-02 2019-10-29 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for improved encapsulation of functional proteins in polymeric vesicles
ES2865481T3 (es) 2016-04-29 2021-10-15 Poseida Therapeutics Inc Micelas basadas en poli(histidina) para la complejación y el aporte de proteínas y ácidos nucleicos
KR102447083B1 (ko) 2016-10-06 2022-09-26 포세이다 테라퓨틱스, 인크. 유도성 카스파제 및 사용 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015134877A1 (en) * 2014-03-07 2015-09-11 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Caspase polypeptides having modified activity and uses thereof
WO2016135470A1 (en) * 2015-02-24 2016-09-01 Ucl Business Plc Chimeric protein

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Immunotherapy, 2013, Vol.36, No.1, pp.1-10 1부.* *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3523325A1 (en) 2019-08-14
AU2017339511B2 (en) 2021-12-02
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