KR20190012589A - 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생체 적합한 천연재료인 젤란검 하이드로겔을 베이스로 하고 여기에 콘드로이틴 설페이트가 배합된 주입식 하이드로겔 조성물을 이용하여 연골 손상 치료용 조성물로 사용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 연골 손상 치료용 조성물을 체내에 주입하면 관절 조직 보호와, 항산화 효과 및 세균감염 억제를 시켜주는 콘드로이틴 설페이트의 효과와 더불어 젤란검 특유의 높은 탄성과 내구성으로 인하여 연골치료용 주사제로써 적합하다. 또한, 세포 독성이 없고, 염증 반응이나 독성 물질에 의해 녹지 않는 장점이 있다. 또한, 연골 재생 효과를 증진시키기 위해, 자가 무릎 연골을 채취하여, 기존 자가 연골세포 이식술에서 생기는 단점을 최소화할 수 있다.

Description

콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물 {Gellan-gum Hydrogels Composition containing Chondroitin Sulfate}

본 발명은 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 연골치료를 목적으로 한 생체 내에서 연골세포의 증식을 돕는 콘드로이틴 설페이트가 배합된 젤란검 하이드로겔 조성물과 이를 이용한 연골 손상 치료용 조성물에 관한 것이다.

연골은 한번 손상되거나 퇴화되면 재생하기 어려워 조기에 재생시켜주지 않으면 손상된 연골이 기계적 압력에 의해 쉽게 부서지고 마모되며, 염증을 발생시켜 결손부위가 점차적으로 증가하게 된다. 따라서 손상 연골은 조기에 재생시켜주는 치료 방법 개발이 매우 중요하게 대두되고 있다.

현재 연골이 손상되었을 경우 치료 방법에는 손상된 정도에 따라 여러 가지 방법이 있다. 대표적인 치료 방법으로는 자가 연골 세포이식술, 골수의 줄기세포를 이용한 골수 자극술, 성체줄기세포와 배아줄기세포를 이용한 연골재생 치료법, 손상된 부위에 미세 구멍을 뚫어 골수세포를 흘러나오게 하여 손상된 부위를 치료하게 하는 미세 골절술 등이 이용되고 있다. [Z. Lin, C. Willers, J. Xu, and M. H Zheng, Tissue Eng., 12, 1971 (2006)]

그러나 상기에 언급한 연골 손상 치료법들은 까다로운 수술방법이나, 치료과정 중 발생되는 여러 문제점이 생긴다는 단점이 있다. 따라서 이러한 여러 단점들을 개선하면서 효과적인 치료를 할 수 있는 조직공학적 방법들이 제기되고 있다.

조직공학에서 사용되는 생체재료로써 연골재생 재료로는 콜라겐, 히알루론산, 젤라틴, 젤란검 등이 있다. 그 중 젤란검(gellan gum, GG)은, 글루콘산, 람노오스, 그리고 포도당(1:1:2)이 규칙적으로 배열된 복합다당류로, 무취, 무색, 내열성, 그리고 내효소성 등이 우수하다. 또한, 이온 첨가 및 pH조절 등을 통해 하이드로겔의 기계적 물성을 조절할 수 있으며, 세포 독성 또한 없어 생체 재료로 다양하게 연구되고 있다.(J. T. Oliveira, L. Martins, R. Picciochi, I. B. Malafaya, R. A. Sousa, N. M. Neves, J. F. Mano and R. L. Reis, Journal of Biomedical Materials Research Part A, 93A, 852 (2010)).

또한, 콘드로이틴설페이트(Chondroitin sulfate, CS)는 D-glucuronic acid, N-acetyl-D-galactosamine과 황산으로 결합된 점질성 다당류(뮤코다당, mucopolysaccharide)이다. CS는 동물 결합조직의 기질, 장기, 체액 등에 분포하며, 항산화 효과, 혈액응고작용, 동맹경화 억제 및 예방, 관절조직 보호, 그리고 세균감염 억제작용 등 다양한 효과가 있다고 알려져 있다.

한국등록특허 제10-1220158호에서는 대상세포의 분자영상화를 위한 효과적인 시스템에 관한 것으로, 양쪽 말단에 서로 다른 작용기를 가지는 생체적합성 매개 고분자 물질을 이용하여 대상세포와 조영제를 화학적으로 연결시키는 방법을 이용한 분자영상화 방법 및 이러한 화학적 결합 구조의 분자영상용 복합체에 관한 기술에서 수십 가지의 고분자 화합물 중에 콘드로이친과 젤란검 등 다양한 고분자 성분의 사용 가능성을 언급하고 있는 정도이다.

그렇지만, 상기에 언급된 생체재료들을 이용하여 연골재생 치료를 위한 주사 가능한 하이드로겔의 연구는 필요성이 분명한데도 불구하고 아직 이들 사용에 대한 효과적인 접근이 이루어지지 못하고 있으며 연구가 전무한 실정이다.

한국등록특허 제10-1220158호

1. J. T. Oliveira, L. Martins, R. Picciochi, I. B. Malafaya, R. A. Sousa, N. M. Neves, J. F. Mano and R. L. Reis, Journal of Biomedical Materials Research Part A, 93A, 852 (2010)

상기와 같은 연골치료 분야에서의 문제점을 개선하고자, 본 발명자들은 별다른 수술부위의 절개없이 손상부위의 국소적인 주사만으로 연골재생이 가능한 세포치료용 하이드로겔의 개발을 해결과제로 한다.

본 발명에서는 과제해결을 위해 오랫동안 연구 검토한 결과, 콘드로이틴설페이트가 배합된 젤란검 하이드로겔이 연골세포 증식에 도움이 되는지 확인하였고, 주사 가능한 물성 또한 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 관절염뿐만 아니라 손상된 연골부위의 치료를 위한 항산화, 관절조직 보호, 연골재생효과가 있는 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 손상 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

위와 같은 본 발명의 과제해결을 위하여, 본 발명은 골염증을 완화 시켜주며 연골 세포 증식에 도움이 되는 성분으로 콘드로이틴 설페이트가 젤란검에 배합되어 하이드로겔 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 손상 치료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 연공 손상 치료용 조성물은 주사에 적당한 기계적 강도를 가짐으로서 주입 가능한 주사용 관절염 치료제로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물의 장점 및 효과를 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명의 하이드로겔 조성물은 관절 조직 보호와, 항산화 효과 및 세균감염 억제를 시켜주는 콘드로이틴 설페이트의 효과와 더불어, 젤란검 특유의 생체에 적합한 천연고분자 재료를 이용함으로써 높은 탄성과 내구성으로 인하여 연골치료용 주사제로써 적합하다. 따라서 안전하고 우수한 효과를 발현하는 연골 재생 및 골관절염 치료제로 사용할 수 있다.

(ii) 본 발명에서는 콘드로이틴 설페이트(Chondroitin sulfate)가 배합된 연골 손상 치료용 젤란검(Gellan-gum) 하이드로겔 조성물의 간단한 제조 방법으로 제조하여 주입용으로 간편하게 사용 가능하도록 하는 조성물을 제공한다. 또한, 세포 독성이 없고, 염증 반응이나 독성 물질에 의해 녹지 않는 장점이 있다.

(iii) 본 발명에 따르면 조직공학적 주입형 하이드로겔을 제작함으로써, 수술에 따른 부작용, 수술 부위의 최소화 및 수술 시간 단축 효과를 가진다.

도 1은 본 발명에 따라 제조되는 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물에 대한 콘드로이틴설페이트(CS)를 젤란검 하이드로겔에 첨가한 함량을 달리하여 굳힌 함량별(0 wt.%, 10 wt.%, 20 wt.%, 30 wt.%) 제품의 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 하이드로겔 조성물에서 CS/젤란검 하이드로겔의 함량별 압축강도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 비율별 CS/젤란검 하이드로겔 조성물에 연골세포를 파종 후 날짜별(1-21 day)로 연골세포의 증식량을 MTT assay를 통해 확인하여 그래프화시킨 도면이다.
도 4는 젤란검과 CS/젤란검 하이드로겔 조성물을 동결건조 시킨 후 지지체 표면의 거침도와 다공을 확인하기 위해 촬영한 SEM 사진이다.
도 5는 비율별 CS/젤란검 하이드로겔 조성물에 연골세포를 파종 후 날짜별(1-21 day)로 연골세포들의 유전자 발현을 GAPDH로 일반화하여 정량화시킨 그래프로서, 도 5a는 aggrecan, 도 5b는 ColⅠ, 도 5c는 Col Ⅱ 의 표현형에 대한 결과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 하나의 구현예로서 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 아직 연구가 미약한 관절염, 연골 재생을 위하여, 생체적합성이 뛰어난 젤란검과 연골 손상 회복에 좋은 콘드로이틴 설페이트와의 배합을 통해 하이드로겔 조성물을 제조하여 연골 손상 치료용 조성물로 사용하는 것에 관한 발명을 제공한다.

본 발명은 기존의 연골 치료에 대한 패러다임을 바꾸어서 기존 연골치료 수술법과는 다르게 추가적인 재수술, 부작용, 수술범위를 최소화하는 방법의 치료법을 발명하고자 노력하였다. 그 결과, 생체 적합하고, 연골 세포증식이 뛰어나면서 기능유지가 효과적인 생체재료를 사용하여, 손상된 연골부위를 효과적으로 재생시킬 수 있는 주입 가능한 하이드로겔을 제조하였다.

본 발명의 구현예에 따르면, 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate)는 연골과 함께 단백질 콜라겐을 비롯하여 결합 조직들의 주요 성분으로써, 주로 연골에 20~40% 정도 함유되어 있으며 피부, 탯줄 등 각종 결합 조직에 널리 분포하며, 관절염에 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 젤란검은 하이드로겔로 제조할 시, 가교 방법이나 함량에 따라 기계적 특성을 조절할 수 있다. 또한, 젤란검은 생체 내에서 적합하며, 세포독성이 없고, 시간이 지남에 따라 생분해되는 특성을 가진다. 그러므로 이러한 젤란검을 콘드로이틴 설페이트와 함께 혼합시켜 하이드로겔로 제조하게 되면, 절개 수술을 할 필요 없이 주입식의 주사용 관절염 치료제로 사용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 골염증을 완화 시켜주며 연골 세포 증식에 도움이 되는 콘드로이틴 설페이트와 젤란검을 포함하는 하이드로겔 조성물을 특징으로 한다. 또한 본 발명에 따른 이러한 하이드로겔 형태의 조성물은 연골 손상 치료용 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 생체 적합한 천연재료인 젤란검 하이드로겔을 베이스로 하고 여기에 콘드로이틴 설페이트를 배합하여 하이드로겔 조성물을 구성한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 젤란검 하이드로겔의 농도는 1 ~ 3 중량%, 더욱 좋기로는 1-2중량%인 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에서 사용하는 젤란검 하이드로겔은 순수 젤란검에 3차 증류수를 혼합하고 CaCl₂로 가교한 하이드로겔로 구성된 것으로서, 여기에 콘드로이틴셀페이트를 첨가하여 균일하게 혼합하게 되면 콘드로이틴 설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물로 구성될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 콘드로이틴설페이트의 농도는 젤란검 수용액에서 콘드로이틴설페이트를 첨가하되 젤란검에 대해 5 ~ 30중량% 인 것이 바람직하다. 그 함량이 너무 낮으면 첨가 효과가 없고, 너무 높으면 하이드로겔의 기계적 강도가 감소하므로 바람직하지 않은 문제가 발생할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 하이드로겔 조성물은 예컨대 무릎 연골 손상부위에 적용하는 경우 주사제를 이용하여 곧바로 주입 가능한 제형일 수 있다. 그러므로 본 발명의 하이드겔 형태의 연골 손상 치료용 조성물은 그 사용이 기존에 비해 현저하게 편리한 효과가 있다.

그러므로 본 발명은 상기와 같은 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물을 유효성분으로 포함하는 연골 손상 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 연골 손상 치료용 조성물을 체내에 주입하면 관절 조직 보호와, 항산화 효과 및 세균감염을 억제하는 콘드로이틴 설페이트의 효과와 더불어 젤란검 특유의 높은 탄성과 내구성으로 인하여 연골치료용 주사제로써 적합하다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없고, 염증 반응이나 독성 물질에 의해 녹지 않는 장점이 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 연골 손상 치료용 조성물을 사용하는 경우 기존에 연골 재생 효과를 증진시키기 위해, 자가 무릎 연골을 채취하여, 자가 연골세포 이식술에서 생기는 방법으로 치료하던 방법에서 나타나는 여러 가지 단점을 최소화할 수 있는 것이다.

또한, 본 발명에 따르면 상기와 같은 연골 손상 치료용 조성물에는 추가적으로 콜라겐 등의 첨가물이 통상의 방법으로 혼합 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 연골 손상 치료용 조성물은 주사에 적당한 기계적 강도를 가짐으로서 주입 가능한 주사용 관절염 치료제로 제공될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 하이드로겔 조성물은 연골 손상 부위에 주사하는 경우 예컨대 20 wt% 콘드로이틴설페이트/젤란검 하이드로겔은 주사제로 적용 가능하며, 이 경우 대체로 14일 내지 21일 경과 후에는 연골 재생 효과가 나타나 연골 손상부위에 대한 치료 효과가 이루어지기 때문에 손상된 연골을 치료할 수 있게 되는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 연골 손상 치료용 조성물을 포함하는 주사용 관절염 치료제를 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골 손상 치료용 조성물은 주사형태로 주입하는 경우 연골손상 부위에 따라 0.1~1ml의 범위 내에서 그 투여량을 조절할 수 있다. 바람직하게는 체중 60Kg 중량의 성인 기준으로 무릎관절염 환자에 대해 0.1~1ml의 범위 내에서 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 연골 손상 투여용 조성물은 연골 손상 정도 및 재생 정도에 따라 주 또는 월 단위로, 반복 투여가 가능하다.

본 발명의 연골 손상 치료용 조성물을 체내에 주입하면 관절 조직 보호와, 항산화 효과 및 세균감염을 억제하는 콘드로이틴 설페이트의 효과와 더불어 젤란검 특유의 높은 탄성과 내구성으로 인하여 연골치료용 주사제로써 적합하다.

또한, 세포 독성이 없고, 염증 반응이나 독성 물질에 의해 녹지 않는 장점이 있다.

특히, 연골 재생 효과를 증진시키기 위해, 자가 무릎 연골을 채취하여, 기존 자가 연골세포 이식술에서 생기는 단점을 최소화할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 자세히 설명한다. 하기에 나오는 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

비교예 및 실시예 1 - 3 : 콘드로이틴설페이트/젤란검 하이드로겔 제조 방법

3차 증류수(40 ml)에 젤란검 분말(2 wt%)을 넣어주고 90℃ 이상의 온도에서 20분 동안 가열한 후 젤란검 분말이 완전히 용해될 때까지 교반시킨다. 그 후 콘드로이틴설페이트(CS)를 수용액 기준으로 각각 0(비교예), 10 wt%(실시예 1), 20 wt%(실시예 2), 및 30 wt%(실시예 3) 농도로 넣어준 후 시약이 완전히 용해될 때까지 교반을 시켜준다. 그 후, 가교제로써 CaCl₂(0.03 wt%)를 넣어주고 20분간 가열 및 교반해 준다. 수용액 상태의 젤란검을 패트리디쉬에 분주하여 굳힌 후, 바이옵시 펀치(Biopsy punch)를 이용해 직경 8 mm, 높이 4 mm의 하이드로겔 형태의 젤란검을 제조한다.

이렇게 제조된 각각의 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물에 대한 콘드로이틴설페이트(CS)를 젤란검 하이드로겔에 첨가하여 굳힌 함량별(0 wt%, 10 wt%, 20 wt%, 30 wt%) 제품의 사진을 도 1에 제시하였다.

실험예 :

(1) 연골세포 분리 및 배양

연골세포는 4주된 암컷 뉴질랜드 화이트 토끼(Hanil laboratory animal center, Wanju, Korea)의 무릎 관절에서 분리하여 추출하였다. 추출한 무릎 연골은 바로 인산완충용액(PBS, pH 7.4, Gibco, NY, USA)으로 3번 이상 세척하였다. 그리고 0.25 wt%의 콜라게네이즈 A형(Roche, Applied Science, Germany)용액으로 24시간 동안 인큐베이터(37 ℃ 5 % CO₂)에서 조직을 용해시켰다.

용해가 완료된 조직을 70 ㎛의 나일론 매쉬로 거른 다음 원심분리하여 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM, Gibco)과 F-12 영양배지 혼합액(Ham's F-12, Gibco), 10 % 우태아혈청(FBS, Gibco) 및 1 % 항생제(100 units/mL 페니실린과 100 ㎍/mL 스트랩토마이신)와 200 mM L-글루타민(Gibco), 50 ㎍/mL 아스코르빈산(Sigma), 15 mM HEPES buffer 1 M(Gibco)로 혼합된 배양액을 사용하여 세포배양 플라스크에 분주하고 37 ℃ 5 % CO2 조건하에 배양하였다.

(2) 물성 및 효능 분석

(2-1) 지지체의 압축강도 분석

각각의 콘드로이틴 설페이트의 함량에 따른 하이드로겔들의 압축강도를 측정하기 위해 만능물성측정기(TMS-Pro, Food Technology Corporation, Sterilng, USA)를 사용하였다. 1 N의 힘, 20 mm/sec의 속도, 2 mm의 측정거리로 설정하여 측정한 결과, 콘드로이틴 설페이트의 함량이 증가할수록 압축강도는 감소하는 것을 확인하였다. 그 결과는 도 2에 비교하여 나타내었다.

(2-2) 세포의 증식률 평가

연골 세포가 파종된 하이드로겔 지지체에서 세포 증식능력을 측정하기 위해 MTT(3-[4,5-디메틸치아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드) 분석을 각각 1, 4, 7, 14, 21일째 시행한 결과 시간이 지남에 따라 세포가 증식함을 확인할 수 있었다. 그 결과는 도 3에서 확인할 수 있다.

(2-3) 지지체의 모폴로지 확인

제작된 하이드로겔의 다공 및 지지체의 표면 거침도를 확인하기 위해 SEM 관찰을 실시하였다. 먼저 하이드로겔 지지체들을 동결건조시킨 후 스펀지 상태에서 모폴로지를 확인한 결과, 0, 10, 20 및 30 wt%의 콘드로이틴 설페이트의 함량이 들어간 지지체의 다공 크기는 84.66± 23, 64.53± 17, 39.33± 20, 33.12± 22 μm로 약물 함량이 올라가면, 점차적으로 다공의 크기가 작아지고 거침도 또한 증가함을 볼 수가 있었다. 각 제품에 대한 SEM 관찰 사진은 도 4에 나타내었다.

(2-4) 유전자 발현 분석

젤란검과 콘드로이틴 설페이트가 배합된 하이드로겔에서 연골세포의 유전자 발현도를 비교하였을 때, 연골 유전자와 관련있는 aggrecan, ColⅠ, Col Ⅱ 표현형이 20 wt% 콘드로이틴 설페이트가 배합된 젤란검 하이드로겔에서 가장 높게 나왔다. 이에 따라, 콘드로이틴 설페이트는 연골세포 증식에 긍정적인 역할을 하지만 일정량 이상을 초과하게 되면 연골세포 증식이 최적일 때보다 저해됨을 확인할 수 있었다.

이러한 확인 자료로서 도 5a는 aggrecan, 도 5b는 ColⅠ, 도 5c는 Col Ⅱ 의 표현형에 대한 결과를 보여주는 그래프이다.

(2-5) 실험결과

상기와 같은 실험결과로부터, 본 발명에 따른 콘드로이틴 설페이트/젤란검 하이드로겔은 겔 형태를 유지할 수 있을 뿐만 아니라 보관이 용이하며, 또한 세포의 성장이 완결된 후에는 자연적으로 생분해되어 몸에 흡수되기 때문에 다른 재료 보다 생체 적합한 장점을 가지는 것으로 확인되었다.

또한, 실시예의 경우 콘드로이친설페이트를 사용하지 않은 비교예에 비해 현저하게 각종 물성 및 세포의 성장 효과가 우수하여 연골 손상 치료에 효과가 있는 것으로 확인되었다.

Claims (8)

1. 골염증을 완화 시켜주며 연골 세포 증식에 도움이 되는 성분으로 콘드로이틴 설페이트가 젤란검에 배합되어 하이드로겔 형태로 이루어진 것을 특징으로 하는 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물.
   
2. 청구항 1에 있어서, 젤란검 하이드로겔의 농도는 1 ~ 3 중량%인 것을 특징으로 하는 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물.
   
3. 청구항 1에 있어서, 콘드로이틴 설페이트의 농도는 젤란검에 대해 5 ~ 30중량% 인 것을 특징으로 하는 콘드로이틴 설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물.
   
4. 청구항 1 내지 청구항 3 중에서 선택된 어느 하나의 항에 따른 콘드로이틴설페이트가 함유된 젤란검 하이드로겔 조성물을 포함하는 연골 손상 치료용 조성물.
   
5. 청구항 4에 있어서, 주사제 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는 연골 손상 치료용 조성물.
   
6. 청구항 4에 따른 연골 손상 치료용 조성물을 포함하는 주사용 관절염 치료제.
   
7. 청구항 6에 있어서, 연골손상 부위에 따라 0.1~1ml 투여량을 조절할 수 있는 것을 특징으로 하는 주사용 관절염 치료제.
   
8. 청구항 7에 있어서, 연골 손상 정도 및 재생 정도에 따라 주 또는 월 단위로, 반복 투여하는 것을 특징으로 하는 주사용 관절염 치료제.

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