KR20120046430A - 하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우수한 연골 재생 능력을 발휘하는 하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물은 최소한의 침습적 처치로 연골 결함 또는 손상 부위에 간편하게 적용될 수 있으며, 이식 후 활액막 조직의 침투 및 성장으로 연골의 재생이 효과적으로 일어나고 우수한 연골의 보호 효과를 발휘한다.

Description

하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물{Composition Comprising Hydrogel for Transplant to Cartilage}

본 발명은 하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물에 관한 것이다.

보다 구체적으로 본 발명은 활액막 세포 및 탄성성분을 함유하는, 주사기로 주입가능한 하이드로겔 연골 이식용 조성물에 관한 것이다.

퇴행성 관절염(degenerative arthritis)은 관절 연골이 닳아 없어지면서 국소적인 퇴행성 변화가 나타나는 질환으로서, 골관절염(osteoarthritis) 또는 골관절증이라고도 한다. 퇴행성관절염은 만성관절염의 하나로, 체중부하를 많이 받는 관절 연골에서 퇴행성 변화가 일어나 관절면의 뼈가 과잉 성장되어 발생되는 질환이며, 중?장년기 성인에게 많이 나타난다. 이 질환은 먼저, 연골 조성 성분을 만들어내는 연골세포가 노화로 인해 기능이 떨어지면서 연골이 탄력성을 잃게 되며, 시간이 흐르면서 연골의 표면이 거칠어지고, 관절막으로 싸여진 관절강 내부로 여러 종류의 물질이 유입되어 염증이 생기게 된다. 임상적으로는 반복적인 동통, 관절의 강직감, 관절의 점진적인 운동장애 등이 나타난다.

퇴행성 관절염의 원인은 노화 현상이나 과다한 체중과 관계가 깊으며, 나이가 많아질수록 여성에게서 더 많이 그리고 더 심하게 나타난다. 초기 증상은 한개 또는 두개의 관절이 강직과 함께 쑤시는 듯한 동통이 나타나며, 장기화 되면 연골 하골의 경화, 관절 주변에 골의 과잉형성, 관절의 변형 등을 초래하게 된다.

관절연골의 퇴행성 변화의 원인은 아직 규명되어 있지는 않지만, 연골세포 수의 절대적 감소와 연골세포(chondrocytes)에서 일어나는 연골기질 합성과 분해의 불균형이 하나의 원인으로 알려져 있다. 따라서, 관절연골의 퇴행성 변화는 연골기질의 분해로 인하여 연골 강도와 쿠션으로서의 능력이 감소된다.

히알루론산(hyaluronic acid)은 생체 내 연골조직에 많이 함유되어 있는 물질로, 연골조직의 탄력성을 높이는데 큰 역할을 하며, 수분 함유량이 높고, 뛰어난 점탄성(viscoelasticity)을 지니고 있다. 일반적으로 골관절염 환자에게서 히알루론산의 분해 촉진이 관찰되고 있다.

현재 임상적으로 사용되고 있는 퇴행성 관절염의 치료로는, 약물치료제(진통제, 스테로이드제, 비스테로이드계 항염제 등), 연골보호제(히알루론산, 글루코사민, 콘드로이틴 등)를 이용하거나 수술적 처치(관절경 수술, 경골 근위부 절골술, 관절부분 치환술, 슬관절 전치환술 등)에 의한다. 그러나 약물치료제의 경우는 통증이나 염증반응 자체를 비특이적으로 완화시키는 효과만을 가지며, 연골보호제는 단지 연골세포에 영양을 공급해 주거나 충격을 완화시킴으로써 일시적으로 관절을 보호해 주는 역할을 할 뿐이다. 또한 절제술과 같은 수술적 처치의 경우, 부분 또는 전 절제술로 주로 기계적인 증상을 없애 급성기의 통증을 개선할 수 있지만, 장기적으로 퇴행성 변화를 초래하여 관절염의 진행을 막지 못한다는 한계가 있고, 봉합술의 경우 적응증이 매우 제한되어 있고, 적지 않은 실패율이 보고되고 있다. 이러한 현존하는 퇴행성 관절염 치료 방법의 한계를 극복하기 위하여 조직 공학적인 기법을 이용한 연골 치료법이 대두되고 있으며, 다양한 동물 실험을 거쳐 현재 인체에 대한 임상 연구가 진행 중이다. 하지만 이러한 다양한 시도를 이용한 동물 실험에서 아직 만족할 만한 연골의 재생과 관절 연골 보호 효과를 증명하지 못하고 있다.

활액막 세포는 연골 손상 등 관절 내 손상에서 치유에 중요한 역할을 한다는 것이 잘 알려져 있으며, 관절 연골 또는 섬유 연골로 분화할 능력이 있는 것이 증명되었다. 또한 임상적으로도 최소 침습적인 관절경적 수술을 통하여 손쉽게 채취할 수 있어, 그 응용 및 치료적 적용에 많은 기대가 모아지고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 연골 결함 또는 손상 부위에 간편하게 주사기로 주입가능한 연골 이식용 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 활액막 세포 및 탄성성분을 함유하는 하이드로겔 연골 이식용 조성물을 제조하고, 그의 효과적인 연골 재생 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 본 발명은 하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 연골 이식용 조성물의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 하이드로겔; 및 (b) 상기 하이드로겔에 파종된 활액막 세포를 포함하는 연골 이식용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 연골 결함 또는 손상 부위에 최소한의 침습적 처치로서 주입가능한 연골 이식용 조성물의 개발을 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 활액막 세포 및 탄성성분을 함유하는 하이드로겔 연골 이식용 조성물을 제조하고, 그의 효과적인 연골 재생 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서에서 사용되는 용어 “겔(gel)"이란 젤리와 유사한 물질로서 부드럽고 약한 범위로부터 강하고 거친 범위까지의 물성을 가지며, 정상상태에서 흐름을 나타내지 않는 고체(solid)를 의미하며, 겔의 대부분 중량은 액체(liquid)이나 3차원 네트워크 구조로 인해 전체적으로는 고체와 같이 행동한다.

용어 “하이드로겔(hydrogel)"은 아쿠아겔이라고도 불리우는 3차원 네트워크 구조가 형성된 친수성의 겔을 의미한다. 하이드로겔은 그 수분 함량 때문에 천연 조직(natural tissue)과 거의 유사한 탄성을 나타낸다. 하이드로겔은 조직 공학에서 골격으로 사용될 수 있는 것으로서, 세포를 파종할 수 있는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으며, 예컨대, pH, 온도 또는 대사물질 농도를 감지하는 스마트 겔(Smart Gel), 실리콘 하이드로겔, 폴리아크릴아마이드 하이드로겔, 아가로스 하이드로겔, 메틸셀룰로오스 하이드로겔, 폴리비닐 알코올 하이드로겔, 소듐 폴리아크릴레이트 하이드로겔, 아크릴레이트 하이드로겔, 콘드로이틴 하이드로겔, 글루코사민 하이드로겔, 글리코사미노글리칸 하이드로겔, 소장 점막(porcine small intestinal submucosa) 하이드로겔, 골외막(periosteum) 하이드로겔, 연골외막(perichondrium) 하이드로겔, 피브린 하이드로겔, 피브리노겐 하이드로겔, 트롬빈 하이드로겔, 히알루론산 하이드로겔 및 콜라겐 하이드로겔 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에서, 상기 하이드로겔은 콘드로이틴, 글루코사민, 글리코사미노글리칸, 소장 점막(porcine small intestinal submucosa), 골외막(periosteum), 연골외막(perichondrium), 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 히알루론산 및 콜라겐으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 하이드로겔이며, 바람직하게는 히알루론산, 콜라겐 및 피브리노겐을 포함한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 하이드로겔에 포함되는 콜라겐은 제1형 콜라겐이다. 제1형 콜라겐은 파종된 활액막 세포의 지지체로서의 부착 및 증식에 중요한 역할을 담당한다.

일 구현예에서, 본 발명의 하이드로겔은 생체 내 환경에서 0.1 내지 6 중량%/day의 생분해 속도를 가지며, 주사기로 연골 결함 부위에 주입가능하기 때문에최소한의 침습적 처치만으로 연골 이식을 가능하게 한다.

용어 “활액막 세포”는 활액막에 존재하는 세포군을 의미하며, 특별하게 다른 언급이 없는 하, 활액막-유래 세포(synovium-derived cells)와 동일한 의미로 혼용된다.

본 발명에서 이용되는 활액막 세포는 치료 대상체(subject)로부터 추출한 세포 또는 동종(allogenous) 활액막 세포이다. 본 명세서에서 용어 “동종 활액막 세포”는 동일종으로부터 유래된 활액막 세포를 의미하는 것으로서, 자가 동종 활액막 세포 및 타가 동종 활액막 세포를 포괄하는 의미를 갖는다. 지지체에 파종되는 활액막 세포의 밀도는 특별하게 제한되지는 않으나 바람직하게는, 1 x 10³ - 1 x 10⁷ 세포/겔(㎖)의 세포밀도, 보다 바람직하게는 1 x 10⁵ - 1 x 10⁸ 세포/겔(㎖)의 세포밀도로 파종된다.

활액막 세포가 파종된 하이드로겔은 직후 연골 부위에 이식될 수 있지만, 바람직하게는 활액막 세포의 증식 후 이식된다. 증식 기간은 특별하게 제한되지 않는다.

상기 증식 과정에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM(Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science130:432(1959)), α-MEM(Stanner, C. P. et al., Nat . New Biol . 230:52(1971)), Iscove's MEM(Iscove, N. et al., J. Exp . Med . 147:923(1978)), 199배지(Morgan et al., Proc . Soc . Exp . Bio. Med ., 73:1(1950)), CMRL1066, RPMI1640(Moore et al., J. Amer . Med . Assoc . 199:519(1967)), F12(Ham, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 53:288(1965)), F10(Ham, R.G. Exp . Cell Res. 29:515(1963)), DMEM(Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal . Biochem . 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1(Waymouth, C.J. Natl . Cancer Inst . 22:1003(1959)), McCoy's 5A(McCoy, T.A., etal., Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))등이 이용될 수 있다.

일 구현예에서 본 발명의 활액막 세포가 파종된 하이드로겔은 연골생성 배지에서 배양되며, 연골형성 배지로는 바람직하게는, DMEM, F12, DMEM과 F12의 혼합물 및 RPMI 1640, 가장 바람직하게는 DMEM 포함 배지를 사용할 수 있다. 배지에 대한 설명은 문헌(R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells , A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., NewYork)에 상세하게 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상기 배지는 혈청(예컨대, 우태아혈청)이 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물은 연골 결함 또는 손상 부분에 이식되어 우수한 연골 재생 능력을 발휘한다. 본 발명의 이식용 조성물을 이용하는 경우, 활액막 조직의 침투 및 성장으로 연골의 재생이 효과적으로 일어나며, 연골의 보호 효과가 발생한다.

본 발명의 연골 이식용 조성물을 적용할 수 있는 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)을 포함하며 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 연골 이식용 조성물은 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 및 척추 연골 등 연골 부위에 제한 없이 연골의 결함 및 손상이 있는 부위에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 활액막 세포를 취득하는 단계; 및 (b) 상기 취득한 활액막 세포를 하이드로겔과 혼합하는 단계를 포함하는 연골 이식용 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법은 상술한 하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물을 준비 및 제조하는 방법에 관한 것이므로, 하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물과의 관계에서 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

상기 활액막 세포는 관절 연골 또는 섬유 연골로 분화할 능력이 있는 것이며, 임상적으로도 최소한의 침습적 처치를 통하여 손쉽게 채취할 수 있으며, 이는 치료 대상체(subject)로부터 추출하거나 또는 동종 활액막 세포로부터 취득할 수 있다. 이렇게 취득한 활액막 세포를 파종에 앞서, 하이드로겔에 파종하기에 충분한 세포 수로 배양되는 단계를 추가적으로 거칠 수 있으며, 상기 취득한 활액막 세포는 하이드로겔과 혼합하는 단계에 의하여 하이드로겔 내에 파종될 수 있다. 또한 본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 활액막 세포 및 하이드로겔 혼합물을 배양하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 연골 이식용 조성물을 포함하는 연골 결함 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용되는 질환인 연골 결함은 신체 내 포함되는 연골에 손상, 결함(defect) 또는 부족이 있는 경우를 포괄하는 의미로서 예컨대 연골괴사, 골연골염, 연골파열, 연골외상, 관절염, 연골결핍 및 선천성 기관연화 등이 있으나 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 유효성분으로서 포함되는 상기 연골 이식용 조성물에 더하여 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우 바람직하게는 연골 손상 또는 결함 부위에 직접 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001mg/kg 내지 1000 g/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 우수한 연골 재생 능력을 발휘하는 하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물 및 그 제조방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 하이드로겔을 포함하는 연골 이식용 조성물은 최소한의 침습적 처치로 연골 결함 또는 손상 부위에 간편하게 적용될 수 있으며, 이식 후 활액막 조직의 침투 및 성장으로 연골의 재생이 효과적으로 일어나며, 우수한 연골의 보호 효과를 발휘한다.

도 1은 겔의 효소적 분해실험을 위해 준비한 다양한 혼합 비율의 겔의 사진이다.
도 2는 시간의 경과에 따른 다양한 구성비율을 갖는 겔의 효소적 분해 프로파일이다.
도 3은 겔/세포 컨스트럭트의 28일간 배양 결과를 나타내는 사진이다.
도 4는 겔/세포 컨스트럭트 배양 1일 및 3일 후 Live/Dead Viability 분석 결과이다. 겔 내 생존세포는 녹색, 사멸세포는 적색으로 나타난다.
도 5는 겔/세포 컨스트럭트 배양 14일 후 Live/Dead Viability 분석 결과이다. 겔 내 생존세포는 녹색, 사멸세포는 적색으로 나타난다.
도 6은 겔 ①의 (a) 1일 배양 및 (c) 2주 배양 후와 겔 ②의 (b) 1일 배양 및 (d) 2주 배양 후의 겔 내 생존세포(녹색) 및 사멸세포(적색)의 이미지를 확대하여 나타낸 것이다.
도 7은 MTS 분석 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 합성된 총 GAG의 양을 DNA 양에 대하여 평균화하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 3주 및 4주 배양 후 사프라닌 O로 염색한 프로테오글리칸 발현을 보여주는 사진이다.
도 10은 3주 및 4주 배양 후 제1형 콜라겐 발현을 보여주는 공초점 현미경 사진이다.
도 11은 3주 및 4주 배양 후 제2형 콜라겐 발현을 보여주는 공초점 현미경 사진이다.
도 12는 연골 특이적 ECM 유전자 발현을 나타내는 RT-PCR 분석결과이다.
도 13은 연골형성 실험 1주 후 래빗 무릎 관절 활차형 홈의 형태 구조 및 H&E 염색결과를 나타낸다.
도 14는 연골형성 실험 1주 후 래빗 무릎 관절 중앙 돌기의 형태 구조 및 H&E 염색결과를 나타낸다.
도 15는 연골형성 실험 4주 후 래빗 무릎 관절 활차형 홈의 형태 구조, H&E 염색결과 및 사프라닌 O 염색결과를 나타낸다. 적색 형광은 겔과 함께 주입된 활액막세포이다.
도 16은 연골형성 실험 4주 후 래빗 무릎 관절 중앙 돌기의 형태 구조, H&E 염색결과 및 사프라닌 O 염색결과를 나타낸다. 적색 형광은 겔과 함께 주입된 활액막세포이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 방법

래빗 활액막 세포의 분리 및 배양

생후 12주, 체중 2.6-3 kg의 래빗으로부터 활액막을 얻었다. 활액막을 PBS(phosphate-buffered saline)에서 갈고, 0.02% 콜라게나아제(Sigma, Saint Louis, Mo, USA)로 37℃, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 분해하였다. 70 ㎛ 체를 이용하여 세포를 분리한 다음, 1500 rpm, 4℃에서 5분 동안 원심분리하고, PBS로 2회 세척하였다. 세포를 배지에 현탁시켰다. 이용한 배지는, 10% 우태아혈청(FBS, Life Technologies, Rockville, MD, USA) 및 항생제-항진균제 용액(GIBCO)을 포함하는 저포도당 DMEM(low glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium, LG-DMEM, GIBCO, Grand Island, NY, USA)이다. 상기 배지를 포함하는 150 mm 배양 디쉬에 2 x 10⁴밀도로 플레이팅 하였다. 세포를 디쉬에 48시간 동안 부착시킨 다음, 배지를 교환하였고, 약 14일 동안(P0) 37℃, 5% CO₂에서 증식시켰다. 배지는 2일 후에 교체하여 세포 부착을 유도하였고 비부착 세포들은 제거하였다.

세포를 배지에서 단일층으로 배양하였으며, 5% CO₂대기 하에서 37℃에서 배양하였다. 배지는 3일에 한 번씩 교체하였다. 배양 약 10-14일 후(패시지 0, P0) 세포가 80-90% 컨플루언시에 도달할 때 까지 배양하였다.

겔의 준비 및 효소적 분해

하기 표 1의 다양한 혼합비율로 겔을 준비하고, 인 비보 분해 프로파일을 모사하기 위해, 다양한 혼합 비율의 겔을 1 ㎎/㎖ 리소자임(Sigma, USA)을 포함하는 PBS에서 37℃, 상대습도 95% 및 5% 이산화탄소 조건하 배양하였다. 겔의 분해는 남아있는 겔의 중량%를 측정하여 평가하였다(도 2).

세포 포획(encapsulation)

상기 분리 배양한 래빗 활액막 세포를 피브리노겐(Green Cross, Korea), 10 ㎎/㎖ HA(LG CI, Korea) 및 3 % 제1형 콜라겐(RMS innovations, UK)을 포함하는 용액 내 2x10⁷ 세포/㎖으로 현탁시켰다. 세포를 상기 준비한 겔과 균일하게 혼합하고 트롬빈/CaCl₂을 가하여 약 4 × 10⁶ 세포/겔 컨스트럭트 밀도로 세포를 겔 내 포획시켰다.

연골형성적( Chondrogenic ) 분화

겔 내 세포 분화 능력 차이를 측정하기 위해 상기 형성시킨 겔/세포 컨스트럭트를 화학적으로 정제된 연골생성 배지 내에서 배양하고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 연골생성 배지는 100 μM 아스코베이트-2-포스페이트(Sigma), 프롤린(Sigma) 40 ㎍/ml, 및 ITS^TM+프리믹스 유니버설 배지 보충물(BD Biosciences, Bedford, MA, USA)(6.25 ㎍/ml 인슐린, 6.25 ㎍/ml 트랜스페린, 6.25 ㎍/ml 아셀레늄산, 1.25 mg/ml 우혈청 알부민, 5.35 mg/ml 리놀레산 포함)로 보충된 저포도당 DMEM(GIBCO)을 포함한다. 100 nM 덱사메타손(Sigma)은 배지에 초기에 첨가하였다.

세포 증식 분석

겔 내 생존 세포를 Live/Dead Viability 키트(Molecular Probes, USA)를 사용하여 분석하고 다음과 같이 MTS[3(4,5-dimethylthiazol-2yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] 분석을 수행하여 생존 세포 수를 측정하였다. MTS 분석은 증식 또는 세포독성 분석에서 생존 세포의 수를 결정하는 색광학적 수단을 제공한다. 1% 항생제-항진균제 용액 및 MTS 테트라졸리움 화합물과 전자 커플링 시약(phenazine ethosulfate)을 포함하는 20 ㎕ CellTiter AQueous One Solution 시약Reagent(Promega Corporation, Madison, WI)을 포함하는 저포도당 DMEM 내의 100 ㎕ 0.1% 콜라게나아제(Sigma, Saint Louis, MO)로 세포를 3시간 동안 37℃에서 처리하였다. 이어, 96-웰 플레이트 리더(microplate spectrophotometer, VersaMax; Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA)를 이용하여 490 nm에서의 흡광도를 기록하였고, 표준곡선(동일 패시지의 활액막-유래 세포의 연속적인 희석물을 이용하여 플롯팅됨)을 이용하여 생존 세포의 수를 결정하였다(도 4 내지 도 7).

GAG 및 DNA 정량분석

합성된 글라이코사이노글라이칸(GAG)를 DMB 염료에 대한 결합으로 측정하고, 인돌 분석법에 의해 총 GAG의 양을 DNA 양에 대하여 평균화하였다. 구체적으로 디메틸메틸렌 블루 방법을 사용하여 총 글라이코사이노글라이칸(GAG) 양을 결정하였다. 글라이코사이노글라이칸 양을 분석하기 위해, 파라핀/완충 용액(0.1 M 포름산 나트륨, 5 mM EDTA 내 200 ㎍/ml 파라핀, 5 mM L-시스테인, pH 3.0)을 사용하여 분획물 들을 55℃에서 하룻밤동안 분해하였다. 6000 rpm에서 5분 동안 원심분리 한 다음, 상층액 50 ㎕을 96 웰 플레이트에 플레이팅 하고, DMB 염색 용액 250 ㎕을 첨가하였다. ELISA 판독기를 사용하여 530 및 590 nm에서의 흡광도 율로부터 GAG 레벨을 결정하였다. 콘드로이틴-6-황산염을 용해하여 표준물질로 사용하였고, 총 GAG의 양을 DNA 양에 대하여 평균화하였다(도 8).

연골 형성적 분화 후 조직관찰

프로테오글리칸 탐지를 위하여 각 시점에서의 샘플을 H&E 및 사프라닌 O로 염색하고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 또한 제1형 및 제2형 콜라겐의 발현은 면역세포화학 염색법으로 다음과 같이 분석하였다. 실온에서 4시간 동안 4% 파라포름알데하이드에서 샘플을 고정하고, 조직 텍 임비딩 배지(Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)에 -70℃, 20분 동안 임베딩 하였다. 5 ㎛ 두께의 절단부위 슬라이드를 -20℃에서 만들었다. 상온에서 하룻밤 건조 시킨 후, PBS(phosphate buffered saline)으로 세척하고, 50 units/ml 콘드로이티나아제 ABC(0.1 M 아세트산 나트륨, 0.1 M 트리스, pH 7.3)로 37℃에서 30분 동안 슬라이드를 처리한 다음, 5분 동안 세 번 세척하였다. 블로킹 용액(Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA)으로 상온에서 10분 동안 처리해 비-특이적 반응을 차단하였다. 마우스 단일클론 항-콜라겐 2 항체(2 ug/ml Lab Vision-Neomarkers, Fremont, CA, USA)를 상온에서 1시간 동안 처리하였다. PBS로 세 번 세척한 다음, 1:100 비율로 희석된 FITC-연결 염소 항-마우스Ig 항체(Zymed Laboratories Inc., San Francisco, CA, USA)로 절단 부위를 상온에서 1시간 동안 처리하고, PBS로 다시 세척하였다. DAPI이 포함하는 배지에 슬라이드를 올려 놓은 다음, 공초점 현미경(LSM 510, Carl Zeiss, Germany)으로 관찰하였다(도 10 및 도 11).

역전사효소 -중합효소 연쇄 반응

연골 특이적 ECM 유전자 발현을 RT-PCR으로 분석하였다. 트리졸 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; 페놀+구아닌 이소치오네이트)을 가지고 총 RNA를 추출하였다. 제 1차 cDNA쇄 합성 키트(Fermentas, Life sciences, EU)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 간략하게는, RNA 1ug, 올리고 dT 프라이머 1 ul, 5X 반응 버퍼, RNase 저해제, 10mM dNTP 혼합물을 M-MuLV 역 전사효소와 혼합하고, 25˚C에서 15분, 37˚C 에서 60분 동안 역전사를 실시한 다음 70˚C에서 10분간 항온 처리하여 역전사 효소를 비활성화 시켰다. PCR PreMix(Bioneer, South Korea)를 사용하여 cDNA결과물의 PCR 증폭을 실시하였다. 제1형 콜라겐(COL I), 제2형 콜라겐(COL II), 제10형 콜라겐(COL X), Aggrecan, Sox 9 및 하우스키핑 유전자인 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH)의 발현여부를 조사하였다. 증폭하기 위해 사용된 프라이머 및 반응 조건은 하기 표 2에 나타내었다. 1%의 아가로즈 겔 상에서 전기 연동하여 반응 산물을 분해하고, 에티듐 브로마이드(EtBr)로 시각화 하였다(도 12).

유전자	방향	서열	사이클	어닐링 온도(℃)	앰플리콘 (bp)
COL I	(F)	5'-CGTGGTGACAAGGGTGAGAC-3'	25	52	827
	(R)	5'-TAGGTGATGTTCTGGGAGGC-3'
COL II	(F)	5'-TTCAGCTATGGAGATGACAATC-3'	35	58	472
	(R)	5'-AGAGTCCTAGAGTGACTGAG-3'
COL X	(F)	5'-CCCTTTTTGCTGCTAGTATCC-3'	28	58	468
	(R)	5'-CTGTTGTCCAGGTTTTCCTGGCAC-3'
Aggrecan	(F)	5'-TGAGGAGGGCTGGAACAAGTACC-3'	32	57	350
	(R)	5'-GGAGGTGGTAATTGCAGGGAACA-3'
Sox 9	(F)	5'-CCCGATCTGAAGAAGGAGAGC-3'	32	58	381
	(R)	5'-GTTCTTCACCGACTTCCTCCG-3'
GAPDH	(F)	5'-ATTGTTGCCATCAATGACCC-3'	25	55	579
	(R)	5'-AGTAGAGGCAGGGATGATGTT-3'

COL I: 제1형 콜라겐

COL II: 제2형 콜라겐

COL X: 제10형 콜라겐

GAPDH: 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나이제

(F): 정, 센스 프라이머

(R): 역, 안티센스 프라이머

bp: 염기 쌍

인 비보 연골 형성실험

통상적으로 제조된 수술 도구를 사용하여 래빗 무릎 관절(Ø : 4㎜, 깊이: 3 ㎜)의 활차형 홈 및 중앙 돌기 내에 골연골 결함을 형성시켰다. 이중 주사기를 사용하여 상기 겔 및 트롬빈 용액을 주입하였다. 대조군에는 오직 골연골 결함만을 가하였고, 실험군은 두 그룹으로 나누어 한쪽 그룹에는 활액막 세포를 포함하지 않는 겔 ②와 트롬빈 용액을, 다른 그룹에는 활액막 세포를 포함하는 겔 ②와 트롬빈 용액을 주입하였다. 주입 후 1, 4 및 12주 시점에 실험동물을 희생시키고 연골 형성 결과를 관찰하였다(도 13 내지 도 16).

통계분석

모든 실험은 3회 수행하였고 실험 결과는 대응표본 t-테스트로 분석하였다. 0.005 미만의 P 값은 유의하게 고려되었다.

실험결과

분해 실험에서, 더 높은 피브리노겐 비율을 갖는 하이드로겔이 보다 더 천천히 분해되었다. HA, 제1형 콜라겐 및 피브리노겐의 구성 비율이 0.75:0.75:1.5(겔 ①) 및 0.5:0.5:2(겔 ②)인 겔은 3주 배양 후 최초 겔의 40 % 이상이 남았다(도 2). 시간의 경과에 따른 겔의 효소적 분해 프로파일은 도 2에 나타내었다. 그러므로, 본 발명자들은 다양한 구성비율을 갖는 겔 중에서 겔 ① 및 겔 ②를 선택하여 추가실험을 진행하였다.

겔 내에 심은 대부분의 활액막세포는 생존하여 2주간 증식하였다(도 6 및 도 7). 겔 ① 및 겔 ② 내에 심은 세포로부터의 GAG 합성은 3주까지 증가하는 것으로 나타났다(도 8). 연골발생적 분화 결과 ECM 내 풍부한 프로테오글리칸(도 9) 및 그 내부에 심어져 있는 연골-유사 세포를 확인할 수 있었고, 제1형 콜라겐(도 10) 및 제2형 콜라겐(도 11)에 대한 양성적 염색 결과를 보였다.

RT-PCR 결과 또한 연골 특이적 ECM 유전자 발현을 나타내었다(도 12). 래빗 결함 모델에 있어, 겔 및 세포를 주입한 연골 결함부위는 주입 4주 시점에 재생된 연골질 조직에 의해 채워지는 반면, 대조군 대다수는 결함이 채워지지 않는 것으로 나타났다(도 13 내지 16). 겔과 함께 주입된 세포는 결함 부위 내 적색 형광으로 관찰되었다(도 15 및 도 16 하단). 결함부위 가장자리는 재생된 조직과 완전히 통합되었다.

본 연구의 목적은 HA, 제1형 콜라겐 및 피브린 글루를 포함하는 연골 재생을 위한 주입 가능한 세포 담체로서 사용될 수 있는 신규한 생체적합성 하이드로겔을 개발 및 제조하는 것이었다. 본 발명자들은 활액막세포를 심은 하이드로겔이 연골 결함부위에 점착하여 ECM과 같은 관절 연골의 축적을 촉진하며 따라서 연골 재생을 위한 좋은 후보가 될 수 있음을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

1. (a) 하이드로겔; 및 (b) 상기 하이드로겔에 파종된 활액막 세포를 포함하는 연골 이식용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 하이드로겔은 주사기로 주입가능(injectable)한 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서, 상기 하이드로겔은 콘드로이틴, 글루코사민, 글리코사미노글리칸, 소장 점막(porcine small intestinal submucosa), 골외막(periosteum), 연골외막(perichondrium), 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 히알루론산 및 콜라겐으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 하이드로겔은 히알루론산, 콜라겐 및 피브리노겐을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 콜라겐은 제1형 콜라겐인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서, 상기 활액막 세포는 1 x 10⁵ 내지 1 x 10⁸ 세포/겔(㎖)의 밀도로 하이드로 겔에 파종된 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 하이드로겔은 0.1 내지 6 중량%/day의 생분해 속도를 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
8. 제 1 항에 있어서, 상기 연골은 유리연골(hyaline cartilage), 섬유연골(fibrocartilage) 또는 탄성연골(elastic cartilage)인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 연골은 관절연골(articular Cartilage), 귀 연골, 비연골, 팔꿈치 연골, 반월상연골(meniscus), 무릎연골, 늑연골, 발목연골, 기관연골, 후두연골 및 척추 연골로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 다음의 단계를 포함하는 연골 이식용 조성물의 제조방법:
    (a) 활액막 세포를 취득하는 단계; 및
    (b) 상기 취득한 활액막 세포를 하이드로겔과 혼합하는 단계.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 활액막 세포는 연골 결함 치료 대상체(subject)로부터 추출한 것 또는 동종 활액막 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
    
12. 제 10 항에 있어서, 상기 방법은 상기 활액막 세포 및 하이드로겔 혼합물을 배양하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
    
13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 연골 결함 치료용 약제학적 조성물.
    
14. 제 13 항에 있어서, 상기 연골 결함은 연골괴사, 골연골염, 연골파열, 연골외상, 관절염, 연골결핍 및 선천성 기관연화로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.

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