KR102541271B1 - 젤란 검 하이드로겔(gellan gum hydrogels), 제조, 방법 및 그 용도 - Google Patents

젤란 검 하이드로겔(gellan gum hydrogels), 제조, 방법 및 그 용도 Download PDF

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루이 페드로 로메로 아만디 데 소우사
크리스티나 코레이아
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스템매터스, 바이오테크놀로지아 이 메디시나 리제네레티바, 에스.에이.
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Abstract

겔란 검-기반 하이드로겔은 본 발명에서 시험관 내 세포 배양 및 조직 공학 및 재생 의학 응용에 대해 개시되어있다. 이러한 젤란 검-기반 하이드로겔은 인간 및/또는 동물에서의 적용을 위해 단독으로 또는 살아있는 세포 및/또는 생체분자와 함께 사용될 수 있다. 선택된 이온-킬레이트 치환체를 갖는 젤란 검의 화학적 개질은 조절가능한 물리화학적 및 생물학적 특성을 부여하는 신규한 젤란 검 하이드로겔을 제공한다. 본 발명에 기재된 개질된 젤란 검은 장기간의 배양 기간 동안 캡슐화된 세포를 유지하고 건강한 세포외 기질 마커들의 발현을 상향-조절시키는 반면, 용해성, 이온성 가교결합 다용도성, 제형의 용이성 및 주입성 및 생물학적 조직 및 표면 내에서의 보다 큰 접착력을 포함하는, 기존의 하이드로겔 시스템에 대한 장점을 제공한다.

Description

젤란 검 하이드로겔(GELLAN GUM HYDROGELS), 제조, 방법 및 그 용도 {GELLAN GUM HYDROGELS, PREPERATION, METHODS AND USES THEREOF}
본 발명은 독립형 의료 장치로서 또는 세포 캡슐화를 위해 사용하기에 적합한 개선된 물리화학적 및 생물학적 특성을 갖는 하이드로겔을 형성하는 개질된, 생체-모방형(bio-inspired) 젤란 검에 관한 것이다. 캡슐화된 세포를 함유하는 개질된 젤란 검 하이드로겔은 체외 세포 배양 또는 조직 공학, 재생 의학 및 약물 전달 분야에서 세포 및/또는 활성 물질 및/또는 생체분자의 최소 침습성 체내 전달 및 유지를 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 개시된 개질된 젤란 검 하이드로겔은 제조의 재현성, 높은 수용성 및 제형의 용이함을 포함하여, 전통적으로 현존하는 하이드로겔 계와 관련된 한계를 극복하게 해준다. 개질된 젤란 검은 생리학적으로 관련된 다양한 양이온에 의해 조절가능한 이온성-가교결합을 나타내고 체외 배양 기간 동안 포유동물 세포를 생존가능하게 유지하면서, 탁월한 접착력을 유지한다. 개질된 젤란 검 하이드로겔은 또한 건강한 연골원성 세포외 매트릭스 마커의 발현의 증가를 촉진시킨다.
본 발명은 또한 연골 및 연조직 공학 및 재생 의학에 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다.
세포 캡슐화 기술은 체외 세포 배양 및 스크리닝 모델뿐만 아니라 조직 공학 및 재생 의학 분야에 대한 관심을 계속 끌고 있다. 특히, 생리학적으로 관련된 조건 하에서 하이드로겔을 형성할 수 있는, 미생물 또는 해양 공급원으로부터 수득된 다당류를 포함하는 천연 기원의 고분자는 체외 세포 배양 및 포유동물 세포 및/또는 체내 생체분자의 캡슐화 및 전달을 위한 기질로서 광범위하게 연구되어 왔다. 또한, 특정 하이드로겔은 다른 무세포(cell-free) 조직 공학 응용분야에서 의료 장치의 형태로 독립형 제품으로도 사용될 수 있다. 하이드로겔은 포유동물 조직의 세포외 기질(ECM(extracellular matrix))을 닮거나 이를 모방하는 연질 및 다공성 구조를 형성하기 위해 물리적, 효소적, 화학적 또는 이온성 가교결합 과정에서 조직화된 3차원 네트워크를 형성하는 친수성 고분자로 구성된 고도로 수화된 물질이다. 주입, 생체적합성 및 가스, 영양소 및 신진대사 폐기물의 지속적인 흐름을 허용하는 투과성과 같은, 최소 침습성 절차를 통한 용이한 전달은 모두 기능성 세포/생체분자 캡슐화 물질에 대한 필수 조건이다. 또한, 고분자는 세포 생존능력 또는 기능을 손상시키지 않는 가교결합 과정을 통해 하이드로겔을 형성할 수 있어야 하고, 원하는 작용 부위에서 이식된 세포 및/또는 생체분자를 견고하게 유지할 수 있어야 한다.
현재까지, 천연 다당류 및 단백질에 기초한 다수의 하이드로겔이 잠정적인 세포 배양 및 세포/생활성 캡슐화/전달 제제로서 연구되어 왔다. 이들은 다른 것들 중에서, 아가로오스, 알기네이트(alginate), 카라지난(carrageenan) 군, 키토산, 히알루론산, 콜라겐, 엘라스틴, 피브린, 젤라틴 및 실크 피브로인을 포함한다. 그러나, 이러한 물질의 대부분은 체외 세포 배양, 세포 전달 또는 체내 독립형 치료 환경에서 일반적인 적용가능성을 심각하게 제한하는 중대한 결점을 가지고 있다. 여기에는, 생산 또는 추출 중 구조적 일관성 및 합성 재현성 부족, 장단기 물리적 및 대사 불안정성뿐만 아니라, 생리학적으로 관련있는 배지 및 pH에서의 부적절한 용해성이 포함된다. 일부의 경우, 이들은 또한 열 민감성 치료제와 양립할 수 없는 생리적 온도 이상의 처리 온도를 필요로 하고 특정 용도에 대해 부적절한 기계적 성질을 갖는 하이드로겔의 형성을 야기한다. 또한, 이들 물질 중 일부는 제어되지 않은 분해 속도를 가지므로, 생체물질의 신진대사 및 제거가 캡슐화된 세포 및/또는 생분자 전달에 의한 ECM 또는 조직 생성 속도와 일치하거나 양립되지 않는다.
따라서, 세포 및/또는 생체분자 캡슐화를 위한 보다 다양한 생체물질 및 독립형 의료 장치에 대한 탐색이 계속되고 있다. 최근에 젤란 검이 그러한 목적을 위한 대체 생체물질로 제안되었다(Oliveira, 2009; 2010). 젤란 검은 슈도모나스 엘로디아(Pseudomonas elodea) 박테리아에 의해 분비되는 선형, 음이온성, 세포외 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharide)이고, 이는 두 개의 D-글루코오스, 하나의 D-글루쿠론산 및 하나의 L-람노오스 잔기로 구성된 반복되는 사당류(tetrassaccharide) 단위로 구성된다[→3)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-GlcpA-(1→4)-β-D-Glcp-(1→4)-α-L-Rhap-(1→].
상업적으로, 젤란 검은 아세틸레이티드(acetylated(high-acyl))와 디아세틸레이티드(deacetylated(low-acyl))의 두 가지 형태로 제공된다. 하이-아실(High-acyl) 젤란 검은 두 가지 아실 치환기, 즉 아세테이트(두 반복 단위마다 하나의 아세테이트기)와 글리세레이트(모든 반복 단위마다 하나의 글리세레이트기) 둘 다 동일한 포도당 잔기에 위치하며, 로우-아실(low-acyl) 젤란 검은 염기성 가수 분해에 의해 생성되고 전형적으로 아실 그룹이 없는 것에 대해 5 % 미만의 아실 치환기를 함유한다. 이 두 가지 동형단백질은 Ca2+ 및 Mg2+와 같은 2가 양이온의 존재 하에서 용액의 온도가 감소할 때 현저하게 다른 기계적 특성을 갖는 열-가역 하이드로겔을 생성한다. 이는 젤란 검 하이드로겔의 형성이 불편한 가열/냉각 사이클을 필요로 하고 2가 양이온의 존재가 필수적이라는 것을 의미한다. 나트륨(Na+) 및 칼륨(K+)과 같은 1가 양이온만 존재하는 젤란 검 용액의 냉각은 2가 양이온으로 얻은 것으로서 유사한 기계적 성질을 가진 하이드로겔을 제공하기 위해 약 100배 더 높은 이온 농도를 필요로 한다. 이러한 상승된 농도는 삼투압 충격으로 인하여 캡슐화된 세포 생존을 제한할 것으로 예상된다. 한편, 젤란 검 하이드로겔은 낮은 세포독성을 나타내며 온화한 열과 묽은 산에 대해 비교적 안정하지만, 체내에서 이식될 때 3D-매트릭스 내에서 생리학적 1가 양이온과 효과적인 교차결합에 대한 원인인 2가 양이온의 확산 및 교환으로 인해 시간이 지남에 따라 기계적 강도를 잃는 경향이 있다. 세포 캡슐화 연구는 겔런 검 하이드로겔이 인간 관절 연골세포에 의한 ECM의 성장과 퇴위를 어느 정도 유지할 수 있음을 입증했다. 그럼에도 불구하고, 음으로 하전된 하이드로겔의 상당한 친수성은 물 분자의 결합을 선택적으로 선호하여 세포-접착성 단백질의 흡착이 세포-물질 표면에서 크게 억제되어 세포가 부착할 수 없는 결과를 초래한다. 고분자 표면에서의 부착 부위 또는 세포 접착 리간드의 결여는 접착-의존적 세포의 생존 및 기능에 해로울 수 있고, 이는 시간 경과에 따른 세포 생존력의 감소 및 궁극적으로 좋지 못한 성능 결과를 초래할 수 있다.
언급된 바와 같이, 젤란 검 하이드로겔의 치료적 유용성은 생리학적 온도(37 ℃) 이하에서 상업적으로 이용가능한 고분자의 낮은 수용해도에 의해 추가로 저해된다. 전형적으로 약 1 % w/V 농도의, 희석 수용액은, 적어도 약 1시간 동안, 통상적으로 약 90 ℃의 가혹한 온도에서, 상업적으로 이용가능한 로우-아실 고분자를 물로 가열함으로써 수득될 수 있다. 불편하게도, 열-가역 겔화는 용액 온도가 약 40-42 ℃로 감소될 때 발생한다. 명백하게, 용해 및 열-겔화 온도 모두 생리학적 온도(37 ℃)보다 현저히 높아서 세포가 캡슐화시 열 충격을 겪어, 세포 생존력 및 기능성이 감소될 수 있다. 젤란 검의 조기 열 겔화는 또한 좁은 바늘을 통한 주입에 의해 전달되는 용액의 주요 문제점을 나타내므로, 좁은 온도 창(temperature window)은 심각한 기술적 한계를 나타낸다.
젤란 검에 관련된 또 다른 단점은 생물학적 조직 및 생체 표면에 대한 제한된 접착력, 특히 수술 과정에서 사용되는 체액 및 관주 용액(irrigation solution)의 존재와 관련이 있다. 젤란 검 하이드로겔은 대부분의 하이드로겔과 같이 매우 친수성이기 때문에, 습한 환경에서 유기 또는 무기 표면(연질 또는 경질 조직)에 효과적으로 접착할 수 없다. 따라서 체내에서 전달되거나 이식된 젤란 검 하이드로겔은 일단 물리적 또는 기계적 스트레스에 노출되면, 생체 표면에 머물러있지 않게 되므로, 치료 환경에서의 일반적인 적용가능성 및 효과가 심각하게 감소된다.
젤란 검은 글루쿠론산 잔기의 모든 사당류 반복 단위에 대해 하나의 카복실산(-C02H) 작용기를 포함하고 있기 때문에, 물리화학적 및 생물학적 특성을 최적화하기 위해 젤란 검을 화학적으로 변형할 가능성이 탐구되었다. 약간의 염기 조건 하에서 과량의 글리시딜 메타크릴레이트(glycidyl methacrylate)와 젤란 검의 반응(Silva-Correia, 2011a)은 메타크릴레이트된 젤란 검(GG-MA)을 제공한다. 이 매우 다용도의, 반-합성 물질은 낮은 온도에서 상위 젤란 검보다 높은 수용해도를 가지므로, 실온 또는 생리학적 온도에서 물에서 1-2 % w/V 농도의 용액을 얻을 수 있지만, 고농도에서 생성된 용액의 점도는 주입에 의한 전달의 경우 수용가능한 범위의 상한 범위에 있음에도 불구하고, 용해 과정 중에 과도한 공기 포집을 피하여 교차결합이 발생한 후에 하이드로겔 내의 원하지 않는 기포 형성을 초래할 수 있으므로 주의해야 한다. 모체(parent) 고분자와 마찬가지로, GG-MA는 Ca2+ 및 Mg2+와 같은 생리적으로 관련된 2가 양이온에 의해 촉진된 이온성-교차결합을 거쳐 하이드로겔을 형성한다. 또한 메타크릴레이트 치환기 상에 α, β-불포화 케톤 잔기의 존재로 인해, 공유 가교결합이 적합한 라디칼 광-개시제의 존재하에 고분자 용액을 자외선에 노출시킴으로써 수행될 수 있다. 고분자 농도와 가교결합의 방법/정도를 변화시킴으로써, 조정가능한 기계적 성질을 갖는 GG-MA 하이드로겔을 제조할 수 있다(Silva-Correia, 201lb). 이온성- 및 광-가교결합된 GG-MA 하이드로겔은 모두 생체적합성을 보이며 여러 세포 유형을 캡슐화하는데에 사용되어왔다(Silva-Correia, 2013).
수용해도 및 물리화학적 성질의 관점에서 앞서 언급한 개선에도 불구하고, GG-MA는 모체 고분자와 특정 한계를 공유한다. W02011/119059 Al에 기술된 바와 같이, GG-MA는 '어느 정도의 생체-접착력'을 가지므로, GG-MA 하이드로겔은 습윤 환경에서 생물학적 조직 또는 표면에 효율적으로 부착하기 어렵고, 스트레스 적용시에 제자리에 머물지 않을 것이다. 또한, 메타크릴레이트 치환기의 그래프트(grafting)는 젤란 검 하이드로겔과 관련된 높은 친수성 문제를 다루지 않으며, GG-MA 하이드로겔은 또한 장기간의 기능적 행동 및 부착 의존성 세포에 의한 ECM 생산에 가장 적합한 환경을 제공하지 못한다. 마지막으로, 체내에서 이식될 때 3D-매트릭스 내의 1가 양이온에 의한 2가 양이온의 교환으로 인해 시간에 따른 기계적 강도의 손실에 대한 우려가 계속된다.
최근, 표면-접착성 생체물질의 개발은 생체모방 접근법에 초점을 맞추고 있다. 해양 홍합은 암석 표면과 직접 접촉하는 접착 패드의 말단부에 접착성 단백질이 생성되기 때문에, 바다 파도에 의한 끊임없는 공격에도 불구하고 젖고 미끄러운 암석 표면에 대해 인상적인 접착력을 보여준다. 접착 패드를 홍합에 연결하는 족사(Byssal threads)는 카테콜아민 약물분자구조(catecholamine pharmacophore)를 함유하는, L-DOPA(3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌)로 알려진 증가된 양의 아미노산을 함유한다. 카테콜(catechol) 작용기(1,2-디하이드록시페닐)는 카테콜기를 올쏘-퀴논으로 산화시키는 메커니즘을 통해 부착을 매개하는데, 이는 적정한 알칼리성의 해수 pH에 의해 촉진되는 과정이다. 이어서, 해수에 많이 존재하는 3가 금속 이온(주로 Fe3+)에 대한 올쏘-퀴논 모이어티의 배위를 수반하는 이온성-가교결합은 단백질 네트워크로 구성된 끈적끈적한, 방수 접착제의 형성을 유도한다. 카테콜 작용기와 3가 철 이온 사이의 이온 배위 결합의 세기는 현저하게 강하다. 일부 트리스- 및 비스-카테콜-Fe3+ 복합체는 공지된 금속-리간드 킬레이트 중 가장 높은 안정도 상수(stability constant)를 가지며 많은 경우 금속 이온-카테콜 복합체를 파괴시키는데에 필요한 힘은 공유 결합의 힘과 거의 유사하다.
따라서 천연 접착 메카니즘을 모방한다는 전제가 세포 캡슐화에 사용되는 하이드로겔의 접착 성질을 향상시키기 위한 목적으로 다수의 천연 고분자로 연구되어왔다. 다른 것들 중에서, 키토산(Ryu, 2015), 알지네이트(Lee, 2013), 폴리에틸렌 글리콜(PEG)(Barrett, 2013) 및 히알루론산(Shin, 2015) 및 이들의 혼합물에 대해 조정가능한 물리적 및 기계적 특성을 갖는 카테콜-결합 고분자가 기술되어 왔다. 세포 생존율 데이터는 카테콜-결합 알기네이트 하이드로겔(catechol-conjugated alginate hydrogels)[Huh-7, Neuro-2A, 인간 제대정맥혈관 내피 세포(HUVEC, human umbilical vein endothelial cells), 인간 지방 유래 줄기 세포(hASC, human adipose derived stem cell) 및 인간 신경 줄기 세포(hNSC, human neural stem cells) 및 카테콜-결합 히알루론산(인간 간세포)에서 캡슐화된 다양한 세포 유형에 대해 보고되었지만, 비교적 짧은 배양 기간(각각, 최대 14일 및 7일)에 대해서만 보고되었다. 그러나, 카테콜 작용기의 과요오드산 나트륨 산화를 포함하는, 금속 양이온과의 이온성-가교결합이 발생하기 전에 두 고분자-카테콜 결합의 추가 화학 공정 단계가 필요했다. 이러한 추가적인 합성 처리 단계의 불편함 외에도, 이렇게 형성된 하이드로겔은 생성된 올쏘-퀴논의 형성 및 중합으로 인해 매우 많이 착색되었다(갈색-흑색). 바람직하게는, 조직 공학 및 재생 의학 분야에서 체외 세포 배양액, 조직 바이오-접착제 또는 세포 전달 매트릭스로서 사용하기 위해, 투명의 무색 하이드로겔이 바람직하며 이는 생체물질 및 세포 현탁액 성분 혼합시 매트릭스 내의 균질한 세포 분산을 시각적으로 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 이미징 및 생화학적 분석에 의한 생물학적 결과 모니터링을 용이하게 한다. PEG-카테콜 결합체의 경우, 하이드로겔은 3가 철이온(Fe3+)으로만 형성되고, pH가 형성된 하이드로 겔의 기계적 특성에 상당한 영향을 미쳤다.
강하게 전자를 끄는 니트로기의 추가 결합 및 특정한 하이드로겔의 가교결합 및 바이오-접착 특성에 대한 니트로기 치환의 효과에 의한 고분자-카테콜 결합체의 카테콜 고리의 기능화가 보고되었다(Shafiq, 2012; Cencer, 2015 and Ding, 2015).
AU2011381641 B2는 지혈 효과를 갖는 바이오-접착제로서 티올기(thiol group)를 함유하는 폴록사머(poloxamer)를 갖는 조성물에 포함되는 카테콜기-결합된 키토산의 제조를 개시하고 있다.
EP2784101 A1은 바이오-접착 특성을 갖는 하이드록시페닐 관능화된 폴리(에스터 아마이드)를 개시한다.
US8968716 B2는 조직 접착제로서 사용하기 위해, 효소 반응을 통해 제자리에서 하이드로겔을 형성하는 카테콜-개질된 고분자를 개시한다.
WO2015175655A1은 조직 접착제 또는 오염방지 코팅제로서의 카테콜 개질된 고분자를 개시한다.
WO2013/123946은 자기-치유, pH-반응성 카테콜-개질된 고분자 및 겔 조성물을 개시한다. 기계적 특성에 대한 선택적 조정이 요구되었지만, 유리한 세포 캡슐화 특성 또는 생물학적 반응에 대한 세부사항은 밝혀지지 않았다.
문헌으로부터, 현존하는 생체물질은 체외 세포 배양 및 조직 공학 및 재생 의학 응용분야 모두에서 물리화학적 및/또는 생물학적 한계를 나타낸다. 이러한 목적을 위해 개선된 생체물질의 설계는 여러가지 요소를 고려해야 한다. (i) 일관된 품질에 관한 재현성 (ii) 하이드로겔 전구체는 생리학적 온도 또는 그 이하의 관련 농도에서 신속한 용해를 촉진하는 상당한 수용성이 부여되어야 하며, (iii) 하이드로겔 전구체는 분자에 가교결합 기능성을 도입하기 위한 추가의 중간단계의 화학적 또는 제조 단계가 필요없이 기계적으로 안정한, 조직 또는 표면-접착성 및 실질적으로 무색의 하이드로겔을 형성할 수 있어야 하고 (iv) 이온성-가교결합은 약학적으로 허용가능하고 생리학적으로 관련이 있는 1가, 2가 및 3가 금속 이온의 넓은 범위에서 가능해야 한다. 마지막으로, 가장 바람직한 하이드로겔 시스템은 캡슐화된 세포의 생존력 및 장기간 생체분자의 기능을 유지하고 건강한 세포 외 매트릭스 마커(markers)의 발현의 상향-조절을 촉진할 수 있어야 한다.
이러한 사실은 본 명세서에 의해 다루어지는 기술적 문제를 예시하기 위해 개시된다.
본 발명은 1가, 2가 및/또는 3가 금속 이온을 킬레이트화하여 하이드로겔을 형성할 수 있는 페놀기 또는 카테콜기 또는 그 등배전자체(isostere)로 개질된 젤란 검을 포함하는 신규한 젤란 검-기반 물질을 제공한다. 이러한 젤란 검 하이드로겔에는 조직 공학 및 재생 의학 분야에서 체외 세포 배양 및/또는 포유동물 세포 및/또는 생분자의 캡슐화 및 체내 전달/유지를 위한 개선된 물리화학적 및 생물학적 특성이 부여된다. 개질된 젤란 검 하이드로겔은 장시간 배양시 포유동물 세포를 생존가능하게 유지하고 건강한 세포외 매트릭스 마커 및 조직 재생의 발현의 상향-조절을 촉진하면서, 제형 및 주사의 용이성, 신속한 용해, 다중 이온성-가교결합 모드, 시간에 따른 기계적 특성 유지 및 제자리에서 접착력 증가를 포함한, 현재 하이드로겔 시스템과 전통적으로 관련된 한계를 극복한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 개질된 젤란 검 아실화도(acylation degree)는 둘 다 동일한 글루코스 잔기 상에 위치하는, 아실기 없는 것(저-아실)부터 최대 2개의 아실 치환기(고-아실), 즉 아세테이트 및 글리세레이트, 보다 바람직하게는 반복 단위 당 하나의 글리세레이트 치환기 및 2개의 반복 단위 당 하나의 아세테이트 치환기이다. 바람직하게는, 젤란 검은 5 % 미만의 아실 그룹에서부터 아실 그룹을 함유하지 않는 것까지를 포함한다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 상업용 젤란 검(GGc)은 본 명세서에 기재된 개질된 젤란 검 하이드로겔의 제조를 위한 출발 물질로서 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 상업용 젤란 검은 저-아실 젤란 검이다. 더욱 바람직한 구체예에서, 하이드로겔 전구체 물질은 정제된 젤란 검(GGp)을 출발 물질로 사용하여 제조된다(Doner, 1997). 상업용 젤란 검은 2가 양이온 불순물뿐만 아니라 산 형태의 적절한 이온 교환 수지로, 젤란 검을 중간 유리(free) 카복실산 형태로 전환시켜, 제거할 수 있는 무기 재(ash)를 함유한다. 수성 소듐 수산화물, 포타슘 수산화물 또는 리튬 수산화물과 같은, 희석된 수성 알칼리 금속 수산화물 수용액을 사용하여 젤란 검의 중간체의 유리 카복실산 형태를 처리하면 실온에서 최대 5 % w/V의 농도까지 상당히 물에 녹는 1가 알칼리 금속 염 형태의 젤란 검에 상응하는 형태가 형성되며, 이는 수성 조건 하에서 합성 유기 화학을 통한 추가의 구조적 조작에 보다 적합한 고분자의 형태를 형성한다. 정제된 젤란 검은 2가 및 3가 양이온의 존재하에 하이드로겔을 형성하지만, 단지 1가 이온의 존재 하에서는 기계적으로 안정한 하이드로겔을 형성하지 못한다. 따라서 생물학적 연구에서 대조군으로 사용된 정제된 젤란 검 하이드로겔은 2가 양이온 Ca2+ 및 Mg2+ 를 가교결합제로서 사용하여 제조되었다.
또는, 중간 유리 카복실산 형태의 젤란 검을 수산화 암모늄 또는 수산화 테트라알킬암모늄으로 처리하여 상응하는 암모늄 염 형태의 젤란 검을 형성할 수 있다. 상기 염은 다른 것들 중에서 N, N-디메틸포름아미드, N, N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리디논 및 DMSO와 같은 극성 유기 용매에서 가용성인 장점을 가지며, 이는 이러한 암모늄염 형태의 고분자를 비-수성 조건 하에서 합성 유기 화학을 통한 추가의 구조 조작에 보다 적합하게 만든다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 정제된 젤란 검 출발 물질의 분자량을 변화시킴으로써, 물리화학적 및 기계적 특성을 제어하고, 개질된 젤란 검의 가교결합 운동을 조절할 수 있도록 100 KDa 내지 2500 KDa 범위의 분자량 범위로 개질된 젤란 검을 수득할 수 있다. 젤란 검의 분자량을 감소시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 특허 US6242035는 균질화, 초음파처리, 방사선, 산화 및 가수분해를 포함하는, 젤란 검의 분자량을 감소시키는 몇 가지 방법을 기재하고 있다. 산에 의해 촉매화되는 가수분해는 다당류-기반 고분자의 분자량을 감소시키는데에 사용되는 특히 잘 알려진 기술이다. 보다 극단적인 가수분해 조건 하에서, 다당류는 올리고당 및 구성 당질로 분해될 수 있다. 다른 것들 중에서 황산, 염산, 아세트산 및 트리플루오로아세트산과 같은 유기 및 무기산을, 상이한 농도 및 반응 온도에서 사용함으로써, 분자량 범위의 젤란 검을 얻는 것이 가능하다. 대안적으로, 젤란 검의 분자량은 과요오드산 나트륨, 과산화물 또는 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-N-옥실(TEMPO)과 같은 산화제를 사용하여 고분자 중추의 화학적 절단을 통해 감소될 수 있다. 과요오드산나트륨에 의한 겔란 산화는 특히 분자량이 감소된 젤란 검의 범위를 얻는데에 효과적이다(Gong, 2009). 또는, 바실러스 속(Bacillus sp.) GL1 박테리아로부터의 세포외 젤란 리아제(gellan lyase)에 기초한 효소적 방법은 젤란 검의 분자량을 감소시키기 위해 사용될 수 있다(Hashimoto, 1999).
본 발명의 바람직한 구체예에서, 개질된 젤란 검은 100 내지 2500 KDa, 보다 바람직하게는 500 내지 2500 KDa 그리고 보다 더욱 바람직하게는 1000 내지 2500 KDa의 분자량을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 1가, 2가 및/또는 3가 이온을 킬레이트할 수 있는 젤란 검에 결합된 유닛은 페놀 또는 카테콜 유닛 또는 이의 등배전자체이다. 페놀기는 하나의 하이드록실기를 함유하는 카보사이클릭 방향족 고리이고 카테콜은 두 개의 인접한 하이드록실기를 함유하는 카보사이클릭 방향족 고리이다. 바람직하다면, 페놀 또는 카테콜 유닛은 방향족 고리상에서 하나 이상의, 또는 하기 그룹의 조합에 의해 추가로 치환될 수 있다: C1-C6 저급 알킬기(메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, 펜틸 및 헥실); 하이드록실, 나이트로, 시아노, 트라이플루오로메틸 또는 할로겐기(불소, 염소, 브롬, 요오드); 저급 알콕시기 -OR1(상기 R1은 상기 정의된 바와 같은 C1-C6 저급 알킬기를 의미한다); -C(O)-R2기(상기 R2는 수소 또는 상기 정의된 C1-C6 저급 알킬기를 의미한다); -C(O)-OR3기(상기 R3는 수소 또는 상기 정의된 C1-C6 저급 알킬기를 의미한다); -C(O)NR4R5기(상기 R4 및 R5는 수소 또는 상기 정의된 C1-C6 저급 알킬기를 의미한다) 또는 -SO2R6기(상기 R6는 수소 또는 상기 정의된 C1-C6 저급 알킬기를 의미한다).
본 발명의 하나의 구체예에서, 페놀 또는 카테콜 유닛은 산소 또는 선택적으로 치환된 질소일 수 있는, 헤테로원자를 통해 또는 헤테로원자 및 스페이서(spacer) 또는 링커 그룹(linker group)을 통해 직접 젤란 검에 공유결합 될 수 있다. 링커 그룹의 적합한 예는 산소 또는 선택적으로 치환된 질소일 수 있는, 헤테로원자를 통해 젤란 검의 카복실산 작용기에 연결된, C1-C18 저급 알킬기(메틸 내지 옥타데실)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하다면, C1-C18 알킬 링커 그룹은 선형 또는 분지형일 수 있고, 선택적으로 추가로 치환될 수 있으며 선택적으로 질소, 산소 또는 황으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, C1-C18 링커 그룹은 선택적으로 불포화 탄소-탄소 결합을 함유할 수 있다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 페놀 또는 카테콜 유닛은 아마이드 질소 헤테로원자 및 에틸기 링커(-NH(CH2)2-카테콜 또는 페놀)를 통해 카복실산 작용기 젤란 검에 공유결합된다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 1가, 2가 및 3가 금속 양이온을 킬레이트할 수 있는 잘 알려진 카테콜 등배전자체의 예는 직교 케톤, 아미노, 또는 하이드록실 작용기를 함유하는 포화 또는 불포화 지방족, 카복실기 또는 헤테로사이클기, 예를 들어 트로폴론(tropolones), 퀴놀리논(quinolinones), 피론(pyrones), 피리디논(pyridinones) 및 피리미돈(pyrimidones)을 포함한다. 다른 가능한 카테콜 등배전자체는 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 카테콜 등배전자체는 3-하이드록시-4-피리디논 또는 5-하이드록시피리미돈-4(3H)-온을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 페놀 또는 카테콜 유닛 또는 이들의 등배전자체를 함유하는 개질된 젤란 검은 Na+, K+, Li+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+, Sr2+, Ba2+, Co2+, Mn2+, Ni2+, Sn2+, Zn2+, Fe3+, Al3+, Ga3+ 및 Ti3+ 이온을 포함하는, 하나 이상의 1가, 2가 및/또는 3가 금속 이온, 또는 이들의 혼합물의 존재하에 이온성-가교결합을 겪을 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 페놀 또는 카테콜 유닛을 함유하는 개질된 젤란 검은, 예를 들어 겨자무과산화효소 및 과산화수소의 존재하에, 효소의 가교결합을 겪을 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 본 명세서에 기재된 개질된 젤란 검은 0.01-5 % w/V, 더욱 바람직하게는 1-3 % w/V의 농도에서 실온 또는 생리학적 온도(15-37 ℃)에서 물, 또는 다른 생리학적으로 허용가능한 비히클(vehicle)에 완전히 가용성이다. 보다 더욱 바람직하게는, 개질된 젤란 검은 실온에서 30분 이하의 시간 동안 물 또는 생리학적으로 허용가능한 비히클에 가용성이다. 개질된 젤란 검 용액은 다양한 니들 게이지(needle gauge)(7-34)를 통한 주사에 더 적합한 점도를 가지고 있다.
본 발명은 화학식 I에 따른 조성물을 갖는 개질된 젤란 검의 이온성-가교결합 또는 효소 가교결합에 의해 제조될 수 있는 하이드로겔로부터의 개질된 젤란 검에 관한 것이다:
Figure 112022079117227-pat00001
화학식 I
상기에서
n은 1-4000, 바람직하게는 50-4000, 보다 바람직하게는 500-4000의 정수이고,
A는 -O-R7 또는 -N-R7R8기(상기 R7은 화학식 II에 따른 기를 의미한다)를 의미하고:
-(CH2)g-B
화학식 II
상기에서
g는 0 내지 18의 정수이고
B는 하나 이상의, 하기 그룹과 동일하거나 또는 하기 그룹의 조합에 의해 방향족 고리상에서 선택적으로 치환된 페놀기 또는 카테콜기를 나타낸다: C1-C6 알킬기(메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, 이소펜틸, 이소헥 실); 하이드록실, 나이트로, 시아노, 트라이플루오로메틸 또는 할로겐기(불소, 염소, 브롬, 요오드); 알콕시기 -OR1(여기서 R1은 상기 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬기를 의미한다); -C(O)-R2기(여기서 R2는 수소 또는 상기 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬기를 의미한다); -C(O)-OR3기(여기서 R3는 수소 또는 상기 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬기를 의미한다); -C(O)NR4R5(여기서 R4 및 R5는 수소 또는 상기 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬기를 의미한다) 또는 -SO2R6기(여기서 R6은 수소 또는 상기 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬기를 의미한다); 또는 B는 3-하이드록시-4-피리디논 또는 5-하이드록시피리미돈-4(3H)-온기를 나타내고; 그리고 R8은 수소 또는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 이소펜틸 또는 헥실로부터 선택된 C1-C6 알킬기를 의미한다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 화학식 III에 따른 조성물을 갖는 개질된 젤란 검을 이온성-가교결합 또는 효소 가교결합시켜 하이드로 겔을 제조할 수 있는 개질된 젤란 검에 관한 것이고;
Figure 112022079117227-pat00002
화학식 III
상기에서
n은 1-4000, 바람직하게는 50 내지 4000, 보다 바람직하게는 500 내지 4000의 정수이고,
그리고 R9, R10, R11 및 R12는 동일하거나 상이하고, 수소, 하이드록실, C1-C6 알킬기(메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 이소부틸, 이소펜틸, 이소헥실); 나이트로, 시아노, 트라이플루오로메틸 또는 할로겐기(불소, 염소, 브롬, 요오드); 알콕시기 -OR1(여기서 R1은 상기 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬기를 의미함); -C(O)-R2기(여기서 R2는 수소 또는 상기 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬기를 의미함); -C(O)-OR3기(여기서 R3는 수소 또는 상기 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬기를 의미함); -C(O)NR4R5기(여기서 R4 및 R5는 상기 정의된 바와 같은 수소 또는 C1-C6 알킬기를 의미함) 또는 -SO2R6기(여기서 R6는 수소 또는 상기 정의된 바와 같은 C1-C6 알킬기를 의미함)를 의미한다.
본 발명의 보다 더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명은 화학식 IV에 따른 조성물을 갖는 젤란 검을 이온성-가교결합 또는 효소 가교결합시켜 하이드로겔을 제조할 수 있는 개질된 젤란 검에 관한 것이다;
Figure 112022079117227-pat00003
화학식 IV
상기에서:
n은 1-4000, 바람직하게는 50 내지 4000, 보다 바람직하게는 500 내지 4000의 정수이고,
R11 및 R12는 동일하거나 상이하고 수소, 나이트로, 시아노 또는 할로겐(불소, 염소, 브롬, 요오드)을 의미한다.
본 발명의 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 화학식 V의 조성물을 갖는 개질된 젤란 검을 이온성-가교결합 또는 효소 가교결합시켜 하이드로겔을 제조할 수 있는 개질된 젤란 검에 관한 것이다;
Figure 112022079117227-pat00004
화학식 V
n은 1-4000, 바람직하게는 50 내지 4000, 더욱 바람직하게는 500 내지 4000의 정수이다.
본 발명의 하나의 구체예에서, C1-C6 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 펜틸, 이소펜틸, 헥실 또는 이소헥실로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 할로겐기는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 젤란 검은 효소적으로 가교결합 될 수 있고, 특히 겨자무과산화효소 및 과산화수소에 의해 가교결합 될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 하나의 구체예에서, 본 발명의 젤란 검은 인간 또는 동물용 의약품 또는 체외 세포 배양의 용도 또는 약제로 사용된다. 바람직하게는, 본 발명의 젤란 검은 조직 공학 또는 재생 의학에 된다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 젤란 검은 미세골절, 또는 뼈, 연골 또는 연조직 질병 또는 병변의 치료 또는 요법에 사용된다. 보다 더욱 바람직하게는, 히알린 연골 손상(hyaline cartilage damage), 특히 무릎 연골 손상의 치료 또는 요법에 사용하기 위한 것이다. 보다 더욱 바람직하게는, 본 발명의 젤란 검은 인간 중간엽 줄기 세포의 연골형성 및/또는 골형성 및/또는 지방생성 분화에 사용된다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 하나의 구체예에서, 본 발명의 젤란 검은 인간 간엽 줄기 세포의 연골형성 및/또는 골형성 및/또는 지방생성 분화에 의해 긍정적으로 영향을 받는 질병의 치료 또는 요법에 사용될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 하나의 구체예에서, 본 발명의 젤란 검은 골 치료 및 미세골절에 사용될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 하나의 구체예에서, 본 발명의 젤란 검은 골절의 치료 또는 요법, 골 치료 또는 정골요법 치료 또는 골연골염의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 하나의 구체예에서, 본 발명의 젤란 검은 피부내(intradermal) 및 경피 치료에 사용될 수 있다.
일 구체예에서, 화학식 I, III, IV 및 V에 따른 조성물을 함유하는 개질된 젤란 검은 상업적 젤란 검(GGc) 또는 정제된 젤란 검(GGp)을 당업자에게 공지된 적절한 커플링제의 존재하에 적절하게 치환된 알콜 또는 적절하게 치환된 1차 및 2차 아민과 반응시켜 각각, 산소 또는 질소 친핵체와의 반응을 위한 카복실산의 활성화를 촉진시켜 에스터 및 아마이드를 형성함으로써 제조될 수 있다. 적절한 커플링제는 다른 것들 중에서, 하이드록시벤조트리아졸(HOBt) 또는 N-하이드록시숙신이미드(NHS)와 같은 첨가제를 갖거나 갖지 않는, 다이사이클로헥실카보디이미드(DCC) 또는 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)와 같은 카보다이이미드, 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(다이메틸아미노)-포스포늄 헥사플루오로포스페이트와 같은 포스포늄염, (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트 및 N,N,N’,N’-테트라메틸-O-(벤조트리아졸-1-일)우로늄 테트라플루오로보레이트와 같은 구아니디늄(guanidinium) 및 우라늄염, 및 N-메틸모폴린과 함께 시아누르(cyanuric) 클로라이드 및 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진(CDMT)와 같은 트리아진을 포함한다. 특히 바람직한 커플링제는 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모폴리늄 클로라이드(DTMMCl)를 포함한다. 놀랍게도, DTMMCl이 1차 및 2차 아민의 반응성 유리 염기 형태를 방출하기 위해 트라이에틸아민, 다이아이소프로필아민 또는 DBU와 같은 비-친핵성 염기의 첨가 없이도 정제된 젤란 검과 염 형태의 1차 및 2차 아민(염산염, 브롬화수소산염)의 반응을 위한 커플링제로 사용되는 것을 발견하였다. 이는 특히 도파민과 같은 아민의 경우 중요하고, 유리-염기 형태에서 반응성이 높기 때문에 신속하게 자기-응축되어 강하게 착색된 폴리도파민을 형성하고, 이는 도파민-개질된 젤란 검에 대해 원하지 않은 어두운 색을 부여한다. 도파민 염산염을 사용하는 경우 커플링제로서 DTMMCl을 사용함으로써, 아민 염에 비해 약간의 과량의 첨가 염기를 사용할 필요가 없으며, 개질된 젤란 검은 백색 내지 회백색 분말로서 수득된다.
본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 개질된 젤란 검 및 특히 수용액에서의 적합한 용매를 포함하는 하이드로겔에 관한 것이다. 바람직하게는, 적합한 용매는 물, 세포 배양 배지, 수성 식염수 용액, 또는 이들의 혼합물이다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 본 발명의 젤란 검의 농도는 0.01 % 내지 5 % w/V, 바람직하게는 0.5 % - 5 % w/V, 보다 바람직하게는 0.5 % - 2.5 % w/V, 보다 더 바람직하게는 1.25 % - 2 % w/V일 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 젤란 검 또는 하이드로겔 및 세포, 줄기 세포, 단백질, 생분자, 소분자 활성 물질, 치료제 또는 진단 마커, 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 생체 활성성분을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 세포 또는 줄기 세포는 포유동물 연골세포, 포유동물 중간엽 기질세포/줄기세포, 포유동물 골수 중간엽 줄기세포, 또는 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 조성물은 포유동물 세포 및 이온성 가교결합을 위한 유효량의 양이온을 포함하는 생리학적 이온성 용액을 포함할 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 조성물은 골수 흡인 농축물, 성장 인자 및/또는 항생제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 조성물은 본 발명의 젤란 검 또는 본 발명의 하이드로겔 및 인간 지방질의 중간엽 기질세포/줄기세포를 함유하는 매트릭스를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 세포는 젤란 검, 바람직하게는 자가조직 세포 내에, 캡슐화 될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 성장 인자는 TGF-β1, 골 형성 단백질-2(BMP-2), BMP-7(골 형성 단백질-1[OP-1]으로도 공지됨) 또는 연골-유래 형성 단백질 CDMP-1 및 CDMP-2, 혈소판 용해물, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
조성물은 국소, 직장 및 비경구를 비롯한, 다양한 경로로 투여될 수 있다. 비경구 투여 경로는 동맥-내, 관절-내, 강내, 피내, 림프내, 근육내, 활막내, 정맥내, 및 피하를 포함한다. 직장 경로는 경구 및 위장을 포함한다. 국소 경로는 피부 및 점막에의 도포를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 조성물은 주사가능한 형태 또는 경피 형태, 즉 현장 주사 또는 경피 치료 시스템, 보다 바람직하게는 패치에서 환자에게 전달된다.
본 발명의 또다른 양태는 본 발명의 젤란 검 또는 본 발명의 하이드로겔 또는 본 발명의 조성물을 포함하는 망(mesh), 디스크, 골격, 3차원 구조체, 스트립, 네트, 거즈 또는 멤브레인에 관한 것이다.
본 발명의 젤란 검 또는 본 발명의 하이드로겔, 또는 본 발명의 조성물을 포함하는, 경피 치료 시스템 특히 패치.
본 발명의 젤란 검 또는 본 발명의 하이드로겔, 또는 본 발명의 조성물 및 포유동물 세포를 포함하는 조직 공학, 재생 의학, 또는 시험관 내 세포 배양에 사용하기 위한 키트.
따라서 본 발명의 또다른 양태는 화학식 VI에 따라 정제된 젤란 검을 화학식 HO-R7을 갖는 1차, 2차, 또는 3차 알콜 또는 HN-R7R8을 갖는 1차 아민 또는 2차 아민으로 반응시킴으로써 화학식 I, III, IV, 및 V에 따라 비착색된 개질된 젤란 검을 제조하는 방법을 포함하고;
Figure 112022079117227-pat00005
화학식 VI
상기 화학식 VI에서,
n은 1-4000, 바람직하게는 50 내지 4000, 보다 바람직하게는 500 내지 4000의 정수이고,
M+는 Na+, K+, 및 Li+ 그룹으로부터 선택된 1가 알칼리 금속 이온을 의미하고; 또는 M+는 N+X4기를 의미하고, 상기 X는 수소 또는 C1-C4 알킬기(메틸, 에틸, 프로필, 부틸)를 의미하고, 상기 화학식 HN-R7R8에서, R7 및 R8은 상기 정의된 바와 같고, 그리고 상기 반응은 하나 이상의 커플링제의 존재하에서 그리고 선택적으로 비-친핵성 염기의 존재하에 수행된다.
물, 증류수 또는 멸균수, 또는 N,N-디메틸포름아마이드, N,N-디메틸아세트아마이드, N-메틸피롤리디논 및 디메틸설폭사이드(DMSO)와 같은 극성 유기 용매에서, 또는 2-(N-모폴리노)에테인술폰산(MES) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)의 수용액과 같은 완충된 배지에서, 반응의 pH 조절이 바람직하게 고려된다면, 화학식 I, III 및 IV의 젤란 검 하이드로겔을 얻기 위한 시판되거나 정제된 젤란 검과 알콜 및 아민의 커플링이 수행될 수 있다. 바람직한 경우, 상기 커플링 반응은 물과 하나 또는 선택적으로 그 이상의 극성 유기 용매의 혼합물에서 수행될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 알콜 및 아민과 시판되거나 정제된 젤란 검의 커플링은 비-친핵성 염기의 존재하에 수행될 수 있다. 적절한 비-친핵성 염기는 다른 것들 중에서, 트리에틸아민, 트리부틸아민 및 N,N-다이이소프로필에틸아민(Hunig 염기)과 같은 알킬아민, 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데-7-센(DBU) 및 N-메틸모폴린과 같은 사이클릭 아민, 및 피리딘, 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘, 2,6-디메틸피리딘 및 콜리딘과 같은 방향족 아민을 포함한다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 알콜 및 아민과 젤란 검의 커플링 반응은 0 ℃ 내지 용매의 끓는점, 바람직하게는 10 내지 60 ℃ 그리고 보다 더욱 바람직하게 는 15 내지 40 ℃의 온도에서 수행될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 본 발명의 개질된 젤란 검은 메탄올, 에탄올 또는 아이소프판올과 같은 알콜, 아세톤과 같은 케톤 또는 디에틸 에터 또는 디아이소프로필 에터와 같은 디알킬 에터를 포함하는 1 내지 50 용량의 수혼화성 유기 용매의 첨가에 의한 생성물의 침전에 의해 반응 혼합물로부터 회수되고, 이어서 여과에 의해 상분리 될 수 있다. 원하는 경우, 이와 같이 수득된 개질 젤란 검을 물 및 침전물에서 반복하여 복원하여 추가로 정제할 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 본 발명의 침전된 개질 젤란 검은 물에서 용해될 수 있고 저분자량 오염물질의 확산을 허용하는 적절한 공극 크기를 갖는 셀룰로오스 멤브레인을 사용하여 물에 대한 투석에 의해 정제될 수 있다. 또는, 정제는 예를 들어 상기 오염물질의 통과를 허용하는 적절한 공극 크기를 갖는 셀룰로오스 또는 폴리에터설폰 멤브레인을 사용하여 한외여과(ultrafiltration)를 통해 달성될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 개질 및 정제된 젤란 검을 함유하는 수용액은, 예를 들어 0.22 μm의 병원체가 없는 폴리에터설폰 멤브레인을 통한 여과에 의해, 진공 또는 압력을 적용함으로써, 멸균(박테리아 미생물 및 내독소의 부재) 될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 본 발명의 개질된 젤란 검은 0 내지 -210 ℃, 바람직하게는 -20 내지 -80 ℃의 온도에서 용액을 먼저 냉동시키고, 이어서 동결건조(freeze-drying)를 -40 내지 -90 ℃의 온도에서 진공하에 약 0.01mbar의 압력에서 수행함으로써 분리될 수 있다. 또한, 개질된 젤란 검은 용액의 분무-건조에 의해 분리될 수 있다. 분무-건조 조건을 주의 깊게 선택함으로써, 다양한 입자 크기를 갖는 개질된 젤란 검을 얻을 수 있다. 바람직하게는, 항생제, 의료 재료 및 첨가제와 함께 분무-건조를 사용하여 젤란 검을 캡슐화하거나 재료를 넣을 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 용액 또는 고체 상태의 개질된 젤란 검의 멸균 방법은 다른 것들 중에서, 습한 또는 건조한 열, 에틸렌 옥사이드에의 노출, 적절한 압력 및 온도에서, 선택적으로 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올을 포함하는 알콜과 같은 공-용매, 또는 과산화수소 또는 과산화산과 같은 과산화물의 존재 하에서 이산화탄소와 같은 초임계 유체와의 접촉, 또는 UV 또는 감마선-조사를 포함한다.
이와 같이하여 수득된 개질 젤란 검은 핵자기공명(NMR) 분광법과 같은 분석 기술에 의해 구조가 특징지어질 수 있다. 이 기술은 또한 선택된 참조 피크의 적분에 기초한 수학 방정식의 적용에 의해, 이온-킬레이트화 페놀 및 카테콜 치환체에 의해 개질된 젤란 검의 치환 정도를 결정하는데에 사용될 수 있다(Hamcerencu, 2008).
본 발명의 하나의 구체예에서, 적절한 반응 온도, 시약의 화학양론 및 반응 시간의 선택에 의해, 젤란 검의 상이한 치환도를 얻을 수 있고, 이에 따라 특정한 분야에 대해 개질된 젤란 검의 물리화학적, 기계적 및 생물학적 특성을 조절할 수 있다. 바람직하게는, 젤란 검의 치환도는 0.01-30 %, 보다 바람직하게는 0.1-20 % 그리고 가장 바람직하게는 0.5-15 %이다. 이전 단락에서 언급했듯이, 치환도는 젤란 검의 에스터 유도체에 대한 문헌에 보고된 방정식을 사용하여 계산될 수 있다(Hamcerencu, 2008, 2.4장에 기술된 NMR 분광법에 의함).
본 발명의 더 나은 결과를 위한 하나의 구체예에서, 본 발명의 개질된 젤란 검은 대기 및 생리학적(37 ℃) 및 실온(20 ℃) 이하에서 안정한 물질이고, 이는 분말, 수성 용액, 또는 주사용 멸균수, 식염수 또는 인산염 완충 식염수 등과 같은 약학적으로 허용가능한 비히클 내의 멸균 주사 용액의 형태로 조성물에 제공될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 본 발명에 개시된 개질된 젤란 검은 바람직하게는 3 미만 그리고 보다 바람직하게는 2.5 미만의, 낮은 다분산도 지수(Mw/Mn)를 갖는다. 다분산도 지수는 겔 투과 또는 사이즈-배제 크로마토그래피에 의해 결정될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 굴절률 검출기(RI-Detector 8110, Bischoff)를 사용하여, 일반적으로 4개의 기둥 세트에 직각 산란 및 점도계 검출기가 장착된, Malvern Viscotek TDA 305 굴절계를 사용할 수 있다. 이 시스템은 30 ℃에서 보관될 수 있고 MilliQ 물 또는 기타 적절한 용매가 약 1 mL/min의 유속에서 용리액으로 사용된다. 용리 시간 및 RI 검출기 신호는 좁은 다분산도 및 180 Da 내지 708 KDa 범위의 Mp(최대 피크에서의 분자량)의 표준치를 갖는 시판용 다당류 세트로 측정될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 하나의 구체예에서, 본 발명의 개질된 젤란 검은 시험관내 및 체내 응용을 위한 무세포 또는 세포계로 사용될 수 있고, 컴퓨터 보조 시스템을 사용하여 수동 또는 자동으로 분배될 수 있고, 주사와 같은 최소 침습적인 절차에 의해 인간/동물의 몸에 전달될 수 있고, 생리학적으로 적절한 양이온에 의해 원하는 작용 부위에서 직접, 또는 다른 대안으로 약학적으로 허용가능한 양이온 첨가제에 의해 조제를 위해 이온적으로 가교결합된다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 하나의 구체예에서, 본 발명의 개질된 젤란 검은 부위-특이적 전달 및 보유를 위해 약학적으로 허용가능한 양으로 생물학적 활성제 또는 치료제와 혼합될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 생물학적 또는 치료학적 제제는 세포, 줄기 세포, 단백질, 진단 마커 또는 소분자 활성 물질, 또는 이들의 혼합물이다. 생물학적 또는 치료학적 제제가 세포인 경우, 세포는 자가조직(autologous) 또는 동종이계(allogeneic)일 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 하나의 구체예에서, 세포는 연골 형성 세포와 관련될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 세포는 다능성 또는 다분화성 줄기세포와 관련된다. 보다 바람직한 구체예에서, 세포는 성체 간엽 기질/줄기세포와 관련된다. 바람직한 구체예에서, 세포는 골수 또는 지방 조직으로부터 얻어지고, 이는 환자로부터 분리 직후 사용되거나, 또는 Master Cell Bank 또는 Working Cell Bank로부터 얻을 수 있다. 이 경우 상기 세포의 기증자는 연령, 체질량 지수, 혈액매개 병원균의 부재, 임의의 특정 의학적 상태의 존재/부재와 같은 관련 인자에 관한 자격이 있어야 한다. 바람직한 구체예에서, 세포는 무균성, 생존력, 및 간엽 기질/줄기세포 마커의 발현에 대해 자격이 있어야 한다. 보다 바람직한 구체예에서, 연골 간세포(幹細胞)의 부분집단은 CD73, CD106, CD271, CD29, SOX-9, dlk1/FA1, CD44 및 CD151 마커를 발현하는 세포와 같은 초기 간질/줄기세포로부터 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직한 구체예에서, 세포는 1 내지 10, 바람직하게는 2 내지 5의 통로에서 사용되는, 필요한 수의 세포에 도달하도록 이종(xeno) 없는 세포 배양 배지에서 확장된다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 본 발명의 개질된 젤란 검은 연골세포를 단독으로 또는 중간엽 기질/줄기세포와 조합하여 연골세포와 혼합될 수 있다. 또는, 개질된 젤란 검은 배아줄기세포, 태아줄기세포, 성체줄기세포, 양막줄기세포, 유도만능줄기세포, 성상세포, 뵈트허(boettcher)세포, 맥락막망세포, 상피 세포, 클라우디스(claudis)세포, 원주세포, 원뿔체 광수용체세포, 암세포, 도관세포, 표피세포, 상피세포, 선세포, 유모세포, 유리체세포, 치간세포, 케라티노사이트, 렌즈섬유세포, 광세포, 메르켈세포, 뮐러세포, 근상피세포, 뉴런, 희돌기교 세포, 지골세포, 주상세포, 송과체간질세포, 송과체세포, 하수체세포, 뇌하수체 세포, 반월상체세포, 간상세포, 피지선세포, 분비세포, 편평상피세포, 별세포, 맥관선조세포, 지지세포, 띠뇌실막세포, 타입 i 미뢰세포, 전정기관막세포를 포함하는 외배엽 계통의 세포, 선포세포, 알파세포, 은친화세포, 베타세포, 브러쉬보더세포, 선포중심세포, 혐색소세포, 섬모호흡기관세포, 클라라세포, 델타세포, 관세포, 상피세포, 위장관췌장세포, 선세포, 간세포, 산분비세포, 파네스세포, 폐포세포, 주(chief)세포, 폐내분비세포, 분비성폐세포, 흉선상피-망상세포, 흉선세포, 갑상선모낭세포, 효소원세포를 포함하는 내배엽 계열의 세포, 지방성세포, 브러쉬보더(brush border)세포, 접착아세포(cementoblast), 연골파괴세포(chondroclast), 솜털생식(ciliated reproductive)세포(암수(male and female)), 황체세포(corpus luteum cell), 수지상세포(dendritic cell), 관세포(duct cell), 내피세포(endothelial cell), 상피세포(epithelial cell), 적혈구(erythrocyte), 섬유아망상세포(fibroblastic reticular cell), 여포세포(foliicle cell), 샘세포(gland cell), 간세포(interstitial cell), 쿠퍼세포(kupffer cell), 랑게르한스세포(langerhans cell), 백혈구(leukocyte), 라이디히세포(leydig cells), 연안세포(littorial cells), 림프세포(lymphocytes), 대식세포(macrophages), 밀집반세포(macula densa cells), 비만세포(mast cells), 거핵구세포(megakaryocyte cells), 메산쥼세포(mesangial cells), 중피세포(mesothelial cells), 소교세포(microglia), 단백백혈구(monocytes), 용골세포(osteoclasts), 골아세포(osteoblasts), 근육세포(muscle cells), 근섬유모세포(myofibroblasts), 무섬모 세포(non-ciliated cells), 수핵세포(nucleus pulposus cells), 벽세포(parietal cells), 페리극세포(peripolar cells), 플라스마세포(plasma cells), 형질세포양 수지상세포(plasmacytoid dendritic cells), 부고환주세포(epididymis principal cells), 심장전도근육섬유세포(purkinje fibre cells), 분비세포(secretory cells), 장막세포(serosal cells), 세르톨리세포(sertoli cells), 건세포(tenocytes), 고환간세포(testis interstitial cells), 포자낭인터나세포(theca interna cells), 다발층세포(zona fasciculata cells), 글로무스 및 망상 세포(reticularis cells), 족세포(podocytes), 연골세포(chondrocytes), 혈관주위세포(pericytes), 골세포(osteocytes), 섬유아세포(fibroblasts), 활막세포(synovial cells)를 포함하는 중배엽 계열의 세포, 경동맥소체(carotid body) 타입 i 세포, 크롬친화성세포(chromaffin cells), 장의신경교세포(enteric glial cells), 상피세포(epithelial cells), 멜라노사이트(melanocytes), 근상피성세포(myoepithelial cells), 신경세포(neurons), 치아모세포(odontoblasts), 난포방세포(parafollicular cells), 위성세포(satellite cells), 슈반세포(Schwann cells), 작고강렬한형광성세포(small intensely fluorescent cells), 편평상피세포(squamous cells), 경동맥소체 유형 ii 세포 및 분비세포를 포함하는 신경관 계열의 세포, 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 세포와 혼합될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 개질된 젤란 검은 예를 들어 안구, 코, 귀, 설하, 직장, 질 또는 진피 투여와 같은, 국소, 장 또는 비경구 경로를 통한 부위-특이적 전달 및 유지를 위한 약학적으로 허용가능한 양으로 생물학적 활성제 또는 치료제와 혼합되거나, 캡슐화할 수 있고, 전반적인 효능을 향상시키기 위해 물질 및/또는 방출 프로파일의 생체이용률을 향상시키는 수단으로서 사용된다. 이러한 맥락에서 생물학적 또는 치료학적 제제는 생물학적 또는 생리학적 기능을 강화, 개질 또는 유지하기 위한 약물 또는 화장품 제제로서 정의된다. 예를 들어, 생물학적 활성제 또는 치료제는 α-아드레날린 작용제; β-아드레날린 작용제; α-아드레날린 차단제; β-아드레날린 차단제; 알코올 억제제; 알도오스 환원효소 저해제; 알도스테론 길항제; 아미노산; 아나볼릭(anabolic); 진통제; 마취제; 거식증 환자, 제산제; 구충제; 항여드름제; 항알레르기제; 항안드로겐제; 항협십증제; 항불안제; 항부정맥제; 항천식제; 항균제 및 항생제; 탈모방지제 및 항탈모제; 항아메바성; 항체; 항콜린제; 항응고제 및 혈액희석제; 항결장제; 항경련제 및 항간질제; 항담낭제; 항우울제; 항당뇨병제; 설사약; 항이뇨제; 해독제; 항구토제; 항여포호르몬; 항팽만제; 항진균제; 항원; 항내녹장약제; 항히스타민제; 항활동항진제; 항갑상선항진제; 항고지질단백혈증제; 혈압강하제; 저혈압약; 항감염약; 소염제(스테로이드성 및 비스테로이드성); 말라리아예방약; 항편두통제; 항종양약; 비만증치료제; 항파킨슨병제; 항이상운동제; 폐렴약; 항원충제; 항소양제; 건선치료제; 항정신병약; 해열제; 항류머티즘약; 항분비제; 항쇼크약물; 진경제; 항혈전제; 항종양약제; 진해제; 항궤양제; 항바이러스제; 항불안제; 살균소; 골압축강화기; 기관지확장제; 칼슘통로차단제; 탄산 탈수효소 억제제; 강심제 및 심장자극제; 화학요법제; 담즙분비촉진제; 콜린성제제; 만성 피로 증후군 약물; CNS 자극제 및 억제제; 응고제; 피임제; 낭포성 섬유증 약물; 충혈제거약; 이뇨제; 도파민 수용체 길항 물질; 길항제; 효소, 에스트로겐; 거담제; 위 과다활동 약물; 글루코코르티코이드(glucocorticoids); 지혈제; HMG CoA 환원효소 억제제; 호르몬; 진정제; 면역조절물질; 면역억제제; 완하제; 구강 및 치주 질환에 대한 약제; 축동약; 모노아민 산화효소 억제제; 점액용해제; 다발성 경화증 약물; 근이완제; 동공확대제; 마약대항제; NMDA 수용체 길항제; 올리고핵산염; 안과용 약물, 자궁수축제; 펩타이드, 폴리펩타이드; 단백질; 다당류; 프로제스토젠; 프로스타글란딘; 단백질분해효소억제제; 호흡자극제; 진정제; 세로토닌 섭취 저해제; 성호르몬; 금연 약물; 평활근 이완제 및 자극제; 스테로이드; 혈전용해제; 정신안정제; 비뇨산미제; 요실금 약물; 혈관확장제; 혈관 예방보호제; 피부보호제 및 자외선차단제, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 개질된 젤란 검은 하이드로겔, 다공성 지지체, 섬유, 3차원 구조체, 미세입자, 나노입자, 캡슐, 멤브레인, 네트, 거즈 또는 디스크와 같은, 상이한 유형의 지지체를 형성하기 위해 수동 또는 자동화된 공정 및 시스템을 사용하여 처리될 수 있다. 또다른 바람직한 구체예에서, 개질된 젤란 검은 개선된 점막접착 성질을 갖는 분무가능한 겔을 형성하도록 가공될 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 개질된 젤란 검 하이드로겔은 제2의 개질된 또는 비-개질된 젤란 검을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 더 나은 결과를 위한 구체예에서, 본 발명에 기재된 개질된 젤란 검 하이드로겔은 조직 충전제 또는 패치와 같은 독립형 의료 장치로서 사용될 수 있다. 바람직한 구체예 및 예로서, 개질된 젤란 검 하이드로겔은 미세골절(MFX)의 컨텍스트에서 지지체 확대를 위해 사용되는 다른 물질보다 개선된 의료 장치로서 사용될 수 있다. 1980년대에 개발된 MFX는 비교적 작고, 증상이 있는 연골 손상에 대한 가장 중요한 관절경 검사의 치료 방법이 되었다. 요컨대, 미세골절 중에, 연골 결손 내 연하골 플레이트가 키르쉬너선(Kirschner wire)의 천공 또는 사용에 의해, 관통하여 출혈을 일으키고 결손 부위를 채우고 노출된 뼈 표면을 덮는, 피브린 응고가 형성된다. 그 다음으로 다능성, 골수-유래 중간엽 줄기세포는 응고물에 침투하여 수복 조직 형성을 촉진한다. 불행하게도, 수복 조직은 주로 섬유연골성 연골로 구성되어 있고, 정상적이고, 건강한 유리-형 연골보다 질이 낮은 생화학적 및 생체역학적 특성을 가지고 있다. 더욱이, 이 절차의 임상적 효능은 대개 피브린 응고가 손상 부위로부터 단순히 분리되어, 가져가거나 방출된 골수 줄기세포의 누출을 허용하기 때문에, 매우 다양하다.
따라서, 콜라겐 II형 및 프로테오글리칸 함량의 증가된 형성을 촉진할 가능성이 더 있는 병변 부위 내 환경을 제공함으로써 히알린-유사 조직의 보다 효과적인 재생성을 개선하는 노력이 집중되어왔다. 따라서 천연 또는 합성 고분자를 기반으로 한 지지체 임플란트는, 건강한 연골의 인접한 주변 영역과 수복 조직의 통합을 돕는 동시에, 결함 내에서 피브린 응고를 유지하고, 골수 줄기세포의 접착과 이동을 촉진하는 목적으로, MFX 절차를 증가시키는 의료 장치(표 1)로 사용되도록 제안되었다.
Figure 112022079117227-pat00006
그럼에도 불구하고, 표 1에 제시된 모든 의료 장치는 여러 단점을 나타낸다. 첫째, 후자의 세가지는 환자의 사망률과 복잡한 수술-후 회복 과정을 일으키는, 인공 관절의 완전 노출을 포함하는 관절절개술 절차를 필요로 한다. 이상적인 의료 장치는 최소한의 침습적인 절차, 즉 관절경 절차를 통한 주입에 의해 전달되어야 한다. 둘째, MFX 공간에 있는 기존 의료 장치의 대다수는 가능한 프리온 오염 및 감염 문제, 알러지 반응뿐만 아니라 일부 지역의 윤리적 고려사항으로 인해 바람직하지 않은, 동물성 성분을 포함한다. 이상적인 의료 장치는 이종-비함유이고 비-동물성 원천의 재료로 제조될 수 있다. 마지막으로, 가장 중요한 것은, 기존 의료 장치의 대다수가 독자적인 접착 특성이 없기 때문에, 피브린 접착제와 같은 추가 고정 보조제가 필요하다는 것이다. 비-이종-비함유 고려사항 이외에도, 이는 수술 절차의 복잡성의 또다른 단계를 추가한다. 이상적인 의료 장치는 추가 고정을 요구하지 않고 병변 부위 내 위치를 유지할 수 있다.
놀랍게도, 본 발명에 개시된 이종-비함유, 개질된 젤란 검은 이러한 조건을 나타내고 현재의 최첨단 기술의 한계를 극복한다. MFX 절차 중 출혈이 관찰된 직후, 관절경검사 중 주사기로 주사하여 병변 부위에 개질된 젤란 검 제형을 도포하고, 약 10분간 중합할 수 있다. 이 시간 동안, 개질된 젤란 검 하이드로겔은 0.9 % w/V 염화나트륨 용액을 사용하여 수화된 상태로 유지되고, 이의 1가 나트륨 이온은 표면에서 고분자의 이온성 가교결합을 촉진한다. 개질된 젤란 검 하이드로겔의 접착 특성으로 인하여, 더 이상의 고정 보조제는 필요하지 않고 하이드로 겔은 병변 부위의 보다 나은 충진을 제공할 수 있고 또한 병변 내에서 골수 줄기세포를 함유하는 혈전을 유지할 수 있어, 더 높은 품질의 연골 재생 및 주위의 건강한 조직과의 보다 큰 융화를 일으킬 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 개질된 젤란 검 하이드로겔은 당업자에게 공지된 기술에 의해 수득될 수 있는, 자가 골수 흡인 농축물을 캡슐화하는데에 사용될 수 있고, 제제는 동일한 절차를 사용하여 관절경검사로 병변 부위에 전달될 수 있다.
본 발명의 추가의 구체예에서, 개질된 젤란 검 하이드로겔은 단독으로 또는 세포와 함께, 예를 들어 TGF-β1, 골 형성 단백질-2 (BMP-2), BMP-7 (골원성 단백질-1 [OP-1]로도 알려짐) 및 연골-유래의 형태형성 단백질 CDMP-1 및 CDMP-2, 혈소판 용해물 및/또는 항생제와 같은 소분자와 같은, 성장 인자와 추가적으로 섞일 수 있다.
다음의 도면은 설명을 예시하기 위한 바람직한 구체예를 제공하고 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 보여서는 안된다.
도 1은 정제된 젤란 검의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다(D2O, 1 % w/V, 70 ℃).
도 2는 3당량의 도파민으로 개질된 정제된 젤란 검의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다(GG-DOPA3, D2O, 1 % w/V, 70 ℃).
도 3은 6-니트로도파민 헤미설페이트(NITRODOPA, DMSO-d6, 1 % w/V, 70 ℃)의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 1당량의 6-니트로도파민으로 개질된 정제된 젤란 검의 1H NMR 스펙트럼을 나타낸다(GG-NITRODOPA1, D2O, 1 % w/V, 70 ℃).
도 5는 1 % w/V의 농도에서 물 중의 GG-DOPA3 용액의 전단율을 증가시키는 함수로서의 점도 프로파일을 나타낸다.
도 6은 전형적인 다공성 탈수된 무세포 지지체(왼쪽), 재수화된 무세포 지지체(가운데), 및 개질된 젤란 검으로 제조된 하이드로겔(오른쪽)을 나타낸다.
도 7은 가교제로서 전혈을 사용하여 개질된 젤란 검으로부터 제조된 전형적인 하이드로겔을 나타낸다.
도 8은 시간에 따라 수용액에 담그어진 개질된 젤란 검 지지체의 팽창 특성을 나타낸다.
도 9는 시간에 따라 수용액에 담그어진 개질된 젤란 검 지지체의 물 흡수량을 나타낸다.
도 10a는 조건 시험 후에, 직경 8 mm 및 두께 2 mm의 체외 연골 병변 내에서 GG-기반 하이드로겔의 고정을 나타낸다. GGp-DOPA1 및 GGp-DOPA3 하이드로겔의 완전한 고정 및 GGp 및 GG-MA 하이드로겔의 부분만의 고정에 주의한다.
도 10b는 모든 접착 테스트를 순차적으로 통과한 후 GGp-DOPA3 하이드로겔로 채워진 1 및 3-7로 표시된 6개의 결함을 갖는 돼지 관절(가운데 그림)을 나타낸다. X로 표시된 결함은 빈 대조 병변이다.
도 11은 21일 배양 후 GG-기반 제형 내에 살아있는/죽은 캡슐화된 세포의 이미징을 나타낸다. 녹색=살아있음; 빨간색=죽음. 배율=50x.
도 12는 GGp-DOPA1, GGp-DOPA3, GGp 또는 GG-MA 하이드로겔 내의 연골발생 계통으로 분화된 인간 지방성 기질/줄기세포의 유전자 발현을 나타낸다. 결과는 배양 21일 후 세포의 발현 비(d21)로 나타내었고, 배양-전 값(d0)으로 표준화하였다.
본 발명은 실온 및 생리학적 온도(37 ℃)에서 개선된 겔화 및 제형화 특성을 부여하기에 적합한 이온-킬레이팅 페놀 및 카테콜 치환체를 함유하는 개질된 겔란 검을 제공하고, 이는 하이드로겔 내에 캡슐화한 후 장시간 보다 높은 세포 생존력을 유지하고 건강한 세포외 매트릭스 마커의 발현의 상향-조절을 촉진하는, 최소 착색된, 현저한 표면-접착성 하이드로겔을 형성한다.
당업자는 개시된 주제를 가장 잘 설명하기 위해, 본 명세서에서 사용되는 이하의 설명, 및 용어를 이해할 것이고, 그렇게 하도록 선택된 구체예는 본 발명을 개시된 형태로 제한하거나 포괄하려는 것은 아니다. 대안적인 접근법, 균등물 및 조건은 당업자에게 자명할 것이다.
상업용 젤란 검의 정제
상업용 젤란 검(Sigma, 5 g)을 60 ℃로 가열하면서 증류수(500 mL)에 용해시켰다. 용액 pH가 약 2.4로 안정화될 때까지 Amberlyst IR-120(H+ 형) 이온 교환 수지를 30분 동안 첨가하였다. 용액을 60 ℃에서 10분 동안 교반한 후 여과하여 수지를 제거하였다. 여과액에 pH가 8.5가 될 때까지 수산화나트륨 수용액을 첨가하였다. 용액을 에탄올에 붓고, 침전물을 형성시켰다. 실온에서 1시간 동안 교반한 후, 액상을 따라내고 남아있는 침전물을 여과하고, 증류수에 용해시키고 증류수에 대하여 투석하였다. 냉동 및 동결-건조 후, 정제된 젤란 검은 백색 고체 3.2 g으로 수득되었다. 정제된 젤란 검 생성물(도 1)의 1H NMR 스펙트럼은 예상되는 구조와 일치한다.
3당량의 도파민으로 정제된 젤란 검의 개질(GGp-DOPA3)
정제된 젤란 검 100 mg을 실온에서 증류수 10 mL에 용해시켰다. 그 다음 0.124 g의 DTMMCl을 2 mL의 물에 용해시키고 용액에 적가하고, 이를 실온에서 30분 동안 교반하였다. 그 다음, 3몰 당량의 도파민 염산염(DOPA, 85mg)을 2 mL의 물에 용해시키고 용액에 적가하고 이어서 용액을 24시간 동안 교반하였다. 다음날, 용액을 교반하지 않고 에탄올 10 mL를 넣고 1시간 동안 방치하였다. 그 후, 에탄올을 따라내고 잔류하는 침전물을 증류수에 용해시키고 증류수에 대해 5일 동안 투석한 다음, -20 ℃에서 동결시키고 동결-건조하여 생성물(GGp-DOPA3)을 백색 고체 128 mg로서 수득하였다. 생성물의 1H NMR 스펙트럼(도 2)은 도파민에 의해 개질된 젤란 검의 예상 구조와 일치한다. 이 경우의 치환도는 약 4 %로 측정되었다.
정제된 젤란 검 출발 물질에 비해 상기 실시예에서 사용된 활성화제 및 도파민 염산염의 몰 당량을 적절하게 감소시키거나 증가시킴으로써, 치환도가 0.01-30 % 범위인 개량된 젤란 검을 수득할 수 있다. 예를 들어, 상기 개시된 절차를 1 또는 7.5 몰 당량으로 적용하면, 보다 낮은(GGp-DOPA1) 그리고 보다 높은(GGp-DOPA7.5) 치환도(2.1 및 5.6 %)를 갖는 각각의, DOPA-개질된 젤란 검을 수득할 수 있다.
일반적으로 DOPA-개질된 젤란 검은 물 형태로 약 7-10 %의 잔류 수분을 함유하고 있다. 잔류 용매, 금속, 중금속 및 여과할 수 있는 불순물에 대한 시험은 일반적으로 시험 방법의 검출 한계 이하의 분석 수준을 보고한다.
정제된 젤란 검 출발 물질의 분자량을 추가로 변화시킴으로써, 겔-투과 또는 크기-배제 크로마토그래피(GPC-SEC), 폴리머 물질의 평균 분자량(Mw), 평균 분자수(Mn) 및 고유 점도(IV)를 결정하기 위한 표준 기술에 의해 측정된 바와 같이, 다양한 분자량을 갖는 DOPA-개질된 젤란 검을 얻을 수 있다(표 2).
표 II. 분자량이 다른 정제된 젤란 검 출발 물질을 사용하는 GGp-DOPA3의 대표적인 일군(batches)의 분자량.
Batch Mw(KDa) Mn(KDa) Mw/Mn IV(cm3/g)
#1 2080 1170 1.8 3190
#2 1454 673 2.2 2020
#3 2604 1687 1.5 4247
당업자에게 명백한 바와 같이, 동일한 합성 절차를 적용하고 도파민 대신에 적절하게 치환된 알콜(R7-0H) 및 1차/2차 아민(HN-R7R8)을 사용함으로써, 본 발명에서 개시된 모든 범위의 개질된 젤란 검이 제조될 수 있다.
도파민 염산염의 니트로화
증류수(25 mL) 중의 도파민 염산염(1.92 g, 10 mmol)의 교반된 용액에 아질산 나트륨(1.52 g, 22 mmol)을 첨가하고 용액을 빙수 욕에서 냉각시켰다. 거기다, 증류수(10 mL) 중 황산(1 mL)의 용액을 적가하여 반응 혼합물이 짙은 오렌지-레드 외관으로 변하게 하였다. 첨가가 끝날 때 쯤, 황색-오렌지색 침전이 형성되었다. 이어서 혼합물을 실온에서 하룻밤 교반하고, 이어서 여과하고 얼음물, 무수 에탄올 및 이어서 디에틸 에터로 순차적으로 세척하였다. 진공하에 건조시킨 후, 6-니트로도파민 헤미설페이트를 황색 고체로서 수득하였다. 생성물의 1H NMR 스펙트럼(도 3)은 예상되는 구조와 일치한다.
정제된 젤란 검을 6-니트로도파민 1당량으로 개질(GGp-NITRODOPA1)
정제된 젤란 검 500 mg을 증류수(50 mL)에 실온에서 용해시켰다. 그런 다음 0.20 g의 DTMMCl을 증류수(5 mL)에 용해시키고 용액에 적가하여 30분 동안 실온에서 교반하였다. 이어서, 1몰 당량의 6-니트로도파민 헤미설페이트(NITRODOPA, 220 mg)를 N,N-디메틸아세트아마이드(8 mL)에 용해시키고 용액에 적가하고 이어서 24시간 동안 교반하였다. 다음날, 용액을 500 mL의 에탄올에 붓고 침전물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 침전물을 여과하고, 에탄올로 세척한 후, 증류수(200 mL)에 용해시켰다. 생성물을 증류수로 5일 동안 투석한 후, 동결 및 동결-건조시켜 오렌지-황색 고체로서 생성물(GGp-NITRODOPA1)을 수득하였다. 생성물의 1H NMR 스펙트럼(도 4)은 니트로도파민에 의해 개질된 젤란 검의 예상되는 구조와 일치한다.
상기 실시예에서 사용된 활성화제 및 니트로도파민 헤미설페이트의 몰 당량을 적절하게 감소 또는 증가시킴으로써, 치환도가 0.01-30 %인 개질된 젤란 검을 수득할 수 있다. 예를 들어, 상기 절차를 3몰 당량으로 적용하면, 보다 높은 (GGp-NITRODOPA3) 치환도를 갖는 NITRODOPA-개질된 젤란 검을 수득할 수 있다.
2-클로로도파민 염산염(McCarthy, 1986)와 1-(2'-아미노에틸)-2-메틸-3-하이드록시-4-피리디논 중염산염 (Dobbin, 1993)을 설명한대로 제조하였다. 이들 물질로 상기 기술된 실시예의 절차를 적용하여, 상응하는 개질된 젤란 검 하이드로겔 전구체를 또한 얻었다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 명세서에서 GG-DOPA3로 예시된, 개질된 젤란 검을 5 내지 40 ℃, 바람직하게는 15 내지 37 ℃의 온도, 바람직하게는 1시간 이내에 약한 교반 하에서, 멸균 또는 다른 방법으로, 탈이온수에 용해시키고 유지시킬 수 있다. 또한 또다른 바람직한 구체예에서, 용해 매질은 세포 배양 배지, 인산염 완충액 식염수 또는 염화나트륨 식염수를 포함할 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 용해 시간은 0.5 내지 1시간, 바람직하게는 30분 미만이다.
개질된 젤란 검 용액의 바람직한 농도는 0.01 % 내지 5 % w/V, 보다 바람직하게는 0.1 내지 4 % w/V 및 보다 더 바람직하게는 0.5 내지 3 % w/V이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 개질된 젤란 검 용액은 충분히 이동가능하고 주사기에 의해 주입되기에 적합한 점도를 갖는 전단-박화(shear-thinning) 액체이다(도 5). 개질된 젤란 검 용액의 바람직한 고유 점도는 5 mg/mL의 농도에서 1000-5000 cm3/g, 더 바람직하게는 1500-4500 cm3/g이다(표 2). 개질된 젤란 검 용액은 갇힌 공기가 거의 없고 투명하고 무색이며, 거의 무색 또는 외관의 색이 미약하다. 이러한 용액의 이온 가교결합에 의해 형성된 개질된 젤란 검 하이드로겔은 투명하고 갇힌 공기 기포가 거의 없다.
개질된 젤란 검 하이드로겔 형성
초기 표적 고분자 농도는 1.25 % w/V이다. GGp-DOPA3 12.5 mg을 플라스틱 바이알에 달고 자기 교반 막대를 넣는다. 1 ml의 주사용 멸균수를 첨가한다. 수동으로 그리고 조심히, 습기를 공급하기 위해 바이알의 물이 모든 재료와 접촉하는지 확인한다. 자기 교반을 시작하고 재료가 실온에서 완전히 용해될 때까지 계속한다. 최종 용액은 투명하고 점성이 있다. 이상적인 자기 특성 및 바람직한 자기 교반 속도를 사용하여 기포의 형성을 최소화한다. 필요한 경우, 갇힌 공기 기포가 빠져나올 수 있도록 용액을 그대로 둔다.
용해가 완료되면, 자기 교반을 멈춘다. 고분자 용액(Ca2+/Mg2+를 갖는 8:2 비율의 하이드로겔:PBS)에 인산염완충식염수(Ca2+/Mg2+를 갖는 PBS) 250 μL를 가한다. Ca2+/Mg2+를 갖는 PBS 내의 2가 양이온은 고분자의 이온성 가교결합을 촉진한다. 최종 고분자 농도는 1 % w/V이다. 부드럽게 1분 동안 용액을 소용돌이치게 한다. 그 사이에, 웰 플레이트(well plates)에서, 각 웰의 바닥에 원통형 플라스틱 주형을 둔다. 조심스럽게 주형을 건드리지 않고 가교결합된 고분자 용액의 원하는 부피로 주형을 채운다. 5분 후, 주형을 PBS(Ca2+/Mg2+를 가짐)로 덮는다. 적절한 시간 동안 웰 플레이트를 놓은 다음, 주형을 제거한다. 적절한 시간 동안 PBS 용액(부유 상태)에 겔을 올려놓는다. 웰 플레이트에서 겔을 제거한다(도 6, 오른쪽).
또다른 바람직한 구체예에서, 세포 배양 배지는 PBS 대신에 사용되어 이온성-가교결합을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, Ca2+ 및 Mg2+ 이외의 양이온을 첨가하여 이온 가교결합을 통해 개질된 젤란 검 하이드로겔을 형성시킬 수 있다. Fe2+, Cu2+, Sr2+, Ba2+, Co2+, Mn2+, Ni2+, Sn2+, Zn2+, Fe3+, Al3+, Ga3+ 및 Ti3+ 와 같은, 하나 또는 그 이상의 2가 및 3가 이온, 또는 이들의 혼합물을 염화물 및 황산염 및 이의 수화물과 같은, 약학적으로 허용가능한 염 형태의 제제에, 생리학적으로 적절한 농도로 첨가할 수 있다. 이들 이온의 원자가전자 및 이온 반경이 다르기 때문에, 광범위한 물리화학적 및 기계적 특성을 갖는 개질된 젤란 검 하이드로겔을 얻을 수 있다.
놀랍게도, 젤란 검 및 이전에 보고된 젤란 검의 개질과 대조적으로, 2가 및 3가 양이온 이외의 이온은 본 발명에서 개시된 개질된 젤란 검을 동일한 농도에서 이온성으로 가교결합 시키는데에 사용될 수 있다. 특히, Na+, K+ 및 Li+ 단독 또는 이들의 혼합물과 같은 생리학적으로 관련된 1가 양이온은, 모두 기계적으로 안정한 하이드로겔의 형성을 촉진시킬 수 있다. 이것은 앞서 언급한 바와 같이, 1가 양이온만의 존재 하에서는 하이드로겔을 형성하지 않는, 개질되지 않은 정제된 젤란 검과는 대조적이다. 바람직한 구체예에서, 이온 가교결합은 0.9 % 염화나트륨 용액에 의해 촉진된다.
이러한 발견은 특히 생리학적 유체에 대하여 관련이 있다. 따라서, 개질된 젤란 검 하이드로겔은 인간 또는 동물 전혈 또는 혈장을 가교결합제(도 7)로서 사용하여 수득할 수 있는데 이는 이들이 전해질로서 1가의 양이온이 풍부하기 때문이다. 이러한 양상은 미세골절의 맥락에서 특히 관련이 있다.
또한, 1가 양이온의 존재하에 안정한 하이드로겔을 형성하기 위한 본 발명에 개시된 개질된 젤란 검의 놀라운 능력은 2가 및 1가 양이온의 교환과 관련하여, 젤란 검 및 메타크릴화 검으로 체내에서 시간 경과에 따라 관측된 기계적 안정성 문제를 극복한다. 따라서 본 발명에 개시된 개질된 젤란 검은 젤란 검 및 메타크릴화 젤란 검보다 체내에서 장기간에 걸쳐 기계적 특성을 유지할 수 있다.
개질된 젤란 검 다공성 무세포 지지체
개질된 젤란 검 다공성 무세포 지지체는 하기 대표적인 절차를 적용하여 개질된 젤란 검으로부터 형성될 수 있다.
교반하에 실온에서 GGp-DOPA3(375 mg)를 증류수(30 mL)에 용해시켜 1.25 % w/V 용액을 수득하였다. 다음에, Ca2+ 및 Mg2+ 이온을 함유하는 7.5 mL의 PBS를 플라스틱 디스크의 중앙에 놓고 바로 직후에, GGp-DOPA3 용액을 플라스틱 디스크에 첨가하고 압설자를 사용하여 가교결합 용액과 격렬하게 혼합하였다. 이어서 생성된 혼합물을 30분 내지 1시간 동안 그대로 두었다. 이 기간이 경과한 후에, 디스크의 상부가 완전히 잠길때까지 추가의 PBS 용액을 첨가하였다. 그 다음 디스크를 15분에서 30분 동안 그대로 두었다. 이어서 직경 12 mm의 원통형 펀치로 하이드로겔을 펀칭함으로써 고분자 실린더를 형성시켰다. 이어서 생성된 고분자 실린더를 24 웰플레이트(각 웰에서 하나의 디스크)에 옮기고 PBS로 덮은 다음, PBS를 매 9시간마다 3번씩 변화시켰다. 이어서, 각 웰로부터 과량의 PBS를 제거한 후, 플레이트를 24시간 동안 -80 ℃에서 동결시켰다. 그런 다음 플레이트를 냉동고에서 꺼내어 3일에서 5일 동안 동결건조하여 다공성 탈수된 GGp-DOPA3 지지체를 얻는다(도 6, 왼쪽).
상기 다공성 지지체는 조직 임플란트, 조직 충전제 또는 예를들어 미세골절과 함께 지지체 증가물(scaffold augmentation)로서 사용될 수 있다.
GGp-DOPA3 지지체는 예를 들어 PBS 용액(도 6, 가운데)을 사용하여 재수화되고 무세포 구조물과 같이 사용되거나, 지방 또는 골수 유래 중간엽 기질/줄기세포를 비롯한 다양한 세포 유형의 시험관내 시딩(seeding)에 사용될 수 있고, 따라서 체내 적용을 위한 세포-함유 임플란트를 제공한다.
GGp-DOPA3 지지체의 팽창 특성
9개의 원통형 지지체를 캘리퍼스(caliper)로 측정하고(길이 및 높이) 각각의 지지체를 별도의 플레이트 웰에 놓았다. 각각의 웰을 PBS로 채우고, 1분 후에, 지지체를 용액으로부터 제거하고 캘리퍼스로 즉시 측정하였다(길이 및 높이). 그 후, 지지체를 즉시 PBS 용액에 다시 놓고, 동일한 절차를 30분, 1시간, 6시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일의 시점에서 반복하였다. 모든 측정값을 기록하였고, 도 8과 같이 각각의 시점에서 지지체의 부피를 계산하였다.
GGp-DOPA3 지지체의 수분-흡수 특성
9개의 원통형 지지체의 무게를 달고 각각의 지지체를 별도의 플레이트 웰에 놓았다. 각 웰은 PBS로 채웠다. 1분 후, 지지체를 용액으로부터 제거하고 과량의 용액을 제거하고 지지체의 무게를 달았다. 그 후, 지지체를 다시 용액에 놓고, 동일한 절차를 30분, 1시간, 6시간, 24시간, 2일, 3일, 4일, 5일 및 6일의 시점에서 반복하였다. 도 9에서와 같이 모든 무게가 각각의 시점에 기록되었다.
GGp-DOPA 하이드로겔 접착성 평가 및 비교 - 연골 병변 내 고정 - 체외
인간 무릎 관절에서, 내측 대퇴부 관절구(medial femoral chondyle)는 피하 등급 III 및 IV 병변의 가장 빈번한 부위이다. 연골 회복에 대해 치료된 사람의 병변은 그 크기가 0.5-12 cm2이다. 인간의 경우, 5군데의 평균 관절 연골 두께는 2.2-2.5 mm이고, 돼지의 2-4 mm와 비교된다. 연골 병변의 유도를 위한 연골 두께와 관련하여, 돼지 모델은 인간의 시나리오와 보다 유사하다. 따라서, 인간에서 발견된 것과 유사한 체외 조건을 사용하여 병변의 위치, 크기, 깊이뿐만 아니라 물리적 스트레스(중력 및 마찰)를 포함하는, 새로운 개질된 젤란 검-기반 하이드로겔의 고정을 시험하였다.
관절형 돼지 관절에서 원형의 8 mm 직경(0.5 cm2) 연골 병변이 형성되었다(임계 크기 결함 - 관절구(chondyle) 폭의 50 %). 연하골에 도달할 때까지 병변 부위의 연골을 제거하였고 병변의 깊이는 약 2 mm였다. 시험을 수행하기 위해 정의된 하이드로겔 부피를 각 병변에 대해 계산하였다(V=πr2 x 높이). GGp-DOPA1(1 % w/V), GGp-DOPA3(1 % w/V), GGp(1 % w/V) 및 GG-MA(2 % w/V) 하이드로 겔을 전술한 바와 같이 배합하고 병변으로 피펫으로 옮겨, 각 병변이 완전히 채워졌다. 그 다음 생리 식염수 용액(0.9 % w/V)을 사용하여 5분 동안 가교결합을 유도하였다. 하기의 스트레스 테스트가 수행되었다;
중력 테스트: 원형(prototype)을 천천히 뒤집어서, 병변을 아래로 향하게 하였다. 이 원형을 병변 내에서 하이드로겔의 고정을 확인하거나(양성 결과) 또는 병변에서 하이드로겔이 탈락하는지(음성 결과) 확인하기 위해 격렬히 흔들었다.
마찰 테스트 - 원형 관절을 조립하고 관절 운동을 모방하여 병변 내의 하이드로겔 고정을 확인하거나(양성 결과) 또는 하이드로겔이 병변에서 파열 또는 탈락하는지(음성 결과)를 확인하였다.
생리학적 온도 내에서의 고정은 인공 관절을 37℃의 식염수 용액에 밤새 담금으로써 추가로 모의되었다.
GGp-DOPA 하이드로겔 제제(GGp-DOPA1 및 GGp-DOPA3)는 모두 2 mm 두께의 연골 병변 내에서 완전 무결성을 유지하면서, 모든 스트레스 테스트 조건을 성공적으로 이겨냈다(도 10a). 또한, 고정 테스트 후 3D GGp-DOPA 하이드로겔을 병변에서 완전히 온전하게 제거할 수 있었다. 반대로, GGp 및 GG-MA 제제의 부분 고정만이 동일한 테스트 시스템 내에서 관찰되었고, 하이드로겔 분열이 또한 관찰되었다.
하이드로겔 제제의 농도와 관련하여, 분말 용해 시간, 용액 점도 및 3D 하이드로겔 농도 및 안정성과 관련하여 1 % w/V가 GGp-DOPA1, GGp-DOPA3 및 GGp에 특히 적절한 것으로 밝혀졌다. 그러나 GG-MA의 경우, 유사한 성질을 얻기 위해서는 2 % w/V의 최소 농도가 필요했다. 이러한 결과는 당업계의 젤란 검 하이드로겔과 동등하거나 이보다 낮은 농도에서 이온-킬레이트 치환기로 개질된 겔란 검 하이드로겔의 접착성이 현저하게 크다는 것을 확인시켜준다.
겔란 검 하이드로겔의 접착 특성을 추가로 확인하기 위해, 이 고정 테스트를 돼지 관절 내의 몇몇 위치에서 생성된 연골 병변으로 반복하였고, 여기서 연골 두께의 변화는 하이드로겔의 접착을 더욱 어렵게 할 수 있다. 6개의 모든 위치(도 10b)에서, 일련의 테스트 후에 제자리에서 하이드로겔이 발견되었다.
본 발명에 개시된 개질된 젤란 검 하이드로겔의 개선된 접착 특성은 다른 하이드로겔과 달리, 본 발명의 개질된 젤란 검 하이드로겔이 보다 큰 면적의 표면에 달라붙을 수 있기 때문에, 보다 큰 크기의 연골 병변이 치료될 수 있음을 의미한다(> 4 cm2). 예를 들어, 미세골절, ACI 또는 MACI와 같은 현재 사용가능한 치료 옵션은 1-4 cm2의 보다 작은 병변을 치료할 때만 효과적이다. 따라서 개질된 젤란 검 하이드로겔은 최신 기술 및 케어 치료 옵션의 표준에 이점을 제공한다.
체외에서 GGp-DOPA 하이드로겔 내의 세포 생존력 평가
젤란 검-기반 하이드로겔 내에서 캡슐화된 인간 연골원 세포의 생존력을 체외 배양에 의해 최대 21일까지 평가하였고, 이는 연골형성에 필요한 최소 시간이다. 1 % w/V 농도의 GGp-DOPA1, GGp-DOPA3 및 GGp 하이드로겔, 및 2 % w/V 농도의 GG-MA 하이드로겔을 생성하기 위해, 실온에서 대표적인 GG-기반 용액과 세포를 혼합하였고, 모든 제제는 5백만 세포/mL를 함유하였다.
상이한 세포 유형을 갖는 두 개의 독립적인 배양이, 즉 인간 연골세포 및 인간 지방 중간엽 기질/줄기세포(hASC)를 사용하여 수행되었다. hASC는 연골 성장 인자(chondrogenic growth factor)를 사용하여, 미분화상태로 유지되거나 연골세포(chondrogenic) 계통으로 유도되었다. 개별적인 20μL 세포의 하이드로겔을 피펫으로 옮기고 세포 배양 배지를 첨가하여 하이드로겔의 교차결합을 촉진시켜, 안정되고 이동가능한 개별 3D 구조를 만들었다.
시험관 내 배양 후, 살아있는 세포와 죽은 세포는 특이적 염색에 의해 현미경으로 관찰되었고, 이로써 살아있는 세포는 칼세인 AM(calcein AM)에 의해 녹색으로 염색되고, 죽은 세포는 프로피듐 요오드화물(propidium iodide)에 의해 빨간색으로 염색된다(도 11).
지방성 간질/줄기세포와 관련하여, 다른 제제와 비교하여, GGp-DOPA3 하이드로겔 내에 명확하게 증가된 살아있는 세포 밀도가 관찰된다. 이는 분화세포와 비분화세포 모두에서 분명하게 나타났다(도 11, 중간 및 오른쪽 열). 또한, GGp-DOPA1 하이드로겔 내에서 보다 GGp-DOPA3 하이드로겔 내에서 더 우수한 세포 분포가 관찰되는 반면, GGp 및 GG-MA 하이드로겔 내에서는 세포가 존재하지 않는 구역이 상당하게 관찰되었다.
연골세포 배양에 관해서는, 실제적으로 동등한 세포 밀도 및 생존력이 다양한 하이드로겔 제제 중에서 관찰되었다(도 11, 왼쪽 열). 이러한 결과는 GGp-DOPA 하이드로겔이 최첨단 겔란 검 하이드로겔에 비해 캡슐화 후 장기간 생존가능한 다른 세포 유형을 유지할 수 있다는 것을 확인하고 치환도의 신중한 선택에 의해, 하이드로겔을 통해 세포 생존력 및 분포를 최적화할 수 있음을 확인하였다.
체외에서 GGp-DOPA 하이드로겔 내의 연골형성 평가
II형 콜라겐은 건강한 관절 히알린 연골의 가장 풍부한 세포외 기질 성분이다. 반면에, I형 콜라겐의 존재는 건강에 해로운, 섬유성 연골 조직과 관련이 있다.
따라서, 젤란 검-기반 하이드로겔 내에 캡슐화 된, 인간 연골세포에 의한 이들 두 마커의 발현을 21일까지 시험관내 배양조직에 의해 평가하였다. 실험 프로토콜은 세포 생존력의 평가를 위해 앞서 기술한 바와 같다.
놀랍게도 상이한 하이드로겔 제형이 II형 콜라겐 및 I형 콜라겐의 발현에 매우 극심하고 예기치 않은 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 시험된 4가지 제형 중, GGp-DOPA3는 I형 콜라겐보다 높은 수준의 II형 콜라겐의 발현을 명백하게 유도했다(도 12). 이 차별화 요소가 분명하지만, 훨씬 더 두드러지는 것은 II형 콜라겐의 발현이 I형 콜라겐보다 4배 더 높다는 사실이다. I형 콜라겐과 비교하여 II형 콜라겐의 발현이 증가하는 것 외에도, II형 콜라겐의 전반적인 수준 상향-조절은 GGp-DOPA3에 의해 다른 어떤 제형보다 평균 13배 더 높았고, 이는 또한 연골세포-친화 특성을 유지한다.
따라서 놀랍게도 이온-킬레이팅기의 성질과 이 치환체에 의한 젤란 검의 치환도가 연골형성에 알맞다는 것이 밝혀졌다. 히알린 연골 재생과 같은 잠재적인 치료적 적용을 고려하면, 본 발명에 기재된 바와 같이 치환도가 정의된 이온-킬레이팅기를 함유하는 특정 개질된 젤란 검 하이드로겔은 세포-기반 연골 병변 치료제의 효능을 현저하게 개선할 잠재력을 갖는다.
따라서, 본 발명에 기재된 이온-킬레이트 치환기로 개질된 젤란 검 하이드로겔은 신체 조직 및 표면 내에서 개선된 접착 거동을 나타내지만, 장기간 세포 생존력 및 건강한 세포외 매트릭스 마커의 발현의 상향-조절을 촉진함으로써 체외 세포 배양 및 조직 공학 및 재생 의학에 상당한 이점을 제공한다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "포함하는" 이라는 용어는 명시된 특징, 정수, 단계, 구성요소의 존재를 나타내도록 의도되었지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 구성요소 또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
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당업자는 통상적인 실험만을 사용하여 본 발명의 명세서에 기술된 본 발명의 특정 구체예에 대한 다수의 균등물을 인식하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범위는 상기 설명에 한정되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구범위에 명시된 바와 같다.
청구범위의 기재에서 단수 형태의 요소 또는 특징이 사용되는 경우, 복수형 또한 포함되고, 특별히 배제되지 않는 한, 그 반대도 마찬가지이다. 예를 들어, "하나의 세포" 또는 "상기 세포"라는 용어는 또한 복수형 "세포들" 또는 "상기 세포들"을 포함하고, 그 반대도 마찬가지이다. 청구범위에서 "a", "an", 및 "the"와 같은 관사는 문맥에서 반대로 표시되거나 달리 명시되지 않는 한 하나 이상을 의미할 수 있다. 군의 하나 또는 그 이상의 구성원 사이에 "또는"을 포함하는 청구항 또는 명세서의 설명은 문맥에서 반대로 표시되거나 달리 명시되지 않는 한 군 구성원 중 하나, 하나 이상, 또는 모두가 특정한 생성물 또는 절차에 존재하거나, 사용되거나, 또는 기타 관련이 있는 경우 충족되는 것으로 간주된다. 본 발명은 군의 정확히 한 구성원이 특정한 생성물 또는 절차에 존재하거나, 사용되거나, 또는 기타 관련이 있는 구체예를 포함한다. 본 발명은 또한 하나 이상, 또는 모든 군 구성원이 특정한 생성물 또는 절차에 존재하거나, 사용되거나, 또는 기타 관련이 있는 구체예를 포함한다.
또한, 본 발명은 하나 이상의 청구항들 또는 발명의 상세한 설명의 관련 부분들로부터의, 하나 이상의 제한, 요소, 절, 기술적 용어 등이 또다른 청구항에 삽입되는 모든 변형, 조합, 및 치환을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 또다른 청구항에 의존하는 임의의 청구항은 동일한 기본 청구항에 의존하는 임의의 다른 청구항에 있는 하나 이상의 제한을 포함하도록 수정될 수 있다. 또한, 청구항이 조성물을 기술하는 경우, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 모순 또는 불일치가 발생한다는 것이 명백하지 않는 한, 본 발명의 명세서에 개시된 임의의 목적을 위해 조성물을 사용하는 방법이 포함되고, 본 명세서에 개시된 임의의 제조 방법에 따라 조성물을 제조하는 방법 또는 공지된 다른 방법이 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
범위가 주어진 경우에는, 종점이 포함된다. 또한, 문맥상 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 당업자의 문맥 및/또는 이해로부터 달리 지시되거나 기타 명백한 경우를 제외하고, 범위로 표현된 값은 그 범위의 하한 단위의 10분의 1까지, 본 발명의 각각의 구체예에서 기술된 범위 내의 임의의 특정 값을 취할 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 또한 당업자의 문맥 및/또는 이해로부터 달리 지시되거나 기타 명백한 경우를 제외하고, 범위로 표현된 값은 주어진 범위 내의 임의의 부분범위를 취할 수 있고, 여기서 부분범위의 종점은 그 범위의 하한 단위의 10분의 1과 동일한 정확도로 표현된다.
또한, 본 발명의 임의의 특정 구체예는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명백하게 배제될 수 있음을 이해해야 한다. 범위가 주어지면, 범위 내의 임의의 값이 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명백하게 배제될 수 있다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 임의의 구체예, 요소, 특징, 용도, 또는 양태는, 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 배제될 수 있다. 간략화를 위해, 하나 이상의 요소, 특징, 목적, 또는 양태가 배제되는 모든 구체예는 본 명세서에서 명시적으로 설명되지 않는다.
전술한 구체예들은 결합가능하다.
다음의 청구범위는 본 명세서의 개시의 특정 구체예를 추가로 설명한다.
참고문헌
Oliveira, J.T., Sousa, R.A., Reis, R.L. {2009} Gellan gum based hydrogels for regenerative medicine and tissue engineering applications, its system and processing devices. W02009j101518 A2.
Oliveira, J.T., Santos, T.C, Martins, I., Picciochi, R., Marques, A.P., Castro A.G., Neves, N.N., Mano, J.F., Reis, R.L. {2010} Gellan gum injectable hydrogels for cartilage tissue engineering applications: In vitro studies and preliminary in vivo evaluation. Tissue Engineering Part A. 16{1}: 343-353.
Silva-Correia, J., Oliveira, J.M., Oliveira, J.T., Sousa, R.A., Reis, R.L. {2011a} Photo-crosslinked gellan gum-based hydrogels: preparation methods and uses thereof. W02011j119059 A1.
Silva-Correia, J., Oliveira, J.M., Caridade, S.G., Oliveira, J.T., Sousa, R.A., Mano, J.F., Reis, R.L. {2011b} Gellan gum hydrogels for intervertebral disc tissue-engineering applications. J. Tissue Eng. Regen. Med., 5, 97-107.
*Silva-Correia, J., Zavan, B., Vindigni, V., Silva, T.H., Oliveira, J.M., Abatangelo, G., Reis, R.L. (2013) Biocompatibility evaluation of ionic- and photo-crosslinked methacryalted gellan gum hydrogels: in vitro and in vivo study. Adv. Healthcare Mater., 2, 568-575.
Ryu, J.H., Hong, S., Lee, H. (2015) Bio-inspired adhesive catechol-conjugated chitosan for biomedical applications: a mini-review. Acta Biomaterialia, 27, 101-115.
Lee, c., Shin, J., Lee, J.S., Byun, E., Ryu, J.H., Um, S.H., Kim, D-I., Lee, H., Cho, S-W. (2013) Bioinspired, calcium-free alginate hydrogels with tunable physical and mechanical properties and improved biocompatibility. Biomacromolecules, 14(6), 2004-2013.
Barret, D.G., Fullenkamp, D.E., He, L., Holten-Andersen, N., Lee, K.Y, Messersmith, P.B. (2013) pHBased regulation of hydrogel mechanical properties through mussel-inspired chemistry and processing. Adv. Funct. Mater., 23, 1111-1119.
Shin, J., Lee, J.S., Lee, c., Park, H-J., Yang, K., Jin, Y., Ryu, J.H., Hong, K.S., Moon, S-H., Chung, HM. Yang, H.S., Um, S.H., Oh, J-W., Kim, D-I., Lee, H., Cho, S-W. (2015) Tissue adhesive catechol modified hyaluronic acid hydrogel for effective, minimally invasive cell therapy. Adv. Funct. Mater., 25, 3814-3824.
Lee, H., Lee, M., Ryu, H.J. (2013) Hydrogel comprising catechol group-coupled chitosan or polyamine and poloxamer comprising thiol group coupled to end thereof, preparation method thereof, and hemostat using same. AU2011381641 B2.
Manolakis, I., Noordover, J.A., Vendamme, R., Eevers, W.E. (2014) Hydroxyphenyl functionalized poly (ester amide). EP2784101 A1.
Park, K-D., Joung, Y-K., Park, K-M., Lih, E-G. (2015) In situ forming hydrogel for tissue adhesives and biomedical use thereof. US8968716 B2.
Dalsin, J.L., Koepsel, J.T. (2015) Bioadhesive compounds and methods of synthesis and use.
Shafiq, Z., Cui, J., Pastor-Perez, L., Miguel, V.S., Gropeanu, R.A., Serrano, c., del Campo, A. (2012) Bioinspired underwater bonding and debonding on demand. Angew. Chem. Int. Ed., 51, 4332-4335.
Cencer, M., Murley, M., Liu, Y, Lee, B.P. (2015) Effect of nitro-funtionalization on the cross-linking and bioadhestion of biomimetic adhesive moiety. Biomacromolecules, 16,404-410.
Ding, X., Vegesna, G.K., Meng, H., Winter, A., Lee, B.P. (2015) Nitro-group functionalization of dopamine and its contribution to the viscoelastic properties of catechol-containing nanocomposite hydrogels. Macromol. Chem. Phys., 216(10), 1109-1119.
Doner, W. (1997) Rapid purification of commercial gellan gum to highly soluble and gellable monovalent cation salts. Carbohydrate Polymers, 32, 245-247.
Gong, Y., Wang, c., Lai, R.C., Su, K., Zhang, F., Wang, D. (2009) An improved injectable polysaccharide hydrogel: modified gellan gum for long-term cartilage regeneration in vitro. J. Mater. Chem., 19, 1968-1977.
Hamcerencu, M., Desbrieres, J., Khoukh, A., Popa, M., Reiss, G. (2008) Synthesis and characterization of new unstarurated esters of gellan gum. Carbohydrate Polmers, 71, 92-100.
Hashimoto, W., Nankai, H., Sato, N., Kawai, S., Murata, K. (1999) Characterisation of an a-Lrhamnosidase of Bacillus sp. GL1 responsible for the complete depolymerisation of gellan. Archives of Biochemistry and Biophysics, 368(1), 56-60.
Rodenstein, M., Zurcher, S., Tosaitti, S.G.P., Spencer, N.D. (2010) Fabricating chemical gradients on oxide surfaces by means of fluorinated, catechol-based, self-assembled monolayers. La ngm ui r, 26(21)' 16211-16220.
McCarthy, J.R., McCowan, J., Zimmerman, M.B., Wenger, M.A., Emmert, L.W. (1986) Synthesis and renal vasodilator activity of 2-chlorodopamine and N-substituted derivatives. J. Med. Chem., 29, 1586-1590.
Dobbin, P.S., Hider, R.C., Hall, A.D., Taylor, P.D., Sarpong, P., Porter, J.B., Xiao, G., van der Helm, D. (1993) Synthesis, physicochemical properties and biological evaluation of N-substituted 2- alkyl-3-hydroxy-4{lH)-pyridinones: orally active iron chelators with clinical potential. J. Med. Chem., 36, 2448-2458.

Claims (17)

  1. 화학식 I의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 젤란 검:
    Figure 112022079117227-pat00007

    화학식 I
    상기에서
    n은 1 내지 4000의 정수이고,
    A는 -N-R7R8기를 의미하고,
    상기 R8은 수소 또는 C1-C6 알킬기이고,
    상기 R7은 화학식 II에 따른 기를 의미하고:
    -(CH2)g-B
    화학식 II
    상기에서
    g는 0 내지 18의 정수이고,
    B는 하기 기의 하나 이상, 또는 조합에 의해 방향족 고리 상에서 선택적으로 치환된 페놀기 또는 카테콜기이고:
    C1-C6 알킬기, 하이드록실, 나이트로, 시아노, 트라이플루오로메틸 또는 할로젠기;
    저급 알콕시기 -OR1(상기 R1은 C1-C6 알킬기를 의미함); -C(O)-R2기(상기 R2는 수소 또는 C1-C6 알킬기를 의미함); -C(O)-OR3기(상기 R3는 수소 또는 C1-C6 알킬기를 의미함); -C(O)NR4R5기(상기 R4 및 R5는 수소 또는 C1-C6 알킬기를 의미함); 또는 -SO2R6기(상기 R6는 수소 또는 C1-C6 알킬기를 의미함), 또는 B는 3-하이드록시-4-피리디논기 또는 5-하이드록시피리미돈-4(3H)-온기이고,
    상기 젤란 검은 Na+, K+, Li+, Ca2+, Mg2+, Fe2+, Cu2+, Sr2+, Ba2+, Co2+, Mn2+, Ni2+, Sn2+, Zn2+, Fe3+, Al3+, Ga3+ 및 Ti3+로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 1가, 2가 또는 3가 양이온, 또는 이들의 혼합물에 의해 이온 가교결합 함.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 III의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 젤란 검:
    Figure 112022079117227-pat00008

    화학식 III
    상기에서
    R9, R10, R11, 또는 R12는 서로 독립적으로 선택되고,
    R9, R10, R11, 또는 R12는 수소, 하이드록실, C1-C6 알킬기; 나이트로, 시아노, 트라이플루오로메틸 또는 할로젠기; 알콕시기 -OR1(상기 R1은 C1-C6 알킬기를 의미함); -C(O)-R2기(상기 R2는 수소 또는 C1-C6 알킬기를 의미함); -C(O)-OR3기(상기 R3는 수소 또는 C1-C6 알킬기를 의미함); -C(O)NR4R5기(상기 R4 및 R5는 수소 또는 C1-C6 알킬기를 의미함) 또는 -SO2R6기(상기 R6는 수소 또는 C1-C6 알킬기를 의미함)이고,
    n은 1 내지 4000의 정수임.
  3. 제2항에 있어서, 화학식 IV의 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 젤란 검:
    Figure 112022079117227-pat00009

    화학식 IV
    상기에서; R11 및 R12는 서로 독립적으로 선택되고,
    R11 또는 R12는 수소, 나이트로, 시아노, 또는 할로젠이고,
    n은 1 내지 4000의 정수임.
  4. 제3항에 있어서,
    Figure 112022079117227-pat00010

    을 포함하는 것을 특징으로 하는 젤란 검:
    상기 n은 1 내지 4000의 정수임.
  5. 제1항에 있어서, 상기 젤란 검의 치환도는 0.1 내지 30 %인 것을 특징으로 하는 젤란 검.
  6. 제5항에 있어서, 100 내지 2500 KDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 젤란 검.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 조직 공학(tissue engineering) 또는 재생 의학(regenerative medicine)에서 뼈, 연골 또는 연조직 질환 또는 병변의 치료에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 젤란 검.
  9. 제1항에 있어서, 미세골절에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 젤란 검.
  10. 제1항에 있어서, 히알린 연골 손상 또는 무릎 연골 손상의 치료 또는 요법에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 젤란 검.
  11. 제8항에 있어서, 상기 치료가 피하내(intradermal) 치료 또는 경피(transdermal) 치료인 것을 특징으로 하는 젤란 검.
  12. 제1항에서 정의된 젤란 검, 및 수용액, 물, 세포 배양액, 수성 염수 용매, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적합한 용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  13. 제12항에 있어서, 상기 젤란 검의 농도는 0.01% 내지 5% w/V인 것을 특징으로 하는 하이드로겔.
  14. 제1항에 기재된 젤란 검 또는 제12항에 기재된 하이드로겔, 및 세포, 줄기세포, 단백질, 생체분자, 소분자 활성 물질, 치료제, 또는 진단 마커, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 생체활성 성분을 포함하고; 상기 세포 또는 줄기세포는 포유동물 연골세포, 포유동물 중간엽 기질세포/줄기세포, 포유동물 골수 중간엽 줄기세포, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제1항 내지 제6항 및 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 젤란 검을 포함하는 조성물에 있어서, 골수 흡인 농축액, 성장 인자, 항생제, 인간 지방 중간엽 기질/줄기 세포, 또는 이들의 혼합물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제1항에 기재된 젤란 검, 제12항에 기재된 하이드로겔, 또는 제14항에 기재된 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 물품.
  17. 제16항에 있어서, 상기 물품은 메쉬(mesh), 디스크(disk), 지지체, 3차원 구조체, 스트립, 네트, 거즈, 경피 치료 시스템, 키트 또는 멤브레인인 것을 특징으로 하는 물품.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3019131C (en) * 2016-04-01 2023-09-26 Boston Scientific Scimed, Inc. Injectable compositions and methods of preparation and use thereof
EP3501553A1 (en) * 2017-12-21 2019-06-26 Association for the Advancement of Tissue Engineering and Cell based Technologies & Therapies (A4TEC) - Associação Hydrogel comprising manganese, methods and uses thereof
GB201820018D0 (en) * 2018-12-07 2019-01-23 Univ Birmingham Therapeutic hydrogel compositions
GB201820021D0 (en) * 2018-12-07 2019-01-23 Univ Birmingham Ocular hydrogel compositions
JP2022540223A (ja) * 2019-07-09 2022-09-14 セルアートジェン インコーポレイテッド 生体模倣組織接着性ハイドロジェルパッチ及びその用途
KR102308719B1 (ko) * 2019-07-09 2021-10-06 주식회사 세라트젠 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치 및 이의 용도
KR102528666B1 (ko) * 2020-01-23 2023-05-08 고려대학교 산학협력단 자가치유능을 가지는 신경봉합용 패치 및 이의 제조방법
CN111569139A (zh) * 2020-05-26 2020-08-25 上海市第六人民医院 一种负载血小板裂解液的自支撑自组装多层膜及其应用
WO2022050682A1 (ko) * 2020-09-01 2022-03-10 주식회사 세라트젠 엑소좀이 담지된 생체모사 조직 접착성 하이드로젤 패치
US20230310715A1 (en) * 2020-09-01 2023-10-05 Cellartgen Inc. Extracellular matrix-loaded bio-inspired tissue-adhesive hydrogel patch
KR102496721B1 (ko) * 2020-10-16 2023-02-06 경희대학교 산학협력단 그래핀 옥사이드를 포함하는 체내 주입형 하이드로겔
KR20220092682A (ko) 2020-12-24 2022-07-04 전북대학교산학협력단 덱사메타손-사이클로덱스트린 복합체가 로딩된 젤란검 하이드로겔 조성물 및 이의 골관절염 치료 용도
WO2022211493A1 (ko) 2021-03-31 2022-10-06 연세대학교 산학협력단 갈롤 유도체가 수식된 펙틴 및 그의 용도
WO2022216134A1 (ko) * 2021-04-09 2022-10-13 연세대학교 산학협력단 페놀 유도체로 수식된 셀룰로오스를 포함하는 하이드로젤 및 이의 용도
CN114478820B (zh) * 2022-02-25 2023-06-16 河北科技大学 一种多巴胺改性多糖及其制备方法和应用
CN115536920B (zh) * 2022-08-26 2023-05-26 武汉理工大学 一种壳聚糖衍生物基创面修复水凝胶及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009101518A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies & Therapies (A4Tec) Gellan gum based hydrogels for regenerative medicine and tissue engineering applications, its system, and processing devices
WO2011059326A2 (en) 2009-11-11 2011-05-19 University Of Twente, Institute For Biomedical Technology And Technical Medicine (Mira) Hydrogels based on polymers of dextran tyramine and tyramine conjugates of natural polymers

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2087471T3 (es) * 1991-02-11 1996-07-16 Fidia Spa Esteres gelan.
IT1247158B (it) * 1991-02-11 1994-12-12 Fidia Spa Esteri del gellano
US6242035B1 (en) 1998-11-23 2001-06-05 Cp Kelco U.S., Inc. Reduced molecular weight native gellan gum
FR2832156B1 (fr) 2001-11-15 2004-05-28 Oreal Preparation de composes de type betainates de polysaccharides, composes obtenus, leur utilisation et les compositions les comprenant
US8137688B2 (en) * 2003-01-10 2012-03-20 The Cleveland Clinic Foundation Hydroxyphenyl cross-linked macromolecular network and applications thereof
JP2008505716A (ja) * 2004-07-09 2008-02-28 ザ クリーヴランド クリニック ファウンデーション ヒドロキシフェニル架橋高分子ネットワーク及びその用途
KR101103423B1 (ko) 2009-09-04 2012-01-06 아주대학교산학협력단 생체 주입형 조직 접착성 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도
WO2011119059A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies And Therapies - A4Tec Photo-crosslinked gellan gum-based hydrogels: preparation methods and uses thereof
WO2012009664A2 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Knc Ner Acquisition Sub, Inc. Bioadhesive compounds and methods of synthesis and use
JP5805882B2 (ja) 2011-11-21 2015-11-10 イノ セラピー インコーポレイテッド カテコール基が結合したキトサンまたはポリアミン及び末端にチオール基が結合したポロキサマーを含むヒドロゲル及びこれの製造方法及びこれを利用した止血剤
EP2817360A1 (en) * 2012-02-20 2014-12-31 Aarhus Universitet Multi-responsive self-healing polymer and gel compositions
IL300460A (en) * 2012-07-24 2023-04-01 Nissan Chemical Corp A culture medium preparation, and a method for culturing cells or tissues by using the preparation
WO2014126537A1 (en) * 2013-02-13 2014-08-21 Agency For Science, Technology And Research A Polymeric System for Release of an Active Agent
EP2784101A1 (en) 2013-03-28 2014-10-01 Nitto Europe N.V Hydroxyphenyl functionalized poly(ester amide)
PT2983727T (pt) * 2013-04-09 2017-11-29 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Tech & Therapies (A4Tec) Hidrogel esponjoso de goma gelana, sua preparação e aplicações biomédicas do mesmo
US20170113582A1 (en) 2014-05-14 2017-04-27 Johnson Controls Technology Company Adjustment mechanism for a head restraint
CN104710653A (zh) * 2015-01-28 2015-06-17 南京工业大学 一种壳聚糖水凝胶及其制备方法与应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009101518A2 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Association For The Advancement Of Tissue Engineering And Cell Based Technologies & Therapies (A4Tec) Gellan gum based hydrogels for regenerative medicine and tissue engineering applications, its system, and processing devices
WO2011059326A2 (en) 2009-11-11 2011-05-19 University Of Twente, Institute For Biomedical Technology And Technical Medicine (Mira) Hydrogels based on polymers of dextran tyramine and tyramine conjugates of natural polymers

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Hongwei Du et al., ‘Injectable in situ Physically and Chemically Crosslinkable Gellan Hydrogel’, Macromol. Biosci., Vol.12, pp.952-961 (2012.)

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