KR20180135454A - Cd137에 대한 신규한 이중특이성 폴리펩타이드 - Google Patents

Cd137에 대한 신규한 이중특이성 폴리펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은, CD137에 특이적으로 결합 가능한, B1로 지칭되는 제1 결합 도메인, 및 종양 세포-관련 항원에 특이적으로 결합 가능한, B2로 지칭되는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 폴리펩타이드를 제공한다. 또한 이러한 이중특이성 폴리펩타이드의 약제학적 조성물 및 의약에서의 이의 용도가 제공된다.

Description

CD137에 대한 신규한 이중특이성 폴리펩타이드
암의 면역요법
암은 선진국에서 조기 사망의 주된 원인이다. 암의 면역요법은 종양 세포에 대한 효과적인 면역 반응을 증가시키는 것을 목적으로 한다. 이는, 예를 들어, 종양 항원에 대한 내성을 파괴하고, 항-종양 면역 반응을 증대시키며, 종양 부위에서 국소 사이토카인 반응을 자극함으로써 달성될 수 있다. 장기 지속적 항-종양 면역 반응의 중요한 효과기 세포는 활성화된 종양 특이적 효과기 T 세포이다. 활성화된 효과기 T 세포의 강력한 확장은 종양을 향한 면역 반응을 재지향시킬 수 있다. 이 맥락에서, 종양 미세환경에 의해 유도된 각종 면역억제 기전은 효과기 T 세포의 활성도를 억제시킨다. 몇 가지 면역억제 매개체가 종양 세포에 의해 발현된다. 이러한 매개체는, 예컨대, 조절 T 세포(Treg) 또는 골수-유래 억제 세포를 유도함으로써 T 세포 활성화를 직접적으로 또는 간접적으로 저해시킨다. 따라서, 이러한 조절 세포를 고갈, 저해, 반전 또는 비활성화시키는 것은 항-종양 효과를 제공하고 종양 미세환경에서 면역 억제를 반전시킬 수 있다. 추가로, 예를 들어, 수지상 세포에 의한 효과기 T 세포의 불완전 활성화는 차선으로 활성화된 또는 무력화된 T 세포를 야기시켜, 비효율적 항-종양 반응을 초래할 수 있다. 이와 대조적으로, 수지상 세포에 의한 적절한 유도는 활성화된 효과기 T 세포의 강력한 확장을 생성하여, 종양을 향하여 면역 반응을 재지향시킬 수 있다. 또한, 자연 살해(Natural killer: NK) 세포는 하향 조절된 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen: HLA) 발현에 의해 종양 세포를 공격함으로써 그리고 항체 의존성 세포독성(antibody dependent cellular cytotoxicity: ADCC)을 유도함으로써 종양 면역학에서 중요한 역할을 한다. 따라서, NK 세포의 자극은 또한 종양 성장을 저감시킬 수 있다.
종양-관련 항원
종양-관련 항원(TAA)은 종양 세포에 선택적으로 발현된 세포 표면 단백질이다. 용어 종양-관련은 TAA가 완전히 종양-특이적이지 않지만, 오히려 종양에서 과발현되는 것을 나타낸다. 방대한 수의 TAA가 기술되어 있고, 단클론성 항체, TAA-CD3 이중특이성 항체, 면역사이토카인 및 항체 약물 접합체를 이용한 T 세포 재지향 요법을 비롯한 다양한 치료적 근거에 사용되어 왔다. 일부 잘 연구된 TAA는, (Cheever et al., 2009)에 요약된, EGFR 계열 분자(HER2, HER3 및 EGFR/HER1), VEGFR, EpCAM, CEA, PSA, PSMA, EphA2, gp100, GD2, MUC1, CD20, CD19, CD22 및 CD33을 포함한다.
5T4(또한 영양막 당단백질, TPBG, M6P1 및 Waif1로 지칭됨)는 맨체스터 대학의 Peter Stern 교수(Hole and Stern, 1988)가 최초로 확인한 잘 정의된 TAA이다. 이것은 비-소세포 폐암, 신장암, 췌장암, 전립선암, 유방암, 결장직장암, 위암, 난소암 및 자궁경부암뿐만 아니라 급성 림프구성 백혈병을 비롯한 다양한 악성 종양에서 높은 비율의 환자에서 발현된 태아종양 항원이며, 또한 종양-개시 세포에서 발현되는 것으로 제시되었다(Castro et al., 2012; Damelin et al., 2011; Elkord et al., 2009; Southall et al., 1990).
5T4 발현은 종양 선택적이며 대부분의 정상 조직에서는 발현이 없거나 낮다. 비-악성 조직에서, 5T4는 주로 태반(영양막과 양막 상피)에서 그리고 기타 정상 조직에서 낮은 수준(US 2010/0021483 참조)으로뿐만 아니라, 몇몇 특수화된 상피에서 낮은 수준(Hole and Stern, 1988)에서 발현된다. 그러나, 일부 건강한 조직에서는 낮은 수준이 검출되었지만, 종양의 발현 수준이 상당히 높기 때문에 이와 관련된 안전 위험은 낮다고 간주된다. 이것은 제III상 임상 프로그램인 5T4를 표적화하는 ANYARA와 TroVax가 심각한 5T4 관련 독성을 보고하지 않았다는 사실에 의해 뒷받침된다.
Stern 등으로부터의 데이터는, 5T4가 CXCR4의 기능적 활성도를 조절한다는 것을 입증한다(Castro et al., 2012; Southgate et al., 2010). 5T4 결합 항체 또는 5T4 넉-다운은 CXCR4-매개 세포 이동의 저해를 초래하였다. CXCR4 경로는 종양 성장과 전이에 관련된다. 따라서, CXCR4 저해 방식으로 5T4를 표적화하는 것은 종양 성장 및/또는 전이를 감소시키는 공산이 있다.
CD137
CD137(4-1BB, TNFRSF9)은 종양 괴사 인자(TNF) 수용체(TNFR) 수퍼패밀리 구성원이다. 암 면역요법에서의 그의 역할이 예컨대 (Bartkowiak and Curran, 2015)에서 검토되었다. CD137의 활성화는 항원 제시 세포(APC) 및 다른 세포 유형의 세포 표면에서 삼량체로서 발현되는 CD137L에 결합에 의해 유도되는 수용체 올리고머화에 의존한다(Rabu et al., 2005; Wyzgol et al., 2009). CD137은 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 조절 T 세포(Treg), 수지상 세포(DC), 단구, 비만 세포, 호산구 및 종양 내피 세포를 포함하는 다양한 세포 집단에서 발현된다. CD137 활성화는 CD8+ T 세포 활성화 및 생존에 중요한 역할을 한다(Lee et al., 2002; Pulle et al., 2006). 이것은 효과기 기능을 유지하고 증대시키며 Th1 사이토카인 생산을 우선적으로 뒷받침한다(Shuford et al., 1997). CD4+ T 세포에서, CD137 자극은 처음에는 활성화, 그리고 나중에는 활성화-유도되는 세포 사멸을 유발하며, 이는 CD137 작동 항체가 자가면역뿐만 아니라 종양 면역에도 치료적 효과를 나타내는 이유를 설명하는 것으로 생각된다(Zhang, JCI, 2007, Sun, Trends Mol Med, 2003). CD137은 또한 Treg 기능을 억제하거나 또는 Treg를 세포 독성 CD4+ T-세포로 전환시키는 것으로 보고되었다(Akhmetzyanova et al., 2016; So et al., 2008).
CD137은 사이토카인 또는 CD16(FcγRIII) 자극에 의해 활성화된 NK 세포에서 상향 조절된다(문헌[Melero, CCR 19 (5) 1044-53, 2013] 참조). CD137의 활성화는 쥣과 세포 및 인간 세포 둘 다에서 NK 세포의 항체-의존성 세포 독성(ADCC) 활성을 증가시키는 것으로 나타났다(Hout 2012, Oncoimm에 의해 검토된 Kohrt 2012 and 2014 J Clin Invest). 또한, CD137은 DC 및 대식세포와 같은 APC 상에 발현되며, 이들 세포 유형에 대한 CD137의 자극은 종양 면역을 유발할 수 있는 면역 활성화를 유도할 수 있다.
작용성 CD137 항체는 종양 환경에서 내피 세포를 활성화시켜 ICAM-1 및 VCAM-1의 상향 조절을 유도하고 T 세포 동원을 개선하는 것으로 나타났다 (Palazon, Cancer Res, 2011).
몇 가지 연구는 전임상 모델에서 작용성 CD137 mAb로 치료함으로써 종양 면역의 유도를 입증했다. 작용 모드는 다양한 세포 유형을 포함할 수 있는데, CD8+ T 세포는 CD137-유도 종양 면역과 관련된 주요 효과기 세포 중 하나이다(Dubrot et al., 2010; Gauttier et al., 2014; Kim et al., 2001; McMillin et al., 2006; Melero et al., 1997; Miller et al., 2002; Sallin et al., 2014; Taraban et al., 2002; Uno et al., 2006; Vinay and Kwon, 2012; Wilcox et al., 2002). 또한 이것은 CpG, TRAIL, CD40, OX-40, DR5, PD-1/PD-L1, CTLA-4, Tim-3, IL-2 및 IL-12를 비롯한 여러 면역 조절제와 상승작용한다(Curran et al., 2011; Gray et al., 2008; Guo et al., 2013; Kwong et al., 2013; Lee et al., 2004; Morales-Kastresana et al., 2013; Pan et al., 2002; St Rose et al., 2013; Uno et al., 2006; Wei et al., 2013; Westwood et al., 2010; Westwood et al., 2014a; Westwood et al., 2014b. 종양 면역의 유도 및 유지에서 CD137의 중요한 역할은 CD137+ 종양 침윤 T 세포가 종양-특이적이며 종양 성장으로부터 효과적으로 보호되는 것을 나타내는 지견에 의해 더욱 뒷받침된다(Ye et al., 2014).
두 가지 CD137 항체가 임상 개발 중에 있다. 우렐무맙(Urelumab)(BMS-66513)은 브리스톨-메이어스 스큅사(Bristol-Myers Squibb)가 개발한 완전 인간 IgG4 항체입니다. 각종 적응증에서의 여러 제I상 및 제II상 연구가 현재 진행중이다. 전이성 흑색종에서 2차 요법으로서 우렐루맙을 이용한 제II상 연구는 간 독성으로 인해 2009년에 종료되었다(Garber, 2011; Li and Liu, 2013). PF-05082566은 화이자사(Pfizer)가 개발한 완전 인간 IgG2 항체이다. 현재 림프종에서 제I상 개발 중에 있고 각종 고형 암과 예비 자료는, 내성은 양호하지만 단지 보통의 항종양 효과만 있음을 시사한다.
CD137 활성화 시의 독성은 환자뿐만 아니라 마우스 모델에서 관찰되었다(Ascierto et al., 2010; Dubrot et al., 2010; Niu et al., 2007). 독성은 증가된 아스파테이트 아미노 전이효소/알라닌 아미노 전이효소 비(ASAT/ALAT) 수준 및 사이토카인 방출로서 나타나는 피부 독성 및 간 독성을 포함한다. 이것은 어느 한쪽의 독성이 면역 세포 집단(T 세포 유사)의 CD137 매개 사전-활성화를 필요로 하거나 항약물-항체(antidrug-antibody: ADA) 반응에 의해 초래된 이차적인 효과에 좌우되어, 잠재적으로 증대된 가교결합을 초래할 수 있는 CD137 항체의 응집체를 형성하는 것을 시사한다. 마우스에서 보이는 독성은 가역적이며 TNFα/CD8+ 세포에 의존하는 것으로 보인다(Ascierto et al., 2010). 원숭이에서의 독성 연구에 따르면, 피부 또는 간 독성이 검출되지 않아 4주 동안 매주 1회 최대 100 ㎎/㎏의 단일 투약 및 반복 투약 둘 다에 내약성이 있었던 것을 나타내었다(Ascierto 2010 Semin Onc).
TNFR 계열의 구성원은 유도될 활성화를 위해 수용체 가교결합에 의존적이다. 이러한 가교결합은 세포의 세포 표면 상에 발현된 천연 리간드에 의해 또는 재조합 다량체화된 리간드에 의해 유도될 수 있다. 대안적으로, 이것은 수용체에의 항체 결합에 의해 유도되고 Fcγ 수용체(FcγR)에 결합된 Fc 영역에 의해 가교결합될 수 있다. 이러한 가교결합 의존성은 DR5, GITR, CD27 및 CD40을 포함하는 다양한 TNFR 구성원에 대해 나타났다(Li and Ravetch, 2011; White et al., 2011; Wilson et al., 2011a; Wilson et al., 2011b; Wyzgol et al., 2009). 작용성 TNFR 패밀리 항체에 의한 활성의 저해 FcγRIIB(CD32B)의 중요한 역할은 몇몇 연구에서 제시된 반면(Li and Ravetch, 2011; White et al., 2011; White et al., 2013), 다른 데이터는 활성화가 FcγR을 활성화시킬 뿐만 아니라 가고-결합의 저해에 의해 유도되는 것을 시사한다(Li and Ravetch, 2011; Wilson et al., 2011a).
다른 TNFR 구성원들과 마찬가지로, CD137의 활성화는 수용체 올리고머화에 의존적이다. CD137L의 육량체는 효과적으로 CD137 활성화를 유도하는 반면, 단량체 또는 삼량체 CD137L은 유도하지 못한다(Rabu et al., 2005; Wyzgol et al., 2009). 따라서, CD137 작용성 항체가, 예컨대, 생체내에서 효과적인 활성이 발생하는 FcγR을 통해서 가교결합을 필요로 할 공산이 있다. 그러나, 다른 TNFR 구성원과 대조적으로, Fcγ RII는 마우스 연구에서 CD137에 의한 종양 면역성의 유도에 중요하지 않은 반면, FcγRIII은 종양 면역성을 손상시킨다(Sallin et al., 2014; Sanmamed et al., 2015).
CD137 및 다른 TNFR 수퍼패밀리 구성원의 활성화에서 다양한 FcγR의 역할에 대한 번역 관련성은 불확실한데, 그 이유는 인간 FcγR 분포뿐만 아니라, 상이한 FcγR에 대한 상이한 IgG 아이소형의 친화도가 마우스와 인간 사이에 상이하기 때문이다.
지난 10년간 다양한 암의 치료를 위한 면역요법의 개발이 진행되었음에도 불구하고, 새롭고 효율적인 제제에 대한 요구가 여전히 있다.
따라서, 본 발명은 암 치료를 위한 개선된 폴리펩타이드-기반 요법을 제공하고자 한다.
본 발명의 제1 양상은 CD137에 특이적으로 결합 가능한, B1로 지칭되는 제1 결합 도메인, 및 종양 세포-관련 항원에 특이적으로 결합 가능한, B2로 지칭되는 제2 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 폴리펩타이드를 제공한다.
하나의 면역-활성화 모이어티, 예컨대, CD137 작용제, 및 하나의 종양-표적화 모이어티, 예컨대, 5T4 결합제를 포함하는 이러한 이중특이성 화합물은 고도로 유효하고 안전한 암 면역요법을 확립하는데 사용될 수 있다.
각종 유형의 종양-국재화 면역요법 분자, 예컨대, 면역사이토카인 및 이중특이성 항체는 병원뿐만 아니라 전임상 연구에서 유익한 면역 활성화 및 종양 성장의 저해를 나타내었다([Kiefer and Neri, 2016]에서 검토됨).
CD137 활성화제에 의한 전신 독성을 회피하기 위하여, 그러나 종양 영역에서 높은 효능을 얻기 위하여, CD137 작용제의 분자 형식의 설계가 최적화될 수 있다. 예를 들어, CD137 활성화를 위해 TAA에 결합함으로써 가교 결합을 요하는 TAA-CD137 이중 특이성 항체에 의해 양호한 효능/안전성 프로파일이 얻어질 수 있다. 이어서, 종양에 존재하는 사전-활성화된 CD137-발현 T 세포가 우선적으로 활성화되는 반면, 다른 조직의 CD137 발현 세포는 활성화되지 않을 것이다. 이것은 일반화된 CD137 활성화에 의해 유도된 독성을 제한하면서 관련 종양-특이적 T 세포의 집중적인 활성화를 허용할 것이다(이 맥락에서 '활성화'는, 예를 들어, Tregs 억제 기능의 하향 조절 및/또는 효과기 T 세포 기능의 상향 조절에 의해, 종양-유도 T 세포 반응을 야기하는 알짜 면역 활성화).
면역사이토카인의 임상 진행은 아직까지 인상적이지 못하며, 종양-결합 실체가 단지 제한된 종양 국재화를 부여하기 때문에 부작용이 여전히 남아 있으며, 면역사이토카인의 대부분은 다른 구획에서 끝난다. 본 발명에서 기술되는 바와 같은 종양에 대한 활성도를 제한하는 이중특이성 항체는 이것이 종양의 부재 하에 비활성이기 때문에 면역사이토카인에 비해서 명백한 이점을 제공할 것이다.
또한, 본 발명의 이중특이성 폴리 펩타이드는 CD3을 표적화하는 이중특이성 항체에 비해서 뚜렷한 이점을 제공한다. CD3-표적화 이중특이성 분자는 T 세포를 효과기 세포로서 사용하고 TAA 결합과는 독립적으로 T 세포를 활성화시킬 수 있다. 따라서, 이들은 특히 종양 특이적 T-세포를 활성화시키지 못한다. 얻어지는 항-종양 효과는 따라서 장기 지속되는 항-종양 면역을 생성하지 못할 공산이 있다. 게다가, CD3은 모든 T 세포에서 발현되므로, 전신성 T 세포 활성화는 독성 문제와 연관된다. 이와 대조적으로, 본 발명의 이중특이성 항체는 종양 특이적 T-세포를 선택적으로 활성화시키고 장기 지속되는 종양 면역성을 생성시키는 잠재성을 지닌다.
이중특이성 폴리펩타이드의 구조
"폴리펩타이드"는 본 명세서에서 2개 이상의 소단위 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 다른 펩티도미메틱(peptidomimetic)의 화합물을 지칭하기 위하여 그의 가장 넓은 의미로 사용된다. 따라서, 용어 "폴리펩타이드"는 짧은 펩타이드 서열뿐만 아니라 더 긴 폴리펩타이드 및 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 D 또는 L 광학 이성질체, 및 아미노산 유사체 및 펩티도미메틱을 비롯한 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산 중 하나를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "이중특이성"은 폴리펩타이드가 적어도 2개의 표적 실체에 특이적으로 결합 가능하다는 것을 의미한다.
하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드는 이중특이성 항체이다(이의 많은 예가 이하에 상세히 설명된다).
따라서, 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 항체 및 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
"항체 또는 이의 항원 결합 단편"은 실질적으로 무손상 항체 분자뿐만 아니라, 키메라 항체, 인간화 항체, 단리된 항체, 단쇄 항체, 이중특이성 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 동종이량체 및 이종이량체 항체 중쇄 및/또는 경쇄, 및 이들의 항원-결합 단편 및 유도체를 포함한다. 적합한 항원-결합 단편 및 유도체는 Fv 단편(예컨대, 단쇄 Fv 및 다이설파이드-결합된 Fv), Fab-유사 단편(예컨대, Fab 단편s, Fab' 단편 및 F(ab)2 단편), 단일 가변 도메인(예컨대, VH 및 VL 도메인) 및 단일 도메인 항체(dAb, 단일 및 이중 형식[즉, dAb-링커-dAb], 및 나노바디를 포함함)를 포함한다. 전체 항체가 아니라 항체 단편을 이용하는 잠재적인 이점은 여러 가지이다. 보다 작은 크기의 단편은, 고형 조직의 더 양호한 침투력과 같은 개선된 약리학적 특성을 초래할 수 있다. 또한, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편과 같은 항원-결합 단편은 이. 콜라이(E. coli)에서 발현 및 분비될 수 있어, 다량의 상기 단편을 용이하게 생산할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 항원-결합 단편은 Fv　단편(예컨대, 단쇄 Fv 단편, 또는 다이설파이드-결합된 Fv 단편), Fab-유사 단편(예컨대, Fab 단편; Fab' 단편 또는 F(ab)2 단편) 및 단일 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
예를 들어, 제1 결합 도메인(B1) 및/또는 제2 결합 도메인(B2)은 Fab 단편을 포함할 수 있거나 이것으로 이루어질 수 있다.
대안적으로, 또는 부가적으로, 제1 결합 도메인(B1) 및/또는 제2 결합 도메인(B2)은 Fv 단편(예컨대, scFv 또는 다이-설파이드 브리지된 Fv)을 포함할 수 있거나 이것으로 이루어질 수 있다. 결합 도메인이 scFv인 경우, 그 속의 VH 및 VL 영역은 링커 서열, 예를 들어, 하기에 의해 접합될 수 있다:
GGGGSGGGGSGGGGS [서열번호 93]
당업자라면, 이러한 scFv 폴리펩타이드가 1개 이상의 아미노산 잔기 상에서 글라이코실화, 예를 들어, N-글라이코실화될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
어구 "항체 또는 이의 항원-결합 단편"은 항체 모방체(예를 들어, 소정의 위치에서 가변성이 도입되도록 여전히 허용하는 높은 정도의 안정성을 지니는 비-항체 골격 구조)를 포함하도록 의도된다. 생화학 분야의 당업자라면, 문헌[Gebauer & Skerra, 2009, Curr Opin Chem Biol 13(3): 245-255](이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)에서 논의된 바와 같이, 이러한 많은 분자와 친숙할 것이다. 예시적인 항체 모방체는 아피바디(affibody)(또한 트라이넥틴이라고 불림; Nygren, 2008, FEBS J, 275, 2668-2676); CTLD(또한 테트라넥틴(Tetranectin)이라 불림; Innovations Pharmac . Technol . (2006), 27-30); 아드넥틴(adnectin)(또한 단일체라 불림; Meth . Mol . Biol., 352 (2007), 95-109); 안티콜린(Drug Discovery Today (2005), 10, 23-33); DARPin(안키린(ankyrin); Nat. Biotechnol. (2004), 22, 575-582); 아비머(avimer)(Nat. Biotechnol. (2005), 23, 1556-1561); 미소체(microbody)(FEBS J, (2007), 274, 86-95); 펩타이드 앱타머(Expert. Opin . Biol. Ther. (2005), 5, 783-797); 쿠니츠(Kunitz) 도메인(J. Pharmacol . Exp . Ther. (2006) 318, 803-809); 아플린(affilin)(Trends. Biotechnol. (2005), 23, 514-522); 어피머(affimer)(Avacta Life Sciences, 영국 웨더비 소재)를 포함한다.
또한 키메라 T-세포 수용체(또한 키메라 T 세포 수용체, 키메라 면역수용체 및 키메라 항원 수용체 또는 CAR로도 공지됨)(문헌[Pule et al., 2003, Cytotherapy 5(3):211-26] 참조, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들은, 면역 효과기 세포 상에 임의의 특이성을 접목시키는 조작된 수용체이다. 전형적으로, CAR은 T 세포 상에 단클론성 항체의 특이성을 접목시키는데 사용되며, 이들의 암호화 서열의 전사가 레트로바이러스 벡터에 의해 용이해진다. 이러한 분자의 가장 통상의 형태는 CD3-제타 막관통 및 엔도도메인에 융합된 단클론성 항체로부터 유래된 단쇄 가변 단편(scFv)을 포함하는 융합이다. T 세포가 이 융합 분자를 발현할 경우, 이는 전사된 단클론성 항체 특이성을 발현하는 표적 세포를 인지하고 사멸시킨다.
당업자라면, 본 발명이 또한, 현재 존재하든지 또는 미래에 존재하든지 간에, 예컨대, 폴리에틸렌 글라이콜 또는 다른 적합한 중합체(이하 참조)의 공유 부착에 의해 변형된 항체 및 이의 항원-결합 단편의 변형된 버전을 포함하는 것을 더욱 이해할 것이다.
항체 및 항체 단편을 생성하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 항체는 항체 분자의 생체내 생산의 유도, 면역글로불린 라이브러리의 선별(Orlandi et al, 1989. Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 86:3833-3837; Winter et al., 1991, Nature 349:293-299, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨) 또는 배양액 중 세포주에 의한 단클론성 항체 분자의 생성을 이용하는 몇 가지 방법 중 어느 하나를 통해서 생성될 수 있다. 이들은 하이브리도마 수법, 인간 B-세포 하이브리도마 수법, 및 엡스타인-바 바이러스(EBV)-하이브리도마 수법을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다(Kohler et al., 1975. Nature 256:4950497; Kozbor et al., 1985. J. Immunol . Methods 81:31-42; Cote et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030; Cole et al., 1984. Mol . Cell. Biol . 62:109-120, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨).
단클론성 항체의 생산을 위한 적합한 방법은 또한 문헌[Monoclonal Antibodies: A manual of techniques", H Zola (CRC Press, 1988, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)] 및 문헌[Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", J G R Hurrell(CRC Press, 1982, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)]에 개시되어 있다.
마찬가지로, 항체 단편은 당업계에 잘 알려진 방법을 이용해서 얻어질 수 있다(예를 들어, 문헌[Harlow & Lane, 1988, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New York] 참조, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨). 예를 들어, 본 발명에 따른 항체 단편은 이 단편을 암호화하는 DNA의 이. 콜라이 또는 포유류 세포(예컨대, 중국 햄스터 난소 세포 배양액 또는 다른 단백질 발현 시스템)에서의 발현에 의해 또는 항체의 단백질 분해 가수분해에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 항체 단편은 통상의 방법에 의해 전체 항체의 펩신 또는 파파인 소화에 의해 얻어질 수 있다.
당업자라면, 인간 요법 또는 진단을 위하여, 인간 또는 인간화된 항체가 바람직하게는 이용된다는 것을 이해할 것이다. 비-인간(예컨대, 쥣과) 항체의 인간화된 형태는 바람직하게는 비-인간 항체로부터 유래된 최소-부분을 갖는 유전자 조작된 키메라 항체 또는 항체 단편이다. 인간화된 항체는 인간 항체(수용자 항체)의 상보성 결정 영역이 목적하는 기능성을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간종(공여체 항체)의 상보성 결정 영역으로부터의 잔기로 대체된다. 몇몇 경우에, 인간 항체의 Fv 프레임워크 잔기는 대응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 인간화된 항체는 또한 수용자 항체에서도 이입시킨 상보성 결정 영역 또는 프레임워크 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 하나, 전형적으로 2개의, 가변 도메인의 실질적으로 전부를 포함할 것이며, 여기서 상보성 결정 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 비-인간 항체의 것들에 대응하며, 프레임워크 영역의 전부 또는 실질적으로 전부가 관련된 인간 공통 서열의 것들에 대응한다. 인간화된 항체는 최적으로는 또한 전형적으로 인간 항체로부터 유래된, 항체 불변 영역, 예컨대, Fc 영역의 적어도 일부를 포함한다(예를 들어, 문헌[Jones et al., 1986. Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Presta, 1992, Curr . Op. Struct . Biol . 2:593-596] 참조, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨).
비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터 이에 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기(종종 이입된 잔기라 지칭됨)는 전형적으로 이입된 가변 도메인으로부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 인간 상보성 결정 영역을 대응하는 설치류 상보성 결정 영역으로 치환함으로써 (예를 들어, 문헌[Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Reichmann et al., 1988. Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536l], US 4,816,567 참조, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 인간화된 항체는, 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비-인간종으로부터의 대응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체이다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 상보성 결정 영역 잔기 및 가능하게는 일부 프레임워크 잔기가 설치류 항체 내 유사한 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체일 수 있다.
인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리를 비롯하여 당업계에 공지된 각종 수법을 이용해서 식별될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hoogenboom & Winter, 1991, J. Mol . Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol . Biol . 222:581; Cole et al., 1985, In: Monoclonal antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77; Boerner et al., 1991. J. Immunol . 147:86-95] 참조, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨).
본 발명의 이중특이성 폴리펩타이드, 예컨대,　항체가 임의의 적합한 구조적 형식으로 이루어질 수 있다는 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
따라서, 본 발명의 이중특이성 항체의 예시적인 실시형태에 있어서:
(a) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2는 무손상 IgG 항체이고(또는, 함께 무손상 IgG 항체를 형성하고);
(b) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2는 Fv 단편(예컨대, scFv)이며;
(c) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2는 Fab 단편이고; 그리고/또는
(d) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2는 단일 도메인 항체(예컨대, 도메인 항체 및 나노바디)이다.
당업자라면, 이중특이성 항체가 인간 Fc 영역, 또는 상기 영역의 변이체를 포함할 수 있고, 여기서 상기 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 영역, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 영역이라는 것을 이해할 것이다.
치료적 단클론성 항체 또는 Fc 융합 단백질의 Fc 영역을 조작하는 것은 이들에 요구되는 약리학적 활성도에 더 양호하게 적합화되는 분자의 생성을 허용한다(Strohl, 2009, Curr Opin Biotechnol 20(6):685-91, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입된다).
(a) 증가된 반감기를 위한 조작된 Fc 영역
치료적 항체의 효능을 개선시키기 위한 하나의 접근법은 이의 혈청 지속성을 증가시키는 것이며, 이에 따라서 더 높은 순환 수준, 더 적은 빈번한 투여 및 저감된 용량을 가능하게 한다.
IgG의 반감기는 신생아 수용체 FcRn에 대한 이의 pH-의존성 결합에 좌우된다. 내피 세포의 표면 상에 발현된 FcRn은 pH-의존성 방식으로 IgG를 결합하고 이를 분해로부터 보호한다.
pH 7.4이 아니라 pH 6.0에서 FcRn을 선택적으로 결합하는 일부 항체는, 다양한 동물 모델에서 더 높은 반감기를 발휘한다.
CH2 도메인과 CH3 도메인 사이의 계면에서 위치된 몇몇 돌연변이, 예컨대, T250Q/M428L(Hinton et al., 2004, J Biol Chem. 279(8):6213-6, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨) 및 M252Y/S254T/T256E + H433K/N434F(Vaccaro et al., 2005, Nat. Biotechnol . 23(10):1283-8, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)는, 생체내에서 FcRn에 대한 결합 친화도 및 IgG1의 반감기를 증가시키는 것으로 제시되었다.
(b) 변경된 효과기 기능에 대한 조작된 Fc 영역
종양 항원의 부재 시 CD137 활성화의 결여를 확실하게 하기 위하여, 이중특이성 항체의 Fc 부분은 FcγR에 대해서 친화도 없이 혹은 매우 낮은 친화도로 결합해야만 하는데, 그 이유는 CD137 항체의 FcγR-매개 가교결합이 활성화에 의해 유도될 수 있기 때문이다. "매우 낮은 친화도"는, 절반 최대 결합이 FcγR 발현 세포의 유세포 분석에서(Hezareh et al., 2001, J Virol , 75(24):12161-8) 또는 by FcγR ELISA(Shields et al., 2001, J Biol Chem . 276(9):6591-604)에 의해 달성되는 농도에서 결정된 바, Fc 부분이 야생형 IgG1에 비해서 FcγRI, FcgRII 및 III에 대해서 적어도 10배 저감된 친화도를 발휘하는 것을 포함한다.
고려할 다른 인자는 FcγR의 증대가 또한 항체로 코팅된 세포의 항체-의존성 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식세포작용(antibody-dependent cellular phagocytosis: ADCP) 및 보체-의존성세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC)을 유발할 수 있다는 점이다. 따라서, 종양-의존적 CD137 활성화를 확실하게 할 뿐만 아니라, CD137 발현, 종양-반응성 T 효과기 세포의 결핍을 회피하기 위하여, TAA-CD137 이중특이성 항체의 아이소형은 바람직하게는 침묵되어야 한다.
4개의 인간 IgG 아이소유형은, 상이한 친화도를 갖는, 활성화된 Fcγ 수용체(FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa), 저해 FcγRIIb 수용체 및 보체(C1q)의 제1 성분과 결합하여, 매우 상이한 효과기 기능을 수득한다(Bruhns et al., 2009, Blood. 113(16):3716-25, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨). IgG1 분자는 효과기 기능을 유도하는 능력 및 최고 친화도를 갖는 반면, IgG2, IgG3 및 IgG4는 덜 효과적이다(Bruhns, 2012; Hogarth and Pietersz, 2012; Stewart et al., 2014) (Wang 2015 Front Im; Vidarson 2014 Fron Imm). 또한, IgG1의 Fc 영역에서의 소정의 돌연변이는 신생아 FcR(FcRn) 인터페론을 보유하면서 FcγR 친화도 및 효과기 기능을 극적으로 저감시킨다(Ju and Jung, 2014; Leabman et al., 2013; Oganesyan et al., 2008; Sazinsky et al., 2008).
가장 널리 이용되는 IgG1 돌연변이체는 소위 "LALA" 이중 돌연변이체 L234A/L235A를 비롯하여, L234 및 L235 위치에서의 돌연변이뿐만 아니라, 단독으로 또는 D265A와 조합하여 N297A이다. 돌연변이에 의해 IgG1을 더욱 침묵화시키기 위하여 기재된 또 다른 위치는 P329이다(US 2012/0251531 참조).
따라서, FcRn에 대한 결합을 보유하지만 낮은 효과기 기능을 갖는 돌연변이된 IgG1 형식을 선택하는 것은 CD137의 5T4-의존적 활성화를 갖고 바람직한 효능/안전 프로파일 및 양호한 PK 특성을 발휘하는 이중특이성 항체를 초래할 수 있다.
유리하게는, 폴리펩타이드는 항체 의존적 세포 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식세포작용(ADCP), 및/또는 보체-의존성세포독성(CDC)을 유도할 능력이 없다. "할 능력이 없는"이란, ADCC 등을 유도하는 폴리펩타이드의 능력이, 예컨대, 문헌[Hezareh et al. 2001(상기 참조)]에 의해 기재된 단핵구-의존적 ADCC 또는 CDC 검정에 의해 나타낸 바와 같이 야생형 IgG1과 비교해서 적어도 10배 더 낮은 것을 포함한다.
일 실시형태에 있어서, Fc 영역은 이하의 위치들 중 하나 이상에서 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역의 변이체일 수 있다:
L234, L235, P239, D265, N297 및/또는 P329.
유리하게는, 알라닌은 돌연변이된 위치(들)에서 존재할 수 있다.
선택적으로, IgG1 변이체는 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역의 변이체(즉, LALA 이중 돌연변이체; 서열번호 86 참조)일 수 있다.
당업자라면, 본 발명의 이중특이성 폴리펩타이드가 몇몇 상이한 구조적 형식을 가질 수 있음을 이해할 것이다(예를 들어, 문헌[Chan & Carter, 2016, Nature Reviews Immunology 10, 301-316] 참조, 이의 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨).
예시적인 실시형태에서, 이중특이성 항체는 하기 (a) 내지 (h)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) 2가의 이중특이성 항체, 예컨대, IgG-scFv 이중특이성 항체(예를 들어, B1은 무손상 IgG이고, B2는 IgG의 경쇄의 N-말단에서 그리고/또는 경쇄의 C-말단에서 그리고/또는 중쇄의 N-말단에서 그리고/또는 중쇄의 C-말단에서 B1에 부착된 scFv이거나, 또는 그 반대이다);
(b) 1가의 이중특이성 항체, 예컨대, 듀오바디(DuoBody)(등록상표) (Genmab AS, 덴마크 코펜하겐 소재) 또는 '노브-인-홀(knob-in-hole)' 이중특이성 항체(예를 들어, scFv-KIH, scFv-KIHr, BiTE-KIH 또는 BiTE- KIHr(예를 들어, 문헌[Xu et al., 2015, mAbs 7(1):231-242)' 참조);
(c) scFv2-Fc 이중특이성 항체(예컨대, Emergent Biosolutions Inc(미국 시애틀 소재)로부터의 ADAPTIR(상표명) 이중특이성 항체);
(d) BiTE/scFv2 이중특이성 항체;
(e) 이용되는 2가 또는 링커/커넥터에 관계 없이 DVD-Ig 이중특이성 항체 또는 다른 IgG-FAb, FAb-IgG 이중특이성 항체;
(f) DART-기반 이중특이성 항체(예를 들어, DART2-Fc, DART2-Fc 또는 DART);
(g) DNL-Fab3 이중특이성 항체; 및
(h) scFv-HSA-scFv 이중특이성 항체.
예를 들어, 이중특이성 항체는 IgG-scFv 항체일 수 있다(도 1 참조). IgG-scFv 항체(및 구체적으로는 그 안의 scFv 도메인)는 VH-VL 또는 VL-VH 배향 중 하나일 수 있다. 일 실시형태에 있어서, scFv는 VH와 VL 사이의 S-S 브리지에 의해 확립될 수 있다.
대안적인 실시형태에 있어서, 이중특이성 항체는 scFv2-Fc 항체일 수 있으며, 예를 들어, 각 폴리펩타이드가, N-말단에서부터 C-말단으로, 제1 scFv, 힌지 도메인, Fc 도메인 및 제2 scFv를 포함하는 이량체(도 1 참조)일 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 결합 도메인 B1과 결합 도메인 B2는 서로 직접 융합된다.
대안적인 실시형태에 있어서, 결합 도메인 B1과 결합 도메인 B2는 폴리펩타이드 링커를 통해서 접합된다. 예를 들어, 폴리펩타이드 링커는 약 10 내지 약 25개의 아미노산의 짧은 링커 펩타이드일 수 있다. 링커는 가요성을 위해 통상 글리신이 풍부할 뿐만 아니라 용해도를 위해 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, VH의 N-말단을 VL의 C-말단과 연결할 수 있거나, 또는 그 반대일 수 있다.
따라서, 링커는 아미노산 서열 SGGGGSGGGGS(서열번호 87), SGGGGSGGGGSAP(서열번호 88), NFSQP(서열번호 89), KRTVA(서열번호 90), GGGSGGGG(서열번호 91), GGGGSGGGGS(서열번호 92), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 93), THTCPPCPEPKSSDK(서열번호 140), GGGS(서열번호 141), EAAKEAAKGGGGS(서열번호 142), EAAKEAAK(서열번호 143) 또는 (SG)m(여기서 m = 1 내지 7)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
추가의 실시형태에 있어서, 결합 도메인 B1과 결합 도메인 B2은 폴리펩타이드 상에서 면역글로불린 불변 영역(예컨대, Fc 영역)에 의해 분리된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 용어 "아미노산"은 표준 20개의 유전자-암호화된 아미노산 및 (천연의 'L'형태에 비해서) 이들의 대응하는 'D' 형태의 입체이성질체, 오메가-아미노산류인, 기타 천연형 아미노산, 통상적이지 않은 아미노산(예컨대, α,α-이치환된 아미노산, N-알킬 아미노산 등) 및 화학적으로 유도체화된 아미노산(이하 참조)를 포함한다.
아미노산이, 예컨대, "알라닌" 또는 "Ala" 또는 "A"와 같이 구체적으로 나열될 경우, 이 용어는 달리 명확하게 기술되지 않는 한 L-알라닌과 D-알라닌 둘 다를 지칭한다. 또 다른 통상적이지 않은 아미노산은 또한, 목적하는 기능적 특성이 폴리펩타이드에 의해 보유되는 한, 본 발명의 폴리펩타이드에 대한 적합한 성분일 수 있다. 나타낸 펩타이드에 대해서, 각각의 암호화된 아미노산 잔기는, 적절한 경우, 통상의 아미노산의 속명에 대응하는 단일 문자 표기로 나타낸다.
일 실시형태에 있어서, 본 명세서에서 정의된 바와 같은 항체 폴리펩타이드는 L-아미노산을 포함하거나 이것으로 이루어진다.
당업자라면, 본 발명의 항체 폴리펩타이드가 변형되거나 유도체화된 1종 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나 이것으로 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.
1종 이상의 아미노산의 화학적 유도체는 기능적 측기와의 반응에 의해 달성될 수 있다. 이러한 유도체화된 분자는, 예를 들어, 유리 아미노시가 유도체화된 아민 염산염, p-톨루엔 설포닐기, 카복시벤족시기, t-부톡시카보닐기, 클로로아세틸기 또는 폼일기를 형성하는 이들 분자를 포함한다. 유리 카복실기는 유도체화되어 염, 메틸 및 에틸 에스터 또는 에스터 및 하이드라자이드의 기타 유형을 형성할 수 있다. 유리 하이드록실기는 유도체화되어 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 또한, 화학적 유도체로서, 20개의 표준 아미노산의 천연형 아미노산 유도체를 함유하는 펩타이드가 포함된다. 예를 들어: 4-하이드록시프롤린이 프롤린 대신에 치환될 수 있고; 5-하이드록시라이신이 라이신 대신에 치환될 수 있으며; 3-메틸히스티딘이 히스티딘 대신에 치환될 수 있고; 호모세린이 세린 대신에 치환될 수 있으며; 오르니틴이 라이신 대신에 치환될 수 있다. 유도체는 또한 필요한 활성도가 유지되는 한 하나 이상의 부가 또는 결실을 함유하는 펩타이드를 포함한다. 다른 포함되는 변형은 아미드화, 아미노 말단 아실화(예컨대, 아세틸화 또는 티오글라이콜산 아미드화), 말단 카복실아미드화(예컨대, 암모니아 또는 메틸아민을 이용) 등과 같은 말단 변형이다.
대안적으로, 또는 부가적으로, 하나 이상의 아미노산이 글라이코실화, 예컨대, N-결합 글리코실화(글리칸 모이어티가 아스파라긴의 질소 또는 아르기닌 곁사슬에 부착됨) 및/또는 O-결합 글리코실화(글리칸 모이어티가 세린, 트레오닌, 티로신, 하이드록시라이신 또는 하이드록시프롤린에 부착됨)된다. 글라이코실화된 항체의 생산 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Jefferis, 2009, Nature Reviews Drug Discovery 8:226-234] 참조, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨).
당업자라면, 펩티도미메틱 화합물이 또한 유용할 수 있다는 것을 더욱 이해할 것이다. 용어 '펩디도미메틱'은 치료제로서의 특정 펩타이드의 형태 및 바람직한 특성을 모방하는 화합물을 지칭한다.
예를 들어, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 잔기가 펩타이드(-CO-NH-) 결합에 의해 연결된 분자뿐만 아니라 펩타이드 결합이 역전된 분자도 포함한다. 이러한 레트로-인버소(retro-inverso) 펩티도미메틱은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 문헌[Meziere et al. (1997) J. Immunol . 159, 3230-3237](이것은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 것들을 이용해서 만들어질 수 있다. 이 접근법은, 곁사슬의 배향이 아니라, 골격을 포함하는 의사-펩타이드 함유 변화를 만드는 것을 포함한다. CO-NH 펩타이드 결합 대신에 NH-CO 결합을 함유하는 레트로-인버스 펩타이드는 단백질 분해에 대해서 훨씬 더 저항성이다. 대안적으로, 상기 폴리펩타이드는 아미노산 잔기 중 하나 이상이 통상의 아마이드 결합 대신에 -y(CH2NH)- 결합에 의해 연결된 펩티도미메틱 화합물일 수 있다.
추가의 대안예에 있어서, 펩타이드 결합은 아미노산 잔기의 탄소 원자 간의 간격을 유지하는 적절한 링커 모이어티가 사용된다는 조건 하에 전체적으로 분배될 수 있고; 링커 모이어티가 펩타이드 결합과 실질적으로 같은 평면성 및 실질적으로 같은 하전 분포를 갖는 것이 유리할 수 있다.
또한 상기 폴리펩타이드는 외부-단백질 분해 소화에 대한 감수성을 저감시키는 것을 돕기 위하여 그의 N- 또는 C-말단에서 편리하게 차단될 수 있음이 이해될 것이다.
D-아미노산 및 N-메틸 아미노산과 같은 각종 미암호화된 또는 변형된 아미노산은 또한 포유류 펩타이드를 변형시키는데 사용되어 왔다. 또한, 추정되는 생활성 형태는 공유 변형, 예컨대, 고리화에 의해, 또는 락탐 또는 기타 유형의 브리지에 혼입에 의해 안정화될 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Veber et al., 1978, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 75:2636 및 Thursell et al., 1983, Biochem . Biophys. Res. Comm. 111:166]을 참조하면 되고, 이 문헌은 참고로 본 명세서에 편입된다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 폴리펩타이드는 종양 면역성을 유도할 수 있다. 이것은, 예컨대, IL-2 및 IFNγ 생산을 측정함으로써 T 세포 활성화 검정에서 시험관 내에서 시험될 수 있다. 효과기 T 세포의 활성화는 종양 특이적 T 세포 반응이 생체내에서 달성될 수 있는 것을 나타낼 것이다. 또, 생체내 모델, 예컨대, 마우스 모델에서의 항-종양 반응은 종양을 향한 성공적인 면역 반응이 달성된 것을 의미할 것이다.
따라서, 이중특이성 폴리펩타이드는 표적 면역계 세포의 활성도를 조절할 수 있으며, 여기서 상기 조절은 상기 세포의 활성도의 증가 또는 감소이다. 이러한 세포는 T 세포, 수지상 세포 및 자연 살해 세포를 포함한다.
면역계 세포는 전형적으로 T 세포이다. 따라서, 항체는 CD4+ 또는 CD8+ 효과기 T 세포의 활성도를 증가시킬 수 있거나, 또는 조절 T 세포(Treg)의 활성도를 감소시킬 수 있다. 어느 경우에도, 항체의 알짜 효과는, 효과기 T 세포, 특히 CD8+ 효과기 T 세포의 활성도를 증가시킬 것이다. 효과기 T 세포의 활성도의 변화를 결정하는 방법은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 대조군의 존재 하에 T 세포 증식의 증가 및/또는 T 세포 사이토카인 생산 수준에 비해서 항체의 존재 하에 T 세포 사이토카인 생산(예컨대, IFN-γ 또는 IL-2)의 수준의 증가, 또는 T 세포 증식의 증가를 포함한다. 세포 증식 및/또는 사이토카인 생산에 대한 검정은 잘 알려져 있다.
예를 들어, 폴리펩타이드는 하기(a) 내지 (e)를 유도 가능할 수 있다:
(a) 세포독성 T 세포, 즉, CD8+ T 세포의 활성화;
(b) 헬퍼 T 세포, 즉, CD4+ T 세포의 활성화;
(c) 수지상 세포의 활성화;
(d) 자연 살해 세포의 활성화; 및/또는
(e) Tregs의 효과기 T 세포로의 리프로그래밍(문헌[Akhmetzyanova et al., 2016, J Immunol. 196(1):484-92] 참조).
본 발명의 폴리펩타이드 또는 결합 도메인은 또한 이들의 결합 항체를 특징으로 할 수 있고 이들의 결합 항체로 정의될 수 있다. 표적을 향한 리간드의 결합능을 평가하기 위한 표준 검정법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA 및 유세포분석을 포함한다. 폴리펩타이드의 결합 역학(예컨대, 결합 친화도)은 또한 당업계에 공지된 표준 검정법에 의해, 예컨대, 표면 플라스몬 공명 분석(SPR)에 의해 평가될 수 있다.
용어 "결합 활성도" 및 "결합 친화도"는 표적에 결합하거나 결합하지 않는 폴리펩타이드 분자의 경향을 지칭하도록 의도된다. 결합 친화도는 폴리펩타이드 및 이의 표적에 대한 해리 상수(Kd)를 결정함으로써 정량화될 수 있다. 유사하게, 표적에 대한 폴리펩타이드의 결합의 특이성은, 폴리펩타이드 및 또 다른 비-표적 분자에 관하여 해리 상수와 비교해서, 표적에 대한 폴리펩타이드의 상대적 해리 상수(Kd)의 면에서 정의될 수 있다.
이 해리 상수의 값은 잘 알려진 방법에 의해 직접적으로 결정될 수 있고, 예를 들어, Caceci 등(Byte 9:340-362, 1984; 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)에 기재된 것과 같은 방법에 의해 심지어 복잡한 혼합물에 대해 산출될 수 있다. 예를 들어, Kd는 이중-필터 나이트로셀룰로스 필터 결합 검정, 예컨대, Wong & Lohman(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993)에 의해 개시된 것을 이용하여 확립될 수 있다. 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA 및 유세포분석법을 비롯한, 표적에 대한 리간드, 예컨대, 항체의 결합능을 평가하는 다른 표준 검정이 당업계에 공지되어 있다. 항체의 결합 역학(예컨대, 결합 친화도)은 또한 표준 검정, 예컨대, 비아코어(Biacore)(상표명) 시스템 분석에 의해 평가될 수 있다.
표적에 대한 항체의 결합이 그 표적의 또 다른 공지된 리간드, 예컨대 또 다른 항체에 의한 표적의 결합과 비교되는 경쟁적 결합 검정이 수행될 수 있다. 50% 저해가 발생하는 농도는 Ki로서 공지되어 있다. 이상적인 조건 하에, Ki는 Kd와 동등하다. Ki값은 결코 Kd 미만이 아닐 것이므로, Ki의 측정은 Kd에 대한 상한을 제공하도록 편리하게 대체될 수 있다.
결합 친화도의 대안적인 척도는 EC50 또는 IC50을 포함한다. 이 맥락에서, EC50은 폴리펩타이드가 고정된 양의 표적에 대한 그의 최대 결합의 50%를 달성하는 농도를 나타낸다. IC50은 폴리펩타이드가 고정된 양의 표적에 대해서 고정된 양의 경쟁자의 최대 결합의 50%를 저해하는 농도를 나타낸다. 두 경우에, 더 낮은 수준의 EC50 또는 IC50은 표적에 대한 더 높은 친화도를 나타낸다. 그의 표적에 대한 리간드의 EC50값 및 IC50값은 둘 다 잘 알려진 방법, 예를 들어, ELISA에 의해 결정될 수 있다. 폴리펩타이드의 EC50 및 IC50을 평가하는 적합한 검정법이 실시예에 제시된다.
본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 또 다른 비-표적 분자에 대한 결합에 대한 이의 친화도의 적어도 2배, 10배, 50배, 100배 또는 그 초과인 친화도로, 이의 표적에 결합 가능하다.
CD137 결합 도메인
본 발명의 이중특이성 폴리펩타이드는 CD137에 구체적으로 결합 가능한 결합 도메인(B1)을 포함한다.
유리하게는, 결합 도메인 B1은 10×10-9M 미만, 예를 들어, 4×10-9M 미만 또는 1.2×10-9M 미만의 KD로 인간 CD137에 결합한다.
예시적인 실시형태에 있어서, 결합 도메인 B1은 하기 (a) 내지 (t)를 포함한다:
(a) 항체 1200/1201의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 79 및/또는 서열번호 46, 65 및 72);
(b) 항체 1202/1203의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 80 및/또는 서열번호 60, 66 및 73);
(c) 항체 1204/1205의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 81 및/또는 서열번호 61, 67, 74);
(d) 항체 1214/1215의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 82 및/또는 서열번호 46, 68 및 75);
(e) 항체 1618/1619의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 83 및/또는 서열번호 62, 69 및 76);
(f) 항체 1620/1621의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 84 및/또는 서열번호 63, 70 및 77);
(g) 항체 1626/1627의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 85 및/또는 서열번호 64, 71 및 78);
(h) 항체 3012/3013의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 158, 155 및 83);
(i) 항체 3014/3015의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 62, 69 및 76 및/또는 서열번호 159, 160 및 83);
(j) 항체 3016/3017의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 62, 69 및 76 및/또는 서열번호 159, 155 및 83);
(k) 항체 3018/3019의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 158, 161 및 83);
(l) 항체 3020/3021의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 162, 163 및 83);
(m) 항체 3022/3023의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 159, 155 및 83);
(n) 항체 3024/3025의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 54, 55 및 83);
(o) 항체 3026/3027의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 162, 165 및 83);
(p) 항체 3028/3029의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 157, 69 및 76 및/또는 서열번호 159, 166 및 83);
(q) 항체 3030/3031의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 54, 166 및 83);
(r) 항체 3032/3033의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 54, 55 및 83);
(s) 항체 3034/3035의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 62, 69 및 76 및/또는 서열번호 54, 155 및 83); 또는
(t) 항체 3036/3037의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 162, 155 및 83).
여기서 항체(예컨대, 항체 X/Y)의 넘버링은 중쇄 가변 영역(X) 및 경쇄 가변 영역(Y)를 각각 정의한다(또는, 여기서 단일의 번호가 나타날 경우, 중쇄 가변 영역[X]만이 정의된다).
따라서, 결합 도메인 B1은 하기 (a) 내지 (t)를 포함할 수 있다:
(a) 항체 1200/1201의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 19 및/또는 서열번호 17);
(b) 항체 1202/1203의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 23 및/또는 서열번호 21);
(c) 항체 1204/1205의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 25 및/또는 서열번호 27);
(d) 항체 1214/1215의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 31 및/또는 서열번호 29);
(e) 항체 1618/1619의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 35 및/또는 서열번호 33);
(f) 항체 1620/1621의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 39 및/또는 서열번호 37);
(g) 항체 1626/1627의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 43 및/또는 서열번호 41);
(h) 항체 3012/3013의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 114 및/또는 서열번호 115);
(i) 항체 3014/3015의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 116 및/또는 서열번호 117);
(j) 항체 3016/3017의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 118 및/또는 서열번호 119);
(k) 항체 3018/3019의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 120 및/또는 서열번호 121);
(l) 항체 3020/3021의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 122 및/또는 서열번호 123);
(m) 항체 3022/3023의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 124 및/또는 서열번호 125);
(n) 항체 3024/3025의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 126 및/또는 서열번호 127);
(o) 항체 3026/3027의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 128 및/또는 서열번호 129);
(p) 항체 3028/3029의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 130 및/또는 서열번호 131);
(q) 항체 3030/3031의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 132 및/또는 서열번호 133);
(r) 항체 3032/3033의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 134 및/또는 서열번호 135);
(s) 항체 3034/3035의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 136 및/또는 서열번호 137); 또는
(t) 항체 3036/3037의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 138 및/또는 서열번호 139).
본 발명의 이중특이성 폴리펩타이드는 대안적으로 위에서 정의된 가변 영역의 변이체를 포함할 수 있다 것이 당업자에 의해 인식될 것이다.
본 명세서에서 인용된 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열 중 임의의 것의 변이체는 상기 서열의 치환, 결실 또는 부가 변이체일 수 있다. 변이체는 상기 서열로부터의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개 이하, 20개 이하, 30개 이하 또는 이것 초과의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다. "결실" 변이체는 개별 아미노산의 결실, 작은 그룹의 아미노산, 예컨대, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산의 결실, 또는 더 큰 아미노산 영역의 결실, 예컨대 특정한 아미노산 도메인 또는 다른 특징의 결실을 포함한다. "치환" 변이체는 바람직하게는 동일한 수의 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 대체 및 보존적 아미노산 치환을 만드는 것을 포함한다. 예를 들어, 아미노산은 유사한 특성을 지니는 대안적인 아미노산, 예를 들어 또 다른 염기성 아미노산, 또 다른 산성 아미노산, 또 다른 중성 아미노산, 또 다른 하전된 아미노산, 또 다른 친수성 아미노산, 또 다른 소수성 아미노산, 또 다른 극성 아미노산, 또 다른 방향족 아미노산 또는 또 다른 지방족 아미노산에 의해 치환될 수 있다. 적합한 치환기를 선택하기 위해 사용될 수 있는 20개의 주요 아미노산의 여러 특성은 하기와 같다:
Figure pct00001
여기서의 아미노산은 전체 명칭, 3문자 코드 또는 단일 문자 코드로 지칭될 수 있다.
바람직한 "유도체" 또는 "변이체"는 천연형 아미노산 대신에 서열에서 나타나는 아미노산이 이의 구조 유사체인 것들을 포함한다. 서열에서 사용된 아미노산은 또한 유도체화 또는 변형, 예컨대, 표지될 수 있고, 단, 항체의 기능은 상당히 부정적으로 영향을 받지 않는다.
위에서 기재된 바와 같은 유도체 및 변이체는 부위 지정 돌연변이유발, 랜덤 돌연변이유발, 또는 효소 절단 및/또는 핵산의 결찰의 공지된 기법을 이용하여 항체의 합성 동안 또는 제조 후 변형에 의해, 또는 항체가 재조합 형태일 경우 제조될 수 있다.
바람직하게는 변이체는 본 명세서에 개시된 서열에 나타낸 바와 같은 서열(예컨대, 그 안의 VH 또는 VL 영역 서열, 또는 CDR 서열)에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예를 들어 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 아미노산 동일성의 이 수준은, 전장 폴리펩타이드의 크기에 따라, 관련 서열 번호 서열의 전체 길이에 걸쳐서 또는 그 서열의 일부에 대해서, 예컨대, 20, 30, 50, 75, 100, 150, 200개 또는 그 이상의 아미노산에 걸쳐서 보일 수 있다.
예를 들어, 상기 CDR 서열의 변이체는 기준 서열에 대해서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이(예컨대, 아미노산의 결실, 치환 및/또는 삽입)를 포함할 수 있다.
아미노산 서열과 관련하여, "서열 동일성"은 하기 매개변수에 의해 ClustalW(Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22(22):4673-80; 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨)를 이용해서 평가될 경우 기술된 값을 갖는 서열을 지칭한다:
쌍 정렬 매개변수(pairwise alignment parameter) - 방법: 정확한 매트릭스: PAM, 갭 오픈 패널티(Gap open penalty): 10.00, 갭 연장 패널티: 0.10;
다수의 정렬 매개변수 - 매트릭스: PAM, 갭 오픈 패널티: 10.00%, 지연에 대한 동일성: 30, 최종 갭의 패널티: 유, 갭 분리 거리: 0, 음성 매트릭스: 없음, 갭 연장 패널티: 0.20, 잔기 특이적 갭 패널티: 있음, 친수성 갭 패널티: 있음, 친수성 잔기: GPSNDQEKR. 특정한 잔기에 대한 서열 동일성은 단순히 유도체화된 동일한 잔기를 포함하도록 의도된다.
따라서, 일 실시형태에 있어서, 결합 도메인 B1은 이에 대해서 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 위에서 정의된 경쇄 가변 영역 및/또는 상기 중쇄 가변 영역의 하나 이상의 변이체를 포함할 수 있다.
바람직한 실시형태에 있어서, 결합 도메인 B1은 하기 (a) 내지 (t)를 포함한다:
(a) 항체 1200/1201의 중쇄 및/또는 경쇄;
(b) 항체 1202/1203의 중쇄 및/또는 경쇄;
(c) 항체 1204/1205의 중쇄 및/또는 경쇄;
(d) 항체 1214/1215의 중쇄 및/또는 경쇄;
(e) 항체 1618/1619의 중쇄 및/또는 경쇄;
(f) 항체 1620/1621의 중쇄 및/또는 경쇄;
(g) 항체 1626/1627의 중쇄 및/또는 경쇄;
(h) 항체 3012/3013의 중쇄 및/또는 경쇄;
(i) 항체 3014/3015의 중쇄 및/또는 경쇄;
(j) 항체 3016/3017의 중쇄 및/또는 경쇄;
(k) 항체 3018/3019의 중쇄 및/또는 경쇄;
(l) 항체 3020/3021의 중쇄 및/또는 경쇄;
(m) 항체 3022/3023의 중쇄 및/또는 경쇄;
(n) 항체 3024/3025의 중쇄 및/또는 경쇄;
(o) 항체 3026/3027의 중쇄 및/또는 경쇄;
(p) 항체 3028/3029의 중쇄 및/또는 경쇄;
(q) 항체 3030/3031의 중쇄 및/또는 경쇄;
(r) 항체 3032/3033의 중쇄 및/또는 경쇄;
(s) 항체 3034/3035의 중쇄 및/또는 경쇄; 또는
(t) 항체 3036/3037의 중쇄 및/또는 경쇄.
예를 들어, 결합 도메인 B1은 항체 1200/1201의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역(서열번호 19 및/또는 서열번호 17), 또는 서열번호 19 및/또는 서열번호 17에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
대안적으로, 결합 도메인 B1은 항체 1618/1619의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역(서열번호 35 및/또는 서열번호 33), 또는 서열번호 35 및/또는 서열번호 33에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
종양 세포- 표적화 도메인
본 발명의 이중특이성 폴리펩타이드는 종양 세포-관련 항원에 특이적으로 결합 가능한 결합 도메인(B2)를 더 포함한다.
"종양 세포-관련 항원"은, 종양 세포의 세포외 표면에 접근 가능한 단백질을 포함하므로, 이는 신체 내로 투여된 후에 본 발명의 이중특이성 폴리펩타이드에 접근 가능하다. 일 실시형태에 있어서, 종양 세포-관련 항원은 종양 특이적이며, 즉, 통상의 건강한 세포가 아니라 종양 세포에서 배타적으로 발견된다. 그러나, 당업자라면, 종양 세포-관련 항원가 우선적으로 종양 세포에서 발현될 수 있으며, 즉, 정상의 건강한 세포가 아니라 보다 높은 수준에서 종양 세포에 발현되는 것(즉, 종양 세포 상에의 항원의 발현은 정상의 건강한 세포 상에서 적어도 5배 초과, 예를 들어, 종양 세포 상의 발현 수준이 적어도 10배 초과, 12배 초과, 15배 초과일 수 있음)이 이해될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 결합 도메인 B2는, 하기 (a) 내지 (l)로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 세포-관련 항원에 결합된다:
(a) 돌연변이된 종양유전자 및 종양 억제 유전자의 산물;
(b) 과발현된 또는 이상 발현된 세포 단백질;
(c) 종양 바이러스에 의해 생산된 종양 항원;
(d) 태아종양 항원;
(e) 변경된 세포 표면 당지질 및 당단백질;
(f) 세포 유형-특이적 분화 항원;
(g) 저산소증-유도 항원;
(h) MHC 부류 I에 의해 제시된 종양 펩타이드;
(i) 상피 종양 항원;
(j) 혈액학적 종양-관련 항원;
(k) 고환암 항원; 및
(l) 흑색종 항원.
따라서, 종양 세포-관련 항원은 5T4, CD20, CD19, MUC-1, 암배아 항원(CEA), CA-125, CO17-1A, EpCAM, HER2, EGFR, HER3, GD2, 포도칼릭신, TROP-2, DLK-1, Ox1R, 넥틴-4(Nectin-4), FAP, EphA2, EphA3, 메소텔린, E-카드헤린, CD24 및 VEGFR로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 종양 세포-관련 항원은 태아종양 항원이다. 예를 들어, 종양 세포-관련 항원은 5T4일 수 있다(예를 들어, UniProt Q13641 참조).
일 실시형태에 있어서, 종양 세포는 고형 종양 세포이다.
예를 들어, 고형 종양은 신장세포 암종, 결장직장암, 폐암, 전립선암, 유방암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 자궁경부암, 식도암, 위암, 두/경부암, 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
유리하게는, 결합 도메인 B2는 10×10-9M 미만, 예를 들어, 4×10-9M 미만 또는 1.2×10-9M 미만의 KD로 종양 세포-관련 항원에 결합한다.
예시적인 실시형태에 있어서, 결합 도메인 B2는 하기 (a) 내지 (m)을 포함한다:
(a) 항체 1206/1207의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 56 및/또는 서열번호 45, 47 및 50);
(b) 항체 1208/1135의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 57 및/또는 서열번호 46, 48 및 51);
(c) 항체 1210/1211의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 58 및/또는 서열번호 46, 48 및 52);
(d) 항체 1212/1213의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 59 및/또는 서열번호 46, 49 및 53);
(e) 항체 2992/2993의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 144, 48 및 52 및/또는 서열번호 145, 55 및 58);
(f) 항체 2994/2995의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 146, 147 및 52 및/또는 서열번호 145, 55 및 58);
(g) 항체 2996/2997의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 146, 48 및 52 및/또는 서열번호 148, 55 및 58);
(h) 항체 2998/2999의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 146, 48 및 52 및/또는 서열번호 149, 55 및 58);
(i) 항체 3000/3001의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 150, 48 및 52 및/또는 서열번호 148, 151 및 58);
(j) 항체 3002/3003의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 152, 48 및 52 및/또는 서열번호 145, 55 및 58);
(k) 항체 3004/3005의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 146, 48 및 52 및/또는 서열번호 153, 55 및 58);
(l) 항체 3006/3007의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 144, 48 및 52 및/또는 서열번호 154, 155 및 58); 또는
(m) 항체 3008/3009의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 146, 48 및 52 및/또는 서열번호 154, 55 및 58).
여기서 항체(예컨대, 항체 X/Y)의 넘버링은 중쇄 가변 영역(X) 및 경쇄 가변 영역(Y)를 각각 정의한다(또는, 여기서 단일의 번호가 나타날 경우, 중쇄 가변 영역[X]만이 정의된다).
따라서, 결합 도메인 B2는 하기 (a) 내지 (l)을 포함할 수 있다:
(a) 항체 1206/1207의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 3 및/또는 서열번호 1);
(b) 항체 1208/1135의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 7 및/또는 서열번호 5);
(c) 항체 1210/1211의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 11 및/또는 서열번호 9);
(d) 항체 1212/1213의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 15 및/또는 서열번호 13);
(e) 항체 2992/2993의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 96 및/또는 서열번호 97);
(f) 항체 2994/2995의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 98 및/또는 서열번호 99);
(g) 항체 2996/2997의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 100 및/또는 서열번호 101);
(h) 항체 2998/2999의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 102 및/또는 서열번호 103);
(i) 항체 3000/3001의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 104 및/또는 서열번호 105);
(j) 항체 3002/3003의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 106 및/또는 서열번호 107);
(k) 항체 3004/3005의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 108 및/또는 서열번호 109);
(l) 항체 3006/3007의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 110 및/또는 서열번호 111); 또는
(m) 항체 3008/3009의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 112 및/또는 서열번호 113).
당업자라면, 결합 도메인 B2가 대안적으로, 예를 들어, 이에 대해서 적어도 90% 서열 동일성을 갖는, 상기 경쇄 가변 영역 및/또는 상기 중쇄 가변 영역의 변이체를 포함할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
예를 들어, 상기 CDR 서열의 변이체는 기준 서열에 대해서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 아미노산 돌연변이(예컨대, 아미노산의 결실, 치환 및/또는 삽입)를 포함할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 결합 도메인 B2는 하기 (a) 내지 (m)을 포함한다:
(a) 항체 1206/1207의 중쇄 및/또는 경쇄;
(b) 항체 1208/1135의 중쇄 및/또는 경쇄;
(c) 항체 1210/1211의 중쇄 및/또는 경쇄;
(d) 항체 1212/1213의 중쇄 및/또는 경쇄;
(e) 항체 2992/2993의 중쇄 및/또는 경쇄;
(f) 항체 2994/2995의 중쇄 및/또는 경쇄;
(g) 항체 2996/2993의 중쇄 및/또는 경쇄;
(h) 항체 2998/2999의 중쇄 및/또는 경쇄;
(i) 항체 3000/3001의 중쇄 및/또는 경쇄;
(j) 항체 3002/3003의 중쇄 및/또는 경쇄;
(k) 항체 3004/3005의 중쇄 및/또는 경쇄;
(l) 항체 3006/3007의 중쇄 및/또는 경쇄; 또는
(m) 항체 3008/3009의 중쇄 및/또는 경쇄.
예를 들어, 결합 도메인 B2는 항체 1208/1135의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역(서열번호 7 및 서열번호 5), 또는 서열번호 7 및/또는 서열번호 5에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
대안적으로, 결합 도메인 B2는 항체 1210/1211의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역(서열번호 11 및 서열번호 9), 또는 서열번호 11 및/또는 서열번호 9에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
대안적으로, 결합 도메인 B2는 항체 2992/2993의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역(서열번호 96 및 서열번호 97), 또는 서열번호 96 및/또는 서열번호 97에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
대안적으로, 결합 도메인 B2는 항체 2994/2995의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역(서열번호 98 및 서열번호 99), 또는 서열번호 98 및/또는 서열번호 99에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함한다.
예시적인 CD137 - 5T4 이중특이성 항체
본 발명의 이중특이성 폴리펩타이드의 하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 결합 도메인 B1은 IgG이고 결합 도메인 B2는 scFv이다. 반대로, 결합 도메인 B1은 scFv일 수 있고 결합 도메인 B2는 IgG일 수 있다.
본 발명의 이중특이성 폴리펩타이드의 대안적인 바람직한 실시형태에 있어서, 결합 도메인 B1은 (예컨대, scFv2-Fc 형식에서) scFv이고 결합 도메인 B2는 scFv이다.
본 발명의 예시적인 이중특이성 폴리펩타이드에 있어서:
(a) B1은 항체 1200/1201의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 79 및/또는 서열번호 46, 65 및 72)을 포함하고 B2는 항체 1208/1135의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 57 및/또는 서열번호 46, 48 및 51)을 포함하거나;
(b) B1은 항체 1200/1201의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 79 및/또는 서열번호 46, 65 및 72)을 포함하고 B2는 항체 1210/1211의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 58 및/또는 서열번호 46, 48 및 52)을 포함하거나;
(c) B1은 항체 1618/1619의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 83 및/또는 서열번호 62, 69 및 76)을 포함하고 B2는 항체 1208/1135의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 57 및/또는 서열번호 46, 48 및 51); 또는
(d) B1은 항체 1618/1619의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 83 및/또는 서열번호 62, 69 및 76)을 포함하고 B2는 항체 1210/1211의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 58 및/또는 서열번호 46, 48 및 52)을 포함한다.
따라서, 소정의 실시형태에 있어서:
(a) B1은 항체 1200/1201의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 19 및/또는 서열번호 17)을 포함하고 B2는 항체 1208/1135의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 7 및/또는 서열번호 5)을 포함하거나;
(b) B1은 항체 1200/1201의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 19 및/또는 서열번호 17)을 포함하고 B2는 항체 1210/1211의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 11 및/또는 서열번호 9)을 포함하거나;
(c) B1은 항체 1618/1619의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 35 및/또는 서열번호 33)을 포함하고 B2는 항체 1208/1135의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 7 및/또는 서열번호 5)을 포함하거나;
(d) B1은 항체 1618/1619의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 35 및/또는 서열번호 33)을 포함하고 B2는 항체 1210/1211의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 11 및/또는 서열번호 9)을 포함하거나; 또는
(e) (위에서 논의된 바와 같이) 예를 들어, 이에 대해서 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 상기 경쇄 가변 영역 및/또는 상기 중쇄 가변 영역의 변이체.
바람직한 실시형태에 있어서, B1은 항체 1200/1201의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 19 및/또는 서열번호 17)을 포함하고 B2는 항체 1210/1211의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 11 및/또는 서열번호 9), 또는 (예를 들어, 이에 대해서 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는) 상기 경쇄 가변 영역 및/또는 상기 중쇄 가변 영역의 변이체를 포함한다.
대안적인 바람직한 실시형태에 있어서, B1은 항체 1210/1211의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 11 및/또는 서열번호 9)을 포함하고 B2는 항체 1618/1619의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 35 및/또는 서열번호 33), 또는 (예를 들어, 이에 대해서 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는) 상기 경쇄 가변 영역 및/또는 상기 중쇄 가변 영역의 변이체를 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 이중특이성 항체 폴리펩타이드는, 위에서 정의된 가변 영역 서열에 부가해서, 불변 영역 서열을 포함할 수 있다.
(완전한 중쇄를 형성하기 위하여) 본 명세서에 개시된 임의의 VH 영역 서열과 조합될 수 있는 예시적인 중쇄 불변 영역 아미노산 서열은 하기 IgG1 중쇄 불변 영역 서열이다:
Figure pct00002
또는 L234A 및 L235A("LALA") 돌연변이를 포함하는 이의 변이체(위에서 강조된 아미노산 잔기 참조).
마찬가지로, (완전한 경쇄를 형성하기 위하여) 본 명세서에 개시된 임의의 VL 영역 서열과 조합될 수 있는 예시적인 경쇄 불변 영역 아미노산 서열은 하기에 재현된 카파쇄 불변 영역 서열이다:
Figure pct00003
따라서, 본 발명의 이중특이성 항체는 하기 (a) 내지 (d)를 포함할 수 있다:
(a) 서열번호 17, 21, 27, 29, 33, 37, 41, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136 또는 138 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 19, 23, 25, 31, 35, 39, 43, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135 또는 139 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인(B1);
(b) Fc 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역(예를 들어, 서열번호 94 또는 96);
(c) 서열번호 1, 5, 9, 13, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110 또는 112 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 3, 7, 11, 15, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 또는 113 중 어느 하나의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인(B2) 및
(d) 선택적으로, 경쇄 불변 영역(예를 들어 서열번호 95).
하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 이중특이성 항체는 IgG-scFv 이중특이성 항체이다(예를 들어, B1은 무손상 IgG이고 B2는 IgG의 중쇄의 C-말단에 부착된 scFv이거나, 또는 그 반대이다).
예를 들어, 이중특이성 항체는 하기 성분을 포함할 수 있다:
(a) N-말단에서부터 C 말단의 순서로, 각각 하기를 포함하는 2개의 중쇄:
[VH 서열] - [H쇄 불변 영역] - [커넥터] - [scFv]
여기서 scFv는 N-말단에서부터 C 말단의 순서로 하기로 구성될 수 있음:
[VH 서열] - [링커] - [VL 서열], 또는 그 반대
(b) N-말단에서부터 C 말단의 순서로 각각 하기를 포함하는 2개의 경쇄:
[VL 서열] - [L쇄 불변 영역]
이러한 "모리슨 형식(Morrison format)" 이중특이성 항체에 있어서:
- VH 서열은 본 명세서에 개시된 것들 중 어느 하나로부터, 예를 들어, 클론 1618(서열번호 33), 클론 1210(서열번호 9) 또는 이의 변이체로부터 선택될 수 있고;
- H쇄 불변 영역은 본 명세서에 개시된 것들 중 어느 하나로부터, 예를 들어 서열번호 86 또는 94로부터 선택될 수 있으며;
- 커넥터는 본 명세서에 개시된 것들 중 어느 하나로부터, 예를 들어 서열번호 92 또는 140 또는 143으로부터 선택될 수 있고;
- scFv 내의 링커는 본 명세서에 개시된 것들 중 어느 하나로부터, 예를 들어 서열번호 93으로부터 선택될 수 있으며,
- scFv 내의 VL 서열은 본 명세서에 개시된 것들 중 어느 하나로부터, 예를 들어, 클론 1619(서열번호 35), 클론 1211(11) 또는 이의 변이체로부터 선택될 수 있고; 그리고
- L쇄 불변 영역은 본 명세서에 개시된 것들 중 어느 하나로부터, 예를 들어 서열번호 95로부터 선택될 수 있다.
위에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 항체 폴리펩타이드의 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
편리하게는, 항체 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드이거나 또는 이를 포함한다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서의 발현과 같은 이러한 재조합 폴리펩타이드의 적합한 제조 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Green & Sambrook, 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor, New York] 참조, 이 문헌에서의 관련된 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨).
본 발명의 항체 폴리펩타이드는 또한 상업적으로 입수 가능한 시험관내 변역 시스템, 예컨대, 토끼 망상적혈구 용해물 또는 맥아 용해물(프로메가사(Promega)로부터 입수 가능함)을 이용해서 생산될 수 있다. 바람직하게는, 번역 시스템은 토끼 망상적혈구 용해물이다. 편리하게는 번역 시스템은 예컨대, TNT 전사-번역 시스템(프로메가사)과 같은 번역 시스템에 커플링될 수 있다. 이 시스템은 번역과 동일한 반응에서 암호화 DNA 폴리뉴클레오타이드로부터 적합한 mRNA 전사물을 생성하는 이점을 갖는다.
당업자라면, 본 발명의 항체 폴리펩타이드가 대안적으로 예를 들어, 잘 알려진 액상 또는 고상 합성 수법(예컨대, t-Boc 또는 Fmoc 고상 펩타이드 합성)을 이용해서 인공적으로 합성될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
폴리뉴클레오타이드 , 벡터 및 세포
본 발명의 제2 양상은 선행하는 청구범위 중 임의의 한 항에 따른 이중특이성 폴리펩타이드 또는 이의 성분 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 핵산 분자는 표 A에 제공된 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같은 임의의 폴리펩타이드, 또는 B1의 전부 또는 일부, 또는 B2의 전부 또는 일부를 암호화할 수 있다. 용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되며, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중 하나의 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 비제한적 예는 유전자, 유전자 단편, 메신저 RNA(mRNA), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 단리된 또는 실질적으로 단리된 형태로 제공될 수 있다. 실질적으로 단리된은 실질적이지만, 전체는 아닌, 임의의 주변 배지로부터의 폴리펩타이드의 단리가 있을 수 있다는 것을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 그들의 의도된 사용을 방해하지 않고 여전히 실질적으로 단리된으로서 고려되는 담체 또는 희석제와 혼합될 수 있다.
선택된 폴리펩타이드를 "암호화하는" 핵산 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓일 때 생체내에서 폴리펩타이드로 (DNA의 경우에) 전사되고 (mRNA의 경우에) 번역된 핵산 분자이다. 암호 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에서 시작 코돈 및 3'(카복시) 말단에서 번역 중단 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 핵산 서열은 바이러스로부터의 cDNA, 원핵 또는 진핵 mRNA, 바이러스 또는 원핵 DNA 또는 RNA로부터의 게놈 서열 및 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 전사 종결 서열은 암호화 서열에 대해 3'에 위치될 수 있다.
항체의 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열의 예를 암호화하는 대표적인 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 개시된 뉴클레오타이드 서열 중 임의의 하나, 예를 들어, 표 A에 제시된 서열을 포함하거나 또는 이것으로 이루어질 수 있다.
적합한 폴리뉴클레오타이드 서열은 대안적으로 이들 특정 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 변이체는 상기 핵산 서열 중 임의의 것의 치환, 결실 또는 첨가 변이체일 수 있다. 변이체 폴리뉴클레오타이드는 서열 목록에서 부여된 서열로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 10개까지, 20개까지, 30개까지, 40개까지, 50개까지, 75개 이상까지의 핵산 치환 및/또는 결실을 포함할 수 있다.
적합한 변이체는 본 명세서에 개시된 핵산 서열 중 임의의 하나의 폴리뉴클레오타이드에 대해 적어도 70% 상동성, 바람직하게는 그에 대해 적어도 80 또는 90% 및 더 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 바람직하게는, 이들 수준에서 상동성 및 동일성은 적어도 폴리뉴클레오타이드의 암호 영역에 대해 존재한다. 상동성을 측정하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 본 내용에서, 상동성은 핵산 동일성에 기반하여 계산된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 상동성은 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 30개, 예를 들어, 적어도 40, 60, 100, 200개 이상의 인접한 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 존재할 수 있다. 이러한 상동성은 비변형 폴리뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐 존재할 수 있다.
변이체는 본 명세서에 개시된 핵산 서열 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드에 대해서 적어도 70% 상동성, 바람직하게는, 이에 대해서 적어도 80 또는 90%, 더 바람직하게는 적어도 95%, 97% 또는 99% 상동성일 수 있다. 바람직하게는, 이들 수준에서의 상동성 및 동일성은 적어도 폴리뉴클레오타이드의 암호화 영역에 관하여 존재한다. 상동성을 측정하는 방법은, 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자라면, 본 발명이 맥락에서, 상동성이 핵산 동일성을 기초로 해서 계산되는 것임을 이해할 것이다. 이러한 상동성은 적어도 15, 바람직하게는 적어도 30, 예를 들어, 적어도 40, 60, 100, 200개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐서 존재할 수 있다. 이러한 상동성은 미변형 폴리뉴클레오타이드 서열의 전체 길이에 걸쳐서 존재할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 상동성 또는 동일성을 측정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 UWGCG 패키지는 상동성을 계산하기 위해 사용될 수 있는(예를 들어, 그의 디폴트 설정에 대해 사용되는) BESTFIT 프로그램을 제공한다(Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Research 12 :387-395; 이의 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨).
PILEUP 및 BLAST 알고리즘은 또한, 예를 들어 문헌[Altschul, 1993, J Mol Evol 36:290-300; Altschul et al, 1990, J Mol Biol 215:403-10, 이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨]에 기재된 바와 같이 (전형적으로 그들의 디폴트 설정에 대해) 상동성 또는 라인업 서열을 계산하기 위해 사용된다.
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국가생물공학센터(National Centre for Biotechnology Information)를 통해 공공연하게 입수 가능하다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열 내 동일 길이의 단어와 함께 정렬할 때 일부 양의 값 역치 스코어 T와 매칭되거나 또는 이를 충족시키는 질의 서열 내 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 스코어의 서열 쌍(high scoring sequence pair: HSP)을 처음으로 확인하는 것을 수반한다. T는 근처 단어 스코어 역치로서 지칭된다(Altschul 등, 상기 참조). 이들 초기 근처 단어 히트는 그들을 포함하는 HSP를 찾기 위한 연구를 개시하기 위한 종자로서 작용한다. 단어 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한 각각의 서열을 따라서 방향 둘 다로 연장된다. 각각의 방향에서 단어 히트에 대한 연장은, 누적 정렬 스코어가 하나 이상의 음의-스코어링 잔기 정렬의 축적에 기인하여 0 이하로 진행될 때; 또는 서열 중 하나의 끝에 도달될 때에 중단된다. BLAST 알고리즘 매개변수 W, T 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 단어 길이(W) 11, BLOSUM62 스코어링 매트릭스(문헌[Henikoff & Henikoff, 1992, Proc. Natl . Acad . Sci . USA 89:10915-10919]; 이의 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨) 정렬(B) 50, 예상치(E) 10, M=5, N=4, 및 가닥 둘 다의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 두 서열 사이의 유사성의 통계학적 분석을 수행한다; 예를 들어, 문헌[Karlin & Altschul, 1993, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90:5873-5787] 참조(이의 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 가지 측정은 두 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열이 우연히 생길 확률의 표시를 제공하는 가장 작은 합계 확률(P(N))이다. 예를 들어, 제1 서열 대 제2 서열의 비교에서 가장 작은 합계 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 더 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이라면, 다른 서열과 유사한 것으로 고려된다.
상동체는 3, 5, 10, 15, 20개 미만의 돌연변이만큼 관련된 폴리뉴클레오타이드 내 서열이 상이할 수 있다(이들 각각은 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다). 이들 돌연변이는 상동체의 적어도 30개, 예를 들어, 적어도 40, 60 또는 100개 이상의 인접한 뉴클레오타이드의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 변이체 서열은 유전자 암호에서의 중복도(redundancy) 때문에 서열 목록에서 주어진 특정 서열로부터 변할 수 있다. DNA 암호는 4개의 1차 핵산 잔기(A, T, C 및 G)를 가지며, 유기체 유전자에서 암호화된 단백질의 아미노산을 나타내는 3글자 코돈의 "스펠링(spell)"을 위해 이들을 사용한다. DNA 분자에 따른 코돈의 선형 서열은 해당 유전자에 의해 암호화되는 단백질(들) 내 아미노산의 선형 서열로 번역된다. 암호는 20개의 천연 아미노산에 대해 61가지의 코돈 암호 및 "정지" 신호를 나타내는 3가지 코돈으로 고도로 축퇴된다. 따라서, 대부분의 아미노산은 하나 초과의 코돈에 의해 암호화되며 - 사실 몇몇은 4개 이상의 상이한 코돈에 의해 암호화된다. 따라서 본 발명의 변이체 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 또 다른 폴리뉴클레오타이드와 동일한 폴리펩타이드 서열을 암호화할 수 있지만, 동일한 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈의 사용에 기인하여 상이한 핵산 서열을 가질 수 있다.
따라서 본 발명의 폴리펩타이드는 암호화되고 그것을 발현시킬 수 있는 폴리뉴클레오타이드의 형태로부터 생산되거나 또는 그런 형태로 전달될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 문헌[Green & Sambrook (2012, Molecular Cloning - a laboratory manual, 4th edition; Cold Spring Harbor Press; 이의 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨)]에서 예로서 기재된 바와 같이 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 합성될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 삽입된 서열에 작동 가능하게 연결된 제어 서열을 포함하는 발현 카세트의 형태로 제공될 수 있고, 따라서 생체내에서 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 허용한다. 이들 발현 카세트는 결국 전형적으로 벡터(예컨대, 플라스미드 또는 재조합 바이러스 벡터) 내에서 제공된다. 이러한 발현 카세트는 숙주 대상체에 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 숙주 대상체에게 투여될 수 있다. 바람직하게는, 폴리뉴클레오타이드는 유전자 벡터를 이용하여 제조되고/되거나 투여된다. 적합한 벡터는 충분한 양의 유전자 정보를 운반할 수 있고, 본 발명의 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 임의의 벡터일 수 있다.
따라서 본 발명은 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 이러한 발현 벡터는 분자 생물학 분야에서 일상적으로 구성되고, 본 발명의 펩타이드의 발현을 허용하기 위해, 예를 들어 플라스미드 DNA 및 적절한 개시제, 프로모터, 인핸서 및 기타 요소, 예를 들어 필요할 수 있는, 정확한 배향으로 위치될 수 있는 폴리아데닐화 신호의 사용을 수반할 수 있다. 다른 적합한 벡터는 당업자에게 분명할 것이다(문헌[Green & Sambrook, 상기 참조] 참조).
본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 변형된 세포를 포함한다. 이러한 세포는 일시적인, 또는 바람직하게는 안정적인 더 고등 진핵 세포주, 예컨대, 포유류 세포 또는 곤충 세포, 하등 진핵 세포, 예컨대, 효모 또는 원핵 세포, 예컨대 박테리아 세포를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 또는 발현 카세트의 삽입에 의해 변형될 수 있는 세포의 특정 예는 포유류 HEK293T, CHO, HeLa, NS0 및 COS 세포를 포함한다. 바람직하게는, 선택된 세포주는 안정적일 뿐만 아니라 폴리펩타이드의 성숙 글리코실화 및 세포 표면 발현을 허용하는 것일 것이다.
본 발명의 이러한 세포주는 본 발명의 폴리펩타이드를 생산하기 위한 일상적인 방법을 이용하여 배양될 수 있거나, 또는 대상체에게 본 발명의 항체를 치료적으로 또는 예방적으로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 발현 카세트 또는 벡터는 생체밖에서 대상체로부터의 세포에 투여될 수 있고, 이어서, 대상체의 신체로 복귀될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 이의 항체 중쇄 또는 가변 영역을 암호화한다.
일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 이의 항체 경쇄 또는 가변 영역을 암호화한다.
"핵산 분자"란, 단일- 또는 이중-가닥일 수 있는 DNA(예컨대, 게놈 DNA 또는 상보적 DNA) 및 mRNA 분자를 포함할 수 있다. "단리된"은, 핵산 분자가 위치되지 않거나 또는 다르게는 세포 내에 제공되는 것을 의미한다.
일 실시형태에 있어서, 핵산 분자는 cDNA 분자이다.
당업자라면, 핵산 분자가 특정 숙주 세포에서 항체 폴리펩타이드의 발현을 위하여, 예컨대, 인간 세포의 발현을 위하여 코돈-적합화될 수 있음을 이해할 것이다(예를 들어, 문헌[Angov, 2011, Biotechnol . J. 6(6):650-659] 참조, 이 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨).
또한 본 발명의 범위 내에서는 하기의 것들이 포함된다:
(a) 본 발명의 제3 양상은 본 발명의 제2 양상에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터(예컨대, 발현 벡터)를 제공하고;
(b) 본 발명의 제4 양상은 본 발명의 제2 양상에 따른 핵산 분자 또는 본 발명의 제3 양상에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포(예컨대, 포유류 세포, 예컨대, 인간 세포, 또는 중국 햄스터 난소 세포, 예컨대, CHOK1SV 세포)를 제공하며; 그리고
(c) 본 발명의 제5 양상은 본 발명의 제1 양상에 따른 항체 폴리펩타이드의 제조 방법을 제공하되, 해당 방법은, 상기 폴리펩타이드가 발현되는 조건 하에서 본 발명의 제4 양상에 따른 숙주 세포의 모집단을 배양하는 단계 및 이로부터 폴리펩타이드를 단리시키는 단계를 포함한다.
제6 양상에 있어서, 본 발명은 본 발명의 분자, 예컨대, 본 명세서에 기재된 항체, 이중특이성 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 분자, 예컨대, 본 발명의 하나 이상의 항체 및/또는 이중특이성 폴리펩타이드, 및 적어도 1종의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
당업자라면, 킬레이트제, 예컨대, EDTA, 시트르산염, EGTA 또는 글루타티온을 비롯한 추가의 화합물이 또한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
약제학적 조성물은 충분히 저장에 적합하고 인간 및 동물에게 투여하기에 적합한 당업계에 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 냉동 건조, 분무 건조, 분무 냉각을 통해서, 또는 초임계 입자 형성으로부터의 입자 형성을 통해서 동결건조될 수 있다.
"약제학적으로 허용 가능한"이란, 본 발명의 항체 폴리펩타이드의 CD137 및 5T4-결합 활성도의 효율을 감소시키지 않는 비독성 물질을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 완충제, 담체 또는 부형제는 당업계에 잘 알려져 있다(문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) 및 handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)] 참조, 이들 문헌의 개시내용은 참고로 본 명세서에 편입됨).
용어 "완충제"는 pH를 안정화시킬 목적으로 산-염기 혼합물을 함유하는 수성 용액을 의미하도록 의도된다. 완충제의 예는 트리즈마(Trizma), 비신(Bicine), 트리신(Tricine), MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, 헤페스(Hepes), HEPBS, MES, 포스페이트, 카보네이트, 아세테이트, 시트레이트, 글라이콜레이트, 락테이트, 보레이트, ACES, ADA, 타르트레이트, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, 카코딜레이트, CHES, DIPSO, EPPS, 에탄올아민, 글라이신, HEPPSO, 이미다졸, 이미다졸락트산, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO 및 TES이다.
용어 "희석제"는 약제학적 제제에서 항체 폴리펩타이드를 희석시킬 목적으로 수성 또는 비수성 용액을 의미하도록 의도된다. 희석제는 식염수, 물, 폴리에틸렌 글라이콜, 프로필렌 글라이콜, 에탄올 또는 오일(예컨대, 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 또는 참깨유) 중 1종 이상일 수 있다.
용어 "애주번트"는 본 발명의 항체 폴리펩타이드의 생물학적 효과를 증가시키기 위하여 제제에 첨가되는 임의의 화합물을 의미하도록 의도된다. 애주번트는 상이한 아실 조성물의 상이한 음이온, 예를 들어, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 티오사이아네이트, 설파이트, 하이드록사이드, 포스페이트, 카보네이트, 락테이트, 글라이콜레이트, 시트레이트, 보레이트, 타르트레이트 및 아세테이트(이들로 제한되지는 않음)와의 아연, 구리 또는 은 염 중 하나 이상일 수 있다. 애주번트는 또한 양이온성 중합체, 예컨대 양이온성 셀룰로스 에터, 양이온성 셀룰로스 에스터, 탈아세틸화 히알우론산, 키토산, 양이온성 덴드리머, 양이온성 합성 중합체, 예컨대 폴리(비닐 이미다졸) 및 양이온성 폴리펩타이드, 예컨대 폴리히스티딘, 폴리라이신, 폴리아르기닌 및 이들 아미노산을 함유하는 펩타이드일 수 있다.
부형제는 탄수화물, 중합체, 지질 및 미네랄 중 1종 이상일 수 있다. 탄수화물의 예는, 예를 들어, 동결건조를 용이하게 하기 위하여 조성물에 첨가되는 락토스, 글루코스, 수크로스, 만니톨 및 사이클로덱스트린을 포함한다. 중합체의 예는, 예를 들어 점도 제어를 위해, 생체접착을 달성하기 위하여, 또는 화학 및 단백분해 분해로부터 지질을 보호하기 위하여 조성물에 첨가되는, 전분, 셀룰로스 에터, 셀룰로스 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로스, 알기네이트, 카라기난, 히알우론산 및 이들의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리설포네이트, 폴리에틸렌글라이콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트 및 폴리비닐피롤리돈(모두 상이한 분자량임)이다. 지질의 예는, 중합체에 대한 것과 유사한 이유로 조성물에 첨가되는, 지방산, 인지질, 모노-, 다이- 및 트라이글라이세라이드, 세라마이드, 스핑고지질 및 글라이코리피드이고(모두 상이한 아실 사슬 길이 및 포화를 가짐), 난 레시틴, 콩 레시틴, 수소화 난 및 콩 레시틴이다. 미네랄의 예는 액체 축적의 감소 또는 유리한 안료 특성과 같은 이익을 얻기 위하여 조성물에 첨가되는 탈크, 산화마그네슘, 산화아연 및 산화티탄이다.
본 발명의 항체 폴리펩타이드는 이의 전달에 적합하도록 당업계에 공지된 임의의 유형의 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은, 항체 폴리펩타이드가, 다른 약제학적으로 허용 가능한 담체 이외에, 미셀, 불용성 단층 및 액체 결정으로서 응집된 형태로 존재하는 양친매성 물질, 예컨대, 지질과 조합된, 리포솜의 형태일 수 있다. 리포솜 제제에 적합한 지질은, 제한 없이, 모노글라이세라이드, 다이글라이세라이드, 설파타이드, 리소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등을 포함한다. 적합한 지질은 또한 혈류 순환 시간을 연장시키기 위해 극성 헤드 기에서 폴리(에틸렌 글라이콜)에 의해 상기 변형된 지질을 포함한다. 이러한 리포솜 제제의 제조는 예를 들어 미국 특허 제4,235,871호(이의 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨)에서 발견될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 생체분해성 미소구체의 형태일 수 있다. 지방족 폴리에스터, 예컨대 폴리(락트산)(PLA), 폴리(글라이콜산)(PGA), PLA 및 PGA의 공중합체(PLGA) 또는 폴리(카프로락톤)(PCL) 및 폴리언하이드라이드는 미소구체의 제조에서 생체분해성 중합체로서 널리 사용된다. 이러한 미소구체의 제조는 미국 특허 제5,851,451호 및 유럽 특허 제0 213 303호(이들의 개시내용은 본 명세서에 참고로 편입됨)에서 발견될 수 있다.
추가의 실시형태에 있어서, 본 발명의 약제학적 조성물은 중합체 겔의 형태로 제공되고, 여기서 중합체, 예컨대 전분, 셀룰로스 에터, 셀룰로스 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시에틸 셀룰로스, 에틸하이드록시에틸 셀룰로스, 알기네이트, 카라기난, 히알우론산 및 이들의 유도체, 폴리아크릴산, 폴리비닐 이미다졸, 폴리설포네이트, 폴리에틸렌글라이콜/폴리에틸렌 옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드/폴리프로필렌 옥사이드 공중합체, 상이한 가수분해도의 폴리비닐알코올/폴리비닐아세테이트 및 폴리비닐피롤리돈은 물질을 함유하는 용액의 점증에 사용된다. 중합체는 또한 젤라틴 또는 콜라겐을 포함할 수 있다.
대안적으로, 항체 폴리펩타이드는 단순히 식염수, 물, 폴리에틸렌 글라이콜, 프로필렌 글라이콜, 에탄올 또는 오일(예컨대, 홍화유, 옥수수유, 땅콩유, 면실유 또는 참깨유), 트래거캔트 검 및/또는 다양한 완충제에 용해될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물이 활성인 항체 폴리펩타이드의 작용의 강화를 위하여 이온 및 한정된 pH를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 추가적으로, 조성물은 종래의 약제학적 조작, 예컨대, 무균으로 처리될 수 있고/있거나, 종래의 애주번트, 예컨대, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 완충제, 충전제 등을 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 약제학적 조성물은 당업자에게 공지된 임의의 적합한 경로를 통해 투여될 수 있다. 따라서, 가능한 투여 경로는 비경구(정맥내, 피하 및 근육내), 국소, 눈, 코, 폐, 협측, 경구, 비경구, 질 및 직장을 포함한다. 또한 임플란트로부터의 투여가 가능하다.
하나의 바람직한 실시형태에 있어서, 약제학적 조성물은 비경구로, 예를 들어 정맥내로, 뇌혈관내로, 동맥내로, 복강내로, 포막내로(intrathecally), 심실내, 흉골내로, 두개골내로, 근육내로 또는 피하로 투여될 수 있거나, 이들은 주입 기법에 의해 투여될 수 있다. 이들은 용액이 혈액과 등장성이 되게 하기에 충분한 다른 물질, 예를 들어 염 또는 글루코스를 함유할 수 있는 무균 수성 용액의 형태로 최고로 사용된다. 수성 용액은 필요한 경우 (바람직하게는 3 내지 9의 pH로) 적절하게 완충되어야 한다. 무균 조건 하에 적합한 비경구 제제의 제조는 당업계의 당업자에게 널리 공지된 표준 약제학적 기법에 의해 용이하게 달성된다.
비경구 투여에 적합한 제형은, 당해 제형이 의도된 수혜자의 혈액과 등장성이 되게 하는 항산화제, 완충제, 세균 발육 저지제 및 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 무균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 무균 현탁액을 포함한다. 제형은 예를 들어 앰플 또는 바이알에 밀봉된 단위 용량 또는 다회 용량 용기에 제공될 수 있거나, 사용 직전에 오직 무균 액체 담체, 예를 들어 주사용수의 첨가를 요하는 냉동 건조(동결건조) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 주사 용액 및 현탁액은 이전에 기재된 종류의 무균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 약제학적 조성물은 비경구, 예컨대, 정맥내 투여에 특히 적합하다.
대안적으로, 약제학적 조성물은 또한 비강내로 또는 흡입에 의해 (예를 들어, 다이클로로다이플루오로메탄, 트라이클로로플루오로메탄, 다이클로로테트라플루오로-에탄, 하이드로플루오로알칸, 예컨대, 1,1,1,2-테트라플루오로에탄(HFA 134A3 또는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판(HFA 227EA3), 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스의 사용에 의해 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 분무장치로부터 건조 분말 흡입기 또는 에어로졸 스프레이 제시의 형태로) 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 투약량 단위는 계량된 양을 전달하도록 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 가압 용기, 펌프, 스프레이 또는 분무장치는 활택제, 예를 들어 소르비탄 트라이올레에이트를 추가적으로 함유할 수 있는, 예를 들어 용매로서 에탄올 및 추진제의 혼합물을 사용하여 활성 폴리펩타이드의 용액 또는 현탁액을 함유할 수 있다. 흡입기 또는 통기장치에서 사용하기 위한 (예를 들어, 젤라틴으로부터 제조된) 캡슐 및 카트리지는 본 발명의 화합물 및 적합한 분말 기제, 예컨대, 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 약제학적 유효 용량으로 환자에게 투여될 것이다. 본 명세서에서 이용되는 바와 같이 '치료적 유효량', 또는 '유효량', 또는 '치료적으로 유효한'은, 주어진 병태 및 투여 요법에 대해서 치료 효과를 제공하는 양을 지칭한다. 이것은 필요로 되는 첨가제 및 희석제, 즉, 담체, 또는 투여 비히클과 관련하여 목적하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 활성 물질의 미리 결정된 양이다. 또한, 숙주의 활성도, 기능 및 반응에서 임상적으로 상당한 결손을 저감, 가장 바람직하게는 예방하기에 충분한 양을 지칭한다. 대안적으로, 치료적 유효량은 숙주에서 임상적으로 상당한 상태의 개선을 일으키기에 충분하다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 화합물의 양은 이의 특정한 활성도에 따라 변할 수 있다. 적합한 투약량은 필요한 희석제와 연관되어 목적하는 치료적 효과를 내기 위해 계산된 활성 조성물의 미리 결정된 양을 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제조를 위한 방법 및 사용에 있어서, 활성 성분의 치료적 유효량이 제공된다. 치료적 유효량은, 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 환자 특징, 예컨대, 연령, 체중, 성별, 상태, 합병증, 다른 질환 등에 기초하여 통상의 숙련된 의학 또는 수의학 작업자에 의해 결정될 수 있다. 치료적 유효 용량의 투여는 개별적인 용량 단위 또는 그 밖의 수 개의 더 작은 용량 단위의 형태로 단일 투여 그리고 또한 특정 간격에서 더욱 분할된 용량의 다회 투여 둘 다에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 용량은 연장된 기간에 걸쳐서 연속적인 주입으로서 제공될 수 있다.
특히 바람직한 조성물은 전신 투여를 위해 제형화된다.
조성물은 바람직하게는 일정 시간 기간에 걸쳐서 지속 방출을 위해 제형화될 수 있다. 따라서, 조성물은 지속 방출을 용이하게 하는 매트릭스 내에 또는 매트릭스의 부분으로서 제공될 수 있다. 바람직한 지속 방출 기질은 몬타나이드 또는 γ-폴리글루탐산(PGA) 나노입자를 포함할 수 있다.
항체 폴리펩타이드는 사용 중인 폴리펩타이드의 효능/독성에 따라서 각종 농도에서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 제형은 0.1μM 내지 1mM, 더 바람직하게는 1μM 내지 500μM, 500μM 내지 1mM, 300μM 내지 700μM, 1μM 내지 100μM, 100 μM 내지 200μM, 200μM 내지 300μM, 300μM 내지 400μM, 400μM 내지 500μM, 500μM 내지 600μM, 600μM 내지 700μM, 800μM 내지 900μM, 또는 900μM 내지 1mM의 농도에서 활성 항체 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 전형적으로, 제형은 300μM 내지 700μM의 농도에서 활성 항체 폴리펩타이드를 포함한다.
전형적으로, 인간 환자에서 (치료적 모이어티를 갖는 또는 갖지 않는) 항체 폴리펩타이드의 치료적 용량은 투여당(70㎏ 체중을 기준으로) 100㎍ 내지 700㎎의 범위일 것이다. 예를 들어, 최대 치료적 용량은 투여당 0.1 내지 10㎎/㎏, 예컨대, 0.1 및 5㎎/㎏ 또는 1 및 5㎎/㎏ 또는 0.1 내지 2㎎/㎏의 범위일 수 있다. 이러한 용량은 종양학자/의사에 의해 결정되는 바와 같이 상이한 간격에서 투여될 수 있다는 것이; 예를 들어, 용량이 매일, 주 2회, 매주, 2주마다 또는 매달 투여될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
당업자라면, 본 발명의 약제학적 조성물이 암의 치료에서 사용되는 다른 치료제, 예컨대, 항대사물질, 알킬화제, 안트라사이클린류 및 기타 세포독성 항생제, 빈카 알킬로이드, 에토포사이드, 백금 화합물, 탁산류, 국소이성질체화효소 I 저해제, 기타 세포정지 약물, 항증식 면억억제제, 코르티코스테로이드, 성 호르몬 및 호르몬 길항제 및 기타 치료적 항체(예컨대, 종양-관련 항원 또는 면역 관문 조절제에 대한 항체)와 병용해서 또는 단독으로 투여될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은 PD-1/PD-1L, CTLA-4, OX40, CD40, GITR, LAG3, TIM3, CD27 및 KIR로 이루어진 군으로부터 선택된 표적에 결합하는 면역치료제와 병용하여 투여될 수 있다.
따라서, 본 발명은 면역 관문 분자와 특이적으로 결합하는, 암의 치료에서 유효한 추가의 면역치료제와 함께 본 발명의 이중특이성 폴리펩타이드를 포함하는 병용 요법을 포함한다. 추가의 면역치료제의 치료적 유익이 저해적 면역 관문 분자의 기능을 약화시킴으로써 그리고/또는 자극 면역 관문 또는 공-자극 분자의 기능을 활성화시킴으로써 매개될 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 추가의 면역치료제는 하기 (a) 내지 (d)로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(a) PD-1 및/또는 PD-1L의 기능을 저해하는 면역치료제;
(b) CTLA-4의 기능을 저해하는 면역치료제;
(c) OX40의 기능을 활성화시키는 면역치료제; 및
(d) CD40의 기능을 활성화시키는 면역치료제.
따라서, 추가의 면역치료제는 PD1 기능을 저해 가능한 PD1 저해제, 예컨대, 항-PD1 항체, 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 람브롤리주맙, PDR-001, MEDI-0680 및 AMP-224)일 수 있다. 대안적으로, PD1 저해제는 PD1 기능을 저해 가능한 항-PD-L1 항체, 또는 항원-결합 단편(예를 들어, 두르발루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙 및 MDX-1105)을 포함할 수 있거나 또는 이들로 이루어질 수 있다.
또 다른 실시형태에 있어서, 추가의 면역치료제는 CTLA-4 저해제, 예컨대, 항-CTLA-4 항체 또는 이의 항원-결합 부분이다.
추가의 실시형태에 있어서, 추가의 면역치료제는 OX40, 예컨대, 작용성 항-OX40 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 활성화시킨다.
추가의 실시형태에 있어서, 추가의 면역치료제는 CD40, 작용성 항-CD40 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 활성화시킨다.
당업자라면 두 활성제(위에서 상세히 기재됨)의 존재가 대상체에서 종양의 치료에 상승작용적 유익을 제공할 수 있음을 이해할 것이다. "상승작용적"은, (예컨대, 종양의 성장 속도 또는 크기를 참조하여 결정된 바대로) 병용되는 2종의 제제의 치료적 효과가 그들 자체로 투여되는 2종의 물질의 상가적 치료적 효과보다 높다는 것을 포함한다. 이러한 상승작용은, 고형 종양의 관련 세포주 모델에서, 활성제를 단독으로 그리고 병용하여 시험함으로써 식별될 수 있다.
본 발명의 범주 내에 본 발명의 폴리펩타이드 또는 다른 조성물 및 사용을 위한 설명서를 포함하는 키트가 있다. 키트는 1종 이상의 추가적인 시약, 예컨대, 위에서 논의된 바와 같은 추가적인 치료제 또는 예방제를 추가로 함유할 수 있다.
의학적 용도 및 방법
본 발명에 따른 폴리펩타이드는 치료 또는 예방에서 사용될 수 있다. 치료적 용도에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 병태 또는 그의 증상 중 하나 이상을 치료하거나, 완화시키거나 또는 부분적으로 저지시키기에 충분한 양으로 이미 장애 또는 병태를 앓고 있는 대상체에게 투여된다. 이러한 치료적 치료는 질환 증상의 중증도 감소 또는 무증상 기간의 빈도 또는 지속기간의 증가를 초래할 수 있다. 이를 달성하기에 적절한 양은 "치료적 유효량"으로서 정의된다. 예방적 적용에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 증상의 진행을 예방하거나 또는 저지시키는 데 충분한 양으로 장애 또는 병태의 증상을 아직 나타내지 않은 대상체에게 투여된다. 이러한 양은 "예방적 유효량"으로서 정의된다. 대상체는 임의의 적합한 수단에 의해 질환 또는 병태가 발생할 위험 중에 있는 것으로 확인되었을 수 있다.
따라서, 본 발명의 제7 양상은 의약에서 사용하기 위한 본 발명의 제1 양상에 따른 이중특이성 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명의 제8 양상은 대상체에서 신생물 장애를 치료함에 있어서 사용하기 위한 본 발명의 제 1양상에 따른 이중특이성 폴리펩타이드를 제공한다.
'치료'는 환자의 치료적 및 예방적 치료 둘 다를 포함한다. 용어 '예방적'은 신생물 장애의 가능성, 또는 환자 또는 대상체에서 암세포의 확산, 전파 또는 전이를 예방하거나 저감시키는, 본 명세서에 기재된 바와 같은 제제 또는 이의 제형의 용도를 포함하도록 사용된다. 용어 '예방적'은 또한, 신생물 장애에 대해서 이미 치료받았던 환자에서 신생물 장애의 재발을 방지하기 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 제제 또는 이의 제형의 용도를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 신생물 장애는 대상체의 신체 내의 고형 종양의 형성과 연관된다.
따라서, 고형 종양은 전립선암, 유방암, 폐암, 결장직장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 자궁경부암, 식도암, 위암, 두/경부암, 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 고형 종양은 신장세포 암종, 결장직장암, 폐암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 제9 양상은, 대상체의 신생물 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 본 발명의 제1 양상에 따른 이중특이성 폴리펩타이드의 용도를 제공한다.
일 실시형태에 있어서, 신생물 장애는 (예를 들어, 위에서 상세히 기재된 바와 같이) 대상체의 신체 내의 고형 종양의 형성과 연관된다.
본 발명의 제10 양상은 대상체에서 신생물 장애의 치료 또는 진단 방법을 제공하되, 상기 방법은 본 발명의 유효량의 제1 양상에 따른 이중특이성 폴리펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 신생물 장애는, (예를 들어, 위에서 상세히 기재된 바와 같이) 대상체의 신체 내의 고형 종양의 형성과 연관된다.
일 실시형태에 있어서, 대상체는 인간이다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 이중특이성 항체를 전신 투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에 있어서, 상기 방법은 1종 이상의 추가의 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함한다.
본 명세서에서 명백하게 이전에 간행된 문서의 나열 또는 논의는, 반드시 그 문서가 당업계의 상태의 일부이거나 통상의 일반적인 지식이라는 확인으로서 취해져서는 안 된다.
청구범위 및/또는 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용될 경우의 단수 표현의 사용은 "하나"를 의미할 수 있지만, 또한 "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 초과의"와 일치한다.
본 발명의 이들 및 기타 실시형태는 첨부 도면 및 상기 설명과 함께 고려될 경우 더욱 잘 인식되고 이해될 것이다. 그러나, 상기 설명은, 본 발명의 각종 실시형태 및 이의 많은 구체적인 상세를 나타내지만, 제한으로서가 아니라 예시로서 부여되는 것임이 이해되어야 한다. 많은 치환, 변형, 부가 및/또는 재배열이 본 발명의 정신으로부터 벗어나는 일 없이 본 발명의 범위 내에서 이루어질 수 있으며, 본 발명은 이러한 치환, 변형, 부가 및/또는 재배열의 모두를 포함한다.
이하의 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 소정의 양상을 더욱 입증하기 위하여 포함된다. 본 발명은 여기에 제시된 구체적인 실시형태의 상세한 설명과 함께 이들 도면의 하나 이상을 참조하면 더욱 잘 이해될 수 있다.
도 1은 본 발명의 이중특이성 항체에 대한 예시적인 형식의 구조의 개략적인 도해를 도시한다. 각 형식에서, 불변 영역은 채워진 밝은 회색으로서 표시되고; 가변 중쇄 영역 VH1은 체크무늬의 흑백으로서 표시되며; 가변 경쇄 영역 VL1은 채워진 백색으로서 표시되고; 가변 중쇄 영역 VH2는 채워진 흑색으로서 표시되며; 가변 경쇄 영역 VL2는 대각선을 가진 백색으로서 표시된다. CD137 결합 도메인(결합 도메인 1)은 전형적으로 체크무늬의 흑백 도메인과 채워진 백색 도메인(VH1/VL1)의 쌍으로서 표시되며; 종양-관련 항원 결합 도메인(결합 도메인 2)은 전형적으로 채워진 흑색 도메인과 대각선을 가진 백색 도메인의 쌍(VH2/VL2)으로서 표시된다. 그러나, 표시된 형식의 전부에서, 결합 도메인 1 및 2가 전환될 수 있는 것이 이해될 것이다. 즉, CD137 결합 도메인은 종양-관련 항원 도메인에 대해서 이 도면에 나타낸 위치에서 생길 수 있거나 그 반대일 수 있다.
도 2는, 유세포분석에 의해 분석된, 5T4-형질주입된 B16 세포에 대한 5T4 항체 결합의 용량-반응 실험의 일례를 도시한다.
도 3은 5T4-형질주입된 B16 세포에 대해서 2.5㎍/㎖의 농도에서 5T4 mAb 결합의 정규화된 평균 형광 강도(MFI)를 도시한 유세포분석 데이터를 도시한다. 이 도면은, 표 2에 나타낸 바와 같이, 각 항체에 대해서 1 내지 4개의 데이터 점을 가진, 4회의 실험으로부터의 풀링된 데이터의 평균 ± SD를 나타낸다. MFI값은 기준 항체 1628에 대해서 정규화되었다.
도 4는 사이노몰거스 5T4-형질주입된 CHO 세포에 대한 5T4 항체 결합의 용량-반응 분석을 나타낸다.
도 5는 5T4 항체의 에피토프 맵핑에 이용된 5T4 키메라의 예시도이다. A: 표시된 도메인 E1 내지 E7의 각각은 인간/마우스 키메라에서 마우스 5T4 서열로 대체되었다. B: aa 173-420은 마우스 5T4 서열에 의해 대체되었다.
도 6은 인간 및 사이노몰거스 CD137에 대해서 예시적인 항-CD137 항체의 결합을 도시한다. 두 개별적인 실험으로부터의 데이터가 포함된다.
도 7은 인간/마우스 CD137 키메라의 개요를 도시한다. 흑색: 마우스 서열, 백색: 인간 서열.
도 8은 기준 1811/1812에 대해서 정규화된 자극 지수값을 도시한다.
도 9는 CHO-huCD137 세포(25㎍/㎖)에 대한 CD137L 결합과의 CD137L mAb 경쟁의 두 실험의 요약을 도시한다.
도 10은 가교결합 항체의 존재 하의 CD137 활성화를 도시한다.
도 11은 가교결합 항체의 부재 하의 CD137 활성화를 도시한다.
도 12는 5T4-CD137 이중특이성 항체의 이중 ELISA의 용량-반응 곡선을 도시한다. 각 그래프는 각종 CD137 작용성 항체(1200[즉, 1200/1201], 1202, 1204, 1214, 1618, 1620 또는 1626)와 조합된 1종의 5T4 결합제(1206[즉, 1206/1207], 1208, 1210 또는 1212)에 기초한 데이터를 포함한다.
도 13은 본 발명의 예시적인 이중특이성 항체(bsAb)의 5T4-의존적 T 세포 활성화를 도시한다. 각 bsAb(1㎍/㎖)는 2 내지 4개의 개별적인 공여체에 기초한 CD8 T 세포 검정에서 시행되었다. 데이터는 기준(1200-1210)에 대한 평균 배수 변화로서 제시되고, 오차막대는 SD를 나타낸다. 그래프의 좌측 부분은, 5T4 scFv가 CD137 IgG 등에 융합된 이중특이성 항체, 즉, 1200-1206을 도시하는 반면, 그래프의 우측 부분은 CD137 scFv가 5T4 IgG 등에 융합된 이중특이성 항체, 즉, 1206-1200을 도시한다.
도 14는 5T4 의존적 T 세포 활성화를 도시하는 5T4-CD137 bsAb의 용량-반응을 도시한다. 데이터는 기준(1㎍/㎖에서 1200-1210)에 대한 배수 변화로서 분석된다. 상부 패널: IgG로서의 CD137 작용제 및 IgG의 C-말단에 융합된 scFv로서의 5T4 결합제. 하부 패널: IgG로서의 5T4 결합제 및 IgG의 C-말단에 융합된 scFv로서의 CD137 작용제. 클론 명칭은 도 10에 기재된 바와 같은 동일한 원리를 따른다.
도 15는 5T4-발현 종양 세포로 배양된 인간 CD8+ T 세포에 대한 예시적인 5T4-CD137 이중특이성 항체의 기능적 활성도를 도시한다. 모든 생성된 bsAb는 코팅된 5T4-Fc로 수행된 검정에서 얻어진 결과를 검증하기 위하여 완전 세포-기반 T 세포 검정에서 1㎍/㎖에서 평가되었다. 결과는 기준(1200-1210)에 대한 배수 변화로서 제시되고, 오차막대는 SD이다. 클론 명칭은 도 10에 기재된 바와 같은 동일한 원리를 따른다.
도 16은 (A) CHOh5T4 및 (B) CHOcyno5T4 세포에 대한 5T4 리드 최적화된 클론의 결합 곡선을 도시한 도면.
도 17은 (A) CHOhCD137 및 (B) CHOcynoCD137 세포에 대한 CD137 리드 최적화된 클론의 결합 곡선을 도시한 도면.
도 18은, EC50의 결정을 가능하게 하는 3-매개변수 S자형 용량-반응 모델로서 표현된, 5T4-Fc 코팅된 플레이트에서 배양된 인간 CD8+ T 세포에서의 정규화된 인터페론 감마(IFNγ) 반응을 도시한다.
도 19는, 검정 플레이트 간의 결과의 상관 관계를 가능하게 하기 위하여 정규화된 IFNγ 수준과 함께, 가교결합된 5T4-Fc를 이용한 CD8+ T 세포 검정에서의 리드 최적화된 bsAb에 대한 결과를 도시한다.
도 20은, 검정 플레이트 간의 결과의 상관 관계를 가능하게 하기 위하여 정규화된 IFNγ 수준과 함께, 가교결합된 5T4-Fc를 이용한 CD8+ T 세포 검정에서 상이한 링커로 생성된 bsAb에 대한 결과를 도시한다.
도 21은, EC50의 결과를 가능하게 하기 위하여 3-매개변수 S자형 용량-반응 모델로서 나타낸, 5T4-발현 및 5T4-비-발현 종양 세포로 배양된 간 CD8+ T 세포에서의 리드 최적화된 bsAb를 이용한 정규화된 인터페론 감마(IFNγ) 반응을 도시한다.
도 22는 5T4-Fc의 존재 하에 또는 부재 하에 PBMC의 CD137-매개 활성화로부터의 인터페론 감마(IFNγ) 반응을 도시한다.
도 23은 CD8+ T 세포 및 CD32-발현 L 세포의 공동-배양으로부터의 인터페론 감마(IFNγ) 반응을 도시한다.
도 24는 TAA-CD137 이중특이성 항체에 대한 이중 ELISA 검출 CD137로부터의 결과를 도시한다.
도 25는 CD3/TAA-코팅된 플레이트에서 배양된 CD8+ T 세포에서 TAA-CD137 이중특이성 항체를 이용한 인터페론 감마(IFNγ) 반응을 도시한 것으로 여기서 TAA는 (A) EpCAM, (B) EGFR 및 (C) Her2이다.
도 26은 항원-발현 종양에 대한 이중특이성 항체의 5T4-의존적 국재화를 도시한다. B16 및 B16-5T4 종양은 비히클, 1618-1210(bsAb), 1618(항-CD137 Mab) 또는 2112(기준 항-CD137 Mab)로 처리된 SCID-베이지 마우스로부터 수집하였다. 종양에 대한 항체의 국재화는 항-인간 IgG로 검출되고 유세포분석에 의해 분석되었다. 그래프는 생세포 중에서 인간 IgG+ 세포의 빈도를 도시한다(n=5).
도 27은 항원-발현 종양에 대한 이중특이성 항체의 5T4-의존적 국재화를 도시한다. CT26 및 CT26-5T4 종양은 비히클, 1618-1210, 1618 또는 2112로 처리된 SCID-베이지 마우스로부터 수집하였다. 종양에 대한 항체의 국재화는 (A) 항-인간 IgG과 또는 (B) 바이오틴화된 CD137의 결합에 의해 검출되고, 유세포분석에 의해 분석하였다. 그래프는 단일의 살아있는 종양 세포 중에서 양성 세포의 빈도를 도시한다(n=5).
도 28은 바이오틴화된 CD137 및 종양 항원 5T4의 결합에 대해서 양성인 종양 세포의 백분율을 도시한다. SKOV-3 종양은 비히클, 1618-1210, 1618 또는 2112로 처리된 SCID-베이지 마우스로부터 수집하였다. 5T4 양성 종양 세포에 대한 항체의 국재화는 항-인간 IgG 및 항-인간 5T4-항체로 검출되었다. 그래프는 단일의 살아있는 종양 세포 중에서 이중 양성 세포의 빈도를 도시한다(mCD45-CD45RA-(n=5/치료)).
표 (서열)
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Figure pct00026
실시예
실시예 1 - 앨리게이터 골드(Alligator GOLD)(상표명) 라이브러리로부터 5T4 항체의 선택
1×1010개 초과의 독특한 구성원을 함유하는 완전 인간 scFv 라이브러리인 scFv 라이브러리 앨리게이터-골드(상표명)(엘리게이터 바이오사이언스 아베(Alligator Bioscience AB), 스웨덴 룬드 소재)를 이용해서 h5T4에 대한 파지 디스플레이 선택을 수행하였다. 고상 선택, 바이오틴화된 5T4-Fc를 이용한 용액 중 선택, 스트렙타비딘 비드에 커플링된 바이오틴화된 5T4-Fc에 의한 선택뿐만 아니라, 재조합 h5T4-Fc에 대해서 이미 선택된 파지 저장액을 이용해서 5T4 발현 B16 세포에 대한 1라운드의 선택을 비롯하여 몇 가지 상이한 선택 전략이 이용되었다. 선택 전에, 스트렙타비딘에 대한 강력한 결합제, 표적의 Fc 부분 및 다른 류신 풍부 반복 단백질에 대해서 교차 반응성인 결합제를 제거하기 위하여, 스트렙타비딘, 베리글로빈(Beriglobin) 또는 SLIT2에 대해서 파지 저장액을 사전-선택하였다.
파지 선택으로부터 특정 결합제를 식별하기 위하여, 5T4-Fc 또는 비-표적 단백질(바이글리칸 또는 오렌시아(Orencia))로 코팅된 ELISA를 이용하는 파지 형식에서 대략 1250개의 개별 클론을 선별하였다. 이것에 이어서 서열분석뿐만 아니라, 완전-곡선 ELISA, 50℃에서 수행된 ELISA 및 선택된 클론의 FACS 분석에서 가용성 scFv로서의 선별을 수행하였다. 이것에 기반하여, 비-표적 분자에 또는 5T4 음성 세포에 대해서 양성 반응을 보이는 일 없이 재조합 5T4에 그리고 5T4 발현 세포에 결합된 14개의 독특한 후보자 scFv를 선택하였다.
선택된 14개의 5T4 scFv 클론을 추가의 특성 규명을 위하여 전체 IgG1에 대해서 전환시켰다. (대표적인 종래 기술 개시내용으로부터 선택된) 1628로 지칭되는 기준 항-5T4 항체가 이 연구에서 양성 대조군으로서 이용되었다.
14개의 클론 중에서, 이중특이성 항체 형식에서 추가의 평가를 위하여 4개의 클론을 선택하였다. 이들 4개의 클론은 이하에 더욱 기술되고 기준 클론 1628과 비교된다.
실시예 2 - ELISA에 의해 측정된 인간 5T4의 결합
재료 및 방법
표준 프로토콜을 이용해서 ELISA를 수행하였다. 플레이트(#655074, 그라이너 바이오-원 게엠베하(Greiner Bio-One GmbH), 독일 소재)를 0.5㎍/㎖ 5T4-Fc(Peter L. Stern(맨체스터 대학)으로부터 획득함)로 하룻밤 사전 코팅하였다. 5T4 항체를 1:4 희석액으로 6 내지 1.5×10-3㎍/㎖로부터 희석시키고 각 웰에 50㎕로 2벌로 첨가하였다. 결합을 토끼 항-h 카파 L-쇄-HRP(P0129, 다코 덴마크(Dako Denmark))로 검출하고, ELISA는 수퍼시그널 ELISA 피코 화학발광 기질(SuperSignal ELISA PICO Chemiluminescent substrate)(써모 사이언티픽 피어스사(Thermo Scientific Pierce), 미국 일리노이주 록포드 소재)로 2 내지 10분 동안 전개시키고 자동화 마이크로플레이트 기반 다중-검출 판독기(automated microplate based multi-detection reader)(FLUOstar OPTIMA, 네덜란드 소재)로 판독하였다.
결과 및 결론
결과는, 대다수의 5T4 mAb가 하위-nM 범위의 EC50 값으로 1628과 유사한 5T4에 대한 역가로 결합된 것을 나타낸다(표 1). 그러나, 클론 1208은 다소 더 높은 EC50값을 나타낸다.
Figure pct00027
실시예 3 - 유세포분석에 의해 결정된 세포 표면 상에 발현된 5T4에 대한 결합
재료 및 방법
유세포분석에 의한 5T4 mAb 결합의 분석은 5T4-형질주입된 세포주 및 음성 대조군으로서, 모의 형질주입된 세포를 이용해서 수행하였다. 이용된 3개의 상이한 형질주입된 세포주가 이 연구에서 사용되었다; 5T4 작제물 또는 빈 벡터 대조 작제물 중 하나로 형질주입된, B16, A9 및 CHO. FACS 완충액(PBS, 0.5% BSA 및 0.02% NaN3)에 희석된 5T4 항체로 세포를 염색하였다. 1:100 희석된 2차 항체 항-IgG (Fc)-PE(109-115-098, 잭슨 이뮤노리서치 유럽(Jackson ImmunoResearch Europe), 영국 소재)로 결합을 검출하였다. 샘플을 FACSCalibur 또는 FACSverse(BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 독일 하이델베르크 소재) 상에서 분석하고 평균 형광 강도(MFI)를 결정하였다.
결과 및 결론
5T4-형질주입된 B16 세포에 대한 5T4 항체 결합의 유세포 분석에서, 대부분의 항체는 양호한 결합을 나타낸다. 개별 실험 간의 EC50 값의 큰 변동이 관찰되었다. 따라서, 결과는 내부 대조군 1628로 정규화된 평균 EC50뿐만 아니라 평균 EC50(nM)으로서 요약되어 있다(표 2). 5T4-형질주입된 B16 세포에 대한 5T4 mAb의 결합에 대한 용량-반응 곡선의 일례가 도 2에 도시되어 있다. 도 3에서, 2.5㎍/㎖ 항체의 고정된 농도에서의 정규화된 MFI가 도시되어 있다. 종합하면, 데이터는, 대부분의 항체가 5T4-형질주입된 B 16 세포에 잘 결합되고, 클론 1208이 더 약한 결합을 발휘하는 것을 나타낸다.
Figure pct00028
유세포분석에 의해 EC50을 계산하려는 새로운 시도에서, 5T4 mAb 용량 반응 실험은 인간 5T4가 안정적으로 형질주입된 CHO 세포를 이용해서 수행하였다. 4개의 적정 시리즈 중 하나는 2.5nM에서 시작하여 수행하였다. 데이터는 표 3에 요약되어 있다.
Figure pct00029
마지막으로, 5T4-형질주입된 A9 세포에 대한 결합 역가는 2개의 개별 실험에서 평가하였다. B16-5T4 세포로 수행된 실험에서와 같이, 개별적인 실험에서 결정된 절대 EC50 값은 다양하고, 따라서 데이터는 기준 1628로 정규화된 바와 같이 제공된다(표 4). 결과는 5T4 항체가 기준 1628에 대해서 견줄만한 역가로 결합하는 것을 나타낸다.
Figure pct00030
요약하면, 4개의 5T4 항체의 결합 역가는 3개의 상이한 5T4-형질주입된 세포주(B16, CHO 및 A9)를 사용해서 유세포분석에 의해 평가하였다. 이들 연구로부터의 결론은, 모든 항체가 합리적인 결합을 나타내고 클론 1208이 일반적으로 다른 클론보다 더 낮은 역가를 나타낸다는 것이다.
실시예 4 - 사이노몰거스 5T4에 대한 결합
재료 및 방법
사이노몰거스 5T4에 대한 결합 시 5T4 항체의 역가는 유세포분석에 의해 결정하였다. CHO 세포는 마카카 물라타(Macaca mulatta)(사이노몰거스) 5T4로 안정적으로 형질주입하였다. 세포를 2.5nM에서 시작하여 1:4 적정을 이용해서 ACS 완충액(PBS, 0.5% BSA 및 0.02% NaN3)으로 희석된 5T4 항체로 염색하였다. 결합은 1:100으로 희석된 2차 항체 항-IgG (Fc)-PE (109-115-098, 잭슨 이뮤노리서치 유럽, 영국 소재)로 검출하였다. 샘플을 FACSCalibur 또는 FACSverse(BD 바이오사이언시스사, 독일 하이델베르크 소재) 중 하나로 분석하고 평균 형광 강도(MFI)를 결정하였다. 3가지 실험을 견줄만한 결과로 수행하였으나, 단지 하나의 실험이 완전 용량-반응 곡선을 포함한 반면 나머지 두 개의 실험은 단지 3개의 항체 농도를 포함하였다. 인간과 사이노몰거스 5T4 간의 EC50 값을 비교하기 위하여, cy5T4/hu5T4 비는 전체 용량-반응으로 실험으로부터 계산하였다.
결과 및 결론
수행된 3가지 실험은 클론 1206, 1208 및 1210에 의한 사이노몰거스 5T4에 대한 양호한 결합 및 1212에 의한 약한 결합을 입증하고, 기준 1628(도　4, 표 5) 클론 1206은 비교적 양호한 역가를 지녔지만, 효능은 낮았다. 선택된 클론에 대해서 사이노몰거스와 인간 5T4 간의 상대적인 EC50 값의 비교는 클론 1206, 1208 및 1210이 사이노몰거스 5T4에 대해서 비교적 높은 친화도를 갖는 반면 1212는 그러하지 않은 것을 나타낸다.
Figure pct00031
실시예 5 - 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 친화도
재료 및 방법
5T4-특이적 mAb의 결합 역학은 2개의 상이한 SPR-기반 플랫폼인, 비아코어 3000(GE 헬스케어사(GE Healthcare)) 및 MASS-1 플랫폼(세에라 센서스사(Sierra Sensors))을 이용해서 연구하였다. 간략하게는, 센서 칩 표면에서 5T4를 직접 아민 커플링(비아코어 플랫폼)을 통해서 또는 스트렙타비딘 코팅된 칩 및 바이오틴화된 5T4(MASS-1 플랫폼)를 이용해서 포착하였다. 이어서 상이한 5T4-특이적 mAb를 농도를 증가시키면서 칩 위에 주입하고, 회합 및 해리 속도를 실시간에 연구하였다. 1:1　랑그뮈어(Langmuir) 모델이 곡선 적합화를 위하여 사용되었다.
결과 및 결론
2개의 플랫폼을 이용해서 얻어진 결합 속도 상수 및 친화도의 요약은 표 6에 제시된다. 그러나, 사용된 검정 셋업이 항원에 대한 mAb의 2가 결합을 허용하는 것을 고려해야만 한다. 이것은 오프-레이트(off-rate)(kd) 및 따라서 친화도값(KD)의 상당한 과소평가를 초래하는 산성도 효과를 일으킬 것이다. 차이 5T4 항체는 상이한 결합 특징을 보이며, 1208 및 기준 1628은 매우 낮은 오프-레이트를 나타내는 한편 온-레이트(on-rate)는 결합제 간에 매우 적다. 두 검정 간에 상당한 변동이 있음은 명백하며, 1206 및 1628에 대해서 10배 이상 차이가 있다. 1628에 대해서, 이것은 오프-레이트가 매우 낮게 낮은(해리가 없는 것에 근사한) 경우 정확한 곡선 적합화의 곤란성으로 인한 공산이 있다.
Figure pct00032
실시예 6 - 5T4 항체의 도메인 맵핑
재료 및 방법
에피토프 맵핑은 유세포분석에 의해 인간/마우스 키메라 5T4 작제물의 패널을 이용해서 항체에 의해 결합 소실의 연구에 의해 수행하였다. 이 전략은 5T4 항체가 쥣과 5T4와 교차 반응이 없으므로 가능하였다. 두 전략은 도 5에 예시된 바와 같이 에피토프 맵핑에 대해서 사용되었다. 하나의 접근법에서, 7개의 상이한 도메인으로 5T4를 분할하는 것에 기반하여 7가지 인간/마우스 5T4 키메라를 작제하였다(도 5). 각 도메인을 대응하는 마우스 서열로 교체함으로써, 7가지 인간/마우스 7 5T4 인간/마우스 키메라를 생성하였다. 키메라는 인간 단백질 5T4 서열 NP_006661.1(기준 mRNA 서열 NM_006670.4) 및 대응하는 마우스 서열 NP_035757.2(기준 mRNA 서열 NM_011627.4)를 이용해서 생성하였다. 인간/마우스 키메라 DNA 작제물뿐만 아니라, 인간 및 마우스 야생형 5T4를 pcDNA3.1 발현 벡터에 클로닝하였다. 안정적으로 형질주입된 CHO 세포를 생성하였고, MACS 선별에 의해 5T4 발현 세포가 풍부하였으므로, 60 내지 80% 양성 세포를 얻었다. 다른 접근법에서, 인간/마우스 5T4 키메라로 형질주입된 세포(Woods et al., 2002, Biochem J 366(1):353-365)가 사용되었는데, 이것은 아미노산 173-420의 마우스 서열이 인간 서열을 대체한 것이었다(도 5). 대조군으로서, 인간 5T4 및 마우스 5T4-형질주입된 세포를 사용하였다.
유세포 분석을 위하여, 세포를 FACS 완충액(PBS, 0.5% BSA)으로 희석시킨 상이한 5T4 항체로 염색하였다. 결합은 1:100으로 희석된 2차 항체 항-IgG (Fc)-PE(109-115-098, 잭슨 이뮤노리서치 유럽, 영국 소재)로 검출하였다. 샘플은 FACSverse(BD 바이오사이언시스사, 독일 하이델베르크 소재)에 의해 분석하고% 양성 세포를 결정하였다. 각종 형질주입된 모집단에서% 5T4 양성 세포의 변동을 보상하기 위하여, 결합 수준은 각 클론에 대한% 양성 세포를 최고% 양성 세포가 얻어지는 클론에 대한% 양성 세포로 나눔으로써(% 양성 세포클론X/% 양성 세포max) 각 키메라 내에 정규화하였다. 정규화된 값 ≤ 0.75는 mAb 결합이 대체된 영역에 의존적인 것으로 정의되는 한편, 정규화된 값 ≤ 0.25는 완전한 의존성으로서 정의된다.
결과 및 결론
4개의 5T4 항체는 도메인 E2, E3, E4, E6 또는 aa 173-420 중 적어도 하나에 거의 의존성인 것으로 나타난 반면, E1, E5 또는 E7에 대한 명백한 의존성은 관찰되지 않았다(표 7).
모두 4개의 항체는 명백한 결합 패턴을 지녔다:
1. 클론 1208; E2 및 E4에 의존성
2. 클론 1210; E2, E4 및 aa173-420에 의존성
3. 클론 1206; E2, E3, E4 및 aa173-420에 의존성
4. 클론 1212; E6 aa173-420에 의존성
기준 항체 1628은 본 발명의 예시적인 항체 전부와는 상이하며 E4 및 aa173-420에 완전히 의존적이었다.
Figure pct00033
이 실험은 E2, E3 및 E6 키메라에 대해서 1회 반복하고, 높은 재현성을 갖는 E4 키메라에 대해서는 3회 반복하였다. 정규화된 결합값 ≤ 0.75를 갖는 mAb는 볼드체로 나타낸다.
실시예 7 - 앨리게이터 골드 ® 라이브러리로부터의 CD137 항체의 선택
인간 항체(scFv) 라이브러리인 앨리게이터 골드 ® (엘리게이터 바이오사이언스 아베사, 스웨덴 룬드 소재)를 이용해서 파지 디스플레이 선택을 수행하였다. 비드 또는 관 표면 상에 코팅되거나 또는 CD137-형질주입된 세포의 표면 상에 발현된 가용성 형태로 재조합 CD137에 대한 선택을 수행하였다. CTLA4-Fc 및 무관한 His-태그 단백질을 선택에서 과량으로 포함한 비표적으로서 사용하였다. 각각의 선택 라운드 전에, 비특이적 결합제를 제거하기 위해 바이오틴일화된 베리글로빈, CTLA4-Fc, 비드 또는 CD137 음성 세포에 대해 파지 저장액을 사전-선택하였다.
파지 선택으로부터 특정 결합제를 식별하기 위하여, 재조합 표적(CD137-Fc) 또는 비표적(CTLA4-Fc) 단백질 중 하나로 코팅한 ELISA를 이용하는 파지 형식에서 대략 4500개의 개별 클론을 선별한 다음, 일부 클론에 대한 가용성 scFv로서 확인하였다. CD137에 대한 특정 결합을 나타내는 클론을 서열분석하고 나서, 추가 특성규명을 위해 IgG로서 독특한 클론을 생성하였다.
실시예 8 - ELISA에 의해 측정된 인간 CD137에 대한 결합
재료 및 방법
재조합 인간 CD137에 대한 CD137 항체의 결합을 샌드위치 ELISA에 의해 결정하였다. 간략하게, 재조합 인간 CD137-Fc(R&D # 838-4B)로 코팅한 ELISA 플레이트(그라이너(Greiner) # 655074)를 연구할 다양한 CD137 항체의 연속 희석물과 함께 항온처리하였다. HRP-접합된 염소-항-인간 카파 경쇄(AbD 세로텍(AbD Serotec) # STAR127P)를 이용하여 CD137 항체를 검출하고 나서, 수퍼시그널 ELISA 피코 화학발광 기질(피어스(Pierce) # 37069)을 이용하여 연구하였다. 2 내지 6회의 별개의 실험에서 다양한 항체의 EC50 값을 결정하였다.
두 상이한 기준 항-CD137 항체를 이 연구에서 양성 대조군으로서 사용하였다("1811/1812" 및 "1813/1814"로서 표기됨, 둘 다 당업계에서 입수 가능함).
결과 및 결론
대다수의 항체는 기준 항체의 범위와 유사한 범위, 즉, 하위 nM 또는 낮은 nM의 EC50 값을 나타낸다. 데이터를 표 8에 요약한다.
Figure pct00034
실시예 9 - 인간 및 사이노몰거스 CD137에 대한 결합의 유세포 분석 결정
재료 및 방법
인간 CD137, 사이노몰거스 CD137 또는 빈 벡터로 형질주입된 CHO 세포의 유세포 분석을 이용해서 결합 및 EC50을 결정하였다. 인간 또는 사이노몰거스 CD137의 세포외 부분을 인간 CD40의 막관통 및 세포내 부분에 융합시키고 나서, pcDNA3.1 내로 클로닝시켰다. 후속적으로 벡터를 CHO 세포 내로 안정적으로 형질주입시켰다. 30분 동안 4℃에서 CD137 항체(인간 CD137-PE, BD 바이오사이언시스 # 555956)를 이용하는 유세포분석에 의해 CD137의 발현을 확인하였다. CD137-형질주입 및 빈 벡터-형질주입 세포를 적어도 1시간 동안 4℃에서 CD137 항체와 함께 항온처리하여 결합을 포화시켰다. 항체 내재화를 최소화하기 위해, 항온처리 완충제 중에 0.05% 아자이드화나트륨을 사용하고, 모든 작업을 얼음 상에서 수행하였다. PE-접합된 항-hIgG 항체(109-115-098, 잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈사(Jackson Immunoresearch laboratories))를 이용하여 CD137 항체를 검출하고 나서, 30분 동안 4℃에서 인큐베이션시켰다. 염색 직후에, 파라폼알데하이드 용액(10× 농도 BD CellFIX, BD 바이오사이언시스 # 340181)을 이용하여 세포를 고정시켰다. FACSVerse(BD 바이오사이언시스)를 이용하는 유세포분석에 의해 세포를 분석하였다. 각각의 샘플에 대한 중위 형광 강도(MFI)를 결정하고 나서, 그래프 패드 프리즘(Graph Pad Prism)을 이용하여 용량 반응 데이터를 분석하였다.
MFI 데이터를 각각의 항체에 대해 정규화시켰고, 여기서 0%는 가장 낮은 값으로서 정의되고, 100%는 각 항체에 대한 용량 적정에서 가장 높은 값이다. 두 실험으로부터의 데이터에 기반하여 그래프 패드 프리즘을 이용하여 EC50 및 95% 신뢰구간을 계산하였다(비선형 회귀(곡선 적합화), 제약을 0 내지 100으로 설정).
결과 및 결론
두 별개의 실험에서 CHO-huCD137, CHO-cyCD137 및 CHO-pcDNA에 대한 결합을 확인하였다(도 6). 모든 CD137 항체는 두 기준 항체 1811/1812 및 1813/1814와 견줄만한 EC50을 지니는 인간 CD137에 상대적으로 잘 결합한다. 모두에 전혀 결합하지 않거나 또는 매우 약하게 결합하는 기준 항체 1811/1812 및 1200/1201(데이터 제시 생략) 및 약하게 결합하고 완전한 포화에 도달되지 않는 클론 1620/1621을 제외하고, 시험된 대다수의 CD137 항체는 사이노몰거스 CD137에 잘 결합한다. 단, 사이노몰거스 CD137 세포에 대해서 얻어진 최대 MFI는 인간 CD137 발현 세포에 대한 것보다 2 내지 3배 낮았는데, 이는 세포에 대한 수용체 밀도의 차이를 나타내는 것임에 유의해야 한다.
EC50 결정은, 검정 간 및 검정 내 변동을 포함하도록 시험된 각 CD137 항체에 대해서 95% 신뢰 구간으로서 제시된다(표 9).
Figure pct00035
실시예 10 - 비아코어에 의해 측정된 CD137 항체의 친화도
재료 및 방법
통상적인 아민 결합을 이용하여 인간 CD137(R&D 시스템즈사(R&D systems))을 비아코어(상표명) 센서칩 CM5에 고정시켰다. 시험 항체 및 대조군(1/2 10 내지 0.63nM로 연속 희석시킴)을 30㎕/㎖의 유량에서 HBS-P(GE, #BR-1003-68)에서 결합에 대해 분석하였다. 5분 동안 회합시키고, 15분 동안 해리시켰다. 30초 동안 10mM 글리신 pH 1.7을 이용하여 2회 재생성을 수행하였다. 1:1 랑그뮈어 모델을 이용하여 역학적 매개변수 및 친화도 상수를 계산하였다.
결과 및 결론
칩 표면 상에 코팅된 CD137 위로 유동시킨 2가 항체를 이용하여 측정한 항체의 친화도는 나노몰 내지 서브나노몰 범위였다(표 10).
Figure pct00036
실시예 11 - ELISA에 의해 결정된 CD137 항체의 표적 특이성
재료 및 방법
비-표적 단백질과 교차반응하는 잠재적 성향을 검출하기 위해 ELISA 방법이 이미 확립된 TNFR 슈퍼패밀리 구성원(CD40 및 OX40)에 대한 결합을 평가하였다. 또한, BLAST 탐색을 수행하여 TNFRSF21을 거의 유사한 서열(34% 서열 동일성)로서 식별하였다. 이 서열 동일성이 오히려 낮으므로, OX40 및 CD40에 대한 비-표적 결합의 결정은 충분한 것으로 여겨졌다.
PBS 중에서 1시간 동안 37℃에서 또는 하룻밤 4℃에서 최종 농도 0.5㎍/㎖로 희석시킨 재조합 인간 OX40(R&D # 1493-CD), CD40-Fc(안셀(Ancell) # 504-820) 또는 CD137(R&D # 838-4B)의 50㎕/웰로 ELISA 플레이트(그라이너 # 655074)를 코팅시켰다. PBS + 0.05% TWEEN20(PBST)으로 플레이트를 세척하고 나서, PBST + 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 차단시켰다. PBST + 1% BSA 중에서 10 내지 0.01㎍/㎖로 연속적 1/10 희석으로서 항체 샘플을 제조하고 나서, 실온에서 1시간 동안 항온처리시킨 다음, 겨자무과산화효소-접합된 항-인간 카파 경쇄 항체(AbD 세로텍(AbD Serotec) # STAR127P)를 이용하여 검출하고, 수퍼시그널 ELISA 피코 화학발광 기질(피어스 써모사이언티픽 #37069)을 이용하여 전개시켰다.
결과 및 결론
두 실험으로부터의 결과는 유사하였다. 하나의 항체(1202/1203)가 OX40 및 CD40에 대해서 약한 결합을 나타낸 반면에, 나머지 항체의 어느 것도 OX40 또는 CD40 중 어느 하나에 대한 어떠한 검출 가능한 결합도 나타내지 않았다. 분석된 항체의 개요 및 두 실험으로부터의 결과는 표 11에 나타낸다. ELISA에서 CD137에 대한 1202/1203 결합에 대한 EC50은 대략 0.06㎍/㎖에 대응하는 0.41nM로서 결정되었다. ELISA 신호는 심지어 10㎍/㎖에서 매우 낮고, OX40 및 CD40에 대한 결합에 대한 EC50은, 희석 곡선이 정체부에 도달하지 않기 때문에 대부분 10㎍/㎖보다 더 높은 공산이 있다.
또한, 다수의 혈액 공여체로부터의 1차 PBL에 대한 결합이 시험되었다. PBL에 대한 결합은 기준 항체와 유사하였다. 비-표적 단백질에 대한 관련된 비특이적 결합은 검출되지 않았다.
Figure pct00037
실시예 12 - CD137에 대한 항체 결합의 도메인 맵핑
재료 및 방법
형질주입된 세포의 표면 상에서 발현된 인간/마우스 CD137 키메라 패널에 결합하는 각 항체의 능력을 유세포분석에 의해 분석하였다.
인간 CD137의 도메인 또는 모듈을 대응하는 마우스 도메인으로 교환함으로써 키메라를 설계하였다(도 7). CD137 인간/마우스 키메라의 유전자를 합성하였고(젠스크립트사(GenScript)), 작제물을 pcDNA3.1 벡터(인비트로젠사(Invitrogen)) 내로 클로닝하고 나서, 프리스타일(FreeStyle) 293-F 세포(인비트로젠) 내로 일시적으로 형질주입시켰다. 형질주입된 세포를 CD137 항체 및 대조군 항체와 함께 항온처리한 다음, 검출을 위하여 항-인간 IgG-PE(잭슨 이뮤노리서치)와 함께 항온처리하고, FACS Verse(BD 바이오사이언시스)로 분석하였다. 상이한 키메라 작제물에 대한 결합을 아이소형 대조군의 결합에 비교하여 상대적 MFI로서 계산한 다음, 전장 인간 CD137 작제물에 정규화시켜, 개별 항체 간의 친화도 차이의 효과를 최소화하였다.
결과 및 결론
4개의 결합 패턴은 이하에 기재된 바와 같이 관찰될 수 있다. 데이터는 표 12에 요약되어 있다.
패턴 A:
항체 1811/1812(기준 항체) 및 1618/1619는 도메인 1에 의존적이다.
패턴 B:
항체 1200/1201, 1202/1203 및 1204/1205는 주로 도메인 2에 의존적이다. 또한, 작제물 1555에 대해 결합의 일부 상실이 또한 보이는데, 이는 도메인 1의 영향도 나타낸다.
패턴 C:
항체 1813/1814(기준 항체) 및 1620/1621은 도메인 3B 내지 4A에 주로 의존적인 것으로 나타난다. 그러나, 결합의 상실은 모든 작제물에 대해 보이는데, 이는 이 패턴을 패턴 D와 상당히 유사하게 만든다.
패턴 D:
항체 1214/1215 및 1626/1627에 대해서, 특정 CD137 도메인에 대한 분명한 의존성은 입증할 수 없었다. 대신에, 이들 항체는 모든 키메라에 대한 광대한 결합 상실을 나타내었다. 그러나, 1214/1215에 대해서, 결과는 실험 간에 차이가 있었다(표 12 참조).
Figure pct00038
실시예 13 - CD137 항체의 시험관내 효능
재료 및 방법
1차 인간 CD8+ T 세포에 기반하여 CD137 항체의 작용제 활성도를 평가하였다. 간략하게는, CD8+ T 세포를 제조업자의 프로토콜에 따라서 MACS 분리(밀테니(Miltenyi) # 130-096-495)에 의해 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터 분리시켰다. 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(눈크써모 사이언티픽(NuncThermo Scientific) #268200)에서 항온처리하고 나서, 항-CD3 항체(클론 OKT3, 애피메트릭스 이바이오사이언스(Affymetrix eBioscience) # 16-0037)로 사전 코팅하고, 시험될 CD137 항체의 농도를 적정하였다. 72 또는 96시간 항온처리 후에, 배양 배지를 채취하고 나서, ELISA(BD #555142)에 의해 IFN-γ 수준을 결정하였다.
각각의 클론을 적어도 6명의 공여체에서 분석하고 나서, 기준 CD137 항체 1811/1812 및 음성 대조군 항체와 비교하였다.
큰 공여체 내 분산에 기인하여, 자극 지수(SI, 음성 대조군과 비교한 항체에 의한 유도 배수)를 각 샘플에 대해 결정하고 나서, 기준 항체 1811/1812에 대한 자극 지수에 대해 정규화시켰다.
결과 및 결론
기준 1811/1812와 견줄 만한 효능을 지니는 몇몇 클론이 식별되었다.
데이터는, CD137 자극에 의해 유도된 절대 IFN-γ 수준을 나타내는 도 8에 요약되어 있다. 그러나, 모든 항체는 모든 공여체에서 직접 대면하여 분석하지 않았고, 정규화된 SI는 효능의 비교에 더 적절하다. IgG1 형식에서 항체를 평가하였고, 효능에 영향을 미칠 수도 있는, 웰의 표면에 코팅된 항체를 이용하여 효능을 측정하였다.
실시예 14 - CD137 항체의 경쟁적 결합( 리간드 차단 )
목표 및 배경
본 목표는 예시적인 CD137 항체가 CD137 리간드 결합을 차단하는지의 여부를 결정하는 것이다.
이전의 도메인 맵핑 실험에서, CD137 항체를 CD137 항원의 유사한 서브도메인에 대한 그들의 결합에 기반하여 상이한 군으로 나누었다. CD137 항체가 리간드 결합 영역에 가까운 에피토프에 결합한다면, 항원에 대한 결합은 리간드 결합의 부분적 또는 전체적 차단을 야기할 수 있다. CD137 리간드 결합 에피토프에 가까운 결합은 CD137 리간드 결합 에피토프의 입체 장애 또는 입체배좌 변화에 기인하여 리간드 결합에 영향을 미칠 수 있다. 리간드 차단 특성의 평가를 위해 고정된 농도의 CD137L에 대해 모든 CD137 항체를 적정하였다.
재료 및 방법
리간드 경쟁을 위해 인간 CD137로 형질주입된 CHO-세포를 사용하였다. 인간 CD137의 세포외 부분을 hCD40의 막관통 및 세포내 부분에 융합시키고, pcDNA3.1 내로 클로닝시켰다. 후속적으로 벡터를 CHO 세포 내로 안정적으로 형질주입시켰다. CD137을 표적화하는 상업적 항체를 이용한 염색에 의해 CD137의 발현을 확인하였다.
CHO-huCD137을 CD137 단클론성 항체와 함께 사전항온처리하고, EC50의 농도에서 CD137 리간드의 첨가 전에 1시간 동안 +4℃에서 10:1에서부터 0.01;1 몰비의 CD137 mAb(250㎍/㎖) 대 CD137L(hCD137_CD8 리간드)(안셀 # 503-020)를 하향 적정하였다. 또 다른 30분 동안 +4℃에서 공동-항온처리 후에, 세포를 세척하고 나서, 결합된 CD137 리간드를 αCD8a-PE(클론 53-6.7)(BD # 553033)로 검출하고, 파라폼폼알데하이드(10× 농축물 BD 셀픽스, BD 바이오사이언시스)로 고정시켰다. FACSverse를 이용하여 분석을 수행하고 나서, 플로조(FlowJo) 소프트웨어를 이용하여 MFI(중위 형광 강도)를 계산하였다.
결과 및 결론
CD137L 차단 실험을 2회 수행하였다. 시험된 모든 CD137 mAb가 CD137 리간드 결합을 차단하지 않는다는 결론을 내릴 수 있다(표 13, 도 9). 군 B 및 C(1204 및 1620)에 속하고, 도메인 2B 내지 4A에 결합하는 CD137 mAb는 CD137L을 차단하였다. 항체 1814는 또한 CD137L을 차단한다. 도메인 1에 결합된 군 A에 속하는 1618은 CD137 리간드를 차단하지 못하였다.
Figure pct00039
실시예 15 - ELISA에 의해 측정된 CD137 항체의 경쟁적 결합
목표 및 배경
예시적인 CD137 항체를 서로 경쟁시킴으로써, 그들의 차단 패턴에 기반하여 유사한 에피토프에 대한 항체 결합을 결정하는 것이 가능하다. 코팅된 CD137-Fc에 결합할 때 바이오틴일화된 CD137 항체를 비-바이오틴일화된 CD137 항체와 함께 공동-항온처리함으로써 경쟁 ELISA를 수행한다. 경쟁은 바이오틴일화된 CD137 항체로부터의 신호 상실로서 정의된다. 낮은 경쟁값은 항체 사이의 경쟁 없음 또는 항체의 결합 역학에 기인할 수 있었다. 하나의 항체의 결합은 또한 다른 CD137 항체의 결합에 영향을 미치는 항원의 결합일 때 입체 장애 또는 입체배좌적 변화를 야기할 수 있었다.
재료 및 방법
CD137 항체는 바이오틴일화되었고(EZ-연결 NHS-LC-바이오틴, 써모피셔사(ThermoFisher)), CD137-Fc에 대한 무손상 결합 특성은 바이오틴일화된 항-CD137 mAb와 비-바이오틴일화된 항-CD137 mAb 사이의 EC50을 비교함으로써 ELISA에 의해 검증하였다. 비-바이오틴일화된 항-CD137(항-CD137-바이오)를 0.5시간 동안 결정된 EC50보다 30배 더 높은 농도에서 CD137-Fc에 대해 사전 항온처리시켰다. 세척 없이, 항-CD137-바이오를 첨가하고 나서, 다른 1시간 동안 공동항온처리시켰다. 스트렙타비딘-HRP(피어스사)를 이용하여 항-CD137-바이오의 결합을 검출하였다. 항체의 최대 경쟁(그 자신과 경쟁)에 비해 다른 항체에 대해 측정된 결합을 나눔으로써 경쟁을 상대적 수로서 계산하였다. 얻어진 상대적 값을 최대 차단 능력에 대해 정규화시켰다(표 14).
Figure pct00040
결과 및 결론
각 항체에 대한 상대적 경쟁값을 정규화한 경우, 경쟁 패턴이 식별될 수 있었다(표 14). 항체 1812 및 1618은 경쟁 ELISA에서 독특한 패턴을 나타내었다(패턴 X). 분석된 다른 CD137 항체는 유사한 차단 패턴을 지녔다(패턴 Y). 이들 항체 간의 결합 역학의 차이는, 군 Y 내의 작은 변동이 결합 에피토프의 실질적인 차이를 반영한 것을 제외할 수 있다고 하더라도, 이들 항체 간의 결합 패턴에서 일부 약간의 변동을 설명할 수 있다.
실시예 16 - CD137 mAb의 가교결합 의존성
재료 및 방법
1차 인간 CD8+ T 세포에 기반한 T 세포 검정에서 CD137 항체의 가교결합 의존성을 평가하였다. 간략하게는, 항-CD3 항체(클론 OKT3, 애피메트릭스 이바이오사이언스 # 16-0037)로 사전 코팅된 96-웰 마이크로타이터 플레이트(96-well microtiter plates)(눈크써모 사이언티픽 #268200)에서 세포를 항온처리하였다. 1:3 몰비에서의 가교결합 항체인, 염소-항 인간 Fc F(ab')2(잭슨 이뮤노(Jackson Immuno) #109-006-098)의 존재 유무에서 CD137 항체의 적정된 농도를 상기 플레이트에 첨가하였다. 72시간 후에, 배양 배지를 수확하고 IFN-γ 수준을 ELISA(BD #555142)에 의해 결정하였다.
결과 및 결론
그 결과는 가교결합 항체의 존재에서의 CD137 활성화를 도시한 도 10 및 가교결합 항체의 부재 중에서의 활성화를 도시한 도 11에 요약되어 있다. 얻어진 결과로부터, CD137 mAb 클론 1618은, CD137-발현 면역 세포의 CD137 매개 활성화와 비교할 경우, 가교결합 의존적이고, 기준 CD137 특이적 IgG4 항체(기준 Ab)는 가교결합 독립적인 것으로 결론지을 수 있다.
실시예 17 - 5T4-CD137 이중특이성 항체의 생산
재료 및 방법
4개의 5T4 및 8개의 CD137 항체에 기반한 30개의 5T4-CD137 bsAb를 bsAb로서 클로닝하였고, 결합 모이어티 중 하나를 scFv로서 클로닝하고 IgG의 중쇄의 C-말단에 융합시켰다(즉, 모리슨 형식으로). 대다수의 bsAb를 scFv로서 5T4 결합제로 그리고 IgG로서 CD137 작용제로 클로닝하였지만, 몇몇 작제물에서는, CD137 scFv를 5T4 IgG의 중쇄에 융합시켰다(표 15). 또한, 5T4 또는 CD137 결합제 중 하나가 아이소형 대조군 항체로 대체된 4가지 아이소형 대조군 작재물이 포함되었다. bsAb는 Freestyle293 세포(써모 피셔사)의 일시적 형질 주입에 의해 생산하고 프로테인 A(Protein A) 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
bsAb 명칭은 다음과 같았다:
Figure pct00041
첫 번째 번호는 항체 클론명을 나타낸다
Figure pct00042
두 번째 번호는 scFv 클론명을 나타낸다
따라서, 명칭 "1200-1206"은 CD137 작용제 항체 1200(즉, 항체 1200/1201의 가변 도메인 중쇄 및 경쇄 서열을 포함)의 Fc의 C-말단에 융합된 scFv 형식에서 5T4 결합제 1206(즉, 항체 1206/1207의 가변 도메인 중쇄 및 경쇄 서열을 포함)을 지칭한다.
Figure pct00043
실시예 18 - ELISA에 의해 측정된 5T4-CD137 이중특이성 항체에 의한 인간 CD137 및 5T4에의 결합
재료 및 방법
두 표적 CD137 및 5T4에 대한 이중특이성 결합은 표준 ELISA 프로토콜을 이용해서 평가하였다. 플레이트(#655074, 그라이너 바이오-원 게엠베하, 독일 소재)는 0.5㎍/㎖ 5T4-Fc(맨체스터 대학의 Peter Stern 교수로부터 획득)로 하룻밤 사전 코팅하였다. CD137-5T4 bsAb는 1:4 희석액으로 8 내지 2×10-3 ㎍/㎖로 희석시키고, 각 웰에 50㎕를 두 벌로 첨가하였다. CD137-바이오(안셀 #502-030)은 0.5㎍/㎖에서 검출 항체로서 사용하였고 결합은 스트렙타비딘-HRP(피어스 #21126)로 검출하였다. ELISA는 수퍼시그널 ELISA 피코 화학 발광 기질(써모 사이언티픽 피어스사, 미국 일리노이주 록포드 소재)로 2 내지 10분 동안 전개시키고 자동화 마이크로플레이트 기반 다중-검출 판독기(FLUOstar OPTIMA, 네덜란드 소재)로 판독하였다.
결과 및 결론
대다수의 bsAb를 하위- 또는 낮은nM 범위에서의 EC50 값으로 이중 ELISA에서 이중 표적으로 결합시켰다. 그러나, 몇몇 bsAb는 상당히 높은 EC50 값을 나타내었는데, 이는 이 항체 - scFv 조합에서 어느 하나 또는 둘 다의 표적에 대한 불량한 친화도를 나타낸다. 용량 반응 곡선은 도 12에 도시되고, EC50 값은 표 16에 요약되어 있다.
Figure pct00044
실시예 19 - 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 CD137-5T4 이중특이성 항체의 친환도
재료 및 방법
CD137-5T4 bsAb의 선택의 결합 역학은 SPR-기반 MASS-1 플랫폼(세에라 센서스사)을 이용해서 평가하였다. 간략하게는, CD137 또는 5T4는 스트렙타비딘 코팅된 칩 및 바이오틴화된 항원을 이용해서 센서 칩 표면에서 포착되었다. 상이한 CD137-5T4 bsAb를 이어서 농도를 증가시키면서 칩 위에 주입하고, 회합 및 해리 속도를 실시간에 연구하였다.
결과 및 결론
얻어진 결합 속도 상수 및 친화도의 요약은 표 17에 제시된다. 사용된 검정 셋업이 항원에 대한 bsAb의 2가 결합을 허용하는 것을 고려해야만 한다. 이것은 오프-레이트(kd) 및 따라서 또한 친화도값(KD)의 상당한 과소평가를 초래하는 산성도 효과를 일으킬 것이다. 이것은 다른 화합물에 대한 비교를 번거롭게 만들지만, 얻어진 값은 데이터세트 내에서 비교를 위하여 타당하다.
역학 분석으로부터의 결과는 이중특이성 분자의 CD137-특이적 mAb 부분의 보유된 친화도를 확인해주는 한편, scFv 부분은 모 mAb에 비해서 저감된 5T4 친화도를 나타낸다. 예상되는 바와 같이, scFv 형태의 유연성 저감 링커에 의해서 유도된 형태 변화는 항원 결합 친화도에 대해서 부정적인 효과를 지닌다. 1210의 경우에, 이 효과는 단지 미소한 반면, 1208의 친화도는 약 6배 저감된다.
Figure pct00045
실시예 20 - 5T4- Fc 코팅된 플레이트에서 배양된 인간 CD8+ T 세포에 대한 5T4-CD137 이중특이성 항체의 기능적 활성도
재료 및 방법
5T4-CD137 bsAb의 기능적 활성도는 CD8 T 세포 검정에서 평가되었으며, 이때 세포는 5T4-Fc 및 CD3 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에서 배양하였다. 말초혈액 단핵구 세포(MNC)는 건강한 공여체(클리니컬 이뮤놀로지 앤드 트랜스퓨전 메디신(Clinical Immunology and Transfusion Medicine), 스웨덴 룬드 랩매디신 리전 스칸 소재)로부터 획득한 백혈구 농축액으로부터의 피콜-플라크(Ficoll-Paque)(ρ 1.077g/㎖)(GE 헬스케어사 #17-1440-02)를 이용해서 밀도 구배 원심분리에 의해 단리시켰다. CD8+T 세포는 CD8+ T 세포 단리 키트(밀테니이 130-096-495)를 이용해서 음성적 선택에 의해 풍부화되었다. 플레이트는 3㎍/㎖ αCD3, 클론 OKT3(애피메트릭스 이바이오사이언스 #16-0037-85)로 4℃에서 하룻밤 코팅하고, 세척하고, 37℃에서 2시간 동안 5㎍/㎖ 5T4-Fc로 코팅하였다. 5T4-Fc 코팅 후에, 플레이트를 세척하고, 10% FCS(열 불활성화, 깁코 # 10270-106 로트 41Q9248K) 및 10 mM 헤페스(Hepes)(깁코 # 15630056)를 함유하는 RPMI(깁코(Gibco) # 61870010)로 최소 30분 동안 차단시켰다.
10% FCS 및 10mM 헤페스를 함유하는 RPMI에 CD137-5T4 bsAb를 희석시키고, CD8+ T 세포(0.07×106개 세포/웰)의 첨가 전 30분에 플레이트에 첨가하였다. 검정 플레이트를 37℃에서 68 또는 92시간 동안 배양하고, 배양 상청액을 수확하였다. 상청액 중의 IFN-γ 수준을 ELISA(BD OptiEIA #555142)에 의해 측정하였다. 그 결과는 모든 실험에서의 내부 대조군으로서 사용된 CE_1200-1210와 비교한 배수 변화로서 나타낸다.
결과 및 결론
1㎍/㎖의 고정된 농도에서 사용된 제1 세트의 bsAb로부터의 결과(도 13)는 5T4 결합제 1206, 1208 또는 1210 중 하나에 기초한 bsAb의 대다수가 T 세포 검정에서 기능적인 반면, 5T4 항체 1212에 기초한 것들은 그러하지 않은 것을 나타낸다. 데이터는 또한 CD137 클론 1202에 기초한 bsAb가 CD137 클론 1204 및 1200에 기초한 bsAb에 비해서 더 낮은 효능 및/또는 역가를 지닐 수 있다는 것을 시사한다. 5T4-CD137 bsAb의 작용제 효과는 5T4에 의한 가교결합에 의존적이었는데, 그 이유는 하나의 아이소형 대조군 모이어티를 포함하는 bsAb 또는 5T4의 부재 하에서 활성화가 얻어지지 않았기 때문이다.
이들 결과를 기반으로, IgG로서 5개의 새로운 CD137 클론에 그리고 scFv로서 5T4 클론 1208 및 1210에 기초한 제2 세트의 bsAb를 조사하였다. 5T4 결합제 1212 및 1206은 각각 bsAb로서 불량한 기능적 활성도 및 낮은 Tm 값, 따라서 scFv로서 불량한 안정성으로 인해 배제되었다. 모든 bsAb의 기능적 활성도는 도 14에 요약되어 있다.
실시예 21 - 5T4-발현 종양 세포로 배양된 인간 CD8+ T 세포에 대한 5T4-CD137 이중특이성 항체의 기능적 활성도
재료 및 방법
CD8 T 세포를 위에서 기재된 바와 같이 단리시키고 5T4-발현 세포 B16 세포의 존재 하에 배양하였다. 빈 벡터로 형질주입된 B16 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. CD3 자극은 제조사의 프로토콜에 따라서 αCD3(OKT-3) 코팅된 비드(Dynal M-450 토실활성화된 #14013)로 수행하였다.
조사된(irradiated) B16 종양 세포(6000 세포/웰)를 96 웰 플레이트에 첨가하고 2시간 동안 부착된 채로 정치시켰다. CD137-5T4 bsAb를 첨가하고 CD8+ T 세포(0.1×106 세포/웰) 및 αCD3 코팅된 비드(0.5×105 비드/웰)의 첨가 전 30분 동안 배양하였다. 플레이트를 68 또는 92시간 동안 배양하고 배지 중의 IFN-γ 수준을 ELISA(BD OptiEIA #555142)에 의해 측정하였다.
결과 및 결론
완전 세포-기반 검정으로부터의 결과는, bsAb의 대다수가 기능적이고 그 효과는 5T4-특이적이며, 5T4 음성 B 16 세포 또는 아이소유형-CD137 bsAb에 의해 유도된 활성화는 없는 것을 나타낸다(도 15).
실시예 22 - 이중특이성 항체의 친화도 및 생물물리적 특성의 최적화: 5T4-특이적 가변 도메인의 최적화
재료 및 방법
최적화의 목표는 친화도 및 생물물리적 특성에 관하여 5T4-특이적 1210/1211 항체의 버전을 생성하는 것이었다. 선택은 리드 최적화된 라이브러리 1210LOlib1을 가진 5T4에 대해서 수행하였다. 전체적으로, 170개의 독특한 클론이 양호한 표적 신호뿐만 아니라 표적/비-표적 비로 초기 1차 선별에서 동정되었다. 이들 클론은 온도 안정성에 관하여 확대된 1차 선별에서 더욱 조사되었다. 온도 안정성 평가는, 동정된 독특한 클론의 대다수가 야생형 1210/1211 scFv 클론에 비해서 더 양호한 안정성을 보이는 것을 나타내었다. 상부 96개의 클론은 용량-반응 ELISA에서 더욱 평가되었고, 이들은 모두 유사한 허용 가능한 결합 거동을 보였다. 시험-선별 및 1차 선별로부터의 서열 분석은 유사한 경향을 보였다.
1차 및 확대된 1차 선별로부터의 상부의 96개 동정된 클론은 단클론성 항체(mAb) 부분으로서 1618/1619와 함께 모리슨-형식으로 scFv-부분으로서 더욱 재클로닝화되고 결합, 친화도 및 안정성에 기초하여 평가되었다.
역학 측정은 항-인간 Fab-CH1 2세대 센서 팁(2nd generation sensor tips)(포르테바이오사(ForteBio))이 장착된 Octet RED96 플랫폼을 이용해서 수행하였다. 이중특이성 항체를 1x 역학적 완충액(kinetic buffer)(포르테바이오사) 중에서 1.5㎍/㎖로 희석시키고 바이오센서에 커플링시켰다. 인간 5T4(인하우스 생산)를 1x 역학적 완충액에서 50nM, 10nM 및 2nM로 희석시켰다. 결합 역학을 1x 역학적 완충액에서 연구하였으며, 여기서 회합은 300초 동안 허용하고 나서 600초 동안 해리시켰다. 센서 팁은 10mM 글리신, pH 2.2를 사용해서 재생시켰다. 생성된 데이터는 병행 완충 블랭크를 차감함으로써 기준으로 하였고, 기준선은 y-축으로 정렬시키고, 해리에 대한 정렬에 의한 단차내 상관을 수행하고 데이터는 데이터 분석 소프트웨어(v.9.0.0.14)에서 사비츠키-골레이 필터(Savitzky-Golay filter)에 의해 평활화시켰다. 처리된 데이터를 적합화 정밀도의 측정으로서 X2를 이용하는 1:1 랑그뮈어 결합 모델을 이용해서 적합화시켰다.
결과 및 결론
데이터는 표 18에 요약되어 있다. 전체적으로, 리드 최적화된 변이체는 ELISA에서의 EC50 평가와 매우 유사하게 거동하였다. 친화도 평가는 친화도(KD)가 야생형 1618-1210 클론에 비해서 3 내지 10배 이상 개선된 것을 나타내었다. 세포에 대한 EC50 평가는 또한 상이한 최적화된 변이체의 유사한 거동을 나타내었고, 모두는 야생형 1618-1210 클론과 비교해서 개선된 성능을 나타내었다. 안정성과 관련하여, 상부 수행 클론은, 각각, HPLC 및 DSF에 의해 측정된 바와 같이 프로테인 A 정제 후 10% 미만의 응집을 나타내고, Fc의 Tm보다 더 높은 Tm(>70℃)을 지닌다.
Figure pct00046
실시예 23 - 이중특이성 항체의 친화도 및 생물물리적 특성의 최적화: CD137-특이적 가변 도메인의 최적화
재료 및 방법
최적화의 목표는 친화도 및 생물물리적 특성에 관하여 CD137-특이적 1618/1619 항체의 버전을 생성하는 것이었다. 선택은 리드 최적화된 라이브러리 1618LOlib1을 가진 CD137에 대해서 수행하였다. 전체적으로, 153개의 독특한 클론이 양호한 표적 신호뿐만 아니라 표적/비-표적 비로 초기 1차 선별에서 동정되었다. 이들 클론은 온도 안정성에 관하여 확대된 1차 선별에서 더욱 조사되었다. 온도 안정성 평가는, 야생형 1618/1619 scFv 클론에 비해서 온도 안정성에 관하여 최상으로 수행되는 독특한 클론의 동정을 가능하게 하였다. 상부 50개의 클론은 용량-반응 ELISA에서 더욱 평가되었고, 이들은 모두 유사한 허용 가능한 결합 거동을 보였다. 시험-선별 및 1차 선별로부터의 서열 분석은 유사한 경향을 보였다.
1차 및 확대된 1차 선별로부터의 상부의 50개 동정된 클론은 단클론성 항체(mAb) 부분으로서 1210/1211과 함께 모리슨-형식으로 scFv-부분으로서 더욱 재클로닝화되고 결합, 친화도 및 안정성에 기초하여 평가되었다.
역학 측정은 항-인간 Fab-CH1 2세대 센서 팁(포르테바이오사)이 장착된 Octet RED96 플랫폼을 이용해서 수행하였다. 이중특이성 항체를 1x 역학적 완충액(포르테바이오사) 중에서 1.5㎍/㎖로 희석시키고 바이오센서에 커플링시켰다. 인간 CD137-Fc(R&D 시스템즈사, #838-4B)를 1x 역학적 완충액에서 50nM, 10nM 및 2nM로 희석시켰다. 결합 역학을 1x 역학적 완충액에서 연구하였으며, 여기서 회합은 300초 동안 허용하고 나서 600초 동안 해리시켰다. 센서 팁은 10mM 글리신, pH 2.2를 사용해서 재생시켰다. 생성된 데이터는 병행 완충 블랭크를 차감함으로써 기준으로 하였고, 기준선은 y-축으로 정렬시키고, 해리에 대한 정렬에 의한 단차내 상관을 수행하고 데이터는 데이터 분석 소프트웨어(v.9.0.0.14)에서 사비츠키-골레이 필터에 의해 평활화시켰다. 처리된 데이터를 적합화 정밀도의 측정으로서 X2를 이용하는 1:1 랑그뮈어 결합 모델을 이용해서 적합화시켰다.
결과 및 결론
데이터는 표 19에 요약되어 있다. 전체적으로, 리드 최적화된 변이체는 ELISA에서의 EC50 평가와 매우 유사하게 거동하였다. 친화도 평가는 친화도(KD)가 야생형 1210-1618 클론과 견줄만한 것임을 나타내었다. 세포에 대한 EC50 평가는 또한 상이한 최적화된 변이체의 유사한 거동을 나타내었다. 안정성과 관련하여, 상부 수행 클론은, 각각, HPLC 및 DSF에 의해 측정된 바와 같이 프로테인 A 정제 후 6% 미만의 응집을 나타내고, 54℃ 내지 59℃의 Tm을 지닌다.
Figure pct00047
실시예 24 - 이중특이성 항체의 친화도 및 생물물리적 특성의 최적화: 촤적화된 이중특이성 항체의 이중 ELISA 분석
재료 및 방법
개선된 생물물리적 특성을 지니는 최적화된 이중특이성 항체는 리드 최적화된 결합 도메인을 조합하고 추가의 돌연변이 및 커넥터의 사용을 비롯한 상이한 전략을 이용해서 획득하였다.
이 실시예에서의 이중특이성 항체는 IgG-scFv 이중특이성 항체이다. CD137 결합 도메인은 무손상 IgG이고 5T4 결합 도메인은 IgG의 중쇄의 C-말단에 부착된 scFv이다. 이중특이성 항체는 예를 들어 이하의 성분들을 포함한다: (1) 2개의 중쇄는 각각 N-말단에서부터 C 말단의 순서로: [VH 서열; 표 20에서의 A] - [표 20에서 mX 접미사로 표기되지 않는 한 돌연변이가 없는 IgG1 아형의 H쇄 불변 영역] - [m6, m15, m16 또는 m17 커넥터] - [scFv, 여기서 가변 사슬(중쇄 또는 경쇄)이 N-말단으로부터 C 말단으로의 순서로 정렬되었는데, 표 20에서의 C쇄가 링커에 후속되고 이어서 표 20에서의 D쇄에 후속됨]이 되도록 포함되고; 및 (2) 2개의 경쇄는 각각 N-말단에서부터 C 말단의 순서로: [VL 서열; 표 20에서의 B] - [L쇄 불변 영역]을 포함한다.
이 실시예에서의 이중특이성 항체의 몇몇에 대한 scFv는 어느 하나에 위치된 재조합 N-글리코실화 부위를 보유한다.
최적화된 이중특이성 항체 암호화 유전자는 인하우스에서 설계되고 젠아트(GeneArt)(써모 피셔사, 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies))에서 합성되거나 발현 벡터 내로의 표준 클로닝 방법에 의해 생성되었다. 이중특이성 항체는 Expi293(상표명)(써모 피서 사이언티픽사)의 일시적 형질 주입에 의해 생산되고 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 두 표적 CD137 및 5T4에 대한 이중특이성 결합은, 표준 ELISA 프로토콜을 이용해서 평가되었다. 플레이트(#655074, 그라이너 바이오-원 게엠베하, 독일 소재)를 0.5㎍/㎖ 5T4-Fc(맨체스터 대학의 Peter Stern 교수로부터 획득)를 하룻밤 사전 코팅하였다. CD137-5T4 bsAb를 1:4 희석으로 8 내지 2×10-3㎍/㎖로 희석시키고, 각 웰에 50㎕를 두 벌로 첨가하였다. CD137-바이오(안셀 #502-030)를 0.5㎍/㎖에서 검출 항체로서 사용하고, 결합은 스트렙타비딘-HRP(피어스 #21126)로 검출하였다. ELISA를 수퍼시그널 ELISA 피코 화학발광 기질(써모 사이언티픽 피어스사, 미국 일리노이주 록포드 소재)로 2 내지 10분 동안 전개시키고 자동화 마이크로플레이트 기반 다중-검출 판독기(FLUOstar OPTIMA, 네덜란드 소재)로 판독하였다.
결과 및 결론
데이터는 표 20에 요약되어 있다. 신규한 커넥터 및/또는 역전된 중쇄 및 경쇄 순서 또는 N-글리코실화 부위를 포함하는 추가의 안정화 전략을 이용해서 리드 최적화된 CD137 결합 도메인 및/또는 리드 최적화된 5T4 결합 도메인 및/또는 안정화된 이중특이성 항체로 이루어진 최적화된 이중특이성 항체는 두 표적인 CD137 및 5T4에 대해서 이중 결합을 나타낸다. 예를 들어, 1210LO1 및 1210LO2와 같은 개선된 결합을 가진 결합 도메인은 최적화되지 않은 1210 결합 도메인을 포함하는 이중특이성 항체에 비해서 더 낮은 EC50 값으로서 관찰되는 바와 같은 개선된 이중 결합을 제공한다.
Figure pct00048
실시예 25 - 유세포분석에 의해 측정된, 세포 5T4를 발현하는 세포에 대한 리드 최적화된 5T4 클론의 결합
재료 및 방법
유세포분석을 이용한 5T4 mAb 결합의 분석은 마카카 물라타(사이노몰거스) 5T4-형질주입된 CHO-K 세포주 및 음성 대조군으로서의, 모의 형질주입된 세포를 이용해서 수행하였다. 세포를 FACS 완충액(PBS, 0.5% BSA 및 0.02% NaN3) 중에서 희석된 5T4 리드 최적화된 클론(bsAb 형식의 scFv)으로 염색하였다. 결합은 1:100으로 희석된 2차 항체 항-IgG (Fc)-PE (109-115-098, 잭슨 이뮤노리서치 유럽, 영국 소재)로 검출하였다. 샘플을 FACSverse(BD 바이오사이언시스사, 독일 하이델베르크 소재) 상에서 가동시키고 플로조 소프트웨어를 이용해서 평균 형광 강도(MFI)를 결정하였다.
ELISA를 표준 프로토콜을 이용해서 수행하였다. 플레이트(#655074, 그라이너 바이오-원 게엠베하, 독일 소재)를 0.5㎍/㎖ 5T4-Fc(인하우스에서 생산)로 하룻밤 사전-코팅하였다. 5T4 항체를 PBST+1% BSA에 희석시키고 50㎕를 각 웰에 첨가하였다. 결합은 항-인간 카파경쇄 항체(AbD Serotec # STAR127P)로 검출하고 ELISA는 수퍼시그널 ELISA 피코 화학발광 기질(써모사이언티픽 피어스사, 미국 일리노이주 록포드 소재)을 이용하여 2 내지 10분 동안 전개시키고, 자동화 마이크로플레이트 기반 다중-검출 판독기(FLUOstar OPTIMA, 네덜란드 소재)로 판독하였다..
결과 및 결론
CHOh5T4 및 CHOcyno5T4 세포에 대한 결합 곡선은 도 16(A 및 B)에서 볼 수 있다. 모든 리드 최적화된 변이체는 인간 및 cyno 5T4 발현 세포 둘 다에 대해서뿐만 아니라 원래의 항체에 비해서 ELISA로 측정된 인간 5T4에 대해서 유사한 결합 역가를 지닌다. 리드 최적화된 변이체는 ELISA 및 FACS 둘 다로 측정된 바와 같이 인간 및 cyno 5T4 둘 다에 대해서 개선된 친화도를 지닌다.
실시예 26 - 유세포분석에 의해 측정된, CD137을 발현하는 세포에 대한 리드 최적화된 CD137 클론의 결합
재료 및 방법
유세포분석을 이용한 CD137 mAb 결합의 분석은 인간 및 cyno CD137-형질주입된 CHO-K 세포주 및 음성 대조군으로서의 모의 형질주입된 세포를 이용해서 수행하였다. 세포는 FACS 완충액(PBS, 0.5% BSA 및 0.02% NaN3)으로 희석된 CD137 리드 최적화된 클론으로 (bsAb 형식의 scFv로서) 염색하였다. 결합은 1:100으로 희석된 2차 항체 항-IgG(Fc)-PE(109-115-098, 잭슨 이뮤노리서치 유럽, 영국 소재)로 검출하였다. 샘플은 FACSverse(BD 바이오사이언시스사, 독일 하이델베르크 소재) 상에서 가동시키고, 플로조 소프트웨어를 이용해서 평균 형광 강도(MFI)를 결정하였다.
ELISA 플레이트(그라이너 # 655074)는 37℃에서 1시간 동안 또는 4℃에서 하룻밤 PBS 중 0.5㎍/㎖의 최종 농도로 희석된 재조합 CD137(R&D # 838-4B)의 50㎕/웰로 코팅하였다. 플레이트는 PBS+0.05% TWEEN20(PBST)으로 세척하고 나서 PBST+1% 소혈청 알부민(BSA)으로 차단하였다. 항체 샘플을 PBST+1% BSA로 희석시키고 실온에서 1시간 동안 항온처리하고 나서, 겨자무과산화효소-접합된 항-인간 카파 경쇄 항체(AbD 세로텍 # STAR127P)를 이용하여 검출하고, 수퍼시그널 ELISA 피코 화학발광 기질(피어스 써모사이언티픽 #37069)을 이용하여 전개시켰다.
결과 및 결론
CHOhCD137 및 CHOcynoCD137 세포에 대한 이중특이성 항체의 결합 곡선은 도 17(A 및 B)에서 볼 수 있다.
EC50 값은 인간 및 cyno CD137 둘 다에 대해서 야생형 1210-1618(scFv로서 1618) 클론과 견줄만하다.
실시예 27 - 5T4 코팅된 플레이트 상에서 인간 CD8+ T 세포를 이용한 IFNγ 방출 검출에서의 리드 최적화된 5T4-CD137(1618-1210) 이중특이성 항체의 시험관내 활성도
재료 및 방법
5T4-CD137 bsAb의 기능적 활성도는 CD8+ T 세포 검정에서 평가되었으며, 여기서 세포를 5T4-Fc 및 CD3 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에서 배양하였다. 건강한 공여체(클리니컬 이뮤놀로지 앤드 트랜스퓨전 메디신, 스웨덴 룬드 랩매디신 리전 스칸 소재)로부터 획득한 백혈구 농축액으로부터의 피콜-플라크(ρ 1.077g/㎖)(GE 헬스케어사 #17-1440-02)를 이용해서 밀도 구배 원심분리에 의해 말초혈액 단핵구 세포(MNC)를 단리시켰다. CD8+T 세포는 CD8+ T 세포 단리 키트(밀테니이 130-096-495)를 이용해서 음성 선택에 의해 농축시켰다. 플레이트를 3㎍/㎖ αCD3, 클론 OKT3(애피메트릭스 이바이오사이언스 #16-0037-85)으로 4℃에서 하룻밤 코팅하고, 세척하고 5㎍/㎖ 5T4-Fc로 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. 5T4-Fc 코팅 후, 플레이트를 세척하고 10% FCS(열 비활성화됨, 깁코 # 10270-106 로트 41Q9248K) 및 10mM 헤페스(깁코 # 15630056)를 함유하는 RPMI(깁코 # 61870010)로 최소 30분 동안 차단하였다. 1618-1210 bsAb를 10% FCS 및 10mM 헤페스를 함유하는 RPMI로 희석시키고, CD8+ T 세포(0.07×106개 세포/웰)의 첨가 전 30분에 플레이트에 첨가하였다. 검정 플레이트를 37℃에서 68시간 동안 항온처리하고, 배양 상청액을 수확하였다. 상청액 중의 IFN-γ 수준을 ELISA(BD OptiEIA #555142)에 의해 측정하였다.
결과 및 결론
1618-1210 bsAb의 역가는 5T4-Fc 코팅된 플레이트에서 배양된 인간 CD8+ T 세포를 이용해서 EC50 0.6 내지 0.9nM로 결정되었고, 두 실험 및 총 6개의 공여체에 기초하였다. 데이터는 정규화되었고, EC50은 3-매개변수 S자형 용량-반응 모델을 이용해서 결정되었다(도 18).
1618-1619 및 1210-1211의 최적화된 가변 도메인을 가진 이중특이성 항체 변이체를가 표 D, 표 E, 표 18, 표 19 및 표 20에 개요된 바와 같이 생성하였다. 최적화된 가변 서열을 가진 생성된 bsAbs 변이체는 도 19에 나타낸 바와 같이 가교결합된 5T4-Fc를 이용하는 CD8+ T 세포 검정에서 기능적이었다. 상이한 검정 플레이트로부터의 결과를 상관시키기 위하여, 계산된 IFNγ 수준을 플레이트 기준으로 정규화시켰다.
이중특이성 항체는 또한 표 D, 표 E 및 표 20에 개요된 바와 같은 상이한 링커로 생성하고 CD8 T 세포 검정으로 평가하였다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 생성된 bsAb는 종양 항원의 존재 하에서만 CD137 활성화를 유도할 수 있었다. 이전의 도 19에서와 같이, 얻어진 IFNγ값은 플레이트에서 양성 대조군으로 정규화시켰다.
실시예 28 - 5T4 -발현 종양 세포(B16-5T4)로 배양된 인간 CD8+ T 세포를 이용한 IFNγ 방출 검정에서 리드 최적화된 5T4-CD137 (1618-1210) 이중특이성 항체의 시험관내 활성도
재료 및 방법
CD8+ T 세포를 위에서 기재된 바와 같이 단리시키고, 항원 관련 항원(TAA) 5T4-발현 세포 B16 세포의 존재 하에 배양하였다. 빈 벡터로 형질주입된 B16 세포를 음성 대조군으로서 사용하였다. CD3 자극은 제조사의 프로토콜에 따라서 αCD3 (OKT3) 코팅된 비드(Dynal M-450 토실활성화된 #14013)로 수행하였다.
조사된 B16 종양 세포(6000 세포/웰)를 96 웰 플레이트에 첨가하고 2시간 동안 부착되도록 정치시켰다. CD137-5T4 bsAb를 첨가하고 CD8+ T 세포(0.1×106 세포/웰) 및 αCD3 코팅된 비드(0.5×105 비드/웰)의 첨가 전 30분 동안 항온처리하였다. 플레이트를 68시간 동안 배양하고 배지 중의 IFN-γ 수준을 ELISA(BD OptiEIA #555142)에 의해 측정하였다.
결과 및 결론
이중특이성 항체 1618-1210은, 5T4를 발현하지 않는 세포 상에서 배양된 경우가 아니라, 5T4(TAA) 발현 세포 상에서 배양된 경우 용량 의존적 방식으로 CD8+ T 세포 중 IFNγ 생산을 유도하였다. 그 결과는 CD137-TAA 항체가 종양 항원의 존재 하에서만 T 세포를 자극시키는 것을 더욱 확인시켜 준다. 1618-1210 bsAb의 역가는 B16-5T4 발현 종양 세포에서 수행된 CD8+ T 세포 검정에서 EC50 0.2 내지 0.7nM로 결정되었다. EC50은 두 공여체로부터 정규화된 데이터에 기초하여, 3-매개변수 S자형 용량-반응 모델을 이용해서 결정하였다(도 21).
실시예 29 - 5T4 - Fc 코팅된 플레이트에서 배양된 인간 PBMC를 이용한 IFNγ 방출 검정에서의 리드 최적화된 5T4-CD137 (1618-1210) 이중특이성 항체의 시험관내 활성도
재료 및 방법
5T4-CD137 bsAb의 기능적 활성도는 PBMC 검정에서 평가되었는데, 여기서 세포는 5T4-Fc 항체로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에서 배양하였다. 건강한 공여체(클리니컬 이뮤놀로지 앤드 트랜스퓨전 메디신, 스웨덴 룬드 랩매디신 리전 스칸 소재)로부터 얻어진 백혈구 농축액으로부터 피콜-플라크(ρ 1.077g/㎖)(GE 헬스케어사 #17-1440-02)를 이용해서 밀도 구배 원심분리에 의해 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)를 단리시켰다. CD8+T 세포는 CD8+ T 세포 단리 키트(밀테니이 130-096-495)를 이용한 음성 선택에 의해 농축시켰다. 플레이트는 37℃에서 2시간 동안 5㎍/㎖ 5T4-Fc로 코팅하였다. 5T4-Fc 코팅 후, 플레이트를 세척하고 10% FCS(열 비활성화됨, 깁코 # 10270-106 로트 41Q9248K) 및 10mM 헤페스(깁코 # 15630056)를 함유하는 RPMI(깁코 # 61870010)로 최소 30분 동안 차단시켰다.
1618-1210 bsAb는 10% FCS 및 10 mM 헤페스를 함유하는 RPMI로 희석시키고, CD8+ T 세포(0.1×106개 세포/웰)의 첨가 전 30분에 플레이트에 첨가하였다. CD3 자극을 1㎍/㎖ 가용성 αCD3으로 수행하였다. 검정 플레이트를 37에서 68시간 동안 항온처리하고, 배양 상청액을 수확하였다. 상청액 중의 IFN-γ 수준을 ELISA(BD OptiEIA #555142)에 의해 측정하였다.
결과 및 결론
도 22에 도시된 결과는 이중특이성 항체 1618-1210.m2가 PBMC의 TAA(5T4)-의존성 CD137 매개 활성화를 유도한 것을 입증한다. 이 검정에 존재하는 5T4가 없는 경우 PBMC의 활성화는 검출되지 않았다.
실시예 30 - CD32 ( FcγRII )-발현 L 세포로 배양된 인간 CD8+ T 세포를 이용한 IFNγ 방출 검정에서 리드 최적화된 5T4-CD137 이중특이성 항체의 시험관내 활성도
재료 및 방법
CD8 T 세포를 위에서 기재된 바와 같이 단리시키고, CD32-발현 L 세포의 존재 하에 배양하였다. CD3 자극은 제조사의 프로토콜에 따라서 αCD3 (OKT3) 코팅된 비드(Dynal M-450 토실활성화 #14013)로 수행하였다.
조사된 CD32 L 세포(10000개 세포/웰)를 96 웰 플레이트에 첨가하고 2시간 동안 부착되도록 정치시켰다. LALA 돌연변이를 갖는 그리고 갖지 않는 CD137(1618)을 첨가하고 CD8+ T 세포(0.1×106개 세포/웰) 및 αCD3 코팅된 비드(0.5×105 비드/웰)의 첨가 전에 30분 동안 배양하였다. 플레이트를 68시간 동안 배양하고, 배지 중의 IFN-γ 수준을 ELISA(BD OptiEIA #555142)에 의해 측정하였다.
결과 및 결론
도 23에 도시된, CD8+ T 세포와 CD32-발현 세포의 공동-배양 검정으로부터의 결과는, CD137 활성화가 LALA 돌연변이를 함유하는 Fc 침묵화된 1618 IgG1에 의해서가 아니라 wt IgG1을 함유하는 1618에 의해서만 유도되는 것을 입증하며, 추가로 1618/1619와 같은 항체에 의한 CD137을 통한 T 세포의 활성화가 가교 결합을 필요로 한다는 결론을 뒷받침한다.
실시예 31 - 이중-결합 ELISA에 의해 측정된 TAA -CD137 이중특이성 항체의 결합
재료 및 방법
3가지 종양 관련 항원(TAA)인 EpCAM, HER2 및 EGFR에 대한 이중특이성 항체를 생성하였다. CD137에 대한 scFv(1204/1205) 결합은 에드레콜로맙, 세툭시맙 및 허셉틴의 결합 도메인에 대응하는 서열을 갖는 3가지 상이한 IgG 항체의 C-말단에 융합시켰다. bsAb를 Expi293(상표명)(써모 피서 사이언티픽사)의 일시적 형질주입에 의해 생산하고, 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 정제시켰다.
두 표적 CD137 및 TAA에 대한 이중특이성 결합은 표준 ELISA 프로토콜을 이용해서 평가하였다. 플레이트(#655074, 그라이너 바이오-원 게엠베하, 독일 소재)를 0.5　㎍/㎖ TAA(hEGFR-His, 시노바이오로지컬(SinoBiological) #10001-H08H, hEpCAM-Fc, 시노바이오로지컬 #10694-H02H, HER2-His, 시노바이오로지컬 #10004-H08H 및 5T4-Fc)로 하룻밤 사전 코팅하였다. TAA-bsAb를 1:4 희석으로 20㎍/㎖로 희석시키고 각 웰에 50㎕를 두 벌로 첨가하였다. CD137-바이오(안셀 #502-030)는 0.5㎍/㎖에서 검출 항체로서 사용하고, 결합은 스트렙타비딘-HRP(피어스 #21126)로 검출하였다. ELISA를 수퍼시그널 ELISA 피코 화학발광 기질(써모 사이언티픽 피어스사, 미국 일리노이주 록포드 소재)로 2 내지 10분 동안 전개시키고 자동화 마이크로플레이트 기반 다중-검출 판독기(FLUOstar OPTIMA, 네덜란드 소재)로 판독하였다.
결과 및 결론
생성된 TAA-CD137 bsAb는 낮은 nM 범위의 EC50 값으로 이중 ELISA에서 두 표적에 결합되었다(표 21, 도 24).
Figure pct00049
실시예 32 - TAA 코팅된 플레이트에서 배양된 인간 CD8+ T 세포를 이용한 IFNγ 방출 검정에서 TAA -CD137 이중특이성 항체의 시험관내 활성도
재료 및 방법
EpCAM, EGFR 및 Her2에의 3개의 TAA-CD137 bsAb 결합의 기능적 활성도를 CD8+ T 세포 검정에서 평가하였으며, 여기서 세포는 CD3 항체 및 EGFR, EpCam 또는 Her2 중 하나로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에서 배양하였다. 음성 대조군으로서, 병렬 웰들을 단지 CD3 항체로 코팅하였다. 말초혈액 단핵구 세포(PBMC)를 건강한 공여체(클리니컬 이뮤놀로지 앤드 트랜스퓨전 메디신, 스웨덴 룬드 랩매디신 리전 스칸 소재)로부터 획득한 백혈구 농충액으로부터의 피콜-플라크(ρ 1.077g/㎖)(GE 헬스케어사 #17-1440-02)를 이용해서 밀도 구배 원심분리에 의해 단리시켰다. CD8+ T 세포 단리 키트(밀테니이 130-096-495)를 이용한 음성적 선택에 의해 CD8+T 세포를 농축시켰다. 플레이트를 3㎍/㎖ αCD3, 클론 OKT3(애피메트릭스 이바이오사이언스 #16-0037-85)로 4℃에서 하룻밤 코팅하고 5㎍/㎖ TAA로 37℃에서 2시간 동안 코팅하였다. TAA 코팅 후에, 플레이트를 세척하고 10% FCS(열 비활성화됨, 깁코 #10270-106 로트 41Q9248K) 및 10 mM 헤페스(깁코 #15630056)를 함유하는 RPMI(깁코 # 61870010)로 최소 30분 차단하였다.
TAA-CD137 bsAb를 10% FCS 및 10 mM 헤페스를 함유하는 RPMI 중에 희석시키고 CD8+ T 세포(0.07×106개 세포/웰)의 첨가 전 30분에 플레이트에 첨가하였다. 검정 플레이트를 37℃에서 68시간 배양하고, 배양 상청액을 수확하였다. 상청액 중의 IFN-γ 수준은 ELISA(BD OptiEIA #555142)에 의해 측정하였다.
결과 및 결론
EpCAM-1204(도 25(A)), EGFR-1204(도 25(B)) 및 Her2-CD137(도 25(C)) bsAb의 기능성을 분석한 바, 생성된 bsAb의 전부가 TAA의 존재 하 그리고 TAA의 부재가 아닌 상태에서 (웰은 CD3 항체만으로 코팅됨) TAA 매개 CD137 활성화를 유도시킨 것으로 결론내렸다. 이것은 CD137-TAA 항체에 의해 생성된 TAA-의존성 CD137-매개 면역 세포 활성화가 세포 표면 발현된 TAA의 모든 유형에 적용 가능한 일반적인 현상이라는 것을 강력하게 나타낸다.
실시예 33 - CT26-5T4 결장암 모델에서의 이중특이성 항체 1618-1210의 생체내 항-종양 효과
요약
1618-1210(CD137 및 5T4를 표적화하는 예시적인 항체)의 항-종양 효과는 인간 CD137에 대한 형질전환 마우스 및 CT26 결장 암종 발현 인간 5T4의 피하 상승작용적 종양 모델을 이용해서 연구하였다.
이중특이성 항체 1618-1210은 단클론성 항체 1618 표적화 CD137에 비해서 종양 용적 저해를 입증하였다.
재료 및 방법
인간 4-1BB 넉-인 마우스 모델은 Lieping Chen 교수에 의해 개발되었고, 이형접합체 F1 암컷을 이 실험에서 사용하였다. BalbC 암컷과 함께 C57 백그라운드에서 인간 CD137에 대한 수컷 동형접합체를 번식시킴으로써 이형접합체를 생성하였다. 모든 실험은 말뫼/룬드 윤리 위원회의 승인에 의해 수행하였다.
CT26 결장암 세포는 ATCC로부터 획득하고 인간 5T4로 형질주입시켰다. 대수상에서 성장 중인 CT26-5T4 세포주를 우측 뒤쪽/옆구리에 피하 주사하였다(제0일(D0)에 100㎕ 중 0.5×106개 세포). 복강내 치료(1.33nM)는 제7일, 제10일 및 제13일에 수행하였다.
종양을 캘리퍼로 폭, 길이 및 높이를 측정하여, 종양 용적을 계산하였다(w/2×l/2×h/2×pi×(4/3)). 종양 용적이 2㎤에 도달하기 전에, 상흔 시에, 또는 마우스의 건강이 나빠지기 전에 동물을 종료시켰다.
데이터는 그래프패드 프리즘 및 엑셀을 이용해서 단클론성 항체와 비교해서 이중특이성 항체에 의해 종양 용적 저해에 대해서 분석하였다.
결과 및 결론
항-종양 효능은 종양 성장 저해의 형태로 제8 내지 22일에 단클론성 항체 1618에 의한 치료에 비해서 이중특이성 항체 1618-1210에 의한 치료를 이용해서 입증되었다. 종양 용적 저해의 백분율은 1618-1210로 치료된 경우에 0 내지 68% 범위였다(표 22 참조).
결론적으로, 1618-1210의 항-종양 효과는 인간 5T4를 가진 CT26 결장 암종의 피하 종양 모델 및 인간 CD137에 대한 형질전환 마우스를 이용해서 연구하였다. 이중특이성 항체 1618-1210은 단클론성 CD137 mAb 1618에 비해서 종양 용적 저해를 입증하였다.
Figure pct00050
실시예 34 - 이중특이성 5T4-CD137 항체가 종양 영역에 국재화된다
재료 및 방법
타코닉사(Taconic)(덴마크 소재)로부터의 암컷 SCID-베이지 마우스(7-8 w)를 이 실험에서 사용하였다. 모든 실험은 말뫼/룬드 윤리 위원회의 승인에 의해 수행되었다.
이중 종양 연구(B16 및 CT26 종양)
B16.F10 wt (B16) 흑색종은 ATCC로부터 획득하고 ATCC에 의한 권장에 따라서 배양하였다. B16-5T4는 Peter Stern 교수로부터 획득하였고, 1.2㎎/㎖ G418이 보충된 동일 배지에서 배양하였다. CT26 및 CT26-5T4 세포는 RPMI, 10% FCS, NaPy 및 HEPES에서 배양하였다. CT-5T4 배지는 1.2㎎/㎖ G418을 보충하였다.
B16 및 CT26 종양에 대해서, 이중 종양 연구를 수행하고 각 마우스에게는 옆구리의 각 측면에 하나의 5T4 음성 및 하나의 양성 종양을 공급하였다, 대수상에서 성장하는 세포주를 피하 주사하였다(제0일에 100㎕ 중 1×105개 세포). 백혈구 농축액으로부터 단리된 인간 PBMC(100㎕ 중 10×106개)를 동일자에 복강내 주사하였다. 백혈구 농축액은 룬드 대학 병원으로부터 획득하였다.
복강내 항체 치료(100㎍)를 B16 종양에 대해서는 제6일과 제13일에 그리고 CT26 종양에 대해서는 제6, 13 및 20일에 수행하였다.
단일 종양 연구( SKOV -3 종양)
SKOV-3 종양에 대해서, 각 마우스에게는 우측 옆구리에 단일 종양을 공급하였다. 대수상으로 성장하는 세포주를 피하 주사하였다(제0일에 100㎕ 중 10×106개 세포). 일단 평균 종양 용적이 100㎣ 초과에 도달하면, 백혈구 농축액으로부터 단리된 인간 PBMC(100㎕ 중 10×106개)를 복강내 주사하였다. 복강내 항체 치료(100㎍)는 제55일, 제62일 및 제67일에 PBMC 전사 후에 6일에 시작하였다.
FACS 분석
마우스는 최종 치료 후 24시간에 희생시키고, 종양을 수집하였다. 종양을 리버라제 TL(Liberase TL)(로슈(Roche) #05401020001) 및 DNase I(로슈 #10104159001)을 이용해서 효소로 소화시켰다. 소화된 종양 물질은 70㎛ 셀 스트레이너(cell strainer)(피셔 사이언티픽 #22363548)를 통과시키고, 얻어진 단일 세포 현탁액을 FACS 분석을 위하여 염색하였다.
불특정 항체 결합은 마우스 IgG(잭슨 이뮤노리서치 #015-000-003) 및 Fc 블록(BD #553141)을 이용해서 차단하였다. 사멸 세포는 제조사의 지시에 따라서 픽서블 바이어빌러티 스테인 450(Fixable Viability Stain 450)(BD #562247)을 이용해서 검출하였다. 종양 세포에의 항체(인간 IgG)의 결합은 염소-항-인간 IgG-PE(잭슨 이뮤노리서치 #109-115-098)를 이용해서 검출하였다. 샘플을 FACSVerse(BD) 상에서 가동시키고 플로조 소프트웨어를 이용해서 데이터를 분석하였다.
결과
SCID -베이지 마우스에서 5T4-양성 B16 및 CT26 종양에 대한 1618- 1210.m2.m5 의 국재화
인간 IgG의 결합은 동일한 마우스로부터 B16.F10 wt 종양에서가 아니라 1618-1210.m2.m5로 치료된 마우스로부터 B16-5T4 종양에서 세포의 대략 6% 상에서 명백하게 검출 가능하였다. 1618.m2 또는 2112.s4.m3으로 치료된 마우스는 종양 유형에 관계 없이 세포의 1% 미만에 결합된 인간 IgG를 지녔다(도 26).
유사한 관찰이 CT26 종양-보유 마우스에서 이루어졌다. 항체 국재화가 재차 5T4-발현 종양에서 특이적으로 관찰되었다. B16 종양과 마찬가지로, 인간 IgG는 1618.m2 또는 2112.s4.m3으로가 아니라 1618-1210.m2.m5로 치료된 마우스에서 가변적인 생존 종양 세포의 대략 8%에서 검출 가능하였다. 게다가, 바이오틴화된 CD137은 또한 1618-1210.m2.m5로 치료된 마우스로부터의, 5T4-발현 종양으로부터의 세포에 의해 특이적으로 결합되었다(도 27).
1618- 1210.m2.m5의 SKOV -3 종양으로의 국재화
CT26 종양에 대해서 관찰된 것과 유사하게, 바이오틴화된 CD137의 결합은 1618.m2 또는 2112.s4.m3이 아니라 1618-1210.m2.m5로 처리된 마우스로부터의 SKOV-3 종양에서 관찰되었다. 또한, 결합된 CD137을 가진 세포가 또한 5T4를 발현하였는데, 이것은 이중특이성 항체가 5T4-발현 세포를 특이적으로 표적화하여 종양 내에 무손상인 채로 있는 것을 시사한다(도 28).
결론
이들 데이터는 이중특이성 항체 1618-1210.m2.m5가 생체내에서 5T4-발현 종양에 선택적으로 결합하는 것을 나타낸다. 이와 대조적으로, CD137 단일특이성 항체 1618.m2 및 2112.s4.m3은 종양에 국재화되지 않는다.
실시예 35 - 최적화된 5T4 및 CD137 결합제의 증대된 Tm
Tm 측정은 UNcle 플랫폼(Unchained Labs)을 구비한 단백질 형광을 이용해서 가용성 scFv 또는 이중특이성 항체에 대해서 수행하였다. 응집의 개시는 UNcle 플랫폼을 이용하는 정적 광 산란(static light scattering: SLS)으로 측정하였다. 측정은 0.12 내지 1.32㎎/㎖의 단백질 농도 범위에서 PBS 중에서 분당 0.4℃의 상승 속도로 20℃ 내지 95℃의 온도 범위에서 수행하였다. 데이터 분석은 디폴트 세팅을 이용하는 UNcle 분석 소프트웨어 버전 2.0으로 수행하였다.
표 23에서 알 수 있는 바와 같이, 최적화된 서열은 야생형 서열(각각 1618 및 1210)과 비교해서 개선된 Tm1 및 Tagg를 나타낸다.
표 24에서, (모리슨 형식에서) 예시적인 이중특이성 항체에 대한 Tm1 및 Tagg이 표시된다. 데이터는, 최적화된 서열이 이중특이성 형식으로 이용될 경우 열안정성이 증가되는 것을 나타낸다.
Figure pct00051
Figure pct00052
[참고문헌]
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
SEQUENCE LISTING <110> ALLIGATOR BIOSCIENCE AB <120> NOVEL POLYPEPTIDES <130> WO 2017/182672 <140> PCT/EP2017/059656 <141> 2017-04-24 <150> GB1607046.8 <151> 2016-04-22 <160> 168 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1206, heavy chain, VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Arg Asn Val His Pro Tyr Asn Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1206, heavy chain, VH <400> 2 gaggtgcagc tgttggagag cgggggaggc ttggtacagc 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gcgctaccat 300 tctggtgttt tggactattg gggccaggga accctggtca ccgtctcctc a 351 <210> 15 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1213, light chain VL <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Tyr His Tyr Leu 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1213, light chain VL <400> 16 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggaag 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tccatcctcc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgcgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggaag cgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tactacattc cgcacacttt tggccagggg 300 accaagctgg agatcaaa 318 <210> 21 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1202, heavy chain VH <400> 21 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Gly Ser 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Tyr Gly Ser Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Tyr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 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gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggaag cgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttatta ctgtcaacag tactacgaca acctgcccac ttttggccag 300 gggaccaagc tggagatcaa a 321 <210> 37 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1620 (VH) <400> 37 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Ser Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Val Gly Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 38 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1620 (VH) <400> 38 gaggtgcagc tgttggagag cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgcctc 60 tcctgtgcag 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Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln 450 455 460 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 465 470 475 480 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Glu Ser Tyr Ala Met Ser 485 490 495 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile 500 505 510 Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 515 520 525 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 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Claims (88)

  1. 이중특이성 폴리펩타이드로서,
    CD137에 특이적으로 결합 가능한, B1로 지칭되는 제1 결합 도메인, 및
    종양 세포-관련 항원에 특이적으로 결합 가능한, B2로 지칭되는 제2 결합 도메인을 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  3. 제2항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 Fv　단편(예컨대, 단쇄 Fv 단편, 또는 다이설파이드-결합된 Fv 단편), Fab-유사 단편(예컨대, Fab 단편; Fab' 단편 또는 F(ab)2 단편) 및 도메인 항체로 이루어진 군으로부터 선택된, 이중특이성 폴리펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 이중특이성 항체인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  5. 제4항에 있어서,
    (a) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2가 무손상 IgG 항체이고;
    (b) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2가 Fv 단편이고;
    (c) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2가 Fab 단편이고; 그리고/또는
    (d) 결합 도메인 B1 및/또는 결합 도메인 B2가 단일 도메인 항체인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 인간 Fc 영역 또는 상기 영역의 변이체를 포함하고, 상기 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 영역, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 Fc 영역인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 Fc는 FcgR에 대해서 너무 낮은 친화도를 나타내거나 또는 친화도를 나타내지 않는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 Fc 영역은 다음의 위치 중 하나 이상에 돌연변이를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역의 변이체인, 이중특이성 폴리펩타이드:
    L234, L235, P239, D265, N297 및/또는 P329.
  9. 제8항에 있어서, 알라닌이 상기 돌연변이된 위치(들)에 존재하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  10. 제9항에 있어서, 상기 Fc 영역이 이중 돌연변이 L234A 및 L235A를 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역의 변이체인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  11. 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는,
    (a) 2가의 이중특이성 항체, 예컨대, IgG-scFv 이중특이성 항체(예를 들어, B1이 무손상 IgG이고 B2가상기 IgG의 경쇄의 N-말단에서 그리고/또는 경쇄의 C-말단에서 그리고/또는 중쇄의 N-말단에서 그리고/또는 중쇄의 C-말단에서 B1에 부착된 scFv이거나, 또는 그 반대임);
    (b) 1가의 이중특이성 항체, 예컨대, 듀오바디(DuoBody)(등록상표) 또는 '노브-인-홀(knob-in-hole)' 이중특이성 항체(예를 들어, scFv-KIH, scFv-KIHr, BiTE-KIH 또는 BiTE- KIHr);
    (c) scFv2-Fc 이중특이성 항체(예를 들어, ADAPTIR(상표명) 이중특이성 항체);
    (d) BiTE/scFv2 이중특이성 항체;
    (e) 이용되는 2가 또는 링커/ 커넥터에 관계 없이 DVD-Ig 이중특이성 항체 또는 다른 IgG-FAb, FAb-IgG 이중특이성 항체;
    (f) DART-기반 이중특이성 항체(예를 들어, DART2-Fc, DART2-Fc 또는 DART);
    (g) DNL-Fab3 이중특이성 항체; 및
    (h) scFv-HSA-scFv 이중특이성 항체
    로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 이중특이성 항체는 IgG-scFv 이중특이성 항체인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B1과 결합 도메인 B2는 서로 직접 융합되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B1과 결합 도메인 B2는 폴리펩타이드 링커를 통해서 접합되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  15. 제14항에 있어서, 상기 링커는 아미노산 서열 SGGGGSGGGGS(서열번호 87), SGGGGSGGGGSAP(서열번호 88), NFSQP(서열번호 89), KRTVA(서열번호 90), GGGSGGGG(서열번호 91), GGGGSGGGGS(서열번호 92), GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 93), THTCPPCPEPKSSDK(서열번호 140), GGGS(서열번호 141), EAAKEAAKGGGGS(서열번호 142), EAAKEAAK(서열번호 143), 또는 (SG)m(m = 1 내지 7)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 항체 의존적 세포 세포독성(antibody dependent cell cytotoxicity: ADCC), 항체-의존성 세포 식세포작용(antibody-dependent cellular phagocytosis: ADCP) 및/또는 보체-의존성세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC)을 유도 불가능한, 이중특이성 폴리펩타이드.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 종양 면역성을 유도 불가능한, 이중특이성 폴리펩타이드.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
    (a) 세포독성 T 세포, 즉, CD8+ T 세포의 활성화;
    (b) 헬퍼 T 세포, 즉, CD4+ T 세포의 활성화;
    (c) 수지상 세포의 활성화; 및/또는
    (d) 자연 살해 세포의 활성화; 및/또는
    (e) 효과기 T 세포 내로의 Tregs의 리프로그래밍
    을 유도 가능한, 이중특이성 폴리펩타이드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B1은 10×10-9M 미만, 예를 들어, 4×10-9M 미만 또는 1.2×10-9M 미만의 KD로 인간 CD137에 결합되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B1은,
    (a) 항체 1200/1201의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 79 및/또는 서열번호 46, 65 및 72);
    (b) 항체 1202/1203의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 80 및/또는 서열번호 60, 66 및 73);
    (c) 항체 1204/1205의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 81 및/또는 서열번호 61, 67, 74);
    (d) 항체 1214/1215의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 82 및/또는 서열번호 46, 68 및 75);
    (e) 항체 1618/1619의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 83 및/또는 서열번호 62, 69 및 76);
    (f) 항체 1620/1621(서열번호 54, 55 및 84 및/또는 서열번호 63, 70 및 77);
    (g) 항체 1626/1627(서열번호 54, 55 및 85 및/또는 서열번호 64, 71 및 78);
    (h) 항체 3012/3013의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 158, 155 및 83);
    (i) 항체 3014/3015의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 62, 69 및 76 및/또는 서열번호 159, 160 및 83);
    (j) 항체 3016/3017의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 62, 69 및 76 및/또는 서열번호 159, 155 및 83);
    (k) 항체 3018/3019의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 158, 161 및 83);
    (l) 항체 3020/3021의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 162, 163 및 83);
    (m) 항체 3022/3023의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 159, 155 및 83);
    (n) 항체 3024/3025의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 54, 55 및 83);
    (o) 항체 3026/3027의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 162, 165 및 83);
    (p) 항체 3028/3029의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 157, 69 및 76 및/또는 서열번호 159, 166 및 83);
    (q) 항체 3030/3031의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 54, 166 및 83);
    (r) 항체 3032/3033의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 54, 55 및 83);
    (s) 항체 3034/3035의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 62, 69 및 76 및/또는 서열번호 54, 155 및 83); 또는
    (t) 항체 3036/3037의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 156, 69 및 76 및/또는 서열번호 162, 155 및 83)을 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B1은,
    (a) 항체 1200/1201의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 19 및/또는 서열번호 17);
    (b) 항체 1202/1203의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 23 및/또는 서열번호 21);
    (c) 항체 1204/1205의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 25 및/또는 서열번호 27);
    (d) 항체 1214/1215의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 31 및/또는 서열번호 29);
    (e) 항체 1618/1619의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 35 및/또는 서열번호 33);
    (f) 항체 1620/1621의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 39 및/또는 서열번호 37);
    (g) 항체 1626/1627의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 43 및/또는 서열번호 41);
    (h) 항체 3012/3013의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 114 및/또는 서열번호 115);
    (i) 항체 3014/3015의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 116 및/또는 서열번호 117);
    (j) 항체 3016/3017의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 118 및/또는 서열번호 119);
    (k) 항체 3018/3019의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 120 및/또는 서열번호 121);
    (l) 항체 3020/3021의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 122 및/또는 서열번호 123);
    (m) 항체 3022/3023의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 124 및/또는 서열번호 125);
    (n) 항체 3024/3025의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 126 및/또는 서열번호 127);
    (o) 항체 3026/3027의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 128 및/또는 서열번호 129);
    (p) 항체 3028/3029의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 130 및/또는 서열번호 131);
    (q) 항체 3030/3031의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 132 및/또는 서열번호 133);
    (r) 항체 3032/3033의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 134 및/또는 서열번호 135);
    (s) 항체 3034/3035의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 136 및/또는 서열번호 137); 또는
    (t) 항체 3036/3037의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 138 및/또는 서열번호 139)을 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B1은,
    (a) 항체 1200/1201의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (b) 항체 1202/1203의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (c) 항체 1204/1205의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (d) 항체 1214/1215의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (e) 항체 1618/1619의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (f) 항체 1620/1621의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (g) 항체 1626/1627의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (h) 항체 3012/3013의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (i) 항체 3014/3015의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (j) 항체 3016/3017의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (k) 항체 3018/3019의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (l) 항체 3020/3021의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (m) 항체 3022/3023의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (n) 항체 3024/3025의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (o) 항체 3026/3027의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (p) 항체 3028/3029의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (q) 항체 3030/3031의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (r) 항체 3032/3033의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (s) 항체 3034/3035의 중쇄 및/또는 경쇄; 또는
    (t) 항체 3036/3037의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B1은 항체 1200/1201의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역(서열번호 19 및/또는 서열번호 17), 또는 서열번호 19 및/또는 서열번호 17에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B1은 항체 1618/1619의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역(서열번호 35 및/또는 서열번호 33), 또는 서열번호 35 및/또는 서열번호 33에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B2는,
    (a) 돌연변이된 종양유전자 및 종양 억제 유전자의 산물;
    (b) 과발현된 또는 이상 발현된 세포 단백질;
    (c) 종양 바이러스(oncogenic virus)에 의해 생산된 종양 항원;
    (d) 태아종양 항원;
    (e) 변경된 세포 표면 당지질 및 당단백질;
    (f) 세포 유형-특이적 분화 항원;
    (g) 저산소증-유도 항원;
    (h) MHC 부류 I로 제시되는 종양 펩타이드;
    (i) 상피 종양 항원;
    (j) 혈액학적 종양-관련 항원;
    (k) 고환암 항원; 및
    (l) 흑색종 항원
    으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 세포-관련 항원에 결합하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포-관련 항원은 5T4, CD20, CD19, MUC-1, 암배아 항원(CEA), CA-125, CO17-1A, EpCAM, HER2, EGFR, HER3, GD2, 포도칼릭신(Podocalyxin), TROP-2, DLK-1, Ox1R, 넥틴-4(Nectin-4), FAP, EphA2, EphA3, 메소텔린, E-카드헤린, CD24 및 VEGFR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포-관련 항원은 태아종양 항원인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포-관련 항원은 5T4인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포는 고형 종양 세포인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  30. 제29항에 있어서, 상기 고형 종양은 신장세포 암종, 결장직장암, 폐암, 전립선암, 유방암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 자궁경부암, 식도암, 위암, 두/경부암, 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B2는 10×10-9M 미만, 예를 들어, 4×10-9M 미만 또는 1.2×10-9M 미만의 KD로 상기 종양 세포-관련 항원에 결합되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B2는,
    (a) 항체 1206/1207의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 56 및/또는 서열번호 45, 47 및 50);
    (b) 항체 1208/1135의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 57 및/또는 서열번호 46, 48 및 51);
    (c) 항체 1210/1211의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 58 및/또는 서열번호 46, 48 및 52);
    (d) 항체 1212/1213의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 59 및/또는 서열번호 46, 49 및 53);
    (e) 항체 2992/2993의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 144, 48 및 52 및/또는 서열번호 145, 55 및 58);
    (f) 항체 2994/2995의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 146, 147 및 52 및/또는 서열번호 145, 55 및 58);
    (g) 항체 2996/2997의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 146, 48 및 52 및/또는 서열번호 148, 55 및 58);
    (h) 항체 2998/2999의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 146, 48 및 52 및/또는 서열번호 149, 55 및 58);
    (i) 항체 3000/3001의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 150, 48 및 52 및/또는 서열번호 148, 151 및 58);
    (j) 항체 3002/3003의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 152, 48 및 52 및/또는 서열번호 145, 55 및 58);
    (k) 항체 3004/3005의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 146, 48 및 52 및/또는 서열번호 153, 55 및 58);
    (l) 항체 3006/3007의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 144, 48 및 52 및/또는 서열번호 154, 155 및 58); 또는
    (m) 항체 3008/3009의 중쇄의 3개의 CDR 및/또는 경쇄의 3개의 CDR(서열번호 146, 48 및 52 및/또는 서열번호 154, 55 및 58)을 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B2는,
    (a) 항체 1206/1207의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 3 및/또는 서열번호 1);
    (b) 항체 1208/1135의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 7 및/또는 서열번호 5);
    (c) 항체 1210/1211의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 11 및/또는 서열번호 9);
    (d) 항체 1212/1213의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 15 및/또는 서열번호 13);
    (e) 항체 2992/2993의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 96 및/또는 서열번호 97);
    (f) 항체 2994/2995의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 98 및/또는 서열번호 99);
    (g) 항체 2996/2997의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 100 및/또는 서열번호 101);
    (h) 항체 2998/2999의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 102 및/또는 서열번호 103);
    (i) 항체 3000/3001의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 104 및/또는 서열번호 105);
    (j) 항체 3002/3003의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 106 및/또는 서열번호 107);
    (k) 항체 3004/3005의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 108 및/또는 서열번호 109);
    (l) 항체 3006/3007의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 110 및/또는 서열번호 111); 또는
    (m) 항체 3008/3009의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역(서열번호 112 및/또는 서열번호 113)을 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B2는,
    (a) 항체 1206/1207의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (b) 항체 1208/1135의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (c) 항체 1210/1211의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (d) 항체 1212/1213의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (e) 항체 2992/2993의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (f) 항체 2994/2995의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (g) 항체 2996/2993의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (h) 항체 2998/2999의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (i) 항체 3000/3001의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (j) 항체 3002/3003의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (k) 항체 3004/3005의 중쇄 및/또는 경쇄;
    (l) 항체 3006/3007의 중쇄 및/또는 경쇄; 또는
    (m) 항체 3008/3009의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B2는 항체 1208/1135의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역(서열번호 7 및 서열번호 5), 또는 서열번호 7 및/또는 서열번호 5에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  36. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B2는 항체 1210/1211의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역(서열번호 11 및 서열번호 9), 또는 서열번호 11 및/또는 서열번호 9에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  37. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B2는 항체 2992/2993의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역(서열번호 96 및 서열번호 97), 또는 서열번호 96 및/또는 서열번호 97에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  38. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B2는 항체 2994/2995의 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역(서열번호 98 및 서열번호 99), 또는 서열번호 98 및/또는 서열번호 99에 대해서 60% 초과, 또는 70% 초과, 예컨대, 75 또는 80%, 바람직하게는 85% 초과, 예컨대, 90% 초과 또는 95%의 아미노산 동일성을 갖는 변이체를 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B1은 IgG이고 결합 도메인 B2는 scFv인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  40. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B1은 scFv이고 결합 도메인 B2는 IgG인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  41. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인 B1은 scFv이고 결합 도메인 B2는 (예컨대, scFv2-Fc format 내) scFv인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) B1은 항체 1200/1201의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 79 및/또는 서열번호 46, 65 및 72)을 포함하고 B2는 항체 1208/1135의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 57 및/또는 서열번호 46, 48 및 51)을 포함하거나;
    (b) B1은 항체 1200/1201의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 79 및/또는 서열번호 46, 65 및 72)을 포함하고 B2는 항체 1210/1211의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 58 및/또는 서열번호 46, 48 및 52)을 포함하거나;
    (c) B1은 항체 1618/1619의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 83 및/또는 서열번호 62, 69 및 76)을 포함하고 B2는 항체 1208/1135의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 57 및/또는 서열번호 46, 48 및 51)을 포함하거나; 또는
    (d) B1은 항체 1618/1619의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 83 및/또는 서열번호 62, 69 및 76)을 포함하고 B2는 항체 1210/1211의 경쇄의 3개의 CDR 및/또는 중쇄의 3개의 CDR(서열번호 54, 55 및 58 및/또는 서열번호 46, 48 및 52)을 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) B1은 항체 1200/1201의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 19 및/또는 서열번호 17)을 포함하고 B2는 항체 1208/1135의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 7 및/또는 서열번호 5)을 포함하거나;
    (b) B1은 항체 1200/1201의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 19 및/또는 서열번호 17)을 포함하고 B2는 항체 1210/1211의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 11 및/또는 서열번호 9)을 포함하거나;
    (c) B1은 항체 1618/1619의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 35 및/또는 서열번호 33)을 포함하고 B2는 항체 1208/1135의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 7 및/또는 서열번호 5)을 포함하거나; 또는
    (d) B1은 항체 1618/1619의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 35 및/또는 서열번호 33)을 포함하고 B2는 항체 1210/1211의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 11 및/또는 서열번호 9)을 포함하거나; 또는
    (e) B1 및/또는 B2는 이에 대해서 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 상기 경쇄 가변 영역 및/또는 상기 중쇄 가변 영역의 변이체를 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, B1은 항체 1200/1201의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 19 및/또는 서열번호 17)을 포함하고 B2는 항체 1210/1211의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 11 및/또는 서열번호 9)을 포함하거나, 또는 (예를 들어, 이에 대해서 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는) 상기 경쇄 가변 영역 및/또는 상기 중쇄 가변 영역의 변이체를 포함하거나, 또는 이의 반대인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, B1은 항체 1618/1619의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 35 및/또는 서열번호 33)을 포함하고 B2는 항체 1210/1211의 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역(서열번호 11 및/또는 서열번호 9), 또는 (예를 들어, 이에 대해서 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는) 상기 경쇄 가변 영역 및/또는 상기 중쇄 가변 영역의 변이체를 포함하거나, 또는 이의 반대인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 94 또는 96의 아미노산 서열을 갖고/갖거나 서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는,
    (a) 'LALA' 돌연변이를 포함하는 Fc 영역;
    (b) 다이설파이드 브리지를 형성 가능한 시스테인 잔기에 중쇄 및 경쇄 가변 영역 내에 돌연변이를 포함하는 scFv; 및/또는
    (c) 1개 이상의 N-글리코실화 부위를 작성하기 위하여 상기 중쇄 가변 영역에 돌연변이를 포함하는 scFv
    중 적어도 하나를 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 결합 도메인(B1)은 서열번호 17, 21, 27, 29, 33, 37, 41, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136 또는 138 중 임의의 것의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 19, 23, 25, 31, 35, 39, 43, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135 또는 139 중 임의의 것의 경쇄 가변 영역;
    (b) Fc 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역(예를 들어, 서열번호 94 또는 96);
    (c) 서열번호 1, 5, 9, 13, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110 또는 112 중 임의의 것의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 3, 7, 11, 15, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111 또는 113 중 임의의 것의 경쇄 가변 영역을 포함하는 결합 도메인 (B2); 및
    (d) 선택적으로, 경쇄 불변 영역(예를 들어 서열번호 95)
    을 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산 분자, 또는 이의 성분 폴리펩타이드 사슬
  50. 제49항에 있어서, 상기 분자는 cDNA 분자인, 핵산 분자.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 항체 중쇄 또는 가변 영역을 암호화하는, 핵산 분자.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 경쇄 또는 가변 영역을 암호화하는, 핵산 분자.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  54. 제53항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터인, 벡터.
  55. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자 또는 제53항 또는 제54항에 따른 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  56. 제55항에 있어서, 상기 숙주 세포는 세균 세포인, 재조합 숙주 세포.
  57. 제55항에 있어서, 상기 숙주 세포는 포유류 세포인, 재조합 숙주 세포.
  58. 제55항에 있어서, 상기 숙주 세포는 인간 세포인, 숙주 세포.
  59. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 폴리펩타이드를 생산하는 방법으로서, 상기 이중특이성 폴리펩타이드 또는 이의 성분 폴리펩타이드 사슬의 발현을 허용하는 조건 하에서 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 이중특이성 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  60. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 비경구 전달용으로 구성된, 약제학적 조성물.
  62. 제60항에 있어서, 정맥내 전달용으로 구성된, 약제학적 조성물.
  63. 의약에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 폴리펩타이드.
  64. 대상체에서 신생물 장애를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한, 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 폴리펩타이드.
  65. 제64항에 있어서, 상기 신생물 장애는 상기 대상체의 신체 내의 고형 종양의 형성과 연관되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  66. 제65항에 있어서, 상기 고형 종양은 전립선암, 유방암, 폐암, 결장직장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 자궁경부암, 식도암, 위암, 두/경부암, 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  67. 제64항에 있어서, 상기 고형 종양은 신장세포 암종, 결장직장암, 폐암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  68. 제64항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 1종 이상의 추가의 치료제와 함께 사용하기 위한 것인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  69. 제68항에 있어서, 상기 1종 이상의 추가의 치료제는 PD-1/PD-1L, CTLA-4, OX40, CD40, GITR, LAG3, TIM3, CD27 및 KIR로 이루어진 군으로부터 선택된 표적과 결합하는 면역치료제인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  70. 대상체의 신생물 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서의, 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 폴리펩타이드의 용도.
  71. 제70항에 있어서, 상기 신생물 장애는 상기 대상체의 신체 내의 고형 종양의 형성과 연관되는, 이중특이성 폴리펩타이드.
  72. 제71항에 있어서, 상기 고형 종양은 전립선암, 유방암, 폐암, 결장직장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 자궁경부암, 식도암, 위암, 두/경부암, 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  73. 제72항에 있어서, 상기 고형 종양은 신장세포 암종, 결장직장암, 폐암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
  74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 1종 이상의 추가의 치료제와 함께 사용하기 위한 것인, 용도.
  75. 제74항에 있어서, 상기 1종 이상의 추가의 치료제는 PD-1/PD-1L, CTLA-4, OX40, CD40, GITR, LAG3, TIM3, CD27 및 KIR로 이루어진 군으로부터 선택된 표적과 결합하는 면역치료제인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  76. 대상체의 신생물 장애의 치료 또는 진단 방법으로서,
    유효량의 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 따른 이중특이성 폴리펩타이드를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 신생물 장애의 치료 또는 진단 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 신생물 장애는 상기 대상체의 신체 내의 고형 종양의 형성과 연관되는, 신생물 장애의 치료 또는 진단 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 고형 종양은 전립선암, 유방암, 폐암, 결장직장암, 흑색종, 방광암, 뇌/CNS 암, 자궁경부암, 식도암, 위암, 두/경부암, 신장암, 간암, 림프종, 난소암, 췌장암 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 신생물 장애의 치료 또는 진단 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 고형 종양은 신장세포 암종, 결장직장암, 폐암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 신생물 장애의 치료 또는 진단 방법.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 신생물 장애의 치료 또는 진단 방법.
  81. 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 이중특이성 항체를 전신에 투여하는 단계를 포함하는, 신생물 장애의 치료 또는 진단 방법.
  82. 제76항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는, 신생물 장애의 치료 또는 진단 방법.
  83. 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 추가의 치료제는 PD-1/PD-1L, CTLA-4, OX40, CD40, GITR, LAG3, TIM3, CD27 및 KIR로 이루어진 군으로부터 선택된 표적과 결합하는 면역치료제인, 이중특이성 폴리펩타이드.
  84. 설명 및 도면을 참조하여 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 이중특이성 폴리펩타이드.
  85. 설명 및 도면을 참조하여 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리뉴클레오타이드.
  86. 설명 및 도면을 참조하여 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 약제학적 조성물.
  87. 설명 및 도면을 참조하여 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 이중특이성 폴리펩타이드의 용도.
  88. 설명 및 도면을 참조하여 실질적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 치료 방법.
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