KR20180126053A - 면역 체크포인트 조절제 및 공생 미생물군에 의한 발효 산물로의 병용 암 치료법 - Google Patents

면역 체크포인트 조절제 및 공생 미생물군에 의한 발효 산물로의 병용 암 치료법 Download PDF

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KR20180126053A
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Abstract

본 발명은 면역 체크포인트 조절제(예를 들어, 면역 체크포인트 억제제) 및 공생 미생물군에 의해 제조된 발효 산물을 사용한 암의 병용 치료법에 관한 것이다.

Description

면역 체크포인트 조절제 및 공생 미생물군에 의한 발효 산물로의 병용 암 치료법
관련된 출원
본 출원은 35 U.S.C. §119에 따라 2016년 3월 30일에 출원된 미국가출원번호 제62/315259호의 이익을 청구하며, 이러한 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
면역 체크포인트(immune checkpoint)는 면역계에서 신호전달 경로를 조절하여, 면역 반응에서 면역 세포 활성을 조절하는 분자이다. 다수의 암세포는 T 세포 활성화를 억제함으로써 면역 감시(immune surveillance)를 벗어날 수 있다. 2010년 이후에, 면역 체크포인트는 암 면역요법을 위한 신규한 타겟으로서 점점 더 고려되고 있다. 다수의 체크포인트 조절제, 예를 들어, Yervoy®(이필리무맙), Keytruda®(펨브롤리주맙), 및 Opdivo®(니볼루맙)는 임상 시험에서 암세포 성장을 억제하는 데 효과적인 것으로서 입증되었다.
발효는 락트산 발효의 경우에서와 같이, 효모 및 박테리아와 같은 미생물에 의해, 또는 산소-부족 근육 세포에 의해 당을 산, 가스 또는 알코올로 변환시키는 대사 과정이다. 식품 가공에서, 발효는 혐기성 조건 하에서, 효모, 박테리아, 또는 이들의 조합을 사용하여 탄수화물을 알코올 및 이산화탄소 또는 유기산으로 변환시킨다. 발효 과정에서 생성된 대사물질은 종종 건강에 이득을 부여한다.
본 개시내용은 암 성장의 억제에 대한 면역 체크포인트 조절제(예를 들어, 항-PD1 항체) 및 발효 대두 조성물의 조합물의 예상치 못한 상승 효과를 기초로 한 것이다.
이에 따라, 본 개시내용의 일 양태는 암을 치료하는 방법으로서, (i) 이를 필요로 하는 대상체에 유효량의 면역 체크포인트 조절제(예를 들어, 면역 체크포인트 억제제)를 투여하는 단계; 및 (ii) 대상체에 하나 이상의 적합한 미생물에 의한 콩과 식물(legume plant), 이의 부분, 또는 이의 추출물의 발효를 통해 생성된 다수의 대사물질을 포함하는 발효 조성물(예를 들어, 발효 대두 조성물)을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 암을 치료하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 발효 대두 조성물을 투여하는 것을 포함하며, 대상체는 면역 체크포인트 조절제(예를 들어, 면역 체크포인트 억제제)를 포함하는 항암 치료법을 받았거나 받고 있는 중인 방법을 제공한다.
본원에 기술된 임의의 방법에서, 발효 조성물은 경구 투여에 의해 또는 정맥내 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 예에서, 발효 조성물은 액체 형태로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 발효 조성물은 효모, 락토바실러스, 또는 이들의 조합에 의한 콩과 식물(예를 들어, 대두), 이의 부분(예를 들어, 종자), 또는 이의 추출물의 발효를 통해 생성된 다수의 대사물질을 포함할 수 있다. 발효 조성물은 면역 체크포인트 조절제의 투여 전, 후, 또는 동시에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 발효 조성물은 락트산, 아세트산, 및 3-아미노이소부티르산의 (예를 들어, 둘 이상의) 조합을 포함할 수 있다. 일 예에서, 발효 조성물은 5 내지 20 중량%의 락트산, 5 중량% 미만의 아세트산, 및 5 중량% 미만의 3-아미노이소부티르산을 포함한다.
일부 예에서, 발효 조성물은 (i) 대두 또는 이의 추출물의 발효를 가능하게 하는 조건 하, 콩과 식물(예를 들어, 대두), 이의 부분(예를 들어, 종자), 또는 이의 추출물을 포함하는 배지에서 효모, 락토바실러스, 또는 이들의 조합을 성장시키는 단계; 및 (ii) 단계 (i)로부터 수득된 발효 조성물을 수집하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조될 수 있다. 선택적으로, 제조 공정은 발효 조성물을 여과하고/거나, 발효 조성물을 살균시키고/거나, 발효 조성물을 농축시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기술된 임의의 방법에서 사용하기 위한 면역 체크포인트 조절제는 PD-1, CD28, CTLA-4, CD137, CD40, CD134, ICOS, KIR, LAG3, CD27, TIM-3, BTLA, GITR, TIGIT, CD96, CD226, KIR2DL, VISTA, HLLA2, TLIA, DNAM-1, CEACAM1, CD155, IDO(예를 들어, IDO1), TGF-베타, IL-10, IL-2, IL-15, CSF-1, IL-6, 및 아데노신 A2A 수용체(A2AR), 또는 이의 리간드일 수 있는, 면역 체크포인트 분자의 조절제(예를 들어, 억제제)일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 체크포인트 조절제는 면역 체크포인트 또는 이의 리간드에 대해 특이적인 항체, 예를 들어, PD1 또는 이의 리간드(PDL1 또는 PDL2)에 대해 특이적인 항체이다. 일부 예에서, 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다.
본원에 기술된 방법에 의해 치료되는 예시적인 암은 대장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 난소암, 신장암, 위암, 두경부암, 식도암, 방광암, 직장암, 골암, 자궁암, 전립선암, 및 혈액성 악성종양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
또한, 본 개시내용은 (i) 본원에 기술된 바와 같은 면역 체크포인트 조절제 중 하나 이상(예를 들어, 면역 체크포인트 억제제), 및 (ii) 본원에 기술된 바와 같은 발효 조성물(예를 들어, 발효 대두 조성물)을 포함하는 키트를 특징으로 한다.
또한, 본 개시내용의 범위 내에는 암, 예를 들어, 본원에 기술된 암을 치료하는 데 사용하기 위한 약제 조성물로서, (i) 본원에 기술된 바와 같은 면역 체크포인트 조절제(예를 들어, 면역 체크포인트 억제제), 및 (ii) 본원에 기술된 바와 같은 발효 조성물(예를 들어, 발효 대두 조성물)을 포함하는 약제 조성물; 및 암을 치료하는 데 사용하기 위한 약제 또는 키트를 제작하기 위한 면역 체크포인트 조절제 및 발효 조성물의 조합물의 용도가 있다. 본 발명은 또한, 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 약제 또는 키트를 제작하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 발효 조성물(예를 들어, 발효 대두 조성물)의 용도로서, 대상체가 면역 체크포인트 조절제(예를 들어, 면역 체크포인트 억제제)를 포함하는 항암 치료법을 받았거나 받는 중인 용도를 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 구현예의 세부사항은 하기 설명에 기술되어 있다. 본 발명의 다른 특성 또는 장점은 하기 도면 및 여러 구현예의 상세한 설명으로부터, 그리고, 또한 첨부된 청구범위로부터 명백하게 될 것이다.
도 1a는 대장암 마우스 모델에서 경구 투여를 통한 항-PD1 항체 및 발효 조성물(조성물 X)의 조합의 효과를 연구하기 위한 실험 설계의 개략도이다. 마우스는 대장암 CT26 세포로 동시에 이식되었고, 발효 조성물로 치료되었다.
도 1b는 대장암 마우스 모델에서 경구 투여를 통한 항-PD1 항체 및 발효 조성물(조성물 X)의 조합의 효과를 연구하기 위한 실험 설계의 개략도이다. 마우스는 대장암 CT26 세포의 이식 전에 발효 조성물로 치료되었다.
도 2a는 비히클 대조군, 항-PD1 항체, 또는 다양한 용량의 항-PD1 항체와 발효 조성물의 조합으로 치료된 마우스에서 대장암 CT26 세포의 피하 주사에 의해 형성된 종양 크기를 나타낸 사진이다. 마우스는 대장암 CT26 세포로 이식되고, 발효 조성물로 치료되었다. 체중의 유의미한 차이가 그룹 간에 관찰되지 않았다.
도 2b는 비히클 대조군, 항-PD1 항체, 또는 다양한 용량의 항-PD1 항체와 발효 조성물의 조합으로 치료된 마우스에서 대장암 CT26 세포의 피하 주사에 의해 형성된 종양 크기를 나타낸 사진이다. 마우스는 대장암 CT26 세포의 이식 이전에 발효 조성물로 치료되었다. 체중의 유의미한 차이가 그룹 간에 관찰되지 않았다.
도 3a는 대장암 마우스 모델에서 관찰된 종양 성장에 대한 항-PD1/조성물 X 조합의 억제 효과를 도시한 차트(chart)를 포함한다. 마우스는 대장암 CT26 세포로 이식되고, 발효 조성물로 치료되었다.
도 3b는 대장암 마우스 모델에서 관찰된 종양 성장에 대한 항-PD1/조성물 X 조합의 억제 효과를 도시한 차트를 포함한다. 마우스는 대장암 CT26 세포의 이식 전에 발효 조성물로 치료되었다.
도 4는 대장암 마우스 모델에서 관찰된 비장 T 세포 프로파일링(splenic T 세포 프로파일링)에 대한 조성물 X-항-PD1 조합의 효과를 도시한 차트를 포함한다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹과 대조군(비히클 처리됨)의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 5는 폐암 마우스 모델에서 조성물 X-항-PD1 조합의 효과를 연구하기 위한 예시적인 실험 설계의 개략도이다.
도 6은 비히클 대조군, 항-PD1 항체, 또는 다양한 용량의 항-PD1 항체와 발효 조성물의 조합으로 치료된 마우스에서 폐암종 LL2 세포의 피하 주사에 의해 형성된 종양 크기를 나타낸 사진이다. 체중의 유의미한 차이가 그룹 간에 관찰되지 않았다.
도 7은 폐암 마우스 모델에서 관찰된 종양 성장에 대한 항-PD1/조성물 X 조합의 억제 효과를 도시한 차트를 포함한다.
도 8은 폐암 마우스 모델에서 관찰된 종양-침윤 T 세포 프로파일링에 대한 조성물 X-항-PD1 조합의 효과를 도시한 차트를 포함한다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 대조군(비히클 처리됨)의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 9는 폐암 마우스 모델에서 관찰된 비장 T 세포 프로파일링에 대한 조성물 X-항-PD1 조합의 효과를 도시한 차트를 포함한다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 대조군(비히클 처리됨)의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 10은 폐암 세포가 이식되고 항-PD1 항체, 조성물 X, 또는 이들의 조합으로 치료된 마우스로부터 얻어진 종양 조직에서 PD1/PD-L1 발현 프로파일링을 도시한 차트를 포함한다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 대조군(비히클 처리됨)의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 11은 종양-침윤 골수-유래 억제 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC) 프로파일링을 도시한 차트이다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 대조군(비히클 처리됨)의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 12는 대장암 마우스 모델에서 경구 투여 또는 정맥내 주사를 통한 항-PD1 항체 및 발효 조성물(조성물 X)의 조합의 효과를 연구하기 위한 실험 설계의 개략도이다.
도 13은 경구 투여를 통한 비히클 대조군, 항-PD1 항체, 항-PD1 항체와 발효 조성물의 조합, 또는 정맥내 주사를 통한 항-PD1 항체와 발효 조성물의 조합으로 치료된 마우스에서 대장암 CT26 세포의 피하 주사에 의해 형성된 종양 크기를 도시한 사진이다.
도 14는 경구 투여 또는 정맥내 주사 중 어느 하나를 통한 대장암 마우스 모델에서 관찰된 종양 성장에 대한 항-PD1/조성물 X 조합의 억제 효과를 도시한 차트를 포함한다.
도 15는 대장암 마우스 모델에서 관찰된 종양 부위에서 T 세포의 프로파일링에 대한 조성물 X-항-PD1 조합의 효과를 도시한 차트를 포함한다. 조성물 X는 경구적으로 또는 정맥내로 투여되었다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 대조군(비히클 처리됨)의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 16은 대장암 마우스 모델에서 관찰된 비장 T 세포 프로파일링에 대한 조성물 X-항-PD1 조합의 효과를 도시한 차트를 포함한다. 조성물 X는 경구적으로 또는 정맥내로 투여되었다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 대조군(비히클 처리됨)의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 17은 폐암 세포가 이식되고 항-PD1 항체, 조성물 X, 또는 이들의 조합으로 치료된 마우스로부터 얻어진 종양 조직에서 PD1/PD-L1 발현 프로파일링을 도시한 차트를 포함한다. 조성물 X는 경구로 또는 정맥내로 투여되었다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 대조군(비히클 처리됨)의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 18은 NK 세포의 수준(CD3e-/CD49b+로서 특징됨)에 대한 항-PD1 항체, 조성물 X, 또는 이들의 조합의 효과를 도시한 차트이다. 조성물 X는 경구로 또는 정맥내로 투여되었다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 대조군(비히클 처리됨)의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 19는 종양-침윤 골수-유래 억제 세포(MDSC) 프로파일링을 도시한 차트이다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. 조성물 X는 경구로 또는 정맥내로 투여되었다. P-값은 각 개입 그룹 및 대조군(비히클 처리됨)의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 20은 비히클 대조군, 항-PD1 항체, 조성물 X, 또는 이들의 조합으로 치료된 마우스에서의 종양 부위에서 시토카인 IL-2, IFN-γ, 및 IL-15의 수준을 도시한 차트를 포함한다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. 조성물 X는 경구로 또는 정맥내로 투여되었다. P-값은 각 개인 그룹 및 비히클 대조군의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 21은 비히클 대조군, 항-PD1 항체, 조성물 X, 또는 이들의 조합으로 치료된 마우스에서의 종양 부위에서 시토카인 IL-6, TNF-α, 및 IL-5의 수준을 도시한 차트를 포함한다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. 조성물 X는 경구로 또는 정맥내로 투여되었다. P-값은 각 개인 그룹 및 비히클 대조군의 비교에 의해 얻어졌다. #p < 0.05; ##p < 0.01; ###p < 0.001. P-값은 각 개입 그룹 및 항-PD1 항체-치료 그룹의 비교에 의해 얻어졌다.
도 22는 비히클 대조군, 항-PD1 항체, 조성물 X, 또는 이들의 조합으로 치료된 마우스에서 시토카인 IFN-γ, IL-15, IL-6, IL-4 및 IL-1의 혈청 수준을 도시한 차트를 포함한다. *p < 0.05; **p < 0.01; 및 ***p < 0.001. 조성물 X는 경구로 또는 정맥내로 투여되었다. P-값은 각 개인 그룹 및 비히클 대조군의 비교에 의해 얻어졌다.
도 23은 비히클, 항-PD1 항체, 발효 대두 조성물(조성물 X), 또는 항-PD1 항체와 조성물 X의 조합으로 치료된 마우스의 창자에서 특정 박테리아 종의 존재비(abundance)와 종양 크기 간의 상관 관계(correlation)를 도시한 다이아그램이다.
면역 체크포인트 조절제는 여러 연구에서 암세포 성장을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 본 개시내용에서 제공되는 연구는 놀랍게도, 발효 대두 조성물, 예를 들어, 예시적인 대두 발효 조성물, 본원에 기술된 조성물 X가 면역 체크포인트 조절제(예를 들어, 항-PD1 항체와 같은 면역 체크포인트 억제제)의 항암 효과를 성공적으로 향상시켰다는 것을 나타낸다. 일부 경우에, 면역 체크포인트 조절제 및 발효 대두 조성물의 동시-사용은 동물 암 모델에서 암 성장을 억제하는 데 상승 효과를 나타내었다. 이론에 의해 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이러한 연구의 결과는, 발효 조성물이 면역 체크포인트 억제제가 암 발달과 관련된 것으로서 당해 분야에서 보고된 창자 미생물군을 조절하는 것을 촉진시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 이러한 예상치 못한 결과는, 발효 대두 조성물이 암을 더욱 효과적으로 치료하기 위해 억제제와 같은 하나 이상의 면역 체크포인트 조절제와 동시-사용될 수 있음을 나타낸다.
이에 따라, 본원에는 면역 체크포인트 조절제 및 발효 대두 조성물의 동시-사용을 포함하는 병용 암 치료법, 및 이의 사용을 위한 키트가 제공된다.
I. 병용 암 치료법(Combined Cancer Therapy)을 위한 작용제
본원에 기술된 병용 암 치료법은 활성제로서 발효 대두 조성물과 같은 발효 조성물 및 면역 체크포인트 조절제의 사용을 포함한다.
(a) 면역 체크포인트 조절제
면역 체크포인트 단백질은 이차적인 조직 손상을 최소화하기 위해 자가-내성을 유지시키고 말초 조직에서 생리학적 면역 반응의 지속시간 및 진폭(amplitude)을 조절하도록 면역계를 조절하는(예를 들어, 이의 신호를 높이거나 낮추는) 다양한 조절 경로에 관련된 분자를 지칭한다. 통상적으로, 면역 체크포인트 단백질은 암세포(예를 들어, 종양)에 의해 이상조절된다. 임의의 특정 이론에 의해 제한하고자 하는 것은 아니지만, 면역 체크포인트 단백질은 예를 들어, 문헌[Pardoll et al., Nature Reviews Cancer, 12: 252-264, 2012]에 의해 기술된 바와 같은, 항암 치료법으로서 조절제(활성제 또는 억제제)를 타겟으로 할 수 있다.
면역 세포 신호전달 경로는 세포 상에서 하기 예시적인 수용체/리간드 쌍 중 하나 이상에 의해 매개될 수 있다: PD1/PDL1, PD1/PDL2, CD28/B7-1(CD80), CD28/B7-2(CD86), CTLA4/B7-1(CD80), CILA4/B7-2(CD86), 4-1BB(CD137)/4-1BBL(CD137L), ICOS/B7RP1, CD40/CD40L, 헤르페스바이러스 도입 매개체(Herpesvirus entry mediator: HVEM)/B- 및 T-림프구 약화인자(B- 및 T-lymphocyte attenuator: BTLA); OX40/OX40L, CD27/CD70, GITR/GITRL, KIR/MHC, 림프구-활성화 유전자 3(LAG3 또는 CD223)/MHC, A형 간염 바이러스 세포 수용체 2(HAVCR2; T-세포 면역글로불린 및 점액-도메인 함유-3(TIM3)으로도 공지됨)/TIM3 리간드, Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT)/CD96, 및 TIGIT/CD226. 면역 세포 신호전달 경로는 또한, 하기 예시적인 시토카인/케모카인 및 이의 동족 세포-표면 수용체: 인터류킨 2(IL-2)/CD122, 아데노신/아데노신 A2A 수용체(A2AR), 인터류킨 6(IL-6)/IL6R(CD126), 인터류킨 10(IL-10)/IL-10R, 인터류킨 15(IL-15)/IL-15R, 형질전환 성장인자 β(TGFβ)/TGFβR, 및 대식세포 콜로니-자극 인자 1(CSF-1)/CSF-1R 중 하나 이상에 의해 매개될 수 있다. 다른 면역 체크포인트는 KIR2DL, VISTA, HLLA2, TLIA, DNAM-1, CEACAM1, CD155, 및 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO), 예를 들어, IDO1을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 상술된 임의의 면역 체크포인트 분자는 본원에 기술된 바와 같은 항암 치료법에 대한 타겟일 수 있다.
본원에서 사용되는 "면역 체크포인트 조절제"는 대조 비히클에 비해 세포에서 면역 체크포인트 단백질(예를 들어, 본원에 기술된 것들 중 어느 하나)의 활성을 변경시키는 작용제를 지칭한다. 용어 "조절제"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 본원에 기술된 분자에 의해 매개된 신호전달 경로를 포함하는, 하나 이상의 면역 체크포인트 분자에 의해 조절된 신호전달 경로를 부분적으로 또는 완전히 변경시키는 임의의 분자를 포함한다.
일부 경우에, 면역 체크포인트 조절제는 그러한 체크포인트 분자에 의해 매개된 활성을 감소시키고/거나, 늦추고/거나, 중단시키고/거나, 막는 체크포인트 분자의 억제제이다. 용어 "억제제"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 본원에 기술된 분자에 의해 매개된 조절 경로(modulatory pathway)를 포함하는, 하나 이상의 면역 체크포인트 분자에 의해 조절된 신호 전달 경로를 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제, 또는 상쇄시키는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 억제 분자는 상세하게, 길항제 항체 또는 항체 단편, 천연 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 유기 소분자, 재조합 단백질 또는 펩티드, 등을 포함한다.
다른 경우에, 면역 체크포인트 조절제는 그러한 체크포인트 분자에 의해 매개된 활성을 향상 및 개선시키는 체크포인트 분자의 활성제이다. 용어 "활성제"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 본원에 기술된 분자에 의해 매개된 신호전달 경로를 포함하는, 하나 이상의 면역 체크포인트 분자에 의해 조절된 신호전달 경로를 향상시키는 임의의 분자를 포함한다. 적합한 활성제는 효능성 항체(agonistic antibody) 또는 항체 단편, 유기 소분자, 재조합 단백질, 또는 펩티드, 등을 포함한다. 일부 경우에, 활성제는 체크포인트 단백질의 효능성 항체, 예를 들어, MEDI0562(인간화된 OX40 효능성 항체), MEDI6469(뮤린 OX4 효능제); 및 MEDI6383(OX40 효능제)일 수 있다.
이러한 조절제를 동정하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 후보 조절제는 적합한 면역 체크포인트 타겟과 접촉할 수 있으며, 그러한 면역 체크포인트에 의해 매개된 신호전달의 세기는 보편적인 검정에 의해 측정될 수 있다. 블랭크 대조군(blank control)에 대한 후보 조절제의 존재 하에서의 신호전달의 검출 가능한 변화는 후보 조절제가 면역 체크포인트 분자의 조절 활성을 지님을 지시한다.
본원에 기술된 바와 같은 면역 체크포인트 조절제는 예를 들어, 체크포인트 단백질-엔코딩 핵산의 전사 또는 번역을 감소시킴으로써, 또는 체크포인트 단백질 활성을 억제 또는 차단함으로써, 또는 둘 모두에 의해, 면역 체크포인트 단백질에 의해 매개된 면역 세포에서 신호전달을 방해하는 억제제(inhibitory agent)일 수 있다. 면역 체크포인트 억제제의 예는 안티센스 폴리뉴클레오타이드, 간섭 RNA, 촉매 RNA, RNA-DNA 키메라, 체크포인트 단백질-특이적 아프타머, 항-체크포인트 단백질 항체(예를 들어, 전장 항체 또는 이의 항원-결합 단편), 체크포인트-결합 소분자, 체크포인트-결합 펩티드, 및 체크포인트 조절제와 체크포인트 단백질 간의 상호작용이 체크포인트 단백질 활성 또는 발현의 감소 또는 중단을 야기시키도록 체크포인트 단백질을 특이적으로 결합시키는 다른 폴리펩티드(하나 이상의 추가적인 도메인에 선택적으로 융합될 수 있는, 이의 동족 리간드의 체크포인트-결합 단편을 포함하지만, 이로 제한되지 않음)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 경우에, 체크포인트 단백질 조절제가 다른 체크포인트 단백질 활성에 영향을 미치지 않으면서 하나의 체크포인트 단백질 활성을 길항시키거나 상쇄시킬 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 본원의 특정 방법에서 사용하기 위한 요망되는 체크포인트 조절제는 임의의 경우에, 체크포인트 단백질과 다른 동족 리간드 간의 상호작용에 영향을 미치지 않거나 최소한으로 영향을 미치면서, 체크포인트 단백질과 하나의 동족 리간드 간의 결합 상호작용을 방해하는 체크포인트 조절제일 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 면역 체크포인트 조절제는 면역 세포에서 체크포인트 단백질에 의해 매개된 신호전달의 세기를 적어도 20% 이상, 예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 이상 감소시킬 수 있다. 체크포인트 단백질에 대한 이러한 조절제의 조절 활성은 보편적인 방법에 의해 결정될 수 있다.
항-체크포인트 항체
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 병용 항암 치료법에서 사용하기 위한 면역 체크포인트 조절제는 면역 체크포인트 분자에 특이적으로 결합하고 예를 들어, 동족 리간드에 대한 이의 결합을 방해함으로써 이의 생활성을 억제하는 항체이다. 본원에서 사용되는 용어 "항체"는 폴리클로날, 모노클로날, 인간화된, 키메라, Fab 단편, Fv 단편, F(ab') 단편 및 F(ab')2 단편뿐만 아니라 단쇄 항체(scFv), 융합 단백질 및 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 다른 합성 단백질을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
면역 체크포인트 단백질의 활성을 저해하는 임의의 항체는 당해 분야에 공지된 보편적인 방법 또는 본원에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 타겟 항원에 대해 특이적인 항체(면역 체크포인트 단백질, 예를 들어, PD1, PDL1, PDL2, CTLA4 및 본원에 기술된 임의의 다른 것)는 보편적인 하이브리도마(hybridoma) 기술에 의해 제조될 수 있다. KLH와 같은 운반 단백질에 선택적으로 커플링된, 전장 타겟 항원 또는 이의 단편은 그러한 항원에 결합하는 항체를 생성시키기 위한 숙주 동물을 면역화하기 위해 사용될 수 있다. 숙주 동물의 면역화의 경로 및 스케쥴은 일반적으로, 본원에서 추가로 기술된 바와 같이, 항체 자극 및 생산을 위한 확립되고 보편적인 기술과 관련이 있다. 마우스, 인간화된, 및 인간 항체의 생산을 위한 일반적인 기술은 당해 분야에 공지되어 있고, 본원에 기술되어 있다. 인간을 포함하는 임의의 포유류 대상체 또는 이로부터의 항체 생산 세포가 인간 하이브리도마 세포주를 포함하는, 포유류의 생산을 위한 기초로서 작용하도록 조작될 수 있다는 것이 고려된다. 통상적으로, 숙주 동물은 소정 양의 본원에 기술된 것을 포함하는 면역원으로 복강내로, 근육내로, 경구로, 피하로, 발바닥내로 및/또는 피부내로 접종된다.
하이브리도마는 문헌[Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256: 495-497]에 기술거나 문헌[Buck, D.W., et al., In Vitro, 18: 377-381(1982)]에 의해 변형된 일반 체세포 하이브리드화 기술을 이용하여 림프구 및 불멸성 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 솔크 연구소 세포 디스트리뷰션 센터(Salk Institute, Cell Distribution Center)(San Diego, Calif., USA)로부터의 세포주를 포함하지만 이로 제한되지 않는 입수 가능한 골수종 세포주는 하이브리드화에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합원(fusogen)을 사용하여 또는 당업자에게 널리 공지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포 및 림프계 세포를 융합시키는 것을 포함한다. 융합 후에, 세포는 융합 배지로부터 분리되고, 하이브리드화되지 않은 부모 세포를 제거하기 위해 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘(hypoxanthine-aminopterin-thymidine: HAT)과 같은, 선택적 성장 배지에서 성장된다. 혈청이 보충되거나 보충되지 않은, 본원에 기술된 임의의 배지는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하기 위해 사용될 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 다른 대안으로서, EBV 불멸성 B 세포는 본원에 기술된 바와 같이 면역 체크포인트 단백질에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 하이브리도마는 요망되는 경우에, 확장되고 서브클로닝되며, 상청액은 보편적인 면역검정 절차(예를 들어, 방사면역검정, 효소 면역검정, 또는 형광 면역검정)에 의해 항-면역원 활성에 대해 검정된다.
항체의 소스로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 면역 체크포인트 분자에 의해 매개된 신호 경로(예를 들어, 억제 신호 경로)를 방해할 수 있는 모노클로날 항체를 생성시키는 부모 하이브리도마의 모든 유도체, 자손 세포를 포함한다. 이러한 항체를 생성시키는 하이브리도마는 공지된 절차를 이용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 성장될 수 있다. 모노클로날 항체는 요망되는 경우에, 암모늄 설페이트 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피, 및 한외여과와 같은 보편적인 면역글로빈 정제 절차에 의해, 배양 배지 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. 요망되지 않는 활성은, 존재하는 경우에, 예를 들어, 고체상에 부착된 면역원으로 제조된 흡착제 위로 제조물을 진행시키거나 면역원으로부터 요망되는 항체를 용리 또는 배출시킴으로써 제거될 수 있다. 면역화되는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모사이아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 이작용성 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 컨쥬게이션), N-하이드록시숙신이미드(라이신 잔기를 통함), 글루타르알데하이드, 숙신산 무수물, SOCl, 또는 R1N＝C＝NR(여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 이용한 대두 트립신 억제제에 컨쥬게이션된 타겟 아미노산 서열을 함유한 타겟 항원 또는 단편으로 숙주 동물의 면역화는 항체의 집단(예를 들어, 모노클로날 항체)을 산출할 수 있다.
요망되는 경우에, 고려되는(예를 들어, 하이브리도마에 의해 생성된) 항체(모노클로날 또는 폴리클로날)는 서열화될 수 있으며, 이후에, 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 또는 증식을 위해 벡터내에 클로닝될 수 있다. 고려되는 항체를 엔코딩하는 서열은 숙주 세포의 벡터에 유지될 수 있으며, 이후에, 숙주 세포는 앞으로의 사용을 위하여 확장되고 냉동될 수 있다. 대안으로서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체를 "인간화"하거나 항체의 친화력(친화력 돌연변이), 또는 다른 특징을 개선시키기 위해 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은 항체가 인간에서의 임상 시험 및 치료에서 사용되는 경우에 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변 영역과 더욱 유사하도록 조작될 수 있다. 타겟 항원에 대한 더 큰 친화력 및 체크포인트 신호전달 경로를 억제하는 데 더 큰 효능을 얻기 위하여 항체 서열을 유전적으로 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 변경이 항체에 대해 이루어지고 타겟 항원에 대한 이의 결합 특이성을 여전히 유지할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.
일부 예에서, 본원에 기술된 항-체크포인트 항체는 완전한 인간 항체일 수 있다. 완전한 인간 항체는 특정 인간 면역글로불린 단백질을 발현시키도록 조작된 상업적으로 입수 가능한 동물(예를 들어, 마우스)을 사용함으로써 얻어질 수 있다. 더욱 요망되거나(예를 들어, 완전한 인간 항체) 또는 더욱 견고한 면역 반응을 형성하도록 설계된 형질전환 동물은 또한, 인간화된 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예에는 Amgen, Inc.(Fremont, Calif.)로부터의 XenoMouse™ 및 Medarex, Inc.(Princeton, N.J.)로부터의 HuMAb-Mouse™ 및 TC Mouse™가 있다. 다른 대안으로, 항체는 파지 디스플레이 또는 효모 기술에 의해 재조합으로 만들어질 수 있다(예를 들어, 미국특허번호 제5,565,332호; 제5,580,717호; 제5,733,743호; 및 제6,265,150호; 및 문헌[Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455] 참조). 대안적으로, 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-553)은 면역화되지 않은 공여체로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터, 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.
무손상 항체(전장 항체)의 항원-결합 단편은 일반적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있으며, Fab 단편은 F(ab')2 단편의 디설파이드 브릿지의 환원에 의해 생성될 수 있다.
유전학적으로 조작된 항체, 예를 들어, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단쇄 항체, 및 이중-특이적 항체는 예를 들어, 보편적인 재조합 기술을 통해 생성될 수 있다. 일 예에서, 타겟 항원에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 엔코딩하는 DNA는 보편적인 절차를 이용하여(예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 단리되고 서열화될 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 소스로서 역할을 한다. 단리된 직후에, DNA는 하나 이상의 발현 벡터내에 배치될 수 있으며, 이후에, 이는 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 얻기 위해, 달리 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 E. coli 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 트랜스펙션될 수 있다(예를 들어, PCT 공개번호 WO 87/04462호 참조). DNA는 예를 들어, 동종 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 위한 코딩 서열을 치환함으로써(Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81: 6851), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열 모두 또는 일부를 공유 결합시킴으로써 변경될 수 있다. 그러한 방식으로, 타겟 항원의 결합 특이성을 갖는, 유전학적으로 조작된 항체, 예를 들어, "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조될 수 있다.
다른 예에서, 항-체크포인트 항체는 인간화된 항체이다. 인간화된 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유한 특정 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 이의 항원-결합 단편인 비-인간(예를 들어, 뮤린) 항체로부터 유래된 항체를 지칭한다. 대부분의 경우에, 인간화된 항체는 수용체의 상보적 결정 영역(complementary determining region: CDR)으로부터의 잔기가 요망되는 특이성, 친화력, 및 용량을 갖는 마우스, 랫트, 또는 토끼와 같은 비-인간 종(공여체 항체)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된, 인간 면역글로불린(수용체 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 종에 의해 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 수입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않고 항체 성능을 더욱 개선시키고 최적화하기 위해 포함되는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도 1개, 및 통상적으로 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함할 것이며, 여기서, CDR 영역 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로불린의 것에 해당하며, FR 영역 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한, 면역글로불린 불변 영역 또는 도메인(Fc)의 적어도 일부, 통상적으로, 인간 면역글로불린의 것을 최적으로 포함할 것이다. 항체는 WO 99/58572호에 기술된 바와 같이 변경된 Fc 영역을 가질 수 있다. 인간화된 항체의 다른 형태는 고유 항체로부터 하나 이상의 CDR"로부터 유래된" 하나 이상의 CDR로도 지칭되는, 고유 항체에 대해 변경된 하나 이상의 CDR(1, 2, 3, 4, 5, 6개)을 갖는다. 인간화된 항체는 또한, 친화력 돌연변이를 포함할 수 있다. 인간화된 항체를 작제하는 방법은 또한 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)] 참조).
일부 구현예에서, 체크포인트 조절 항체, 예를 들어, 체크포인트 억제 항체는 키메라 항체일 수 있다. "키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; 및 Takeda et al. (1984) Nature 314: 452] 참조).
다른 구현예에서, 체크포인트 조절 항체, 예를 들어, 체크포인트 억제 항체는 단쇄 항체 단편(scFv)일 수 있다. 단쇄 항체는 중쇄 가변 영역을 위해 코딩한 뉴클레오타이드 서열 및 경쇄 가변 영역을 위해 코딩한 뉴클레오타이드 서열을 연결시킴으로서 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다. 바람직하게, 유연한 링커(flexible linker)는 2개의 가변 영역들 사이에 도입된다. 대안적으로, 단쇄 항체의 생산을 위해 기술된 기술(미국특허번호 제4,946,778호 및 제4,704,692호)은 파지 또는 효모 scFv 라이브러리 및 일반적인 절차에 따라 이러한 라이브러리로부터 동정될 수 있는, 면역 체크포인트 단백질에 대해 특이적인 scFv 클론을 생성하기 위해 조정될 수 있다. 포지티브 클론(positive clone)은 면역 체크포인트 단백질의 활성을 억제하는 것을 식별하기 위해 추가로 스크리닝(screening)될 수 있다.
당해 분야에 공지되고 본원에 기술된 방법에 따라 얻어진 항체는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 특징화될 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 항원이 결합되는 에피토프(epitope), 또는 "에피토프 맵핑(epitope mapping)"을 동정하는 것이다. 예를 들어, 문헌[Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]에 기술된 바와 같이, 항체-항원 착물의 결정 구조를 푸는 것, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드-기반 검정을 포함하는, 단백질 상의 에피토프의 위치를 맵핑하고 특징분석하기 위한 당해 분야에 공지된 여러 방법들이 존재한다. 추가적인 예에서, 에피토프 맵핑은 항체가 결합하는 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프, 예를 들어, 아미노산의 단일 스트레치(single stretch)에 함유된 선형 에피토프, 또는 단일 스트레치(1차 구조 선형 서열)에 함유될 필요는 없는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 구조적 에피토프(conformational epitope)일 수 있다. 다양한 길이(예를 들어, 적어도 4 내지 6개의 아미노산 길이)의 펩티드는 단리되거나 (예를 들어, 재조합으로) 합성되고, 항체와의 결합 검정을 위해 사용될 수 있다. 다른 예에서, 항체가 결합하는 에피토프는 타겟 항원 서열로부터 유래된 중첩 펩티드(overlapping peptide)를 사용하고 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적인 스크리닝(systematic screening)에서 결정될 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, 타겟 항원을 엔코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 무작위적으로, 또는 특이적 유전자 작제에 의해 단편화되며, 시험되는 항체와 항원의 발현된 단편의 반응성이 결정된다. 유전자 단편은 예를 들어, PCR에 의해 생성되고, 이후에, 방사성 아미노산의 존재 하에서, 시험관 내에서 단백질 내로 전사되고 번역될 수 있다. 이후에, 방사능으로 표지된 항원 단편에 항체의 결합은 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 특정 에피토프는 또한, 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 랜덤 펩티드 서열의 큰 라이브러리(파지 라이브러리)를 사용함으로써 동정될 수 있다. 대안적으로, 펩티드 단편을 중첩하는 규정된 라이브러리는 단순 결합 검정에서 시험 항체에 결합하는 것에 대해 시험될 수 있다. 추가적인 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 에피토프 결합을 위해 요구되고/거나, 충분하고/거나, 필수적인 잔기를 동정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 도메인 스와핑 실험은 면역 체크포인트 단백질의 다양한 단편은 밀접하게 관련이 있지만 항원적으로 별개의 단백질로부터의 서열로 대체(스와핑)된 타겟 항원의 돌연변이체를 이용하여 수행될 수 있다. 돌연변이 체크포인트 폴리펩티드에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정 항원 단편의 중요성이 평가될 수 있다.
대안적으로, 경쟁 검정은 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 지의 여부를 결정하기 위해 동일한 항원에 결합하는 것으로 알려진 다른 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 경쟁 검정은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 기술된 바와 같은 항-체크포인트 항체의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 핵산은 하나의 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있으며, 각 뉴클레오타이드 서열은 적합한 프로모터(promoter)에 작동 가능하게 연결된다. 일 예에서, 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열 각각은 별도의 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 단일 프로모터와 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 이에 따라, 중쇄 및 경쇄 둘 모두는 동일한 프로모터로부터 발현된다. 일 예에서, 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열 각각은 별도의 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 단일 프로모터와 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 이에 따라, 중쇄 및 경쇄 둘 모두가 동일한 프로모터로부터 발현된다. 필요한 경우에, 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site: IRES)는 중쇄 및 경쇄 엔코딩 서열들 사이에 삽입될 수 있다.
일부 예에서, 항체의 2개의 사슬을 엔코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 2개의 벡터 내에 클로닝되며, 이는 동일하거나 상이한 세포 내에 도입될 수 있다. 2개의 사슬이 상이한 세포에서 발현될 때, 이러한 것들 각각은 이러한 것을 발현시키는 숙주 세포로부터 단리될 수 있으며, 단리된 중쇄 및 경쇄는 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 혼합되고 인큐베이션될 수 있다.
일반적으로, 항체의 하나 또는 모든 사슬을 엔코딩하는 핵산 서열은 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 적합한 프로모터와 작동 가능한 결합으로 적합한 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 서열 및 벡터는 적합 조건 하에서, 서로 쌍을 이룰 수 있고 리가아제와 함께 결합될 수 있는 각 분자 상에 상보적인 단부를 생성시키기 위해 제한 효소와 접촉될 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커는 유전자의 말단에 결찰될 수 있다. 이러한 합성 링커는 벡터에서 특정 제한 부위에 상응하는 핵산 서열을 함유한다. 발현 벡터/프로모터의 선택은 항체를 생성시키는 데 사용하기 위한 숙주 세포의 타입에 따를 것이다.
다양한 프로모터는 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus: CMV) 중간 초기 프로모터, 바이러스 LTR, 예를 들어, Rous 육종 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 원숭이 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, E. coli lac UV5 프로모터, 및 단순 헤르페스 tx 바이러스 프로모터를 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 본원에 기술된 항체의 발현을 위해 사용될 수 있다.
조정 가능한 프로모터(regulatable promoter)가 또한 사용될 수 있다. 이러한 조정 가능한 프로모터는 lac 조작자-함유 포유류 세포 프로모터(lac operator-bearing mammalian cell promoter)로부터 전사를 조정하기 위해 전사 조절제로서 E. coli로부터의 lac 리프레서(repressor)를 사용하는 것[Brown, M. et al., Cell, 49: 603-612(1987)], 테트라사이클린 리프레서(tetR)를 사용하는 것[Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551(1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9: 1939-1950 (1998); Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6522-6526 (1995)]을 포함한다. 다른 시스템은 FK506 다이머, 아스트라디올을 사용한 VP16 또는 p65, RU486, 디페놀 무리스레론, 또는 라파마이신을 포함한다. 유도 가능한 시스템은 Invitrogen, Clontech 및 Ariad로부터 입수 가능하다.
오페론(operon)을 갖는 리프레서를 포함하는 조정 가능한 프로모터가 사용될 수 있다. 일 구현예에서, E. coli로부터의 lac 리프레서는 lac 조작자-함유 포유류 세포 프로모터로부터 전사를 조절하기 위한 전사 조절제([M. Brown et al., Cell, 49: 603-612(1987)]; Gossen and Bujard (1992); [M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551(1992)]), tetR-포유류 세포 전사 활성제 융합 단백질, tTa(tetR-VP 16)을 생성시키기 위해 전사 활성제(VP 16)를 갖는, 포유류 세포에서 유전자 발현을 제어하도록 tetR-tet 조작자 시스템을 생성시키가 위해 인간 시토메갈로바이러스(hCMV) 주요 중간-초기 프로모터로부터 유래된 tetO-함유 최소 프로모터를 갖는, 결합된 테트라사이클린 리프레서(tetR)로서 기능할 수 있다. 일 구현예에서, 테트라사이클린 유도성 스위치가 사용된다. tetR-포유류 세포 전사 인자 융합 유도체보다는 오히려 테트라사이클린 리프레서(tetR) 단독은 테트라사이클린 조작자가 CMVIE 프로모터의 TATA 구성요소에 대해 다운스트림에 적절히 정위되어 있을 때, 포유류 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위한 강력한 트랜스-조절제로서 기능할 수 있다(Yao et al., Human Gene Therapy). 이러한 테트라사이클린 유도성 스위치의 하나의 특정 장점은 이의 조정 가능한 효과를 달성하기 위해 테트라사이클린 리프레서-포유류 세포 트랜스활성제 또는 리프레서 융합 단백질의 사용을 필요로 하지 않는다는 것이며, 이는 일부 경우에, 세포에 대해 독성을 나타낼 수 있다(Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547-5551(1992); Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 6522-6526 (1995)).
추가적으로, 벡터는 예를 들어, 하기 기술된 것들 중 일부 또는 모두를 함유할 수 있다: 선택 가능한 마커 유전자, 예를 들어, 포유류 세포에서 안정하거나 일시적인 감염체의 선택을 위한 네오마이신 유전자; 높은 수준의 전사를 위한 인간 CMV의 전초기 유전자(immediate early gene)로부터의 인헨서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40으로부터의 전사 종료 및 RNA 처리 신호; 복제의 SV40 폴리오마 기원 및 적절한 에피솜 복제를 위한 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위(IRES), 다목적 다중 클로닝 부위; 및 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터. 이식유전자를 함유한 벡터를 생성시키기 위한 적합한 벡터 및 방법은 널리 공지되어 있고 당해 분야에서 입수 가능하다.
본원에 기술된 방법을 실행하는 데 유용한 폴리아데닐화 신호의 예는 인간 콜라겐 I 폴리아데닐화 신호, 인간 콜라겐 II 폴리아데닐화 신호, 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
임의의 항체를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 발현 벡터)는 항체를 생성하기 위한 적합한 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 숙주 세포는 항체 또는 이의 임의의 폴리펩티드 사슬의 발현을 위한 적합한 조건 하에서 배양될 수 있다. 이러한 항체 또는 이의 폴리펩티드 사슬은 보편적인 방법, 예를 들어, 친화력 정제를 통해 배양된 세포에 의해(예를 들어, 세포 또는 배양 상청액으로부터) 회수될 수 있다. 필요한 경우에, 항체의 폴리펩티드 사슬은 항체의 생성을 허용하는 적합한 시간 동안 적합한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 항체를 제조하는 방법은 본원에 또한 기술된 바와 같이, 항-체크포인트 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 엔코딩하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 재조합 발현 벡터는 보편적인 방법, 예를 들어, 칼슘 포스페이트-매개 트랜스펙션을 통해 적합한 숙주 세포(예를 들어, dhfr-CHO 세포) 내에 도입될 수 있다. 포지티브 형질전환체 숙주 세포는 항체를 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현을 허용하는 적합한 조건 하에서 선택되고 배양될 수 있으며, 이는 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 필요한 경우에, 숙주 세포로부터 회수된 2개의 사슬은 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다.
일 예에서, 2개의 재조합 발현 벡터가 제공되며, 하나는 항-체크포인트 항체의 중쇄를 엔코딩하며, 다른 하나는 항-체크포인트 항체의 경쇄를 엔코딩한다. 2개의 재조합 발현 벡터 둘 모두는 보편적인 방법, 예를 들어, 칼슘 포스페이트-매개 트랜스펙션에 의해 적합한 숙주 세포(예를 들어, dhfr-CHO 세포) 내에 도입될 수 있다. 대안적으로, 발현 벡터 각각은 적합한 숙주 세포 내에 도입될 수 있다. 포지티브 형질전환체는 항체의 폴리펩티드 사슬의 발현을 허용하는 적합한 조건 하에서 선택되고 배양될 수 있다. 2개의 발현 벡터가 동일한 숙주 세포 내에 도입될 때, 여기에서 생성된 항체는 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 필요한 경우에, 폴리펩티드 사슬은 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회수되고, 이후에, 항체의 형성을 허용하는 적합한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 2개의 발현 벡터가 상이한 숙주 세포 내에 도입될 때, 이러한 것들 각각은 상응하는 숙주 세포로부터 또는 상응하는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 이후에, 2개의 폴리펩티드 사슬은 항체의 형성을 위한 적합한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술은 재조합 발현 벡터를 제조하고 숙주 세포를 트랜스펙션하고, 형질전환체를 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수하기 위해 사용된다. 예를 들어, 일부 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 커플링된 기질과 함께 친화력 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 항-체크포인트 폴리펩티드 항체의 중쇄, 경쇄 또는 둘 모두를 엔코딩하는 임의의 핵산, 이를 함유한 벡터(예를 들어, 발현 벡터); 및 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포는 본 개시내용의 범위 내에 속한다.
다른 면역 체크포인트 조절제
일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 간섭 RNA, 예를 들어, 작은 간섭 RNA(siRNA) 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)이다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 체크포인트 단백질의 mRNA에 결합하고 이의 번역을 차단하거나 RNA 간섭을 통해 mRNA를 분해하는 작은 간섭 RNA(siRNA)이다. 예시적인 작은 간섭 RNA는 문헌[Hannon et al., Nature, 418 (6894): 244-51(2002); Brummelkamp et al., Science 21(2002); 및 Sui et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 99, 5515-5520 (2002)]에 의해 기술된다. RNA 간섭(RNAi)은 발현되지 않는 유전자(silenced gene)에 대해 서열에 있어서 상동성인 이중-가닥 (dsRNA)에 의해 개시된 동물에서 서열-특이적 전사후 유전자 사일런싱(sequence-specific post-transcriptional gene silencing)의 과정이다. siRNA는 일반적으로 RNA 듀플렉스(RNA duplex)이며, 각 가닥의 길이는 20 내지 25개(예를 들어, 19 내지 21개)의 염기 쌍을 갖는다. 일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 체크포인트 단백질 또는 이의 단편의 핵산(예를 들어, mRNA)에 대해 상보적인 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)이다. shRNA는 통상적으로, 19 내지 29개의 염기쌍의 줄기, 적어도 4개의 뉴클레오타이드(nt)의 루프, 및 선택적으로, 3' 단부에 디뉴클레오타이드 오버행(overhang)을 함유한다. 대상체에서 shRNA의 발현은 shRNA를 엔코딩하는 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 또는 박테리아 벡터)의 전달에 의해 얻어질 수 있다. siRNA 및 shRNA는 당해 분야에 공지되거나 상업적으로 입수 가능한 임의의 방법을 이용하여 설계될 수 있다(예를 들어, Dharmacon and Life Technologies로부터 입수 가능한 제품 참조). siRNA는 또한, 적어도 타겟 mRNA에 대한 이의 안정성 및 결합 친화력을 개선시키기 위해 염기 변형 및/또는 결합 변형과 같은 하나 이상의 화학적 변형을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 체크포인트 단백질의 핵산(예를 들어, mRNA)에 대해 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 단일 가닥 핵산(aDNA, RNA, 또는 하이브리드 RNA-DNA 분자)이며, 이는 체크포인트 단백질의 mRNA의 일부와 같은, 타겟 핵산 서열에 대해 상보적이다. 타겟 서열에 결합시킴으로써, RNA-RNA, DNA-DNA, 또는 RNA-DNA 듀플렉스가 형성되고, 이에 의해 예를 들어, 전사, 처리, 폴리 (A) 첨가, 복제, 번역을 차단하거나, 세포의 조절 메커니즘(modulatory mechanism)을 증진시키는, 예를 들어, mRNA 분해를 증진시킴으로써, 타겟 핵산의 기능 또는 수준을 억제한다. 일부 구현예에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 길이는 10 내지 40개, 12 내지 35개, 또는 15 내지 35개의 염기, 또는 이들 사이의 임의의 정수의 염기이다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 염기, 예를 들어, 2-아미노푸린, 2,6-디아미노푸린(2-아미노-dA), 5-브로모 dU, 5-메틸 dC, 데옥시이노신, 로킹된 핵산(LNA), 5-니트로인돌, 2'-O-메틸 염기, 하이드록시메틸 dC, 2'플루오로 염기를 포함할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 하나 이상의 변형된 결합, 예를 들어, 포스포로티오에이트 결합을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 체크포인트 단백질의 핵산(예를 들어, mRNA)에 대해 상보적이고 핵산을 절단하는 리보자임이다. 리보자임은 부위-특이적 방식으로 핵산을 절단하는 RNA 또는 RNA-단백질 복합체이다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 지니는 특정 촉매 도메인을 갖는다. 본 개시내용의 리보자임은 합성 리보자임, 예를 들어, 미국특허번호 제5,254,678호에 기술된 합성 리보자임일 수 있다. 이러한 합성 리보자임은 별도의 하이브리드화 영역 및 촉매 영역을 갖는다. 이에 따라, 하이브리드화 영역은 체크포인트 단백질에 해당하는 본원에 기술된 바와 같은 서열과 같은, 타겟 서열을 인식하도록 설계될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 siRNA, shRNA, 리보자임, 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 체크포인트 단백질의 핵산(예를 들어, mRNA), 또는 이의 부분에 대해 상보적일 수 있다. 상보성(complementarity)이 100% 상보성을 포함하지만, 하나 이상의 위치에서 반드시 미스매치(mismatch)를 배제하지는 않고, 예를 들어, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 상보성을 초래하는 것으로 이해되어야 한다.
적용 가능할 때, 체크포인트 조절제는 항암 치료법을 필요로 하는 대상체 내로 체크포인트 조절제를 전달하기 위해 사용될 수 있는, 벡터로부터 발현될 수 있다. 본원에서 사용되는 "벡터(vertor)"는 대상체에서의 세포, 예를 들어, 체크포인트 단백질을 발현시키는 세포로 체크포인트 조절제(예를 들어, shRNA, siRNA, 리보자임, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 단백질, 펩티드, 또는 항체)의 전달을 용이하게 할 수 있는 임의의 비히클(vehicle)이다. 일반적으로, 벡터는 플라스미드, 파지미드, 바이러스, 및 체크포인트 조절제를 엔코딩하는 서열의 삽입 또는 도입에 의해 조작된 바이러스 또는 박테리아 소스로부터 유래된 다른 비히클을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 바이러스 벡터는 하기 바이러스로부터의 핵산 서열을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다: 레트로바이러스; 렌티바이러스; 아데노바이러스; 아데노-연관 바이러스; SV40-타입 바이러스; 폴리오마 바이러스; 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus); 유두종 바이러스; 헤르페스 바이러스; 백신 바이러스; 폴리오 바이러스. 명명되지 않았지만 당해 분야에 공지된 다른 벡터가 용이하게 사용될 수 있다.
바이러스 벡터는 비필수 유전자가 체크포인트 조절제를 엔코딩하는 서열로 대체된 비-세포변성 진핵생물 바이러스(non-cytopathic eukaryotic virus)를 기반으로 할 수 있다. 비-세포변성 바이러스는 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스)를 포함하는데, 이의 수명은 게놈 바이러스 RNA가 DNA로 역전사되고 후속하여 숙주 세포 DNA 내에 프로바이러스가 통합되는 것과 관련이 있다. 레트로바이러스는 인간 유전자 치료 시험에 대해 승인되었다. 복제-결핍인(즉, 요망되는 단백질의 합성을 유도할 수 있지만, 감염성 입자를 제조할 수 없는) 그러한 레트로바이러스가 가장 유용하다. 이러한 유전적으로 변형된 레트로바이러스 발현 벡터는 생체내에서 유전자의 고효율 형질도입에 대한 일반적인 유용성을 갖는다. 복제-결핍 레트로바이러스를 생산하는 표준 프로토콜(플라스미드 내에 외인성 유전 물질을 도입하는 단계, 플라스미드로 패키징 세포주(packaging cell line)를 형질도입하는 단계, 패캐징 세포주에 의해 재조합 레트로바이러스를 생산하는 단계, 조직 배양 배지로부터 바이러스 입자를 수집하는 단계, 및 타겟 세포를 바이러 입자에 감염시키는 단계를 포함함)가 당해 분야에 공지되어 있다.
다른 바이러스 벡터는 아데노-바이러스 및 아데노-연관 바이러스를 포함하는데, 이는 또한 유전 치료법에서 인간 사용을 위해 승인된 이중-가닥 DNA 바이러스이다. 아데노-연관 바이러스는 복제 결핍이도록 설계될 수 있고 광범위한 세포 타입 및 종을 감염시킬 수 있다.
다른 벡터는 플라스미드 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터는 당해 분야에서 광범위하게 기술되어 있고, 당업자에게 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4th edition (June 15, 2012)] 참조). 예시적인 플라스미드는 pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40, 및 pBlueScript를 포함한다. 다른 플라스미드는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 추가적으로, 플라스미드는 면역 체크포인트 조절제를 엔코딩하는 서열과 같은, DNA의 특정 단편을 제거하고 첨가하기 위해 제한 효소 및 결찰 반응을 이용하여 맞춤형으로 설계될 수 있다.
일부 구현예에서, 체크포인트 조절제 핵산 서열은 이종 조절 영역, 예를 들어, 이종 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 프로모터는 예를 들어, 유비쿼터스 프로모터(ubiquitous promoter), 예를 들어, CMV 프로모터, ActB 프로모터, 또는 Ubiquitin B 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한, 조직-특이적 프로모터 또는 합성 프로모터일 수 있다. 프로모터는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 상업적으로 입수 가능하다(예를 들어, InvivoGen으로부터 입수 가능한 제품).
일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 비-항체 펩티드 또는 단백질일 수 있다. 펩티드 또는 단백질은 예를 들어, 관련된 체크포인트 단백질에 대한 천연 리간드와 경쟁시킴으로써, 체크포인트 신호전달을 방해하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 단백질 및 펩티드는 당해 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여, 예를 들어, 체크포인트 단백질에 결합시키기 위한 단백질 또는 펩티드의 라이브러리를 스크리닝하거나 리간드에 대한 결합으로부터 체크포인트 단백질을 억제함으로써 설계될 수 있다. 일부 예에서, 비-항체 펩티드 또는 단백질 조절제는 가용성 수용체, 예를 들어, Fc-융합 가용성 수용체일 수 있다.
일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 체크포인트 단백질 자체의 단편 또는 변이체, 예를 들어, 이의 동족 리간드를 결합하지만 상응하는 신호전달을 전송하지 않는 단편일 수 있다. 이러한 타입의 체크포인트 조절제는 우성 네가티브 조절제(dominant negative modulator)일 수 있다.
일부 구현예에서, 체크포인트 조절제는 통상적으로, 5,000 kDa 미만의 분자량을 갖는, 유기 소분자와 같은 소분자이다. 적합한 소분자는 면역 체크포인트 분자에 결합하는 소분자, 또는 이의 단편을 포함하고, 화합물의 큰 라이브러리를 스크리닝하는 것과 같은 방법에 의해(Beck-Sickinger &Weber (2001) Combinational Strategies in Biology and Chemistry (John Wiley &Sons, Chichester, Sussex); 핵자기공명에 의한 구조-활성 관계에 의해(Shuker et al. (1996) "Discovering high-affinity ligands for Proteins: SAR by NMR. Science 274: 1531-1534); 엔코딩된 자가-어셈블링 화학적 라이브러리(Melkko et al (2004) "Encoded self-assembling chemical libraries. " Nature Biotechnol. 22: 568-574); DNA-주형 화학(Gartner et al. (2004) "DNA-templated organic synthesis and selection of a library of macrocycles. Science 305: 1601-1605); 동적 조합 화학(dynamic combinatorial chemistry)(Ramstrom &Lehn (2002) "Drug discovery by dynamic combinatorial libraries. " Nature Rev. Drug Discov. 1: 26-36); 테터링(tethering)(Arkin & Wells (2004) "Small-molecule modulators of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nature Rev. Drug Discov. 3: 301-317); 및 고속 스크린(speed screen)(Muckenschnabel et al. (2004) "SpeedScreen: label-free liquid chromatography-mass spectrometry-based high-throughput screening for the discovery of orphan protein ligands. " Anal. Biochem. 324: 241-249)에 의해 동정될 수 있다. 통상적으로, 소분자는 나노몰 범위의 면역 체크포인트 단백질에 대한 해리 상수(dissociation constant)를 가질 것이다.
체크포인트 조절제를 함유한 약제 조성물
임의의 면역 체크포인트 조절제, 예를 들어, 항체, 엔코딩 핵산 또는 핵산 세트, 이를 포함하는 벡터, siRNA, 안티센스 RNA, 및 이를 운반하는 벡터, 및 소분자 조절제는 타겟 질병(예를 들어, 암)을 치료하는 데 사용하기 위한 약제 조성물을 형성하기 위해 약제학적으로 허용되는 담체(부형제)와 혼합될 수 있다. "허용되는(acceptable)"은 담체가 조성물의 활성 성분과 혼화 가능해야 하고(바람직하게, 활성 성분을 안정화시킬 수 있어야 하고), 치료될 대상체에 대해 유해하지 않아야 한다. 완충제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 부형제(담체)는 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K.E. Hoover] 참조).
본 방법에서 사용되는 약제 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액 형태로 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함할 수 있다(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K.E. Hoover). 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머, 예를 들어, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트란을 포함한 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어, EDTA; 당, 예를 들어, 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예를 들어, 소듐; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들어, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기술된 약제 조성물은 당해 분야에 공지된, 예를 들어, 문헌[Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); 및 미국특허번호 제4,485,045호 및 제4,544,545호]에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있는 항체(또는 엔코딩 핵산)를 함유한 리포솜을 포함한다. 순환 시간을 향상시키는 리포솜은 미국특허번호 제5,013,556호이다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물과 함께 역상 증발 방법(reverse phase evaporation method)에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 요망되는 직경을 갖는 리포솜을 수득하기 위해 규정된 기공 크기의 필터를 통해 압출된다.
항체, 또는 엔코딩 핵산(들)은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기술(coacervation technique)에 의해 또는 계면 중합(interfacial polymerization)에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 하이드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각에, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼(macroemulsion)에 포집될 수 있다. 이러한 기술은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)] 참조).
다른 예에서, 본원에 기술된 약제 조성물은 지속 방출 포맷(sustained-release format)으로 제형화될 수 있다. 지속 방출 제조물의 적합한 예는 항체를 함유한 고체 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이러한 매트릭스는 형상화된 물품, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태를 갖는다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올), 폴리락타이드(미국특허번호 제3,773,919호), L-글루탐산과 7-에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머, 예를 들어, LUPRON DEPOT™(락트산-글리콜산 코폴리머 및 류프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사 가능한 미소구체), 수크로오스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여를 위해 사용되는 약제 조성물은 살균되어야 한다. 이는 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료 항체 조성물은 일반적으로 멸균 액세스 포트(sterile access port)를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사기 주사 니들에 의해 천공 가능한 스톱퍼(stopper)를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 배치된다.
본원에 기술된 약제 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또한, 흡입(inhalation) 또는 취입(insufflation)에 의한 투여를 위한 단위 투약 형태(dosage form), 예를 들어, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제로 존재할 수 있다.
고체 조성물, 예를 들어, 정제를 제조하기 위해, 주 활성 성분은 본 발명의 화합물의 균질한 혼합물, 또는 이의 비-독성의 약제학적으로 허용되는 염을 함유한 고체 예비제형 조성물을 형성하기 위해, 약제학적 담체, 예를 들어, 보편적인 정제화 성분, 예를 들어, 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 소르비톨, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 디칼슘 포스페이트 또는 검, 및 다른 약제학적 희석제, 예를 들어, 물과 혼합될 수 있다. 이러한 예비제형 조성물을 균질한 것으로서 지칭될 때, 조성물이 정제, 환제 및 캡슐과 같은 동일하게 유효한 단위 투약 형태로 용이하게 분할될 수 있도록 활성 성분이 조성물 전반에 걸쳐 균일하게 분산된다는 것을 의미한다. 이후에, 이러한 고체 예비제형 조성물은 0.1 내지 약 500 mg의 본 발명의 활성 성분을 함유한 상술된 타입의 단위 투약 형태로 분할된다. 신규한 조성물의 정제 또는 환제는 연장된 작용의 장점을 제공하는 투약 형태를 제공하기 위해 코팅되거나 달리 배합될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투약 성분 및 외부 투약 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자 위에 엔벨로프(envelope) 형태를 갖는다. 2개의 성분은 위에서 분해를 저항하는 역할을 하는 장 층(enteric layer)에 의해 분리될 수 있고, 내부 구성성분이 온전한 상태로 십이지장으로 통과할 수 있거나, 방출을 지연시킬 수 있다. 이러한 장 층 또는 코팅을 위해 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 이러한 물질은 다수의 폴리머 산, 및 폴리머 산과 셀락(shellac), 세틸 알코올 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
적합한 표면-활성제(surface-active agent)는 특히, 비-이온성 제제, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌소르비탄(예를 들어, Tween™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄(예를 들어, Span™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 보편적으로, 0.05 내지 5% 표면-활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 다른 구성성분, 예를 들어, 필요한 경우에, 만니톨 또는 다른 약제학적으로 허용되는 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
적합한 에멀젼은 Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ 및 Lipiphysan™과 같은, 상업적으로 입수 가능한 지방 에멀젼을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 사전-혼합된 에멀젼 조성물에 용해될 수 있거나, 대안적으로, 이는 오일(예를 들어, 대두유, 홍화유, 면실유, 세삼 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 및 인지질(예를 들어, 달걀 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합 시에 형성된 에멀젼에 용해될 수 있다. 다른 구성성분, 예를 들어, 에멀젼의 등장성(tonicity)을 조정하기 위해 글리세롤 또는 글루코오스가 첨가될 수 있다. 적합한 에멀젼은 통상적으로, 최대 20% 오일, 예를 들어, 5 내지 20% 오일을 함유할 것이다.
에멀젼 조성물은 항체를 Intralipid™ 또는 이의 성분(대두유, 달걀 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.
흡입 또는 취입을 위한 약제 조성물은 약제학적으로 허용되는, 수성 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 중의 용액 및 현탁액을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기에 기술된 바와 같은 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다.
바람직하게, 멸균, 약제학적으로 허용되는 용매 중의 조성물은 가스의 사용에 의해 네뷸라이징될 수 있다. 네뷸라이징된 용액은 네뷸라이징 디바이스(nebulising device)로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나, 네뷸라이징 디바이스는 안면 마스크, 텐트(tent) 또는 간헐적 양압 호흡 기계에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은, 적절한 방식으로 제형을 전달하는 디바이스로부터, 바람직하게, 경구적으로 또는 비강으로, 투여될 수 있다.
(b) 콩과 식물의 발효 조성물
발효는 대사 과정으로서, 여기서, 미생물, 예를 들어, 효모 및 박테리아는 혐기성 조건 하에서, 탄수화물을 산(예를 들어, 유기산, 예를 들어, 락트산), 알코올(예를 들어, 에탄올), 및/또는 다른 대사물질로 전환시킨다. 본원에 기술된 바와 같은 병용 항암 치료법에서 사용하기 위한 발효 조성물은 하나 이상의 적합한 미생물, 예를 들어, 공생 미생물군의 집단에 의한 하나 이상의 콩과 식물의 발효 제품이다. 이러한 발효 조성물은 예를 들어, 보편적인 발효 과정을 통해, 하나 이상의 적합한 미생물에 의해, 적합한 출발 물질, 예를 들어, 콩과 식물, 이의 부분(예를 들어, 잎, 열매, 종자, 등), 또는 이의 추출물의 발효로부터 유래된 다수의 대사물질을 포함할 수 있다. 적합한 미생물은 효모 및 락토바실러스를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다(예를 들어, US20060251748호 참조, 이의 관련된 개시내용은 본원에서 언급된 목적 또는 주제를 위해 본원에서 참고로 포함됨). 일부 구현예에서, 본원에 기술된 발효 조성물은 락트산, 아세트산, 및 3-아미노이소부티르산과 같은 대사물질 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 발효 조성물은 약 5 내지 20 중량% 락트산(예를 들어, 5 내지 10 중량%, 10 내지 20 중량%, 5 내지 15 중량%, 또는 15 내지 20 중량%)을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 발효 조성물은 5 중량% 미만 아세트산, 3-아미노이소부티르산, 또는 둘 모두(예를 들어, 1 내지 5 중량%, 0.5 내지 5 중량%, 1 내지 3 중량%, 0.5 내지 3 중량%, 또는 3 내지 5 중량%)를 포함할 수 있다.
예시적인 콩과 식물은 콩, 완두콩, 알팔파, 붉은 클로버, 파바(fava), 살갈퀴(vetch), 및 무지개콩(cowpeas)을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 병용 항암 치료법에서 사용하기 위한 발효 조성물은 발효 대두 조성물이며, 이는 효모 및 락토바실러스와 같은 하나 이상의 적합한 미생물에 의해 대두 또는 이의 추출물(예를 들어, 수성 추출물)의 발효를 통해 생성된 다수의 대사물질을 포함한다. 당해 분야에 널리 공지된 바와 같이, 이러한 대사물질은 대안적인 공정을 통해 생성될 수 있으며, 이러한 것은 또한, 본 개시내용의 범위 내에 속한다.
본원에 기술된 임의의 발효 조성물, 예를 들어, 발효 대두 조성물은 콩과 식물의 대사산물을 생성하기 위해 콩과 식물의 성분들의 발효를 허용하는 적합한 조건 하에서 본원에 기술된 미생물과 같은 하나 이상의 적합한 미생물에 의해 콩과 식물, 이의 부분, 또는 이의 추출물을 발효시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 발효 조성물은 적합한 조건(예를 들어, 예컨대, 20 내지 45℃(예를 들어, 20 내지 25℃, 20 내지 30℃, 25 내지 30℃, 25 내지 35℃, 30 내지 45℃, 또는 30 내지 40℃) 하에서, 적합한 시간 동안(예를 들어, 2 내지 10일, 예를 들어, 2 내지 5일, 4 내지 8일, 및 5 내지 10일), 콩과 식물 및 이의 부분의 수성 추출물을 포함하는 배지에서 하나 이상의 적합한 미생물을 배양함으로써 제조될 수 있다. 발효 조성물을 제조하는 데 사용하기 위한 하나 이상의 미생물은 공생체(symbiotic)일 수 있는데, 이는 함께 살면서 서로 혜택을 주는 다양한 유기체를 지칭한다. 이후에, 배양물의 상청액이 수집되고, 여과되어 고체 성분을 제거하고, 살균될 수 있다. 필요한 경우에, 상청액은 농축된 발효 조성물 용액을 생성하기 위해 보편적인 방법(예를 들어, 투석)에 의해 농축될 수 있다.
일 예에서, 발효 조성물은 발효 대두 조성물이며, 이는 보편적인 방법을 통해 대두의 수성 추출물을 수득하고, 발효된 액체를 형성하기 위해 적합한 조건 하에서 적합한 시간 동안 수성 추출물을 적어도 하나의 락토바실러스와 적어도 하나의 사카로미세스(Saccharomyces)의 혼합물로 발효시키고, 발효된 액체를 수집, 여과 및 살균하고, 농축된 발효 대두 조성물을 형성하기 위해 살균되고 발효된 액체로부터 물을 제거함으로써 제조될 수 있다.
일부 예에서, 발효 조성물은 액체 형태이다. 다른 예에서, 발효 조성물은 건조 형태, 예를 들어, 분말일 수 있으며, 이는 일반적인 실행(예를 들어, 분무 건조 또는 냉동 건조)에 의해 제조될 수 있다.
발효 조성물을 제조하는 방법은 또한, 예를 들어, 미국특허번호 제6,685,973호, 제6,855,350호, 제6,733,801호, 및 US20120058104호에 기술되어 있으며, 이러한 문헌 각각의 관련 개시내용은 본원에서 언급된 목적 또는 주제를 위해 본원에 참고로 포함된다.
본원에 기술된 임의의 발효 조성물은 본원에 제공되는 설명에 따라 약제 조성물로서 제형화될 수 있다.
다른 구현예에서, 발효 조성물은 건강 식품, 영양 보조 식품 또는 의료 식품으로서 제형화될 수 있으며, 이는 면역 체크포인트 조절제로 치료되었거나 치료 중인 환자를 포함하는, 암 환자에서 면역력을 개선시키기 위해 임의의 부류의 액체 및 고체/반-고체 물질일 수 있다. 건강 식품은 식품(예를 들어, 차-기반 음료, 쥬스, 소프트 드링크, 커피, 우유, 젤리, 쿠키, 시리얼, 초콜렛, 스낵바, 허브 추출물, 유제품(예를 들어, 아이스크림, 및 요거트)), 식품/식이 보조제, 또는 영양 보조 식품일 수 있다.
발효 대두 조성물과 같은 임의의 발효 조성물을 함유한, 본원에 기술된 건강 식품, 영양 보조 제품, 및/또는 의료 식품은 하나 이상의 식용 담체를 포함할 수 있는데, 이는 본원에 기술된 바와 같은 발효 조성물에 이득들 중 하나 이상을 부여한다. 식용 담체의 예는 전분, 사이클로덱스트린, 말토덱스트린, 메틸셀룰로오스, 카본메톡시 셀룰로오스, 잔탄 검, 및 이의 수용액을 포함한다. 다른 예는 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 용매, 분산 매질, 코팅, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 착향제, 염료, 이러한 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 예에서, 발효 조성물은 영양 보조 조성물일 수 있으며, 이는 식품 소스로부터의 성분들을 함유하고 식품에서 발견된 기본적인 영양가 이외에 추가 건강 혜택을 부여하는 조성물을 지칭한다. 본원에 기술된 바와 같인 영양 보조 조성물은 발효 조성물, 및 양호한 건강을 증진시키고/거나 발효 조성물의 안정성 및 생활성을 향상시키는 추가적인 구성성분 및 보충제를 포함한다.
영양 보조 조성물의 작용은 빠르고/거나 단기간일 수 있거나, 본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어, 암에 대한 대상체의 면역력을 개선시키고 면역 체크포인트 조절제의 항암 효과를 향상시키는, 장기간의 건강 목적을 달성하는 데 도움을 줄 수 있다. 영양 보조 조성물은 예를 들어, 식이 보조제 또는 약제학적 제형으로서, 식용 물질에 함유될 수 있다. 식이 보조제로서, 추가적인 영양소, 예를 들어, 비타민, 미네랄 또는 아미노산이 포함될 수 있다. 조성물은 또한, 드링크 또는 식품, 예를 들어, 차(tea), 소프트 드링크, 쥬스, 우유, 커피, 쿠키, 시리얼, 초콜렛, 및 스낵바일 수 있다. 요망되는 경우에, 조성물은 감미제, 예를 들어, 소르비톨, 말티톨, 수소화된 글루코오스 시럽 및 수소화된 전분 가수분해물, 고함량 프룩토오스 옥수수 시럽, 수수당, 비트당, 펙틴, 또는 수크랄로오스를 첨가함으로서 감미화될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 발효 조성물, 예를 들어, 발효 대두 조성물은 의료 식품으로서 제형화될 수 있다. 의료 식품은 소비되거나 장내로 투여되도록 제형화된 식품이다. 이러한 식품은 대개, 본원에 기술된 것과 같은, 타겟 질병의 특정 식이 관리를 위해 전문의의 감독 하에서 사용된다. 일부 경우에, 이러한 의료용 식품 조성물은 치료를 필요로 하는 환자(예를 들어, 암에 걸린 인간 환자)를 위해 특별히 제형화되고 가공된다(자연 상태에서 사용되는 천연 발생 식품과는 상반됨). 일부 예에서, 본원에 기술된 의료용 식품 조성물은 증상을 관리하거나 질병 또는 질환의 위험을 감소시키기 위해 전체 식이요법의 일부로서 전문의에 의해 단순하게 제안되는 것들 중 하나가 아니다.
본원에 기술된 바와 같은 발효 조성물을 포함하는, 본원에 기술된 임의의 의료용 식품 조성물은 하기에서 상세히 기술되는 바와 같이, 액체 용액; 적절한 액체 중 또는 적합한 에멀젼 중 분말, 바(bar), 웨이퍼, 현탁액의 형태로 존재할 수 있다. 자연 발생 또는 합성(비-천연 발생)일 수 있는 적어도 하나의 담체는 발효 조성물에 하나 이상의 이득, 예를 들어, 안정성, 생체 이용률, 및/또는 생활성을 부여할 것이다. 본원에 기술된 임의의 담체는 의료용 식품 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 의료용 식품 조성물은 천연 착향제, 인공 착향제, 주미량 및 초미량 미네랄, 미네랄, 비타민, 귀리(oat), 땅콩, 향신료, 우유, 달걀, 밀가루, 레시틴, 잔탄 검 및/또는 감미제를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가적인 구성성분을 추가로 포함할 수 있다. 의료용 식품 조성물은 적합한 용기에 배치될 수 있으며, 이는 본원에 기술된 것과 같은 적어도 하나의 추가적인 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 개시된 발효 조성물은 용액 형태로 존재할 수 있다. 예를 들어, 발효 조성물은 매질, 예를 들어, 완충제, 용매, 희석제, 불활성 담체, 오일, 또는 크렘(creme)에 제공될 수 있다. 일부 예에서, 발효 조성물은 비-수성 보조-용매, 예를 들어, 알코올을 선택적으로 함유한 수용액 중에 존재한다. 발효 조성물은 또한, 분말, 페이스트, 젤리, 캡슐, 또는 정제의 형태로 존재할 수 있다. 락토오스 및 옥수수 전분이 캡슐용 희석제로서 및 정제용 담체로서 통상적으로 사용된다. 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트는 통상적으로 정제를 형성하기 위해 첨가된다.
발효 조성물은 적합한 투여 경로, 예를 들어, 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 경구 투여를 위하여, 조성물은 결합제(예를 들어, 사전젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스); 충전제(예를 들어, 락토오스, 미정질 셀룰로오스 또는 칼슘 하이드로겐 포스페이트); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자 전분 또는 소듐 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트)와 같은 허용되는 부형제와 함께 보편적인 수단에 의해 제조된 예를 들어, 정제 또는 캡슐 형태를 가질 수 있다. 정제는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 코팅될 수 있다. 또한, 바 및 다른 츄어블 제형이 포함된다.
일부 예에서, 발효 조성물은 액체 형태로 존재할 수 있으며, 하나 이상의 식용 담체는 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 지질(예를 들어, 트리글리세라이드, 식물성 오일, 리포솜), 또는 이들의 조합을 포함하지만 이로 제한되지 않는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예를 들어, 레시틴의 사용에 의해; 예를 들어, 액체 폴리올 또는 지질과 같은 담체 중 분산에 의한 요망되는 입자 크기의 유지에 의해; 예를 들어, 하이드록시프로필셀룰로오스와 같은 계면활성제의 사용에 의해 또는 이들의 조합에 의해 유지될 수 있다. 여러 경우에, 등장제, 예를 들어, 예컨대, 당, 소듐 클로라이드 또는 이들의 조합을 포함하는 것이 바람직할 것이다.
경구 투여를 위한 액체 제조물은 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 가질 수 있거나, 이러한 것은 사용 전에 물 또는 다른 적합한 비히클로 구성하기 위한 건조 제품으로서 제시될 수 있다. 일 구현예에서, 액체 제조물은 과일 쥬스로 투여하기 위해 제형화될 수 있다. 이러한 액체 제조물은 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들어, 현탁화제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 에멀젼화(예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예를 들어, 아몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분별된 식물성 오일); 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트, 벤조에이트 또는 소르베이트)와 함께 보편적인 수단에 의해 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 발효 조성물 및 면역 체크포인트 조절제가 하나의 조성물에 제형화될 수 있다.
II. 암을 치료하기 위한 키트
본 개시내용은 또한, 본원에 기술된 임의의 면역 체크포인트 조절제, 및 본원에 또한 기술된 임의의 발효 조성물(예를 들어, 발효 대두 조성물)로 암을 치료하는 데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 면역 체크포인트 조절제 및 발효 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 항-PD1 항체 또는 이의 엔코딩 핵산, 및 발효 대두 조성물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 임의의 방법에 따라 사용 설명서를 포함할 수 있다. 포함되어 있는 설명서는 예를 들어, 본원에 기술된 임의의 방법에 따라 암(예를 들어, 대장암 또는 폐암)과 같은 증식성 질병을 치료하거나, 발병을 지연시키거나, 완화시키기 위해 면역 체크포인트 조절제 및 발효 조성물의 투여의 설명을 포함할 수 있다. 키트는 개체가 질병을 지니고 있는 지의 여부를 동정하는 것을 기초로 하여 치료를 위해 적합한 개체를 선택하는 설명을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 설명서는 질병의 위험이 있는 개체에 본 개시내용의 하나 이상의 제제를 투여하는 것의 설명을 포함한다.
발효 조성물(예를 들어, 발효 대두 조성물)과 조합하여 항-체크포인트 항체와 같은 면역 체크포인트 조절제의 사용과 관련된 설명서는 일반적으로, 의도된 치료를 위한 투여량, 투약 스케쥴, 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 공급되는 설명서는 통상적으로, 라벨 또는 패키지 인서트(예를 들어, 키트에 포함된 페이퍼 시트) 상에 작성된 설명서이지만, 기계판독 가능한 설명서(예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크에 담긴 설명서)가 또한 허용 가능하다.
라벨 또는 패키지 인서트는 조성물이 암을 치료하고/거나 완화시키고/거나 암의 발병을 지연시키기 위해 사용되는 것을 지시할 수 있다. 설명서는 본원에 기술된 임의의 방법을 실행하기 위해 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 적합한 패키징에 존재한다. 적합한 패키징은 바이알, 병, 단지, 가요성 패키징(예를 들어, 시일링된 Mylar 또는 플라스틱 백), 등을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 또한, 특정 디바이스, 예를 들어, 흡입기, 비강 투여 디바이스(예를 들어, 분무기(aotmizer)) 또는 미니펌프와 같은 주입 디바이스와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 고려된다. 키트는 멸균 액세스 포트(sterile access port)를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 니들에 의해 천공 가능한 스톱퍼를 갖는 바이알 또는 정맥내 용액 백일 수 있음). 용기는 또한, 멸균 액세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 피하 주사 니들에 의해 천공 가능한 스톱퍼를 갖는 바이알 또는 정맥내 용액 백일 수 있음).
키트는 추가적인 성분, 예를 들어, 완충제, 및 해석 정보를 선택적으로 제공할 수 있다. 일반적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 이와 결합된 표지 또는 패키지 인서트(들)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 상술된 키트의 함유물을 포함하는 제작 물품을 제공한다.
병용 치료법
본원에는 본원에 기술된 바와 같은 발효 조성물 및 면역 체크포인트 조절제의 조합을 사용하는 병용 암 치료법이 제공된다. 본원에서 사용되는 용어 병용 치료법(combination therapy)은 순차적인 방식으로 이러한 제제들(예를 들어, 면역 체크포인트 조절제 및 발효 조성물)의 투여(즉, 여기서, 각 치료제는 상이한 시간에 투여됨)뿐만 아니라, 실질적으로 동시의 방식으로, 이러한 치료제, 또는 이러한 제제들 중 적어도 2개의 투여를 포함한다. 각 제제의 순차적인 또는 실질적으로 동시 투여는 경구 경로, 정맥내 경로, 근육내, 피하 경로, 및 점막 조직을 통한 직접 흡수를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 임의의 적절한 경로에 의해 영향을 받을 수 있다. 이러한 제제는 동일한 경로에 의해 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 제1 제제(예를 들어, 발효 조성물)는 경구로 투여될 수 있으며, 제2 제제(예를 들어, 항-체크포인트 항체, 예를 들어, 항-PD1 항체)는 정맥내로 투여될 수 있다. 또한, 선택된 조합물 중 하나의 제제는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 조합물 중 다른 제제는 경구로 투여될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 제제들 중 2개 이상은 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "순차적(sequential)"은 달리 특정하지 않는 한, 투약 요법(dosage regimen)이 면역 체크포인트 조절제, 예를 들어, 항체, 및 발효 조성물의 투여를 포함하는 경우에, 규칙적인 시퀀스 또는 순서에 의해 특징됨을 의미하며, 순차적 투약 요법은 발효 조성물의 투여 전, 동시, 실질적으로 동시, 또는 후에 면역 체크포인트 조절제의 투여를 포함할 수 있지만, 두 제제 모두는 규칙적인 시퀀스 또는 순서로 투여될 것이다. 용어 "별도(separate)"는 달리 특정하지 않는 한, 서로 떨어지게 유지되는 것을 의미한다. 용어 "동시에(simultaneously)"는 달리 특정하지 않는 한, 동시에 발생하거나 수행됨을 의미하며, 즉, 본 개시내용의 제제들이 동시에 투여됨을 의미한다. 용어 "실질적으로 동시에(substantially simultaneously)"는 제제들이 서로 소정 분 내에(예를 들어, 서로 10분 내에) 투여되고 공동 투여(joint administration)뿐만 아니라 연속 투여(consecutive administration)를 수용하도록 의도되지만, 투여가 연속적인 경우에, 단지 짧은 시간 동안 시간이 분리되어 있음(예를 들어, 개업의(medical practitioner)가 2개의 화합물을 별도로 투여하는데 소요되는 시간)을 의미한다. 본원에서 사용되는 동시 투여 및 실질적으로 동시 투여는 교환 가능하게 사용된다. 순차적 투여는 본원에 기술된 제제들의 일시적으로 분리된 투여를 지칭한다.
병용 치료법은 또한, 다른 생물학적 활성 성분(예를 들어, 상이한 항신생물제) 및 비-약물 치료법(예를 들어, 수술 또는 방사선 치료)과 추가로 조합하여 본원에 기술된 제제(예를 들어, 면역 체크포인트 조절제 및 발효 조성물)의 투여를 수용할 수 있다. 병용 치료법이 방사선 치료법을 추가로 포함하는 경우에, 방사선 치료는 치료제들의 조합과 방사선 치료의 공동-작용으로부터 유익한 효과가 달성되는 한, 임의의 적합한 시간에 수행될 수 있다. 예를 들어, 적절한 경우에, 유익한 효과는, 방사선 치료법이 치료제의 투여로부터 일시적으로 제거될 때, 아마도, 수 일 또는 심지어 수 주까지 여전히 달성된다.
면역 체크포인트 조절제 및 본원에 기술된 바와 같은 발효 조성물의 임의의 조합이 암을 치료하기 위한 임의의 시퀀스로 사용될 수 있다는 것으로 인식되어야 한다. 본원에 기술된 조합은 암 진행을 억제 또는 방해하는 효과, 조합물의 다른 제제의 부작용을 완화시키는 효과, 또는 암 관련 증상을 완화시키는 효과를 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 다수의 인자를 기초로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 병용 치료법은 조합의 각 개별 구성원과 관련된 임의의 부작용을 감소시킬 수 있다. 일부 예는 하기 표에 제공되어 있다. 예를 들어, 발효 조성물은 면역 체크포인트 조절제(예를 들어, 항-PD1 항체)를 포함하는 치료 과정 동안 매일 사용될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 면역 체크포인트 조절제 및 발효 조성물의 임의의 조합은 암을 치료하는 데 유용하다. 본원에서 사용되는 용어 "암(cancer)"은 고형암 및 비-고형암을 포함하는, 종양 또는 악성 세포군, 증식, 또는 전이에 의해 매개된 의학적 질환을 지칭한다. 암의 예는 폐암, 신장암, 위암, 유방암, 뇌암, 전립선암, 간세포암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상선암, 흑색종, 두경부암, 대장암, 백혈병, 림프종, 피부암, 위암, 식도암, 골수종, 직장암, 골암, 자궁암, 전립선암, 및 혈액성 악성종양을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
본원에 개시된 방법을 실행하기 위해, 유효량의 본원에 기술된 바와 같은 항암제 조합물은 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간)에, 적합한 경로, 예를 들어, 정맥내 투여를 통해, 예를 들어, 볼루스(bolus)로서, 또는 소정 시간에 걸쳐 연속적인 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 척추강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 투여될 수 있다. 제트 네불라이저 및 초음파 네불라이저를 포함하는, 액체 제형을 위한 상업적으로 입수 가능한 네불라이저는 투여를 위해 유용하다. 액체 제형은 직접적으로 분무화될 수 있으며, 동결건조된 분말은 재구성화 후 분무화될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기술된 바와 같은 면역 체크포인트 조절제(예를 들어, 항체) 및/또는 발효 조성물은 플루오로카본 제형 및 정량 흡입기(metered dose inhaler)를 이용하여 에어로졸화되거나, 동결건조된 및 밀링된 분말로서 흡입될 수 있다.
용어 "대상체(subject)," "개체(individual)," 및 "환자(patient)"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 치료를 위해 평가되고/거나 치료되는 포유동물을 지칭한다. 대상체는 인간일 수 있지만, 또한, 다른 포유동물, 특히, 인간 질병을 위한 실험실 모델로서 유용한 그러한 포유동물, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 등을 포함할 수 있다.
치료를 필요로 하는 인간 대상체는 증식성 질병(예를 들어, 암)과 같은, 타겟 질병/장애를 갖거나, 가질 위험이 있거나, 갖는 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. 타겟 질병 또는 장애를 갖는 대상체는 일상적인 의료 검사, 예를 들어, 실험실 검사, 장기 기능 검사, CT 스캔, 또는 초음파에 의해 동정될 수 있다. 임의의 이러한 타겟 질병/장애를 갖는 것으로 의심된 대상체는 질병/장애의 하나 이상의 증상을 나타낼 수 있다. 질병/장애에 대한 위험을 갖는 대상체는 질병/장애에 대한 위험 인자들 중 하나 이상을 갖는 대상체일 수 있다. 본원에 기술된 방법 및 조성물은 임의의 증식성 질병 또는 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 증식성 질병은 암이다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양에 의해 특징된다.
본원에서 사용되는 "유효량(effective amount)"은 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 활성제와 조합하여, 대상체에 대해 치료 효과를 부여하기 위해 요구되는 각 활성제(예를 들어, 면역 체크포인트 조절제, 예를 들어, 항-PD1 항체 또는 발효 조성물)의 양을 지칭한다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 암세포 성장을 저해하고/거나 종양 부담(tumor burden)을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 발효 조성물의 양은 면역 체크포인트 조절제의 항암 효과를 향상시키는 데 효과적이다. 다른 구현예에서, 발효 조성물의 양은 암세포에 대한 대상체의 면역력을 향상시키는 데 효과적이다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 종양 성장의 예방 또는 억제이다. 일부 구현예에서, 치료 효과는 하나 이상의 제제/약물과 관련된 부작용의 감소이다. 예를 들어, PD-1 경로를 억제하는 것으로부터 야기될 수 있는 부작용(예를 들어, 피로, 말초 부종, 오한, 발열, 설사, 매스꺼움, 복통, 기침, 호흡곤란, 발진, 소양증, 백반, 관절통, 근육통, 요통, 두통, 현기증, 및/또는 증가된 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라아제(aspartate aminotransferase: AST)은 다른 제제의 조절제(예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 면역 체크포인트 조절제 및 발효 조성물)과 동시-치료에 의해 감소될 수 있다.
조절제 조합물의 양이 치료 효과를 달성하였는 지의 결정은 당업자에게 명백할 것이다. 유효량은 치료되는 특정 질환, 질환의 중증도, 치료되는 특정 질환, 질환의 중증도, 연령, 신체 조건, 크기, 성별 및 체중을 포함하는 개별 환자 파라미터, 치료 기간, 동시 치료법의 종류(임의의 경우), 특정 투여 경로, 및 건강 전문의의 지식 및 전문성 내의 유사한 요인들에 따라, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 달라진다. 이러한 인자는 당업자에게 널리 알려져 있고, 일상적인 실험만으로 해결될 수 있다. 일반적으로, 개별 성분 또는 이들의 조합물의 최대 용량, 즉, 건전한 의학적 판단에 따라 가장 높은 안전한 용량이 사용되는 것이 바람직하다.
반감기와 같은 경험적 고려 사항은 일반적으로, 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 양립 가능한 항체, 예를 들어, 인간화된 항체 또는 완전한 인간 항체는 항체의 반감기를 연장시키고 숙주의 면역계에 의해 공격받는 항체를 방지하기 위해 사용될 수 있다. 투여 횟수는 치료 과정에 걸쳐 결정되고 조정될 수 있고, 일반적으로, 타겟 질병/장애의 치료 및/또는 억제 및/또는 완화 및/또는 지연을 기초로 한 것이지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 대안적으로, 항체의 지속적인 연속 방출 제형이 적절할 수 있다. 지속적인 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 디바이스는 당해 분야에 공지되어 있다.
일 예에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체와 같은 면역 체크포인트 조절제에 대한 투여량은 조절제의 하나 이상의 투여(들)를 제공한 개체에서 경험적으로 결정될 수 있다. 개체에는 조절제의 증가 투여량이 제공된다. 길항제의 효능을 평가하기 위하여, 질병/장애의 지표가 따를 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 임의의 항체의 투여를 위하여, 초기 후보 투여량은 약 ㎎/㎏일 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위하여, 통상적으로 일일 투여량은 상기에 언급된 인자들에 따라, 약 임의의 0.1 ㎍/㎏ 내지 3 ㎍/㎏ 내지 30 ㎍/㎏ 내지 300 ㎍/㎏ 내지 3 ㎎/㎏, 또는 30 ㎎/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 수 일 이상에 걸친 반복된 투여를 위하여, 질환에 따라, 치료는 요망되는 증상 억제가 일어날 때까지 또는 충분한 치료 수준이 타겟 질병 또는 장애, 또는 이의 증상을 경감시키기 위해 달성될 때까지, 지속된다. 예시적인 투약 요법은 약 2 ㎎/㎏의 초기 용량, 이후에, 약 1 ㎎/㎏의 주 단위 유지 용량의 항체, 또는 이후에, 격주마다 약 1 ㎎/㎏의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여량 요법은 실무자가 달성하고자 하는 약동학 붕괴(pharmacokinetic decay)의 패턴에 따라, 유용할 수 있다. 예를 들어, 1주에 1 내지 4회의 투여가 고려된다. 일부 구현예에서, 약 3 ㎍/㎎ 내지 약 2 ㎎/㎏ 범위의 투여량(예를 들어, 약 3 ㎍/㎎, 약 10 ㎍/㎎, 약 30 ㎍/㎎, 약 100 ㎍/㎎, 약 300 ㎍/㎎, 약 1 ㎎/㎏, 및 약 2 ㎎/㎏)이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 횟수는 매주 마다, 2주 마다, 4주 마다, 5주 마다, 6주 마다, 7주 마다, 8주 마다, 9주 마다, 또는 10주 마다 1회; 1달 마다, 2달 마다, 또는 3달 마다, 또는 더 긴 기간 마다 1회이다. 이러한 치료법의 진행은 보편적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 요법(사용되는 항체를 포함함)은 시간에 따라 달라질 수 있다.
일부 구현예에서, 정상 체중의 성인 환자에 대하여, 약 0.3 내지 5.00 ㎎/㎏ 범위의 용량이 투여될 수 있다. 특정 투여 요법, 즉, 용량, 타이밍(timing), 및 반복은 특정 개체 및 그러한 개체의 병력뿐만 아니라, 개별 제제의 성질(예를 들어, 제제의 반감기, 및 당해 분야에 널리 공지된 다른 고려사항)에 따를 것이다.
본 개시내용의 목적을 위하여, 본원에 기술된 바와 같은 항체의 적절한 투여량은 사용되는 특정 항체, 항체들, 및/또는 비-항체 펩티드(또는 이들의 조성물), 질병/질환의 타입 및 중증도, 예방 또는 치료 목적을 위해 항체가 투여되는 지의 여부, 이전 치료법, 길항제에 대한 환자의 임상 병력 및 반응, 및 주치의의 재량에 따를 것이다. 통상적으로, 임상의는, 요망되는 결과를 달성하는 투여량이 달성될 때까지 항체를 투여할 것이다. 일부 구현예에서, 요망되는 결과는 혈전증의 감소이다. 투여량이 요망되는 결과를 야기시켰는 지의 여부를 결정하는 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 면역 체크포인트 조절제 및/또는 발효 조성물의 투여는 예를 들어, 수용자의 신체적 조건, 투여 목적이 치료 또는 예방인 지의 여부, 및 숙련된 실무자에게 알려진 다른 인자에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 항체의 투여는 사전선택된 시간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나, 예를 들어, 타겟 질병 또는 장애를 개발하기 전, 동안, 또는 후에, 일련의 이격된 용량일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는(treating)"은 장애, 질병의 증상, 또는 질병 또는 장애에 대한 소인을 치료, 치유, 완화, 변경(alter), 교정(remedy), 개량(ameliorate), 개선(improve) 또는 영향을 미치기 위한 목적으로, 타겟 질병 또는 장래, 질병/장애의 증상, 또는 질병/장애에 대한 소인(predisposition)을 갖는, 대상체에 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다.
타겟 질병/장애를 완화시키는 것은 질병의 발달 또는 진행을 지연시키거나 질병 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 질병을 완화시키는 것은 반드시 치료 결과를 필요로 하는 것은 아니다. 본원에서 사용되는 타겟 질병 또는 장애의 발달을 "지연시키는(delaying)"은 질병의 진행을 지연(defer), 저해(hinder), 줄임, 지체(retard), 안정화, 및/또는 연기시키는(postpone) 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료될 질병 및/또는 개체의 히스토리(history)에 따라, 시간 길이를 다양하게 할 수 있다. 질병의 발달을 "지연" 또는 완화시키거나, 질병의 발병을 지연시키는 방법은 본 방법을 사용하지 않는 것과 비교할 때, 제공된 시간 프레임에서 질병의 하나 이상의 증상을 발달시킬 확률을 감소시키고/거나 제공된 시간 프레임에서 증상의 크기를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 통상적으로, 통계학적으로 유의미한 결과를 제공하는 데 충분한 다수의 대상체를 이용하여, 임상 연구를 기초로 한다.
질병의 "발달(development)" 또는 "진행(progression)"은 질병의 초기 징후(initial manifestation) 및/또는 계속되는 진행(ensuing progression)을 의미한다. 질병의 발달은 당해 분야에 널리 공지된 바와 같은 표준 임상 기술을 이용하여 검출 가능하고 평가될 수 있다. 그러나, 발달은 또한, 검출 가능하지 않을 수 있는 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위하여, 발달 또는 진행은 증사의 생물학적 과정을 지칭한다. "발달"은 발생(occurrence), 재발(recurrence) 및 발병(onset)을 포함한다. 본원에서 사용되는 타겟 질병 또는 장애의 "발병" 또는 "발생"은 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 면역 체크포인트 조절제 및 발효 조성물의 조합물은 하나 이상의 타겟 신호전달 경로의 활성을 생체 내에서 적어도 20%(예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과) 억제하는데 충분한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에 투여된다. 다른 구현예에서, 조합물은 하나 이상의 타겟 항원의 활성 수준을 적어도 20%(예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과) 감소시키는 데 효과적인 양으로 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 바와 같은 발효 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 면역 체크포인트 조절제(예를 들어, 억제제)의 사용을 포함하는 항암 치료를 받거나 항암 치료 중에 있는 대상체(예를 들어, 인간 암 환자)에게 제공된다.
의학 분야의 당업자에게 공지된, 보편적인 방법은 치료될 질병의 타입 또는 질병의 부위에 따라, 대상체에게 약제 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 또한, 다른 보편적인 경로를 통해 투여되고, 예를 들어, 경구적으로, 비경구적으로, 흡입 분무에 의해, 국소적으로, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질내로, 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구(parenteral)"는 피하, 피부내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 척추강내, 병소내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 이는 대상체에, 1-, 3-, 또는 6-달 데폿(depot) 주사제 또는 생분해성 물질 및 방법을 이용하는 것과 같은 주사 가능한 데폿 주사 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 예에서, 약제 조성물은 안구내로 또는 유리체강내로 투여된다.
주사 가능한 조성물은 다양한 담체, 예를 들어, 식물성 오일, 디메틸락트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카르보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 및 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등)을 함유할 수 있다. 정맥내 주사를 위해, 수용성 항체는 드립 방법(drip method)에 의해 투여될 수 있으며, 이에 의해 항체 및 생리학적으로 허용되는 부형제를 함유한 약제 제형이 흡입된다. 생리학적으로 허용되는 부형제는 예를 들어, 5% 덱스트로오스, 0.9% 염수, 링거액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제조물, 예를 들어, 항체의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제형은 주사용 물, 0.9% 염수, 또는 5% 글루코오스 용액과 같은 약제학적 부형제 중에 용해되고 투여될 수 있다.
일 구현예에서, 항체는 부위-특이적 또는 타겟화된 국소 전달 기술을 통해 투여된다. 부위-특이적 또는 타겟화된 국소 전달 기술의 예는 항체의 다양한 이식 가능한 데폿 소스, 또는 국소 전달 카테터, 예를 들어, 주입 카테터, 유치 도뇨관, 또는 니들 카테터, 합성 그라프트(synthetic graft), 외막 랩(adventitial wrap), 션트(shunt) 및 스텐트(stent) 또는 다른 이식 가능한 디바이스, 부위 특이적 캐리어, 직접 주사, 또는 직접 적용을 포함한다(예를 들어, PCT 공개번호 WO 00/53211호 및 미국특허번호 제5,981,568호 참조).
안티센스 폴리뉴클레오타이드, 발현 벡터, 또는 하위게놈 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 치료 조성물의 타겟 전달이 또한 사용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술은 문헌[예를 들어, Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11: 202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J.A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263: 621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269: 542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266: 338]에 기술되어 있다.
폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 본원에 기술된 항체를 엔코딩하는 폴리뉴클레오타이드)를 함유한 치료 조성물은 유전자 치료법 프로토콜에서 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg의 DNA의 범위로 투여된다. 일부 구현예에서, 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 ㎍ 내지 약 2 mg, 약 5 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 및 약 20 ㎍ 내지 약 100 ㎍의 DNA 또는 그 초과의 농도 범위가 또한, 유전자 치료법 프로토콜 동안 사용될 수 있다.
본원에 기술된 치료 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 바이러스 또는 비-바이러스 기원일 수 있다(일반적으로, 문헌[Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1: 51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5: 845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1: 185; 및 Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6: 148] 참조). 이러한 코딩 서열의 발현은 내인성 포유류 또는 이종 프로모터 및/또는 인헨서를 사용하여 유도될 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성적이거나 조절될 수 있다.
요망되는 폴리뉴클레오타이드의 전달 및 요망되는 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기반 벡터는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예시적인 바이러스-기반 비히클은 재조합 레트로바이러스(예를 들어, PCT 공개번호 WO 90/07936호; WO 94/03622호; WO 93/25698호; WO 93/25234호; WO 93/11230호; WO 93/10218호; WO 91/02805호; 미국특허번호 제5,219,740호 및 제4,777,127호; GB 특허번호 제2,200,651호; 및 EP 특허번호 제0 345 242호 참조), 알파바이러스-기반 벡터(예를 들어, 신드비스 바이러스 벡터(Sindbis virus vector), 셈리키 삼림열 바이러스(Semliki forest virus)(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스(Ross River virus)(ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네주엘라 이콰인 뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, PCT 공개번호 WO 94/12649호, WO 93/03769호; WO 93/19191호; WO 94/28938호; WO 95/11984호 및 WO 95/00655호 참조)를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 문헌[Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3: 147]에 기술된 바와 같이 죽은 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 또한 사용될 수 있다.
죽은 아데노바이러스 단독에 연결되거나 연결되지 않은 다중양이온 응축된 DNA(예를 들어, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3: 147 참조); 리간드-연결된 DNA(예를 들어, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985 참조); 진핵 세포 전달 비히클 세포(예를 들어, 미국특허번호 제5,814,482호; PCT 공개번호 WO 95/07994호; WO 96/17072호; WO 95/30763호; 및 WO 97/42338호 참조) 및 세포막과의 핵 전하 중화 또는 융합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 비-바이러스 전달 비히클 및 방법이 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법은 PCT 공개번호 WO 90/11092호 및 미국특허번호 제5,580,859호에 기술되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜은 미국특허번호 제5,422,120호; PCT 공개번호 WO 95/13796호; WO 94/23697호; WO 91/14445호; 및 EP 특허번호 제0524968호에 기술되어 있다. 추가적인 방법은 문헌[Philip, Mol. Cell. Biol. (1994) 14: 2411, 및 Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 1581]에 기술되어 있다.
타겟 질병/장애에 대한 치료 효능은 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.
일반적인 기술
본 발명의 실행은 달리 명시하지 않는 한, 당해 분야의 기술 내에 존재하는, 분자 생물학(재조합 기술을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 보편적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌[예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer 벡터s Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); 항체 (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual(E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)]에서 충분히 설명된다.
추가의 상세한 설명 없이, 당업자는 상기 설명을 기초로 하여, 본 발명을 이의 최대 범위로 사용할 수 있다고 사료된다. 이에 따라, 본원에 제공된 특정 구현예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하고, 어떠한 방식으로도 본 개시내용의 나머지 부분을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에서 인용된 모든 공개문은 본원에 언급된 목적 또는 대상에 대해 참고로 포함된다.
실시예 1 : 경구 투여를 통한 항-PD1 항체 및 조성물 X로 대장암의 치료
조성물 X는 하기와 같이 제조된 발효 대두 조성물이다. 대두의 수성 추출물을 보편적인 방법에 의해 제조하였다. 락토바실러스와 효모의 혼합물을 미생물에 의한 대두 추출물의 발효를 허용하는 조건 하에서 수성 대두 추출물을 함유한 배지에서 배양하였다. 발효된 액체를 수집하고, 여과하여 고체 물질을 제거하고, 살균하였다. 이에 따라 제조된 액체 용액을 농축시켜 조성물 X(액체 형태)를 생성하였다. 각 밀리그램의 조성물 X는 약 2.7 g 대두의 발효된 브로쓰(fermented broth)를 함유한다.
대장암에 대한 조성물 X 및 항-PD1 항체의 병용 치료법의 효과를 대장암 마우스 모델에서 조사하였다. 간단하게, 0일째에 Balb/c 마우스에 2×105개의 대장암 CT26 세포를 피하 주사하였다. 6일째에 이식된 대장암 세포로부터 유래된 종양이 약 60 내지 70 ㎣의 용적까지 성장하였을 때, 마우스에 항-PD1 항체를 10 ㎎/㎏으로 복강내 주사하였다. 항-PD1 항체의 주사를 8일, 10일 및 12일에 동일한 용량으로 반복하였다. 마우스를 분석을 위해 17일째에 희생시켰다. 0일 내지 15일 동안, 일부 마우스에 희석된 조성물 X(1%, 5% 또는 15%)를 매일 공급하고, 나머지 마우스에 비히클 대조군을 공급하였다. 이러한 예시적 실험 설계의 개략도는 도 1a에 제공되어 있다.
대안적으로, 2주일(14일간; 14일째에 시작함) Balb/c 마우스에 매일 조성물 X를 공급하였다. 이후에, 마우스에 2×105개의 대장암 CT26 세포를 피하 주사하였다(0일째). 암세포를 이식하고 5일째에(5일), 마우스를 복강내 주사를 통해 10 ㎎/㎏ 항-PD1로 치료하였으며, 7일, 9일 및 11일에 반복하였다. 마우스를 분석을 위해 15일에 희생시켰다.
하기 표 1 및 표 2 및 도 2 및 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 조성물 X는 본 실시예에서 사용되는 대장암 마우스 모델에서 입증된 바와 같이, 용량-의존 방식으로 종양 성장을 억제함에 있어서 항-PD1 항체의 효능을 유의미하게 향상시켰다. 표 1, 도 2a 및 도 3a는 도 1a에 도시된 실험 설계에 따른 연구로부터 얻어진 결과를 나타낸 것이다. 표 2, 도 2b 및 도 3b는 도 1b에 도시된 실험 설계에 따른 연구로부터 얻어진 결과를 나타낸 것이다.
표 1. 대장암 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 조성물 X 및 항-PD1 항체의 효과
Figure pct00001
표 2. 대장암 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 조성물 X 및 항-PD1 항체의 효과
Figure pct00002
15일째에, 마우스를 희생시키고, 각 마우스로부터의 비장세포를 유세포 분석을 위해 형광-표지된 CD4, CD8, CD62L 및 CD44 항체로 염색하였다. 3-칼라 유세포 분석을 수행하여 T 세포(CD62L+CD44low로서 규정됨) 및 이펙터 기억 T 세포(CD62L-CD44high로서 규정됨)를 동정하였다.
도 4에 도시된 바와 같이, 두 비장 CD8+ 및 CD4+ 세포 모두에서 이펙터 기억 T 세포의 백분율은 항-PD1 및 조성물 X의 병용 치료의 결과로서 유의미하게 증가되었으며, T 세포는 대조군과 비교하여 감소하였다.
실시예 2 : 경구 투여를 통한 항-PD1 항체 및 조성물 X로 폐암의 치료
조성물 X를 상기 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다. 폐암에 대한 조성물 X 및 항-PD1 항체의 병용 치료법의 효과를 하기와 같이 폐암 마우스 모델에서 조사하였다.
0일째에 C57BL/6 마우스에 5×106개의 폐암 LL2 세포를 주사하였다. 4일부터 개시하여, 일부 마우스에 희석된 조성물 X(7.5%, 15% 또는 22.5% 조성물)를 하루에 한번 공급하고, 나머지 마우스를 비히클 대조군으로 치료하였다. 4일에 개시하여, 종양이 대략 60 ㎣의 용적까지 성장하였을 때, 마우스에 격일(4일, 6일, 8일, 10일 및 12일째에) 마다 1회씩 10 ㎎/㎏ 항-PD1 모노클로날 항체를 복강내로 주사하였다. 마우스를 분석을 위해 19일째에 희생시켰다. 이러한 예시된 실험 설계의 개략도는 도 5에 제공된다.
하기 표 3 및 도 6 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 조성물 X는 이러한 폐암 마우스 모델에서 관찰된 바와 같이 용량-의존 방식으로 종양 성장을 억제함에 있어서 항-PD1의 효능을 유의미하게 향상시킨다. 조성물 X는 종양 성장을 저해함에 있어서 항-PD1 항체와 상승적으로 작용하였다.
표 3. 폐암 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 조성물 X 및 항-PD1 항체의 효과
Figure pct00003
종양 조직 내에 침윤된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두를 본원에 기술된 바와 같은 유세포 분석에 의해 분석하였다. 두 종양-침윤 CD4+ 및 CD8+T 세포 모두에서, 이펙터 기억 T 세포의 백분율이 병용 치료의 결과로서 유의미하게 증가되었으며, T 세포가 비히클 대조군과 비교하여 감소되었다는 것이 관찰되었다(도 8).
비히클 대조군 또는 항-PD1과 조성물 X의 조합물로 치료된 마우스의 비장 T 세포 프로파일링을 상기 실시예 1에 기술된 방법에 따라 분석하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 비장 CD8+ 및 CD4+ 세포 둘 모두에서 이펙터 기억 T 세포의 백분율은 항-PD1과 조성물 X의 병용 치료의 결과로서 유의미하게 증가되었으며, T 세포는 대조군과 비교하여 감소하였다.
또한, 종양 조직에서 PD1/PD-L1 발현 프로파일링을 분석하였다. 단독으로 또는 조성물 X와 조합하여 항-PD-1 항체로 치료된 마우스에서 종양-침윤 PD-1high CD4+ T 세포는 유사한 감소 경향을 나타내었다. 조성물 X 단독은 종양-침윤 PD-1high CD8+ T 세포를 감소시켰는데, 이는 항-PD-1 항체와 유사하다(또는 이보다 더욱 양호하다). 종양 세포에서 PD-L1 발현은 병용 치료법 그룹뿐만 아니라 항-PD-1 그룹에서 감소되었다(또는 이보다 더욱 양호하였다). 도 10.
MDSC(골수-유래 억제 세포)는 Gr-1(+)CD11B(+)F4/80(+) 세포로서 특징분석된다. 이러한 세포는 종양 발달에서 중요한 역할을 하고, 종양 면역요법에 대해 부정적인 영향을 갖는다. 조성물 X와 항-PD-1의 병용 치료는 MDSC의 백분율을 유의미하게 감소시켰는데, 이는 이러한 병용 치료법이 암 치료에서 효과적일 것임을 나타내는 것이다. 도 11.
실시예 3 : 경구 투여를 통한 항-PD1 항체 및 조성물 X로 대장암의 치료
조성물 X를 상기 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조하였다. 대장암에 대한, 정맥내로 투여된 조성물 X 및 항-PD1 항체의 병용 치료법의 효과를 하기와 같이 대장암 마우스 모델에서 조사하였다.
0일째에 C57BL/6 마우스에 5×106개의 대장암 CT26 세포를 주사하였다. 5일째에 마우스에, 이식된 대장암 세포로부터 유래된 종양이 50 ㎣의 평균 크기에 도달할 때까지 10 ㎎/㎏으로 항-PD1 항체를 복강내 주사하였다. 항-PD1 항체의 주사를 7일, 9일, 11일 및 13일에 동일한 용량으로 반복하였다. 마우스를 분석을 위해 16일째에 희생시켰다. 4일, 7일, 9일, 11일, 13일, 및 15일에 일부 마우스에 정맥내로 5% 희석된 조성물 X를 투여하고, 나머지는 그러하지 않았다. 하나의 마우스 그룹에 3일째부터 비교를 위해 항-PD1가 주사되거나 주사되지 않은 실험의 종료까지 경구로 15% 조성물 X(10 ㎖/㎏, 매일)를 투여하였다. 이러한 예시적인 실험 설계의 개략도는 도 12에 제공되어 있다.
하기 표 4 및 도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 조성물 X의 정맥내 투여는 조성물 X의 경구 투여와 유사한 정도로 종양 성장을 억제하는 데 항-PD1 항체의 효능을 유의미하게 향상시킨다. 또한, 조성물 X는 종양 성장을 저해하는 데 항-PD1 항체와 상승적으로 작용하였다.
표 4. 대장암 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 정맥내 조성물 X 및 항-PD1 항체의 효과
Figure pct00004
비장 및 종양 부위에서의 면역 세포 프로파일링 및 시토카인 발현을 유세포 분석에 의해 분석하였다(도 15 내지 도 22). 또한, 이펙터/기억 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 백분율 모두는 종양 부위(도 15)뿐만 아니라 비장(도 16)에서 조성물 X의 경구 투여에 의해 또는 정맥내 투여에 의해 병용 치료의 결과로서 유의미하게 증가하였다. 또한, 두 조합물 모두에서, PD1highCD4 및 CD8 T 세포의 백분율은 대조군에 비해 더 낮았고, PD-L1+ 종양 세포의 백분율도 낮았다(도 17). 유사하게, 종양에서 NK 세포의 백분율(CD3e-CD49b+로서 특징분석됨)은 유의미하게 더 높았으며(도 18), MDSC(Gr-1+CD11b+F4/80+로서 특징분석됨)는 항-PD1과 조합된 조성물 X의 경구 및 정맥내 투여 둘 모두에서 유의미하게 더 낮았다(도 19).
또한, 종양 부위(도 20 및 도 21)뿐만 아니라 혈청(도 22)에서 시토카인 발현 프로파일을 측정하였다. T 및 NK 세포 기능을 향상시킬 수 있는 시토카인(IL-2, IFN-γ, IL-15, IL-4) 및 전-염증성 시토카인(IL-5, IL-6, TNF-α) 둘 모두가 종양 부위 및 혈청 둘 모두에서 유의미하게 증가되었다는 것이 관찰되었다.
실시예 4: 항-PD1 항체 및 조성물 X로의 대장암 치료는 큰창자에서 미생물군을 변화시킴
항-PD1 항체 및 조성물 X를 도 1a에 예시된 절차에 따라 대장암 CT26 세포가 이식된 Balb/c 마우스에 제공하였다. 치료 후에, 17일째에 치료된 마우스의 근위 결장 조직을 절제하였으며, 여기서, 마우스를 희생시키고, 차세대 시퀀싱 기술로 미생물군 분석으로 수행하였다. 결과는, 대장암에 걸린 마우스가 항-PD1/조성물 X 조합물로 치료되었을 때 어떠한 치료도 받지 않은 대장암에 걸린 마우스와 비교하여 변화되었음을 나타내었다. 예시적인 박테리아 종은 표 5에 나열되어 있다.
표 5. 대장암에 걸린 마우스에서 미생물군의 변화에 대한 조성물 X 및 항-PD1 항체의 효과
Figure pct00005
또한, 루미노코쿠스(Ruminococcus)의 존재비는 도 23에 도시된 바와 같이, 종양의 크기와 밀접하게 관련이 있으며, 여기서, X-축은 루미노코쿠스의 존재비를 나타내며, Y-축은 종양의 크기를 나타낸다. 종양 크기가 더 클 때, 즉, 비히클 그룹에서 종양이 더 클 때, 큰 크기의 종양을 갖는 마우스(비히클 대조군의 마우스)의 큰창자에서 루미노코쿠스의 존재비는 작은 크기의 종양을 갖는 마우스(조성물 X/항-PD1 항체 조합물에 의해 치료된 마우스)의 루미노코쿠스의 존재비보다 훨씬 더 높다. 창자 미생물군이 대장암에 영향을 미쳤다고 제안된 이후(예를 들어, Gao et. al., Frontiers in Microbiology, 6: 20, 2015 참조), 이러한 연구로부터 얻어진 결과는, 조성물 X 및/또는 항-PD1 항체가 특히, 이러한 조합물로 치료되는 대상체의 창자 미생물군을 조절함을 통해 대장암을 치료하는 데 효과적일 수 있다는 것을 나타낸다.
다른 구현예
본 명세서에 개시된 모든 특징들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징은 동일한, 균등한, 또는 유사한 목적을 수행하는 대안적인 특징에 의해 대체될 수 있다. 이에 따라, 달리 명시적으로 기술하지 않는 한, 개시된 각 특징은 단지 균등한 또는 유사한 특징의 포괄적인 시리즈(generic series)의 예이다.
상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 용이하게 확인할 수 없고, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서, 본 발명의 다양한 변경 및 변형을 수행하여 다양한 용도 및 조건에 적응할 수 있다. 이에 따라, 다른 구현예가 또한, 본 청구범위 내에 속한다.
균등물(EQUIVALENTS)
수 개의 본 발명의 구현예가 본원에 기술되고 예시되어 있지만, 당업자는 기능을 수행하고/거나 본원에 기술된 결과 및/또는 장점들 중 하나 이상을 획득하기 위해 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이며, 이러한 변화 및/또는 변경 각각은 본원에 기술된 본 발명의 구현예의 범위 내에 속하는 것으로 여겨진다. 더욱 일반적으로, 당업자는, 본원에 기술된 모든 파라미터, 치수, 물질, 및 구성이 예시적으로 의도되고, 실제 파라미터, 치수, 물질, 및/또는 구성이 특정 적용 또는 본 발명의 교시가 사용되는 적용에 의존할 것임을 용이하게 인식할 것이다. 당업자는 본원에 기술된 특정 발명의 구현예에 대한 다수의 균등물을 인식할 수 있거나, 이를 일상적인 실험만을 사용하여 확인할 수 있다. 이에 따라, 상기 구현예가 단지 일 예로서 제시되며, 첨부된 청구범위 및 이에 대한 균등물의 범위 내에서, 본 발명의 구현예가 상세하게 기술되고 청구된 것과 다르게 실행될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용의 본 발명의 구현예는 본원에 기술된 각 개별 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 둘 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법의 임의의 조합은, 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트, 및/또는 방법이 서로 불위치하지 않는 경우에, 본 개시내용의 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에서 정의되고 사용되는 모든 정의는 사전 정의, 참조로 포함된 문헌에서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미를 제어하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에 개시된 모든 참고문헌, 특허, 및 특허 출원은 각각이 인용된 주제에 관해서 참고로 포함되며, 이는 일부 경우에, 문헌의 전체를 포함할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용되는 단수 용어("a" 및 "an")는 명확하게 상반되게 명시하지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용되는 구 "및/또는"은 이와 같이 결합된 구성요소(element), 즉, 일부 경우에 공동으로 존재하고 다른 경우에 분리적으로 존재하는 구성요소 중 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"과 함께 나열된 다수의 구성요소는 동일한 방식으로, 즉, 이에 따라 결합된 구성요소들 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 다른 구성요소는, 상세하게 식별된 그러한 구성요소와 관련이 있거나 관련이 없는 지의 여부에 따라, "및/또는" 조항(clause)에 의해 상세하게 식별된 구성요소 이외로 선택적으로 존재할 수 있다. 이에 따라, 비-제한적인 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급(reference)은 "포함하는(comprising)"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때, 일 구현예에서, 단지 A(선택적으로, B 이외의 구성요소를 포함함); 다른 구현예에서, 단지 B(선택적으로, A 이외의 구성요소를 포함함); 또 다른 구현예에서, A 및 B 둘 모두(선택적으로, 다른 구성요소를 포함함), 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용되는 "또는(or)"은 상기에서 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록(list)에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로 해석되어야 하며, 즉, 다수의 구성요소 또는 구성요소 목록, 및 선택적으로, 나열되지 않은 추가적인 항목의 적어도 하나를 포함하지만, 또한 하나를 초과하는 것을 포함하는 것으로서 해석되어야 한다. "단지 하나(only one of)" 또는 "정확하게 하나(exactly one of)"와 같은 상반되게 명확하게 명시된 용어 또는 청구범위에서 사용될 때, "로 이루어진(consisting of)"이라는 용어는 다수의 구성요소 또는 구성요소의 목록의 정확하게 하나의 구성요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은 "어느 하나(either)," "중 하나(one of)," "중 단지 하나(only one of)," 또는 "중 정확하게 하나"와 같은, 배타적인 용어에 의해 선행될 때, 배타적인 대안(즉, "하나 또는 다른 하나, 그러나, 둘 모두는 아님")으로서만 해석되어야 한다. "로 본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"은 청구항에서 사용될 때, 특허법 분야에서 사용되는 이의 일반적인 의미를 가져야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용되는 구 "적어도 하나"는, 하나 이상의 구성요소의 목록을 참조로 하여, 구성요소의 목록에서 구성요소들 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 구성요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 본질적으로 구성요소의 목록 내에서 상세하게 나열된 각 및 모든 구성요소 중 적어도 하나를 포함하지 않고, 구성요소의 목록에서 구성요소들의 임의의 조합을 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한, 구성요소들이 구성요소의 목록 내에서 상세하게 식별된 구성요소 이외의 구성요소가 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용하며, 이에 대한 구 "적어도 하나"는 상세하게 식별된 그러한 구성요소와 관련이 있거나 관련이 없는 지의 여부를 지칭한다. 이에 따라, 비-제한적인 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게, "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 일 구현예에서, 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A를 지칭할 수 있고 B가 존재하지 않으며(및 선택적으로, B 이외의 구성요소를 포함하며); 다른 구현예에서, 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B를 지칭할 수 있고 A가 존재하지 않으며(및 선택적으로 A 이외의 구성요소를 포함하며); 또 다른 구현예에서, 선택적으로 하나 초과는 적어도 하나의 A, 및 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B(및 선택적으로 다른 구성요소를 포함함), 등을 지칭할 수 있다.
또한, 명확하게 상반되게 명시하지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 동작을 포함하는 본원에서 청구된 임의의 방법에서, 본 방법의 단계 또는 동작 순서가 본 방법의 단계 또는 동작이 열거되는 순서로 반드시 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (36)

  1. 암을 치료하기 위한 약제 또는 키트를 제작하기 위한 발효 조성물 및 면역 체크포인트 조절제의 조합물의 용도로서, 발효 조성물은 하나 이상의 미생물에 의한 콩과 식물(legume plant) 또는 이의 부분의 발효를 통해 생성되는 다수의 대사물질을 포함하는 용도.
  2. 제1항에 있어서, 면역 체크포인트 조절제가 면역 체크포인트 억제제(immune checkpoint inhibitor)인 용도.
  3. 제1항에 있어서, 발효 조성물이 경구 투여 또는 정맥내 투여에 의해 투여되는 용도.
  4. 제1항에 있어서, 발효 조성물이 액체 형태로 존재하는 용도.
  5. 제1항에 있어서, 발효 조성물이 대두 또는 이의 추출물의 발효를 통해 생성되는 다수의 대사물질을 포함하는 용도.
  6. 제1항에 있어서, 발효 조성물이 효모, 락토바실러스(lactobacillus), 또는 이들의 조합에 의한 콩과 식물 또는 이의 부분의 발효를 통해 생성되는 다수의 대사물질을 포함하는 용도.
  7. 제6항에 있어서, 콩과 식물의 부분이 대두인 용도.
  8. 제1항에 있어서, 다수의 대사물질이 락트산, 아세트산, 및/또는 3-아미노이소부티르산의 조합을 포함하는 용도.
  9. 제8항에 있어서, 발효 조성물이 5 내지 20 중량%의 락트산, 5 중량% 미만의 아세트산, 및 5 중량% 미만의 3-아미노이소부티르산을 포함하는 용도.
  10. 제6항에 있어서, 발효 조성물이 (i) 콩과 식물, 이의 부분, 또는 이의 추출물의 발효를 허용하는 조건 하, 콩과 식물, 이의 부분, 또는 이의 추출물을 포함하는 배지에서 효모, 락토바실러스, 또는 이들의 조합을 성장시키는 단계, 및 (ii) 단계 (i)로부터 수득된 발효 조성물을 수집하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 용도.
  11. 제10항에 있어서, 제조 공정이 단계 (ii)로부터 수득된 발효 조성물을 여과하고/거나, 발효 조성물을 살균하고/거나, 발효 조성물을 농축시키는 것을 추가로 포함하는 용도.
  12. 제1항에 있어서, 발효 조성물이 면역 체크포인트 조절제의 투여 전, 후, 또는 동시에 투여되는 용도.
  13. 제12항에 있어서, 면역 체크포인트 조절제가 PD-1, CD28, CTLA-4, CD137, CD40, CD134, ICOS, KIR, LAG3, CD27, TIM-3, BTLA, GITR, TIGIT, CD96, CD226, KIR2DL, VISTA, HLLA2, TLIA, DNAM-1, CEACAM1, CD155, IDO, TGF-베타, IL-10, IL-2, IL-15, CSF-1, IL-6, 아데노신 A2A 수용체(A2AR), 및 이들의 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 체크포인트 분자의 조절제인 용도.
  14. 제13항에 있어서, 면역 체크포인트 조절제가 면역 체크포인트 분자에 대해 특이적인 항체인 용도.
  15. 제14항에 있어서, 항체가 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체인 용도.
  16. 제15항에 있어서, 면역 체크포인트 조절제가 PD-1 또는 이의 리간드에 대해 특이적인 항체인 용도.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 대장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 난소암, 신장암, 위암, 두경부암, 식도암, 방광암, 직장암, 골암, 자궁암, 전립선암, 및 혈액성 악성종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
  18. 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 약제 또는 키트를 제작하기 위한 발효 조성물의 용도로서, 발효 조성물은 하나 이상의 미생물에 의한 콩과 식물 또는 이의 부분의 발효를 통해 생성되는 다수의 대사물질을 포함하며, 대상체는 면역 체크포인트 조절제를 포함하는 항암 치료법을 받았거나 받는 중인 용도.
  19. 제18항에 있어서, 면역 체크포인트 조절제가 면역 체크포인트 억제제인 용도.
  20. 제18항에 있어서, 발효 조성물이 경구 투여 또는 정맥내 투여에 의해 투여되는 용도.
  21. 제18항에 있어서, 발효 조성물이 액체 형태로 존재하는 용도.
  22. 제18항에 있어서, 발효 조성물이 효모, 락토바실러스, 또는 이들의 조합에 의한 콩과 식물, 이의 부분, 또는 이의 추출물의 발효를 통해 생성되는 다수의 대사물질을 포함하는 용도.
  23. 제22항에 있어서, 콩과 식물의 부분이 대두인 용도.
  24. 제18항에 있어서, 다수의 대사물질이 락트산, 아세트산, 및/또는 3-아미노이소부티르산의 조합을 포함하는 용도.
  25. 제24항에 있어서, 발효 조성물이 5 내지 20 중량%의 락트산, 5 중량% 미만의 아세트산, 및 5 중량% 미만의 3-아미노이소부티르산을 포함하는 용도.
  26. 제18항에 있어서, 발효 조성물이 (i) 콩과 식물, 이의 부분, 또는 이의 추출물의 발효를 허용하는 조건 하, 콩과 식물, 이의 부분, 또는 이의 추출물을 포함하는 배지에서 효모, 락토바실러스, 또는 이들의 조합을 성장시키는 단계; 및 (ii) 단계 (i)로부터 수득된 발효 조성물을 수집하는 단계를 포함하는 공정에 의해 제조되는 용도.
  27. 제26항에 있어서, 제조 공정이 단계 (ii)로부터 수득된 발효 조성물을 여과하고/거나, 발효 조성물을 살균하고/거나, 발효 조성물을 농축시키는 것을 추가로 포함하는 용도.
  28. 제18항에 있어서, 면역 체크포인트 조절제가 PD-1, CD28, CTLA-4, CD137, CD40, CD134, ICOS, KIR, LAG3, CD27, TIM-3, BTLA, GITR, TIGIT, CD96, CD226, KIR2DL, VISTA, HLLA2, TLIA, DNAM-1, CEACAM1, CD155, IDO, TGF-베타, IL-10, IL-2, IL-15, CSF-1, IL-6, 아데노신 A2A 수용체(A2AR), 및 이들의 리간드로 이루어진 군으로부터 선택된 면역 체크포인트 분자의 조절제인 용도.
  29. 제28항에 있어서, 면역 체크포인트 조절제가 면역 체크포인트 분자에 대해 특이적인 항체인 용도.
  30. 제29항에 있어서, 항체가 인간 항체, 인간화된 항체, 또는 키메라 항체인 용도.
  31. 제30항에 있어서, 면역 체크포인트 조절제가 PD-1 또는 이의 리간드에 대해 특이적인 항체인 용도.
  32. 제18항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 대장암, 폐암, 유방암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 난소암, 신장암, 위암, 두경부암, 식도암, 및 방광암, 직장암, 골암, 자궁암, 전립선암, 및 혈액성 악성종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
  33. (i) 면역 체크포인트 조절제; 및 (ii) 발효 조성물을 포함하는 키트 또는 약제 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 면역 체크포인트 조절제가 제2항 및 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에서 규정된 바와 같은 것인 키트 또는 약제 조성물.
  35. 제33항에 있어서, 발효 조성물이 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에서 규정된 바와 같은 것인 키트 또는 약제 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 발효 조성물이 효모, 락토바실러스, 또는 이들의 조합에 의한 대두 또는 이의 추출물의 발효를 통해 생성되는 다수의 대사물질을 포함하는 키트 또는 약제 조성물.
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