CN109069630B - 使用免疫检测点调节剂和共生微生物菌丛的发酵产物的结合癌症疗法 - Google Patents

使用免疫检测点调节剂和共生微生物菌丛的发酵产物的结合癌症疗法 Download PDF

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Abstract

使用免疫检测点调节剂(例如，免疫检测点抑制剂)以及由共生微生物菌丛制备的发酵产物的癌症的结合疗法。

Description

使用免疫检测点调节剂和共生微生物菌丛的发酵产物的结合癌症疗法
技术领域
本申请主张根据美国专利法第119条规定而于2016年3月30日申请的美国临时申请号62/315259的优先权，其全部的内容是通过引用方式并入本文。
背景技术
免疫检测点为在免疫***中调节信息途径的分子，从而调节免疫反应中的免疫细胞活性。许多癌细胞可通过抑制T细胞活化而逃避免疫监视。自2010年以来，免疫检测点越来越被视为是癌症免疫治疗的新目标。许多检测点调节剂，例如，
Figure BDA0001815537610000011
(依匹单抗，ipilimumab)、
Figure BDA0001815537610000013
(派姆单抗，pembrolizumab)，以及
Figure BDA0001815537610000012
(纳武单抗，nivolumab)，已在临床试验中被证实能有效抑制癌细胞生长。
发酵是一种代谢过程，其是由微生物，例如酵母菌及细菌，或由缺氧的肌肉细胞，如在乳酸发酵的情况中，将糖转化为酸、气体或醇类。在食品加工中，发酵是在厌氧条件下使用酵母菌、细菌或其组合将碳水化合物转化成醇类与二氧化碳或有机酸。在发酵过程中产生的代谢物通常会对健康有好处。
发明内容
本发明是基于一种免疫检测点调节剂(例如，抗PD1抗体)以及发酵大豆组合物的组合对抑制癌症生长具有不可预期的协同效果。
据此，本发明的一方面提供一种治疗癌症的方法，包含：(i)对有需要的个体施用有效量的免疫检测点调节剂(例如，免疫检测点抑制剂)；以及(ii)对该个体施用发酵组合物(例如，发酵大豆组合物)，其包含多种代谢物，该多种代谢物是通过由一或多种合适的微生物发酵豆科植物、该豆科植物的部分，或其萃取物所生成。
于另一方面，本发明提供一种治疗癌症的方法，其包含对有需要的个体施用有效量的如本文所述的发酵大豆组合物，其中该个体已接受或正在接受涉及免疫检测点调节剂(例如，免疫检测点抑制剂)的抗癌疗法。
在本文所述的任何方法中，该发酵组合物可通过口服给药或通过静脉内给药而施用。于一些实例中，该发酵组合物可为液体形式。于一些具体实施例中，该发酵组合物可包含多种代谢物，该多种代谢物是通过由酵母菌、乳酸杆菌或其组合发酵豆科植物(例如，大豆)、该豆科植物的部分(例如，种子)，或其萃取物所生成。该发酵组合物可在施用该免疫检测点调节剂之前、之后或同时施用。
于一些具体实施例中，该发酵组合物可包含(例如，二种或更多种)乳酸、乙酸，以及3-氨基异丁酸的组合。于一实例中，该发酵组合物包含5-20重量％的乳酸、小于5重量％的乙酸，以及小于5重量％的3-氨基异丁酸。
于一些实例中，该发酵组合物可通过以下方法制备：(i)在包含豆科植物(例如，大豆)、该豆科植物的一部分(例如，种子)，或其萃取物的培养基中，在允许该大豆或其萃取物发酵的条件下，培养该酵母、该乳酸杆菌或其组合；以及(ii)收集从步骤(i)获得的发酵组合物。可视需要地，该制备方法可进一步包含过滤该发酵组合物、对该发酵组合物灭菌，及/或浓缩该发酵组合物。
用于本文所述的任何方法中的免疫检测点调节剂可以是一种免疫检测点分子的调节剂(例如，抑制剂)，该免疫检测点分子可为PD-1、CD28、CTLA-4、CD137、CD40、CD134、ICOS、KIR、LAG3、CD27、TIM-3、BTLA、GITR、TIGIT、CD96、CD226、KIR2DL、VISTA、HLLA2、TLIA、DNAM-1、CEACAM1、CD155、IDO(例如，IDO1)、TGF-β、IL-10、IL-2、IL-15、CSF-1、IL-6、腺苷A2A受体(adenosine A2Areceptor，A2AR)，或其之一配体。于一些具体实施例中，该免疫检测点调节剂为针对该免疫检测点，或其配体，具有特异性的抗体，例如，针对PD1或其配体(PDL1或PDL2)具有特异性的抗体。于一些实例中，该抗体可为人类抗体、人源化抗体，或嵌合抗体。
由本文所述的方法治疗的示例性的癌症包括，但不限于，结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮肤癌、脑癌、卵巢癌、肾癌、胃癌、头颈癌、食道癌、膀胱癌、直肠癌、骨癌、子宫癌、***癌，以及血液恶性肿瘤。
此外，本发明的特征在于一种试剂盒，其包含(i)如本文所述的一或多种免疫检测点调节剂(例如，免疫检测点抑制剂)，以及(ii)如本文所述的发酵组合物(例如，发酵大豆组合物)。
本发明的范围还包括用于治疗癌症的医药组合物，例如，如本文所述的医药组合物，该医药组合物包含(i)如本文所述的免疫检测点调节剂(例如，免疫检测点抑制剂)以及(ii)如本文所述的发酵组合物(例如，发酵大豆组合物)；以及该免疫检测点调节剂以及该发酵组合物的组合用于制备治疗癌症的药物或试剂盒的用途。本发明还提供如本文所述的发酵组合物(例如，发酵大豆组合物)用于制备治疗在有需要的个体内的癌症的药物或试剂盒的用途，其中该个体已接受或正在接受涉及免疫检测点调节剂(例如，免疫检测点抑制剂)的抗癌疗法。
于以下的描述中阐述了本发明的一或多个具体实施例的细节。本发明的其它特征或优点将从以下附图与数个具体实施例的详细描述，以及从所附的申请专利范围中变得显而易见。
附图说明
图1A为用于在结肠癌小鼠模型中通过口服给药研究抗PD1抗体以及发酵组合物(组合物X)的组合的效果的实验设计的示意图。该小鼠是同时移植结肠癌CT26细胞以及以该发酵组合物处理。
图1B为用于在结肠癌小鼠模型中通过口服给药研究抗PD1抗体以及发酵组合物(组合物X)的组合的效果的实验设计的示意图。该小鼠在移植结肠癌CT26细胞之前，先以该发酵组合物处理。
图2A为显示肿瘤大小的照片，该肿瘤是通过以皮下注射结肠癌CT26细胞至小鼠中所形成，该些小鼠是分别以不同剂量的载剂对照、抗PD1抗体，或该抗PD1抗体以及发酵组合物的组合处理。该小鼠是同时移植结肠癌CT26细胞以及以该发酵组合物处理。各组间体重并无统计学上的显著差异。
图2B为显示肿瘤大小的照片，该肿瘤是通过以皮下注射结肠癌CT26细胞至小鼠中所形成，该些小鼠是分别以不同剂量的载剂对照、抗PD1抗体，或该抗PD1抗体以及发酵组合物的组合处理。该小鼠在移植结肠癌CT26细胞之前，先以该发酵组合物处理。各组间体重并无统计学上的显著差异。
图3A包括显示抗-PD1/组合物X组合对于在结肠癌小鼠模型中观察到的肿瘤生长的抑制作用的图表。该小鼠是同时移植结肠癌CT26细胞以及以该发酵组合物处理。
图3B包括显示抗-PD1/组合物X组合对于在结肠癌小鼠模型中观察到的肿瘤生长的抑制作用的图表。该小鼠在移植结肠癌CT26细胞之前，先以该发酵组合物处理。
图4包括显示组合物X-抗-PD1组合对于在结肠癌小鼠模型中观察到的脾T细胞特性的影响的图表。*p<0.05；**p<0.01；以及***p<0.001。通过比较每个干预组及对照组(载剂处理)获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图5为用于研究组合物X-抗-PD1组合在肺癌小鼠模型中的作用的示例性实验设计的示意图。
图6为显示肿瘤大小的照片，该肿瘤是通过以皮下注射肺癌LL2细胞至小鼠中所形成，该些小鼠是分别以不同剂量的载剂对照、抗PD1抗体，或该抗PD1抗体以及发酵组合物的组合处理。各组间体重并无统计学上的显著差异。
图7包括显示抗PD1/组合物X组合对于在肺癌小鼠模型中观察到的肿瘤生长的抑制作用的图表。
图8包括显示组合物X-抗-PD1组合对于在肺癌小鼠模型中观察到的肿瘤浸润性T细胞特性的影响的图表。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。通过比较每个干预组及对照组(载剂处理)获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图9包括显示组合物X-抗-PD1组合对于在肺癌小鼠模型中观察到的脾T细胞特性的影响的图表。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。通过比较每个干预组及对照组(载剂处理)获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图10包括显示在肿瘤组织中PD1/PD-L1表现特性的图表，该肿瘤组织是获自移植肺癌细胞并以抗PD1抗体、组合物X，或其组合处理的小鼠。*p<0.05；**p<0.01；以及***p<0.001。通过比较每个干预组及对照组(载剂处理)获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图11为显示肿瘤浸润性的骨髓来源抑制细胞(myeloid-derivedsuppressorcells，MDSC)特性分析图。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。通过比较每个干预组及对照组(载剂处理)获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图12为在结肠癌小鼠模型中通过口服给药或静脉注射研究抗PD1抗体以及发酵组合物(组合物X)的组合的作用的实验设计的示意图。
图13为显示肿瘤大小的照片，该肿瘤是通过以皮下注射结肠癌CT26细胞至小鼠中所形成，该些小鼠是分别以下述处理：载剂对照、抗PD1抗体、通过口服施用该抗PD1抗体以及发酵组合物的组合，或通过皮下注射该抗PD1抗体以及该发酵组合物的组合。
图14包括显示通过口服给药或静脉内注射抗PD1/组合物X组合对于在结肠癌小鼠模型中观察到的肿瘤生长的抑制作用的图表。
图15包括显示组合物X-抗-PD1组合对于在结肠癌小鼠模型中观察到的肿瘤部位的T细胞特性的影响的图表。组合物X是以口服或静脉内给药。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。通过比较每个干预组及对照组(载剂处理)获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图16包括显示组合物X-抗-PD1组合对于在结肠癌小鼠模型中观察到的脾T细胞特性的影响的图表。组合物X是以口服或静脉内给药。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。通过比较每个干预组及对照组(载剂处理)获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图17包括显示在肿瘤组织中PD1/PD-L1表现特性的图表，该肿瘤组织是获自移植肺癌细胞并以抗PD1抗体、组合物X，或其组合处理的小鼠。组合物X是以口服或静脉内给药。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。通过比较每个干预组及对照组(载剂处理)获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图18为显示抗PD1抗体、组合物X或其组合对NK细胞含量(以CD3e-/CD49b+为特征)的影响的图。组合物X是以口服或静脉内给药。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。通过比较每个干预组及对照组(载剂处理)获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图19为显示肿瘤浸润性的骨髓来源抑制细胞(MDSC)特性分析图。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。组合物X是以口服或静脉内给药。通过比较每个干预组及对照组(载剂处理)获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图20包括显示在小鼠中肿瘤部位的细胞激素IL-2、IFN-γ，以及IL-15的含量的图表，该小鼠是分别以载剂对照、抗PD1抗体、组合物X，或其组合处理。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。组合物X是以口服或静脉内给药。通过比较每个干预组及载剂对照组获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图21包括显示在小鼠中肿瘤部位的细胞激素IL-6、TNF-α，以及IL-5的含量的图表，该小鼠是分别以载剂对照、抗PD1抗体、组合物X，或其组合处理。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。组合物X是以口服或静脉内给药。通过比较每个干预组及载剂对照组获得P值。#p<0.05；##p<0.01；###p<0.001。通过比较每个干预组及抗PD1抗体处理组获得P值。
图22包括显示在小鼠中的细胞激素IFN-γ、IL-15、IL-6、IL-4，以及IL-1的血清含量的图表，该小鼠是分别以载剂对照、抗PD1抗体、组合物X，或其组合处理。*p<0.05；**p<0.01；和***p<0.001。组合物X是以口服或静脉内给药。通过比较每个干预组及载剂对照组获得P值。
图23为表示肿瘤大小与小鼠肠道中某些细菌种类含量之间的相关性的图，该小鼠是分别以载剂、抗PD1抗体、发酵大豆组合物(组合物X)，或该抗PD1抗体与该组合物X的组合处理。
具体实施方式
免疫检测点调节剂已在许多研究中被证实能有效抑制癌细胞生长。在本发明中提供的研究令人意外地证明，发酵大豆组合物，例如，示例性的大豆发酵组合物，如本文所述的组合物X，成功地增强了免疫检测点调节剂(例如，免疫检测点抑制剂，如抗PD1抗体)的抗癌效果。于一些情况下，该免疫检测点调节剂与该发酵大豆组合物的共同使用在动物癌症模型中显现出抑制癌症生长的协同效果。不受理论的束缚，本研究的结果显示，发酵组合物可以协助免疫检测点抑制剂调节肠道微生物菌丛，这在涉及癌症发展的领域中被报告过。这些不可预期的结果指出，发酵大豆组合物可与一或多种免疫检测点调节剂，例如抑制剂，共同使用以更有效地治疗癌症。
据此，本文提供了涉及免疫检测点调节剂与发酵大豆组合物的共同使用的结合癌症疗法，以及用于此类用途的试剂盒。
I.用于结合癌症疗法的药剂
本文所述的结合癌症疗法涉及使用免疫检测点调节剂与发酵组合物，如发酵大豆组合物，作为活性剂。
免疫检测点调节剂
免疫检测点蛋白质是指涉及多种调节途径的分子，其调节(例如，上调或下调信息免疫***以维持自身耐受性并调节周围组织中生理学免疫反应的持续时间及幅度，以尽量减少侧边组织损伤。通常，免疫检测点蛋白质因癌细胞(例如，肿瘤)而失调。不受任何特定理论的约束，免疫检测点蛋白质可为调节剂(活化剂或抑制剂)的目标而作为一种抗癌疗法，例如由Pardoll等人，Nature Reviews Cancer，12：252-264，2012年所述。
免疫细胞信息途径可由细胞上的一或多个以下示例性的受体/配体对调节：PD1/PDL1、PD1/PDL2、CD28/B7-1(CD80)、CD28/B7-2(CD86)、CTLA4/B7-1(CD80)、CILA4/B7-2(CD86)、4-1BB(CD137)/4-1BBL(CD137L)、ICOS/B7RP1、CD40/CD40L、疱疹病毒进入调控因子(Herpesvirus entry mediator，HVEM)/B-及T-淋巴细胞衰减因子(B-and T-lymphocyteattenuator，BTLA)；OX40/OX40L、CD27/CD70、GITR/GITRL、KIR/MHC、淋巴细胞活化基因3(LAG3或CD223)/MHC、A型肝炎病毒细胞受体2(Hepatitis A virus cellular receptor 2，HAVCR2；也称为T细胞免疫球蛋白与含有-3(TIM3))/TIM3配体的黏蛋白结构域、带有Ig与ITIM结构域(TIGIT)/CD96的T细胞免疫受体，以及TIGIT/CD226。免疫细胞信息途径也可由一或多种以下示例性的细胞激素/化学激活素及其同源细胞表面受体调节：介白素2(IL-2)/CD122、腺苷/腺苷A2A受体(adenosine A2A receptor，A2AR)、介白素6(IL-6)/IL6R(CD126)、介白素10(IL-10)/IL-10R、介白素15(IL-15)/IL-15R、转化生长因子β(TGFβ)/TGFβR，以及巨噬细胞群落刺激因子1(CSF-1)/CSF-1R。其他免疫检测点包括，但不限于，KIR2DL、VISTA、HLLA2、TLIA、DNAM-1、CEACAM1、CD155，以及吲哚胺2,3-二氧酶(IDO)，如IDO1。上述任何免疫检测点分子可作为如本文所述的抗癌疗法的目标。
如本文所用，“免疫检测点调节剂”是指相对于对照载剂，改变细胞中免疫检测点蛋白(例如，如本文所述的任何一种)的活性的试剂。“调节剂”一词在本文中以最广泛的含义使用，且包括部分或完全改变由一或多种免疫检测点分子调节的信息途径的任何分子，包括由如本文所述的分子调节的信息传导途径。
于一些情况下，免疫检测点调节剂为一种检测点分子的抑制剂，其可以减少、减缓、停止，及/或阻止由该检测点分子调节的活性。“抑制剂”一词在本文中以最广泛的含义使用，并且包括部分或完全阻断、抑制，或中和由一或多种免疫检测点分子调节的信息途径的任何分子，包括由如本文所述的分子调节的调节途径。合适的抑制分子具体包括天然多胜肽、胜肽、反义寡核苷酸、小的有机分子、重组蛋白或胜肽等的拮抗剂抗体或抗体片段、片段或胺基酸序列变体。
在其他情况下，免疫检测点调节剂为检测点分子的活化剂，其增强及改善由该检测点分子调节的活性。“活化剂”一词在本文中以最广泛的含义使用，且包括增强由一或多种免疫检测点分子调节的信息途径的任何分子，包括由如本文所述的分子调节的信息传导途径。合适的活化剂包括激动性抗体或抗体片段、小的有机分子、重组蛋白质或胜肽等。于一些情况下，活化剂可为检测点蛋白质的激动性抗体，例如MEDI0562(人源化OX40激动性抗体)、MEDI6469(小鼠OX4激动剂)；以及MEDI6383(OX40激动剂)。
识别这种调节剂的方法为本领域公知的。例如，可以使候选调节剂与合适的免疫检测点目标接触，且可通过常规测定法测量由该免疫检测点调节的信息传导的强度。在候选调节剂存在下，相对于空白对照的信息传导的可检测的变化表明，候选调节剂具有免疫检测点分子的调节活性。
如本文所述的免疫检测点调节剂可为干扰免疫细胞中由免疫检测点蛋白调节的信息传导的抑制剂，例如，通过减少编码检测点蛋白的核苷酸的转录或转译，或通过抑制或阻断检测点蛋白质活性，或两者皆有。免疫检测点抑制剂的实例包括，但不限于，反义多核苷酸、干扰RNA、催化RNA、RNA-DNA嵌合体、检测点蛋白特异性适体、抗检测点蛋白抗体(例如，全长抗体或其抗原结合片段)、检测点结合小分子、检测点结合胜肽，以及其他特异性结合检测点蛋白(包括，但不限于，其同源配体的检测点结合片段，其可任选地融合到一或多个额外的结构域)的多胜肽，使得检测点调节剂与检测点蛋白质之间的相互作用导致检测点蛋白质活性或表现的减少或停止。本领域普通技术人员将理解，在某些情况下，检测点蛋白质调节剂可以拮抗或中和一种检测点蛋白质活性，而不影响另一检测点蛋白质活性。例如，用于本文某些方法中所用的期望的检测点调节剂可以是一种检测点调节剂，其破坏检测点蛋白与一同源配体之间的结合相互作用，而不影响或最小程度地影响该检测点蛋白质与另一个同源配体之间的相互作用(如果有的话)。
如本文所述的免疫检测点调节剂可将由免疫细胞中的检测点蛋白调节的信息传导的强度降低至少20％或更多，例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或以上。这种调节剂对检测点蛋白的调节活性可以通过常规方法测定。
抗检测点抗体
于一些具体实施例中，用于如本文所述的结合抗癌疗法的免疫检测点调节剂为一种特异性结合免疫检测点分子并抑制其生物活性的抗体，例如，通过干扰其与同源配体的结合。如本文所用，“抗体”一词包括，但不限于，多株、单株、人源化、嵌合、Fab片段、Fv片段、F(ab')片段，以及F(ab')2片段，以及单链抗体(scFv)、融合蛋白以及包含该抗体的抗原结合位点的其他合成蛋白质。
可以通过本领域已知的常规方法或本文公开的方法来制备抑制免疫检测点蛋白质的活性的任何抗体。
于一些具体实施例中，可通过常规融合瘤技术制备对目标抗原(免疫检测点蛋白，例如PD1、PDL1、PDL2、CTLA4以及如本文所述的任何其他物质)具有特异性的抗体。任选与载体蛋白如KLH偶联的全长目标抗原或其片段可用于免疫宿主动物以产生结合该抗原的抗体。如本文进一步所述，宿主动物的免疫途径及时间表通常与已建立的用于刺激及产生抗体的常规技术保持一致。用于生产小鼠、人源化，以及人类抗体的一般技术为本领域已知，且于本文中描述。预期包括人类的任何哺乳动物个体或其产生抗体的细胞可以***作以作为生产哺乳动物(包括人类融合瘤细胞株)的基础。通常，宿主动物以一定量的免疫原，包括如本文所述的那些，以腹膜内、肌肉内、口服、皮下、眼内，及/或皮内接种。
可以使用Kohler,B.与Milstein,C.(1975年)Nature 256:495-497所述的一般体细胞杂交技术从淋巴细胞与不朽化骨髓瘤细胞制备融合瘤，或由Buck,D.W.等人,InVitro,18:377-381(1982年)所修改的方式进行。可用的骨髓瘤细胞株包括，但不限于，X63-Ag8.653与来自美国加州圣地亚哥细胞分布中心的Salk研究所的那些骨髓瘤细胞株，可被用于杂交。通常，该技术涉及使用融合蛋白原，如聚乙二醇，或以本领域技术人员熟知的电子方式，来融合骨髓瘤细胞与淋巴细胞。融合后，将细胞与融合培养基分离，并在选择性生长培养基如次黄嘌呤-胺基蝶呤-胸腺核苷(HAT)培养基中生长，以除去未杂交的亲本细胞。如本文所述的任何补充有或不含血清的培养基可用于培养分泌单株抗体的融合瘤。作为细胞融合技术的另一替代方法为，EBV不朽化B细胞可用于产生对如本文所述的免疫检测点蛋白质具有特异性的单株抗体。如果需要，扩增并次选殖该融合瘤，并以常规免疫分析程序(例如，放射免疫分析、酵素免疫分析，或荧光免疫分析)测定上清液的抗免疫原活性。
可作为抗体来源的融合瘤包括产生能够干扰由免疫检测点分子调节的信息途径(例如，抑制性信息途径)的单株抗体的所有衍生物、亲本融合瘤的后代细胞。产生这种抗体的融合瘤可使用已知的方法在体外或体内生长。如果需要，可通过常规的免疫球蛋白纯化方法，如硫酸铵沉淀、凝胶电泳、透析、色层分析，以及超滤从培养基或体液中分离出单株抗体。如果存在不期望的活性，则可除去之，例如，通过在与固相连接的免疫原所制成的吸附剂上跑该制剂，并将所需的抗体从免疫原中洗脱或释放出来。以目标抗原或含有与在待免疫的物种中具有免疫原性的蛋白质(例如，匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白，牛甲状腺球蛋白，或使用双功能或衍生剂的大豆胰蛋白酶抑制剂，例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱胺酸残基的缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过离胺酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl，或R1N＝C＝NR，其中R与R1为不同的烷基)缀合的目标胺基酸序列的片段免疫一宿主动物，可产生一群抗体(如，单株抗体)。
如果需要，可以定序有兴趣(例如，由融合瘤产生)的抗体(单株或多株)，然后将该多核苷酸序列选殖至用于表现或增殖的载体中。编码该有兴趣的抗体的序列可以在宿主细胞中的载体内被维持，然后可扩增并冷冻该宿主细胞以供将来使用。或者，该多核苷酸序列可用于遗传操作以使抗体“人源化”或提高抗体的亲和力(亲和力成熟作用)或该抗体的其他特征。例如，若该抗体被用于人类的临床试验及治疗，则恒定区可被改造为更类似于人类的恒定区以避免免疫反应。可能需要遗传操纵抗体序列以获得对目标抗原的更大亲和力，并在抑制检测点信息传导途径方面具有更大的功效。对本领域技术人员而言显而易见的是，可对抗体进行一或多种多核苷酸的改变，且仍保持其与目标抗原的结合特异性。
于一些实例中，如本文所述的抗检测点抗体可为全人类抗体。可通过使用已经被工程化以表现特定的人类免疫球蛋白的市售动物(例如，小鼠)来获得全人类抗体。设计用于产生更理想(例如，全人类抗体)或更强健的免疫反应的转基因动物亦可用于产生人源化或人类抗体。这种技术的实例为来自Amgen公司(Fremont，加州)的XenoMouseTM以及来自Medarex公司(Princeton，纽泽西州)的HuMAb-MouseTM与TCMouseTM。在另一个替代方案中，可通过噬菌体展示技术或酵母菌技术重组抗体。参见，例如，美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号；以及第6,265,150号；以及Winter等人(1994年)Annu.Rev.Immunol.12:433-455。或者，可使用噬菌体展示技术(McCafferty等人，(1990年)Nature 348：552-553)从来自未被免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库中体外产生人类抗体与抗体片段。
可通过常规方法制备完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生F(ab')2片段，以及可通过还原F(ab')2片段的二硫键以产生Fab片段。
遗传工程改造的抗体，如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体，以及双特异性抗体可通过例如常规重组技术产生。于一实例中，可使用常规方法(例如，通过使用能够特异性结合编码单株抗体的重链与轻链的基因的寡核苷酸探针)而容易地分离并定序编码针对目标抗原特异性的单株抗体的DNA。融合瘤细胞是作为这种DNA的优选来源。一经分离，可将该DNA置于一或多个表现载体中，然后将其转染至宿主细胞内，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得重组宿主细胞中单株抗体的合成。参见，例如，PCT公开号WO 87/04462。然后可以修饰该DNA，例如，通过以编码序列取代人类重链与轻链恒定结构域代替同源鼠序列，Morrison等人(1984年)Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851，或通过共价连接到免疫球蛋白编码序列全部或部分的非免疫球蛋白多胜肽的编码序列。以这样的方式，遗传工程化抗体，例如“嵌合”或“杂合”抗体；可被制备，而具有目标抗原的结合特异性。
在其他实例中，该抗检测点抗体为人源化抗体。人源化抗体是指来自非人类(例如，鼠)抗体的抗体，其为含有来自非人类免疫球蛋白的最小序列的特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链，或其抗原结合片段。在大多数情况下，人源化抗体为人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(供体抗体)的CDR的残基替代，例如具有所需特异性、亲和力与能力的小鼠、大鼠，或兔。于一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv构架区(FR)残基被相应的非人类残基代替。此外，人源化抗体可包含不在受体抗体中，也不在进口的CDR或框架序列中发现的残基，而是被包括以进一步改进及优化抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有至少一个，通常为二个可变结构域，其中所有或基本上所有的CDR区域对应于非人类免疫球蛋白与全部或基本上所有的FR区域为人类免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗体最佳还将包含免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常为人类免疫球蛋白的恒定区或结构域(Fc)。抗体可以具有如WO 99/58572中所述的修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一或多个CDR(一个、二个、三个、四个、五个、六个)，其也被称为一或多个“衍生自”一或多个来自原抗体的CDR。人源化抗体也可能涉及亲和力成熟作用。构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见，例如，Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989年)。
于一些具体实施例中，例如检测点抑制的检测点调节性抗体可为嵌合抗体。为生产“嵌合抗体”所开发的技术为本领域熟知的。参见，例如，Morrison等人(1984年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger等人(1984年)Nature 312,604；以及Takeda等人(1984年)Nature 314:452。
于其它具体实施例中，例如抑制性抗体的检测点调节性抗体可为单链抗体片段(scFv)。通过连接编码重链可变区的核苷酸序列与编码轻链可变区的核苷酸序列，可以通过重组技术制备单链抗体。优选地，在二个可变区之间并入柔性连接符。或者，描述用于生产单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号与第4,704,692号)可适用于产生噬菌体或酵母菌scFv文库以及对免疫检测点蛋白具有特异性的scFv选殖株，其可依照常规程序从文库中鉴定出。可对阳性选殖株进行进一步筛选以鉴定出抑制免疫检测点蛋白活性者。
可以使用本领域熟知的方法对遵循本领域已知的方法及本文所述的方法所获得的抗体进行确定特征。例如，其中一种方法为鉴定抗原所结合的抗原决定位或“抗原决定位作图”。本领域已知的许多方法用于测定及确定蛋白质上的抗原决定位的位置特征，包括解决抗体-抗原复合物的结晶结构、竞争测定、基因片段表现测定，以及基于合成胜肽的测定，例如，如Harlow与Lane，Using Antibodies，a LaboratoryManual，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1999年，第11章所述者。于另一实例中，抗原决定位作图可用于确定抗体结合的序列。该抗原决定位可为线性抗原决定位，即，包含在单链胺基酸中，或由不一定包含在单链(主要结构线性序列)中的胺基酸的立体相互作用形成的构象抗原决定位。可以分离或合成不同长度(例如，至少4-6个胺基酸长)的胜肽，并用于与一抗体的结合分析。于另一个实例中，该抗体结合的抗原决定位可通过使用衍生自目标抗原序列的重迭胜肽在***筛选中确定，并以该抗体确定结合。根据该基因片段表现分析，编码目标抗原的开放阅读框架随机地或通过特异性遗传构建进行片段化，并确定抗原表现的片段与待测抗体的反应性。基因片段可以，例如，通过PCR产生，然后在放射性胺基酸存在下在体外转录并转译为蛋白质。然后通过免疫沉淀与凝胶电泳测定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。还可通过使用噬菌体颗粒表面上显示的大量随机胜肽序列库(噬菌体文库)来鉴定某些抗原决定位。或者，可以在简单结合分析中测试定义的重迭胜肽片段文库与测试抗体的结合。于另外的实施例中，可以进行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验，以及丙胺酸扫描诱变，以鉴定抗原决定位结合所需的、足够的，及/或必需的残基。例如，可以使用目标抗原的突变体进行结构域交换实验，其中免疫检测点蛋白的各个片段已被来自紧密相关但抗原性不同的蛋白质的序列替换(交换)。通过评估抗体与突变体检测点多胜肽的结合，可以评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。
或者，竞争分析可以使用已知结合相同抗原的其它抗体来进行，以确定抗体是否与其它抗体结合在相同的抗原决定位上。竞争分析为本领域技术人员所周知的。
编码如本文所述的抗检测点抗体的重链与轻链的核酸可以选殖至一个表现载体中，每个核苷酸序列可操作地连接到合适的启动子。于一实例中，编码重链与轻链的每个核苷酸序列可操作地连接到不同的启动子。或者，编码重链与轻链的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链与轻链都可由相同的启动子表现。必要时可在重链与轻链编码序列之间***内部核醣体进入位点(internal ribosomal entry site，IRES)。
于一些实例中，编码抗体两条链的核苷酸序列被选殖到二个载体中，其可以被引入至相同或不同的细胞中。当两条链在不同的细胞中表现时，每一条都可以从表现该链的宿主细胞中分离出来，并将分离的重链与轻链混合且在允许形成抗体的合适条件下培养作用。
通常，使用本领域已知的方法，可以将编码一抗体的一或所有链的核酸序列选殖到与合适的启动子可操作地连接的合适的表现载体中。例如，核苷酸序列与载体可以在合适的条件下与限制酶接触，以在每个分子上产生互补末端，其可以彼此配对并以连接酶连接在一起。或者，合成的核酸连接符可以连接到基因的末端。这些合成的连接符含有对应于载体中特定限制酶位点的核酸序列。表现载体/启动子的选择取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
多种启动子可被用于如本文所述的抗体的表现，包括，但不限于，巨细胞病毒(CMV)中间体早期启动子、一种病毒LTR，例如劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌lac UV5启动子，以及单纯疱疹病毒启动子。
亦可使用可调节的启动子。这些可调节的启动子包括使用来自大肠杆菌的lac抑制物作为转录调节剂，以调节来自带有lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录物[Brown,M.等人，Cell，49：603-612(1987年)]，使用四环霉素抑制物(tetR)的那些[Gossen,M.与Bujard,H.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551(1992年)；Yao,F.等人，Human GeneTherapy，9：1939-1950(1998年)；Shockelt,P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995年)]。其他***包括FK506二聚体、VP16，或p65，使用天竺葵醇、RU486、二苯酚莽草酮，或雷帕霉素。可诱导的***可获自Invitrogen、Clontech以及Ariad公司。
可以使用含有带有一操纵子的抑制物的可调节启动子。于一具体实施例中，来自大肠杆菌的lac抑制物可作为转录调节剂，以调节来自具有lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录[M.Brown等人，Cell，49：603-612(1987年)]；Gossen与Bujard(1992年)；[M.Gossen等人，Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992年)]将四环霉素抑制物(tetR)与转录活化剂(VP16)组合以产生tetR-哺乳动物细胞转录活化剂融合蛋白，tTa(tetR-VP16)，带有源自人类巨细胞病毒(hCMV)的主要实时早期启动子的携带有tetO的最小启动子，以产生用于控制哺乳动物细胞中的基因表现的tetR-tet操纵子***。于一具体实施例中，使用四环霉素诱导型转换。当四环霉素抑制物(tetR)单独，而非tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物，可以作为有效的反式调节剂，以调节哺乳动物细胞中的基因表现，当四环霉素操纵子适当地位于CMVIE启动子的TATA组件的下游时(Yao等人，Human Gene Therapy)。这种四环霉素诱导型转换的一个特别的优点是不需使用四环霉素抑制物-哺乳动物细胞反式活化剂或抑制物融合蛋白，其于一些情况下可能对细胞具有毒性(Gossen等人，Natl.Acad.Sci.USA，89：5547-5551(1992年)；Shockett等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：6522-6526(1995年))，以实现其可调节的作用。
此外，载体可以包含，例如，以下的一些或全部：选择性标记基因，例如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬间转染子的新霉素基因；用于高量转录的来自人类CMV的实时早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止与RNA加工信息；用于适合的附加型复制的SV40多瘤复制起始点与ColE1；内部核醣体结合位点(IRESes)、多样化多选殖位点；以及用于体外转录正义与反义RNA的T7及SP6RNA启动子。用于生产含有转基因的载体的合适的载体及方法为本领域所公知且可被使用的。
可用于实施本文所述的方法的聚腺苷酸化信息的实例包括，但不限于，人类胶原蛋白I聚腺苷酸化信息、人类胶原蛋白II聚腺苷酸化信息，以及SV40聚腺苷酸化信息。
可将包含编码任何该抗体的核酸的一或多种载体(例如，表现载体)引入合适的宿主细胞中以产生抗体。宿主细胞可以在合适的条件下培养以表现抗体或其任何多胜肽链。这些抗体或其多胜肽链可通过常规方法，例如，亲和性纯化，而由培养的细胞(例如，来自细胞或培养物上清液)回收。如果需要，抗体的多胜肽链可以在合适的条件下培养合适的一段时间，以使其产生抗体。
于一些具体实施例中，如本文所述的用于制备抗体的方法涉及编码抗检测点抗体的重链与轻链两者的重组表现载体，亦如本文所述者。可通过常规方法，例如，磷酸钙调节的转染作用，将重组表现载体引入合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。可在合适的条件下选择及培养阳性转化体宿主细胞，进而允许形成抗体的两条多胜肽链的表现，其可以从细胞或培养基中回收。必要时，从宿主细胞回收的两条链可以在允许形成抗体的合适条件下培养作用。
于一实例中，提供了二个重组表现载体，一个编码抗检测点抗体的重链，另一个编码抗检测点抗体的轻链。可通过常规方法，例如，磷酸钙调节的转染作用，将二种重组表现载体导入合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。或者，可将每个表现载体引入合适的宿主细胞中。可在允许表现抗体多胜肽链的合适条件下选择并培养阳性转化体。当二个表现载体被引入相同的宿主细胞时，其中产生的抗体可以从宿主细胞或培养基中回收。如果需要，可以从宿主细胞或培养基中回收多胜肽链，然后在允许形成抗体的合适条件下培养作用。当二个表现载体被引入不同的宿主细胞时，它们之中的每一个可以从相应的宿主细胞或相应的培养基中回收。然后可以在合适的条件下培养作用该二条多胜肽链以形成抗体。
使用标准分子生物学技术来制备重组表现载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞并从培养基中回收抗体。例如，可以通过蛋白A或蛋白G偶联基质的亲和性色层分析法分离一些抗体。
编码如本文所述的抗检测点多胜肽抗体的重链、轻链或二者的任何核酸，含有此类抗体的载体(例如，表现载体)；以及包含该载体的宿主细胞皆在本发明的范围内。
其他免疫检测点调节剂
于一些具体实施例中，检测点调节剂为干扰RNA，例如小干扰RNA(siRNA)短发夹RNA(shRNA)。于一些具体实施例中，检测点调节剂为与检测点蛋白质的mRNA结合并阻断其转译或通过RNA干扰降解mRNA的小干扰RNA (siRNA)。示例性的小干扰RNA由Hannon等人，Nature，418(6894)：244-51(2002年)；Brummelkamp等人，Science 21(2002年)；以及Sui等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA 99,5515-5520(2002年)所描述。RNA干扰(RNAi)为通过与沉默基因序列同源的双链(dsRNA)启动的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程。siRNA通常为RNA双链体，每条链的长度为20-25个(如，19-21个)碱基对。于一些具体实施例中，检测点调节剂为与检测点蛋白或其片段的核酸(例如，mRNA)互补的短发夹RNA (shRNA)。shRNA通常含有19-29个碱基对的茎干，至少4个核苷酸(nt)的环，以及选择性地在3'端有二核苷酸突出。可以通过递送编码shRNA的载体(例如，质体或病毒或细菌载体)获得个体中shRNA的表现。siRNA与shRNA可以使用本领域已知的或市售可得的方法设计(参见，例如，可获自Dharmacon与Life Technologies公司的产品)。siRNA还可包含一或多种化学修饰，例如至少改善其对目标mRNA的稳定性与结合亲和力的碱基修饰及/或键修饰。
于一些具体实施例中，检测点调节剂为与检测点蛋白的核酸(例如，mRNA)互补的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸通常为与目标核酸序列互补的单链核酸(DNA、RNA或杂交RNA-DNA分子)，例如，检测点蛋白的mRNA的一部分。通过与目标序列的结合，形成RNA-RNA、DNA-DNA或RNA-DNA双链体，从而通过阻断转录、加工、聚(A)等途径抑制目标核酸的功能或含量、添加、复制、转译或促进细胞的调节机制，例如，促进mRNA降解。于一些具体实施例中，反义寡核苷酸的长度为10至40、12至35，或15至35个碱基，或其之间的任何整数。反义寡核苷酸可以包含一或多个修饰的碱基，例如，2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤(2-胺基-dA)、5-溴dU、5-甲基dC、脱氧肌胺酸、锁定核酸(LNA)、5-硝基吲哚、2'-O-甲基碱基、羟甲基dC、2'-氟碱基。反义寡核苷酸可包含一或多个修饰的键，例如，硫代磷酸酯键。
于一些具体实施例中，检测点调节剂为与检测点蛋白质的核酸(例如，mRNA)互补并切割核酸的核糖核酸酶。核糖核酸酶是以位点特异性方式切割核酸的RNA或RNA-蛋白复合物。核糖核酸酶具有内切酶活性的特异性催化结构域。本发明的核糖核酸酶可为合成的核糖核酸酶，例如，美国专利第5,254,678号。这些合成的核糖核酸酶具有分离的杂交区域及催化区域；因此，杂交区域可被设计为识别目标序列，例如，本文所述的对应于检测点蛋白质的序列。
如本文所述的siRNA、shRNA、核糖核酸酶，以及反义寡核苷酸可与检测点蛋白或其部分的核酸(例如，mRNA)互补。应当理解的是，互补性包括100％互补性，但不一定排除于一或多个位置处的错配，导致例如，至少80％、至少90％、至少95％、至少98％，或至少99％的互补性。
如果适用，检测点调节剂可由载体表现，载体可用于将检测点调节剂递送到需要抗癌疗法的个体中。如本文所用的“载体”是能够促进将检测点调节剂(例如，shRNA、siRNA、核糖核酸酶、反义寡核苷酸、蛋白质、胜肽，或抗体)转移到个体的细胞中的任何载体，例如，表现检测点蛋白的细胞。通常，载体包括，但不限于，来自病毒或细菌来源的质体、噬菌体、病毒，以及其他载体，其已通过***或结合编码检测点调节剂的序列来操纵。病毒载体包括，但不限于，来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒；慢病毒；腺病毒；腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；***状瘤病毒；疱疹病毒；牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒。未被提及但为本领域所知的其他病毒亦可被轻易地使用。
病毒载体可基于非细胞病变真核病毒，其中非必需基因已被编码检测点调节剂的序列替代。非细胞病变病毒包括逆转录病毒(例如，慢病毒)，其生命周期涉及将基因组病毒RNA逆转录为DNA，随后原病毒整合至宿主细胞DNA。逆转录病毒已被批准用于人类基因治疗试验。最有用的为那些复制缺陷型(亦即，能够指导所需蛋白质的合成，但不能制造感染性颗粒)的那些逆转录病毒。这种遗传改变的逆转录病毒表现载体对于体内基因的高效转导具有一般效用。用于产生复制缺陷型逆转录病毒的标准方法(包括将外源性遗传物质掺入质体的步骤、带有质体的包裹细胞株的转染、通过包裹细胞株产生重组逆转录病毒、从组织培养基收集病毒颗粒，并以病毒颗粒感染目标细胞)为本领域已知的。
其他病毒载体包括腺病毒和腺相关病毒，其亦为被批准用于人类基因治疗的双链DNA病毒。腺相关病毒可被设计为复制缺陷并能够感染广泛范围的细胞类型及物种。
其他载体包括质体载体。质体载体已在本领域中被广泛地描述，并且为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版社；第4版(2012年6月15日)。示例性质体包括pBR322、pUC18、pUC19、pRC/CMV、SV40，以及pBlueScript。其他质体为本领域普通技术人员所熟知的。此外，质体可使用限制酶与连接反应订制设计，以去除并添加DNA的特异性片段，例如，编码免疫检测点调节剂的序列。
于一些具体实施例中，检测点调节剂核酸序列可在异源调控区域的控制下，例如，异源启动子。启动子可为例如普遍存在的启动子，例如，CMV启动子、ActB启动子，或泛素B启动子。激活子也可为组织特异性激活子或合成激活子。启动子为本领域所公知的并为市售可得(参见，例如，可得自InvivoGen公司的产品)。
于一些具体实施例中，检测点调节剂可为非抗体胜肽或蛋白质。胜肽或蛋白质可包含干扰检测点信息传导的胺基酸序列，例如，通过与所涉及的检测点蛋白质的天然配体竞争。蛋白质与胜肽可使用本领域已知的任何方法设计，例如，通过筛选蛋白质或胜肽的文库来结合检测点蛋白质或抑制检测点蛋白质与配体的结合。于一些实例中，非抗体胜肽或蛋白质调节剂可为可溶性受体，例如，Fc-融合的可溶性受体。
于一些具体实施例中，检测点调节剂可为检测点蛋白本身的片段或变体，例如，结合其同源配体但不传输相应信息的片段。这种类型的检测点调节剂可为显性负调节剂。
于一些具体实施例中，检测点调节剂为小分子，例如，通常具有小于5,000kDa分子量的小的有机分子。合适的小分子包括结合免疫检测点分子或其片段的小分子，并可通过，例如，筛选大量化合物的方法来鉴定(Beck-Sickinger&Weber(2001年)CombinationalStrategies in Biology and Chemistry(John Wiley&Sons出版社，Chichester，萨塞克斯，英国)；通过核磁共振的结构-活性关系(Shuker等人(1996年)“Discovering high-affinity ligands for proteins:SAR by NMR.Science274:1531-1534)；编码的自组装化学文库(Melkko等人(2004年)“Encoded self-assembling chemical libraries”，NatureBiotechnol.22：568-574)；DNA模板化学(Gartner等人(2004年)“DNA-tem plated organicsynthesis and selection of a library of macrocycles.Science 305：1601-1605)；动态组合化学(Ramstrom&Lehn(2002年)“Drug discovery by dynamic combinatoriallibraries”，Nature Rev.Drug Discov.1：26-36)；联系(Arkin&Wells(2004年)“Small-molecule modulators of protein-protein interactions：progressing to thedream.Nature Rev.Drug Discov.3：301-317)；以及快速筛选(Muckenschnabel等人(2004年)“SpeedScreen：label-free liquid chromatography-mass spectrometry－basedhigh－throughput screening for the discovery of orphan protein ligands.”Anal.Biochem.324:241-249)。通常，小分子对奈米莫耳范围内的免疫检测点蛋白质具有解离常数。
含有检测点调节剂的医药组合物
任何免疫检测点调节剂，例如，抗体、编码核酸或核酸组、含有这些的载体、siRNA、反义RNA，以及携带这些的载体，以及小分子调节剂，可与医药上可接受的载剂(赋形剂)混合，以形成用于治疗目标疾病(例如，癌症)的医药组合物。“可接受”是指载剂必须与组合物的活性成分(优选地，能够稳定活性成分)兼容，且对待治疗的个体无害。医药上可接受的赋形剂(载剂)，包括本领域熟知的缓冲液。参见，例如，Remington：The Science andPractice of Pharmacy第20版(2000年)Lippincott Williams and Wilkins出版社，K.E.Hoover编辑。
用于本发明方法的医药组合物可包含冻干制剂或水溶液形式的医药上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。(Remington：The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000年)Lippincott Williams and Wilkins出版社，K.E.Hoover编辑)。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂所使用的剂量及浓度对受体无毒，并可包含缓冲液，例如，磷酸盐、柠檬酸盐，以及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸与甲硫胺酸；防腐剂(例如，十八烷基二甲基芐基氯化铵；六氯化铵；苯扎氯铵、芐索氯铵；苯酚，丁基或芐醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多胜肽；蛋白质，如，血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，如甘胺酸、谷胺酰胺、天冬酰胺、组胺酸、精胺酸或离胺酸；单醣、二糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚醣；螯合剂，如EDTA；醣类，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖，或山梨糖醇；盐形成的抗衡离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；及/或非离子界面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
于一些实例中，如本文所述的医药组合物包括含有可通过本领域已知的方法制备的抗体(或编码核酸)的脂质体，如Epstein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985年)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980年)；以及美国专利第4,485,045号以及第4,544,545号。具有增强的循环时间的脂质体被描述于美国专利第5,013,556号。特别有用的脂质体可通过含有磷脂酰胆碱、胆固醇以及PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物的反相蒸发法产生。脂质体通过规定的孔径的过滤器挤出，以产生具有所需直径的脂质体。
抗体或编码核酸也可包埋在微胶囊中，该微胶囊通过，例如，凝聚技术或界面聚合分别制备，例如，羟甲基纤维素或明胶微胶囊以及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，在胶体药物递送***(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、奈米颗粒，以及奈米胶囊)或在大量乳液中。这些技术为本领域已知的，参见，例如，Remington，The Science and Practice ofPharmacy第20版，Mack出版社(2000年)。
在其它实例中，如本文所述的医药组合物可以缓释形式配制。持续释放制剂的合适实例包括，含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质为成形制品，例如，薄膜或微胶囊形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷胺酸与7乙基-L-谷胺酸盐的共聚物、无法降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如，LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物与醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)、蔗糖乙酸异丁酸酯，以及聚-D(-)-3-羟基丁酸。
用于体内给药的医药组合物必须为无菌的。例如，通过无菌过滤膜过滤而容易被实现。治疗性抗体组合物通常放置在具有无菌入口的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的瓶塞的静脉内溶液袋或小瓶。
如本文所述的医药组合物可以为单位剂型，例如，用于口服、肠胃外或直肠给药的片剂、丸剂、胶囊、粉末、颗粒、溶液或悬浮液或栓剂，或通过吸入或吹入给药。
为了制备固体组合物，如片剂，可将主要活性成分与药物载剂混合，例如，常规压片成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶，以及其它医药稀释剂，例如水，以形成含有本发明化合物或其无毒的医药上可接受的盐的均匀混合物的固体预制组合物。当将这些预制组合物称为均匀时，是指活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地分成同样有效的单位剂型，例如片剂、丸剂，以及胶囊剂。然后将该固体预制组合物细分为上述类型的单位剂量，其含有0.1至约500mg本发明的活性成分。新组合物的片剂或丸剂可以被包衣或以其它方式复合，以提供具有延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包含内部剂量与外部剂量组分，后者是在前者上的封套的形式。二个组分可以被肠溶层分开，其用于抵抗在胃中的崩解，并允许内部组分完整地进入十二指肠或被延迟释放。有许多材料可被用于这种肠溶层或涂层，这些材料包括许多聚合酸以及聚合酸与虫胶、鲸蜡醇以及乙酸纤维素等材料的混合物。
合适的接***性剂特别包括非离子试剂，例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇(例如，TweenTM 20,40,60,80或85)以及其它脱水山梨糖醇(例如，SpanTM 20,40,60,80或85)。具有接***性剂的组合物将方便地包含0.05至5％的接***性剂，并可在0.1至2.5％的间。应当理解的是，如果需要，可以加入其它成分，例如，甘露醇或其它医药上可接受的载剂。
合适的乳剂可使用市售的脂肪乳剂制备，例如，IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM，以及LipiphysanTM。活性成分可溶解在预混合乳液组合物中，或可溶解在油中(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)，且在混合一磷脂质(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)及水时形成乳液。应当理解的是，可以加入其它成分，例如，甘油或葡萄糖，以调节乳液的张力。合适的乳液通常含有高达20％的油，例如，5至20％。
乳液组合物可为通过将抗体与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油及水)混合而制成。
用于吸入或吹入的医药组合物包括在药学上可接受的水性或有机溶剂，或其混合物与粉末中的溶液及悬浮液。液体或固体组合物可含有如上所述的合适的医药上可接受的赋形剂。于一些具体实施例中，组合物通过口服或鼻呼吸途径施用以获得局部或全身效应。
较佳的无菌医药上可接受的溶剂中的组合物可通过使用气体进行雾化。喷雾溶液可直接从喷雾装置呼吸，或雾化装置可附着至面罩、帐篷或间歇正压呼吸机上。溶液、悬浮液或粉末组合物可从以适当的方式递送制剂的装置施用，较佳为口服或鼻腔给药。
(b)豆科植物的发酵组合物
发酵为一种代谢过程，其中例如酵母菌及细菌等微生物在厌氧条件下将碳水化合物转化为酸类(例如，有机酸，如乳酸)、醇类(例如，乙醇)，及/或其它代谢物。用于如本文所述的结合抗癌疗法的发酵组合物为一或多种豆科植物通过一或多种合适的微生物，例如，共生微生物菌丛体，发酵的产物。这样的发酵组合物可包含多种代谢物，其衍生自通过一或多种合适的微生物发酵合适的起始材料，例如，豆科植物，其部分(例如，叶片、果实、种子等)或其萃取物，通过，例如，常规发酵方法。合适的微生物包括，但不限于，酵母菌及乳酸杆菌。参见，例如，美国专利公开第US20060251748号，其参考的相关公开内容是通过引用方式并入本文，为了本文参考的目的或主题。于一些具体实施例中，如本文所述的发酵组合物可包含一或多种代谢物，例如，乳酸、乙酸，以及3-氨基异丁酸。例如，发酵组合物可包含约5-20％重量的乳酸(例如5-10％、10-20％、5-15％，或15-20％重量)。另外或再者，发酵组合物可包含小于5％重量的乙酸、3-氨基异丁酸或两者(例如，1-5％、0.5-5％、1-3％、0.5-3％或3-5％重量)。
示例性豆科植物包括，但不限于，豆类、豌豆、苜蓿、红三叶草、蚕豆、野菜豆，以及豇豆。于一些具体实施例中，用于本文公开的结合抗癌疗法的发酵组合物为发酵大豆组合物，其包含通过一或多种合适的微生物，如酵母菌及乳酸杆菌发酵大豆或其萃取物(例如，水萃取物)而产生的多个代谢物。如本领域众所周知的，这样的代谢物可通过另外的方法产生，其也在本发明的范围内。
如本文所述的任何发酵组合物，例如，发酵大豆组合物，可通过一或多种合适的微生物，例如本文所述的那些，在允许发酵豆科植物的组分以产生其代谢物的合适条件下，通过发酵豆科植物、其部分，或其萃取物来制备。例如，发酵组合物可在适当的条件下(例如，合适的温度，例如，20-45℃(例如，20-25℃、20-30℃、25-30℃、25-35℃、30-45℃，或30-40℃)经过一段合适的时间(例如，2-10天，例如2-5天、4-8天，以及5-10天)，通过培养包含一部分豆科植物的水萃取物的培养基中的一或多种合适的微生物来制备。用于制备发酵组合物的一或多种微生物可为共生的，其指生活在一起且彼此受益的不同生物体。然后可以收集培养物的上清液、过滤除去固体组分并灭菌。当需要时，可通过常规方法(例如，透析)浓缩上清液，以产生浓缩的发酵组合物溶液。
于一实例中，该发酵组合物为发酵大豆组合物，其可通过常规方法获得大豆的水萃取物来制备，以至少一种乳酸杆菌以及至少一种酵母菌属的混合物发酵含水萃取物，在合适的条件下经过合适的时间以形成发酵液体、收集、过滤，以及灭菌发酵液体，并从灭菌及发酵液体中除去水分，以形成浓缩的发酵大豆组合物。
于一些实例中，该发酵组合物为液体形式。于其它实例中，该发酵组合物可为干燥形式，例如粉末，其可通过常规方法(例如，喷雾干燥或冷冻干燥)制备。
用于制备该发酵组合物的方法亦被描述于例如，美国专利号第6,685,973号、第6,855,350号、第6,733,801号、以及美国专利申请公开第US20120058104号中，其各自的相关公开内容是通过引用方式并入本文，为了本文参考的目的或主题。
根据本文提供的描述，如本文所述的任何发酵组合物可以配制为医药组合物。
在其它具体实施例中，发酵组合物可配制为健康食品、保健品或医疗食品，其可为任何种类的液体以及固体/半固体材料，以改善癌症患者的免疫力，包括已接受或正在接受以免疫检测点调节剂治疗者。保健食品可为食品(例如，以茶为基础的饮料、果汁、软性饮料、咖啡、牛奶、果冻、饼干、谷物、巧克力、燕麦棒、草药萃取物、乳制品(例如，冰淇淋及优格))、食物/膳食补充剂，或营养制剂。
本文所述的保健食品、营养食品，及/或医疗食品，含有任何发酵组合物例如发酵大豆组合物，可包含一或多种可食用的载剂，其赋予本文所述的发酵组合物的一或多种益处。可食用的载剂的实例包括，淀粉、环糊精、麦芽糖糊精、甲基纤维素、碳甲氧基纤维素、黄原胶，及其水溶液。其他实例包括，溶剂、分散介质、涂料、接***性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂、凝胶、黏合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料，如本领域普通技术人员已知的类似材料及其组合。
于一些实例中，该发酵组合物可为营养组合物，其是指含有来自食物来源的组分的组合物，且除了在食物中发现的基本营养价值之外，还具有额外的健康益处。如本文所述的营养组合物包含发酵组合物以及增进发酵组合物的良好健康及/或增强稳定性与生物活性的其它成分及补充剂。
营养组合物的作用可以是快速的或/及短期的，或者可帮助实现如本文所述的长期健康目标，例如，提高个体对抗癌症的免疫力，并增强免疫检测点调节剂的抗癌作用。营养组合物可包含在可食用材料中，例如，作为膳食补充剂或医药制剂。作为膳食补充剂，可以包括额外的营养物质，例如，维生素、矿物质或胺基酸。组合物还可为饮料或食品，例如茶、软性饮料、果汁、牛奶、咖啡、饼干、谷物、巧克力，以及燕麦棒。如果需要，可以通过加入甜味剂，如山梨糖醇、麦芽糖醇、氢化葡萄糖浆，以及氢化淀粉水解产物、高果糖玉米糖浆、蔗糖、甜菜糖、果胶，或三氯蔗糖来使组合物变甜。
于一些具体实施例中，如本文所述的发酵组合物，例如发酵大豆组合物，可以配制成医疗食品。医疗食品是一种食用产品，配制成肠内消耗或给药。这样的食品通常在医师的监督下用于目标疾病的特定饮食管理，例如本文所述的那些。于某些情况下，对于需要治疗的患者(例如，患有癌症的人类患者)，这种医疗食品组合物被特别配制及加工(与天然状态中使用的天然存在的食品相反)。于一些实例中，如本文所述的医疗食品组合物并非由医生简单地推荐作为整体饮食的一部分，用于管理症状或降低疾病或病症的风险。
包含如本文所述的发酵组合物的如本文所述的任何医疗食品组合物可为液体溶液的形式；溶于合适的液体中或合适的乳液中的粉末、棒、圆片、悬浮液，如下所述者。至少一种载剂，其可为天然存在或合成的(非天然存在的)，将赋予该发酵组合物一或多个益处，例如，稳定性、生物利用度，及/或生物活性。如本文所述的任何载剂可用于制备医疗食品组合物。于一些具体实施例中，该医疗食品组合物还可包含一或多种选自以下的其它成分，该群组包括，但不限于，天然香料、人造香料、主要微量及超微量矿物质、矿物质、维生素、燕麦、坚果、香料、牛奶、蛋、盐、面粉、卵磷脂、黄原胶，及/或甜味剂。医疗食品组合物可放置在合适的容器中，其可以进一步包含至少额外的治疗剂，例如本文所述的那些。
本文公开的发酵组合物可为溶液的形式。例如，发酵组合物可在缓冲液、溶剂、稀释剂、惰性载剂、油或奶油等介质中被提供。于一些实例中，该发酵组合物存在于选择性地含有非水的共溶剂的水溶液中，例如醇类。发酵组合物亦可为粉末、糊剂、胶状物、胶囊或片剂的形式。乳糖及玉米淀粉通常作为胶囊及片剂的载剂的稀释剂。通常加入润滑剂，如硬脂酸镁，以形成片剂。
该发酵组合物可配制为适合的给药途径，例如，口服给药。对于口服给药，该组合物可以采用例如，通过常规方法，通过可接受的赋形剂，如结合剂(例如，预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮，或羟丙基甲基纤维素)制备的片剂或胶囊剂的形式；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素，或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石，或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或淀粉羟乙酸钠)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可通过本领域熟知的方法进行包覆。还包括棒状形式以及其他咀嚼用的配方。
于一些实例中，发酵组合物可为液体形式，且一或多种可食用载剂可为溶剂或分散介质，其包含，但不限于，乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)、脂质(例如，甘油三酯、植物油、脂质体)或其组合。可保持适当的流动性，例如，通过使用包衣，例如，卵磷脂；通过在载剂，例如液体多元醇或脂质中的分散体维持所需的粒度；通过使用接***性剂，例如羟丙基纤维素；或其组合。在许多情况下，建议包括等渗剂，例如糖、氯化钠或其组合。
用于口服给药的液体制剂可为例如，溶液、糖浆或悬浮液的形式，或者其可以干燥产品形式呈现，在使用前以水或其它合适的载剂构成。于一具体实施例中，该液体制剂可配制为用于果汁的给药。这种液体制剂可通过常规方法，以医药上可接受的添加剂，如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物，或氢化食用脂肪)制备；乳化剂(例如，卵磷脂或***胶)；非水性载剂(例如，杏仁油、油状酯、乙醇，或分馏的植物油)；以及防腐剂(例如，甲基或丙基对羟基苯甲酸酯、苯甲酸酯，或山梨酸酯)。
于一些具体实施例中，如本文所述的发酵组合物与免疫检测点调节剂可配制为一种组合物。
II.用于治疗癌症的试剂盒
本发明还提供了用于使用如本文所述的任何免疫检测点调节剂的治疗癌症的试剂盒，且本文也描述了任何该发酵组合物(例如，发酵大豆组合物)。这样的试剂盒可包括一或多个包含免疫检测点调节剂与发酵组合物的容器。例如，该试剂盒可包括抗PD1抗体或其编码的核酸，以及发酵大豆组合物。
于一些具体实施例中，该试剂盒可包含用于根据如本文所述的任何方法的指示说明。该包括的指示说明可包含，例如，根据本文所述的任何方法，免疫检测点调节剂与发酵组合物的施用的描述、用于治疗、推迟发作或减轻增殖性疾病，例如癌症(例如，结肠癌或肺癌)。该试剂盒还可包含基于鉴定该个体是否具有该疾病来选择适合于治疗该个体的描述。在其他具体实施例中，该指示说明包含对具有疾病风险的个体施用本发明的一或多种药剂的描述。
关于使用免疫检测点调节剂如抗检测点抗体与发酵组合物(例如，发酵大豆组合物)组合的指示说明，通常包括关于预期治疗的剂量、给药方法，以及给药途径的信息。该容器可为单位剂量、批量包装(例如，多剂量包装)或次单位剂量。在本发明的试剂盒中提供的指示说明通常是在标签或包装插页(例如，试剂盒中包括的纸张)上的书面指示，但是机器可读取的指示(例如，磁性或光学存储盘上携带的指示)也是可以接受的。
卷标或包装插页可以指示组合物用于治疗、缓解及/或推迟癌症的发作。可以提供说明以实施如本文所述的任何方法。
本发明的试剂盒置于合适的包装中。合适的包装包括，但不限于，小瓶、瓶子、罐、软性包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)及其类似物。还包括用于与特定装置组合使用的包装，例如，吸入器、鼻部给药装置(例如，雾化器)或例如微型帮浦的输注装置。试剂盒可具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的瓶塞的小瓶)。容器还可以具有无菌入口(例如，容器可以是静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的瓶塞的小瓶)。
试剂盒可选择性地提供附加组件，例如，缓冲液以及解释信息。通常，该试剂盒包含在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。于一些具体实施例中，本发明提供了包含上述试剂盒的内容物的制品。
结合疗法
本文提供了使用如本文所述的免疫检测点调节剂与发酵组合物的组合的结合癌症疗法。本文所用的“结合疗法”一词包括以顺序方式施用这些药剂(例如，免疫检测点调节剂与发酵组合物)，即其中每种治疗剂在不同时间施用，以及施用这些治疗剂，或至少二种药剂，基本上同时进行。每种试剂的顺序，或基本上同时给药，可受任何适当途径的影响，包括，但不限于，口服途径、静脉内途径、肌肉内、皮下途径，以及通过黏膜组织的直接吸收。药剂可以通过相同的途径或不同的途径来施用。例如，可以口服给予第一药剂(例如，发酵组合物)，而以静脉内施用第二药剂(例如，抗PD1抗体等抗检测点抗体)。此外，选择的组合剂可通过静脉内注射施用，而组合的其它药剂可以口服给药。或者，例如，可以通过静脉内或皮下注射施用二种或更多种药剂。
如本文所用，“顺序”一词是指，除非另有说明，其特征在于规则的顺序或次序，例如，如果给药方案包括施用免疫检测点调节剂，如抗体，以及发酵组合物，则连续给药方案可以包括在施用发酵组合物之前、同时、基本上同时，或之后施用免疫检测点调节剂，但两种试剂将以规则的顺序或次序施用。除非另有规定，“分开”一词是指将另一个分开。“同时”一词是指，除非另有说明，同时发生或完成，即本发明的试剂同时施用。“基本上同时”一词是指在相互之间的几分钟内(例如，彼此之间的10分钟内)施用试剂，并且意图包括联合给药以及连续施用，但若给药是连续的，则其在时间上分离只有很短的时间(例如，医生要分开管理两种化合物的时间)。如本文所用，并行施用以及基本上同时给药可互换使用。顺序给药是指时间上分离施用本文所述的试剂。
结合疗法还可包括如本文所述的药剂(例如，免疫检测点调节剂与发酵的组合物)进一步与其它生物活性成分(例如，不同的抗肿瘤剂)以及非药物治疗(例如，手术或放射治疗)组合的施用。在结合疗法进一步包含放射治疗的情况下，放射治疗可以在任何合适的时间进行，只要从治疗剂的组合与放射治疗的共同作用获得有益的效果即可。例如，在适当的情况下，当放射治疗暂时从治疗剂的给药中除去时，可能达到几天甚至数周，仍可达到该有益效果。
应当理解的是，免疫检测点调节剂与如本文所述的发酵组合物的任何组合可以治疗癌症的任何顺序使用。可基于许多因素来选择本文所述的组合，该因素包括，但不限于，抑制或预防癌症进展的有效性、减轻组合的另一种药物的副作用的有效性，或缓解癌症相关症状的有效性。例如，如本文所述的结合疗法可减少与组合的每个单独成员相关联的任何副作用。下列表格中提供了一些示例。例如，该发酵组合物可以在涉及免疫检测点调节剂(例如，抗PD1抗体)的治疗过程中每天使用。
如本文所述的免疫检测点调节剂与发酵组合物的任何组合可用于治疗癌症。本文所用的“癌症”一词是指由肿瘤或恶性细胞群、增殖或转移调节的医学病症，包括固体癌症及非固体癌症。癌症的实例包括，但不限于，肺癌、肾癌、胃癌、乳腺癌、脑癌、***癌、肝细胞癌、胰腺癌、子***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、黑素瘤、头颈癌、结肠癌、白血病、淋巴瘤、皮肤癌、胃癌、食管癌、骨髓瘤、直肠癌、骨癌、子宫癌、***癌，以及血液恶性肿瘤。
为了实施本文公开的方法，可以将有效量的如本文所述的抗癌剂组合施用于需要经由合适途径进行治疗的个体(例如，人类)，合适途径，例如，静脉内给药，例如，通过一段时间的推注或连续输注，通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。用于液体制剂的市售喷雾器，包括喷射式喷雾器以及超音波雾化器对于给药是有用的。液体制剂可以直接雾化，且冻干粉末可以在重建后雾化。或者，如本文所述的免疫检测点调节剂(例如，抗体)及/或发酵的组合物可使用氟碳制剂与一计量剂量吸入器雾化，或作为冻干及研磨的粉末吸入。
“个体”、“个人”以及“患者”等词在本文中可互换使用，而且是指被评估用于治疗及/或被治疗的哺乳动物。个体可为人类，但亦包括其他哺乳动物，特别是可用作人类疾病实验室模型的那些哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔、狗等。
需要治疗的人类个体可能为具有目标疾病/病症(例如，增殖性疾病(例如，癌症))的风险，或怀疑患有该疾病或病症的人类患者。可以通过常规体检，例如，实验室检查、器官功能测试、计算机断层扫描，或超声波来鉴定具有目标疾病或病症的个体。怀疑有任何此类目标疾病/病症的个体可能会显示一或多种疾病/病症的症状。患有疾病/障碍风险的个体可以是具有该疾病/病症的一或多种危险因素的个体。如本文所述的方法及组合物可用于治疗任何增殖性疾病或病症。于一些具体实施例中，增殖性疾病为癌症。于一些具体实施例中，该癌症的特征为实体肿瘤。
如本文所用，“有效量”是指对个体赋予治疗效果所需的每种活性剂(例如，免疫检测点调节剂，例如，抗PD1抗体或发酵组合物)的量，不论是单独或组合地与一或多种其它活性剂施用。于一些具体实施例中，治疗效果为抑制癌细胞生长及/或减少肿瘤负担。于一些具体实施例中，发酵组合物的量对增强免疫检测点调节剂的抗癌作用是有效的。在其它具体实施例中，发酵组合物的量对增强个体对癌细胞的免疫力是有效的。于一些具体实施例中，治疗效果为预防或抑制肿瘤生长。于一些具体实施例中，治疗效果为与一种或多种药物/药物相关的副作用的降低。例如，可能由抑制PD-1途径(例如，疲劳、末梢水肿、发冷、发热、腹泻、恶心、腹痛、咳嗽、呼吸困难、皮疹、瘙痒、白斑病、关节痛、肌痛、背痛、头痛、头晕，及/或增加的天门冬胺酸胺基转移酶(AST))的副作用可通过与另一种药剂(例如，免疫检测点调节剂与如本文所述的发酵组合物)的共同治疗而减轻。
确定调节剂组合的量是否达到治疗效果对于本领域技术人员将是显而易见的。有效量的变化，如本领域技术人员所认知，取决于所治疗的具体病症、病症的严重程度、个体患者参数，包括年龄、身体状况、体型大小、性别及体重、治疗的持续时间、合并治疗的性质(若有的话)、具体的施用途径，以及医疗专业人员知识及专长内所知的其他因素。这些因素为本领域普通技术人员所熟知的，且可以不多于常规实验的方式来解决。通常较佳使用单个组分或其组合的最大剂量，亦即，根据健康医学判断的最高安全剂量。
经验上的考虑，如半衰期，通常会有助于剂量的确定。例如，可使用与人类免疫***兼容的抗体(例如，人源化抗体或全人类抗体)来延长抗体的半衰期，并防止抗体被宿主的免疫***攻击。可在治疗过程中确定并调整施用频率，且通常，但不是必需，基于目标疾病/病症的治疗及/或抑制及/或改善及/或延迟。或者，抗体的持续连续释放制剂可能是合适的。用于实现持续释放的各种制剂及装置为本领域已知的。
于一实例中，免疫检测点调节剂，如本文所述的抗体的剂量可以在施用一或多种调节剂的个体中依照经验来确定。给予个体增量的剂量的调节剂。为了评估拮抗剂的功效，可以遵循疾病/病症的指标。
通常，为了施用如本文所述的任何抗体，初始候选剂量可为约2mg/kg。为了本发明的目的，典型的日剂量可为0.1μg/kg至3μg/kg至30μg/kg至300μg/kg至3mg/kg、至30mg/kg至100mg/kg以上，取决于上述因素。对于几天或更长时间的反复给药，取决于病症，治疗持续到发生所需的症状抑制，或达到足够的治疗程度以减轻目标疾病或病症或其症状为止。示例性的给药方案包含施用约2mg/kg的初始剂量，随后每周维持剂量为约1mg/kg的抗体，或每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。然而，其他剂量方案可能是有用的，这取决于从事者希望实现的药物动力学衰变的模式。例如，预期每周四次给药。于一些具体实施例中，给药范围为约3μg/mg至约2mg/kg(例如，约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg，以及约2mg/kg)。于一些具体实施例中，给药频率为每周一次、每2周、每4周、每5周、每6周、每7周、每8周、每9周或每10周一次；或每月一次、每2个月、或每3个月或更长时间。通过常规技术与测定法容易监测该疗法的进展。给药方案(包括使用的抗体)可随时间变化。
于一些具体实施例中，对于正常体重的成年患者，可施用约0.3至5.00mg/kg的剂量。具体的剂量方案，亦即剂量、时间及重复次数，将取决于具体个体及该个体的病史，以及各个药剂的性质(例如，药剂的半衰期，以及在本技术中众所周知的其它因素)。
为了本发明的目的，如本文所述的抗体的合适剂量将取决于所使用的特异性抗体、抗体及/或非抗体胜肽(或其组合物)，疾病/病症的类型以及严重程度、是否为预防或治疗目的施用抗体、先前的治疗、患者的临床病史及对拮抗剂的反应，以及主治医师的判断。通常，临床医师将施用抗体，直到达到期望结果的剂量。于一些具体实施例中，期望的结果为血栓形成的减少。确定剂量是否导致所需结果的方法对于本领域技术人员将是显而易见的。免疫检测点调节剂及/或发酵组合物的施用可以是连续的或间歇的，这取决于，例如，接受者的生理状况、施用的目的为治疗性或是预防性的，以及熟练的从事者已知的其它因素。抗体的施用可以在预选的时间段内基本连续的，或者可为一系列间隔的剂量，例如，在目标疾病或病症发展之前、期间或之后。
如本文所用，“治疗”一词是指将包括一或多种活性剂的组合物应用或施用于一个体，该个体患有目标疾病或病症、疾病/病症的症状，或对该疾病/病症的倾向，且其目的为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、增进，或影响疾病、疾病症状，或对该疾病或病症的倾向。
缓解目标疾病/病症包括推迟疾病的发展或进展，或降低疾病严重程度。缓解疾病并不一定需要治疗结果。如其中所使用的，“延迟”目标疾病或病症的发展意指推迟、阻止、缓慢、妨碍、稳定，及/或推迟疾病进展。这样的延迟可为不同的时间长度，这取决于疾病的历史及/或被治疗的个体。一种“延迟”或减轻疾病发展，或推迟疾病发病的方法，为减少在给定时间框架内发展一或多种疾病症状的可能性，及/或在给定的时间框架内减少症状程度的方法，与未使用该方法者进行比较。这种比较通常基于临床研究，使用足以给出统计学显著结果的多个个体。
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现及/或随后的进展。可使用本领域熟知的标准临床技术检测并评估疾病的发展。然而，发展亦指可能无法检测的进展。为了本发明的目的，发展或进展是指该症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发及发病。如本文所用，目标疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作及/或复发。
于一些具体实施例中，如本文所述的免疫检测点调节剂与发酵组合物的组合，以足以将一或多种目标信息传导途径的活性体内抑制至少20％(例如，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高)的量，施用于需要治疗的个体。在其它具体实施例中，该组合以将一或多种目标抗原的活性程度降低至少20％(例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或以上)的有效量施用。
于一些具体实施例中，将如本文所述的发酵组合物给予已经接受或正在接受涉及使用免疫检测点调节剂(例如，抑制剂)的抗癌疗法的个体(例如，人类癌症患者)，如本文所述者。
医学领域的普通技术人员已知的常规方法，可用于根据待治疗的疾病的类型或疾病的部位，而向个体施用医药组合物。该组合物亦可通过其它常规途径施用，例如，口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部性、直肠、鼻腔、口腔、***，或经由植入的储库给药。本文所用的“肠胃外”一词包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、脑内，以及颅内注射或输注技术。此外，其可通过可注射的贮库途径施用于个体，例如使用1、3或6个月储存罐注射或可生物降解的材料及方法。于一些实例中，该医药组合物在眼内或玻璃体内施用。
可注射的组合物可含有各种载剂，如植物油、二甲基乳酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉荳蔻酸异丙酯、乙醇，以及多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇及其类似物)。对于静脉注射，可通过滴注法施用水溶性抗体，由此输入含有抗体及生理学上可接受的赋形剂的医药制剂。生理上可接受的赋形剂可包括，例如，5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液，或其它合适的赋形剂。可将肌肉注射制剂，例如，抗体的合适的可溶性盐形式的无菌制剂溶解，并以医药赋形剂，例如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液施用。
于一具体实施例中，通过位点特异性或目标局部递送技术施用抗体。位点特异性或目标局部递送技术的实例包括，该抗体的各种可植入式储库来源或局部递送导管，例如输注导管、留置导管或针导管、合成移植物、外膜包裹物、分流器和支架或其它可植入装置，位点特异性载剂，直接注射，或直接应用。参见，例如，PCT公开号WO 00/53211以及美国专利第5,981,568号。
还可使用含有反义多核苷酸、表现载体或次基因组多核苷酸的治疗组合物的目标递送。受体调节的DNA递送技术被描述于，例如，Findeis等人，Trends Biotechnol.(1993年)11：202；Chiou等人，Gene Therapeutics：Methods And Applications Of Direct GeneTransfer(J.A.Wolff编辑)(1994年)；Wu等人，J.Biol.Chem.(1988年)263：621；Wu等人，J.Biol.Chem.(1994年)269：542；Zenke等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990年)87：3655；Wu等人，J.Biol.Chem.(1991年)266：338。
在基因治疗方案中，含有多核苷酸(例如，编码如本文所述的抗体的那些)的治疗组合物在约100ng至约200mg的DNA范围内施用，以进行局部给药。于一些具体实施例中，亦可在基因治疗方案中使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg，以及约20μg至约100μg的DNA，或更多的浓度范围。
如本文所述的治疗性多核苷酸及多胜肽可使用基因递送载剂递送。基因递送载剂可为病毒或非病毒来源的(通常，参见，Jolly，Cancer Gene Therapy(1994年)1:51；Kimura，Human Gene Therapy(1994年)5：845；Connelly，Human Gene Therapy(1995年)1：185；以及Kaplitt，Nature Genetics(1994年)6：148)。可使用内源哺乳动物或异源启动子及/或增强子来诱导这些编码序列的表现。编码序列的表现可为组成型或调节型。
用于递送所需多核苷酸的病毒载体与在所需细胞中的表现为本领域熟知的。示例性的基于病毒的载剂包括，但不限于，重组逆转录病毒(参见，例如，PCT公开号WO 90/07936；WO 94/03622；WO 93/25698；WO 93/25234；WO 93/11230；WO 93/10218；WO 91/02805；美国专利第5,219,740号以及第4,777,127号；英国专利第2,200,651号，以及欧洲专利第0 345 242号)，基于甲病毒的载体(例如，辛德毕斯病毒载体、塞尔比奇森林病毒(ATCCVR-67；ATCC VR-1247)、罗氏河流病毒(ATCCVR-373；ATCC VR-1246)，以及委内瑞兰马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR1249；ATCC VR-532)，以及腺相关病毒(AAV)载体(参见，例如，PCT公开号WO 94/12649、WO 93/03769；WO93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984，以及WO 95/00655)。亦可使用与灭活的腺病毒相连的DNA的施用，如Curiel，Hum.Gene Ther.(1992年)3：147所述者。
亦可使用非病毒递送载剂及方法，包括，但不限于，与单独杀死的腺病毒连接或未连接的聚阳离子缩合DNA(参见，例如，Curiel，Hum.Gene Ther.(1992年)3：147)；配体连接的DNA(参见，例如，Wu，J.Biol.Chem.(1989年)264：16985)；真核细胞递送载剂细胞(参见，例如，美国专利第5,814,482号；PCT公开号WO 95/07994；WO 96/17072；WO 95/30763，以及WO 97/42338)以及核电荷中和或与细胞膜融合。亦可使用裸DNA。示例性的裸DNA引入方法如PCT公开号WO 90/11092以及美国专利第5,580,859号所述。可作为基因递送载剂的脂质体则被描述于美国专利第5,422,120号；PCT公开号WO 95/13796；WO94/23697；WO 91/14445；以及欧洲专利第0524968号中。额外的方法被描述于Philip，Mol.Cell.Biol.(1994年)14：2411，以及Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.(1994年)91：1581。
目标疾病/病症的治疗效果可通过本领域公知的方法进行评估。
一般技术
除非另有说明，本发明的实践将使用在本领域技术范围内的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学，以及免疫学的常规技术。在文献中完全解释了这样的技术，例如Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989年)冷泉港出版社；寡核苷酸合成(M.J.Gait编辑，1984年)；Methods in MolecularBiology，Humana出版社；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑，1998年)Academic出版社；动物细胞培养(R.I.Freshney编辑，1987年)；细胞与组织培养介绍(J.P.Mather与P.E.Roberts，1998年)Plenum出版社；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths，以及D.G.Newell编辑，1993-8年)J.Wiley and Sons出版社；酵素学方法(Academic出版社公司)；Handbook ofExperimental Immunology(D.M.Weir与C.C.Blackwell编辑)；哺乳动物细胞的基因转移载体(J.M.Miller与M.P.Calos编辑，1987年)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel，等人编辑，1987年)；PCR：聚合酶连锁反应(Mullis等人编辑，1994年)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑，1991年)；Short Protocolsin Molecular Biology(Wiley and Sons出版社，1999年)；免疫生物学(C.A.Janeway与P.Travers，1997年)；抗体(P.Finch，1997年)；抗体：一种实用的方法(D.Catty编辑，IRL出版社，1988-1989年)；单株抗体：一种实用的方法(P.Shepherd与C.Dean编辑，OxfordUniversity出版社，2000年)；使用抗体：实验室手册(E.Harlow与D.Lan(冷泉港实验室出版社，1999年)；The Antibodies(M.Zanetti与J.D.Capra编辑，Harwood Academic出版社，1995年)。
没有进一步的阐述，相信本领域技术人员可基于上述描述最大限度地利用本发明。因此，本文所提供的具体实施例将被解释为仅仅是说明性的，而非以任何方式限制本发明其余的部分。本文所引用的所有出版物是通过引用方式并入，为了本文参考的目的或主题。
实施例1：通过口服给药以抗PD1抗体及组合物X治疗结肠癌
组合物X是如下所制备的发酵大豆组合物。通过常规方法制备大豆的水萃取物。在允许通过微生物发酵大豆萃取物的条件下，在含有大豆水萃取物的培养基中培养乳酸杆菌及酵母菌的混合物。收集发酵液、过滤除去固体物质、灭菌。将如此制备的液体溶液浓缩，以产生组合物X(液体形式)。每毫克组合物X含有约2.7g的大豆发酵液。
在结肠癌小鼠模型中研究了组合物X与抗PD1抗体对结肠癌的结合疗法的有效性。简言之，Balb/c小鼠在第0天皮下注射2×105个结肠癌CT26细胞。于第6天时，当来自移植的结肠癌细胞增长到约60-70mm3时，以腹膜内注射10mg/kg抗PD1抗体。于第8、10以及12天时，以相同的剂量重复注射抗PD1抗体。于第17天时牺牲小鼠，以用于分析。于第0至第15天期间，某些小鼠每日被喂养稀释的组合物X(1％、5％或15％)，而其他小鼠则被喂食载剂对照。图1A中提供了该示例性实验设计的示意图。
或者，Balb/c小鼠每天喂养组合物X共两周(14天；从第14天开始)。然后将小鼠以皮下注射2×105个结肠癌CT26细胞(在第0天)。于癌细胞移植后5天(第5天)，通过腹膜内注射以10mg/kg抗PD1抗体处理小鼠，于第7天、第9天，以及第11天重复上述步骤。于第15天牺牲小鼠，以用于分析。
如下表1、表2，以及图2及图3所示，组合物X以剂量依赖性方式显著增强了抗PD1抗体在抑制肿瘤生长中的功效，如在该实施例中使用的结肠癌小鼠模型中所示。表1、图2A，以及图3A显示从图1A所示的实验设计之后的研究所获得的结果。表2、图2B，以及图3B显示从图1B所示的实验设计之后的研究所获得的结果。
表1.组合物X与抗PD1抗体对结肠癌小鼠模型中肿瘤生长的影响
组别(n＝6) <![CDATA[平均肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)]]> 肿瘤生长抑制率(％)
载剂 570.4 -
抗PD1抗体 485.8 14.8
1％组合物X+抗PD1抗体 344.7 39.6
5％组合物X+抗PD1抗体 304.8 46.6
15％组合物X+抗PD1抗体 256.5 55.0
表2.组合物X与抗PD1抗体对结肠癌小鼠模型中肿瘤生长的影响
Figure BDA0001815537610000521
在第15天时，牺牲小鼠，并以荧光标记的CD4、CD8、CD62L，以及CD44抗体染色每只小鼠的脾细胞，以流式细胞仪分析。进行三色流式细胞仪分析，以鉴定初始T细胞(定义为CD62L+CD44低)以及效应记忆T细胞(定义为CD62L-CD44高)。
如图4所示，作为抗PD1抗体与组合物X的结合疗法的结果，脾脏CD8+以及CD4+细胞中效应记忆T细胞的百分比显著增加，而与对照组相比，初始T细胞减少。
实施例2：通过口服给药以抗PD1抗体与组合物X治疗肺癌
组合物X是以如上述实施例1所述的方法制备。在肺癌小鼠模型中研究了组合物X与抗PD1抗体对肺癌结合疗法的有效性，如下所述。
C57BL/6小鼠在第0天时注射5×106个肺癌LL2细胞。从第4天开始，某些小鼠每天给予稀释的组合物X(7.5％、15％或22.5％组合物)一次，其余的小鼠以载剂对照处理。自第4天开始，当肿瘤生长到体积约60mm3时，每隔一天以腹膜内注射10mg/kg抗PD1单株抗体(第4、6、8、10、12天)一次。于第19天时牺牲小鼠以进行分析。图5提供了该示例性实验设计的示意图。
如下表3、图6及图7所示，组合物X以剂量依赖性方式显著增强了抗PD1抗体在肺癌小鼠模型中观察到的抑制肿瘤生长的功效。组合物X在抑制肿瘤生长中与抗PD1抗体协同作用。
表3.组合物X与抗PD1抗体对肺癌小鼠模型中肿瘤生长的影响
组别(n＝7或8) <![CDATA[平均肿瘤体积(mm<sup>3</sup>)]]> 肿瘤生长抑制率(％)
载剂 1551.9 -
抗PD1 1354.4 12.7
15％组合物X 1179.5 24.0
7.5％组合物X+抗PD1 921.0 40.7
15％组合物X+抗PD1 755.3 51.3
通过如本文所述的流式细胞仪分析浸润到肿瘤组织中的CD4+与CD8+T细胞。观察到在肿瘤浸润的CD4+与CD8+T细胞中，作为结合疗法的结果，效应记忆T细胞的百分比显著增加，而与载剂对照组相比，其初始T细胞则减少。图8。
根据上述实施例1中描述的方法，分析以载剂对照或抗PD1抗体与组合物X的结合治疗的小鼠的脾T细胞特性。如图9所示，作为抗PD1抗体与组合物X的结合疗法的结果，脾脏CD8+与CD4+细胞中效应记忆T细胞的百分比显著增加，而与对照组相比，其初始T细胞则减少。
此外，分析肿瘤组织中的PD1/PD-L1表现特征。以抗PD-1抗体单独或与组合物X结合治疗的小鼠中，肿瘤浸润性PD-1高CD4+T细胞显示出类似的降低趋势。组合物X单独减少肿瘤浸润性PD-1高CD8+T细胞，其与抗PD-1抗体效果相似(甚至优于抗-PD-1抗体)。结合疗法组的肿瘤细胞中PD-L1表现减少，如同抗PD-1抗体组的效果(或甚至优于抗PD-1抗体组)。图10。
MDSC(骨髓来源抑制细胞)的特征为Gr-1(+)CD11b(+)F4/80(+)细胞。这些细胞在肿瘤发展中具有重要的作用，对肿瘤免疫治疗具有负面影响。组合物X与抗PD-1抗体的结合疗法显著降低MDSC的百分比，表示该结合疗法在癌症治疗中是有效的。图11。
实施例3：通过静脉内注射以抗PD1抗体与组合物X治疗结肠癌
组合物X按照上述实施例1中所述的方法制备。以下在结肠癌小鼠模型中研究了以静脉内施用组合物X与抗PD1抗体在结肠癌上的结合疗法的有效性。
Balb/c小鼠在第0天以皮下注射2×105个结肠癌CT26细胞。于第5天时，当来自移植结肠癌细胞的肿瘤达到平均大小为50mm3时，以腹膜内注射小鼠10mg/kg抗PD1抗体。在第7、9、11以及13天以相同的剂量重复注射抗PD1抗体。于第16天牺牲小鼠以用于分析。某些小鼠在第4、7、9、11、13以及15天以静脉内给予5％稀释的组合物X，而其他的小鼠则没有。有一群小鼠自第3天起以口服给予15％组合物X(10ml/kg，每天)，直到实验结束时，同时注射或不注射抗PD1抗体以用于比较。图12提供了该示例性实验设计的示意图。
如下表4、图13以及图14所示，组合物X的静脉内给药显著提高了抗PD1抗体在抑制肿瘤生长方面，与组合物X的口服给药存在相似的功效。再次地，组合物X在抑制肿瘤生长中与抗PD1抗体协同作用。
表4.静脉内组合物X与抗PD1抗体对结肠癌小鼠模型中肿瘤生长的影响
Figure BDA0001815537610000561
通过流式细胞仪分析脾脏与肿瘤部位的免疫细胞分布及细胞激素表现(图15-22)。再次地，效应/记忆CD4+与CD8+T细胞的百分比由于通过口服或通过静脉内施用组合物X，而在肿瘤部位(图15)以及脾脏(图16)显著增加。此外，在两种组合中，PD1高CD4与CD8T细胞的百分比低于对照组，而PD-L1+肿瘤细胞的百分比也是如此(图17)。类似地，肿瘤中NK细胞(特征为CD3e-CD49b+)的百分比显著较高(图18)，而MDSC(特征为Gr-1+CD11b+F4/80+)的表现量在以口服及静脉内施用组合物X与抗PD1抗体的组合的组别中则显著较低(图19)。
此外，测量肿瘤部位(图20-21)以及血清中的细胞激素表现特性(图22)。观察到能够增强T及NK细胞功能(IL-2、IFN-γ、IL-15、IL-4)的细胞激素以及促发炎的细胞激素(IL-5、IL-6、TNF-α)分别为在肿瘤部位及血清中都有显著的增加。
实施例4：以抗PD1抗体与组合物X治疗结肠癌改变大肠中的微生物菌丛
按照图1A所示的步骤，将抗PD1抗体与组合物X给予移植有结肠癌CT26细胞的Balb/c小鼠。治疗后，在第17天切除处理的小鼠的近端结肠组织，其中小鼠被牺牲，并以次世代定序技术进行微生物分析。结果显示，与没有任何处理的带有结肠癌的小鼠相比，以抗PD1抗体/组合物X结合处理带有结肠癌的小鼠时，几种细菌物种被改变。示例性细菌种类列于表5中。
表5.组合物X与抗PD1抗体对改变带有结肠癌的小鼠中的微生物菌丛的影响
Figure BDA0001815537610000571
此外，瘤胃球菌属细菌含量与肿瘤的大小密切相关，如图23所示，其中X轴代表瘤胃球菌属细菌的含量，Y轴表示肿瘤的大小。当肿瘤大小较大时，亦即载剂组肿瘤，具有大体积肿瘤的小鼠的大肠中的瘤胃球菌属细菌的含量(载剂对照组的小鼠)比具有小体积肿瘤的小鼠的高得多(由组合物X/抗-PD1抗体结合处理的小鼠)。由于肠道微生物菌丛被认为会影响结肠癌(参见，例如，Gao等人，Frontiers in Microbiology，6:20，2015年)，由本研究获得的结果显示，组合物X及/或抗PD1抗体可能通过，尤其是，调节以这种结合治疗的个体的肠道微生物菌丛，而有效地治疗结肠癌。
其他具体实施例
本说明书中公开的所有特征可以任何组合形式来进行组合。本说明书中公开的每个特征可以由作用于相同、等同或相似目的的替代特征所代替。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅仅为等效或类似特征的通用系列的示例。
从上面的描述中，本领域技术人员可以轻易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离本发明的精神及范围的情况下，可以对本发明进行各种改变与修改，以使其适应各种用途及条件。因此，其它具体实施例也在申请专利范围内。
等同
虽然本文已描述并阐明了几个发明具体实施例，但是本领域普通技术人员将容易想出用于执行功能及/或获得结果的各种其他手段及/或结构及/或所述的一或多个优点，且这些变化及/或修改中的每一个被认为包含在本文所述的发明具体实施例的范围内。更一般地，本领域技术人员将容易理解到，如本文所述的所有参数、尺寸、材料及配置目的为示例性的，且实际参数、尺寸、材料及/或配置将取决于具体应用或应用使用本发明的教示。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定如本文所述的特定发明具体实施例的许多等同物。因此，应当理解的是，前述具体实施例仅以示例的方式呈现，且在所附的申请专利范围及其等同物的范围内，发明具体实施例可以不同于特定描述及请求保护的方式实施。本发明的发明具体实施例涉及如本文所述的每个单独特征、***、制品、材料、试剂盒及/或方法。此外，如果这些特征、***、物品、材料、试剂盒及/或方法不相互矛盾，则二个或更多个这样的特征、***、制品、材料、试剂盒及/或方法的任何组合都包括在本发明的发明范围内。
本文定义及使用的所有定义应理解为掌控字典定义、通过引用并入的文献中的定义，及/或定义术语的普通含义。
本文中公开的所有参考文献、专利及专利申请均通过引用方式并入本文，并涉及每个被引用的主题，在某些情况下其可包含整个文件。
在本说明书及申请专利范围中使用的定冠词“一”以及“一个”，除非明确指出相反意思，否则应理解为“至少一个”。
在本说明书及申请专利范围中使用的词组“及/或”应被理解为是指所结合的组件中的“一个或二个”，亦即，在某些情况下该些组件结合存在，而在另一情况下则分开存在。以“及/或”列出的多个组件应该以相同的方式来解释，亦即，“一个或多个”组件如此地连接。除了以“及/或”子句特别标识的组件外，其他组件可选择性地存在，不论与这些特别标识的组件相关或不相关。因此，作为非限制性的示例，当结合诸如“包含”的开放式语言使用时，对“A及/或B”的引用可以于一具体实施例中仅指A(选择性地包括除了B之外的组件)；在另一具体实施例中，则仅指B(选择性地包括除了A之外的组件)；在另一具体实施例中，则指A与B(选择性地包括其它组件)；等等。
如本说明书及申请专利范围中所使用的，“或”应理解为具有与上述定义的“及/或”相同的含义。例如，当在一列表中分离项目时，“或”或“及/或”应被解释为包括的，亦即，包括数量或组件列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及选择性地，额外未列出的项目。只有明确指示出相反的意思，例如“只有一个”或“确切为一个”，或，当用于申请专利范围中，“由...组成”时，将指的是仅列出之一或多个组件。一般而言，当前面放有排他性术语，例如“任一”、“之一”、“只有之一”或“确切为一个”时，本文所用的“或”一词应仅被解释为表示排他性的替代品(亦即，“一个或另一个，但不是二者”)。当“主要由...组成”用于申请专利范围中时，应具有其在专利法领域所使用的普通含义。
如本说明书及申请专利范围中所使用的，词组“至少一个”对于一个或多个组件的列表，应当被理解为是指从组件列表中的任何一个或多个组件选择出的至少一个组件，但不一定包括特定列在组件列表中的各个及每个组件中的至少一个，且并不排除组件列表中的组件的任何组合。该定义还允许选择性地存在除了在词组“至少一个”所指的组件列表中特定标识的组件之外的组件，无论是与这些特定标识的组件相关或不相关的组件。因此，作为非限制性的实例，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”或等同地“A及/或B中的至少一个”)，于一具体实施例中，可以指至少一个，选择性地包括多于一个，A，而没有B的存在(且任选地包括除了B之外的组件)；在另一个具体实施例中，指至少一个，选择性地包括多于一个，B，而没有A的存在(且选择性地包括除了A之外的组件)；在另一具体实施例中，指至少一个，选择性地包括多于一个，A，以及至少一个，选择性地包括多于一个，B(且选择性地包括其它组件)；等等。
还应当理解的是，除非明确地指出相反者，否则在本文所要求的任何包括多于一个步骤或作用的方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于在所述的该方法的步骤或动作的顺序。

Claims (17)

1.一种免疫检测点调节剂以及发酵组合物的组合用于制备治疗癌症的药物或试剂盒的用途，其中该发酵组合物包含多种代谢物，该多种代谢物是通过由微生物发酵大豆或其萃取物所生成，该微生物包含酵母菌及乳酸杆菌；其中该免疫检测点调节剂为PD-1抗体，且其中该发酵组合物连同该免疫检测点调节剂提供增强的抗癌效果，相较于该免疫检测点调节剂或该发酵组合物的单独的抗癌效果而言。
2.如权利要求1的用途，其中该发酵组合物是通过口服给药或静脉内给药而施用。
3.如权利要求1的用途，其中该发酵组合物为液体形式。
4.如权利要求1的用途，其中该多种代谢物包含乳酸、乙酸，及/或3-氨基异丁酸的组合。
5.如权利要求4的用途，其中该发酵组合物包含5-20重量％的乳酸、小于5重量％的乙酸，以及小于5重量％的3-氨基异丁酸。
6.如权利要求1的用途，其中该发酵组合物是通过以下方法制备，该方法包含：
(i)在允许该大豆或其萃取物发酵的条件下，在包含该大豆或其萃取物的培养基中培养该酵母及该乳酸杆菌；以及
(ii)收集从步骤(i)获得的发酵组合物。
7.如权利要求6的用途，其中该制备方法进一步包含过滤从步骤(ii)获得的发酵组合物、对该发酵组合物灭菌，及/或浓缩该发酵组合物。
8.如权利要求1的用途，其中该发酵组合物是在施用该免疫检测点调节剂之前、之后或同时施用。
9.如权利要求1的用途，其中该抗体是人类抗体、人源化抗体，或嵌合抗体。
10.如权利要求1至9中任一项的用途，其中该癌症选自：结肠癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、皮肤癌、脑癌、卵巢癌、肾癌、胃癌、头颈癌、食道癌、膀胱癌、直肠癌、骨癌、子宫癌、***癌，以及血液恶性肿瘤。
11.一种试剂盒或医药组合物，包含：
(i)免疫检测点调节剂；以及
(ii)发酵组合物，
其中该发酵组合物包含多种代谢物，该多种代谢物是通过由微生物发酵大豆或其萃取物所生成，该微生物包含酵母菌及乳酸杆菌；其中该免疫检测点调节剂为PD-1抗体，且其中该发酵组合物连同该免疫检测点调节剂提供增强的抗癌效果，相较于该免疫检测点调节剂或该发酵组合物的单独的抗癌效果而言。
12.如权利要求11的试剂盒或医药组合物，其中该抗体是人类抗体、人源化抗体，或嵌合抗体。
13.如权利要求11的试剂盒或医药组合物，其中该发酵组合物是液体形式。
14.如权利要求11的试剂盒或医药组合物，其中该多种代谢物包含乳酸、乙酸，及/或3-氨基异丁酸的组合。
15.如权利要求11的试剂盒或医药组合物，其中该发酵组合物包含5-20重量％的乳酸、小于5重量％的乙酸，以及小于5重量％的3-氨基异丁酸。
16.如权利要求11的试剂盒或医药组合物，其中该发酵组合物是通过以下方法制备，该方法包含：
(i)在允许该大豆或其萃取物发酵的条件下，在包含该大豆或其萃取物的培养基中培养该酵母及该乳酸杆菌；以及
(ii)收集从步骤(i)获得的发酵组合物。
17.如权利要求16的试剂盒或医药组合物，其中该制备方法进一步包含过滤从步骤(ii)获得的发酵组合物、对该发酵组合物灭菌，及/或浓缩该发酵组合物。
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