KR20180095565A

KR20180095565A - 피리도[1,2-a]피리미돈 유사체, 이의 결정형, 이의 중간체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20180095565A
Application number: KR1020187019466A
Authority: KR
Inventors: 타오 위; 닝 리; 링웨이 콩; 페이페이 지앙; 용 왕; 지민 롱; 창쥔 왕; 펑 구아; 종비안 리; 젱 왕; 지아후 우; 청더 우
Original assignee: 치아타이 티안큉 파마수티컬 그룹 주식회사
Priority date: 2015-12-16
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2018-08-27
Also published as: EP3395817A1; US20180319799A1; HK1256044A1; AU2016369835A1; RU2753696C2; RU2018125475A; JP7037483B2; JP2018537497A; EP3395817B1; CA3008689A1; PL3395817T3; EP3395817A4; ZA201804007B; WO2017101847A1; US10479789B2; CN108602815B; AU2016369835B2; CN108602815A; DK3395817T3; ES2908498T3

Abstract

본 발명은 피리도[1,2-A]피리미돈 유사체의 결정형, 이의 제조방법 및 이의 중간체에 관한 것이다.
[화합물 1]

Description

피리도[1,2-A]피리미돈 유사체, 이의 결정형, 이의 중간체 및 이의 제조방법{PYRIDO[1,2-A]PYRIMIDONE ANALOG, CRYSTAL FORM THEREOF, INTERMEDIATE THEREOF AND PREPARATION METHOD THEREFOR}

본 발명은 피리도[1,2-A]피리미돈 유사체의 결정형, 이의 제조방법 및 이의 중간체에 관한 것이다.

PI3K 경로는 돌연변이가 가장 흔히 발생하고, 세포 증식, 활성화 및 신호 증폭을 유발할 수 있는 인간 암 세포의 부위이다.

PI3K 키나아제(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3Ks)는 지질 키나아제 계열에 속하며, 포스파티딜이노시톨의 이노시톨 고리의 3'-OH 말단을 인산화할 수 있다. PI3K는 조절 서브유닛 p85 또는 p101과 촉매 서브유닛 p110으로 구성된 지질 키나아제이며, 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트(PIP2)의 인산화를 촉진하여 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리포스페이트(PIP3)를 형성함으로써 후속의 Akt 등을 활성화시킴으로써 세포 증식, 생존 및 대사 등에 중요한 역할을 한다. 따라서, 포스파티딜이노시톨-3-키나아제의 저해는 PI3K 경로에 영향을 미칠 수 있으며, 암세포의 증식과 활성화를 억제할 수 있다.

종양 억제 유전자 PTEN(10번 염색체에서 포스파타아제 및 긴장 동족체 결실)은 PIP3을 탈 인산화시켜 PIP2를 생성하고, 따라서, PI3K/Akt 신호 전달 경로의 음성 조절(negative regulation)을 달성하여 세포 증식을 억제하고, 세포 사멸을 촉진한다. PI3K 유전자 돌연변이와 증식의 빈번한 발생과 더불어 암에서의 PTEN의 소실 등은 PI3K가 종양 형성에 밀접하게 전달된다는 것을 나타낸다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 화합물 1의 제조방법을 제공한다:

[화합물 1]

식 중에서,

X는 Cl 또는 Br로부터 선택되고,

알칼리 C는 피리딘, 2,6-루티딘, Et₃N, 4-DMAP, LiOH, Cs₂CO₃, 또는 K₂CO₃으로부터 선택되고;

용매 c는 피리딘, 디클로로메탄, 톨루엔, 아세토니트릴, 아세톤, DMF 또는 THF로부터 선택되고;

화합물 7 대 화합물 8의 몰 비는 1:1-3, 바람직하게는 1:1.2~1.6이고;

화합물 7 내 알칼리 C의 몰 비는 1:1~3이다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 7 대 화합물 8의 몰 비는 1:1.2~1.6이다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 화합물 1의 제조는 하기 단계를 포함한다:

식 중에서,

알칼리 A는 탄산칼륨, 탄산나트륨, 탄산세슘, 수산화칼륨 또는 수산화나트륨으로부터 선택되고;

용매 a는 DMF, DMSO, 또는 NMP로부터 선택된다.

여기서, 2-디메틸아미노에틸 클로라이드 또는 2-디메틸아미노에틸 브로마이드는 2-디메틸아미노에틸 클로라이드 염산염 또는 2-디메틸아미노에틸 브로마이드 염산염과 같이, 이들의 염의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 5 대 2-디메틸아미노에틸 클로라이드(또는 이의 염산염) 또는 2-디메틸아미노에틸 브로마이드(또는 이의 염산염)의 몰 비는 1:1~2이다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 5 대 2-디메틸아미노에틸 클로라이드(또는 이의 염산염) 또는 2-디메틸아미노에틸 브로마이드(또는 이의 염산염)의 몰 비는 1:1.1~1.3이다.

식 중에서,

알칼리 B는 탄산칼륨, 탄산나트륨, 수산화바륨, 인산칼륨, 탄산세슘, 불화칼륨, 불화세슘, 수산화나트륨, t-부톡시화칼륨, t-부톡시화나트륨, 아세트산칼륨 또는 아세트산나트륨으로부터 선택되고;

용매 b는 1,4-디옥산, DMSO, THF, 1,4-디옥산/물 또는 THF/물로부터 선택되고;

용매 b 내에서 1,4-디옥산 또는 THF 대 물의 부피 비는 3~6:1, 바람직하게는 5:1이고;

촉매는 Pd(dppf)Cl₂, 또는 Pd(PPh₃)₄로부터 선택된다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 용매 b 내에서 1,4-디옥산 또는 THF 대 물의 부피 비는 5:1이다.

상기 반응식에서, 화합물 6을 생성시키기 위한 화합물 5와 2-디메틸아미노에틸 클로라이드 염산염의 반응은 바람직하게는 알칼리 A 및 용매 a의 존재 하에서 수행되고, 식 중에서, 알칼리 A는 탄산칼륨, 탄산나트륨, 탄산세슘, 수산화칼륨 또는 수산화나트륨으로부터 선택되고; 용매 a는 DMF, DMSO, 또는 NMP로부터 선택된다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 5 대 2-디메틸아미노에틸 클로라이드 염산염의 몰 비는 1:1~2이다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 5 대 2-디메틸아미노에틸 클로라이드 염산염의 몰 비는 1:1.1~1.3이다.

상기 반응식에서, 화합물 7을 생성시키기 위한 화합물 6과 2-메톡시-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리딘-3-아민의 반응은 바람직하게는 알칼리 B, 용매 b 및 촉매의 존재 하에서 수행되고, 식 중에서, 알칼리 B는 탄산칼륨, 탄산나트륨, 수산화바륨, 인산칼륨, 탄산세슘, 불화칼륨, 불화세슘, 수산화나트륨, t-부톡시화칼륨, t-부톡시화나트륨, 아세트산칼륨 또는 아세트산나트륨으로부터 선택되고; 용매 b는 1,4-디옥산, DMSO, THF, 1,4-디옥산/물 또는 THF/물로부터 선택되고; 여기서, 용매 b 내에서 1,4-디옥산 또는 THF 대 물의 부피 비는 3~6:1, 바람직하게는 5:1이고; 촉매는 Pd(dppf)Cl₂ 또는 Pd(PPh₃)₄로부터 선택된다.

상기 반응식에서, 화합물 1을 생성하기 위한 화합물 7과 2-클로로-4-플루오로벤젠설포닐 클로라이드의 반응은 바람직하게는 알칼리 C 및 용매 c의 존재 하에서 수행되고, 식 중에서, 알칼리 C는 피리딘, 2,6-루티딘, Et₃N, 4-DMAP, LiOH, Cs₂CO₃ 또는 K₂CO₃으로부터 선택되고; 용매 c는 피리딘, 디클로로메탄, 톨루엔, 아세토니트릴, 아세톤, DMF 또는 THF로부터 선택되고; 화합물 7 대 2-클로로-4-플루오로벤젠설포닐 클로라이드의 몰 비는 1:1-3이고, 화합물 7 대 알칼리 C의 몰 비는 1:1~3이다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 7 대 2-클로로-4-플루오로벤젠설포닐 클로라이드의 몰 비는 1:1.2~1.6이다.

본 발명은 또한 화합물 1의 제조를 위한 중간체로서, 하기 화학식의 화합물을 제공한다:

,

.

본 발명은 X-선 회절 패턴(XRD)에서 2θ= 7.947°, 10.073°, 14.531°, 19.187°, 21.237°, 24.055°, 25.497°; 전형적으로 2θ= 7.947°, 10.073°, 11.970°, 13.468°, 14.531°, 15.911°, 19.187°, 21.237°, 24.055°, 25.497°; 보다 전형적으로 2θ= 7.947°, 10.073°, 11.970°, 13.468°, 14.531°, 15.911°, 19.187°, 19.561°, 21.237°, 23.446°, 24.055°, 25.497°, 27.074°에서 회절 피크를 갖는 것이 특징인, 화합물 1의 결정형 IX를 제공한다.

본 발명은 도 25에 나타낸 바와 같은 XRPD 패턴을 갖는 화합물 1의 결정형 IX를 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 1의 상기 결정형 IX의 XRPD 패턴 분석 데이터를 표 1에 나타내었다.

표 1. 화합물 1의 결정형 IX의 XRPD 패턴 분석 데이터

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 1의 상기 결정형 IX의 DSC 패턴은 도 26에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 1의 상기 결정형 IX의 TGA 패턴은 도 27에 나타낸 바와 같다.

화합물 1의 결정형 IX는 비-용매화물 결정 또는 용매화물 결정의 형태로 제공될 수 있다. 상기 용매화물은 상응하는 화합물과 유기용매 또는/및 물에 의해 형성된 용매화물을 의미한다.

본 발명은 결정형 IX의 결정질 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서 결정형 IX는 결정질 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 80 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상으로 존재한다.

본 발명은 치료적 유효량의 결정형 IX 또는 결정형 IX의 결정질 조성물을 포함하는 결정형 IX의 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 매질을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 2를 제공한다:

[화합물 2]

.

본 발명은 X-선 회절 패턴(XRD)에서 2θ= 10.154°, 12.285°, 14.511°, 16.328°, 24.311°, 26.188°; 전형적으로 2θ= 7.270°, 10.154°, 12.285°, 13.206°, 14.511°, 16.328°, 24.311°, 26.188°, 27.724°; 보다 전형적으로 2θ= 7.270°, 10.154°, 12.285°, 13.206°, 14.511°, 16.328°, 19.008°, 20.702°, 21.259°, 24.311°, 26.188°, 27.724°에서 회절 피크를 갖는 것이 특징인, 화합물 2의 결정형 I를 제공한다.

본 발명은 도 1에 나타낸 바와 같은 XRPD 패턴을 갖는 화합물 2의 결정형 I를 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 I의 XRPD 패턴 분석 데이터를 표 2에 나타내었다.

표 2. 화합물 2의 결정형 I의 XRPD 패턴 분석 데이터

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 I의 DSC 패턴은 도 2에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 I의 TGA 패턴은 도 3에 나타내었다.

화합물 2의 결정형 I는 비-용매화물 결정 또는 용매화물 결정의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 상기 용매화물은 상응하는 화합물과 유기용매 또는/및 물에 의해 형성된 용매화물을 의미한다.

본 발명은 결정형 I의 결정질 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서 결정형 I는 결정질 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 80 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상으로 존재한다.

본 발명은 치료적 유효량의 결정형 I 또는 결정형 I의 결정질 조성물을 포함하는 결정형 I의 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 매질을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.

본 발명은 X-선 회절 패턴(XRD)에서 2θ= 6.524°, 7.782°, 13.895°, 15.495°, 17.487°, 19.322°; 전형적으로 2θ= 6.524°, 7.782°, 11.628°, 13.895°, 15.495°, 17.487°, 19.322°, 20.962°, 23.269°; 보다 전형적으로 2θ= 6.524°, 7.782°, 11.628°, 13.895°, 15.495°, 17.487°, 19.322°, 20.962°, 23.269°, 24.257°, 26.009°, 31.533°에서 회절 피크를 갖는 것이 특징인, 화합물 2의 결정형 II를 제공한다.

본 발명은 도 4에 나타낸 바와 같은 XRPD 패턴을 갖는 화합물 2의 결정형 II를 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 II의 XRPD 패턴 분석 데이터를 표 3에 나타내었다.

표 3. 화합물 2의 결정형 II의 XRPD 패턴 분석 데이터

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 II의 DSC 패턴은 도 5에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 II의 TGA 패턴은 도 6에 나타낸 바와 같다.

화합물 2의 결정형 II는 비-용매화물 결정 또는 용매화물 결정의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 상기 용매화물은 상응하는 화합물과 유기용매 또는/및 물에 의해 형성된 용매화물을 의미한다.

본 발명은 결정형 II의 결정질 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서 결정형 II는 결정질 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 80 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상으로 존재한다.

본 발명은 치료적 유효량의 결정형 II 또는 결정형 II의 결정질 조성물을 포함하는 결정형 II의 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 매질을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.

본 발명은 X-선 회절 패턴(XRD)에서 2θ= 6.979°, 9.939°, 14.392°, 16.107°, 20.982°, 25.990°; 전형적으로 2θ= 6.187°, 6.979°, 9.939°, 11.910°, 14.392°, 16.107°, 20.982°, 22.755°, 25.990°; 보다 전형적으로 2θ= 6.187°, 6.979°, 9.939°, 11.910°, 13.148°, 14.392°, 16.107°, 20.982°, 22.755°, 23.975°, 25.990°, 29.006°에서 회절 피크를 갖는 것이 특징인, 화합물 2의 결정형 III를 제공한다.

본 발명은 도 7에 나타낸 바와 같은 XRPD 패턴을 갖는 화합물 2의 결정형 III를 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 III의 XRPD 패턴 분석 데이터를 표 4에 나타내었다.

표 4. 화합물 2의 결정형 III의 XRPD 패턴 분석 데이터

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 III의 DSC 패턴은 도 8에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 III의 TGA 패턴은 도 9에 나타낸 바와 같다.

화합물 2의 결정형 III는 비-용매화물 결정 또는 용매화물 결정의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 상기 용매화물은 상응하는 화합물과 유기용매 또는/및 물에 의해 형성된 용매화물을 의미한다.

본 발명은 결정형 III의 결정질 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서 결정형 III는 결정질 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 80 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상으로 존재한다.

본 발명은 치료적 유효량의 결정형 III 또는 결정형 III의 결정질 조성물을 포함하는 결정형 III의 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 매질을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.

본 발명은 X-선 회절 패턴(XRD)에서 2θ= 6.388°, 7.278°, 11.076°, 15.454°, 21.256°; 전형적으로 2θ= 6.388°, 7.278°, 11.076°, 12.102°, 15.454°, 16.091°, 18.912°, 21.256°; 보다 전형적으로 2θ= 6.388°, 7.278°, 11.076°, 12.102°, 15.103°, 15.454°, 16.091°, 18.912°, 21.256°, 21.846°에서 회절 피크를 갖는 것이 특징인, 화합물 2의 결정형 IV를 제공한다.

본 발명은 도 10에 나타낸 바와 같은 XRPD 패턴을 갖는 화합물 2의 결정형 IV를 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 IV의 XRPD 패턴 분석 데이터를 표 5에 나타내었다.

표 5. 화합물 2의 결정형 IV의 XRPD 패턴 분석 데이터

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 IV의 DSC 패턴은 도 11에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 IV의 TGA 패턴은 도 12에 나타낸 바와 같다.

화합물 2의 결정형 IV는 비-용매화물 결정 또는 용매화물 결정의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 상기 용매화물은 상응하는 화합물과 유기용매 또는/및 물에 의해 형성된 용매화물을 의미한다.

본 발명은 결정형 IV의 결정질 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서 결정형 IV는 결정질 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 80 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상으로 존재한다.

본 발명은 치료적 유효량의 결정형 IV 또는 결정형 IV의 결정질 조성물을 포함하는 결정형 IV의 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 매질을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.

본 발명은 X-선 회절 패턴(XRD)에서 2θ= 7.116°, 14.137°, 15.911°, 22.223°, 24.610°; 전형적으로 2θ= 7.116°, 14.137°, 15.911°, 21.691°, 22.223°, 24.213°, 24.610°, 28.987°에서 회절 피크를 갖는 것이 특징인, 화합물 2의 결정형 V를 제공한다.

본 발명은 도 13에 나타낸 바와 같은 XRPD 패턴을 갖는 화합물 2의 결정형 V를 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 V의 XRPD 패턴 분석 데이터를 표 6에 나타내었다.

표 6. 화합물 2의 결정형 V의 XRPD 패턴 분석 데이터

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 V의 DSC 패턴은 도 14에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 V의 TGA 패턴은 도 15에 나타낸 바와 같다.

화합물 2의 결정형 V는 비-용매화물 결정 또는 용매화물 결정의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 상기 용매화물은 상응하는 화합물과 유기용매 또는/및 물에 의해 형성된 용매화물을 의미한다.

본 발명은 결정형 V의 결정질 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서 결정형 V는 결정질 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 80 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상으로 존재한다.

본 발명은 치료적 유효량의 결정형 V 또는 결정형 V의 결정질 조성물을 포함하는 결정형 V의 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 매질을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.

본 발명은 X-선 회절 패턴(XRD)에서 2θ= 5.775°, 11.770°, 14.415°, 15.753°, 22.518°, 26.623°; 전형적으로 2θ= 5.775°, 11.770°, 14.415°, 15.753°, 17.132°, 20.939°, 22.518°, 26.623°; 보다 전형적으로 2θ= 5.775°, 11.770°, 14.415°, 15.753°, 17.132°, 20.939°, 22.518°, 23.745°, 26.623°, 31.295°에서 회절 피크를 갖는 것이 특징인, 화합물 2의 결정형 VI를 제공한다.

본 발명은 도 16에 나타낸 바와 같은 XRPD 패턴을 갖는 화합물 2의 결정형 VI를 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 VI의 XRPD 패턴 분석 데이터를 표 7에 나타내었다.

표 7. 화합물 2의 결정형 VI의 XRPD 패턴 분석 데이터

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 VI의 DSC 패턴은 도 17에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 2의 상기 결정형 VI의 TGA 패턴은 도 18에 나타낸 바와 같다.

화합물 2의 결정형 VI는 비-용매화물 결정 또는 용매화물 결정의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 상기 용매화물은 상응하는 화합물과 유기용매 또는/및 물에 의해 형성된 용매화물을 의미한다.

본 발명은 결정형 VI의 결정질 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서 결정형 VI는 결정질 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 80 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상으로 존재한다.

본 발명은 치료적 유효량의 결정형 VI 또는 결정형 VI의 결정질 조성물을 포함하는 결정형 VI의 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 매질을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.

본 발명은 하기 화학식으로 표시되는 화합물 3을 제공한다:

.

본 발명은 X-선 회절 패턴(XRD)에서 2θ= 6.325°, 12.677°, 15.813°, 21.395°, 22.519°, 27.133°; 전형적으로 2θ= 6.325°, 12.677°, 13.251°, 15.813°, 18.954°, 21.395°, 22.519°, 25.161°, 27.133°; 보다 전형적으로 2θ= 6.325°, 12.677°, 13.251°, 15.813°, 16.565°, 18.954°, 21.395°, 22.519°, 24.117°, 25.161°, 26.405°, 27.133°에서 회절 피크를 갖는 것이 특징인, 화합물 3의 결정형 VII를 제공한다.

본 발명은 도 19에 나타낸 바와 같은 XRPD 패턴을 갖는 화합물 3의 결정형 VII를 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 3의 상기 결정형 VII의 XRPD 패턴 분석 데이터를 표 8에 나타내었다.

표 8. 화합물 3의 결정형 VII의 XRPD 패턴 분석 데이터

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 3의 상기 결정형 VII의 DSC 패턴은 도 20에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 3의 상기 결정형 VII의 TGA 패턴은 도 21에 나타낸 바와 같다.

화합물 3의 결정형 VII는 비-용매화물 결정 또는 용매화물 결정의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 상기 용매화물은 상응하는 화합물과 유기용매 또는/및 물에 의해 형성된 용매화물을 의미한다.

본 발명은 결정형 VII의 결정질 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서 결정형 VII는 결정질 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 80 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상으로 존재한다.

본 발명은 치료적 유효량의 결정형 VII 또는 결정형 VII의 결정질 조성물을 포함하는 결정형 VII의 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 매질을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.

본 발명은 하기 화학식으로 표시되는 화합물 4를 제공한다:

.

본 발명은 X-선 회절 패턴(XRD)에서 2θ= 5.889°, 11.002°, 12.518°, 14.906°, 17.825°, 22.814°, 25.555°; 전형적으로 2θ= 5.889°, 7.173°, 11.002°, 11.396°, 12.518°, 12.895°, 14.906°, 17.825°, 22.814°, 25.555°; 보다 전형적으로 2θ= 5.889°, 7.173°, 11.002°, 11.396°, 12.518°, 12.895°, 14.906°, 16.169°, 17.825°, 19.875°, 21.574°, 22.814°, 25.555°, 27.254°에서 회절 피크를 갖는 것이 특징인, 화합물 4의 결정형 VIII를 제공한다.

본 발명은 도 22에 나타낸 바와 같은 XRPD 패턴을 갖는 화합물 4의 결정형 VIII를 제공한다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 4의 상기 결정형 VIII의 XRPD 패턴 분석 데이터를 표 9에 나타내었다.

표 9. 화합물 4의 결정형 VIII의 XRPD 패턴 분석 데이터

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 4의 상기 결정형 VIII의 DSC 패턴은 도 23에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 화합물 4의 상기 결정형 VIII의 TGA 패턴은 도 24에 나타낸 바와 같다.

화합물 4의 결정형 VIII는 비-용매화물 결정 또는 용매화물 결정의 형태로 제공될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 상기 용매화물은 상응하는 화합물과 유기용매 또는/및 물에 의해 형성된 용매화물을 의미한다.

본 발명은 결정형 VIII의 결정질 조성물을 제공한다. 본 발명의 일 실시 형태에서 결정형 VIII는 결정질 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 80 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상으로 존재한다.

본 발명은 치료적 유효량의 결정형 VIII 또는 결정형 VIII의 결정질 조성물을 포함하는 결정형 VIII의 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 매질을 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다.

본 발명의 목적은 또한, PI3K 키나아제 관련 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 화합물 1, 2, 3 및 4, 또는 이의 약학적 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PI3K 키나아제 관련 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 결정형 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, 및 IX, 이의 결정질 조성물 및 이의 약학적 조성물의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 PI3K 키나아제 관련 질환은 대장암, 위암 등과 같은 암으로부터 선택된다.

본 발명의 목적은 치료적 유효량의 화합물 1, 2, 3 및 4, 또는 이의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 PI3K 키나아제 관련 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 치료적 유효량의 본 발명의 결정형 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, 및 IX, 이의 결정질 조성물 및 이의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 PI3K 키나아제 관련 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

정의 및 설명

달리 언급하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 용어 및 문구는 다음과 같은 의미를 갖는다. 특정 문구나 용어는 특정 정의가 없는 경우, 불확실하거나 불분명하지 않아야 하며, 상식에 따라 이해가 되어야 한다. 본 명세서에 상표명이 기재되어 있는 경우, 해당 제품 또는 그의 활성 성분을 의미한다.

본 발명의 중간체 화합물은 아래에 예시된 특정 실시 형태, 다른 화학 합성 방법과 함께 형성된 실시 형태, 및 당해 분야의 기술자에게 잘 알려진 등가물을 포함하여, 당해 분야의 기술자에게 널리 공지된 다양한 합성방법에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 실시예는 본 발명의 실시예를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 특정 실시 형태에서의 화학 반응은 적합한 용매 내에서 수행되며, 이는 본 발명에서 요구되는 시약 및 물질뿐만 아니라 화학적 변화에 적합하여야 한다. 본 발명의 화합물을 수득하기 위해, 당해 분야의 기술자는 때때로 본 명세서의 실시 형태에 기초하여 합성 단계 또는 반응식을 변형 또는 선택하는 것이 필요하다.

당해 분야의 임의의 합성 경로 계획에 대한 중요한 고려 요소는 반응성 작용기에 적합한 보호기를 선택하는 것이다(예를 들면, 본 발명의 아미노기). 당해 분야의 숙련된 실무자를 위한 이 분야의 권위자인 Greene 및 Wuts의 Protective Groups In Organic Synthesis, Wiley and Sons, 1991. 본 발명에서 인용된 모든 참고 문헌은 그 전체가 참고로 본 명세서에서 포함된다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 사용된 모든 용매는 상업적으로 입수 가능하며, 추가 정제 없이 사용된다. 상기 반응은 일반적으로 무수 용매 내에서 불활성 질소 가스 하에 수행된다. 양성자 핵 자기 공명 데이터는 Bruker Avance III 400 (400MHz) 분광기에서 기록되었으며, 여기서, 화학적 이동은 낮은 장(low field)에서 테트라메틸실란의 (ppm)으로 표시된다. 질량 스펙트럼은 Agilent 1200 Series plus 6110 (&1956A)으로 측정하였다. LC/MS 또는 Shimadzu MS는 DAD: SPD-M20A (LC) 및 Shimadzu Micromass 2020 검출기가 포함된다. 질량분석기는 양극 또는 음극 모드로 작동되는 전자분사 이온화 소스(ESI)가 장착되어 있다.

X-선 회절 스펙트럼에서, 결정질 화합물로부터 수득된 회절 패턴은 특정 결정형에 대해 종종 특징이 있고, 여기서, 결정화 조건, 입자 크기 및 다른 측정 조건의 차이로부터 발생되는 지배적인 지향 효과로 인하여, 밴드의 상대 강도(특히, 낮은 각도에서)가 변할 수 있다는 것이 표시되어야 한다. 따라서, 회절 피크의 상대 강도는 표적 결정형에 대해 특징적이지 않다. 결정형이 공지된 형태와 동일한지 여부를 판단할 때, 주목해야할 점은 피크의 상대적인 위치보다는 이들의 상대적인 강도이다. 또한, 임의의 결정형에 대해 피크의 위치에 약간의 오차가 있을 수 있으며, 이는 결정학 분야에서도 잘 알려져 있다. 예를 들어, 피크의 위치는 시료의 분석 동안 온도 변화, 시료의 이동, 기기 교정의 변화로 인해 이동할 수 있으며, 2θ값의 측정 오차는 때로는 약 ±0.5°, 바람직하게는 약 ±0.3°, 보다 바람직하게는 약 ±0.2°이다. 따라서 각각의 결정형의 구조를 결정할 때, 이러한 오차가 고려되어야 하고, 오차 내의 2θ값 또한 본 발명의 범위 내에 있다. XRD 패턴에서, 피크의 위치는 대게 2θ 각 또는 면간 간격 d로 표시되며, 이들 사이에 간단한 변환 공식이 있다: d=λ/2sinθ(식 중에서, d는 면간 간격을 나타내고, λ는 입사 X-선의 파장을 나타내고, θ는 회절 각임). 동일한 종류의 화합물의 동일한 결정형에 대해 XRD 스펙트럼 내에서 피크의 위치는 전체적으로 유사하고, 상대 강도는 더 큰 오차를 가질 수 있다. 또한, 혼합물의 식별에 있어서, 회절 선(diffraction line)의 일부는 감소된 함유량 등과 같은 인자로 인해 손실될 수 있다는 것을 지적해야 한다. 이 경우에, 심지어 하나의 밴드도 주어진 결정에 대해 특징적일 수 있으며, 이는 고-순도 시료에서 관찰된 바와 같이, 모든 밴드 상에서 의존할 필요는 없다.

결정형 약물을 제조하는 동안, 약물 분자와 용매 분자가 서로 접촉할 때, 용매 분자는 화합물 분자와 공융체를 형성하고, 외부 조건 및 내부 요인으로 인해 고체 내에 남아있어, 용매화물, 특히, 화학량론적 비-화학량론적 용매화물을 포함하는 용매화물을 형성하는 것을 피하기 어렵다. 이러한 용매화물은 본 발명의 범위 내에 포함된다.

본 발명에 의해 제조된 화합물 2(염산염) 내에서의 염소 이온의 화학량론은 이온 크로마토그래피로 측정할 수 있다. 사용된 기기는 883 Basic IC plus 1; 선택된 컬럼은 Metrosep A Supp 5-150/4.0; 유속은 0.700 mL/분; 실행시간은 10분이다.

본 발명은 다음과 같은 약어를 사용한다. DCM은 디클로로메탄을 나타내고; PE는 페트롤륨에테르를 나타내고; EA는 에틸아세테이트를 나타내고; DMF는 N,N-디메틸포름아미드를 나타내고; DMSO는 디메틸설폭시드를 나타내고; THF는 테트라히드로퓨란을 나타내고; MeOH는 메탄올을 나타내고; NMP는 N-메틸피롤리돈을 나타내고; Et₃N은 트리에틸아민을 나타내고; 4-DMAP는 4-디메틸아미노피리딘을 나타내고; LiOH는 수산화리튬을 나타내고; Cs₂CO₃는 탄산세슘을 나타내고; K₂CO₃은 탄산칼륨을 나타내고; PPh₃는 트리페닐포스핀을 나타내고; Pd(PPh₃)₄는 테트라-트리페닐포스핀 팔라듐을 나타내고; Pd(dppf)Cl₂는 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센 팔라듐 클로라이드를 나타낸다.

본 발명의 X-선 분말 회절계 (XRPD) 방법:

기기 모델: Bruker D8 advance X-선 회절계

시험 조건: 자세한 XRPD 매개 변수는 다음과 같다.

X-선 발생기: Cu, kα (λ=1.54056Å)

관 전압: 40 kV, 관 전류: 40 mA.

산란 슬릿: 0.60 mm

검출기 슬릿: 10.50 mm

산란 방지 슬릿: 7.10 mm

스캔 범위: 4-40°

단계 길이: 0.02°

속도: 0.1 S

시료 플레이트의 회전 속도: 15 rpm

본 발명의 시차 주사 열량계 (DSC) 방법:

기기 모델: TA Q2000 시차 주사 열량계

시험 조건: 시료 (0.5~1 mg)를 취하여 시험용 DSC 알루미늄 팬에 넣고, 방법은 실온에서 300℃까지, 10℃/분의 속도로 가열한다.

본 발명의 열 중량 분석기(Thermal gravimetric analyzer, TGA) 방법:

기기 모델: TA Q5000IR 열 중량 분석기

시험 조건: 시료 (2~5 mg)를 취하여 시험용 TGA 백금 팬에 넣고, 방법은 상온에서 300℃까지, 10℃/분의 속도로 가열한다.

기술적 효과

본 발명에서 제공되는 화합물 2, 3, 및 4, 화합물 1의 결정형 IX, 화합물 2의 결정형 I, II, III, IV, V 및 VI, 화합물 3의 결정형 VII 및 화합물 4의 결정형 VIII은 성질이 안정하고, 우수한 용해도 및 뛰어난 흡습성을 가지므로, 약물로서의 미래가 기대된다.

본 발명에 의해 제공되는 화합물 1 및 이의 중간체의 합성 방법은 원료가 싸고, 접근이 용이하고, 사용되는 시약의 높은 독성, 가혹한 반응 조건, 분리 및 정제의 어려움, 산업화가 용이하지 않는 등의 단점을 극복한다.

도 1은 Cu-Kα 방사선을 사용하는 화합물 2의 결정형 I의 XRPD 패턴이다.
도 2는 화합물 2의 결정형 I의 DSC 패턴이다.
도 3은 화합물 2의 결정형 I의 TGA 패턴이다.
도 4는 Cu-Kα 방사선을 사용하는 화합물 2의 결정형 II의 XRPD 패턴이다.
도 5는 화합물 2의 결정형 II의 DSC 패턴이다.
도 6은 화합물 2의 결정형 II의 TGA 패턴이다.
도 7은 Cu-Kα 선을 사용한 화합물 2의 결정형 III의 XRPD 패턴이다.
도 8은 화합물 2의 결정형 III의 DSC 패턴이다.
도 9는 화합물 2의 결정형 III의 TGA 패턴이다.
도 10은 Cu-Kα 방사선을 사용하는 화합물 2의 결정형 IV의 XRPD 패턴이다.
도 11은 화합물 2의 결정형 IV의 DSC 패턴이다.
도 12는 화합물 2의 결정형 IV의 TGA 패턴이다.
도 13은 Cu-Kα 방사선을 사용하는 화합물 2의 결정형 V의 XRPD 패턴이다.
도 14는 화합물 2의 결정형 V의 DSC 패턴이다.
도 15는 화합물 2의 결정형 V의 TGA 패턴이다.
도 16은 Cu-Kα 선을 사용하는 화합물 2의 결정형 VI의 XRPD 패턴이다.
도 17은 화합물 2의 결정형 VI의 DSC 패턴이다.
도 18은 화합물 2의 결정형 VI의 TGA 패턴이다.
도 19는 Cu-Kα 선을 사용하는 화합물 3의 결정형 VII의 XRPD 패턴이다.
도 20은 화합물 3의 결정형 VII의 DSC 패턴이다.
도 21은 화합물 3의 결정형 VII의 TGA 패턴이다.
도 22는 Cu-Kα 방사선을 사용하는 화합물 4의 결정형 VIII의 XRPD 패턴이다.
도 23은 화합물 4의 결정형 VIII의 DSC 패턴이다.
도 24는 화합물 4의 결정형 VIII의 TGA 패턴이다.
도 25는 Cu-Kα 방사선을 사용하는 화합물 1의 결정형 IX의 XRPD 패턴이다.
도 26은 화합물 1의 결정형 IX의 DSC 패턴이다.
도 27은 화합물 1의 결정형 IX의 TGA 패턴이다.

본 발명의 내용이 보다 잘 이해될 수 있도록 본 발명의 내용에 제한을 두지 않는 하기의 특정 실시예를 조합하여 추가로 기술할 것이다.

참고예 1: 화합물 5의 제조

메틸 2-(벤질옥시)아세테이트(2)의 제조

화합물 2

3.0 L 3구 둥근-바닥 플라스크 내에 디클로로메탄 (960 mL)을 넣고, 메탄올 (197.6 g, 247 mL) 및 피리딘 (304.78 mL, 311 mol)을 추가하고, 상기 혼합물을 얼음 수조 내에서 0℃로 냉각시켰다. 질소 가스의 보호 하에, 둥근-바닥 플라스크 안에 2-(벤질옥시)아세틸 클로라이드 (300g, 1.54mol)를 적가(dropwise)하고, 첨가하는 동안 온도를 0-10℃로 조절하였다. 첨가 후, 얼음 수조를 제거하고, 반응 용액을 20℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 시료 채취 및 검출 후, TLC (페트롤륨에테르/에틸아세테이트=5/1)는 반응이 완료되었음을 보여준다. 둥근-바닥 플라스크에 물 (1.5 L)을 첨가하여 10분 동안 교반하고, 층을 분리하고, 유기층을 수집하고; 유기층을 1.0 mol/L 묽은 염산 (900 mL×2)으로 세척하고, 층을 분리하고, 유기층을 수집하고; 유기층을 20% 탄산나트륨 용액 (600 mL)으로 추가 세척하고, 층을 분리하고, 유기층을 수집하고, 무수 황산나트륨 (150 g)으로 건조하고, 여과하고, 여액을 감압 하에 농축하여 무색 오일 생성물을 수득하였다(284 g, 1.53 mol, 수율 97%, 순도 99%). ¹H NMR (400MHz, 클로로포름-d) ppm 7.37-7.32 (m, 5H), 4.63 (s, 2H), 4.11 (s, 2H), 3.76 (s, 3H); LCMS (ESI) m/z: 202.8 (M+23).

메틸 2-(벤질옥시)-3-(디메틸아미노)아세테이트(3)의 제조

화합물 3

3.0 L 둥근-바닥 플라스크 내에 메틸 2-(벤질옥시)아세테이트 (506 g, 2.72 mol)를 넣고, t-부톡시비스(디메틸아미노)메탄 (569 g, 3.26 mol)을 첨가하고, 반응 온도를 90℃-100℃로 조절하고, 14시간 동안 반응하였다. 시료 채취 및 검출 후, TLC (PE/EA=5/1)는 반응이 완료되었음을 보여준다. 반응 용액을 60℃로 냉각시키고, 오일 펌프를 사용하여 농축시켜 노란색 오일 생성물 (699 g, 조 생성물)을 수득하고, 이를 다음 단계에서 직접 사용하였다.

¹H NMR (400MHz, 클로로포름-d) ppm 7.44-7.2 (m, 2H), 7.37-7.28 (m, 3H), 6.87 (s, 1H), 4.72 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 2.98 (s, 6H).

3-(벤질옥시)-7-브로모-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온(4)의 제조

화합물 4

5 L 둥근-바닥 플라스크 내에 메틸 2-(벤질옥시)-3-(디메틸아미노)아세테이트 (318 g, 1.35 mol)를 넣고, 여기에 2-아미노-5-브로모피리딘 (246 g, 1.35 mol)을 첨가하였다. 상기 반응 용액을 120℃-130℃로 온도를 조절하여 14시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 시료 채취 및 검출 후, LCMS는 반응이 대부분완료되었음을 보여준다. 상기 반응 용액을 60℃로 냉각시키고, 농축 및 감압하여 용매를 제거하고, 에틸아세테이트 (750 mL)를 추가하고, 10분 동안 교반하고, 여과하였다. 수득된 여과 케이크는 에틸아세테이트 (500 mL)를 사용하여 10분 동안 교반하고, 여과하였다. 수득된 추가의 여과 케이크를 에틸아세테이트 (150 mL)로 세정하고, 회전-건조하여 노란색 고체 화합물을 수득하였다 (319 g, 순도 95%, 수율 67.79%).

¹H NMR (400MHz, 클로로포름-d) d=9.13 (d, J=2.0Hz, 1H), 8.05 (s, 1H), 7.56 (dd, J=2.0, 9.6 Hz, 1H), 7.46-7.42 (m, 3H), 7.37-7.33 (m, 3H), 5.30 (s, 2H); LCMS (ESI) m/z: 332.6 (동위원소 M+1).

7-브로모-3-히드록시-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온(5)의 제조

화합물 5

3 L 둥근-바닥 플라스크 내에 트리플루오로아세트산 (1.2 L)을 넣고, 여기에 3-(벤질옥시)-7-브로모-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온 (313 g, 897.9 mmol)을 첨가하고, 반응 용액을 80-90℃로 온도를 조절하여 교반하면서 2시간 동안 반응시켰다. 시료 채취 및 검출 후, LCMS는 반응이 대부분 완료되었음을 보여준다. 상기 반응 용액을 60℃로 냉각시키고, 농축 및 감압하여 용매를 제거하고, 에틸아세테이트 (1.2 L)를 추가하고, 60분 동안 교반하고, 여과하였다. 수득된 여과 케이크는 에틸아세테이트 (400 mL)를 사용하여 60분 동안 교반하고, 여과하였다. 수득된 추가의 여과 케이크를 40℃에서 70시간 동안 감압 하에 건조하여, 노란색 고체 화합물을 수득하였다(191 g, 함량 95.6%, 순도 100%, 수율 84.59%).

¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) d=9.92 (br, 1H), 8.90 (s, 1H), 8.07 (s, 1H), 7.73 (dd, J=2.0, 9.6 Hz, 1H), 7.53 (d, J=9.6 Hz, 1H); MS m/z: 240.9 (M+1), 242.8 (동위원소 M+1).

실시예 1: 화합물 1의 제조

7-브로모-3-(2-(디메틸아미노)에톡시-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온(6)의 제조

화합물 6

둥근-바닥 플라스크 내에 7-브로모-3-히드록시-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온 (300g, 1.2mol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (3 L)를 넣고, 반응기의 온도를 95℃ 내지 100℃로 조절하였다. 상기 반응 플라스크 내에 탄산칼륨 (497.4 g, 3.6 mol)을 첨가하고 30분 동안 교반하였다. 이어서, 2-디메틸아미노에틸 클로라이드 염산염을 삼등분하여 다음과 같이 공급하였다: 반응 플라스크 내에 2-디메틸아미노에틸 클로라이드 염산염 (70.6 g, 0.49 mol)을 첨가하여 30분 동안 교반하고; 반응 플라스크 내에 2-디메틸아미노에틸 클로라이드 염산염 (70.6 g, 0.49 mol)을 첨가하여 30분 동안 교반하고; 반응 플라스크 내에 2-디메틸아미노에틸 클로라이드 염산염 (70.6 g, 0.49 mol)을 첨가하여 2~2.5시간 동안 교반한다.

반응이 완료된 후(HPLC를 사용하여 모니터링), 반응기의 온도를 15±5℃로 조절하였다. 반응 용액에 물 (15 L)을 가하고, 디클로로메탄 (4.5 L×4)으로 추출하였다. 유기층을 모으고, 35±5℃에서 감압 하에 일정 중량이 되도록 농축하였다. 농축 후, 수득된 생성물에 n-헵탄 (1.8 L)을 가하고, 15±5℃에서 15~16시간 동안 교반하였다. 여과 후, 얻어진 여과 케이크를 35±5℃에서 감압 하에 회전-증발시켜 녹색 고체 생성물을 수득하였다 (280 g, 수율 74.09%, 순도 98.22%).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d=2.35 (s, 6 H), 2.78 (t, J=5.6Hz, 2H), 4.25 (t, J=6.0Hz, 2H), 7.45 (d, J=9.6Hz, 1H), 7.55 (dd, J=9.6Hz, 2Hz, 1H), 8.13 (s, 1H), 9.09 (d, J=2.0Hz, 1H); LCMS (ESI) m/z: 312 (동위원소 M+1).

7-(5-아미노-6-메톡시피리미딘-3-일)-3-(2-(디메틸아미노)에톡시)-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온(7)의 제조

화합물 7

반응 플라스크 내에 7-브로모-3-(2-(디메틸아미노)에톡시)-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온 (275 g, 0.87 mol), 2-메톡시-5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보로란-2-일)피리딘-3-아민 (249 g, 0.96 mol), 1,4-디옥산 (2.75 L), 물 (550 mL) 및 탄산칼륨 (362 g, 2.62 mol)을 연달아 첨가하고; 30-60분 동안 버블링한 후, Pd(dppf)Cl₂(19.2 g, 26 mmol)를 반응 플라스크 내에 첨가하고, 반응 플라스크를 질소 가스로 5회 대체시키고; 반응 플라스크의 온도를 95±5℃로 조절하고, 상기 혼합물을 이 온도에서 2~2.5시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(HPLC를 사용하여 모니터링), 반응기의 온도를 15±5℃로 조절하였다. 반응 용액을 n-헵탄(6.6 L)에 첨가하고, 온도를 15±5℃로 조절하고, 상기 혼합물을 이 온도에서 2~2.5시간 동안 교반하였다. 여과 후, 수득된 여과 케이크를 45±5℃에서 감압 하에 회전-건조하였다. 수득된 잔류물에 디클로로메탄/메탄올 (V/V = 8/1, 2.75 L)을 가하고, 15±5℃에서 30~60분 동안 교반하고, 여과하여 여과 케이크를 얻고, 상기 여과 케이크에 디클로로메탄/메탄올 (V/V = 8/1, 1.375 L)을 첨가하고, 15±5℃에서 30~60분 동안 교반하고, 다시 여과하여 다른 여과 케이크를 얻고, 다음으로 디클로로메탄/메탄올 (V/V = 8/1, 1.375 L)으로 헹구었다. 수득된 두 여액을 모으고, 45±5℃에서 감압 하에 농축시켰다. 농축 잔류물에 디클로로메탄/메탄올 (V/V = 2/1, 4.125 L)을 가하고, 교반하여 용해시켰다. 생성 용액에 티오시아누르산(13.93 g) 및 활성 카본 (27.5 g)을 첨가하고, 15±5℃에서 15~16시간 동안 교반하고, 규조토(diatomaceous earth) (137.5 g)로 여과하고, 얻어진 여과 케이크를 디클로로메탄/메탄올 (V/V = 2/1, 1.375 L×2)으로 헹구었다. 여액을 45±5℃에서 감압 하에 농축시켰다. 농축 잔류물에 메탄올 (1.1 L)을 가하고, 15±5℃에서 2~3시간 동안 교반하고, 여과하고, 얻어진 여과 케이크를 메탄올 (137.5 mL)으로 헹구고, 45±5℃에서 감압 하에 회전-증발시켜 노란색 고체 생성물을 수득하였다(270 g, 순도 97.98%, 수율 84.24%).

¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) d=8.92 (d, J=1.6Hz, 1H), 8.24 (s, 1H), 8.04 (dd, J=9.6Hz, 2Hz, 1H), 7.80 (d, J=2Hz, 1H), 7.67 (d, J=9.6Hz, 1H), 7.27 (d, J=2.0Hz, 1H), 5.24 (s, 2H), 4.19 (t, J=6.0Hz, 2H), 3.93 (s, 3H), 2.66 (t, J=6.0Hz, 2H), 2.25 (s, 6H); LCMS (ESI) m/z: 356 (M+1).

화합물 1의 제조

화합물 1

반응 플라스크에 7-(5-아미노-6-메톡시피리미딘-3-일)-3-(2-(디메틸아미노)에톡시)-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온 (265 g, 0.72 mol) 및 피리딘 (2.65 L)을 넣고; 5±5℃로 냉각시킨 후, 피리딘 (504 mL) 내의 2-클로로-4-플루오로벤젠설포닐 클로라이드 (252 g, 1.08 mol)의 용액을 반응 플라스크 내에 적가하고; 첨가가 완료되면, 반응 용액을 30~35℃의 온도로 조절하고, 이 온도에서 2~3시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후(HPLC를 사용하여 모니터링), 반응 용액을 화합물 7의 2.5~3배의 중량이 되도록 45±5℃에서 감압 하에 농축하였다. 농축 생성물에 디클로로메탄 (3.7 L)을 첨가하고, 25±5℃에서 30분 동안 교반하고, 다음으로 화합물 7의 2.5~3배의 중량이 되도록 45±5℃에서 감압 하에 농축하였다. 농축 생성물에 디클로로메탄 (3.7 L)을 첨가하고, 25±5℃에서 2~3시간 동안 슬러리화 하였다. 여과한 후, 여과 케이크를 수집하고, 화합물 7의 1.3~1.7배의 중량이 되도록 45±5℃에서 회전-증발시켰다. 회전-증발 생성물에 디클로로메탄 (1.85 L)을 가하고, 25±5℃에서 2~3시간 동안 슬러리화시켰다. 여과한 후, 여과 케이크를 수집하고, 화합물 7의 1.2~1.4배의 중량이 되도록 45±5℃에서 회전-증발시키고, 화합물 7의 1.2~1.3배의 중량이 되도록 45℃에서 3~4시간 동안 진공-건조하였다. 얻어진 조 생성물에 아세토니트릴 (2.12 L)을 첨가하고, 55±5℃에서 15~16시간 동안 슬러리화시켰다. 슬러리화 후의 용액을 25±5℃로 냉각시키고, 여과하고, 얻어진 여과 케이크를 수집하고, 화합물 7의 1.1~1.2배의 중량이 되도록 45±5℃에서 회전-증발시켰다. 회전-증발 생성물에 아세토니트릴 (1.9 L)을 첨가하고, 45±5℃에서 15~16시간 동안 슬러리화시켰다. 슬러리화 후의 용액을 25±5℃로 냉각시키고, 여과하고, 얻어진 여과 케이크를 수집하고, 화합물 7의 1.0~1.1배의 중량이 되도록 45±5℃에서 회전-증발시켰다. 회전-증발 생성물에 메탄올 (5.3 L) 및 활성 카본 (53 g)을 첨가하고, 75±5℃에서 2~3시간 동안 교반하였다. 규조토 (132 g)로 여과하고, 얻어진 여과 케이크를 수집하고, 디클로로메탄과 메탄올(V/V = 4/1, 7.95 L)의 혼합 용매를 첨가하고, 25±5℃에서 30~60분 동안 교반하였다. 여과를 다시 수행하고, 얻어진 두 여과액을 모으고, 화합물 7의 1.01~1.03배의 중량이 되도록 45±5℃에서 농축시켰다. 농축 생성물에 물 (4.24 L)과 에탄올 (1.06 L)을 첨가하고, 25±5℃에서 5~10분 동안 교반하고, 포화 탄산수소나트륨 수용액 (1.3 L)을 적가하고, 추가로 2~3시간 동안 교반하였다. 여과 후, 여과 케이크를 화합물 7의 1.1~1.3배의 중량이 되도록 45±5℃에서 회전-증발시켰다. 상기 회전-증발 생성물에 에탄올 (1.59 L)을 첨가하고, 75±5℃에서 15~16시간 동안 슬러리화시켰다. 슬러리화 후의 용액을 25±5℃로 냉각시키고, 여과하고, 여과 케이크를 수집하고, 화합물 7의 0.89~0.92배의 중량이 되도록 45±5℃에서 회전-증발시켰다. 회전-증발 생성물에 물(2.35 L)을 첨가하고, 45±5℃에서 61±1시간 동안 교반하였다. 혼합 용액을 25±5℃로 냉각시키고, 여과하였다. 상기 얻어진 여과 케이크를 수집하고, 물 (2.35 L)을 첨가하고, 25±5℃에서 2~3시간 동안 교반하고, 여과하였다. 수득된 여과 케이크를 수집하고, 60±5℃에서 15~16시간 동안 진공-건조하고, 60 메쉬 체로 체가름 하여 연노란색 고체 생성물을 얻었다(190 g, 순도 98.33%, 수율 47.36%).

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6-d) d=2.96 (t, J=6.0Hz, 2H), 3.72 (s, 3H), 4.27 (t, J=5.2Hz, 2H), 7.32 (td, J=8.8, 2.8Hz, 1H), 7.60 (dd, J=8.4, 2.4Hz, 1H), 7.70 (d, J=9.2Hz, 1H), 7.75 (d, J=2.0Hz, 1H), 7.95-8.05 (m, 2H), 8.15 (d, J=1.6Hz, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.85 (s, 1H); LCMS (ESI) m/z: 548 (M+1).

실시예 2: 화합물 1의 결정형 IX 제조

7-(5-아미노-6-메톡시피리미딘-3-일)-3-(2-(디메틸아미노)에톡시)-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온 (2.5g, 6.75mmol, 1.0eq)을 피리딘 (25 mL) 내에 용해시키고, 0℃에서 2-클로로-4-플루오로벤젠설포닐 클로라이드 (2.01 g, 8.78 mmol, 1.3 eq)를 적가하고, 10~20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후, 용매를 회전-건조 제거하여 조 생성물을 얻었다. 조 생성물을 컬럼(DCM/MeOH: 10/1-4/1)으로 정제하였다. 노란색 고체 생성물을 수득하였다(2.4 g, 순도 98.31%, 수율 63.79% ).

상기 노란색 고체 (1.3 g, 2.37 mmol)를 분취 HPLC(중성)로 분리하였다. 분리 HPLC(중성)으로 분리된 액체를 DMC (500 mL×3)로 추출하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 (100 g)으로 건조하고, 여과하고, 얻어진 여액을 회전-건조하여 흰색 고체 생성물(화합물 1의 결정형 IX)을 수득하였다(970 mg, 1.75 mmol, 순도 99%, 수율 73.94%).

실시예 3: 화합물 2의 결정형 I 제조

7-(5-아미노-6-메톡시피리미딘-3-일)-3-(2-(디메틸아미노)에톡시)-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온 (29.0 g, 81.60 mmol, 1.0eq) 및 피리딘 (290 mL)을 교반기가 장착된 1.0 L 3구 둥근-바닥 플라스크 R1 내에 넣었다. R1을 얼음 수조 내에 두고, 0-5℃로 냉각시켰다. 피리딘 (60 mL) 내의 2-클로로-4-플루오로벤젠설포닐 클로라이드 (24.30 g, 106.08 mmol, 1.3eq) 용액을 약 30분에 걸쳐 R1 내에 적가하고, 반응 용액을 자연적으로 20℃로 가온시키고, 16시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 감압 하에 농축하여 피리딘을 제거하고, 적색 고체 조 생성물 80 g을 얻었다. 상기 조 생성물 64 g을 취하여 1.0 L 둥근-바닥 플라스크 R2 내에 넣고, 디클로로메탄 (350 mL)을 R2 내에 첨가하였다. 이어서, R2를 15℃에서 2시간 동안 교반하고, 여과하고, 얻어진 여과 케이크를 수집하고, 건조하여 담적색 고체를 얻었다(33.4 g, 수율 77%, 순도 99.4%). 상기 고체 30 g을 취하여 1 L 둥근-바닥 플라스크 R3 내에 넣고, 메탄올 (600 mL)과 활성 카본 (6 g, 20%)을 R3 내에 첨가하였다. 상기 혼합물을 70℃의 오일조(oil bath) 내에 두고 12시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 뜨거울 때에 규조토(15 g)로 여과하였다. 여액을 수집하고, 회전-건조하여 노란색 고체 생성물을 수득하였다(22.6 g, 순도 97.47%). 아세토니트릴 (150 mL)을 상기 고체에 첨가하고; 생성된 혼합물을 85℃의 오일조 내에서 12시간 동안 교반하고, 20℃로 냉각시키고, 여과하고, 여과 케이크를 수집하고, 건조하여 화합물 2의 결정형 I인 백색 고체로서 표제 화합물을 얻었다(21 g, 수율 44.3%, 순도 100%). 이온크로마토그래피로 측정시, 화합물 2의 염화물 이온 대 화합물 1의 몰비는 1:1 이었다.

¹H NMR (400MHz, DMSO-d6-d) d=2.91 (s, 6H), 3.53 (t, 2H), 3.71 (s, 3H), 4.52 (t, 2H), 7.38 (m, 1H), 7.77 (m, 2H), 7.97 (m, 2H), 8.16 (m, 1H), 8.45 (m, 2H), 8.98 (s, 1H).

실시예 4: 화합물 2의 결정형 II 제조

화합물 2의 결정형 약 50 mg을 취하고, 0.4 mL의 아세톤을 첨가하여 현탁액을 형성시켰다. 상기 현탁액 시료(sample)를 일정 온도(40℃)의 혼합기 위에 놓고, 2일 동안 진탕 시켰다(빛으로부터 보호됨). 잔류 고체를 원심분리하고, 40℃의 진공 건조 오븐 내에서 밤새 건조시켜 화합물 2의 결정형 II를 얻었다.

실시예 5: 화합물 2의 결정형 III 제조

결정형 III의 제조방법은 아세톤 용매를 이소프로판올로 대체하는 것을 제외하고, 결정형 II의 것과 동일하다. 화합물 2의 결정형 III를 수득하였다.

실시예 6: 화합물 2의 결정형 IV 제조

결정형 IV의 제조방법은 아세톤 용매를 에틸아세테이트로 대체하는 것을 제외하고는 결정형 II의 것과 동일하다. 화합물 2의 결정형 IV를 수득하였다.

실시예 7: 화합물 2의 결정형 V 제조

화합물 2의 결정형 I (2.0 g, 3.42 mmol)를 500 mL 1구 플라스크 R1에 넣고, 고체를 교반하면서 DCM/MeOH (2/1, 200 mL)을 첨가하여 완전히 용해시켰다. 상기 용액을 40℃에서 감압하여 용매를 제거하여 노란색 고체 2.0 g을 얻고; 1 g의 고체를 취하여 50 mL의 1구 플라스크에 넣고, 이어서, 에탄올 (6 mL)을 첨가하고; 얻어진 혼합물을 80℃의 오일조(oil bath) 내에 두고 12시간 동안 교반한 후, 가열을 정지시켰다. 상기 혼합물을 교반 하에 20℃로 냉각시킨 뒤, 여과하고, 여과 케이크를 건조하여 화합물 2의 결정형 V를 얻었다.

실시예 7: 화합물 2의 결정형 VI 제조

7-(5-아미노-6-메톡시피리미딘-3-일)-3-(2-(디메틸아미노)에톡시)-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온 (70.0 g, 222.90 mmol, 1.0 eq, 순도 99.4%) 및 피리딘 (700 mL)을 교반기가 장착된 2.0 L 3구 둥근-바닥 플라스크 R1 내에 첨가하고, R1을 얼음 수조 내에 두고, 0-5℃로 냉각시켰다. 피리딘 (140 mL) 내의 2-클로로-4-플루오로벤젠설포닐 클로라이드 (70.81 g, 293.67 mmol, 1.5 eq, 순도 95%) 용액을 약 30분에 걸쳐 R1 내에 적가하였다. R1을 30℃의 오일조(oil bath) 내에 두고 2시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 반응 용액을 감압 하에 농축하여 피리딘을 제거하고, 적색 고체 조 생성물 200 g을 얻었다. 잔류물에 디클로로메탄 (1.0 L)을 첨가하고, 20℃에서 3시간 동안 교반하였다. 여과 후, 여과 케이크를 수집하였다. 아세토니트릴 (1.2 L)을 상기 여과 케이크에 첨가하고, 얻어진 반응 용액을 85℃에서 12시간 동안 환류시키고, 20℃로 냉각시키고, 여과하고; 다른 여과 케이크를 수집하고, 건조하여 고체를 얻었다(92g). 여과 케이크의 고체에 메탄올 (2 L)과 활성 카본 (14 g)을 첨가하고, 3시간 동안 교반하면서 환류시키고, 여전히 뜨거울 때 규조토(15 g)로 여과하고, 500 m로 헹구었다. 여액을 40℃에서 감압 하에 회전-건조하여 고체 (83 g)을 수득하였다. 얻어진 고체에 아세토니트릴 (800 mL)을 첨가하고, 혼합물을 85℃에서 밤새 환류시키고, 20℃로 냉각시키고 여과하고, 얻어진 여과 케이크를 건조하여 77 g의 흰색 고체를 얻었다. 흰색 고체 72 g을 취하여 메탄올 내에 완전히 용해시키고, 회전-건조하여 화합물 2의 결정형 VI를 얻었다.

실시예 8: 화합물 3의 결정형 VII 제조

화합물 1 (997.34 mg, 1.82 mmol, 1.00 eq)을 5 mL 유리 바이알에 넣고, 에탄올/물(7.5 mL/2.5 mL)을 첨가하고, 실온 (15℃)에서 0.1시간 동안 교반하였고, 내에서 다량의 고체는 용해되지 않았다. 말레산(Maleic acid) (211.25 mg, 1.82 mmol, 1.00 eq)을 상기 혼합물에 첨가하고, 실온(15℃)에서 18시간 동안 교반하였고, 고체가 완전히 용해되어 노란색 용액을 형성하였다. 수득된 용액을 0℃에서 감압 하에 2 mL의 부피가 되도록 회전-건조시키고, EA (20 mL)을 가하고, 0.5시간 동안 교반하고, 여과하고; 형성된 여과 케이크를 40℃에서 감압 하에 회전-건조하여 화합물 3의 결정형 VII를 얻었다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) d ppm 2.94 (s, 6H) 3.51 - 3.56 (m, 2H) 3.71 (s, 3H) 4.36 - 4.59 (m, 2H) 6.03 (s, 2H) 7.18 - 7.48 (m, 1H) 7.65 - 7.90 (m, 2H) 7.92 - 8.09 (m, 2H) 8.17 (dd, J=9.29, 1.76Hz, 1H) 8.35 - 8.55 (m, 2H) 8.99 (s, 1H).

실시예 9: 화합물 4의 결정형 VIII 제조

화합물 1 (997.34 mg, 1.82 mmol, 1.00 eq)을 5 mL 유리 바이알에 넣고, 에탄올/물(7.5 mL/2.5 mL)을 첨가하고, 실온 (15℃)에서 0.5시간 동안 교반하였고, 내부에서 다량의 고체가 용해되지 않았다. 시트르산 (382.45 mg, 1.82 mmol, 1.00 eq)을 혼합물에 첨가하고, 실온 (15℃)에서 18시간 동안 교반하여, 반응 바이알 내에서 유백색 슬러리를 얻었다. 얻어진 혼합 용액을 40℃에서 감압 하에 2 mL의 부피가 되도록 회전-건조시키고, EA (20 mL)을 가하고, 0.5시간 동안 교반하고, 여과하고; 형성된 여과 케이크를 40℃에서 감압 하에 회전-건조하여 화합물 4의 결정형 VIII를 얻었다.

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) d ppm 2.56-2.68 (m, 4H)2.76 (s, 6 H) 3.31 (m, 2H) 3.72 (s, 3H) 4.37 - 4.40 (m, 2H) 7.35-7.37 (m, 1H) 7.71 - 7.78 (m, 2H) 7.91 - 7.95(m, 1H) 7.95-8.09 (m, 1H) 8.11-8.13 (m, 1H) 8.36 - 8.37 (m, 2H) 8.96 (d, J=1.6, 1H).

시험예 1: 상이한 용매 내에서의 화합물 1의 결정형 IX의 안정성 시험

적당량의 화합물 1의 결정형 IX 시료 여러 개를 취하고, 하기 표에서 나타낸 바와 같이, 단일 용매 또는 혼합용매 0.3~0.4 mL에 각각 첨가하고, 40℃에서 교반하였다. 2일 동안 교반한 후, 시료를 원심분리하였다. 시료에서 고체를 수집하고 결정 상태를 XRPD로 검출하였다. 그 결과를 표 10에 나타내었다.

표 10: 상이한 용매 내에서의 유리 염기의 결정형 IX의 안정성 실험

시험예 2: 고온, 고습 및 강한 광 조건 하에서의 화합물 1의 결정형 IX의 고체 상태 안정성 시험

화합물 1의 결정형 IX 약 10 mg을 칭량하고, 유리 시료 병의 바닥에 놓아 얇은 층을 형성시켰다. 60℃ 및 실온/92.5% RH의 조건 하에 놓인 샘플의 경우에는 병의 상단을 알루미늄 호일로 덮고, 알루미늄 호일에 여러 개의 구멍을 만들어 시료가 환경 내에서 공기에 완전히 노출되도록 하였고; 강한 빛(5Klx) 하에 놓인 샘플의 경우에는 병을 스크류 캡으로 밀봉하였다. 또 다른 시료 결정형 IX 15 mg을 취하고, 시료의 결정형 검출을 위해 상기 기재된 방법에 따라 위치시켰다. 상이한 조건 하에 놓인 시료를 샘플링하여 5일과 10일에 검출하였고, 검출 결과를 0일의 초기 검출 결과와 비교하였다. 상기 시험 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

표 11: 화합물 1의 결정형 IX의 고체상태 안정성 시험

시험 결과: 본 발명의 결정형은 양호한 안정성을 가지며, 약물로서 유용하게 제조될 수 있다.

시험예 3: 효소 활성의 시험관 내 실험

ADP- Glo 분석법 I

화합물 희석:

시험 화합물을 3배 농도 구배로 희석하고, 총 10개의 농도(10000nM 내지 0.5nM)를 수득하였다.

실험 방법:

본 발명의 시험 화합물 50 nL를 반응 플레이트(PerkinElmer #6007299)에 옮기고, 효소/기질 혼합물 (0.33nM PI3Kalpha, Millipore #14-602-K/166.5 μM PIP2 3 μL를 첨가하고; 20분 동안 배양한 후, ATP 용액 (100 μM) 2 μL를 첨가하여 반응을 개시시키고; 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, ADP-Glo 시약 5μL를 첨가하여 키나아제 반응을 정지시키고, 이어서 실온에서 60분 동안 배양하여 남아있는 미반응 ATP가 완전히 소화되도록 하고; 생성된 용액에 키나아제 검출 시약 10 μL를 첨가하고, 실온에서 40분 동안 배양한 다음, Envision에서 형광을 판독하였다. PIP2, ATP, 상기 ADP-Glo 시약 및 키나아제 검정 시약은 모두 ADP-Glo Kinase Assay Kit (Promega #V1792)의 것이다.

데이터 분석:

IC₅₀은 표준 4-매개변수 맞춤 방법(Model 205, XL-fit, iDBS)을 사용하여 계산하였다.

mTOR 키나아제에 대한 본 발명의 시험 화합물의 활성은 하기 시험 방법으로 시험하였다.

반응 완충액: 20 mM Hepes (pH 7.5), 10 mM MgCl₂, 2 mM MnCl₂, 1 mM EGTA, 0.02 % Brij35, 0.02 mg/ml BSA, 0.1 mM Na₃VO₄, 2 mM DTT, 2% DMSO.

응용 효소: 곤충 세포에서 발현되는 N-말단 GST 태그(아미노산 1360-2549, 분자량=163.9 kDa)를 갖는 인간화 재조합 mTOR 조각.

반응 기질: 박테리아에서 발현되는 N-말단 His 태그(분자량 = 13.6 kDa)를 갖는 인간화 재조합 전장(full-length) 4EBP1;

반응 조건: 3 μM 4EBP1 및 10 μM ATP.

반응 절차:

1. 반응 기판 및 다른 반응 인자를 새로 제조한 반응 완충액에 첨가하였다.

2. 키나아제를 기질 반응에 첨가하고 부드럽게 혼합하였다.

3. 100% DMSO 내에 용해된 화합물을 어쿠스틱 테크놀로지(Echo 550; nanoliter rang)를 사용하여 키나아제 반응 용액으로 옮긴 다음 실온에서 20분 동안 배양하였다.

4. 적절한 농도의 32P-ATP를 반응 시스템에 첨가하였다.

5. 실온에서 2시간 동안 배양하였다.

6. 키나아제 활성은 P81 여과-결합 방법으로 검출하였다.

실험 결과는 표 12에 나타내었다.

[표 12]

참고: A ≤ 1 nM; 200 nM < D.

결론: 화합물 1은 PI3K (p110α)에서는 유의한 억제 효과를 나타내었지만, mTOR에서는 억제 효과가 약했다.

ADP- Glo 분석 II

실험 절차:

1) 화합물을 Labcyte 사의 Echo를 사용하여 희석하고, 화합물 50 nL를 분석 플레이트 안에 옮기고, 1000 rpm의 속도로 10 초간 원심분리하였다.

2) 키나아제/지질 기질 혼합 용액 및 키나아제 반응 완충액/지질 기질 혼합 용액을 제조하고; 키나아제/지질 기질 혼합 용액을 분석 플레이트의 3-24 컬럼 안에 웰 당 3 μL씩 첨가하고; 키나아제 반응 완충액/지질 기질 혼합 용액을 분석 플레이트의 1~2 컬럼 안에 웰 당 3 μL씩 첨가하고; 상기 플레이트를 1000 rpm의 속도로 10초 동안 원심분리하였다.

3) ATP 용액을 준비하고, 분석 플레이트 안에 웰 당 2 μL를 첨가하고; 상기 플레이트를 1000rpm의 속도로 10 초간 원심분리하고, 플레이트 쉐이커(plate shaker)에서 2차 기어 모드로 1분 동안 진탕시켜 혼합하고, 추가로 1000rpm의 속도로 10초 동안 원심분리하고, 23℃에서 120분 동안 배양하였다 .

4) ADP-Glo^® 시약을 준비하고, 분석 플레이트 안에 웰 당 5 μL씩 넣고; 상기 플레이트를 1000 rpm의 속도로 10초 동안 원심분리하고, 플레이트 쉐이커(plate shaker)에서 2차 기어 모드로 1분 동안 진탕시켜 혼합하고, 추가로 1000rpm의 속도로 10초 동안 원심분리하고, 23℃에서 60분 동안 배양하였다 .

5) 키나아제 검출 시약을 준비하고, 분석 플레이트 안에 웰 당 10 μL씩 넣고; 플레이트를 1000 rpm의 속도로 10초 동안 원심분리하고, 플레이트 쉐이커에서 2차 기어 모드로 1분 동안 진탕시켜 혼합하고, 추가로 1000rpm의 속도로 10초 동안 원심분리하고, 23℃에서 30분 동안 배양한 다음, 다중-마커 탐지기 Envision에서 판독하였다.

데이터 분석:

IC₅₀ 결과는 IDBS 사의 XLfit5 (Formula 205)로 분석하였다.

양성 대조 약물로서 화합물 BKM-120을 사용하여, 전술한 바와 같은 실험 절차를 사용하여 해당 실험 및 분석을 수행하였다.

실험 결과:

PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ 및 PI3Kγ 활성에 대한 화합물 1의 억제에 대한 IC₅₀ 값은 각각 0.6±0.2 nM, 9.9±2.7 nM, 0.5±0.1nM 및 7.0±0.9 nM (n=2)이었다. 대조적으로, PI3Kα, PI3Kβ, PI3Kδ 및 PI3Kγ 활성에 대한 양성 대조 약물 BKM120 (PI3K 억제제, 부파리십)의 IC₅₀ 값은 각각 24.7±4.7 nM, 241.6±50.6 nM, 68.8±25.0 nM 및 111.9±15.2 nM로 나타났다.

결론: 화합물 1은 PI3K의 모든 4가지 아형(subtype)에서 매우 높은 억제 활성을 나타낸다.

시험예 4: 세포 활성의 시험관 내 시험

실험 단계 및 방법:

1) MCF-7 세포를 2.5×10⁴ 세포/웰의 밀도로 96 웰 플레이트 안에 접종하였다(배양 배지는 10 % FBS를 포함하는 완전 배양 배지여야 함).

2) 다음날, 각 웰 내의 배지를 꺼냈다. 시험 화합물의 특정 농도(예비 스크리닝) 또는 일련의 농도(IC₅₀ 시험)를 혈청이 없는 배양 배지에 용해시키고, 2시간 동안 세포를 배양하기 위해 96-웰 플레이트에 첨가하였다.

3) 인슐린을 혈청이 없는 배지에 용해시켜 배양 세포에 첨가하고, 30분 동안 배양하였다(인슐린의 최종 농도는 10 mg/mL임).

4) 반응 대기시간 동안 하기 방법에 따라 용균 용액(lysis solution)을 제조하였다:

a) 증강자(Enhancer) 용액을 냉장고에서 꺼내어 사전에 녹였다.

b) 증강자 용액을 5×용균 완충액으로 10배 희석하여 농축 용균 용액을 얻었다.

c) 농축 용균 용액을 재증류수로 5배 희석하여 용균 용액을 얻었다.

5) 각 웰 내의 배지를 완전히 제거하고, 각 웰을 PBS로 한번 빠르게 헹구었다.

6) 새롭게 제조한 용균 용액 150 μL를 각 웰에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 진탕 시켰다.

7) 모든 세포가 분리되었음을 확인한 후, 세포 잔해와 함께 용균 용액을 1.5 mL 튜브로 옮겼다.

8) 튜브를 여러 번 와류(vortexed)시켜 용균 용액과 세포를 완전히 혼합한 후, 12,000 g 하에서 10분 동안, 4℃에서 원심분리하였다.

9) 필요한 ELISA-one 마이크로-웰 플레이트의 스트립 수를 계산하였다. 불필요한 스트립을 프레임으로부터 꺼내어 저장 백 안에 다시 넣고 밀봉하였다. 마이크로-웰 플레이트의 스트립을 사용하기 전에, 재증류수 200μL를 사용하여 각 웰을 헹구어 방부제를 제거하였다.

10) 항체 혼합물 50 μL를 각 웰에 첨가하였다(항체 혼합 용액은 배지 항체 시약과 효소 표지 항체 시약을 같은 비율로 혼합하여 제조하였다. 항체 혼합물의 제조에는 와류가 필요하지 않다).

11) 세포 용균액(lysate) 25 μL를 ELISA-One 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 마이크로-웰 플레이트를 접착 밀봉 필름으로 덮고, 실온에서 1시간 동안 마이크로-웰 플레이트 진동(oscillation) 장치 위에서 배양하였다.

12) 각각의 웰을 1×헹굼 완충액 150 μL로 3회 헹구었다. 마지막 헹굼 후, 웰 내의 헹굼 버퍼가 완전히 제거되었다. 필요한 경우, 상기 ×헹굼 완충액을 최대 30분 동안 마이크로-웰 플레이트에 머물게 할 수 있으며, 이러한 시간 동안 기판 혼합 용액이 제조될 수 있다.

13) 기질 혼합 용액은 매 사용 직전에 제조해야 하며, 기질 혼합 용액 100 μL를 각 웰에 첨가하고, 마이크로-웰 플레이트를 주석-호일로 밀봉하고, 실온에서 10분 동안 마이크로-웰 플레이트 진동 장치 위에서 배양하였다..

14) 정지 용액 10 μL를 각 웰에 첨가하고, 마이크로-웰 플레이트 진동 장치 위에서 잠깐(5-10초) 혼합하였다.

15) 해당 ELISA-One 여과 그룹을 모으고, 형광 신호 강도를 판독하는데 사용했다.

실험 결과를 표 13에 나타내었다.

표 13: 시험관 내 세포 활성의 실험 결과

참고: A≤50 nM.

시험예 5: 생체 내 효능 실험

연구는 시험 약물이 인간 결장암 CO-04-0032 동물 모델 및 위암 ST-02-0013 동물 모델에서 생체 내 효능을 갖는지를 조사하기 위해 수행하였다. 동물 사료, 사료 성분, 실험 관찰, 실험 지수, 실험 종료 및 실험 데이터 분석에 대한 설명은 다음과 같다:

동물 식이: 도착한 동물은 실험을 시작하기 전에 실험 환경에서 3-7일 동안 먹이를 주었다. 동물은 SPF-등급 동물원(animal house)의 IVC(독립 환기 시스템) 케이지(케이지당 5 마리 동물) 안에 수용시켰다. 케이지, 충전재(padding) 및 식수는 사용하기 전에 모두 멸균시켰으며, 멸균 기록은 별도로 표시하였다. 동물원의 모든 실험실 직원은 조작 시 보호복과 라텍스 장갑을 착용해야 한다. 각 케이지 정보 카드에는 케이지, 성별, 변형, 도착 날짜, 복용법, 실험 번호, 그룹 및 실험 개시일의 동물 수를 나타내어야 한다. 케이지, 사료 및 식수는 주 2회 교체하였다. 급식 환경 및 조명 조건은 다음과 같다:

온도: 20~26℃

습도: 40~70%

명암주기: 빛 제공 12시간 , 빛 없이 12시간

사료 성분: 사료는 실험실 동물 사료 식별 기준을 준수하였다. 오염 물질의 최대 함량은 통제 가능한 범위 내에 있으며, 제조사에서 정기 검사를 담당하였다. 가압 멸균 처리된(Autoclaved) 음용수를 식수로 사용하였다.

동물 그룹화: 동물의 체중을 측정하고, 종양 체적을 투여 전에 측정하였다. 동물을 종양의 크기에 따라 무작위로 분류하였다(무작위 블록 설계).

관찰: 실험 프로토콜 및 그 변형은 WuXi AppTec, 상하이의 인스티튜셔날 애니멀 케어 및 사용위원회(IACUC)의 승인 하에 수행되었다. 실험 동물의 사용과 복지는 실험 동물 관리 협회(AAALAC)의 규정에 따랐다. 동물의 건강과 사망은 매일 모니터링하였고, 일상적인 검사는 동물의 일상 행동 및 행동, 식이 및 수분섭취 체중 변화(측정은 일주일에 2회), 외형 또는 기타 비정상적인 상황과 같은 퍼포먼스에 대해서 약물 치료의 종양 성장 및 영향을 관찰하는 것이 포함되었다. 각 그룹의 동물 수를 기준으로 동물의 사망과 부작용을 기록하였으며, 관련 기록은 부록에서 확인할 수 있다.

실험 지수: 실험 지수는 종양의 성장이 저해, 지연 또는 치료되는지 여부를 조사하기 위해 사용되었다. 종양 직경은 버니어 캘리퍼스로 주 2회 측정하였다. 종양 부피는 공식 V = 0.5a×b²에 의해 계산되었으며, 식 중에서, a 및 b는 각각 종양의 긴 직경 및 짧은 직경을 나타낸다. 화합물의 종양 억제(TGI)를 T-C(일) 및 T/C(%)로 평가하였다. T-C(일)은 종양 성장 지연 지수를 나타내며, 식 중에서, T는 투여군에서 소정의 종양 부피(예: 1,000 mm³)에 도달하는 데 필요한 평균 일수를 나타내고, C는 대조군에서 동일한 종양 부피에 도달하는데 필요한 평균 일수를 나타낸다. T/C(%)의 백분율 값은 종양 성장 억제율을 나타내며, 식 중에서, T 및 C는 각각 특정 날의 투여군 및 대조군의 종양 중량(종양 부피)을 나타낸다.

종양 성장 억제율은 하기 식에 의해 계산되었다: TGI(%) = [1-(T_i-T₀)/(V_i-V₀)]×100 (식 중에서, T_i는 특정 일에서의 투여 군의 평균 종양 체적이고, T₀은 투여 시작시 투여 군의 평균 종양 체적이며; V_i는 특정 일(T_i와 같은 날)에서의 비히클 대조군의 평균 종양 체적이고, V₀는 투여 시작시 비히클 대조군의 평균 종양 체적이다). 실험 종료시, 종양 중량을 측정하고, T/C 백분율을 계산하였다(식 중에서, T 및 C는 각각 투여군 및 비히클 대조군의 종양 중량을 나타낸다.

실험 종료: 동물의 건강 상태가 계속 악화되거나 또는 동물의 종양 부피가 2,000 mm³ 이상이거나, 또는 심한 질병 또는 통증이 있는 경우, 동물을 안락사시켜야 한다. 아래의 정황이 나타나는 경우, 수의사에게 통보하고, 동물을 안락사시켜야 한다:

이 경우에서는 실험을 중단해야 한다:

확실히 마름, 20% 이상의 체중 감소;

음식과 물을 자유롭게 이동할 수 없음;

대조군의 평균 종양 부피가 2,000 mm³에 도달.

동물은 다음과 같은 임상 증상을 나타내며 지속적으로 악화된다:

○ 털 세움(Piloerection)

○ 활처럼 굽은 등(Arched back)

○ 창백한 귀, 코, 눈 또는 발

○ 급한 호흡

○ 경련

○ 지속적인 설사

○ 탈수

○ 느린 동작

○ 소리

데이터 분석: 3종 이상의 그룹을 비교하기 위해 일원분산분석(One-way ANOVA)를 사용하였다. F 값에 상당한 차이가 있는 경우, ANOVA 분석 후에 여러 비교를 수행해야 한다. 모든 데이터는 SPSS 17.0을 사용하여 분석하였다. p <0.05는 유의한 차이를 보였다.

인간 대장암 CO-04-0032 세포의 피하 이종 이식 종양 모델에서의 시험 약의 생체 내 약력학 연구:

실험 설계:

인간 종양 이식 모델의 확립: 인간 결장암 CO-04-0032 모델은 수술에서 제거된 종양 표본에서 본래 유래하였다. 검체의 획득 및 사용은 환자의 정보에 입각한 동의를 포함하여, 국가, 병원 및 회사의 윤리적인 법률 및 규정을 엄격하게 준수하였다. 계대 세대를 명명하는 규칙은 다음과 같다: 누드 마우스 내에 종양 검체를 접종한 후의 종양을 P0 세대로 명명하고, 연속 계대를 P1 세대로 명명하고, 등등 다시 제작된 표본은 FP로 명명하였다. 본 실험에 사용한 종양 조직은 FP4 세대였다.

동물: BALB/c 누드 마우스, 암컷, 6-8 주량, 체중 18-20 g, Shanghai Sippr-BK Laboratory Animal Co., Ltd. 제공.

종양 접종: CO-04-0032 종양 조직 약 30 mm³의 부피를 각 마우스의 오른쪽 등 속에 피하 접종하고; 평균 종양 체적 부피가 약 100~200 mm³에 도달했을 때, 마우스를 그룹으로 나누고, 각 그룹에 약물을 투여하였다.

실험 결과: 본 발명의 화합물 1(이의 결정형 IX 포함)의 투여 15일부터 30일까지 종양 부피 증가가 거의 없었으며, 양성 대조 약물 BKM120과 비교하여, 화합물 1(이의 결정형 IX 포함)은 대장암에 대해 보다 우수한 항-종양 활성을 갖는다.

인간 위암 ST-02-0013의 피하 이종 이식 종양 모델에서의 시험 약의 생체 내 약력학 연구

실험 설계:

인간 종양 이식 모델의 확립: ST-02-0013의 PDX 모델은 수술로 제거된 임상 표본에서 본래 유래하였으며, 누드 마우스에 이식하여 P0으로 지정하였다. P0 종양을 이식한 다음 세대는 P1 세대로 지정하였으며, 마우스 내에서 세대 간 연속 이식에 의해 종양에 대해서도 계속되었다. FP2 종양은 FP3 종양을 얻기 위해 다시 제작하였다. FP3 종양을 계대시켜 본 연구에 사용된 FP4 종양을 얻었다.

동물: BALB/c 누드 마우스, 암컷, 6-8 주령, 체중 18-22 g, Shanghai Ling Chang Biotechnology Co., Ltd. 제공.

종양 접종: ST-02-0013 FP4 종양 조직 약 30 mm³의 부피를 각 마우스의 오른쪽 등 속에 피하 접종하고; 평균 종양 체적 부피가 약 150~200 mm³에 도달했을 때, 마우스를 그룹으로 나누고, 각 그룹에 약물을 투여하였다.

실험 결과: 본 발명의 화합물 1(이의 결정형 IX 포함)의 투여 15일부터 30일까지 종양 부피 증가가 거의 없었으며, 양성 대조 약물 BKM120과 비교하여, 화합물 1(이의 결정형 IX 포함)은 위암에 대해 보다 우수한 항-종양 활성을 갖는다.

Claims

하기 화학식으로 표시되는 화합물 1의 결정형 IX:
[화합물 1]

결정형 IX는 X-선 회절 패턴에서 2θ= 7.947°, 10.073°, 14.531°, 19.187°, 21.237°, 24.055°, 25.497°; 전형적으로 2θ= 7.947°, 10.073°, 11.970°, 13.468°, 14.531°, 15.911°, 19.187°, 21.237°, 24.055°, 25.497°; 보다 전형적으로 2θ= 7.947°, 10.073°, 11.970°, 13.468°, 14.531°, 15.911°, 19.187°, 19.561°, 21.237°, 23.446°, 24.055°, 25.497°, 27.074°에서 회절 피크를 갖는 것이 특징임.
제1항에 있어서, XRPD 패턴 분석 데이터가 하기와 같은 것이 특징인 결정형 IX:

.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 XRPD 패턴이 도 25에 도시된 바와 같은 것이 특징인 결정형 IX.
하기 화학식으로 표시되는 화합물 2:
[화합물 2]

.
X-선 회절 패턴에서 2θ= 10.154°, 12.285°, 14.511°, 16.328°, 24.311°, 26.188°; 전형적으로 2θ= 7.270°, 10.154°, 12.285°, 13.206°, 14.511°, 16.328°, 24.311°, 26.188°, 27.724°; 보다 전형적으로 2θ= 7.270°, 10.154°, 12.285°, 13.206°, 14.511°, 16.328°, 19.008°, 20.702°, 21.259°, 24.311°, 26.188°, 27.724°에서 회절 피크를; 가장 전형적으로 하기의 XRPD 패턴 분석 데이터를 가지는 것이 특징인, 제4항의 화합물 2의 결정형 I:

.
X-선 회절 패턴에서 2θ= 6.524°, 7.782°, 13.895°, 15.495°, 17.487°, 19.322°; 전형적으로 2θ= 6.524°, 7.782°, 11.628°, 13.895°, 15.495°, 17.487°, 19.322°, 20.962°, 23.269°; 보다 전형적으로 2θ= 6.524°, 7.782°, 11.628°, 13.895°, 15.495°, 17.487°, 19.322°, 20.962°, 23.269°, 24.257°, 26.009°, 31.533°에서 회절 피크를; 가장 전형적으로 하기의 XRPD 패턴 분석 데이터를 가지는 것이 특징인, 제4항의 화합물 2의 결정형 II:

.
X-선 회절 패턴에서 2θ= 6.979°, 9.939°, 14.392°, 16.107°, 20.982°, 25.990°; 전형적으로 2θ= 6.187°, 6.979°, 9.939°, 11.910°, 14.392°, 16.107°, 20.982°, 22.755°, 25.990°; 보다 전형적으로 2θ= 6.187°, 6.979°, 9.939°, 11.910°, 13.148°, 14.392°, 16.107°, 20.982°, 22.755°, 23.975°, 25.990°, 29.006°에서 회절 피크를; 가장 전형적으로 하기의 XRPD 패턴 분석 데이터를 가지는 것이 특징인, 제4항의 화합물 2의 결정형 III:

.
X-선 회절 패턴에서 2θ= 6.388°, 7.278°, 11.076°, 15.454°, 21.256°; 전형적으로 2θ= 6.388°, 7.278°, 11.076°, 12.102°, 15.454°, 16.091°, 18.912°, 21.256°; 보다 전형적으로 2θ= 6.388°, 7.278°, 11.076°, 12.102°, 15.103°, 15.454°, 16.091°, 18.912°, 21.256°, 21.846°에서 회절 피크를; 가장 전형적으로 하기의 XRPD 패턴 분석 데이터를 가지는 것이 특징인, 제4항의 화합물 2의 결정형 IV:

.
X-선 회절 패턴에서 2θ= 7.116°, 14.137°, 15.911°, 22.223°, 24.610°; 전형적으로 2θ= 7.116°, 14.137°, 15.911°, 21.691°, 22.223°, 24.213°, 24.610°, 28.987°에서 회절 피크를; 가장 전형적으로 하기의 XRPD 패턴 분석 데이터를 가지는 것이 특징인, 제4항의 화합물 2의 결정형 V:

.
X-선 회절 패턴에서 2θ= 5.775°, 11.770°, 14.415°, 15.753°, 22.518°, 26.623°; 전형적으로 2θ= 5.775°, 11.770°, 14.415°, 15.753°, 17.132°, 20.939°, 22.518°, 26.623°; 보다 전형적으로 2θ= 5.775°, 11.770°, 14.415°, 15.753°, 17.132°, 20.939°, 22.518°, 23.745°, 26.623°, 31.295°에서 회절 피크를; 가장 전형적으로 하기의 XRPD 패턴 분석 데이터를 가지는 것이 특징인, 제4항의 화합물 2의 결정형 VI:

.
하기 화학식으로 표시되는 화합물 3:

.
X-선 회절 패턴에서 2θ= 6.325°, 12.677°, 15.813°, 21.395°, 22.519°, 27.133°; 전형적으로 2θ= 6.325°, 12.677°, 13.251°, 15.813°, 18.954°, 21.395°, 22.519°, 25.161°, 27.133°; 보다 전형적으로 2θ= 6.325°, 12.677°, 13.251°, 15.813°, 16.565°, 18.954°, 21.395°, 22.519°, 24.117°, 25.161°, 26.405°, 27.133°에서 회절 피크를; 가장 전형적으로 하기의 XRPD 패턴 분석 데이터를 가지는 것이 특징인, 제11항의 화합물 3의 결정형 VII:

.
하기 화학식으로 표시되는 화합물 4:

.
X-선 회절 패턴에서 2θ= 5.889°, 11.002°, 12.518°, 14.906°, 17.825°, 22.814°, 25.555°; 전형적으로 2θ= 5.889°, 7.173°, 11.002°, 11.396°, 12.518°, 12.895°, 14.906°, 17.825°, 22.814°, 25.555°; 보다 전형적으로 2θ= 5.889°, 7.173°, 11.002°, 11.396°, 12.518°, 12.895°, 14.906°, 16.169°, 17.825°, 19.875°, 21.574°, 22.814°, 25.555°, 27.254°에서 회절 피크를; 가장 전형적으로 하기의 XRPD 패턴 분석 데이터를 가지는 것이 특징인, 제13항의 화합물 4의 결정형 VIII:

.
제1항 내지 제3항, 제5항 내지 10항, 제12항 및 제14항 중 어느 한 항의 결정형을 포함하는 결정질 조성물로서, 상기 결정형은 결정질 조성물의 50 중량% 이상, 바람직하게는 80 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 90 중량% 이상, 가장 바람직하게는 95 중량% 이상으로 존재 하는 것인, 결정질 조성물.
제4항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 10항, 제12항 및 제14항 중 어느 한 항의 결정형, 또는 제15항의 결정질 조성물을 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 치료적 유효량의 화합물 또는 결정형 또는 결정질 조성물, 및 임의적으로 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 및/또는 매질을 포함하는 것인, 약학적 조성물
PI3K 키나아제 관련 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 10항, 제12항 및 제14항 중 어느 한 항의 결정형, 또는 하기 화학식으로 표시되는 화합물 1, 또는 제4항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이들의 결정질 조성물, 또는 이들의 약학적 조성물의 용도로서, 상기 PI3K 키나아제 관련 질환은 바람직하게는 암, 보다 바람직하게는 대장암 및 위암 중에서 선택되는 것인, 용도:
[화합물 1]

.
치료적 유효량의 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 10항, 제12항 및 제14항 중 어느 한 항의 결정형, 또는 제4항, 제11항 및 제13항 중 어느 한 항의 화합물, 또는 이들의 결정질 조성물 또는 이들의 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 PI3K 키나아제 관련 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 PI3K 키나아제 관련 질환은 바람직하게는 암, 보다 바람직하게는 대장암 및 위암 중에서 선택되는 것인, 방법.
하기 단계를 포함하는 하기 화학식으로 표시되는 화합물 1의 제조 방법:

[화합물 1]

.
식 중에서,
X는 Cl 또는 Br로부터 선택되고,
알칼리 C는 피리딘, 2,6-루티딘, Et₃N, 4-DMAP, LiOH, Cs₂CO₃, 또는 K₂CO₃으로부터 선택되고;
용매 c는 피리딘, 디클로로메탄, 톨루엔, 아세토니트릴, 아세톤, DMF 또는 THF로부터 선택되고;
화합물 7 대 화합물 8의 몰 비는 1:1-3, 바람직하게는 1:1.2~1.6이고;
화합물 7 대 알칼리 C의 몰 비는 1:1~3이다.
제19항에 있어서, 하기 단계를 포함하는 것인 방법:

;

식 중에서,
알칼리 A는 탄산칼륨, 탄산나트륨, 탄산세슘, 수산화칼륨 또는 수산화나트륨으로부터 선택되고;
용매 a는 DMF, DMSO, 또는 NMP로부터 선택되고;
알칼리 B는 탄산칼륨, 탄산나트륨, 수산화바륨, 인산칼륨, 탄산세슘, 불화칼륨, 불화세슘, 수산화나트륨, t-부톡시화칼륨, t-부톡시화나트륨, 아세트산칼륨 또는 아세트산나트륨으로부터 선택되고;
용매 b는 1,4-디옥산, DMSO, THF, 1,4-디옥산/물 또는 THF/물로부터 선택되고;
용매 b 내에서 1,4-디옥산 또는 THF 대 물의 부피 비는 3~6:1, 바람직하게는 5:1이고;
촉매는 Pd(dppf)Cl₂, 또는 Pd(PPh₃)₄로부터 선택되고;
2-디메틸아미노에틸 클로라이드 또는 2-디메틸아미노에틸 브로마이드는 이들의 염의 형태일 수 있다.
화합물 1의 제조를 위한 중간체로서, 하기 화학식으로 표시되는 화합물:

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