KR20180083352A - 비만 및 비만 관련 대사 증후군을 치료하기 위한 비피더스균 롱검 - Google Patents
비만 및 비만 관련 대사 증후군을 치료하기 위한 비피더스균 롱검 Download PDFInfo
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Abstract
비피더스균 롱검 AH1362(NCIMB 41715)는 폴리사카라이드를 생성하고 에너지 배출을 증가시킨다. 이러한 균주는 비만과 비만 관련 대사 증후군의 예방이나 치료에 사용된다.
Description
본 발명은 비피더스균 롱검(Bifidobacterium longum)의 균주와 관련이 있다.
비만은 21세기의 가장 심각한 공중 보건 문제 중 하나이다. 전 세계적으로 성인의 약 13%가 비만이고 39%는 과체중으로 간주된다(WHO, 2015년). 비만은 에너지 섭취와 비용 지출 사이의 장기적인 불균형의 결과이며 유전적이고 환경적인 요인에 의해 영향을 받는 다인성 장애이다. 비만은 인술린 저항성과 만성적인 저등급 염증에 의해 특징되어 진다(Gregor and Hotamisligil, 2011, Kahn et al., 2006). 면역 체계, 신진대사, 그리고 내장 미생물 사이의 밀접한 상호 작용은 비만과 신진대사 항상성(homeostasis)을 조절하는데 중요한 역할을 할 수도 있다. 비만은 BMI가 증가함에 따라 동시에 대사 동력성(comorbidities)의 확산이 증가하고 있는 상태(Gupta et al., 2015)에서 제2형 당뇨병(T2DM), 비알콜성 지방 간질환(NAFLD), 고혈압, 아테로마성 동맥 경화증, 이상 지혈증, 심장 혈관병(Guh et al., 2009)과 같은 만성 대사 질환의 클러스터를 발생시키고 악화시킬 위험성을 증가시키게 된다. 비만은 또한 알레르기와 천식, 골관절염, 담낭병, 그리고 간에서 지방이 증가되어 간경변증의 주 원인 질환이 되는 비알콜성 지방 간염(NASH)과 같은 심각하고 생명을 위협할 수 있는 간질환의 발생 위험을 증가시킨다.
대사 증후군은 증가하고 있는 공통적인 증상이며, 비만, 고혈당 혈증(hyper lipidemia : high triglycerides), 고혈압(high blood pressure), 포도당 과민증(high blood sugar) 및 저 HDL 콜레스테롤의 조합을 말한다. 이러한 위험 요소는 제2형 당뇨병(T2D)과 심장 혈관 질환의 위험이 높은 환자를 식별하는 데 도움이 된다.
비알콜성 지방 간 질환(NAFLD)은 매우 흔한 질환으로 알콜을 거의 마시지 않거나 아예 마시지 않는 사람들의 간에 과다한 지방이 축적되는 질환을 말한다.
더 심각한 형태의 NAFLD는 비알콜성 지방 간염(NASH)이라고 불린다. NASH는 간을 부풀게하여 손상을 입힌다. NASH는 과체중이거나 비만인 사람들이나 당뇨병, 높은 콜레스테롤 수치 또는 높은 중성 지방을 가진 사람들 사이에서 발전하는 경향이 있다.
많은 임상 및 실험 데이터에서 증가된 인공 지방 조직으로부터 얻은 자유 지방산의 흐름이 증가하면 인슐린 저항성과 관련된 NAFLD가 발생될 수 있다. 따라서 비만, 인슐린 저항성 및 이상 지혈증이 있는 사람들은 NAFLD를 유발시킬 수 있는 가장 큰 위험에 처하게 된다.
무균 상태에서 자란 쥐들이 종래 배양된 쥐들보다 날씬해 졌다는 관찰이 있었기 때문에(Backhed et al., 2004), 비만의 진행에 대한 내장 미생물의 기여가 점점 더 연구되고 있다(Backhed et al., 2007, Cani et al., 2008b, Ridaura et al., 2013, Vrieze et al., 2012). 비만에 대한 장내 미생물학의 기여는 다양한 요소가 있으며, 증가된 에너지 수확(harvest)과 지방 저장(Turnbaugh et al., 2006), 변경된 대사 경로(Kotzampassi et al., 2014, Turnbaugh et al.,), 만성적인 낮은 단계의 염증으로 이어지는 박테리아의 이동(Cani et al., 2007, Cani et al., 2008a)과 같은 문제들을 포함한다. 따라서 프로바이오틱스에 의한 내장 마이크로비오타의 조작은 비만을 개선하고 대사 건강을 개선하는 데 도움이 되는 잠재적인 치료 도구이다. 유산균 균주는 일반적으로 프로바이오틱스로 사용되며, 균주 특정 방식(strain specific manner)으로 체내에서 건강 유익한 효과를 지원하는 상당히 많은 증거를 가지고 있다(Aronsson et al., 2010, Lee et al., 2006, Naito et al., 2011).
이러한 균주들의 작용 메커니즘은 뚜렷하게 특징 지어지지 않는다. 관심 있는 분자 그룹 중 하나는 박테리아성 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharides :EPS)이다. EPS는 당 잔류물로 구성되고 박테리아에 의해 주변 환경으로 분비되는 고분자 중량 중합체이다. 엑소폴리사카라이드(Exopolysaccharide : EPS)-생성 박테리아는 면역 모듈 효과가 있는 것으로 나타났다(Fanning et al., 2012, Hidalgo-Cantabrana et al., 2014, Vinderola et al., 2006, Volman et al., 2008, Jones et al., 2014). 많은 젖산 박테리아(LAB)는 EPS를 합성할 수 있는 능력을 가지고 있다. 그러나 EPS는 이질적인 분자이며, 관찰된 균주 고유의 생물학적 특성을 설명할 수 있는 성분, 전하 및 분자 구조면에 있어서는 다르다(Adams et al., 2008, Bland et al., 2004, Hidalgo-Cantabrana et al., 2012, Kankainen et al., 2009).
비만 및 대사 질환과 관련된 만성적인 낮은 단계의 염증(Gregor and Hotamisligil, 2011)은 비만 발생에 대해서 유리하게 영향을 미칠 수 있도록 하기 위해 프로바이오틱스의 관리에 의해 조작될 수 있는 하나의 위험 요인이다. 우리는 이전에 또 다른 젖산 박테리아인 B. longum NCIMB 41003이 항염증 효과를 가지고 있다는 것을 입증했다. 이러한 박테리아는 기본적으로 EPS 코팅을 가지고 있다. EPS물질은 또한 WO2010055499 A에 설명된 바와 같이 항염증 효과를 가지고 있다.
본 발명은 기탁된 균주 NCIMB 41715를 제공한다. 기탁 번호 NCIMB 41715에 따라 NCIMB에 기탁된 비피더스균 롱검(Bifidobacterium longum : AH1362) 균주이다.
한 양태에 따르면, 본 발명은 비만의 예방이나 치료 그리고 비만과 관련된 대사 증후군에 사용하기 위해 유효한 양의 균주를 포함하는 혼합물을 제공한다. 그 균주는 폴리사카라이드를 생성하고 에너지 배출을 증가시킨다. 그 균주는 플라시보를 먹은 건강한 성인 자원 봉사자의 배설물 시료로부터 분리되었다.
본 발명의 분리된 균주는 인체에 기탁된 체지방을 줄이는 데 사용될 수 있다. 이러한 균주는 체중 증가를 차단하거나 체중을 줄이는 데 사용될 수 있다. 이러한 균주는 과도한 체지방 축적으로 인한 질병의 치료, 예방 또는 완화에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 비만을 예방하거나 치료하기 위해서, 비만을 예방하거나 치료가 필요한 대상에 대해서, 기탁 번호 NCIMB 41715에 따라 NCIMB에 기탁된 균주를 포함하는 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 비만 관련 대사증후군을 예방하거나 치료하기 위해서, 비만관련 대사 증후군을 예방하거나 치료가 필요한 대상에 대해서, 기탁 번호 NCIMB 41715에 따라 NCIMB에 기탁된 균주를 포함하는 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 비알콜성 지방 간질환(NAFLD)을 예방하거나 치료하기 위해서, 비알콜성 지방 간질환(NAFLD)을 예방하거나 치료가 필요한 대상에 대해서, 기탁 번호 NCIMB 41715에 따라 NCIMB에 기탁된 비피더스균 롱검(Bifidobacterium longum : AH1362)의 균주를 포함하는 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
그 균주는 생존 가능한 생세포(viable cell)의 형태로 실현될 수 있다. 그 균주는 생존할 수 없는 세포 형태(non-viable cell)일 수 있다. 일반적으로 프로바이오틱 박테리아의 사용은 생세포의 형태이다. 그러나, 사용은 또한 사멸된 배양액, 생존 및 비생존 배양약의 혼합물 또는 프로바이오틱 박테리아에 의해 발현되는 유익한 요소를 포함하는 혼합물과 같은 비생존 세포들에 이르도록 연장될 수 있다. 이것은 변경된 pH에 노출되거나 압력 또는 감마선 조사 단계를 거쳐 사멸된 미생물 또는 열에 의해 사멸된미생물이 포함될 수 있다. 비생존 세포 제품을 준비하는 것이 더 간단하기 때문에, 세포는 의약품에 쉽게 포함될 수 있고, 저장 요구 사항은 생세포보다 훨씬 덜 제한적이다. Lactobacillus casei. YIT 9018은 미국 특허 번호 US4347240호에 기술된 종양 성장을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법으로서 열에 의해 사멸된세포를 효과적으로 사용하는 실시예를 제공하고 있다.
또한 본 발명은 여기에 기술된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 추가적으로 프로바이오틱 물질로 구성될 수 있다. 조성물은 추가적으로 프리바이오틱 물질로 구성될 수 있다. 조성물은 추가적으로 캐리어로 구성될 수 있다. 캐리어는 섭취 가능한 캐리어가 되거나, 캡슐, 태블릿 또는 분말과 같은 약학적으로 허용 가능한 캐리어가 될 수 있다. 섭취 가능한 캐리어는 산성화된 우유, 요구르트, 냉동 요구르트, 분유, 우유 농축액, 치즈 스프레드, 드레싱 또는 음료와 같은 식료품이 될 수 있다. 몇가지 예는 발효 우유 제품과 같은 발효 식품을 포함한다. 조성물은 단백질 및/또는 펩타이드, 특히, 글루타민/글루타민산염, 지질, 탄수화물, 비타민, 미네랄 및/또는 미량 원소(trace element)가 풍부한 단백질 및/또는 펩타이드로 구성될 수 있다. 비피더스균의 균주는 조성물의 그램 당 106 cfu 보다 많은 양으로 존재할 수 있다. 그 조성물은 추가로 보조제(adjuvant)로 구성될 수 있다. 조성물은 추가적으로 박테리아 성분으로 구성될 수 있다. 조성물은 추가적으로 약물 제품으로 구성될 수 있다. 조성물은 추가적으로 생물학적 화합물로 구성될 수 있다. 모든 경우에 있어서, 조성물은 여기에 기술된 균주를 포함하며 캐리어 또는 다른 약제를 포함할 수 있다. 이러한 캐리어 또는 다른 약제는 경우에 따라서 자연스럽게 발생하지 않는다. 조성물은 어떤 경우에는 면역 및 예방 접종 프로토콜에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 균주 또는 본 발명의 조성물로 구성된 동결 건조된 혼합물을 제공한다.
본 발명은 또한 식품에 사용하기 위해 여기서 설명한 대로 균주 또는 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 의료용으로 사용하기 위해 여기서 설명한 균주 또는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 비만 및 관련 질병의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 여기서 설명한 대로 균주 또는 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 비알콜성 지방간 질환(NAFLD)의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 여기에서 설명한 균주 또는 조성물을 제공한다.
여기에 설명된 균주는 IL-10 수준을 수정하기 위해 생물학적 매개체의 패널을 준비하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 비만 관련 염증의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위해 여기서 설명한 바와 같은 균주 또는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 비만 관련 대사 조절장애의 치료 및/또는 예방법에 사용하기 위해 여기에 설명된 균주 또는 조성물을 제공한다.
본 발명의 특정한 균주는 캡슐, 마이크로캡슐, 태블릿, 과립체(granule), 분말, 트로치, 알약, 좌약, 현탁액 및 시럽과 같은 전통적인 조제물에서는 입으로 소화할 수 있는 형태로 동물(인간 포함)에게 투여될 수 있다는 것을 알 수 있을 것이다. 적합한 조성물은 종래의 유기 및 무기 첨가제를 사용하여 일반적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 의학적 혼합물의 활성 성분의 양은 원하는 치료 효과를 발휘하는 수준일 수 있다.
조성물은 또한 박테리아 성분, 약제품 또는 생물학적 화합물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 균주로 구성된 백신은 기존의 어느 적합한 방법을 사용하여 준비될 수 있으며, 약학적으로 수용 가능한 캐리어 또는 보조제를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 기탁된 균주의 활동성을 가지는 동시에, 변이주(mutants)와 본 발명의 균주로부터 도출되는 변종(variant)이 포함된다. 변이와 변종은 모 균주(parent strain)에 비해 유전자 및/또는 표현 특성(phenotypic properties)이 변경되는 균주를 포함한다. 자연적으로 발생하는 변종은 선택적으로 고립된 표적 특성의 자발적 변경을 포함한다. 모 균주의 계획적인 변경은 유전자 붕괴, 결합 전이 등과 같은 전통적인(체외) 유전자 조작 기술에 의해 수행된다. 유전자 수정은, 예를 들어, 플라스미드 DNA를 포함하는 벡터들, 또는 박테리오파지들을 이용하여, 외인성 및/또는 내인성의 DNA 서열(exogenous and/or endogenous DNA sequences)을 균주의 게놈에 도입하는 것을 포함한다.
자연적 또는 유도된 변이는 삭제, 삽입, 변이(transversion) 또는 DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열의 변경을 초래할 수 있는 다른 DNA 수정과 같은 최소한 단일 베이스 변경들을 포함한다.
변이, 균주 및 유전적으로 변형된 변이라는 용어는, 자연적 변이를 통해 발생하는 모든 미생물 및/또는 유전자 변경 및/또는 게놈(체외에서 진행되는)의 고의적 조작에 의해 달성되지 않지만, 항생 물질과 같은 환경에 노출될 때 박테리아의 생존을 지원하는 선택적인 장점을 제공하는 균주 및/또는 변이의 자연적인 선택을 통해 달성되는 유전자의 획득 및/또는 유전자의 손실에 대해 본질적으로 일정하지 않은 비율로, 게놈에 기탁된 유전자 변경을 거친 균주를 또한 포함한다. 변이는, 유기체의 생화학적 기능을 근본적으로 변화시키지는 않지만, 그 약품들이 박테리아의 식별 또는 선택을 위해, 예를 들어, 항생제 내성을 위해, 사용될 수 있는 특정 유전자들을, 의도적으로 게놈의 내부에 (체외적으로) 삽입함으로써 생성될 수 있다.
당업자들은 변이나 변형된 균주가 모 균주와의 DNA 염기 서열 동족관계(homology) 분석에 의해 식별될 수 있다는 것을 알게 될 것이다. 입증할 수 있는 표현형(phenotypic)이거나 또는 측정 가능한 기능적 차이가 없는 모 균주와 근접한 서열 식별성을 가지는 균주들은, 변이 또는 변형된 균주 계통으로 간주될 수 있다. 모 DNA 서열에서 99.5% 이상의 서열 식별성ID(동족 관계)을 가지는 균주는 변이 또는 변종으로 간주될 수 있다. 서열 동족 관계는, 온라인 호모로지 알고리즘 "BLAST"프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, http://www.ncbi.nlm.nih,gov/BLAST/에서 공개적으로 사용할 수 있다.
또한 모 균주의 변이는 모 균주의 16s- 23s 유전자 사이의 스페이서 폴리뉴클레오티드 서열에 대해서 95.5% 이상의 서열 동족 관계를 가지는 파생 균주를 포함한다. 이러한 변이들은 박테리아 게놈의 다른 DNA서열에서 DNA변이를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 다음 도면들을 참조하여, 단지 예로 주어진 일부 실시예의 다음 설명을 통해 보다 명확하게 이해될 것이다.
도 1은, EPS 편안한 펠렛 높이 만큼 측정된 B. longum NCIMB 41003 및 B. longum NCIMB 41003의 균주 벌키성(bulkiness)을 도시한 도면이다.
도 2는, B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 헥사데칸에 대한 %점착도를 나타내는 막대 도면이다.
도 3은, EPS+ve B. longum NCIMB 41003과 낮은 EPS 생성 유산균(Lactobacillus) 균주를 이용하여 48시간 자극 후에 PBMC 시토카인 유도 분석에서 IL-10 유도를 나타내는 도면이다. EPS의 낮은 유산균 균주에 대해서 EPS+ve B. longum NCIMB 41003과의 자극 후에 항염증 시토카인 IL-10의 유도가 강화되었다.
도 4는, B. longum NCIMB 41030과 낮은 EPS 생성 유산균(Lactobacillus) 균주를 이용하여 48시간 자극 후에 PBMC 시토카인 유도 분석에서 TNF-α 유도를 나타내는 도면이다. EPS의 낮은 유산균 균주에 대해서 EPS+ve B. longum NCIMB 41003을 사용한 자극 후에 염증을 발생시키는 시토카인 TNF-α유도의 유도력이 감소한다.
도 5는, B. longum NCIMB 41003 및 B. longum NCIMB 41715를 사용하여 48 시간 자극 후에, PBMC 시토카인 유도 분석에서 IL-10유도를 나타내는 도면이다. 두 개의 균주 모두, 투입 반응 방식으로, 항염증 시토카인의 수준과 유사한 수준을 유도한다.
도 6은, B. longum NCIMB 41003 및 B. longum NCIMB 41715를 사용하여 48 시간 자극 후에, PBMC 시토카인 유도 분석에서 TNF-α유도를 나타내는 도면이다. B. longum NCIMB 41715는, B. longum NCIMB 41003에 대해 TNF-α와 유사한 수준을 유도한다.
도 7은, 고 지방 다이어트(HFD) 대조군과 비교했을 때에, B. longum NCIMB 41715는 16주까지 지방 질량 증가가 크게 감소한 반면, B. longum NCIMB 41003은 유의미한 영향을 미치지 않았다.
도 8은, 지방 패드 중량에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과를 나타내는 도면이다. B. longum NCIMB 41715는 지방 패드 중량(피하 지방 및 부고환 지방(epipidymal fat)이 크게 감소했지만 B. longum NCIMB 41003은 유의미한 영향을 미치지 않았다.
도 9는, B. longum NCIMB 41715와 B. longum NCIMB 41003이 간 전체의 콜레스테롤과 트리글리세리드에 미치는 영향을 보여 주는 도면이다. B. longum NCIMB 41003를 제외한 B. longum NCIMB 41715는, DIO 마우스에서 간 전체 콜레스테롤과 트리글리세리드를 감소시켰다.
도 10은, 혈장 전체 콜레스테롤에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과를 나타내는 도면이다.
도 11은, 혈장 LDL-콜레스테롤에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과를 나타내는 도면이다.
도 12는, 혈장 VLDL-콜레스테롤에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과를 나타내는 도면이다.
도 13은, 말단(terminal) 혈당에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과를 나타내는 도면이다.
도 14는, DIO 마우스 모델의 고 지방 식이 요법(HFD) 대조군과 비교한 경우, B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003을 투여한 후에 각 마우스에 대한 누적 음식 섭취량을 나타내는 도면이다.
도 15는, DIO 마우스 모델의 고 지방 식이 요법(HFD) 대조군과 비교한 경우, B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003을 투여한 후에, 누적 에너지 배출의 %추정치를 나타내는 도면이다.
도 1은, EPS 편안한 펠렛 높이 만큼 측정된 B. longum NCIMB 41003 및 B. longum NCIMB 41003의 균주 벌키성(bulkiness)을 도시한 도면이다.
도 2는, B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 헥사데칸에 대한 %점착도를 나타내는 막대 도면이다.
도 3은, EPS+ve B. longum NCIMB 41003과 낮은 EPS 생성 유산균(Lactobacillus) 균주를 이용하여 48시간 자극 후에 PBMC 시토카인 유도 분석에서 IL-10 유도를 나타내는 도면이다. EPS의 낮은 유산균 균주에 대해서 EPS+ve B. longum NCIMB 41003과의 자극 후에 항염증 시토카인 IL-10의 유도가 강화되었다.
도 4는, B. longum NCIMB 41030과 낮은 EPS 생성 유산균(Lactobacillus) 균주를 이용하여 48시간 자극 후에 PBMC 시토카인 유도 분석에서 TNF-α 유도를 나타내는 도면이다. EPS의 낮은 유산균 균주에 대해서 EPS+ve B. longum NCIMB 41003을 사용한 자극 후에 염증을 발생시키는 시토카인 TNF-α유도의 유도력이 감소한다.
도 5는, B. longum NCIMB 41003 및 B. longum NCIMB 41715를 사용하여 48 시간 자극 후에, PBMC 시토카인 유도 분석에서 IL-10유도를 나타내는 도면이다. 두 개의 균주 모두, 투입 반응 방식으로, 항염증 시토카인의 수준과 유사한 수준을 유도한다.
도 6은, B. longum NCIMB 41003 및 B. longum NCIMB 41715를 사용하여 48 시간 자극 후에, PBMC 시토카인 유도 분석에서 TNF-α유도를 나타내는 도면이다. B. longum NCIMB 41715는, B. longum NCIMB 41003에 대해 TNF-α와 유사한 수준을 유도한다.
도 7은, 고 지방 다이어트(HFD) 대조군과 비교했을 때에, B. longum NCIMB 41715는 16주까지 지방 질량 증가가 크게 감소한 반면, B. longum NCIMB 41003은 유의미한 영향을 미치지 않았다.
도 8은, 지방 패드 중량에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과를 나타내는 도면이다. B. longum NCIMB 41715는 지방 패드 중량(피하 지방 및 부고환 지방(epipidymal fat)이 크게 감소했지만 B. longum NCIMB 41003은 유의미한 영향을 미치지 않았다.
도 9는, B. longum NCIMB 41715와 B. longum NCIMB 41003이 간 전체의 콜레스테롤과 트리글리세리드에 미치는 영향을 보여 주는 도면이다. B. longum NCIMB 41003를 제외한 B. longum NCIMB 41715는, DIO 마우스에서 간 전체 콜레스테롤과 트리글리세리드를 감소시켰다.
도 10은, 혈장 전체 콜레스테롤에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과를 나타내는 도면이다.
도 11은, 혈장 LDL-콜레스테롤에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과를 나타내는 도면이다.
도 12는, 혈장 VLDL-콜레스테롤에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과를 나타내는 도면이다.
도 13은, 말단(terminal) 혈당에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과를 나타내는 도면이다.
도 14는, DIO 마우스 모델의 고 지방 식이 요법(HFD) 대조군과 비교한 경우, B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003을 투여한 후에 각 마우스에 대한 누적 음식 섭취량을 나타내는 도면이다.
도 15는, DIO 마우스 모델의 고 지방 식이 요법(HFD) 대조군과 비교한 경우, B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003을 투여한 후에, 누적 에너지 배출의 %추정치를 나타내는 도면이다.
2010년 5월 6일, 영국, 스코틀랜드, AB21A 9YA, 애버딘, 벅스번, 크라이브스톤 에스테이트, 퍼거슨 빌딩 소재의 산업 및 해양 박테리아 주식회사(NCIMB)의 국가 기탁 기관에서에서 비피더스균 롱검 AH1362(Bifidobacterium longum AH1362)의 기탁이 만들어졌다. 기탁 번호는 NCIMB 41715호가 부여되었다.
이 기탁은 또한, 1999년 1월 13일, 영국, 스코틀랜드, AB21A 9YA, 애버딘, 벅스번, 크라이브스톤 에스테이트, 퍼거슨 빌딩 소재의 산업 및 해양 박테리아 주식회사(NCIMB)의 국가 기탁 기관에 기탁 되어 있고, 기탁 번호 NCIMB 41003호가 부여되어 있는 균주 비피더스균 롱검 AH1362(Bifidobacterium longum AH1362)와 비교하여 언급하고 있다.
보기
다음의 예는 발명의 범위 내에서 실시예들을 설명하고 증명하는 것이다. 이러한 예들은 단지 설명을 위한 목적으로만 제공되며, 본 발명의 정신과 범위에서 벗어나지 않고 많은 균주이 가능하기 때문에, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
우리는 새로운 EPS 생산 비피더스균 균주(B.longum AH1362)가 비만과 관련된 마커들 및 대사 관련 질환들을 감쇠시켰다는 것을 발견했다. B.longum AH1362 투여는, 장내 미생물의 변화, 지방 저장량의 감소, 간 중성지방 감소, 전체 간 콜레스테롤 수치의 감소, 지방 배출의 증가와 관련이 있었다. 놀랍게도, B.longum NCIMB 41003의 투여는 동일한 효과를 나타내지 못했다.
실시예 1-유전자간 스페이서(intergenic Spacer : IGS))영역의 BLAST 분석을 통해
B.longum
NCIMB 41715의 식별의 확인.
방법
B.longum NCIMB 41715를 식별하기 위해 16s-23s 유전자간 스페이서(IGS) 시퀀싱이 수행되었다. 간단히 말해서, 총 DNA는 추출 용액 100μl, 조직 준비 용액(Sigma-Aldrich, XNAT2 Kit)의 25μl를 사용하여 균주로부터 분리되었다. 샘플은 실온에서 5분간 배양한 후 95°C에서 2시간 동안 배양한 후 100μl의 중성화 용액(Sigma-Aldrich, XNAT2 kit)을 주입했다. DNA용액은 나노 드롭 분광 광도계를 이용하여 정량화되고 4°C에서 저장되었다. PCR은 IGS 프라이머(primer)를 사용하여 수행되었다. 두 균주를 식별하기 위해 사용된 프라이머 쌍은 IGS R 5'-CTGGTGCCAAGGCATCCA-3'과 IGS L 5'-GCTGGATCACCTCCTTTCT-3'이었다. 사이클링 조건은 4분 동안 94°C(1 싸이클), 45초 동안 94°C, 45초 동안 53°C, 45초 동안 72°C(28 싸이클)이 되었다. PCR반응에는 DNA 2μl(100ng), PCR 혼합(Sigma-Aldrich, RedTaq), 0.025 nM IGS L 및 R 프라이머(MWG Biotech, Germany)가 포함되었다. PCR 반응은 Eppendorf 써머싸이클러(thermocycler)에서 수행되었다. PCR 제품은 IGS프로파일을 결정하기 위해서, TAE의 2% 아가로스(agarose) EtBr 염색 겔에서 분자 중량 마커(100 bp Ladder, Roche)에 따라 이동되었다. 비피더스균(단일 밴드)의 PCR 제품은 Promega Wizard PCR 정화 키트를 사용하여 정제되었다. 유산균의 PCR제품은 3개의 밴드를 생산한다. 그 밴드는 약 280 bp(최하위 밴드)에 존재하며 GenElute Agarose Spin Column(Sigma-Aldrich)을 사용하여 삭제되고 정제되고, 재서열화 되었다(resequenced). Promega Wizard PCR 정화 키트를 이용하여 PCR 제품들이 정제되었다. 정제된 PCR 제품은 Beckman Coulter Genomics(UK)에서, 유전자 사이의 스페이서 영역에 대한 프라이머 시퀀스(상기)를 사용하여 서열화되었다. 그 다음에, 서열 데이터는 뉴클레오타이드 동족 관계에 따라 균주 의 식별을 결정하기 위해 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스에 대해 검색되었다. 최종 DNA 서열 데이터는 그 서열에 가장 근접하는 일치성을 식별하기 위해 NCBI 표준 뉴클레오타이드 - 뉴클레오타이드 동족 관계 BLAST 검색 엔진(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 이용했다.
결과들
표 1: 비피더스균 NCIMB 41715의 유전자간 스페이서(IGS : intergenic Spacer)영역의 블라스트(blast) 결과.
표 2: 비피더스균 NCIMB 41715의 유전자간 스페이서(IGS : intergenic Spacer)영역의 서열
실시예 2-EPS 플러피 펠렛 테스트(스트레인 벌키성)
방법
각 균주는 브로스(broth)에서 발효되었다. 원심 분리 후 수집된 시료는 세척된 후 냉동 건조되었다.
총 셀 번호(2 x 10E10)에 맞게 조절된, 냉동-건조 분말은 PBS 10ml 에 다시 현탁되고 4000rpm/10mins/4°C에서 원심분리되었다.
결과들
도 1: EPS 플러피(fluffy) 펠렛 높이로 측정한 B.Longum NCIMB 41715 및 B.Longum NCIMB 41003의 균주 벌키성(bulkiness)
B.Longum NCIMB 41003은 0.9cm의 플러피 펠렛 플러피(fluffy)를 생성했으며, B.Longum NCIMB 41715는 2.5cm의 플러피 펠렛을 생성했다.
결론
B.Longum NCIMB 41003은 높은 EPS 생성자(producer)로 알려져 있다. EPS 플러피 펠렛 테스트와 그 결과로 생긴 펠렛 높이는 B.Longum NCIMB 41715가 EPS를 생성하고, B.Longum NCIMB 41003보다 더 많은 EPS를 생성한다는 것을 입증했다.
실시예 3- 헥사데칸(hexadecan)에 대한 미생물 어드히션(MATH) 분석
소수성(hydrophobicity)은 물을 밀어내는 분자의 물리적 성질이다. 소수성 재료는 물에서 기름을 제거하고, 기름 유출을 관리하고, 극성 화합물에서 비극성 물질을 제거하기 위한 화학적 분리 과정에서 사용된다. 박테리아 세포의 소수성은 현존하는 단백질, 펩타이드, 폴리사카라이드와 관련하여 세포 표면의 구성에 달려 있다. 장내 점막에 대한 프로바이오틱 균주의 점착력은 박테리아 세포가 장내에서 경쟁적인 이점을 제공하면서 위장 통과 중에 스스로 안착하도록 돕는다. 균주의 소수성은 점착력에 기여하는 한 요소이다. 장내 표피 세포에 점착하는(adhere) 균주의 점착력의 지표로 사용되는 헥사데칸에 대한 박테리아 점착력의 결정은 유효한 우수한 접근법이다(Kiely & Olson, 2000).
방법
헥사데칸(MATH) 시험에 대한 미생물 점착력을 사용하여, B.longum NCIMB 41715와 B.longum NCIMB 41003의 헥사데칸에 대한 점착력이 소수성의 측정 지표로서 결정되었다. 헥사데칸에 대한 점착력은 일부 수정된 Rosenberg et al, 1980년의 방법에 따라 측정되었다(Crow and Gopal, 1995; Bellon-Fontaine et al, 1996). 박테리아는 15분 동안 5000g에서 원심 분리를 통해 증식하였고, PBS에서 두 번 세척하였으며, 0.1mol/l KNO3(pH 6.2)에서 OD600 of 0.8으로 다시 현탁되었다. 셀 현탁액의 흡광도는 600nm(A0)에서 측정되었다. 2ml의 헥사데칸(Sigma Aldrich)이 셀 현탁액의 2ml에 추가되었다. 실온에서 10분 사전 배양 후에, 2상 시스템이 2분간 교반하고 나서 혼합되었다. 수용액 형태는 실온에서 20분간 배양 후 제거되었으며, 그 흡수도는 600nm(A1)에서 측정되었다. 헥사데칸에 대한 박테리아 점착력의 백분율은 (1-A1/A0)x100으로 계산되었다. 여기서 A0과 A1은, 각각 용제로 추출하기 전과 추출한 후의 흡수제이다. 실험은 독립적인 배양에서 나온 세포들을 가지고 3번 행해졌다.
결과들
도 2 : 소수성의 척도로서 헥사데칸에 대한 B.longum NCIMB 41715 및 B.longum NCIMB 41003의 % 점착률
결론
B.longum NCIMB 41715(58.3%)는 헥사데칸에 대한 선호도가 높았으며, 이는 B.longum NCIMB 41004(28.6%)와 비교했을 때, 더욱 큰 소수성을 가지고 있다는 것을 나타내고 있다.
실시예 4 - PBMC 항염증 프로필
B.longum NCIMB 41715, B.longum NCIMB 41003, 및 세포 내 낮은 EPS 생산성을 가진 유산균 균주의 항염증 프로필은, 주변 혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell : PBMC) 시토카인 유도 분석에서, 항염증 시토카인 IL-10과 염증 유발성 시토카인 TNF-α의 유도를 평가하여 검사되었다.
방법
주변 혈액 단핵 세포(PBMC) 시토카인 유도 분석
혈액은 코크 티칭 병원의 임상 연구 윤리 위원회의 승인을 받은 3명의 건강한 지원자들로부터 획득했다. 모두 실험 대상자였으며 환자들은 헌혈을 하기 전에 한달 혹은 그 이상의 기간 동안 모두 프로바이오틱, 항생 물질, 또는 항염증 약물 사용을 삼가했다. PBMCs는 히스토파크(histopaque)(Sigma-Aldrich), 즉 혈액 층을 분리하는 친수성 폴리사카라이드를, 이용하는 밀도 기울기 분리에 의해 전체 혈액으로부터 추출되었다. 이 때에, PBMCs를 포함하는 플라즈마 층 아래에 형성된 '버피 코트(buffy coat)'가 형성된다. 각 균주에 대해서, 100mg의 동결 건조 분말을 계량하여 멸균 Dulbecos PBS(Sigma-Aldrich)에서 다시 서스펜드 되었다. 박테리아 세포는 원심 분리(4,000rpm/10분/4°C/Brake 0)에 의해 두번 세척되었고, 멸균 PBS에서 다시 현탁되었다. 직접적인 현미경 카운트가 수행되었고 세포 준비는 100:1;50:1;25:1 총 박테리아:PBMC세포의 비율을 만들기 위해 적절한 농도로 희석되었다. 기술적 반복 실험은 3가지 방법으로 수행했다. 그 후에, (페니실린 및 스트렙토마이신(Sigma-Aldricin)의 존재하에서) 37°C에서 2x105 cells/ml의 농도로 48 시간 동안 PBMC를 배양했다. 이 때에, 제어 매개체 또는 박테리아 균주들의 농도 증가가 나타난다. :1 x 106cells/ml (25: 1 Bacterial:PBMC), 1 x 107cells/ml (50:1 Bacteria:PBMC) and 2 x 107cells/mL (100:1 Bacteria:PBMC). 슈퍼 내성 물질들은, 메소스케일 디스커버리(MesoScale Discovery : MSD) 다중 플랫폼 조직 배양 키트(multiplex platform tissue culture kits)(Meso Scale Diagnostics, Maryland, USA)를 사용하여 측정된 항염증 시토카인 IL-10과 염증 유발 시토카인 TNF-α에 대해 분석되었다. 이전에 항염증 활성도가 있는 것으로 확인된 B. longum NCIMB 41003(Groeger et al., 2013)이 분석 정확도를 검증하기 위해 양성 대조군으로 사용되었다.
결과들
도 3 : EPS+ve B. longum NCIMB 41003과 낮은 EPS 생성 유산균(Lactobacillus) 균주를 이용하여 48시간 자극 후에 PBMC 시토카인 유도 분석에서 IL-10 유도. EPS의 낮은 유산균 균주에 대해서 EPS+ve B. longum NCIMB 41003과의 자극 후에 항염증 시토카인 IL-10의 유도가 강화되었다.
도 4 : B. longum NCIMB 41030과 낮은 EPS 생성 유산균(Lactobacillus) 균주를 이용하여 48시간 자극 후에 PBMC 시토카인 유도 분석에서 TNF-α 유도. EPS의 낮은 유산균 균주에 대해서 EPS+ve B. longum NCIMB 41003을 사용한 자극 후에 염증을 발생시키는 시토카인 TNF-α유도의 유도력이 감소한다.
도 5 : B. longum NCIMB 41003 및 B. longum NCIMB 41715를 사용하여 48 시간 자극 후에, PBMC 시토카인 유도 분석에서 IL-10유도. 두 개의 균주 모두, 투입 반응 방식으로, 항염증 시토카인의 수준과 유사한 수준을 유도한다.
도 6 : B. longum NCIMB 41003 및 B. longum NCIMB 41715를 사용하여 48 시간 자극 후에, PBMC 시토카인 유도 분석에서 TNF-α유도. B. longum NCIMB 41715는, B. longum NCIMB 41003에 대해 TNF-α와 유사한 수준을 유도한다.
결론
B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003은, EPS가 풍부하며, PBMC 시토카인 유도 분석에서 항염증 면역 프로파일을 유도한다. 낮은 RMS 생산 균주는 매우 다른 면역 프로파일을 생성한다.
실시예 5- 식이요법-유도 비만(DIO) 생쥐 모델에서의 신진 대사 결과에 대한,
B. longum
NCIMB 41715,
B. longum
NCIMB 41003 및 EPS가 낮은 젖산의 투여 효과
방법
동물들
7주가 된 숫컷 C57BL/6JRccHsd 마우스(네덜란드 할란 연구소)(72개의 마우스, 그룹 마다 n=12)는, 체중에 따라 무작위로 선택되었으며, 22±3°C의 온도, 50±20%의 습도, 각각 12 시간의 암흑과 밝은 환경 주기, 시간 당 15-20의 신선한 공기 변화를 가지는 제어되는 환경에서 보존되었다. 마우스들은 집단으로 그룹 형태로 수용되었고(케이지 마다 4개의 마우스), 멸군 처리된(autoclaved) 옥수수 빵이 침구 재료로 사용되었다. 마우스들은 생후 5주에 수용되었으며 일주일간 격리되었고 그 후 연구를 시작하기 전에 1주일 동안 적응되도록 했다. 첫 날부터 마우스에게 임의로 먹이를 주었고, 각 케이지의 마우스들에게는, 스테인리스 철강 시퍼 튜브(steel sipper tube)(그룹 3, 4, 5, 및 6; 표 1)가 부착된 폴리카보네이트 병들을 통해, 50ml의 일반 멸균 음용수(그룹 1과 2, 표 1) 또는 동결 건조 프로바이오틱을 포함한 음용수(1 x 109cfu/dose/day)를 제공했다. 치료는 16주 동안 계속되었다.
실험 설계
첫날부터 계속해서, 그룹 1에는, 저지방 식단(LFD)D12450 (10% kcal% 지방, 감마 조사됨; Research Diets Inc, USA)이, 다른 5개의 그룹(2~6그룹)에 대해서는 고지방 식단(HFD)D12451(45% kcal% 지방, 감마 조사됨; Research Diets Inc)이 16주 동안 제공되었다. HFD 음식은 체중 증가와 공복 혈당 수치의 증가로 특징 지어지는 동물에서 인슐린 저항성과 비만을 유발했다. 그룹 1과 그룹 2는 일반적인 멸균된 식수를 제공했고, 그룹 3, 4, 5, 6에는 적절한 프로바이오틱을 1 x 109cfu/dose/day 단위로 제공하였다(표 1). 일반 건강 관찰은 매일 같은 시간에 수행되었다. 이것은 주의력, 머리카락 질감, 케이지의 움직임, 그리고 코, 눈, 입과 귀에서 방출되는 방출의 존재 여부를 포함했다. 마우스가 소비하는 먹이의 양을 조사하기 위해 사전 측정된 사료가 각 케이지에 보관되었으며 매 3일마다 남은 음식이 측정되고 기록되었다. 동물의 물 소비량은 투입되는 첫날부터 1일 단위로 측정되었다. 각 케이지의 마우스(n=4)에 대해서 매일 50mL의 물이 제공되었다. 각 케이지에 남아 있는 물은 24시간마다 측정되었다.
체중 및 조직 샘플링
모든 동물의 체중은 치료 이전에, 수용된 날에, 무작위 선택된 일자에, 개별적으로 기록되었으며, 그리고 3일 후에 한번씩 기록되었다. 체중의 퍼센트 변화는 공식(TT-TC)/TC*100에 따라 계산했다. 여기서 TT는 시험일이고 TC는 시험일 제어이다. 체지방 및 제지방 체중 성분(lean mass composition)을 평가하기 위해서, 쥐들은, -1, 28, 56, 84, 112일차에 Echo MRI(EchoMRI-700TM)를 이용하는 Echo Magnetic Resonance Imaging(MRI)에 의해 검사를 받았다. 동물은 진정제나 마취제 없이 플라스틱 홀더에 넣어졌다. 지방은 신체의 모든 지방 분자의 질량으로 측정된다. 린(lean)은 수분을 함유한 모든 신체 부위와 동등한 근육 조직체 이다. "자유로운 물(free water)"에 대한 기여는 대부분 방광에서 나온다. 전체 물은 자유로운 물과, 몸의 전체 수분 함량이 되는 제지방 체중에 포함된 물을 모두 포함한다. 플라스틱 홀더들은 교차 오염을 피하기 위해 서로 다른 그룹의 동물들 사이에서 위생적으로 처리되었다. 다른 그룹과 다른 동물을 다루는 동안 무균 기술이 적용되었다. 16주 말에, 그 동물들은 CO2질식사로 인해 희생되었다. 간, 골격 근육, 내장 지방(visceral fat)(부고환, 신장 및 장간막 : epididymal, renal and mesenteric), 피하 지방, 비장, 맹장, 갈색 지방 조직, 뇌와 창자는 수집되고 무게가 측정되었으며, 향후 생화학 및 유전학적 분석을 위해 -80°C에서 저장되었다.
대새 마커들(Metabolic Markers)
첫날 투여 일자를 시작으로/포함하는 방식으로, 0, 30, 60, 90, 112일째 오전 9시에 무작위 혈당 측정(총 5회의 샘플링이 이루어졌다)을 위한 꼬리 표본 채취 (tail nipping method)방법에 의해 혈액 샘플들이 수집되었다. 혈당 분석은 존슨과 존슨의 혈당 측정기(Johnson and Johnson glucometer :One touch Ultra 2)에서 수행되었다. 다른 그룹의 동물을 취급하는 동안에 무균 기술이 적용되었다. 16주 말기에, 쥐들은 6시간 동안 금식이 시행되었고 혈액 포도당 측정을 위해 꼬리표본 채취 방법(혈액 채취의 비마취 방법)으로 혈액을 수집했다. 혈액은 경량 이소플루란 마취에서 역 방향 펑크 방법(retro-orbital puncture method under light isoflurane anesthesia)에 의해 채취되었다. 완전 자동 랜덤 액세스 임상 화학 분석기(fully automated random access clinical chemistry analyzer : EM-360, Erba Mannheim, 독일)를 이용하여, 총 콜레스테롤(TC), 중성지방(TG), 고밀도 지질 단백질(HDL) 콜레스테롤, 저 밀도 지질 단백질(LDL) 콜레스테롤 및 비에스테르형 지방산(non-esterified fatty acids : NEFA)을 추정하기 위해 사용되는 혈장을 분리했다. 혈장 VLDL수준은 다음과 같은 계산 법을 통해 구해진다.: (VLDL=Triglycerides (mg/dl)/5). 간 TC와 TG 추정을 위해, 간은 이소프로페닐(1ml/50mg tissue)에서 균질화되고(homogenized) 1시간 동안 4°C에서 배양되었다. 샘플들은 2,500rpm에서 5분 동안 4°C에서 원심 분리되었다. 상등액(supernatants) 내의 콜레스테롤 농도와 중성 지방(triglyceride) 농도는 완전 자동 랜덤 액세스 임상 화학 분석기(EM-360, Erba Mannheim, 독일)에 의해 측정되었다.
에너지 배출 평가
6주차, 10주차, 15 주차에서 각 쥐들로부터 두개의 배설물 펠렛을 채취하여 봄 열량 측정법(bomb calorimetry)에 따라 총 열량을 분석했다. 봄 열량 측정법 분석의 경우, 샘플들이 60˚C에서 48시간 동안 무게 측정되었으며 오븐-건조되었다. 배설물의 에너지 함량은 1109 세미 마이크로 봄(semi-micro bomb)(Parr Instrument & Co, Moline, Illinois, USA)을 사용하여 Parr6100 열량 측정기로 평가되었다.
열량 측정기 에너지 등가 인자(calorimeter energy equivalent factor)는 벤조산 표준을 사용하여 측정되었고 각 샘플(100 mg)은 세 배수(triplicate)로 분석되었다. 연구 과정에 걸쳐 제공된 프로바이오틱이 제공된 쥐들의 누적 에너지 배설량은 고 지방 다이어트 대조군에 속하는 마우스가 배설한 에너지에 대한 상대 백분율로 추정되었다.
통계학적 분석
통계학적 분석은 두 그룹 간의 차이에 대해 쌍을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 수행되었다. 일원 분산 분석(One-way analysis of variance : ANOVA)후에는, 두 개 이상의 그룹이 평가된 경우에 Tukey의 다중 비교 검정을 사용했다. 데이터는 Windows용 GrapPad Prism version 5를 사용하여 분석했다. 결과는 p<0.05일 때에 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
표 5:실험 그룹 및 관련 식단 및 치료 요법. LFD=저 지방식 다이어트 대조, HF=고 지방식 다이어트 대조
결과들
도 7 : 고 지방 다이어트(HF) 대조군과 비교했을 때에, B. longum NCIMB 41715는 16주까지 지방 질량 증가가 크게 감소한 반면, B. longum NCIMB 41003은 유의미한 영향을 미치지 않았다.
도 8 : 지방 패드 중량에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과.
B. longum NCIMB 41715는 지방 패드 중량(피하 지방 및 부고환 지방(epipidymal fat))이 크게 감소했지만 B. longum NCIMB 41003은 유의미한 영향을 미치지 않았다.
도 9 : B. longum NCIMB 41715와 B. longum NCIMB 41003이 간 전체의 콜레스테롤과 중성 지방에 미치는 영향. B. longum NCIMB 41003를 제외한 B. longum NCIMB 41715는, DIO 마우스에서 간 전체 콜레스테롤과 트리글리세리드를 감소시켰다.
도 10 : 혈장 전체 콜레스테롤에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과.
도 11 : 혈장 LDL-콜레스테롤에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과.
도 12 : 혈장 VLDL-콜레스테롤에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과.
도 13 : 말단(terminal) 혈당에 대한 B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003의 효과.
도 14 : DIO 마우스 모델의 고 지방 식이 요법(HF) 대조군과 비교한 경우, B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003을 투여한 후에 각 마우스에 대한 누적 음식 섭취량.
도 15 : DIO 마우스 모델의 고 지방 식이 요법(HF) 대조군과 비교한 경우, B. longum NCIMB 41715 및 B. longum NCIMB 41003을 투여한 후에, 누적 에너지 배출의 % 추정치.
낮은 EPS 생성 유산균은 이 모델에서 큰 영향을 미치지 않았다.
결론
B.Longum NCIMB 41715 투여에 의해, 양 균주의 지방 함량이 16주까지 크게 감소했다. 이것은 B.Longum NCIMB 41715의 피하 지방과 부고환 지방(epididymal fat)이 통계적으로 유의한 감소를 동반했다는 것을 의미한다. B.Longum NCIMB 41715의 투여는, HFD 대조군과 비교했을 때, 간의 전체 콜레스테롤과 중성 지방 수치를 현저하게 감소시켰다. 또한, HFD 대조군과 비교할 때, B.Longum NCIMB 41715의 투여시에, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 및 VLDL-콜레스테롤이 상당히 개선되었다. 연구 과정에서 누적 음식 섭취에 있어서 큰 차이가 없음에도 불구하고, 본 연구에서는 B.Longum NCIMB 41715에 대해서 % 에너지 배출이 증가하는 것을 관찰했다. 소수성 B.Longum NCIMB 41715 균주의 투여는 이러한 DIO생쥐 모델에서 관찰된 대사 결과의 개선과 관련되는 섭취된 음식에서 추출되는 에너지의 양을 줄일 수 있다.
프리바이오틱스(Prebiotics)
프로바이오틱스 유기체(organism)의 도입은 적합한 매개체의 미생물 집단의 섭취에 의해 이루어진다. 큰 창자에 있는 균주의 성장을 촉진하는 매개체를 제공하는 것이 바람직할 것이다. 하나 이상의 올리고사카라이드, 폴리사카라이드 또는 다른 프리바이오틱스를 추가하면 위장 내의 젖산 박테리아의 성장을 촉진할 수 있다. 프리바이오틱스는 긍정적인 가치가 있다고 여겨지는 고유한 박테리아, 예를 들면, 비피더스균, 유산균에 의해 결장에서 특별히 발효되는 생존 불가능한(non-viable) 식품 성분을 말한다. 프리바이오틱스의 종류는 과당, 자일로스, 콩, 갈락토스, 포도당 및 마노스를 포함할 수 있다. 1개 이상의 프리바이오틱스 화합물과 프로바이오틱스 균주의 조합 투여는 체내에서 투여된 프로바이오틱스의 성장을 촉진한다. 그리히여, 매우 상당한 건강의 유익을 초래하며, 신바이오틱(synbiotic)이라고 칭한다.
기타 활성 성분들
위에서 설명한 바와 같이, 그 균주는 질병 예방을 위해 투여되거나 또는 자체적으로 또는 다른 프로바이오틱 및/또는 프리바이오틱 물질을 이용한 치료 방법으로 투여될 수 있다는 것을 알게 될 것이다. 또한, 그 균주는 염증이나 기타 질환, 특히 면역학적인 문제를 가지는 환자들을 치료하는 데 사용되는 것과 같은 다른 활성 물질을 사용하는 질병 예방 또는 치료 방식의 일부로 사용될 수 있다. 이러한 조합은 단일한 조성물 형태로 투여되거나, 동일한 시간 또는 다른 시간에 투여된 독립적인 조성물로 투여되거나, 또는 동일하거나 다른 투여 경로를 사용하여 투여될 수 있다.
조성물
본 발명의 한가지 이상의 균주는 캡슐, 마이크로 캡슐, 태블릿, 과립(granule), 분말, 트로키제(troches), 알약, 좌약(suppository), 현탁액 및 시럽과 같은 전통적인 조제물 형태로 입으로 섭취 가능한 형태로 동물(인간 포함)에게 투여될 수 있다. 적합한 조성물은 종래의 유기 및 무기 첨가제를 사용하여 일반적으로 사용되는 방법에 의해 제조될 수 있다. 의학적 구성 요소에 있어서 활성 성분의 양은 원하는 치료 효과를 발휘하는 수준일 수 있다.
조성물은 또한 박테리아 성분, 약물 제품 또는 생물학적 화합물을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 한가지 이상의 균주로 구성된 백신은 기존의 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 약학적으로 허용가능한 캐리어 또는 보조제를 포함할 수 있다.
본 발명의 균주는 균주의 지연된 방출과 같은 제어된 방출을 촉진하기 위해 형성될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 소장이나 결장(colon)과 같은 위장 기관의 특정 위치에서 균주를 방출하도록 조정될 수 있다. 이러한 통제된 방출을 달성하기 위해 균주는 특정 위치에서 균주를 방출하도록 조정되는 코팅을 가지는 캡슐 형태로 형성될 수 있다. 이러한 제어된 방출을 용이하게 하기 위해 다양한 코팅을 사용할 수 있다. 이러한 코팅 제품 중 하나는 상표 Eudragit에서 구입할 수 있다.
여기에 인용된 모든 문서는 관련 부분으로서, 여기에서 참조로 포함되어 있다.
본 발명은 상기 기재된 실시예들에만 한정되는 것이 아니며, 상세한 부분에서는 변경될 수 있다.
참조 문헌
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gctggatcac ctcctttct 19
Claims (25)
- 기탁 기관(NCIMB)에 기탁 번호 NCIMB 41715호로 기탁된 비피더스균 롱검(Bifidobacterium longum : AH1362)의 균주.
- 제 1항에 있어서,
생존 가능한 생세포(viable cell)의 형태로 청구된 균주. - 제 1항에 있어서,
생존할 수 없는 세포(non-viable cell) 형태로 청구된 균주. - 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에서 청구된 균주를 포함하는 조성물.
- 제 4항에 있어서,
프로바이오틱(probiotic) 물질을 더 포함하는 조성물. - 제 4항 또는 제 5항에 있어서,
프리바이오틱(prebiotic) 물질을 더 포함하는 조성물. - 제 4항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
섭취 가능한 캐리어를 더 포함하는 조성물. - 제 7항에 있어서,
상기 섭취 가능한 캐리어는, 캡슐, 태블릿 또는 분말과 같은 약학적으로 허용 가능한 캐리어가 되는 조성물. - 제 7항에 있어서,
상기 섭취 가능한 캐리어는, 산성화된 우유, 요구르트, 냉동 요구르트, 분유, 우유 농축액, 치즈 스프레드, 드레싱 또는 음료와 같은 식료품이 되는 조성물. - 제 4항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
단백질 및/또는 펩타이드, 특히, 글루타민/글루타민산염, 지질, 탄수화물, 비타민, 미네랄 및/또는 미량 원소(trace element)가 풍부한 단백질 및/또는 펩타이드를 더 포함하는 조성물. - 제 4항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 균주는 상기 조성물의 그램 당 106 cfu 보다 많은 양으로 존재하는 조성물. - 제 4항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서,
보조제(adjuvant)를 추가적으로 더 포함하는 조성물. - 제 4항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
박테리아 성분을 추가적으로 더 포함하는 조성물. - 제 4항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
약제품을 추가적으로 더 포함하는 조성물. - 제 4항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
생물학적 화합물을 더 포함하는 조성물. - 제 1항에서 청구된 균주 또는 제 4항 내지 제 15항 중 어느 한 항에서 청구된 조성물로 구성되는 동결-건조된 혼합물.
- 제 1항에서 청구된 균주, 또는 제 4항 내지 제 15항 중 어느 한 항에서 청구된 조성물, 또는 제 16항에서 청구된 혼합물을 포함하는 식품.
- 제 1항에서 청구된 균주, 또는 제 4항 내지 제 15항 중 어느 한 항에서 청구된 조성물, 또는 제 16항에서 청구된 혼합물을 포함하는 의약품.
- 제 1항에서 청구된 균주, 또는 제 4항 내지 제 15항 중 어느 한 항에서 청구된 조성물, 또는 제 16항에서 청구된 혼합물을 포함하는 캡슐.
- 제 19항에 있어서,
위장 기관내에서 방출이 조절되도록 조정되는 캡슐. - 비만 및 비만 관련 대사 증후군의 예방 또는 치료에 사용되는, 제 1항에서 청구된 균주, 또는 제 4항 내지 제 15항 중 어느 한 항에서 청구된 조성물, 또는 제 16항에서 청구된 혼합물.
- 비알콜성 지방 간 질환(NAFLD)의 예방 또는 치료에 사용되는, 제 1항에서 청구된 균주, 또는 제 4항 내지 제 15항 중 어느 한 항에서 청구된 조성물, 또는 제 16항에서 청구된 혼합물.
- 비만의 예방 또는 치료가 필요한 대상에게, 기탁 기관(NCIMB)에 기탁 번호 NCIMB 41715호로 기탁된 비피더스균 롱검(Bifidobacterium longum ) AH1362의 균주를 포함하는 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는, 비만을 예방하거나 치료하는 방법.
- 비만 관련 대사 증후군의 예방 또는 치료가 필요한 대상에게, 기탁 기관(NCIMB)에 기탁 번호 NCIMB 41715호로 기탁된 비피더스균 롱검(Bifidobacterium longum) AH1362의 균주를 포함하는 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는, 비만 관련 대사 증후군을 예방하거나 또는 치료하는 방법.
- 비알콜성 지방 간 질환(NAFLD)의 예방 또는 치료가 필요한 대상에게, 기탁 기관(NCIMB)에 기탁 번호 NCIMB 41715호로 기탁된 비피더스균 롱검(Bifidobacterium longum) AH1362의 균주를 포함하는 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는, 비알콜성 지방 간 질환(NAFLD)을 예방 또는 치료하기 위한 방법.
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