CN115637237A - 一株长双歧杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域,尤其涉及一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)及其在改善由代谢综合症所引起的体重、血脂、血糖、转氨酶及慢性低度炎症的升高方面的应用。长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)已于2021年07月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No:22949。本发明菌株经体外实验及动物实验表明,其对长期高脂饮食所造成的肥胖及其因此诱发的高血脂、高血糖、转氨酶升高及慢性低度炎症反应等具有显著的抑制作用,通过压力性选择驯化,其对胃酸及胆盐具有更强的耐受能力,可在机体内更长时间定植,并相较于出发菌株及奥利司他,体现出上述更强的生理活性。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域,尤其涉及一株长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)及其在改善由代谢综合症所引起的体重、血脂、血糖、转氨酶及慢性低度炎症的升高方面的应用。
背景技术
肥胖症是21世纪最严重的公共卫生挑战之一。全球约有13%的成年人肥胖,另有39%的人被认为超重[1]。肥胖症是一种多因子病,是能量摄入和支出之间长期失衡的结果,并受遗传和环境因素的影响。饮食中摄入的脂肪过多,是常见的引起肥胖症的非病理性因素,并使得罹患一系列慢性代谢病如2型糖尿病(T2DM)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、高血压、动脉粥样硬化、血脂异常和心血管疾病的风险增加[2]。
肥胖症的特征在于慢性低度炎症和胰岛素抵抗[3,4]。炎症对脂肪细胞的不正常肥大有重要作用,而脂肪组织中的巨噬细胞被认为是炎症的重要来源,肥胖与白色脂肪组织中巨噬细胞的大量浸润有关。M1型巨噬细胞可以通过分泌促炎因子如TNF-a,IL-6,MCP-1等促进炎症反应的发生,引起脂肪组织积累改变和胰岛素抵抗(IR)[5]。胰岛素抵抗(IR)亦同样被认为是由慢性低度炎症所诱发的[6]。胰岛素受体下游信号通路的抑制是炎症因子导致胰岛素抵抗(IR)的主要机制,脂肪细胞分泌的炎症因子,如TNF-a,IL-6, MCP-1等通过激活JNK、PKC、IKK、SOCS等几个丝氨酸/苏氨酸激酶从而抑制胰岛素受体下游趋化作用[7]。
大量的临床和实验数据亦表明,大量内脏脂肪组织游离脂肪酸的增加可导致与胰岛素抵抗有关的非酒精性脂肪肝病(NAFLD),因此,患有肥胖症、胰岛素抵抗和血脂异常的个体亦往往伴随NAFLD的发生[8,9]。故如能有效的降低肥胖,改善机体慢性低度炎症状态,则对由此诱发的高血脂症、糖尿病、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)及动脉粥样硬化等将起到良好的改善作用。
目前研究表明,肠道微生物群对肥胖症的贡献是多因子的,涉及能量收集和脂肪贮存[10]、改变代谢途径[11,12]和细菌易位导致慢性低度炎症[13,14]等问题。乳酸菌通常用作益生菌,并且具有大量的在体内以菌株特异性方式支持健康有益影响的证据[15~17]。因此通过益生菌操纵肠道微生物群是一种潜在的治疗工具,以帮助改善肥胖症并提高代谢健康。
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)是乳酸菌中的一种,通常来源于人体肠道,具有调节人体肠道菌群平衡,改善健康等功效。近年亦有报道其治疗肥胖及相关代谢疾病的报道。B.基利等(CN 109069552 A)发现长双歧杆菌AH1362(NCIMB 41715)产生多糖并增加能量***,该菌株用于预防或治疗肥胖症和肥胖症相关代谢综合征。刘庆军等(CN113234640 A、CN 113293113 A)从人体粪便中分离出两株长双歧杆菌MF-269及MI186,具有降低小鼠体重、内脏脂肪含量及血清中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白含量等功能。益诺康生物(CN 109593678 A)发现长双歧杆菌YH295可通过增加肠道中的乳杆菌和双歧杆菌数量、上调肠道再生基因表达量和肠道跨膜结合蛋白含量、降低血浆内毒素和肠道炎症因子,从而降低腹型肥胖和非酒精性脂肪肝风险。
虽然这些菌株具有明显的生物学活性,但是其经过口服穿过胃液及肠液进入小肠的过程中,不可避免的会因为盐酸及胆盐的作用而大幅降低成活率。以菌株MF-269及MI-186为例,其体外对胆酸(pH2.0)及胆盐(0.3%) 2h处理的存活率分别为:MF-269 14.3%(胆酸)和85.7%(胆盐);MI-186 0.00025%(胆酸)和25%(胆盐)。这对利用活体菌株在机体内行使其功能,并在肠道中实现定植是相当不利的。
参考文献
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发明内容
本发明的目的在于提供一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)及其在改善由代谢综合症所引起的体重、血脂、血糖、转氨酶及慢性低度炎症的升高方面的应用。
为实现上述目的,本发明采用技术方案为:
一株长双歧杆菌,长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)已于2021年 07月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏编号为:CGMCC No:22949。
一种改善由机体代谢综合症引起的亚健康状态的菌剂,菌剂含所述的菌株,或含所述的菌株经持续性梯度压力耐受培养后定向获得的菌株。
所述菌剂为含所述的菌株,或含所述的菌株经持续性梯度压力耐受培养的菌株的培养物沉淀、菌悬液、冻干粉及冻干后灭活菌粉。
所述菌株的培养物沉淀为经MRS培养液发酵产生的菌体经4000rpm离心5min所获得的菌体沉淀;
所述菌株的菌悬液为菌株的培养物沉淀经0.9%生理盐水重新混悬制得;
所述菌株的冻干粉为菌株的培养物沉淀与冻干保护剂(15%脱脂乳粉及 10%海藻糖)以1:2质量比例混合,经低温冷冻干燥制得;
所述菌剂剂型可为溶液剂、颗粒剂、粉剂及片剂等。
所述经持续性梯度压力耐受培养的菌株为以所述菌株为出发菌株,在不同的pH值下的人工模拟胃液和不同胆盐浓度下的人工模拟肠液进行持续性梯度压力耐受培养传代培养,直至培养后菌株性状稳定。
所述经持续性梯度压力耐受培养的菌株将所述菌株依次在人工模拟胃液和人工模拟肠液中分别于37℃孵育2h,孵育后转至MRS平板中37℃培养出单菌落,挑取单菌落,制备菌悬液,进一步按照上述孵育方式对菌株进行传代培养,随着菌株耐受性的提高,逐渐增加筛选压力,既为降低人工模拟胃液pH,提高人工模拟肠液胆盐浓度,直至菌株的耐受性不再提高并获得性状稳定的菌株。
所述经持续性梯度压力耐受培养为将菌株首先在pH值为1.5的人工模拟胃液中于37℃孵育2h,而后再于胆盐浓度为0.3%的人工模拟肠液中于 37℃孵育2h,孵育后MRS平板中37℃培养2~3天,计算本次孵育菌株成活率,成活率小于0.1%,则继续在该人工模拟胃液和人工模拟肠液条件下反复传代培养,直至成活率>0.1%时,将单菌落接种在pH值为1.3的人工模拟胃液中于37℃孵育2h,而后再于胆盐浓度为0.35%的人工模拟肠液中于37℃孵育2h,孵育后MRS平板中37℃培养2~3天,计算本次孵育菌株成活率,成活率小于0.1%,则继续在该人工模拟胃液和人工模拟肠液条件下反复传代培养,直至成活率>0.1%时,将单菌落接种在pH值为1.1的人工模拟胃液中于37℃孵育2h,而后再于胆盐浓度为0.4%的人工模拟肠液中于37℃孵育2h,孵育后MRS平板中37℃培养2~3天,计算本次孵育菌株成活率,成活率小于0.1%,则继续在该人工模拟胃液和人工模拟肠液条件下反复传代培养,直至成活率>0.1%时获取单菌落,即为获得经持续性梯度压力耐受培养的菌株。
进一步说,所述初始菌株为一定量的长双歧杆菌(CGMCC No:22949);所述初始人工模拟胃液为pH1.5,胃蛋白酶10g/L;初始人工模拟肠液为 pH6.8,胆盐0.3%,胰酶10g/L。孵育的条件为将长双歧杆菌菌悬液 (1×1010CFU/ml)1ml放入9ml人工模拟胃液,37℃震荡混合2h,4000rpm 离心5min,去清液后重悬于1ml生理盐水,放入9ml人工模拟肠液,37℃震荡混合2h,4000rpm离心5min,去清液重悬于1ml生理盐水后,稀释涂布于MRS平板,待37℃培养2~3天后,计算本次孵育菌株成活率,成活率小于0.1%,挑取健壮菌落继续按照上述记载的条件下对菌株进行传代培养,直至成活率>0.1%,待成活率>0.1%时将所得菌株转入下一轮压力培养,同时进行平板计数,计算孵育后的菌株成活率。
整个持续性梯度压力耐受培养过程中人工模拟胃液梯度pH值为1.5、 1.3、1.1;人工模拟肠液中胆盐浓度梯度为0.3%、0.35%、0.4%。
所述菌剂可进一步添加至药物、日化品、化妆品、食品添加剂、保健食品及其在其它食品中用于改善由机体代谢综合症引起的亚健康状态。
一种所述改善由机体代谢综合症引起的亚健康状态的菌剂的应用,所述菌剂在改善由机体代谢综合症引起的亚健康状态中的应用。
所述菌剂可进一步添加至药物、日化品、化妆品、食品添加剂、保健食品及其在其它食品中用于改善由机体代谢综合症引起的亚健康状态。
所述机体代谢综合症引起的亚健康状态为通过改善体重、降低血脂、降低血糖、降低转氨酶活性及减少慢性低度炎症等生物学活性用以预防或改善由代谢综合症所导致的一系列疾病或亚健康状态。
与现有技术相比,本发明的最大效果为:
本发明通过筛选获得具有活性的长双歧杆菌作为出发菌株,并进一步获得具有更强的耐受胃酸及胆盐能力的菌株BKR-011,可更多的进入机体并维持较高丰度,当停止摄入后,亦对机体持续保持较长时间的生理效应(见图2、3、14.)。对出发菌株的驯化方法为定向驯化,方法简单稳定,并且可以持续的通过该驯化方法保持菌株BKR-011对胃液及肠液的耐受性不在进一步的连续传代的过程中退化(见图1.)。
经体外实验及动物实验表明,无论是出发菌株体还是驯化菌株,均表现出较为显著及广泛的生理功能,包括:抑制肥胖(见图4~5.)、降低血脂 (见图6~8.)、降低血糖(见图9.)、增强机体糖耐量(见图10.)、改善体脂分布(见图11.)、降低转氨酶活性(见图12.)及改善机体慢性低度炎症状态(见图13~14.),并且菌株经驯化后生理功能明显提高。
附图说明
图1为本发明实施例1中连续进行50代驯化过程中的菌体对初始浓度人工模拟胃液及人工模拟肠液的耐受力的变化。其中图A为每代筛选前活菌数及筛选后的活菌数;图B为每代经筛选后的存活率(筛选后CFU/筛选前CFU);F0为菌株SYP-B4138,F50为BKR-011。
图2为本发明实施例2中0~4周喂养各组小鼠粪便中长双歧杆菌的相对丰度比较。其中第1周及第2周进行给药喂养,第3周至实验结束不进行给药。其中只检测到HDF+F0组及HDF+BKR-011组长双歧菌株丰度, ND组、HDF组未检测到。
图3为本发明实施例2中6周喂养后各组小鼠粪便中长双歧杆菌的PCR 结果。其中第1周及第2周进行给药喂养,第3周至实验结束不进行给药, 1~5泳道分别为各组小鼠粪便样品,第6泳道为长双歧菌株作为阳性对照, 第7组为Marker。
图4为本发明实施例3第一阶段实验提供的菌株BKR-011及其出发菌株F0对小鼠肥胖的预防性作用效果图,其中图A~F各代表不同实验条件下,各组小鼠体重的分布比例。
图5为本发明实施例3第二阶段实验提供的菌株BKR-011及其出发菌株F0在8周治疗期间下小鼠的体重变化效果图(*P<0.05,**P<0.01)。
图6为本发明实施例3第二阶段实验提供的菌株BKR-011及其出发菌株F0在8周治疗期间下小鼠体内的总胆固醇(TC)变化效果图(ns P>0.05, *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001)。
图7为本发明实施例3第二阶段实验提供的菌株BKR-011及其出发菌株F0在8周治疗期间下小鼠体内的甘油三酯(TG)变化效果图(ns P>0.05, **P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001)。
图8为本发明实施例3第二阶段实验提供的菌株BKR-011及其出发菌株F0在8周治疗期间下小鼠体内的低/高密度脂蛋白(LDL-C/HDL-C)变化效果图(*P<0.05,***P<0.001);其中,A为低密度脂蛋白变化量,B为高密度脂蛋白变化量。
图9为本发明实施例3第二阶段实验提供的菌株BKR-011及其出发菌株F0在8周治疗期间下小鼠空腹血糖(FBG)变化效果图(*P<0.05,** P<0.01,***P<0.001,ns P>0.05)。
图10为本发明实施例3第二阶段实验提供的菌株BKR-011及其出发菌株F0在8周治疗期结束后各组小鼠口服糖耐量(OGTT)实验效果图。
图11为本发明实施例3第二阶段实验提供的菌株BKR-011及其出发菌株F0在8周治疗期结束后,各组小鼠性腺脂肪(EAM)肾脏脂肪(PFM) 及肝脏(Liver)重量效果图(ns P>0.05,**P<0.01,***P<0.001,**** P<0.0001);其中,A为各组小鼠性腺脂肪量的比较,B为各组小鼠肾脏脂肪量的比较,C为各组小鼠肝脏重量的比较。
图12为本发明实施例3第二阶段实验提供的菌株BKR-011及其出发菌株F0在8周治疗期结束后,各组小鼠体内谷氨酸转氨酶(ALT)及天冬氨酸转氨酶(AST)的含量效果图(**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001)。
图13为本发明实施例3第二阶段实验提供的菌株BKR-011及其出发菌株F0在8周治疗期结束后,各组小鼠体内白介素-6(IL-6)(A)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)(B)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)(C)的含量效果图(* P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。
图14为本发明实施例提供的采用不同含菌株BKR-011及其出发菌株 F0的悬液在0~4周小鼠体内白介素-6(IL-6)(A)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) (B)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)(C)的含量变化效果图;其中第3周后小鼠不再给药治疗.(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns P>0.05)。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明,应当指出的是,此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明,并不局限于本发明。
本发明对筛选获得具有活性的长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SYP-B4138(保藏编号为:CGMCC No:22949)进行定向驯化,并获得具有耐受胃酸以及胆盐的菌株KBR-011,其在人工模拟胃液及人工模拟肠液中的存活率得以大幅度提高,用以显著增强其在体内的定植能力,经体外实验表明,其对胃酸及胆盐具有良好的耐受能力;通过动物实验表明,该菌株具有显著缓解因肥胖所诱发的高血脂、高血糖、转氨酶升高及慢性低度炎症反应的生理功能,其作用效果优于奥利司他,并在停止服用后,依然可在体内持续产生作用效果。
实施例1长双歧杆菌Bifidobacterium longum BKR-011的获得及遗传稳定性分析
1.出发菌株的获得:
出发菌株提取来自中国辽宁省沈阳市的一名健康婴儿(6个月,母乳喂养)肠道,采集前一月内未服用过抗生素、无益生菌服用史。将其粪便稀释涂布在MRS+溴甲酚紫和MRS+莫匹罗星锂盐选择性培养基平板涂布, 37℃厌氧培养48~72h,分离纯化出待选菌株。
进一步的,将上述获得菌株接种于MRS培养基,37℃培养至OD600 为1.2,培养后的发酵液装于离心管,4000rpm离心5min,弃上清液回收菌体,进行16S rDNA鉴定。
16S rDNA鉴定所采用通用引物为:
27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
1492R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’
菌株DNA经PCR扩增后,送至送上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,利用EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)对所测序列进行相似度比对,进而确定其种属。菌株经16s rDNA鉴定为长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)。该菌于2021年07月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No:22949。
2.对出发菌株的定向驯化
将所获得的菌株SYP-B4138进行平板(MRS培养基,按常规方式培养) 分离,获得单克隆菌株,将所获得的单克隆菌株接种于液体MRS培养基, 37℃培养至OD600为1.2,取20ml菌液,4000rad/min离心5min,弃上清液后用生理盐水调制成1×1010CFU/ml菌悬液备用。
配制人工模拟胃液:取稀盐酸16.4ml,加水约800ml与胃蛋白酶10g (100N.F.U/mg),摇匀后,加水稀释至1000ml。调整pH为1.5、1.3、1.1 备用。
配制人工模拟肠液:即磷酸盐缓冲液(含胰酶)(pH 6.8),具体为:取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用0.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8,另取胰酶10g(250N.F.U/mg),加水适量使其溶解,将两液按不同比例混合后,加水稀释至1000ml,即获得含不同胆盐浓度的人工模拟肠液,不同胆盐浓度为0.3%、0.35%、0.4%备用。
将上述获得菌株悬液1ml放于9ml人工模拟胃液(pH1.5,胃蛋白酶 10g/L)37℃震荡孵育2h,4000rpm离心5min,弃上清液后,重悬于1ml 生理盐水中,放入9ml人工模拟肠液(pH6.8,胆盐0.3%,胰酶10g/L)37℃震荡孵育2h,4000rpm离心5min,弃上清液后将菌体重悬于1ml生理盐水中,并进一步梯度稀释涂布于MRS培养基中,37℃培养待长出菌落(2~3天)后,平板计数,计算菌株经人工模拟胃液及人工模拟肠液处理后的存活率,同时挑取健壮菌落进行传代用于下一轮培养。
当本轮筛选菌株存活率<0.1%,则下一代压力筛选人工模拟胃液及人工模拟肠液酸值及胆盐浓度不变,利用下一代菌株重复进行上述筛选,直到筛选到某代菌株成活率>0.1%时,在其下一代压力筛选时,将人工模拟胃液的pH值降为1.3,人工模拟肠液中胆盐浓度升为0.35%,直到筛选到某代,菌株成活率又>0.1%时,将人工模拟胃液的pH值降为1.1,人工模拟肠液中胆盐浓度升为0.4%,并进行进一步筛选,直到筛选到某代,在该浓度下,菌株的存活率>0.1%筛选完成。
从初始驯化开始,每驯化两代,利用初始浓度人工模拟胃液(pH1.5,胃蛋白酶10g/L)及人工模拟肠液(pH6.8,胆盐0.3%,胰酶10g/L)对该代菌株进行处理,处理条件同上,并计算菌株经处理后的存活率,用以定量比较不同代次菌株对人工模拟胃液及人工模拟肠液的耐受性差异。
经过连续50代的定向驯化,菌体对人工模拟胃液(pH1.5,胃蛋白酶 10g/L)及人工模拟肠液(pH6.8,胆盐0.3%,胰酶10g/L)复合处理下的成活率如图1.所述。
如图1.所示,每两代驯化后,对菌株进行初始浓度的模拟胃液(pH1.5) 及模拟肠液(0.3%胆盐)耐受性的考察,可见随着驯化代数的增加,菌株对其抗性在逐级增强,至第50代(F50),其对经过连续模拟胃液及模拟肠液处理后存活率(87.59%)较出发菌株(0.098%)提高至895倍,菌株F50 即命名为BKR-011。
将出发菌株SYP-B4138(F0)、经驯化后菌株BKR-011(F50)及已经报道的长双歧杆菌相比,其对胃酸及胆盐(胆酸)的耐受性如表1.所示。
表1.不同长双歧杆菌对人工模拟胃酸及胆盐(胆酸)的耐受性.
由表1.可知,与出发菌株SYP-B4138相比,菌株BKR-011在人工模拟胃液、胆酸及胆盐的耐受实验中,均具有大幅度提高,其中对人工模拟胃液的抗性提高了144倍,对胆酸及胆盐的抗性分别是出发菌株的4.04倍及 3.10倍。与已经报道的长双歧菌株MI-186及MF-269相比,菌株BKR-011 对胆酸的抗性分别是MI-186的3.5×105倍及MF-269的6.27倍,亦显示出了明显的优势。
3.驯化菌株与出发菌株的生理生化功能比较及遗传稳定性分析
驯化菌株BKR-011(F50)经16s rDNA测序,经比对与出发菌株 SYP-B4138(F0)一致性为100%,同为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
利用GenIII微孔板,通过对不同生化试验所提供的表型进行检测,并通过Biolog鉴定***(Microlog-M,MicroStation,)中的软件,通过读取GenIII微孔板上所表现出的表型图谱来对本菌株进行鉴定。通过 Biolog鉴定***分别对出发菌株SYP-B4138(F0)及驯化菌株BKR-011 (F50)的表型进行鉴定及比较,结果如表2.所示。
通过表2.可知,驯化菌株BKR-011(F50)可在4%NaCl溶液中具有一定的生长能力,而出发菌株(F0)则不具备该能力,提示经驯化后,菌株的耐盐能力亦得到一定程度的增强。除此,其它生理生化指标与出发菌株相一致,证明其所具有遗传稳定性。
表2.驯化菌株BKR-011(F50)与出发菌株SYP-B4138(F0)的生理生化指标比较.
其中“-”代表阴性,“+”代表阳性,“w”代表弱阳性.
同时上述所获得的菌株BKR-011(F50)菌株公众可按照上述记载的驯化方法制得,或者向申请人购买获得,申请人承诺自本发明申请日起20年可向公众提供该菌株用于非商业性目的科学研究。
实施例2.长双歧杆菌Bifidobacterium longum BKR-011在肠道中的定植
1.本发明菌株对Caco-2细胞的粘附性能分析
将上述实施例1培养好的出发菌株SYP-B4138(F0)及本专利菌株 BKR-011(F50)分别于4000rpm、4℃离心5min,收集菌体用PBS缓冲液洗涤3次,再用DMEM调节菌液浓度至109CFU/mL,将菌悬液加入到已培养好的Caco-2单层细胞中,37℃共培养2h,再用甲醇固定30min后染色,在电镜下观察20个视野100个细胞,计算这两株菌对细胞的粘附力,其中出发菌株SYP-B4138(F0)及菌株BKR-011(F50)的粘附能力平均分别可达22.4±1.5及28.5±1.2个/细胞。
2.本发明菌株在小鼠体内的定植情况
菌悬液的制备:菌株活化后于MRS培养基中培养至OD600为1.2, 4000rad/min离心5min,弃上清液回收菌泥。
实验小鼠:C57BL/6J,SPF级,雄性,4周龄;
饲养环境:温度控制在22-26℃,相对湿度40-70%,12h/12h昼夜交替,自由饮食饮水;
高脂饲料配方见表3.
表3.高脂饲料配方(10kg).
将小鼠正常饮食(ND)适应1周后,将其分为5组,每组5只进行实验,分组方式如下:
ND组:为阴性对照组,整个实验周期保持普通饲料喂养,不进行干预操作;
HDF组:为空白对照组,整个实验周期保持高脂饲料喂养,不进行干预操作;
HDF+Orlistat组:为阳性对照组,整个实验周期保持高脂饲料喂养,每天使用奥利司他(Orlistat)进行灌胃,用量为50mg/kg(B.W.);
HDF+F0组:为出发菌株SYP-B4138(F0)实验组,整个周期保持高脂饲料喂养,前两周每天2.7×107CFU灌胃,第3及第4周停药;
HDF+BKR-011组:为驯化菌株BKR-011(F50)实验组,整个周期保持高脂饲料喂养,前两周每天2.7×107CFU灌胃,第3及第4周停药。
每周对各组小鼠粪便进行采集,并进行梯度稀释,涂于MRS+溴甲酚紫和MRS+莫匹罗星锂盐选择性培养基平板上。37℃培养72h后,每组平板随机挑取96个菌落进行菌落PCR。以阳性结果出现的比率评价粪便中长双歧杆菌的相对丰度。
引物为长双歧杆菌特异性引物:
P1:5'-AGCAGCGGCATATCCTTGAA-3'
P2:5'-TTCTGGCCAACGGCTTTG-3'
PCR完成后,进行电泳,检测是否出现特异性条带,并进一步计算特异性条带出现的比率,用以对各组粪便中长双歧杆菌的含量进行相对比较。
停药后至第6周,利用上述特异性引物,直接对各组小鼠粪便进行PCR 扩增,检测各组是否存有长双歧杆菌基因组特异性条带。
0~4周各组小鼠粪便中长双歧杆菌的相对丰度如图2.所示:
由图2.可知,只在HDF+F0组及HDF+BKR-011组经给药后才检测出长双歧杆菌的相对丰度,说明本实验所体现的数值为出发菌株F0及菌株 BKR-011,而非体内含有的其它菌株。在第1周及第2周每天持续给药的过程中,可发现本发明菌株BKR-011的相对丰度明显高于出发菌株,分别为 69.79%和36.46%,提示该菌经驯化后,可大量进入小肠并具有较高丰度,提示本发明菌株除在体外具有良好的耐人工模拟胃液/肠液能力外,在体内亦有良好的实现;
在第3周停药后,两组菌株在小鼠体内相对丰度均有明显降低,但菌株BKR-011在小鼠体内的丰度仍然明显优于出发菌株,至第4周仍有较多本发明出发菌BKR-011株被检测到(12.50%),而出发菌株则低于检测限下,未能检出。
进一步持续两周停药喂养小鼠(第6周后)后,各组小鼠粪便利用长双歧杆菌特异性引物进行扩增后的结果如图3.所示
由图3.可知,经2周给药,4周停药共计6周的持续性培养,菌株 BKR-011依然可在小鼠粪便中检测到,而出发菌株F0组及其它组均未能检测到,进一步证明菌株BKR-011在体内的高定植能力。
实施例3.长双歧杆菌Bifidobacterium longum BKR-011对小鼠高脂饮食诱导肥胖及高血糖血脂症的预防及治疗
菌悬液的制备:将菌株BKR-011在MRS平板上进行活化,活化后于 MRS培养基中培养至OD600为1.2,4000rad/min离心5min,弃上清液回收菌泥。
a)活体菌株悬液的制备方法为,将菌泥直接用PBS洗涤并重悬为 2.7×108CFU/ml备用。
b)灭活菌株悬液的制备方法为,将菌泥重悬为2.7×108CFU/ml后进行蒸汽湿热灭菌(121℃,20min)。
实验小鼠:C57BL/6J,SPF级,雄性,4周龄;
饲养环境:温度控制在22-26℃,相对湿度40-70%,12h/12h昼夜交替,自由饮食饮水;
高脂饲料配方见表3.
第一阶段实验,本发明菌株BKR-011对高脂饮食小鼠肥胖的预防:
将小鼠正常饮食(ND)适应1周后,按照体重随机分为6组:
ND组:给予普通饲料作为空白对照;
HFD组:实验小鼠喂养高脂饲料(HFD)8周诱导肥胖,期间不进行其它干预;
HFD+F0组:实验小鼠喂养高脂饮食(HFD)8周诱导肥胖,期间每天灌胃出发菌株(F0)活菌数为2.7×107CFU用于肥胖预防。
HFD+BKR-011组:实验小鼠喂养高脂饮食(HFD)8周诱导肥胖,期间每天灌胃驯化菌株(BKR-001)活菌数为2.7×107CFU用于肥胖预防。
HDF+inactivated F0组:实验小鼠喂养高脂饮食(HFD)8周诱导肥胖,期间每天灌胃2.7×107CFU灭活出发菌株(F0)用于肥胖预防。
HDF+inactivated BKR-011组:实验小鼠喂养高脂饮食(HFD)8周诱导肥胖,期间每天灌胃2.7×107CFU灭活驯化菌株BKR-011用于肥胖预防。
按照上述方式实验结束后分别对各组小鼠进行称重,实验结果如图4. 所示,当以超过26g体重作为体重超标计,结果提示:
ND组未超标小鼠占总数的85.72%,而HFD组未超标小鼠占总数的 18.36%,远低于ND组,证明造模成功。
HFD+F0组及HFD+BKR-011组体重未超标小鼠分别占总数的33.97%及44.83%,高于HFD组的18.36%,故认为出发菌株及驯化菌株对喂养高脂饮食的小鼠所诱发的肥胖具有良好的预防作用,其中驯化菌株BKR-011 预防作用最强,可降低26.47%的肥胖发生率。
HDF+inactivated F0组及HDF+inactivated BKR-011组体重未超标小鼠分别占总数的18.37%及18.75%,与HDF组18.36%未见显著差异,故认为菌株是以活体的形式在小鼠体内产生的生理作用。
第二阶段实验,本发明菌株BKR-011及出发菌株F0对高脂饮食小鼠肥胖及其高血糖血脂症的治疗:
第一阶段实验完成后,选取ND组小鼠,作为阴性对照组。及HFD组小鼠,除去体重无明显变化的小鼠,并重新分为7组,每组10只,进一步进行8周治疗:
ND组:为阴性对照组,整个实验周期保持普通饲料喂养,不进行干预操作;
HDF组:为空白对照组,整个实验周期保持高脂饲料喂养,不进行干预操作;
HDF+Orlistat组:为阳性对照组,整个实验周期保持高脂饲料喂养,每天使用奥利司他(Orlistat)进行灌胃,用量为50mg/kg(B.W.);
HDF+F0组:为出发菌株(F0)实验组,整个周期保持高脂饲料喂养,每天灌胃量为2.7×107CFU;
HDF+BKR-011组:为驯化菌株BKR-011实验组,整个周期保持高脂饲料喂养,每天2.7×107CFU灌胃;
上述各组小鼠每天自由饮食。
实验过程中数据的采集:
每2周对小鼠进行体重测量,进行眼眶采血及剪尾采血,用以进行总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C) 及空腹血糖(FBG头晚12h禁食不禁水)测定;选取血脂四项试剂盒(南京建成),用以测定包括胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)在内的血脂水平;利用血糖仪测定小鼠血糖。
8周实验完成后,分别对小鼠进行口服葡萄糖耐量测定(OGTT)、性腺脂肪测定(EAM)、肾周脂肪测定(PFM)及肝脏质量测定,同时检测小鼠血清中的谷氨酰氨转氨酶(ALT)及天冬氨酸转氨酶(AST),并对炎症因子,包括:白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)及单核细胞趋化蛋白(MCP-1)进行检测。
OGTT测定的条件为:所有试验小鼠在禁食16h(不禁水)后按照2 g/kg(葡萄糖质量小鼠体重)的剂量,灌胃给予80mg/150u L的葡萄糖溶液,分别测定15min、30min、60min、90min及120min的血糖浓度,鼠尾采血,血糖检测仪测定。
OGTT测定完成后,处死小鼠,迅速取出血液,血样以1000-2500rpm/min 离心15min,采集血清进行下一步分析;精密剖取每只小鼠的肝脏、性腺脂肪及肾周脂肪进行称重。利用ALT,AST试剂盒测定血清中丙氨酸转氨酶 (ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的含量变化;利用小鼠CBA炎症多因子试剂盒检测IL-6、TNF-α及MCP-1。
实验结果
1.小鼠的体重变化
治疗期间0~8周各组小鼠平均体重的变化值如表4.所示,体重变化趋势如图5.所示。
表4.治疗期间在0~8周治疗期间小鼠的平均体重.(g,SD).
由图4可知,无论是使用出发菌株(HDF+F0)还是驯化菌株 (HDF+BKR-011),均可降低高脂喂养小鼠体重,其中驯化菌株组 (HDF+BKR-011)作用较快,在第2周即明显的强于阳性对照药奥利司他 (P=0.0056),此时两组小鼠平均体重分别为27.5±0.7g及29.2±1.1g,至第 4周即将小鼠平均体重维持在25.8±1.3g的水平。而奥利司他及出发菌株(HDF+F0)第4周才出现明显减重效果(P=0.0031&0.0024),至第6周才将小鼠平均体重维持在26.2±1.3g及26.4±0.9g的水平,较驯化菌株 BKR-011起效为慢。至第8周,出发菌株组(HDF+F0),其减重效果明显优于奥利司他组(P=0.033)。
由此可以看出,本发明驯化菌株BKR-011与出发菌株(F0)及奥利司他相比,具有起效时间更短,持续减重效果更强的优势。
值得注意的是,高脂饮食小鼠经过菌株BKR-011两周14天治疗,既明显产生减重效果,小鼠平均体重由30.3±0.8g降至27.5±0.7g,降幅达到 9.24%;已报道格氏乳杆菌MF296及MI-186,其对高脂饮食小鼠经15天治疗,平均体重降幅分别为1.77%(数据来源于CN 113234640 A表7.中0天与15天比较结果)及0.93%(数据来源于CN 113293113 A表7.中0天与 15天比较结果)
2.小鼠血脂的变化
1)治疗期间0~8周各组小鼠的总胆固醇(TC)变化趋势见图6.
由图6.可知,奥利司他组(HDF+Orlistat)、出发菌株(HDF+F0)组及驯化菌株组(HDF+BKR-011)在8周作用下,均对小鼠的总胆固醇具有降低作用。出发菌株组(HDF+F0)与奥利司他组相比,其在第6周才显现出明显的降低作用(P=0.0002),较奥利司他组第4周显效(P=0.001)为慢,但奥利司他组之后便保持稳定,而出发菌株(HDF+F0)组则总胆固醇(TG) 水平逐渐降低,至第6周,明显优于奥利司他组(P=0.0011)。
与奥利司他组及出发菌株组(HDF+F0)相比,本发明驯化菌株KBR-011 在给药第2周即开始明显起效(P<0.0001),至第6周总胆固醇水平达到最低(3.00±0.38mmol/L)并在之后开始维持,在第6周其平均总胆固醇(TC) 水平,分别较空白对照组(HDF)的4.85±0.34mmol/L、奥利司他组的 4.42±0.25mmol/L及出发菌株组的3.88±0.22mmol/L低38.1%、32.1%及 22.7%。
2)治疗期间0~8周各组小鼠的甘油三酯(TG)变化趋势见图7.
由图7.可知,奥利司他组在整个治疗周期中并未对甘油三酯(TG)起到明显的降低作用(第8周为1.09±0.096mmol/L,同期高脂饲料组为 1.00±0.094mmol/L,P=0.082),而出发菌株组(HDF+F0)及驯化菌株组 (HDF+BKR-011)则对TG降低明显,出发菌株在第6周可看到明显降低的趋势(P=0.0064)并在第8周降至较低水平(0.74±0.13mmol/L)。与出发菌株菌株相比,活菌株起效更快,且效果更好,在第2周即可看到下降趋势(P=0.0003),在第4周即可降至较低水平(0.63±0.12mmol/L)并持续至第8周;与普通饲料组(ND)比较,第4周后活菌株组(HDF+LB)其TG 水平即接近同期普通饲料组(ND),分别为0.63±0.12mmol/L及0.42±0.065mmol/L(第4周)、0.63±0.09mmol/L及0.51±0.06mmol/L(第6 周)、0.51±0.08mmol/L及0.49±0.06mmol/L(第8周)。
由此可见,与对照药奥利司他相比,无论是出发菌株还是驯化菌株均具有降低甘油三脂(TG)的能力,其驯化菌株与出发菌株相比,出发菌株起效作用更快,降低TG作用更明显,其在第4周对TG的降低效果即接近普通饲料组(ND),其同期平均TG水平较高脂饲料组(HDF)低27.6%。
3)治疗期间0~8周各组小鼠的低/高密度脂蛋白(LDL-C/HDL-C)变化趋势见图8和表5.
由图8.可知,奥利司他、出发菌株菌株及驯化菌株均可降低高脂饮食小鼠血清中脂蛋白含量,并且低密度脂蛋白(LDL-C)降低效果强于高密度脂蛋白(HDL-C),以第6周计,各组小鼠LDL-C/HDL-C结果见表5.说明其对这两种脂蛋白浓度的降低具有一定的选择性,该选择性有利于更好的降低低密度脂蛋白(LDL-C)水平,并保持高密度脂蛋白(HDL-C)处于合理水平。
表5.第6周各组小鼠体内低/高密度脂蛋白(LDL-C/HDL-C)的平均水平. (mmol/L,SD)
由图8.A所示,驯化菌株KBR-011于第4周即将小鼠LDL-C降低至平稳水平(0.69±0.18mmol/L),出发菌株菌株则于第6周将小鼠LDL-C降低至平稳水平(0.77±0.16mmol/L),而奥利司他则在第2周将LDL-C降至 (0.83±0.11mmol/L)后未有进一步显著降低。说明本发明无论出发菌株还是驯化菌株,均具有降低低密度脂蛋白(LDL-C)的功效。与出发菌株相比,驯化菌株BKR-011作用效果更强。
由图8.B所示,虽然本发明出发菌株及驯化菌株均对高密度脂蛋白 (HDL-C)具有一定的降低能力,但至8周治疗期结束,以驯化菌株组 (HDF+BKR-011)为例,其小鼠血清中HDL-C含量(3.78±0.28mmol/L)仍高于普通鼠粮组(ND,3.24±0.30mmol/L),说明其对HDL-C的降低并不能对机体的脂代谢产生不利影响。
3.小鼠血糖的变化
1)治疗期间0~8周各组小鼠的血糖(FBG)变化趋势见图9.
由图9.可知,小鼠在前期8周高脂饮食造模阶段完成后,血糖平均水平与普通鼠粮组(ND)均有不同程度的提升,而随着持续8周治疗期过程,高脂鼠粮组(HDF)小鼠平均血糖水平亦持续的提高,其中HDF组由第0 周的5.43±0.36mmol/L提升至第8周的8.45±0.86mmol/L,可见在持续长时间利用高脂饮食喂养小鼠后,除对小鼠诱发肥胖外,亦诱发了小鼠的血糖提升。并且发现,利用奥利司他在对小鼠进行持续干预后,虽然在一定程度上缓解了小鼠的诱发性肥胖,但整个治疗期间尚未发现其对小鼠血糖持续性升高的有效缓解。
而本发明无论是出发菌株还是驯化菌株在整个治疗期间,均可对小鼠血糖的渐进式升高起到缓解作用,与高脂饮食组(HDF)相比较,其在第4 周与HDF组比较即可观察到明显效果(P=0.0021),而出发菌株组则在第8 周体现明显抑制效果(P=0.0225),至第8周治疗期结束,服用出发菌株及驯化菌株小鼠平均空腹血糖(FBG)水平分别为7.37±0.99mmol/L及 6.86±0.34mmol/L,低于HDF组(8.45±0.86mmol/L)的平均水平,其降低率分别为12.78%及18.82%,可见本发明出发菌株及驯化菌株BKR-011均对因高脂饮食所导致的血糖升高具有抑制作用,且经驯化后效果更强。
2)8周治疗期结束后小鼠的口服糖耐量(OGTT)分析见图10.
由图10.可知,在给与葡萄糖灌胃后,各组小鼠在15min血糖浓度达到峰值,并随时间逐级回落,普通喂食组(ND)在第90min时血糖回落至初始水平(5.07±0.43mmol/L);奥利司他组及高脂饮食组在第120min时才将血糖回落至初始水平(分别为8.17±0.79mmol/L及8.29±1.11mmol/L);
而出发菌株组(HDF+F0)及驯化菌株组(HDF+BKR-011)则分别在第90min内将血糖回落至初始水平(分别为7.81±1.14mmol/L及6.97±1.08 mmol/L),与普通喂食组(ND)血糖回落速度相近,说明本发明菌株BKR-011 除可改善长期高脂饮食所诱发的血糖提升,亦可改善机体因高血糖所引起的糖耐量降低。
4.小鼠体内脂肪的变化
8周治疗期结束后小鼠脂肪组织及脏器的变化见图11.
如图11.可知,小鼠经8周治疗后,奥利司他组、出发菌株菌株组及活菌株组,其性腺脂肪(EAM)肾脏脂肪(PFM)及肝脏(Liver)重量均低于高脂饮食组。并且出发菌株组及活菌组均作用较为明显(EAM P<0.0001& <0.0001,PFM P=0.0004&0.0002,Liver P=0.0008&0.0003)。以驯化菌株 BKR-011组为例,该组小鼠平均性腺脂肪(EAM)、肾脏脂肪(PFM)及肝脏(Liver)质量分别为0.55±0.16g、191.5±33.5mg及0.52±0.09g,与高脂饮食组相比较,分别降低49.00%、46.2%及26.17%。
值得注意的是,普通饮食组(ND)小鼠肝脏的平均重量为0.54±0.05g,本发明驯化菌株BKR-011组小鼠肝脏的平均重量为0.52±0.09g,与ND组未见显著性差异,提示本发明菌株可有效降低高血脂症所诱发的肝损伤。
5.小鼠体内转氨酶的变化
8周治疗期结束后小鼠体内的转氨酶含量,见图12.
由图12.可知,与普通饮食组(ND)相比较,高脂饮食组(HDF)小鼠体内的谷氨酸转氨酶(ALT)及天冬氨酸转氨酶(AST)水平均有所增加,其中ALT变化最为明显,ND组及HDF组ALT血清中平均酶活分别为 14.97±1.8U/L及32.42±2.25U/L。说明长期高脂饮食所诱发的高血脂症对小鼠的肝脏造成了一定程度的损伤。
小鼠喂食出发菌株及驯化菌株后,其血清中ALT及AST酶活均较高脂饮食组(HDF)有明显的降低作用(ALT P<0.0001&<0.0001,AST P=0.0002 &=0.0023),与高脂饮食组(ALT 32.42±2.25U/L,AST 24.51±2.59U/L)相比,出发菌株组其体内血清中的ALT及AST酶活,分别较高脂饮食组降低 25.88%及8.16%;驯化菌株组其体内血清中的ALT及AST酶活,分别较高脂饮食组降低32.29%及13.79%。
6.小鼠体内炎症因子的变化
8周治疗期结束后小鼠体内促炎因子的含量,见图13和表6.
由图13.可知,与普通饮食组(ND)相比较,高脂饮食组(HDF)小鼠体内的3种促炎因子含量均有显著的上调,上调水平分别为59.74% (IL-6)、52.93%(TNF-α)及43.02%(MCP-1)。说明小鼠在长期喂食高脂饮食诱发肥胖后,其体内出现了慢性炎症状态。
出发菌株组及驯化菌株组在治疗期完成后,其体内的三种促炎因子均匀可见显著下降(IL-6P=0.0276&0.0003,TNF-αP=0.0433&0.0021, MCP-1P=0.0146&0.0006),以本发明驯化菌株BKR-011为例,其三种促炎因子分别较高脂饮食组下降了31.83%(IL-6)、12.31%(TNF-α)及19.62% (MCP-1)见表6.。
说明本发明无论是出发菌株还是驯化菌株均可明显改善因高脂饮食诱发肥胖所引起的机体亚炎症反应。
表6.三种促炎因子在小鼠体内的含量.(pg/ml,SD.)
实施例4.长双歧杆菌Bifidobacterium longum BKR-011治疗及停药期间对小鼠炎症因子的影响
参见实施例3所述,选取高脂饮食造模成功的小鼠及未进行造模小鼠,分为5组进行实验,每组实验10只小鼠。
ND组:为阴性对照组,整个实验周期保持普通饲料喂养,不进行干预操作;
HDF组:为空白对照组,整个实验周期保持高脂饲料喂养,不进行干预操作;
HDF+Orlistat组:为阳性对照组,整个实验周期保持高脂饲料喂养,前两周使用奥利司他(Orlistat)进行灌胃,用量为50mg/kg(B.W.),第3 及第4周停药;
HDF+F0组:为出发菌株(F0)实验组,整个周期保持高脂饲料喂养,前两周每天菌株悬液灌胃,灌胃量为2.7×107CFU,第3及第4周停药;
5组(HDF+BKR-011)为驯化菌株实验组,整个周期保持高脂饲料喂养,前两周每天用菌株悬液灌胃,灌胃量为2.7×107CFU,第3及第4周停药。
上述各组小鼠每天自由饮食。
每周进行采血,用以测定各组小鼠体内白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的含量(实验方法见实施例3)。0~4周内小鼠体内炎症因子的实验结果检测,如图14.所示。
由图14.可知,HDF组各项炎症因子均明显高于ND组,证明本实验造模成功。其中奥利司他对IL-6因子(图14.A)并未有显著改变,全周期内一直处于较高水平,而对TNF-α及MCP-1因子(图14.B C)则在治疗期间 (1~2周)有所降低,并在停药后(3~4周)立即回升。与奥利司他相比较,出发菌株对IL-6因子(图14.A)作用明显,在治疗期间(1~2周)均明显低于奥利司他组,而对TNF-α及MCP-1因子(图14.B C)则与奥利司他组相近。本发明驯化菌株BKR-011对这3种炎症因子均有较明显的降低作用,在治疗期间,该菌株起效更快,治疗效果明显优于奥利司他及出发菌株,其改善效果与实施例3中(图13.)作用相似。
值得注意的是,在停药后的2~4周,与出发菌株及奥利司他相比,本发明驯化菌株组(HDF+BKR-011)在第4周才观察到有缓慢回升的趋势,提示本发明菌株BKR-011可在小鼠体内定值并持续具有疗效。
Claims (8)
1.一株长双歧杆菌,其特征在于:长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)已于2021年07月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:CGMCC No:22949。
2.一种改善由机体代谢综合症引起的亚健康状态的菌剂,其特征在于:菌剂含权利要求1所述的菌株,或含权利要求1所述的菌株经持续性梯度压力耐受培养后定向获得的菌株。
3.按权利要求2所述的改善机体代谢综合症引起的亚健康状态的菌剂,其特征在于:所述菌剂为含权利要求1所述的菌株,或含权利要求1所述的菌株经持续性梯度压力耐受培养的菌株的培养物沉淀、菌悬液或冻干粉。
4.按权利要求2所述的改善机体代谢综合症引起的亚健康状态的菌剂,其特征在于:所述经持续性梯度压力耐受培养的菌株为以权利要求1所述菌株为出发菌株,在不同的pH值下的人工模拟胃液和不同胆盐浓度下的人工模拟肠液进行持续性梯度压力耐受培养传代,直至培养后菌株性状稳定。
5.按权利要求4所述的改善机体代谢综合症引起的亚健康状态的菌剂,其特征在于:所述经持续性梯度压力耐受培养为将菌株首先在pH值为1.5的人工模拟胃液中于37℃孵育2h,而后再于胆盐浓度为0.3%的人工模拟肠液中于37℃孵育2h,孵育后MRS平板中37℃培养,计算本次孵育菌株成活率,成活率小于0.1%,则继续在该人工模拟胃液和人工模拟肠液条件下反复传代培养,直至成活率>0.1%时,将单菌落接种在pH值为1.3的人工模拟胃液中于37℃孵育2h,而后再于胆盐浓度为0.35%的人工模拟肠液中于37℃孵育2h,孵育后MRS平板中37℃培养,计算本次孵育菌株成活率,成活率小于0.1%,则继续在该人工模拟胃液和人工模拟肠液条件下反复传代培养,直至成活率>0.1%时,将单菌落接种在pH值为1.1的人工模拟胃液中于37℃孵育2h,而后再于胆盐浓度为0.4%的人工模拟肠液中于37℃孵育2h,孵育后MRS平板中37℃培养,计算本次孵育菌株成活率,成活率小于0.1%,则继续在该人工模拟胃液和人工模拟肠液条件下反复传代培养,直至成活率>0.1%时获取单菌落,即为获得经持续性梯度压力耐受培养的菌株。
6.按权利要求2所述的改善机体代谢综合症引起的亚健康状态的菌剂,其特征在于:所述菌剂可进一步添加至药物、日化品、化妆品、食品添加剂、保健食品及其在其它食品中用于改善由机体代谢综合症引起的亚健康状态。
7.按权利要求2所述改善由机体代谢综合症的菌剂的应用,其特征在于:所述菌剂在改善由机体代谢综合症引起的亚健康状态中的应用。
8.按权利要求6所述的应用,其特征在于:所述菌剂可进一步添加至药物、日化品、化妆品、食品添加剂、保健食品及其在其它食品中用于改善由机体代谢综合症引起的亚健康状态。
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