BR112012011315B1 - Formulação que compreende cepa de bifidobactéria probiótica - Google Patents

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Barry Kiely
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Abstract

CEPA DE BIFIDOBACTÉRIA PROBIÓTICA. A presente invenção refere-se a uma cepa de bifidobactéria probiótica AH1714 que é significativamente imunomoduladora após o consumo via oral. A cepa é útil como um agente bioterapêutico imunomodulatório.

Description

INTRODUÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a uma cepa de bifidobactéria e seu uso como uma bactéria probiótica, em particular como um agente bioterapêutico imunomodulatório.
[002] Os mecanismos de defesa para proteção do trato gastrointestinal humano contra a colonização por bactérias intestinais são altamente complexos e envolvem aspectos imunológicos e não imunoló- gicos (1). Os mecanismos de defesa inatos incluem o baixo pH do estômago, sais biliares, peristaltismo, camadas de mucina e compostos anti-microbicianos, tais como lisozima (2). Os mecanismos imunológi- cos incluem agregados linfóides especializados, células M subjacentes, chamadas de placas de peyers, que são distribuídos ao longo do intestino delgado e cólon (3). Antígenos luminais presentes nestes locais resultam na estimulação dos subconjuntos de células T e B adequados com estabelecimento de redes de citoquina e secreção de anticorpos para o trato gastrointestinal (4). Além disso, a apresentação do antígeno pode ocorrer através das células epiteliais para os linfóci- tos epiteliais e para as células imunes de lâmina própria subjacentes (5). Portanto, o hospedeiro investe substancialmente na defesa imuno- lógica do trato gastrointestinal (TGI). Entretanto, devido a mucosa gastrointestinal ser a maior superfície na qual o hospedeiro interage com o ambiente externo, devem existir mecanismos de controle específicos para regular a capacidade de resposta imune aos 90,718 kg (100 tons) de alimento que é gerido pelo trato gastrointestinal durante o tempo médio de vida. Além disso, o trato gastrointestinal é colonizado por mais de 500 espécies de bactérias, alcançando 1011 a 1012/g no cólon. Assim, esses mecanismos de controle devem ser capazes de distin- guir bactérias aderentes não-patogênicas de patógenos invasivos, os quais poderiam causar uma lesão significativa para o hospedeiro. De fato, a flora intestinal contribui para a defesa do hospedeiro, competindo com os micro-organismos potencialmente patogênicos recém- ingeridos.
[003] As bactérias presentes no trato gastrointestinal humano podem causar inflamação. Respostas imunológicas aberrantes para a microflora nativa estiveram envolvidas em certos estados doentios, tal como o processo inflamatório intestinal. Antígenos associados com a flora normal geralmente levam à tolerância imunológica e a falha em alcançar essa tolerância é um importante mecanismo da inflamação mucosal (6). A evidência para essa falha na tolerância inclui um aumento nos níveis de anticorpos dirigidos contra a flora do trato gastrointestinal em pacientes com doença inflamatória intestinal (DII).
[004] A presente invenção é encaminhada em direção a uma cepa de bifidobactéria que mostrou ter efeitos imunomodulatórios, ao modular os níveis de citoquina ou antagonizar e excluir microorganismos pró-inflamatórios do trato gastrointestinal.
DECLARAÇÕES DA INVENÇÃO
[005] A invenção apresenta uma cepa isolada de bifidobactéria NCIMB 41676.
[006] A cepa de bifidobactéria pode estar sob a forma de células viáveis. A cepa de bifidobactéria pode estar sob a forma de células não-viáveis. A bifidobactéria pode ser isolada do tecido para biópsia colônica de um indivíduo humano saudável. A cepa de bifidobactéria pode ser significativamente imunomodulatória após o consumo oral em seres humanos.
[007] A invenção também fornece uma formulação que compreende uma cepa de bifidobactéria conforme descrita na presente invenção. A formulação pode compreender ainda um material probiótico. A formulação pode compreender ainda um material prebiótico. A formulação pode compreender ainda um veículo ingerível. O veículo ingerí- vel pode ser um veículo farmaceuticamente aceitável, como uma cápsula, tablete ou pó. O veículo ingerível pode ser um produto alimentício tal como leite acidificado, iogurte, iogurte congelado, leite em pó, concentrado de leite, requeijão, molhos ou bebidas. A formulação pode compreender ainda uma proteína e/ou peptídeo, em particular proteínas e/ou peptídeos que são ricos em glutamina/glutamato, um lipídio, um carboidrato, uma vitamina, mineral e/ou microelemento. A cepa de bifidobactéria pode estar presente em uma quantidade de mais de 106 ufc por grama da fórmula. A formulação pode compreender ainda um adjuvante. A formulação pode compreender ainda um componente bacteriano. A formulação pode compreender ainda uma entidade de fármaco. A formulação pode compreender ainda um composto biológico. A formulação pode ser usada para protocolos de imunização e vacinação.
[008] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso em produtos alimentícios.
[009] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso como um medicamento.
[0010] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória indesejável.
[0011] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória gastrointestinal indesejável, como doença inflamatória intestinal, por exemplo: doença de Crohn ou colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável; bursite; ou colite pós- infecciosa.
[0012] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncer gastrointestinal.
[0013] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença sistêmica, como artrite reumatoide.
[0014] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de transtornos autoimunes devido a atividade inflamatória indesejável.
[0015] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncer devido a atividade inflamatória indesejável.
[0016] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia de câncer.
[0017] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença diarreica devido a atividade inflamatória indesejável, como diarreia associada a Clostridium difficile, diarreia associada a rotavírus ou diarreia pós-infecciosa, ou doença diarreica devido a um agente infeccioso, como E. coli.
[0018] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na preparação de agentes bioterapêuticos anti-inflamatórios para a profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória indesejável.
[0019] As cepas de bifidobactéria, conforme descrito aqui, podem ser utilizadas na preparação de um painel de agentes bioterapêuticos para modificação dos níveis de IL-10.
[0020] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na prevenção e/ou tratamento de distúrbios inflamatórios, imunodeficiência, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, câncer (particularmente dos sistemas gastrointestinal e imune), doença diarreica, diarreia associada ao uso de antibiótico, diarreia pediátrica, apendicite, distúrbios autoimunes, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, artrite reumatoide, doença celíaca, diabetes mellitus, transplante de órgão, infecções bacterianas, infecções virais, infecções fúngicas, doença periodontal, doença urogenital, doença sexualmente transmissível, infecção por HIV, replicação de HIV, diarreia associada a HIV, trauma associado a cirurgia, doença metastásica induzida por cirurgia, sepse, perda de peso, anorexia, controle da febre, caquexia, cicatrização de ferimentos, úlceras, função de barreira do intestino, alergia, asma, distúrbios respiratórios, distúrbios circulatórios, doenças coronárias, anemia, distúrbios do sistema de coagulação de sangue, doença renal, distúrbios do sistema nervoso central, doença hepática, isquemia, distúrbios nutricionais, osteoporose, distúrbios endócrinos, distúrbios epi- dermais, psoríase, acne vulgar, transtorno do pânico, distúrbio com- portamental e/ou distúrbio de stress pós-traumático.
[0021] A cepa de bifidobactéria, conforme descrito aqui, atua por antagonismo e exclusão de micro-organismos pró-inflamatórios do trato gastrointestinal.
[0022] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na preparação de agentes bioterapêuticos anti-inflamatórios para reduzir os níveis de citoquinas pró-inflamatórias.
[0023] A cepa de bifidobactéria, conforme descrito aqui, pode ser usada como uma cepa probiótica anti-infectante.
[0024] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou tratamento de transtorno bipolar, depressão, transtornos de humor e/ou transtornos de ansiedade.
[0025] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, que pode ser usada como intensificador cognitivo para a profilaxia e/ou para o tratamento de distúrbios do sistema nervoso central, como doença de Alzheimer, esquizofrenia e/ou distúrbio cognitivo leve.
[0026] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de inflamação relacionada à obesidade.
[0027] A invenção também fornece uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação, conforme descrito aqui, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de desregulagem metabólica relacionada à obesidade.
[0028] Descrevemos a cepa de bifidobactéria AH1714 (NCIMB 41676) ou mutantes ou variantes da mesma. O mutante pode ser um mutante geneticamente modificado. A variante pode ser uma variação de ocorrência natural da bifidobactéria. Também há a descrição de uma variante resistente à rifampicina da cepa AH1714. A cepa pode ser um probiótico. Pode estar sob a forma de uma cultura biologicamente pura.
[0029] Também descrevemos uma cepa isolada de bifidobactéria NCIMB 41676. As cepas de bifidobactéria podem estar sob a forma de células viáveis. Alternativamente, as cepas de bifidobactéria estão sob a forma de células não-viáveis. O uso geral de bactérias probióticas se dá sob a forma de células viáveis. Entretanto, pode também ser estendido a células não-viáveis como culturas mortas ou composições contendo fatores benéficos expressados pela bactéria probiótica. Isso pode incluir micro-organismos mortos termicamente ou micro-organismos mortos mediante a exposição a pH alterado ou submissão a pressão ou irradiação gama. Com células não-viáveis, a preparação do produto é simplificada, as células podem ser incorporadas facilmente em fár- macos e os requisitos de armazenamento são muito menos limitados do que com células viáveis. O Lactobacilos casei YIT 9018 oferece um exemplo da eficácia do uso de células mortas pelo calor como um método de tratamento e/ou prevenção de crescimento tumoral, conforme descrito na patente US n° 4347240.
[0030] As cepas de bifidobactéria podem ser isoladas do tecido de biópsia colônica de indivíduos humanos saudáveis, sendo as cepas de bifidobactéria significativamente imunomodulatórias seguindo o consumo oral em seres humanos.
[0031] Também descrevemos uma formulação que compreende a cepa de bifidobactéria conforme descrito aqui. A formulação pode incluir outro material probiótico. A formulação pode incluir um material prebiótico. De preferência, a formulação inclui um veículo ingerível. O veículo ingerível pode ser um veículo farmaceuticamente aceitável como uma cápsula, tablete ou pó. De preferência o veículo ingerível é um produto alimentício como leite acidificado, iogurte, iogurte congelado, leite em pó, concentrado de leite, requeijão, molhos ou bebidas. A formulação pode compreender ainda uma proteína e/ou peptídeo, em particular proteínas e/ou peptídeos que são ricos em glutami- na/glutamato, um lipídio, um carboidrato, uma vitamina, mineral e/ou microelemento. A cepa de bifidobactéria pode estar presente na formu-lação em mais de 106 ufc por grama do sistema de liberação. De preferência, a formulação inclui um ou mais de um adjuvante, um componente bacteriano, uma entidade de fármaco ou um composto biológico.
[0032] Também descrevemos uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação para uso como produtos alimentícios, como um medicamento, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de atividade inflamatória indesejável, para uso no tratamento de atividade inflamatória res- piratória indesejável como asma, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de atividade inflamatória gastrointestinal indesejável como doença inflamatória intestinal, por exemplo: doença de Crohn ou colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável, bursite ou colite pós- infecciosa, para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncer gastrointestinal, para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença sistêmica como artrite reumatóide, para uso na profilaxia e/ou no tratamento de transtornos auto-imunes devido a atividade inflamatória indesejável, para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncer devido a atividade inflamatória indesejável, para uso na profilaxia de câncer, para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença diarreica devido a atividade in-flamatória indesejável, como diarreia associada a Clostridium difficile, diarreia associada a rotavírus ou diarreia pós-infectante, para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença diarreica devido a um agente infeccioso, como E. coli.
[0033] Também descrevemos uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação da invenção para uso na preparação de um agente biote- rapêutico anti-inflamatório para a profilaxia e/ou para o tratamento de atividade inflamatória indesejada ou para uso na preparação de agentes bioterapêuticos anti-inflamatórios para a profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória indesejável. A cepa pode agir por antagonismo e exclusão dos micro-organismos pró-inflamatórios do trato gastrointestinal.
[0034] Também descrevemos uma cepa de bifidobactéria ou uma formulação para uso na preparação de agentes bioterapêuticos anti- inflamatórios para redução dos níveis de citoquinas pró-inflamatórias.
[0035] A cepa de bifidobactéria pode ser usada na preparação de agentes bioterapêuticos anti-inflamatórios para modificar os níveis de IL-10.
[0036] A cepa de bifidobactéria pode ser usada como um probióti- co anti-infectante devido à sua habilidade de antagonizar o crescimento de espécies patogênicas.
[0037] Descobrimos que cepas particulares de bifidobactéria obtêm efeitos imunomodulatórios in vitro.
[0038] A invenção é, portanto, de grande valor terapêutico potencial na profilaxia ou tratamento de respostas imunológicas desregula- das, como reações inflamatórias indesejadas, por exemplo, asma.
[0039] As bifidobactérias são micro-organismos comensais. Elas foram isoladas da flora microbiana dentro do trato gastrointestinal humano. O sistema imunológico no trato gastrointestinal não pode ter uma reação pronunciada em relação aos membros desta flora, uma vez que a atividade inflamatória resultante também destruiria as células hospedeiras e a função do tecido. Portanto, existem alguns mecanismos para que o sistema imunológico possa reconhecer membros comensais não patogênicos da flora gastrointestinal como sendo diferentes dos organismos patogênicos. Isso garante que as lesões ao tecido hospedeiro sejam restritas e que uma barreira defensiva ainda seja mantida.
[0040] Um depósito de cepa de Bifidobacterium longum AH1714 foi feito no National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) Ferguson Building, Craibstone Estate, região de Bucks- burn, cidade de Aberdeen, AB21 9YA, Escócia, Reino Unido no dia 5 de novembro de 2009 e levou o número de registro NCIMB 41676.
[0041] A Bifidobacterium longum pode ser um mutante geneticamente modificado ou pode ser uma variante de ocorrência natural da mesma.
[0042] De preferência, a Bifidobacterium longum pode se apresentar na forma de células viáveis.
[0043] Alternativamente, a Bifidobacterium longum pode estar na forma de células não viáveis.
[0044] Será entendido que a cepa de bifidobactéria específica da invenção pode ser administrada a animais (incluindo seres humanos) em uma forma oralmente ingerível em uma preparação convencional como cápsulas, microcápsulas, tabletes, grânulos, pó, pastilhas, pílulas, supositórios, suspensões e xaropes. Formulações adequadas podem ser preparadas por métodos comumente empregados usando aditivos orgânicos e inorgânicos convencionais. A quantidade de ingrediente ativo na composição médica pode estar em um nível que irá exercer o efeito terapêutico desejado.
[0045] A formulação pode também incluir um componente bacteri-ano, uma entidade farmacológica ou um composto biológico.
[0046] Além disso, uma vacina que compreende as cepas da invenção pode ser preparada com o uso de qualquer método conhecido adequado e pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável ou adjuvante.
[0047] Ao longo do relatório descritivo, os termos mutante, variante e mutante geneticamente modificado incluem uma cepa de bifidobac- térias cujas propriedades genéticas e/ou fenotípicas são alteradas em comparação com a cepa progenitora. Variantes de ocorrência natural de Bifidobacterium longum incluem as alterações espontâneas de propriedades alvo seletivamente isoladas. A alteração deliberada das propriedades da cepa progenitora é alcançada por tecnologias de manipulação genética (in vitro) convencionais, como perturbação genética, transferência conjugativa, etc. A modificação genética inclui a introdução de sequências de DNA exógenas e/ou endógenas dentro do genoma de uma cepa de bifidobactéria, por exemplo por inserção dentro do genoma da cepa bacteriana por vetores, incluindo DNA plasmí- deo ou bacteriófagos.
[0048] As mutações naturais ou induzidas incluem pelo menos alterações de uma única base como supressão, inserção, transversão ou outras modificações de DNA que podem resultar em alteração da sequência de aminoácidos codificada pela sequência de DNA.
[0049] Os termos mutante, variante e mutante geneticamente modificado também incluem uma cepa de bifidobactéria que sofreu alterações genéticas que acumulam em um genoma em uma taxa que é consistente em natureza com todos os micro-organismos e/ou alterações genéticas que ocorrem através de mutação espontânea e/ou captura de genes e/ou perda de genes que não é alcançada por manipulação deliberada (in vitro) do genoma, mas é alcançada através da seleção natural de variantes e/ou mutantes que fornecem uma vantagem seletiva para suportar a sobrevivência da bactéria quando exposta a pressões ambientais, como antibióticos. Um mutante pode ser criado pela inserção deliberada (in vitro) de genes específicos dentro do ge- noma que não alteram fundamentalmente a funcionalidade bioquímica do organismo, mas cujos produtos podem ser usados para identificação ou seleção da bactéria, por exemplo, resistência antibiótica.
[0050] Uma pessoa versada na técnica iria reconhecer que cepas de bifidobactérias mutantes ou variantes podem ser identificadas por análise de homologia de sequências de DNA com a cepa progenitora. As cepas de bifidobactérias que têm uma identidade de sequência próxima a da cepa progenitora são consideradas cepas mutantes ou variantes. Uma cepa de bifidobactéria com uma identidade de sequência (homologia) de 96% ou mais, como 97% ou mais, ou 98% ou mais, ou 99% ou mais com a sequência de DNA da progenitora pode ser considerada uma mutante ou variante. A homologia da sequência pode ser determinada usando-se o algoritmo do programa online "BLAST" (um algoritmo para busca de homologia), publicamente disponível em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
[0051] Mutantes da cepa progenitora também incluem cepas de bifidobactéria tendo pelo menos 85% de homologia de sequência, co mo pelo menos 90% de homologia de sequência, ou pelo menos 95% de homologia de sequência para a sequência de polinucleotídeo do espaçador intergênico de 16s - 23s da cepa progenitora. Esses mu- tantes podem compreender ainda mutações de DNA em outras sequências de DNA no genoma bacteriano.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0052] A invenção será mais claramente compreendida através da descrição a seguir fornecida somente a título de exemplo, com referência aos desenhos em anexo, em que:
[0053] A Figura 1 é um gráfico ilustrando o trânsito da B. longum AH1714 através do trato gastrointestinal.
[0054] A Figura 2 é uma foto da B. longum AH1714 cultivada em uma placa de ágar vermelho congo;
[0055] A Figura 3 é um gráfico de barra ilustrando a razão IL-10:IL- 12p70 de células mononucleares de sangue periférico (CMSPs) estimuladas com a cepa Bifidobacterium longum 1714 (bifidobactéria 1714);
[0056] A Figura 4 é um gráfico de barra mostrando o perfil de in dução do IL-10 em esplenócitos isolados de camundongos administrados com 1714 e com STF, com e sem desafio in vivo de lipopolissaca- rídeo LPS de 1 mg/kg. As células in vitro são não-estimuladas (A), ou são estimuladas com lipopolissacarídeo LPS (B) ou estimuladas com antiCD3/CD28 (C). Os dados são mostrados como a média & EPM;
[0057] A Figura 5 é um gráfico de barra mostrando o perfil de indução do TNF-α em esplenócitos isolados de camundongos administrados com 1714 e com STF, com e sem desafio in vivo de lipopolissa- carídeo LPS in vivo de 1 mg/kg. As células in vitro são não- estimuladas (A) ou são estimuladas com antiCD3/CD28 (B). Os dados são mostrados como a média & EPM;
[0058] A Figura 6 é um gráfico de barra mostrando o perfil de in dução do IFN-Y em esplenócitos isolados de camundongos administrados com 1714 e com STF, com e sem desafio in vivo de lipopolissa- carídeo LPS de 1 mg/kg. As células in vitro são não-estimuladas (A) ou estimuladas com antiCD3/CD28 (B). Os dados são mostrados como a média & EPM.
[0059] A Figura 7 é um gráfico de barra mostrando o perfil de indução do IL-12p70 em esplenócitos isolados de camundongos administrados com 1714 e com STF, com e sem desafio in vivo com lipopo- lissacarídeo (LPS) de 1 mg/kg. As células in vitro são não-estimuladas (A) ou estimuladas com antiCD3/CD28 (B). Os dados são mostrados como a média & EPM;
[0060] A Figura 8 é um gráfico de barra mostrando o perfil de indução do TNF-α (A) e IL-10 (B) em amostras de soro de camundongos administrados com 1714 e com STF após 2 h do desafio in vivo com lipopolissacarídeo (LPS) de 1 mg/kg. Os dados são mostrados como a média & EPM;
[0061] A Figura 9 é um gráfico de barra mostrando a atividade NFkB (fótons/segundo) do baço isolado 3 horas após o desafio com dose única de 0,5 mg/kg de lipopolissacarídeo (LPS), de animais alimentados com placebo e 1714 (** indica p<0,01);
[0062] A Figura 10 é um gráfico de barra (A) mostrando a atividade NFkB (fótons/segundo) de imagens do corpo total 1 h30 m após o desafio com uma dose única de 0,5 mg/kg de lipopolissacarídeo LPS, de animais alimentados com placebo e com 1714 ((B) e (C) são imagens representativas do corpo total em preto e branco e em cores;
[0063] A Figura 11 é um gráfico de barra representando o tempo de imobilidade exibido pelo camundongo durante um teste de 6 minutos;
[0064] A Figura 12 é um gráfico de linha representando a porcentagem de congelamento em resposta ao estímulo temido (contexto) para o dia 1 (captura), dia 2 (memória/extinção) e dia 3 (extinção);
[0065] A Figura 13 é um gráfico de linha representando a porcen tagem de congelamento em resposta ao estímulo temido (pista) para o dia 1 (captura), dia 2 (memória/extinção) e dia 3 (extinção);
[0066] A Figura 14 é um gráfico de barra representando o número de esferas escondidas pelo camundongo durante uma sessão de 30 minutos;
[0067] A Figura 15 é um gráfico de barra representando a variação de temperatura corporal (ΔT) que os camundongos exibiram após o tratamento; e
[0068] A Figura 16 é um gráfico de barra mostrando as mudanças nos níveis de citoquina em esplenócitos estimulados do modelo de ratos induzidos por dieta.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0069] Um depósito de cepa de Bifidobacterium longum AH1714 foi feito no National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) Ferguson Building, Craibstone Estate, região de Bucks- burn, cidade de Aberdeen, AB21 9YA, Escócia, Reino Unido no dia 5 de novembro de 2009 e levou o número de registro NCIMB 41676.
[0070] Um depósito de cepa de Bifidobacterium longum UCC35624 foi feito no National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB) Ferguson Building, Craibstone Estate, região de Bucksburn, cidade de Aberdeen, AB21 9YA, Escócia, Reino Unido no dia 13 de janeiro de 1999 e levou o número de registro NCIMB 41003.
Exemplos
[0071] Os exemplos a seguir descrevem e demonstram com mais detalhes as modalidades no âmbito da presente invenção. Os exemplos são fornecidos somente para fins ilustrativos e não devem ser considerados como limitações à presente invenção, uma vez que mui- tas variações da mesma são possíveis, sem que se desvie do caráter e âmbito da invenção.
Exemplo 1 - Isolamento da Bifidobacterium longum AH1714
[0072] A cepa de Bifidobacterium longum AH1714 foi isolada do tecido de biópsia colônica de indivíduos humanos saudáveis.
[0073] Seções do TGI grosso, obtidas durante sondagem colo- retal, foram analisadas em busca de cepas bacterianas probióticas. Tecido mucoso do trato gastrointestinal humano foi transferido para um tubo de coleta contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS), suplementada com 0,05 de cisteina-HCl. Foi adicionado Triton X-100 (0,05%) para liberar os micro-organismos aderentes da amostra de tecido. Amostras de tecido foram então incubadas por 10 min. As amostras foram agitadas vigorosamente e lactobacilos e bifidobacté- rias foram isolados do tecido gastrointestinal por placas em ágares seletivos (ágares De Man, Rogosa e Sharpe (MRS) + vancomicina e ágar Wilkins-Chalgren + mupirocina, respectivamente). Colônias isoladas foram então retiradas das placas e reaplicadas por esfregaço três vezes para garantir a pureza. Foram usadas avaliações por examinação microscópica, manchas de Gram, testes de catalase, frutose-6-fosfato fosfoquetolase para determinar espécies de bifidobactérias prováveis e os isolados foram colocados em solução-tampão com 40% de glicerol e armazenados em -20 o e -80°C. Foi usado o sequenciamento da região do espaçador intergênico 16S para confirmar a identidade das cepas recém-isoladas.
[0074] Seguindo o isolamento de uma cepa de bifidobactéria pura e após atribuída a designação AH1714, as características microbioló- gicas foram avaliadas e estão resumidas na Tabela 1 abaixo. A AH1714 é uma bactéria gram-positiva de forma pleomórfica de catalase negativa, que é frutose-6-fosfato fosfoquetolase positiva, confirmando sua identidade como uma bifidobactéria. Tabela 1 - Características físico-químicas da B. longum AH1714
Figure img0001
[0075] Sequenciamento do espaçador intergênico (IGS) de 16s-23s foi realizado para identificar as espécies de bifidobactérias isoladas. Brevemente, o DNA foi isolado da AH1714 usando-se 100 μl de solução para extração e 25 μl de solução para preparação de tecidos (Sigma, kit XNAT2). As amostras foram incubadas durante 5 minutos à temperatura ambiente seguido de 2 horas em 95°C e depois 100 μl de solução para neutralização (Sigma, kit XNAT2) foram adicionados. A solução de DNA genômico foi quantificada usando-se um espectrofo- tômetro de nanogotas e armazenado em 4°C. A PCR (reação em cadeia de polimerase) foi realizada com o uso do iniciador de IGS (espa- çador intergênico). Os pares de iniciadores usados foram IGS R 5'- CTGGTGCCAAGGCATCCA-3' (SEQ ID n° 4) e IGS L 5'- GCTGGATCACCTCCTTTCT-3' (SEQ ID n° 3). As condições de ciclo foram 94°C durante 4 minutos (1 ciclo), 94°C durante 45 segundos, 53°C durante 45 segundos, 72°C durante 45 segundos (28 ciclos). A reação PCR continha 2 μl (100 ng) de DNA, mistura de PCR (Sigma, Red Taq), 0,025 nM de iniciador IGS L e R (MWG Biotech, Alemanha). As reações PCR foram realizadas em um termociclo Biotherma. Os produtos de PCR (10 μL) foram passados, juntamente com um marcador de peso molecular (100 bp Ladder, Roche) por um gel de agarose 2% corado com brometo de etídio (EtBr) em TAE (tris-acetato EDTA), para determinar seu perfil de IGS. Os produtos de PCR da bifidobacté- ria (banda única) foram purificados com o uso do kit de purificação Promega Wizard PCR. Os produtos de PCR purificados foram se- quenciados com o uso de sequências iniciadoras (acima) para a região de espaçador intergênico (IGS). Os dados de sequência foram então pesquisados em relação à base de dados de nucleotídeos do NCBI para determinar a identidade da cepa por homologia de nucleotídeos. Os dados da sequência resultante de DNA foram submetidos à ferramenta de busca BLAST de homologia de nucleotídeo-a-nucleotídeo padrão NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). A correspondência mais próxima para a sequência foi identificada e então as sequências foram alinhadas para comparação usando o software DNASTAR Me- gAlign. As sequências (SEQ ID n° 1 [IGS sequência direta] e SEQ ID n° 2 [IGS sequência reversa]) obtidas podem ser vistas na listagem de sequência. A procura na base de dados da NCIMB revelou que a AH1714 tem uma sequência de IGS (SEQ ID n° 1 [sequência direta] e SEQ ID n° 2 [sequência reversa]) única com sua homologia de sequência mais próxima a uma Bifidobacterium longum.
[0076] Para poder desenvolver um perfil PCR de código de barra para AH1714, o PCR foi realizado com o uso de iniciadores BOX (8). As condições de ciclo foram 94°C durante 7 min. (1 ciclo); 94°C durante 1 minuto, 53°C durante 45 segundos, 65°C durante 8 minutos, (30 ciclos) e 65°C durante 16 minutos. A reação PCR continha 50 ng de DNA, mistura PCR (Sigma, Red Taq) e 0,03 nM de iniciador BOXA1R (5'- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3') (SEQ ID n° 5) (MWG Biotech, Alemanha). As reações PCR foram realizadas em um termociclo Biotherma. Os produtos PCR foram passados por um gel de agarose a 3% juntamente com um marcador de peso molecular (Roche, 100 bp ladder) e fotografados.
Perfis de sensibilidade antibiótica.
[0077] Os perfis de sensibilidade antibiótica para a B. longum AH1714 foram determinados usando o ensaio de 'disco de suscetibilida- de'. As culturas foram cultivadas no meio de caldo adequado por 48 h e espalhadas (100 μl) pela placa sobre o meio ágar. Discos contendo concentrações conhecidas dos antibióticos foram colocados sobre o ágar. As cepas foram examinadas em busca de sensibilidade antibiótica depois de 1 a 2 dias de incubação em 37°C sob condições anaeróbicas. Tabela 2 - Resistência antibiotic
Figure img0002
R= Resistente (Tamanho de zona < 14 mm) M= Moderadamente sensível (Tamanho de zona 15 a 19 mm) S = Sensível (Tamanho de zona > 20 mm) Trânsito intestinal
[0078] Para determinar se a Bifidobacterium longum AH1714 pode sobreviver em baixos valores de pH, equivalentes a estes encontrados no estômago, as células bacterianas foram colhidas de culturas frescas de um dia para o outro, lavadas duas vezes em tampão de fosfato (pH 6,5) e re-suspensas em caldo TPY ajustado em pH 2,5 (com 1 M HCl). As células foram incubadas em 37°C e a sobrevivência foi medida em intervalos de 5, 30, 60 e 120 minutos usando o método de contagem em placas. A AH1714 sobreviveu bem durante 5 minutos em pH 2,5 enquanto nenhuma célula viável foi recuperada depois de 30 minutos.
[0079] Ao sair do estômago, probióticos putativos são expostos aos sais biliares no intestino delgado. Para poder determinar a habilidade da B. longum AH1714 para sobreviver à exposição à bílis, as culturas foram aplicadas por esfregaço em placas de ágar TPY suplementadas com 0,3% (peso por volume), 0,5%, 1%, 2%, 5%, 7,5% ou 10% de bílis de porco. O crescimento da B. longum AH1714 foi observado nas placas que continham até 0,5% de bílis.Tabela 3 - Crescimento da AH1714 na presença de bílis de porco (resultados duplicados)
Figure img0003
+++ = crescimento muito bom ~100% ++ = crescimento bom ~66% + = crescimento insatisfatório ~33% - = sem crescimento~0%
[0080] Em um modelo murino livre de germes, a habilidade da B.longum AH1714 para se mover no trato gastrointestinal foi avaliada. Os camundongos consumiram 1x109 AH1714 diariamente e foi examinada a presença de pelotas fecais do micro-organismo ingerido. A detecção da AH1714 foi facilitada ao isolar-se uma variante resistente à rifampicina espontânea da bifidobactéria - a incorporação da rifampi- cina nas placas de RCA + cisteina usadas para avaliar o movimento (trânsito) garantem que foi cultivada somente a bifidobactéria resistente à rifampicina administrada. As amostras fecais foram coletadas diariamente e o trânsito da B. longum AH1714 através do trato gastrointestinal foi confirmado (veja a Figura 1)
Atividade antimicrobiana
[0081] Para avaliar as atividades antimicrobianas da B. longum AH1714 em relação a culturas indicadoras e para determinar se a atividade antimicrobiana foi devida à produção de ácido, a AH1714 foi cultivada de um dia para o outro na MRS (suplementada com 0,05% de cisteína-HCl). 2 μl de cultura AH1714 foi notada sobre o ágar e incubada por 24 h. Os organismos indicadores foram cultivados na TSB (E. coli e Salmonella typhimurium), caldo Brucella (Campylobacter jejuni) e meio reforçado de Clostrídio (RCM, Clostridium difficile). A grama indicadora foi preparada inoculando uma camada derretida com 2% (v/v) da cultura indicadora de um dia para o outro, que foi então derramada sobre a superfície das culturas probióticas pintadas, seguido de crescimento de um dia para o outro nas placas de ágar. As placas foram incubadas em 37°C sob condições adequadas para a cepa indicadora e o crescimento registrado após 24-48 h. Zonas de abertura maior do que 1 mm de diâmetro foram consideradas sensíveis à cepa probiótica. Esse ensaio também foi realizado em meio suplementado com 2% β-glicerofosfato e como agente tampão para limitar a atividade antagonista devido à produção de ácido.Tabela 4 - Atividade antimicrobiana da AH1714
Figure img0004
Geração de rifampicina (RifR) cepas resistentes do 1714
[0082] Para ser possível rastrear o movimento (trânsito) da AH1714 em amostras fecais, uma variante (rif+) resistente à rifampici- na espontânea foi isolada da seguinte forma: uma cultura de caldo fresca de AH1714 foi espalhada pela placa (100 μL) sobre a MRS + rifampicina + cisteina com a menor concentração de rifampicina (na faixa de 0,1%, 0,08%, 0,06%, 0,04%, 0,02% e 0,002%). O meio de placa sem rifampicina foi incluído como controle positivo. Ambos os conjuntos de placas foram incubados anaerobicamente em 37°C (48 horas). A pureza das placas removidas foi então avaliada antes de escolher uma colônia da placa de ágar suplementada com rifampicina e ser aplicada por esfregaço sobre a placa suplementada de rifampicina próxima de maior concentração. Além disso, uma colônia foi retirada por esfregaço da placa de ágar MRS, aplicada sobre uma nova placa de ágar MRS e ambos os conjuntos de placas incubados anaerobica- mente em 37°C (48 horas). Esse processo foi repetido por toda faixa de placas suplementadas com rifampicina. Uma única colônia de uma cultura totalmente madura em uma placa de ágar MRS suplementada com rifampicina de 50 μg/mL foi usada para inocular o caldo MRS de 20 ml e a cultura resultante usada para armazenamento subsequente. A identidade da variante foi confirmada por avaliação microscópica, análise de sequências IGS e por análise PCR específica.
Exemplo 2 - Tela de ágar com vermelho congo
[0083] Uma tela de ágar com vermelho congo foi usada para avaliar fenotipicamente cepas de bactérias que expressam polissacarídeo extracelular (EPS - extracellular polysaccharide). Um meio de caldo Rogosa de 10 ml modificado (+ 0,05% cisteina) foi brevemente inoculado assepticamente com uma colônia recém-cultivada da cepa bacte- riana e incubada anaeróbicamente em 37°C até a turbidez (cerca de 16 até 24 horas). As culturas de caldo foram assepticamente espalha- das por esfregaço nas placas de ágar com vermelho congo e incubadas anaeróbicamente em 37°C por 48 horas. Acredita-se que o polis- sacarídeo extracelular (EPS) produzido como um subproduto do crescimento e/ou metabolismo de certas cepas evita a absorção do corante vermelho congo, resultando em uma morfologia de colônias com coloração creme/branca. Corantes que produzem menos EPS absorvem facilmente o corante vermelho congo, resultando em uma morfologia de colônias com coloração rosa/vermelha. Cepas que não produzem uma coloração vermelha de EPS parecem quase transparentes em fundo de ágar vermelho.
[0084] Com referência à Figura 2, a morfologia da colônia da B. longum AH1714 é de colônias convexas, mucóides e brancas brilhantes.
Exemplo 3 - Bifidobactéria 1714 induz uma razão IL-10:IL-12 significa-tivamente elevada.
[0085] Células mononucleares de sangue periférico (CMSPs) foram isoladas a partir de sangue humano periférico saudável com o uso de tubos CPT, BD Vacutainer (BD catálogo 362761), conforme instruções do fabricante. As CMSPs foram lavadas e ressuspensas em meio de Eagle modificado por Dulbecco- Glutamax™ (Glutamax (substituto da glutamina) + piruvato + 4,5 g/l glicose (catálogo Gibco 10569-010), 10% de soro fetal bovino (catálogo Sigma F4135) e 1% penicili- na/estreptomicina (catálogo Sigma P0781). As CMSPs foram incubadas (2 x 105 células por poço) em placas de fundo chato com 96 poços e 20 μL de uma suspensão bacteriana (em uma concentração de 1 x 107 ufc/mL) foram adicionados. As CMSPs foram coincubadas com bactérias por 48 horas em 37°C / 5% CO2 em um incubador. Depois do período de 2 dias de incubação, as placas foram centrifugadas em 300 x g e os sobrenadantes foram removidos e armazenados congelados em -80°C até análise. Os níveis de interleucina-10 (IL-10) e interleuci- na-12p70 (IL-12p70) nas culturas sobrenadantes foram quantificados com o uso de um kit de ensaio de 96 poços disponível junto à Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD, EUA; catálogo K15008B-1).
[0086] As bactérias foram preparadas para experimentos de cocul-tura em dois formatos: (a) Bactérias recém-cultivadas foram cultivadas em meio Difco MRS e colhidas logo após entrarem na fase estacionária. Todas as células foram cultivadas sob condições anaeróbicas em 37°C. (b) Bactérias foram cultivadas sob condições anaeróbicas em 37°C em meio Difco MRS e colhidas logo após entrarem na fase estacionária. Pós secados por congelamento foram gerados para cada uma dessas bactérias e armazenados em -80°C em frascos de pré- alíquota de 100 mg. Imediatamente antes do uso, uma alíquota de cada cepa foi removida do congelador e deixada ao ar livre até atingir a temperatura ambiente. Cada cepa foi lavada 3 vezes em 10 ml de solução de Ringer seguido de centrifugação. Um frasco novo foi usado em cada ocasião. Curvas de crescimento (DO vs. número de células vivas) foram criadas para cada condição de crescimento e as células lavadas foram normalizadas pelo número de células antes da adição às CMSPs. Um controle sem bactérias foi também incluído em todos os experimentos. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. Os resultados são apresentados na Figura 3.
[0087] O controle de doenças inflamatórias é exercido em vários níveis. Os fatores de controle incluem hormônios, prostaglandinas, oxigênio reativo e intermediários de nitrogênio, leucotrienos e citoqui- nas. As citoquinas são proteínas biológicamente ativas de baixo peso molecular que estão envolvidas na geração e controle de respostas imunológicas e inflamatórias. Várias células produzem essas citoqui- nas, sendo os neutrófilos, monócitos, e linfócitos as maiores fontes durante as reações inflamatórias devido a seu grande número no local lesionado.
[0088] Múltiplos mecanismos existem, pelos quais as citoquinas geradas em locais inflamatórios influenciam a resposta inflamatória. A quimiotaxia estimula o fluxo de células inflamatórias ao local da lesão, enquanto certas citoquinas promovem a infiltração das células nos tecidos. As citoquinas liberadas no local do tecido lesionado resultam na ativação do infiltrado inflamatório. Grande parte das citoquinas são pleiotrópicas e exprimem múltiplas atividades biologicamente sobrepostas. Visto que respostas inflamatórias não controladas podem resultar em doenças, tais como SII, é razoável imaginar que a produção de citoquina tomou um rumo incerto em indivíduos afetados com essas doenças.
[0089] A interleucina-10 (IL-10) é uma citoquina anti-inflamatória que é produzida por muitos tipos de células, incluindo monócitos, ma- crófagos, células dendríticas, mastócitos e linfócitos (em particular células reguladoras T). A IL-10 regula negativamente a expressão de ci- toquinas Th1 pró-inflamatórias, antígenos MHC classe II e moléculas coestimuladoras em células apresentando antígenos. Ela também melhora a sobrevivência da célula B, proliferação e produção de anticorpos. Essa citoquina pode bloquear a atividade NF-KB e está envolvida na regulação da via de sinalização JAK-STAT. Estudos de knockout em murinos demonstraram o papel essencial da IL-10 na imunoregula- ção quando camundongos com IL-10KO desenvolveram colite severa. Além disso, bactérias que são potentes indutores de IL-10 têm se provado capazes de promover diferenciação celular regulatória T in vivo, assim contribuindo para a homeostase imunológica (7; 8).
[0090] A interleucina-12 (IL-12) é uma citoquina pró-inflamatória associada à polarização de respostas de células T com efetor Th1 e estimulam a produção de outras citoquinas Th1 pró-inflamatórias, tais como interferon-gama (IFN-Y) e fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), de células T e exterminadoras naturais (NK). Altos níveis de expressão IL-12 são associados com auto-imunidade. A administração de IL-12 a pessoas sofrendo de doenças auto-imunes agravou os sintomas da doença. Em contraste, camundongos com knockout de IL-12 ou tratamento de camundongos com anticorpos neutralizadores de IL-12 amenizou a doença.
[0091] Cascatas de citoquina e redes controlam a resposta inflamatória, ao invés da ação de uma citoquina em particular em um tipo de célula em particular. Os níveis relativos de expressão ou balanço de duas citoquinas (tais como IL-10 e IL-12) são mais informativos do que a expressão de uma única citoquina. Nestes estudos, estimulamos as CMSPs humano com uma faixa de cepas bacterianas diferentes. Todas as cepas induziram IL-10 e todas as cepas induziram IL-12. Entretanto, a examinação da razão entre a indução de IL-10 e IL-12 revelou que algumas cepas de bactéria induziram uma razão maior (exemplo, mais IL-10 com menos IL-12) comparada a outras cepas. Essa é uma observação importante, já que é o balanço entre cada um desses sinais opostos que por fim determina o resultado imunológico. É esperado que uma razão alta de IL-10:IL-12 promoverá uma resposta anti- inflamatória associada com atividade imunoregulatória adequada enquanto uma baixa razão de IL-10:IL-12 vai contribuir para a polarização de Th1 da resposta imunológica. Assim, a razão de CMSP IL- 10:IL-12 é um importante critério de seleção para identificação de cepas bacterianas com propriedades imunoregulatórias.
Exemplo 4 - A alimentação prolongada de camundongos com Bif. AH1714 está associada com o aumento da citoquina anti-inflamatória IL-10 e com a diminuição de citoquinas Th1 e pró-inflamatórias TNF -α IFN-Y e IL-12 em animais saudáveis e em um modelo de sepse/inflamação. Materiais & Métodos:
[0092] Camundongos fêmeas com 6 a 8 semanas de idade são adquiridos junto à Harlan UK (Reino Unido) e alojados em gaiolas individualmente ventiladas e com acesso ad libitum a alimento e água estéril para camundongos.
[0093] Camundongos de pesos similares são distribuídos aleatori amente em 2 grupos e administrados STF (veículo de controle n=9), cepa de Bifidobacterium longum AH1714 (n=17) via sonda esofágica diariamente por 115 dias. Seguindo o período de administração, o sangue é coletado de 10 camundongos AH1714 e 6 veículos de controle são desafiados com 1 mg/kg de lipopolissacarídeo LPS (Sigma, L4391) via injeção intraperitoneal.
[0094] Seguindo o período de administração, o sangue é coletado de 6 camundongos AH1714 e 4 veículos de controle, o soro é extraído e preservado para medição de citoquina. O baço é também removido e suspensões de células únicas são cultivadas in vitro. As citoquinas são medidas em células supernatantes seguindo as 48 horas de cultivo.
[0095] Adicionalmente, mais 10 camundongos AH1714 e 6 camundongos de controle são administrados com uma dose única de lipopolissacarídeo LPS em 1 mg/kg via injeção intraperitoneal. Depois de 2 horas o sangue é coletado e os camundongos abatidos. O soro e as células esplenócitas foram tratadas e analisadas conforme anteriormente descrito.
Ensaio de citoquina esplenócita
[0096] Os esplenócitos são isolados do baço e incubados por 48 horas em 37°C (na presença de penicilina e estreptomicina) com meio de controle, lipopolissacarídeo LPS ou antiCD3/CD28. As citoquinas nos sobrenadantes das culturas são testadas com o uso de um kit de ensaio de 96 poços disponíveis juntos à Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD, EUA; catálogo K15008B-1). A interleucina 1 beta (Il-1b), interleucina 6 (Il-6), interleucina 8 (Il-8) interleucina 10 (Il-10), interleucina 12p70 (Il12p70), Interferon-gama (IFN-Y) e fator de necro- se tumoral alfa (TNFα) são quantificados e relatados como picogramas por mililitro (pg/mL).
Ensaio de soro de citoquina
[0097] O soro é analisado usando camundongo IL-10 da Meso Scale Discovery e o kit ultrasensível de TNF-α.
Resultados
[0098] A alimentação a longo prazo de camundongos (115 dias) com Bif. AH1714 é associada com um aumento na citoquina anti- inflamatória IL-10 de CMSPs ex vivo estimuladas, comparada com o grupo placebo (alimentados com STF) para camundongos saudáveis (veja a Figura 4 (B)) ou em um modelo de sepse/inflamação (camundongo desafiado com LPS; veja a Figura 4 (C)).
[0099] A alimentação a longo prazo de camundongos (115 dias) com Bif. AH1714 é associada com uma diminuição nas citoquinas Th1 e pró-inflamatórias TNF-α IFN-Y e IL-12 (sub unidade p70) de CMSPs ex vivo estimuladas, comparada com o grupo placebo (alimentados com STF) em um modelo de sepse/inflamação (camundongo desafiado com LPS; veja a Figura 5 (B), a Figura 6 (B) e a Figura 7 (B)).
[00100] A alimentação a longo prazo de camundongos (115 dias) com Bif. AH1714 é associada com um aumento nos níveis séricos da citoquina anti-inflamatória IL-10 e uma diminuição nas citoquinas Th1 e pró-inflamatórias TNF-α comparada com o grupo placebo (alimentados com STF) em um modelo de sepse/inflamação (camundongo desafiado com LPS; veja a Figura 8 (A & B)).
[00101] Tomados juntos, esses resultados demonstram que a cepa 1714 de Bifidobacterium longum tem atividade imunomodulatória sistêmica in-vivo e atividade anti-inflamatória e protege contra LPS ou respostas inflamatórias mediadas por TLR-4.
Exemplo 5 - A Bif 1714 tem atividade imunomodulatória quando coin- cubada com células do sistema imune humano, diferente da Bif. AH35624. Materiais & Métodos
[00102] A cepa de Bifidobacterium longum infantis UCC35624 (B624), dois lotes de cultura independentes (1 & 2) e a cepa de Bifidobacterium longum 1714 são testadas utilizando-se um ensaio de indução de citoquina em CMSP. As bactérias são preparadas para experimentos de cocultura nos formatos a seguir. A bacteria é cultivada sob condições anaeróbicas em 37°C em meio Difco MRS e colhidas logo após entrarem na fase estacionária. Pós secados por congelamento são gerados para cada uma dessas bactérias e armazenados em - 80°C em frascos de pré-alíquota de 100 mg. Imediatamente antes do uso, uma alíquota de cada cepa é removida do congelador e deixada ao ar livre até atingir a temperatura ambiente. Cada cepa é lavada 3 vezes em 10 ml de solução de Ringer seguido de centrifugação. Um frasco novo é usado em cada ocasião.
[00103] Contagens microscópicas diretas são realizadas com o uso de uma câmara de contagem Petroff-Hausser, de acordo com as instruções do fabricante, e as células lavadas são normalizadas pelo número de células antes da adição ao ensaio de CMSP. As bactérias (20 μL em solução salina tamponada com fosfato (PBS - phosphate buffered saline)) são acrescentadas em cada poço de CMSPs para resultar no número total de bactérias, conforme indicado para cada experimento.
Ensaio de indução de citoquinas em CMSP (células mononucleares do sangue periférico)
[00104] Células mononucleares de sangue periférico (CMSPs) são isoladas de sangue periférico humano saudável com o uso de tubos CPT (tubo preparador de células) da BD Vacutainer (BD catálogo 362761), de acordo com as instruções do fabricante. As CMSPs são lavadas e ressuspensas em meio de Eagle modificado por Dulbecco - Glutamax TM (Glutamax (substituto glutamina) + piruvato + 4,5 g/L gli- cose (Gibco catálogo 10569-010), 10% soro fetal bovino (Sigma catálogo F4135), e 1% penicilina/estreptomicina (Sigma catálogo P0781). As CMSPs são incubadas (2 x 105 células por poço) em placas de fundo chato com 96 poços com e 20 μL de uma suspensão bacteriana. Também é feito um controle sem bactérias. Todos os ensaios são realizados em triplicata. Depois de uma incubação de 2 dias em 37°C, as placas foram agitadas em 300 x g e os sobrenadantes foram removidos e armazenados congelados em -80°C até análise. As CMSPs são coincubadas com a bactéria por 48 horas em 37°C / 5% CO2 em um incubador. Depois do período de 2 dias de incubação, as placas são centrifugadas em 300 x g, e os supernadantes removidos e armazenados congelados em -80°C até análise. As citoquinas nos sobrenadan- tes das culturas são testadas com o uso de um kit de ensaio de 96 poços disponíveis juntos à Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD, EUA; catálogo K15008B-1). A interleucina humana 1 beta (Il-1b), inter- leucina humana 6 (Il-6), interleucina humana 8 (Il-8) interleucina humana 10 (Il-10), interleucina humana 12p70 (Il12p70), Interferon-gama humano (IFN-Y) e fator de necrose tumoral alfa (TNFα) são quantificados e relatados como picogramas por mililitro (pg/mL). Cada amostra é testada em duplicata.
Resultados
[00105] A cepa de Bifidobacterium longum infantis UCC35624 (B624), dois lotes de cultura independentes (1 & 2) e cepa de Bifidobacterium longum 1714 são testados para imunomodulação usando-se um ensaio de indução de citoquina em CMSP com 1,0E+07 bactérias. Os sobrenadantes são testados para uma faixa de citoquinas incluindo IL-1β, -6, -8, -10 e -12, TNF-α e IFN-y.
[00106] Por comparação com 35624 (ambas culturas que apresentaram um padrão similar para todas as citoquinas testadas), a cepa 1714 exibiu um padrão muito similar para muitas das citoquinas testa- das. Surpreendentemente, entretanto, a 1714 apresentou um padrão bem diferente para IL-12, IFNY e IL-6.IL-6: Incubação com 1714 induz a um nível significativamente menor de IL-6 comparado a 35624 em 1,0 x 107 bactérias por poço (veja a Tabela 5)Tabela 5
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IL-12: A incubação com 1714 induz um nível significativamente menor de IL-12 comparado ao 35624 em 1,0 x 107 bactérias por poço (veja a Tabela 6)
[00107] A incubação de INF-Y com 1714 induz um nível significativamente menor de INF-Y comparado ao 35624 em 1,0 x 107 bactérias por poço (veja a Tabela 6) Tabela 6
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[00108] Foligne et al19 demonstraram que cepas de bactérias formadoras de ácido lático exibindo uma capacidade de induzir níveis maiores da citoquina anti-inflamatória IL-10 e níveis menores da cito- quina inflamatória IL-12 ofereceram a melhor proteção no modelo de colite in vivo enquanto que, em contraste, cepas levando a uma baixa razão de citoquina IL-10/IL-12 não puderam aliviar significativamente os sintomas da colite. A proteção in vivo observada era específica da cepa. O perfil da citoquina obtida para a Bif. AH1714 poderia sugerir que essa cepa tem o potencial para eficácia aprimorada no modelo de colite ulcerativa in vivo.
[00109] A IL-6 é uma citoquina fortemente ligada na patologia da DII. A L-6 é relevante para muitos processos doentios como diabetes, ateroesclerose, depressão, doença de Alzheimer, lupus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide. Sendo assim, há um interesse em desenvolver agentes anti-IL-6 como terapia contra muitas destas doenças.
Exemplo 6 - A Bif. AH1714 reduz a atividade NFKB induzida por LPS em um modelo de sepse/inflamação de murina in vivo Materiais & Métodos
[00110] Camundongos transgênicos NFkBlux em um antecedente C57BL/6J-CBA/J são obtidos do Charles River Laboratories (Wilmington, EUA) e criados internamente. Os camundongos são alojados sob condições de barreira mantida.
[00111] As fêmeas são administradas com Bif. AH1714, como um pó seco e congelado reconstituído na água em aproximadamente 1x109 unidades de formação de colônia, ou por dia, ou por animal, ou um controle de placebo. Os camundongos consomem microorganismos em sua água ad libitum por 20 dias anteriores ao desafio com LPS.
[00112] A atividade NFkB é medida após a administração do substrato de luciferina e retratada usando a Xenogen IVIS 100. A linha de base da atividade NFkB é medida anteriormente ao desafio com uma dose única de 0,5 mb/kg de LPS. Depois de 3 horas, todos os animais são então retratados. A atividade de NFkB do corpo total é avaliada subtraindo as leituras de linha de base.
[00113] Todos animais são então abatidos e o baço, fígado, intestino delgado e cólon são removidos e colocados em um prato de cultura para imagens individuais.
Resultados
[00114] A Bif. AH1714 reduz a atividade sistêmica NFkB induzida por LPS em um modelo de sepse/inflamação de murino in-vivo, como demonstrado por uma diminuição de atividade NFkB em baços isolados 3 horas após o desafio (veja a Figura 9) e de imagens do animal total 1 h30 m após o desafio (veja a Figura 10) de animais alimentados com 1714 comparado com os animais alimentados com placebo. Esses resultados demonstram que a alimentação com Bif. 1714 está as-sociada com um nível reduzido de inflamação sistêmica associado ao fator de transcrição NFkB.
Exemplo 7 - A 1714 exibe benefícios positivos em modelos de animais de depressão e ansiedade.
[00115] A depressão e ansiedade são os transtornos psiquiátricos mais comuns com uma alta taxa de prevalência na comunidade. Transtornos de ansiedade são geralmente subdivididos em transtorno do pânico, transtorno de ansiedade generalizada, transtorno pós- traumático e transtorno obsessivo compulsivo.
[00116] Antidepressivos modernos, como os inibidores de retomada de serotonina seletiva (por exemplo, fluoxetina) e inibidores de retomada noradrenérgicos e serotoninérgicos seletivos (por exemplo ven- lafaxina) são amplamente usados para tratar esses transtornos. Entretanto, os tratamentos não são sempre eficazes e não são aceitáveis aos pacientes. Há uma necessidade de desenvolver estratégias alternativas. A possibilidade de que probióticos possam ser eficazes em tais condições é sugerida pelos dados anteriores indicando que a Bifidobacterium Infantis probiótica reduz o hormônio do estresse corticos- terona em roedores (9).
[00117] Aqui examinamos os efeitos comportamentais da Bifidobacterium AH1714 em modelos de stress em camundongos e comparamos com um SSRI amplamente usado, especificamente, escitalopram, que é usado para tratar ambas, a ansiedade e depressão. Os animais são tratados com escitalopram, ou AH1714 por três semanas.
Material & Métodos Teste de suspensão da cauda
[00118] Um teste bem caracterizado para avaliar a atividade de depressão ou atividade de anti-depressão. Os camundongos são individualmente suspensos pela cauda em uma barra anelar em um suporte horizontal (distância do chão = 30 cm) usando fita adesiva (distância da ponta da cauda = 2 cm). Tipicamente, os camundongos demonstram vários comportamentos orientados ao escape intercalados com aumento temporário de luta contra a imobilidade. Uma sessão de testes de 6 minutos é empregada e é gravada em vídeo. Os vídeos são subsequentemente pontuados por um observador altamente treinado que desconhece o tratamento. O parâmetro gravado é o número de segundos gastos imobilizado.
Teste de condicionamento do medo
[00119] Amplamente usado para avaliar os componentes cognitivos de transtornos de ansiedade. Usamos um protocolo de três dias que permite a observação do aprendizado de medo contextual e associado à pista. Após 3 minutos de exploração do seu ambiente contextual, os camundongos recebem 6 pares de 20 segundos de uma pista específica (tom de 10 KHz, 70dB combinado com o acendimento da luz do aparelho), combinado no final com um choque leve (0,4 mA) de 2 segundos, seguido de 1 minuto de exposição somente ao contexto. O procedimento é repetido nos dois dias seguintes, entretanto, sem aplicação de choque e o comportamento de congelamento ao contexto ou pista é observado. O primeiro dia permite avaliar a habilidade da intervenção para alterar a força do contexto e o condicionamento de medo induzido por pistas, enquanto que o terceiro dia permite a observação da extinção de aprendizado do medo. A extinção é a formação de novas memórias, e drogas que facilitem a extinção podem ter um papel no tratamento do transtorno de stress pós-traumático.
O teste de esconder esferas.
[00120] Proposto como modelo de transtorno obsessivo- compulsivo. Animais que são mais ansiosos precisam entrar em comportamento ativo (esconder as esferas defensivamente) para evitar estímulo ansiogênico na caixa clara-escura e labirintos elevados. Os camundongos são colocados individualmente em pequenas gaiolas, na qual 20 esferas foram igualmente distribuídas na superfície de 5 cm de profundidade de serragem, e uma tampa de arame é colocada no topo da gaiola. Os camundongos são deixados sem perturbação por 30 min e a seguir as esferras escondidas são contadas (por exemplo, aquelas que estão mais de e menos de três quartos cobertas por serragem).
Resultados
[00121] No teste de suspensão da cauda, a AH1714 dá um resultado positivo sugerindo possível atividade antidepressão. Com referência à Figura 11, a AH1714 induziu tempo de imobilidade menor do que o veículo (Veh) que sugere comportamentos atenuados de depressão em animais alimentados com 1714. Isso é similar ao impacto de anti- depressivos convencionais, como Lexapro®.
[00122] Em termos de cognição, no teste de condicionamento do medo, animais de teste tratados com AH1714 mostraram um efeito de aprendizado positivo. Com referência à Figura 12, no contexto de testes de condicionamento de medo (principalmente memórias dependentes do hipocampo e amígdala), o 1714 induziu um congelamento maior ao contexto (Cxt) do que o veículo (Veh) no dia 1 e dia 2, com a mesma porcentagem de congelamento que o veículo no dia 3, isso sugere que a 1714 promove aprendizado de medo contextual e memória sem prejudicar a extinção, sugerindo um papel positivo na memória contextual de eventos de medo. Com referência à Figura 13, em testes de condicionamento de medo por pistas (dependente da amígdala), o 1714 induziu um maior congelamento à pista de medo (estímulo) do que o veículo (Veh) no dia 1, com a mesma porcentagem de congelamento do que o veículo nos dias 2 e 3. Isso sugere que o 1714 promoveu aprendizado de medo dependente da amígdala (pista) e memória, sem prejudicar a memória e extinção, sugerindo um papel positivo na memória de estímulos de medo independente do contexto.
[00123] Evidência de um efeito positivo no transtorno obsessivo- compulsivo surge de estudos com o teste de esconder as esferas. Animais tratados com AH1714 esconderam menos esferas na tarefa de esconder esferas, que é indicativo de uma menor ansiedade em animais alimentados com 1714 e sugere um possível efeito no transtorno obsessivo-compulsivo (Figura 14). Como no caso de escitalo- pram, a AH1714 induziu um menor aumento de temperatura corporal causado pelo estresse de ser manuseado (diminuição de hipotermia induzida por stress), isso sugere uma menor ansiedade em animais alimentados com 1714 (Figura 24). Não existem diferenças entre os resultados com qualquer intervenção.
Conclusão
[00124] A AH1714 em modelos animais de depressão e ansiedade se comporta de maneira similar a antidepressivos convencionais. O impacto observado é similar ao relatado na literatura para antidepres- sivos como SSIRs (inibidores seletivos de retomada da serotonina).
[00125] Como um todo, os dados indicam que a AH1714 pode ser benéfica no tratamento de síndromes psiquiátricas de depressão e ansiedade.
Exemplo 8: A 1714 exibe benefícios positivos em marcadores inflamatórios em obesidade induzida por dieta.
[00126] Nos anos recentes, foi bem estabelecido que a obesidade está associada a uma inflamação de baixo grau que contribui para o desenvolvimento das patologias associadas com a obesidade, que in- cluem diabetes mellitus do tipo 2 (T2D), doença cardiovascular (CVD), hipertensão, hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia e doença de fígado gordo não-alcóolica. A gordura visceral produz um número de citoquinas inflamatórias e quimiocinas (como leptina, fator de necrose tumoral-α (TNF-α), proteína-1 químio-atrativa de macrófago e interleu- cina-6, entre outros), nas quais a produção pode ser patologicamente desregulada no estado de obesidade (analisado por Shoelson et al., 2007). De fato, enquanto se pensa que macrófagos contribuem de uma maneira importante à resistência de insulina, outros estudos sugeriram que o controle das propriedades anti-inflamatórias das células com um fenótipo potencialmente regulatório pode ter potencial terapêutico. Um estudo recente sugere que as células Treg reduzem o estado inflamatório do tecido adiposo e, assim, a resistência a insulina em camundongos (Feurer et al., 2009). Além disso, um corpo seminal de trabalho implicou em anormalidades da microbiota do trato gastrointestinal como uma força acionadora de desregulagem metabólica relacionada à obesidade, sugerindo que as intervenções que visam a saúde do trato gastrointestinal terão efeitos beneficiais de saúde em distúrbios metabólicos relacionados à obesidade. Foi sugerido que a microbiota do trato gastrointestinal pode estar envolvida no desenvolvimento da obesidade na regulagem da homeostase da energia, na resistência à insulina, doenças do fígado gordo não-alcóolicas e no metabolismo da energia, lipídio e aminoácido (analisado por Ley et al., 2009)
[00127] A obesidade induzida por dieta (DIO - diet-induced obesity) no modelo do camundongo foi escolhida como o modelo de camundongo mais adequado para avaliar o impacto dos candidatos probióti- cos selecionados na obesidade e saúde metabólica e para observar a relação entre a obesidade e marcas inflamatórias. O modelo de camundongo DIO se refere a camundongos saudáveis alimentados em uma dieta de alta gordura para induzir a obesidade ao longo do tempo. Desenvolvimento experimental
[00128] Camundongos machos C57BL/J6 de sete semanas foram alimentados com uma dieta de baixa gordura (10% de calorias da gordura; Research Diets, New Jersey, EUA; #D12450B), uma dieta de alta gordura (DIO; 45% de calorias da gordura; Research Diets, New Jersey, EUA; #D12451) ou uma dieta de alta gordura com AH1714 (1 x 109 ufc/dia) na água potável por 14 semanas. Todos os camundongos foram alojados em grupos de 5 e alíquotas de probióticos frescos foram administrados diariamente. O peso corporal e o consumo alimentar foram avaliados semanalmente. No fim das 14 semanas, os camundongos foram sacrificados e os órgãos internos foram removidos, pesados e armazenados em -80°C. Os baços foram removidos e ensaios de citoquina do esplenócito foram efetuadas como no Exemplo 4.
Resultados
[00129] Como esperado, os camundongos DIO ganharam signifi- cantemente mais massa de gordura (p<0,001) comparado aos controles leves durante as 14 semanas do período de alimentação. Em concordância com os estudos anteriores, os camundongos DIO consumiram significantemente mais calorias do que os controles leves, como medidos pela ingestão calórica cumulativa durante o período de 14 semanas do estudo (p<0,001). Em esplenócitos estimulados por LPS (estímulo de imunidade inata) de camundongos DIO, a AH1714 teve o efeito de reduzir a TNFα e resposta de citoquina IL-12 ao LPS (Figu- ra16). Em esplenócitos estimulados por CD3/CD28 (estímulo de imu-nidade adaptativo), o tratamento com AH1714 teve o efeito de reduzir a resposta da citoquina IL6. Esses resultados indicam um efeito anti- inflamatório sistêmico no modelo de camundongo DIO consistente com os dados CMSP e dados do modelo de camundongo in vivo ilustrados em outros exemplos.
Imunomodulação
[00130] O sistema imunológico humano tem um papel significativo na etiologia e patologia de uma grande variedade de doenças humanas. As respostas hiper e hipo-imunes resultam em, ou são um componente da maioria dos estados doentios. Uma família de entidades biológicas, denominadas citoquinas, é particularmente importante no controle do processo imunológico. Perturbações dessas redes delicadas de citoquinas são cada vez mais associadas com muitas doenças. Essas doenças incluem, mas não se limitam a, distúrbios inflamatórios, imunodeficiência, doença inflamatória intestinal, síndrome do intestino irritável, câncer (particularmente esses dos sistemas gastrointestinal e imune), doença diarreica, diarreia associada ao uso de antibióticos, diarreia pediátrica, apendicite, transtornos auto-imunes, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, artrite reumatóide, doença celíaca, diabetes mellitus, transplante de órgão, infecções bacterianas, infecções virais, infecções fúngicas, doença periodontal, doença urogenital, doença sexualmente transmitida, infecção por HIV, replicação de HIV, diarreia associada ao HIV, trauma associado a cirurgia, doença metas- tásica induzida por cirurgia, sepse, perda de peso, anorexia, controle da febre, caquexia, cicatrização de ferimentos, úlceras, função de barreira do intestino, alergia, asma, distúrbios respiratórios, distúrbios circulatórios, doenças coronárias, anemia, distúrbios do sistema de coagulação do sangue, doença renal, distúrbios do sistema nervoso central, doença hepática, isquemia, distúrbios nutricionais, osteoporose, distúrbios endócrinos, distúrbios epidermais, psoríase e acne vulgar.
[00131] Os efeitos na produção de citoquina são específicos para cada uma das cepas probióticas examinadas. Desse modo, cepas probióticas específicas podem ser selecionadas para normalizar um imbalanço exclusivo, em particular de citoquina, para um tipo de doen ça específico. A personalização de terapias específicas para doenças pode ser alcançada usando-se uma única cepa AH1714 ou mutantes e variantes da mesma ou uma seleção dessas cepas.
Educação imune
[00132] A flora entérica é importante para o desenvolvimento e função adequada do sistema imune intestinal. Na ausência de uma flora entérica, o sistema imune intestinal é subdesenvolvido, como demonstrado nos modelos de animais livres de germes, e certos parâmetros funcionais são diminuídos, como a habilidade fagocítica macrófaga e produção de imunoglobulina (10). A importância da flora do trato gastrointestinal em estimular respostas imunes não danosas está se tornando mais evidente. O aumento na incidência e severidade de alergias no mundo ocidental foi ligado com um aumento na higiene e saniti- zação, concomitante com uma diminuição no número e alcance de desafios infecciosos encontrados pelo hospedeiro. Essa falta de estímulo imune pode permitir a reação do hospedeiro a agentes não- patogênicos, mas antigênicos, resultando em uma alergia ou auto- imunidade. O consumo deliberado de uma série de bactérias imuno- modulatórias não-patogênicas fornecerá ao hospedeiro o estímulo educacional adequado e necessário para o desenvolvimento correto e controle da função imune.
Inflamação
[00133] A inflamação é o termo usado para descrever a acumulação local de fluido, proteínas de plasma e glóbulos brancos em um local que sofreu lesão física, infecção ou onde há uma resposta imune em andamento. O controle da resposta inflamatória é exercido em um número de níveis (11). Os fatores de controle incluem citoquinas, hormônios (por ex. hidrocortisona), prostaglandinas, intermediários reativos e leucotrienos. As citoquinas são proteínas biologicamente ativas de baixo peso molecular que estão envolvidas na geração e controle das respostas imunológicas e inflamatórias, enquanto também regulam o desenvolvimento, reparo de tecido e hematopoiese. Elas fornecem um meio de comunicação entre os leucócitos e também com outros tipos de células. A maioria das citoquinas são pleiotrópicas e expressam múltiplas atividades biologicamente sobrepostas. Cascatas e redes de citoquina controlam a resposta inflamatória ao invés da ação de uma citoquina em particular em um tipo de célula em particular (12). O enfraquecimento da resposta inflamatória resulta em baixas concentrações dos sinais de ativação adequados e outros mediadores inflamatórios levando à cessação da resposta inflamatória. A TNFα é uma citoquina pró-inflamatória pivô porque inicia uma cascata de citoquinas e efeitos biológicos resultando no estado inflamatório. Portanto, agentes que inibem a TNFα estão atualmente sendo usados para o tratamento de doenças inflamatórias, por ex. infliximab.
[00134] Pensa-se que as citoquinas pró-inflamatórias têm um grande papel na patogênese de muitas doenças inflamatórias, incluindo a doença inflamatória intestinal (DII). As terapias atuais para tratar a DII têm como alvo a redução dos níveis dessas citoquinas pró- inflamatórias, incluindo a IL-8 e TNFα. Tais terapias podem também ter um papel significativo no tratamento de doenças inflamatórias sistêmicas como artrite reumatóide.
[00135] As cepas da presente invenção podem ter potencial de aplicação no tratamento de uma gama de doenças inflamatórias, particularmente se usadas em combinação com outras terapias anti- inflamatórias, como fármacos anti-inflamatórios não-esteróides (NSAIDs) ou Infliximab.
Citoquinas e câncer
[00136] A produção de citoquinas multifuncionais por um grande espectro de tipos de tumores sugere que respostas inflamatórias significativas estejam em andamento em pacientes com câncer. É atual- mente incerto que efeito de proteção essa resposta tem em relação ao crescimento e desenvolvimento de células de tumor in vivo. Entretanto, essas respostas inflamatórias podem afetar adversamente o paciente com tumor. Interações complexas de citoquinas estão envolvidas na regulação de produção de citoquina e proliferação celular dentro do tumor e tecidos normais (13, 14). Já é reconhecido há muito tempo que a perda de peso (caquexia) é a única causa mais comum de morte em pacientes com câncer e a desnutrição inicial indica um mau prognóstico. Para um tumor crescer e espalhar, ele deve induzir a formação de novos vasos sanguíneos e degradar a matriz extracelular. A resposta inflamatória pode ter um papel significativo nos mecanismos acima, assim contribuindo para o declínio do hospedeiro e progressão do tumor. Devido às propriedades anti-inflamatórias da Bifidobacterium longum infantis, essas cepas bacterianas podem reduzir a taxa de transformação celular maligna. Adicionalmente, as bactérias intestinais podem produzir, a partir de compostos dietéticos, substâncias com atividade genotóxica, carcinogênica e promotora de tumor e as bactérias do trato gastrointestinal podem ativar os agentes reativos pró- carcinogênicos para o DNA (15). No geral, as espécies de Bifidobacterium têm baixas atividades de enzimas metabolizantes de xenobiótico comparadas a outras populações dentro do trato gastrointestinal como bacteroides, eubactérias e clostrídia. Portanto, aumentar o número de bactéria Bifidobacterium no trato gastrointestinal pode modificar bene- ficialmente os níveis essas enzimas.
Vacina/Aplicação de medicamento
[00137] A maioria dos organismos patogênicos ganha entrada via superfícies mucosas. A vacinação eficaz desses locais protege contra invasão de um agente infeccioso em particular. Estratégias de vacinação oral foram concentradas, até hoje, no uso de organismos patogênicos vivos atenuados ou antígenos encapsulados purificados (16). As bactérias probióticas, desenvolvidas para produzir antígenos de um agente infeccioso, in vivo, podem proporcionar uma alternativa atraente porque essas bactérias são consideradas seguras para o consumo humano (estado GRAS).
[00138] Estudos em murinos demonstraram que o consumo de bactérias probióticas que expressam antígenos estranhos pode provocar respostas imunológicas de proteção. O gene que codifica o fragmento C da toxina tetânica (TTFC - tetanus toxin fragment C) foi expresso no Lactococcus lactis e os camundongos foram imunizados via oral. O sistema foi capaz de induzir anticorpos em concentrações significativamente altas para proteger os camundongos de um desafio de toxina letal. Em adição à apresentação de antígeno, os vetores de bactérias vivas podem produzir compostos bioativos, como citoquinas imunoes- timulatórias, in vivo. A secreção de IL-2 ou IL-6 humana bioativa e TTFC por L. lactis induziu concentrações séricas de lgG de 10 a 15 vezes maiores em camundongos imunizados intranasalmente (17). Entretanto, com essa cepa bacteriana em particular, o nível total de lgA não foi aumentado pela coexpressão com essas citoquinas. Outras cepas bacterianas, como a Streptococcus gordonii, estão também sendo examinadas por sua utilidade como vacinas mucosais. A colonização das cavidades vaginais e orais de murino por S. gordonii re- combinante induziu tanto respostas de anticorpos mucosais como sistêmicos aos antígenos expressos por essa bactéria (18). Sendo assim, a imunização oral usando bactérias probióticas como vetores não somente iria proteger o hospedeiro de infecção, mas também pode substituir o estímulo imunológico que o patógeno normalmente usaria, assim contribuindo para a educação imunológica do hospedeiro.
Prebióticos
[00139] A introdução de organismos probióticos é realizada pela ingestão dos micro-organismos em um veículo adequado. Seria vanta- joso fornecer um meio que pudesse promover o crescimento dessas cepas probióticas no intestino grosso. A adição de um ou mais oligos- sacarídeos, polissacarídeos ou outros prebióticos acentua o crescimento de bactérias formadoras de ácido lático no trato gastrointestinal. O termo prebiótico se refere a qualquer componente alimentício não- viável que seja especificamente fermentado no cólon por bactérias indígenas que se pensam ser de valor positivo, por ex., bifidobactéria, lactobacilo. Tipos de prebióticos podem incluir esses que contém fru- tose, xilose, soja, galactose, glicose e manose. A administração combinada de uma cepa probiótica com um ou mais compostos prebióticos pode melhorar o crescimento do probiótico administrado in vivo, resultando em um benefício de saúde mais pronunciado, e é chamado de simbiótico.
Outros ingredientes ativos
[00140] Será entendido o fato de que cepas probióticas podem ser administradas profilaticamente ou como um método de tratamento ou por si só, ou com outros materiais probióticos e/ou prebióticos, como descrito acima. Além disso, a bactéria pode ser usada como parte de um regime profilático ou de tratamento usando outros materiais ativos, como esses usados para tratar inflamações ou outras desordens, especialmente essas com um envolvimento imunológico. Tais combinações podem ser administradas em uma formulação simples ou em formulações separadas administradas ao mesmo tempo ou em tempos diferentes e usando as mesmas rotas ou diferentes de administração.
[00141] As dimensões e valores apresentados na presente invenção não devem ser compreendidos como estando estritamente limitados aos exatos valores numéricos mencionados. Em vez disso, exceto de outro modo especificado, cada uma dessas dimensões se destina a significar tanto o valor mencionado como uma faixa de valores funcionalmente equivalentes em torno daquele valor. Por exemplo, uma di- mensão apresentada como "40 mm" destina-se a significar "cerca de 40 mm".
[00142] Todos os documentos citados na descrição detalhada da Invenção são, em sua parte relevante, aqui incorporados por referência, e a citação de qualquer documento não deve ser interpretada como admissão de que este represente técnica anterior com respeito à presente invenção. Se houver conflito entre qualquer significado ou definição de um termo mencionado neste documento e o significado ou definição do mesmo termo em um documento incorporado a título de referência, o significado ou definição atribuído ao termo mencionado neste documento terá precedência.
[00143] Embora modalidades particulares da presente invenção tenham sido ilustradas e descritas, deve ficar evidente aos versados na técnica que várias outras alterações e modificações podem ser feitas sem que se desvie do caráter e âmbito da invenção. Portanto, pretende-se cobrir nas reivindicações anexas todas essas alterações e modificações que se enquadram no escopo da presente invenção. Referências 1. McCracken V.J. e Gaskins H.R. Probiotics and the immune system. In: Probiotics a critical review, Tannock, GW (ed), Horizon Scientific Press, Reino Unido. 1999, p. 85-113. 2. Savage D.C. Interaction between the host and its microbes. In: Microbial Ecology of the Gut, Clark and Bauchop (eds), Academic Press, Londres. 1977, p. 277-310. 3. Kagnoff M.F. Immunology of the intestinal tract. Gastroenterol. 1993; 105 (5): 1275-80. 4. Lamm M.E. Interaction of antigens e antibodies at mucosal surfaces. Ann. Rev. Microbiol. 1997; 51: 311-40. 5. Raychaudhuri S., Rock KL. Fully mobilizing host defense: building better vaccines. Nat biotechnol., 1998; 16: 1025-31. 6. Stallmach A., Strober W, MacDonald TT, Lochs H, Zeitz M. Induction and modulation of gastrointestinal inflammation. Immunol. Today, 1998; 19 (10): 438-41. 7. Liam O'Mahony, Louise O'Callaghan, Jane McCarthy, David Shilling, Paul Scully, Shomik Sibartie, Eamon Kavanagh, William O. Kirwan, Henry Paul Redmond, John Kevin Collins, and Fergus Shanahan. Differential cytokine response from dendritic cells to commensal and pathogenic bacteria in different lymphoid compartments in humans. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 290: G839-G845, 2006. 8. O'Mahony C, Scully P, O'Mahony D, Murphy S, O'Brien F, et al. Commensal-Induced Regulatory T Cells Mediate Protection against Pathogen-Stimulated NF-kB Activation. PLoS Pathog 2008, 4(8): e1000112. 9. Desbonnet L, Garrett L, Clarke G, Bienenstock J, Dinan TG. The probiotic Bifidobacteria infantis: An assessment of potential antidepressant properties in the rat. J Psychiatr Res. 2008 Dec; 43(2):164-74. 10. Crabbe P.A., H. Bazin, H. Eyssen, and J.F. Heremans. The normal microbial flora as a major stimulus for proliferation of plasma cells synthesizing IgA in the gut. The germ free intestinal tract. Into. Arch. Allergy Appl Immunol, 1968; 34: 362-75. 11. Henderson B., Poole, S and Wilson M. 1998. In "Bacte- ria-Cytokine interactions in health and disease". Portland Press, 79130. 12. Arai KI, Lee F, Miyajima A, Miyatake S, Arai N, Yokota T. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses. Annu Rev Biochem 1990;59:783-836. 13. McGee DW, Bamberg T, Vitkus SJ, McGhee JR. A synergistic relationship between TNF-alpha, IL-1 beta, and TGF-beta 1 on IL-6 secretion by the IEC-6 intestinal epithelial cell line. Immunology 1995 Sep; 86(1):6-11. 14. Wu S, Meeker WA, Wiener JR, Berchuck A, Bast RC Jr, Boyer CM. Transfection of ovarian cancer cells with tumour necrosis factor alpha (TNF-alpha) antisense mRNA abolishes the proliferative response to interleukin-1 (IL-1) but not TNF-alpha. Gynecol Oncol 1994 Apr; 53(1):59-63. 15. Rowland I.R. Toxicology of the colon: role of the intestinal microflora. In: Gibson G.R. (ed). Human colonic bacteria: role in nutrition, physiology and pathology, 1995, pp 155-174. Boca Raton CRC Press. 16. Walker, R.I. New strategies for using mucosal vaccination to achieve more effective immunization. Vaccine, 1994; 12: 387400. 17. Steidler L., K. Robinson, L. Chamberlain, K.M Schol- field, E. Remaut, R.W.F. Le Page and J.M. Wells. Mucosal delivery of murine interleukin-2 (IL-2) and IL-6 by recombinant strains of Lactococcus lactis coexpressing antigen and cytokine. Infect. Immun., 1998; 66:3183-9. 18. Medaglini D., G. Pozzi, T.P. King and V.A. Fischetti. Mucosal and systemic immune responses to a recombinant protein expressed on the surface of the oral commensal bacterium Streptococcus gordonii after oral colonization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995;92:6868-72McCracken V.J. and Gaskins H.R, 'Probiotics a critical review', Horizon Scientific Press, UK 1999, p. 278. 19. Foligne, B., Nutten, S., Grangette, C., Dennin V., Goudercourt, D., Poiret, S., Dewulf, J., Brassart, D., Mercenier, A., and Pot, B., Correlation between in vitro and in vivo immunomodulatory properties of lactic acid bacteria. World J. Gastroenterol. 2007; 13(2): 236-243.
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Claims (12)

1. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa isolada que é de bifidobactéria NCIMB 41676 e adicionalmente um veículo ingerível que é um veículo farmaceuticamente aceitável, como uma cápsula, um tablete ou um pó.
2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um material probiótico.
3. Formulação, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o veículo ingerível é um produto alimentício como leite acidificado, iogurte, iogurte congelado, leite em pó, leite concentrado, requeijão, molhos ou bebidas.
4. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma proteína e/ou um peptídeo, em particular proteínas e/ou peptídeos que são ricos em glutamina/glutamato, um lipídio, um carboidrato, uma vitamina um mineral e/ou um microelemento.
5. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a cepa de bifidobactéria está presente em uma quantidade de mais de 106 cfu por grama da formulação.
6. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um adjuvante.
7. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um componente bacteriano.
8. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma entidade de fármaco.
9. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um composto biológico.
10. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que é usada para protocolos de imunização e vacinação.
11. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que é para uso em produtos alimentícios.
12. Formulação, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que é para uso como medicamento.
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