KR20180038440A - 플루오로사이클로펜테닐시토신 용도 및 제조 방법 - Google Patents

플루오로사이클로펜테닐시토신 용도 및 제조 방법 Download PDF

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KR20180038440A
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이영복
김덕중
고데프리더스 제이. 피터스
지젬마 사르키스잔
레자 마즈하리
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렉산 파마슈티컬스, 인코포레이티드
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Abstract

상기 개시된 발명의 요지는 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 사용하는 방법 및 상기를 포함하는 키트를 제공한다. 상기 개시된 발명의 요지는 암의 하나 이상의 증상의 치료가 필요한 피험자에게 하기 화학식 I의 화합물을 투여함을 포함하는 상기 증상의 치료 방법 및 상기와 같은 화합물의 제조 방법을 또한 제공한다:
화학식 I
Figure pct00027

Description

플루오로사이클로펜테닐시토신 용도 및 제조 방법
우선권
본 출원은 2015년 6월 9일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/173,174 호; 2015년 8월 27일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/210,708 호; 2016년 2월 1일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/289,801 호; 및 2016년 4월 7일자로 출원된 미국 가 출원 제 62/319,369 호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 출원의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다.
발명의 배경
미국특허 제 7,405,214 호(2008년 7월 29일자로 허여됨)는 하기 화학식 I의 화합물(또한 RX-3117로서 지칭됨), 플루오로사이클로펜테닐시토신 또는 4-아미노-1-((1S,4R,5S)-2-플루오로-4,5-디하이드록시-3-하이드록시메틸-사이클로펜트-2-에닐)-1H-피리미딘-2-온을 개시한다:
[화학식 I]
Figure pct00001
미국특허 제 7,405,214 호는 또한 D-리보스로부터의 RX-3117의 11-단계 완전합성을 개시하며 상기 합성은 값비싼 촉매를 사용하고, 이는 플랜트 생산에서 실행하기에 도전이 된다.
미국특허 제 9,150,520 호(2015년 10월 6일자로 허여됨)는 (3R,4R,6aR)-3급-부틸-(5-플루오로-2,2-디메틸-6-트리틸옥시메틸-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[1,3]디옥솔-4-일옥시)-디페닐-실란에서 4-아미노-1-(3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온으로의 RX-3117의 제조를 위한 짧은 경로를 개시한다. 상기 합성은 각 단계에서 중간체들을 단리시킬 필요가 있다. 따라서, 상기 공정은 시간 및 비용 제약으로 인해 최종 생성물의 규모 확대된 생산에 만족스럽지 못하다. 따라서, 예를 들어 단계들의 수를 감소시키고/시키거나 각 중간체의 정제 필요성을 제거함으로써 개선된 공정을 제공할 필요가 있다.
본 발명은 화학식 I의 화합물의 신규의 용도 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 특히 중간체 물질의 단리 및 정제 없이 다수의 단계들을 병행함으로써 제조 비용을 현저하게 감소시키는 개선된 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 피험자에서 화학식 I의 화합물을 사용하기 위한 투여량 및 노출 수준을 제공한다.
본 명세의 하나의 태양은 종양의 치료에 사용하기 위한 하기 화학식 I의 화합물을 제공하며, 여기에서 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 경구 투여형을 상기 치료가 필요한 피험자에게 약 300 내지 2,000 ㎎/일의 투여량으로 투여한다:
화학식 I
Figure pct00002
실시태양에서, 상기 화학식 I의 화합물을 일수화물로서 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 화학식 I의 화합물을 용매화물, 수화물 및 염 없이 투여한다.
상기 방법의 실시태양은 주당 5 내지 7일 경구 투여량을 투여함을 포함할 수 있다. 상기 방법의 실시태양은 4 연속주일 또는 3 연속주일 동안 주당 5 내지 7일 경구 투여량을 투여한 다음 상기 경구 투여형을 투여하지 않는 1주일-중단을 포함할 수 있다.
상기 방법의 실시태양은 3 연속주일의 치료에 이어서 1주일 중단, 또는 4 연속주일의 치료로 이루어지는 투여 주기를 포함할 수 있으며, 상기 경구 투여형을 12 투여주기 이하 동안 투여한다.
상기 방법의 실시태양은 단일 투여 후 약 700 내지 1,100 ng/㎖의 Cmax를 제공하는 경구 투여형을 포함할 수 있다. 상기 방법의 실시태양은 단일 투여 후 약 8,000 내지 10,000 hr·ng/㎖의 AUC0-t(0-24시간)를 제공하는 경구 투여형을 포함할 수 있다.
상기 방법의 실시태양을 사용하여 췌장, 방광 또는 결장직장암의 치료를 포함하여, 종양을 치료할 수 있다.
상기 방법의 실시태양은 대사길항물질(antimetabolite), DNA-단편화제, DNA-가교결합제, 삽입성 물질(intercalating agent), 단백질 합성 억제제, 국소이성화효소(topoisomerase) I 독, 국소이성화효소 II 독, 미세소관-지향제(microtubule-directed agent), 키나제 억제제, 폴리페놀, 호르몬, 호르몬 길항물질, 사멸수용체(death receptor) 작용물질, 면역 체크포인트 억제제, 항-예정세포사 1(anti-programmed cell death 1) (PD-1) 수용체 항체 및 항-예정세포사 리간드 1(PD-L1) 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 제2 작용제 또는 항-종양제와 함께 상기 경구 투여형을 투여함을 포함할 수 있다. 상기 방법의 실시태양은 PD-L1 항체를 피험자에게 투여함을 포함할 수 있다. 상기 방법의 실시태양은 PD-1 항체를 피험자에게 투여함을 포함할 수 있다. 상기 방법의 실시태양은 고체 경구 투여형을 투여함을 포함할 수 있다. 상기 제2 작용제 또는 항-종양제를 동일한 경구 투여형 또는 별도의 경구 투여형으로 투여할 수 있다.
실시태양에서, 상기 치료가 필요한 피험자는 인간 피험자이다.
본 명세의 또 다른 태양은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에 의해 치료가 필요한 피험자의 치료 효능을 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 상기 피험자로부터 종양 세포 또는 조직의 샘플을 수집하고; (ii) 상기 종양 세포 또는 조직에서 UCK2 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고; 여기에서 상기 UCK2의 발현 수준은 화학식 I의 화합물에 의한 치료 효능의 가능성을 가리킨다:
화학식 I
Figure pct00003
본 명세의 또 다른 태양은 종양 세포 샘플 중 키나제, p53, 또는 UCK2 단백질의 수준을 측정하는 분석의 사용에 의해, 종양의 치료에서 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 잠재적인 효능을 시험하기 위한 키트이다.
본 명세의 또 다른 태양은 암의 하나 이상의 증상의 치료에 사용하기 위한 하기 화학식 I의 화합물을 제공하며, 여기에서 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 피험자에서 메틸트랜스퍼라제를 억제하고 적어도 하나의 저메틸화된 표적을 상향조절하기에 유효한 양으로 투여한다:
화학식 I
Figure pct00004
실시태양에서, 상기 화학식 I의 화합물을 일수화물로서 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 화학식 I의 화합물을 용매화물, 수화물 및 염 없이 투여한다.
본 명세의 또 다른 태양은 임의의 중간체의 단리 없이 하나 초과의 단계로 연속적인 공정에서 3급-부틸(((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)옥시)디페닐실란(ASM11)을 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(INT14)으로 전환시킴에 의한, 4-아미노-1-((1S,4R,5S)-2-플루오로-4,5-디하이드록시-3-(하이드록시메틸)사이클로펜트-2-엔-1-일)피리미딘-2(1H)-온 1H2O(RX-3117-MH)의 제조를 제공한다.
상기 방법의 실시태양은 3급-부틸(((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)옥시)디페닐실란(ASM11)을 2-메틸 테트라하이드로푸란에 용해시키고; 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드를 가하여 반응 용액 중에 ((3aS,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-올)(INT12)을 형성시키고; 유기상 중의 INT12를 회수함을 포함할 수 있다.
상기 유기상 중의 INT12의 회수 실시태양은 상기 반응 용액을 수성 용액으로 세척하고; 상기 INT12를 갖는 유기상으로부터 수성 추출물을 분리시키고; 상기 수성 추출물을 2-메틸 테트라하이드로푸란으로 세척하여 상기 수성 추출물로부터 INT12를 추출하고; 상기 추출된 INT12를 상기 INT12를 갖는 유기상과 합함을 포함할 수 있다.
상기 방법의 실시태양은 상기 유기상 중의 INT12에 2-메틸 테트라하이드로푸란 중의 트리에틸아민 및 메탄설포닐 클로라이드를 가하여 제2 반응 용액 중에 ((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일 메탄설포네이트)(INT13)를 형성시키고; DMSO 중의 INT13을 회수함을 포함할 수 있다.
상기 DMSO 중의 INT13 회수의 실시태양은 상기 INT13을 갖는 제2 반응 용액에 DMSO를 가하고; 증류에 의해 2-메틸 테트라하이드로푸란의 적어도 90% w/w를 제거함을 포함할 수 있다.
상기 방법의 실시태양은 2.5 당량의 세슘 카보네이트 및 시토신을 상기 DMSO 중의 INT13에 가하여 제3 반응 용액 중에 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(INT14)을 형성시킴을 포함할 수 있다.
상기 방법의 실시태양은 반응 온도를 약 33 내지 37 ℃에서 유지시킴을 포함할 수 있다.
실시태양에서, 상기 INT14는 약 95:5 초과의 N- 대 O-이성질체의 비를 갖는다.
상기 방법의 실시태양은 상기 INT14를 갖는 제3 반응 용액에 산을 가하여 4-아미노-1-((1S,4R,5S)-2-플루오로-4,5-디하이드록시-3-(하이드록시메틸)사이클로펜트-2-엔-1-일)피리미딘-2(1H)-온(RX-3117)을 형성시키고; 상기 RX-3117을 메틸 3급-부틸 에테르 및 물로 세척하여 유기상 및 RX-3117을 갖는 수성상을 형성시키고; 상기 RX-3117을 정제하여 RX-3117-MH를 형성시킴을 포함할 수 있다.
상기 방법의 실시태양은 상기 반응 혼합물을 메탄올로 충전시키고 상기 세척 단계 전에 아세토니드의 약 1.0% 미만의 면적이 검출될 때까지 상기 반응 혼합물을 증류시켜 상기 아세토니드를 제거함을 포함할 수 있다.
상기 세척 단계의 실시태양은 상기 유기상으로부터 RX-3117을 갖는 수성상을 분리시키고; 상기 RX-3117을 갖는 수성상을, 상기 수성상 중에서 약 0.5% w/w 미만의 트리틸 알콜이 검출될 때까지 메틸 3급-부틸 에테르로 세척하고; 상기 RX-3117을 갖는 수성상에 염기성 음이온 수지를 가하여 슬러리를 형성시키고; 상기 슬러리를 여과하여 모액을 유지시키고; 상기 모액을 농축시켜 농축물을 형성시키고; 상기 농축물에 아세토니트릴을 가하여 정제된 RX-3117-MH를 형성시킴을 포함할 수 있다.
본 명세의 또 다른 태양은 3급-부틸(((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)옥시)디페닐실란(ASM11)으로부터 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(INT14)을 제조하기 위한 연속적인 공정을 제공하며, 상기 공정은 상기 ASM11을 2-메틸 테트라하이드로푸란에 용해시키고; 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드를 가하여 ((3aS,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-올)(INT12)을 형성시키고; 상기 INT12에 2-메틸 테트라하이드로푸란 중의 트리메틸아민 및 메탄설포닐 클로라이드를 가하여 ((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일 메탄설포네이트)(INT13)를 형성시키고; 상기 INT13에 세슘 카보네이트 및 시토신을 가하여 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(INT14)을 형성시키는 단계들을 포함하며; 여기에서 상기 단계들을 INT12 또는 INT13의 단리 없이 하나 이상의 고정된 반응기에서 수행한다.
본 명세의 또 다른 태양은 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(INT14)으로부터 4-아미노-1-((1S,4R,5S)-2-플루오로-4,5-디하이드록시-3-(하이드록시메틸)사이클로펜트-2-엔-1-일)피리미딘-2(1H)-온 1H2O(RX-3117-MH)를 제조하기 위한 연속적인 공정을 제공하며, 상기 공정은 상기 INT14를 산과 반응시켜 4-아미노-1-((1S,4R,5S)-2-플루오로-4,5-디하이드록시-3-(하이드록시메틸)사이클로펜트-2-엔-1-일)피리미딘-2(1H)-온(RX-3117)을 형성시키고; 상기 RX-3117을 메틸 3급-부틸 에테르 및 물로 세척하여 유기상 및 RX-3117을 갖는 수성상을 형성시키고; 상기 유기상으로부터 RX-3117을 갖는 수성상을 분리시키고; 상기 RX-3117을 갖는 수성상을, 상기 수성상 중에서 약 0.5% w/w 미만의 트리틸 알콜이 검출될 때까지 메틸 3급-부틸 에테르로 세척하고; 상기 RX-3117을 갖는 수성상에 강한 염기성 음이온 수지를 가하여 슬러리를 형성시키고; 상기 슬러리를 여과하여 모액을 유지시키고; 상기 모액을 농축시켜 농축물을 형성시키고; 상기 농축물에 아세토니트릴을 가하여 정제된 RX-3117-MH를 형성시키고; 상기 정제된 RX-3117-MH를 단리시키는 단계들을 포함하며; 여기에서 상기 단계들을 하나 이상의 고정된 반응기에서 수행한다.
본 명세의 또 다른 태양은 세포를 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염과 접촉시킴으로써, 상기 세포에 세포자멸(apoptosis)을 유도하는 방법을 제공한다:
화학식 I
Figure pct00005
본 명세의 또 다른 태양은 세포를 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염과 접촉시킴으로써, 상기 세포를 세포자멸성 신호에 감작시키는 방법을 제공한다:
화학식 I
Figure pct00006
본 명세의 또 다른 태양은 세포를 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염과 접촉시킴으로써, 상기 세포 중의 단백질 키나제를 조절하는 방법을 제공한다.
본 명세의 또 다른 태양은 (i) 비-소 폐암 세포를 갖는 피험자를 진단하고; (ii) 상기 피험자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계들에 의해 비-소세포 폐암을 치료하는 방법을 제공한다.
도 1은 24시간 후 G1 기의 A549, SW1573, SW1573/G- 및 H460 세포에 대한 RX-3117(1 μM)의 효과를 나타내는 일련의 막대그래프이다. 1 μM의 용량에서, RX-3117은 24시간 노출 후 G1 기의 A549, SW1573, SW1573/G- 및 H460 세포의 축적을 유도하였다.
도 2는 24시간 및 48시간 후 S 기의 A549, SW1573 및 SW1573/G- 세포에 대한 RX-3117(5xIC50)의 효과를 나타내는 일련의 막대그래프이다. 5xIC50의 보다 높은 용량에서, RX-3117은 S 기의 A549, SW1573 및 SW1573/G- 세포의 축적을 유도하였다.
도 3은 SW1573 세포에서 프로-카스파제 9 활성화에 대한 RX-3117의 농도 증가 효과를 나타내는 일련의 웨스턴 블럿이다. RX-3117은 SW1573 세포에서 프로-카스파제 9를 감소시켰다. 프로-카스파제 9의 감소는 카스파제의 활성화 및 연속되는 세포자멸 유도를 가리킨다.
도 4는 A549 세포에서 프로-카스파제 9 활성화에 대한 RX-3117의 농도 증가 효과를 나타내는 일련의 웨스턴 블럿이다. RX-3117은 A549 세포에서 프로-카스파제 9를 감소시켰다.
도 5는 48시간 후 SW1573 세포 중 생물마커 γH2A.X(포스포 S139)에 의해 지시되는 바와 같은 RX-3117에 의해 유도된 이중-가닥 파손(DSB)을 나타내는 일련의 웨스턴 블럿이다. RX-3117은 48시간 후 DSB 포스포 S139 H2A.X에 대한 마커에 의해 지시되는 DSB를 유도한다. C*는 2일 후 50 μM 에토포시드에 의한 DNA 손상을 의미하며, 이는 양의 대조용으로서 제공되었다.
도 6은 24시간 후 RX-3117의 농도를 증가시킴으로써 유도된 절단된 PARP를 나타내는 일련의 웨스턴 블럿이다.
도 7은 A549 세포에서 p53 발현 수준에 대한 RX-3117 1 μM 및 5 μM의 효과를 나타내는 일련의 웨스턴 블럿이다. 1 μM 및 5 μM에서, RX-3117은 A549 세포주에서 p53 발현 수준을 증가시켰다.
도 8은 24 및 48시간 후 SW1573 세포에서 Chk1, Chk2, Cdk1, Cdk2 및 p-Cdc25C 발현 수준에 대한 RX-3117 10 μM의 효과를 나타내는 일련의 웨스턴 블럿이다. SW1573 세포에서 Chk1은 10 μM RX-3117에 48시간 노출 후 증가하고, pCDC25C는 감소하며 Cdk2는 증가한다.
도 9는 24시간 후 SW1573 세포에서 wee1 발현 수준에 대한 RX-3117 농도 증가 효과를 나타내는 일련의 웨스턴 블럿이다. RX-3117의 농도 증가는 wee1에 대해 영향을 미치며, 이는 SW1573 세포주에서 24시간 후에 감소된다.
도 10은 24시간(d1) 및 48시간(d2) 후 서브-G1 기의 PI 염색된, 세포자멸성 A549 및 SW1573 세포에 대한 5xIC50에서의 RX-3117의 효과를 나타내는 막대그래프이다.
도 11은 24시간(d1), 48시간(d2), 72시간(d3) 및 96시간(d4) 후 서브-G1 기의 애넥신 V 염색된, 세포자멸성 A549 및 SW1573 세포에 대한 RX-3117 5 μM(A549의 경우) 및 10 μM(SW1573의 경우)의 효과를 나타내는 막대그래프이다.
도 12는 용량 1 및 용량 7에 따른 피크 혈장 농도 Cmax(ng/㎖)을 나타내는 그래프이다.
도 13은 용량 1 및 용량 7에 따른 AUC0-t(ng·h/㎖)에서의 혈장 노출을 나타내는 그래프이다.
도 14는 시티딘, 젬시타빈, 및 신규의 시티딘 유사체 RX-3117에 대한 화학식을 나타낸다.
도 15는 RX-3117과의 배양-전 또는 -후의 방사선감작 효과를 나타내는 막대그래프이다. 회색 막대는 대조용의, 4 Gy 조사된 A2780 세포를 나타내고, 흑색 막대는 4 Gy 조사 후 24시간 동안 1 μM RX-3117과의 배양을 나타낸다. 백색/회색 막대는 4 Gy 조사 전 1 μM RX-3117과의 24시간 배양을 나타낸다. P.E.는 도말 효율을 나타낸다.
도 16은 클론형성 분석을 사용하는 상이한 방사선조사 용량에 의한 1 μM RX-3117(SW1573 세포의 경우 5 μM RX-3117)의 방사선감작 효과를 나타내는 일련의 그래프이다. 세포를 24시간 동안 RX-3117과 함께 예비배양하였다. A: A2780 세포는 1.8의 용량 변형 인자(DMF)를 가졌다. B: A549 세포는 1.8의 DMF를 가졌다. C: H460 세포는 불량한 방사선감작 효과를 나타내었다. D: SW1573 세포는 1.5의 DMF를 가졌다. E: SW1573/G-세포는 1.4의 DMF를 가졌다. F: 1 μM RX-3117과 배양 후 24시간 동안 2 Gy에 의한 5일간의 SW1573 세포의 분할 방사선조사.
도 17은 회전타원체에 대한 RX-3117의 방사선감작 효과를 나타내는 일련의 그래프이다. A: SW1573, 15일에 걸쳐 표준화된 회전타원체 부피. 대조용; 1 μM RX-3117 처리된; 5일 동안 2 Gy의 RT 처리; 5일 동안 2 Gy의 RT 처리 및 1 μM RX-3117과 예비 배양된. B: A549 구, 15일에 걸쳐 표준화된 회전타원체 부피. 대조용; 1 μM RX-3117 처리된; 5일 동안 2 Gy의 RT 처리; 5일 동안 2 Gy의 RT 처리 및 1 μM RX-3117과 24시간 동안 예비 배양된.
도 18은 DNA 손상의 웨스턴 블럿 분석을 나타낸다. A: 48시간 동안 0.1 μM 내지 10 μM RX-3117로부터 출발하는 증가하는 농도에 노출된 A2780 세포에서 DSB 손상 마커 γH2A.X의 발현. B: 방사선와 함께 SW1573 세포에서 DNA 손상의 시간 의존적인 유도. C*는 2일 후 50 μM 에토포시드에 의한 DNA 손상을 의미하며, 이는 양성 대조용으로서 제공되었다.
도 19는 세포주에서 RX-3117 및 방사선에 의한 세포주기 분포의 동요를 나타내는 일련의 막대그래프(A) 및 웨스턴 블럿(B)이다. A: 4 Gy 방사선의 존재 또는 부재하에서 24시간 동안 1 μM RX-3117로 처리된 세포주의 세포 단계의 막대그래프. 세포를 처리 후 24시간째에 수확하였다. B: 약물 배양 후 24시간 및 방사선조사 후 30분째에 웨스턴 블럿과 함께 세포주기 단백질 분석.
도 20은 SW1573 세포에서 세포주기 단백질의 발현에 대한 RX-3117 및 방사선의 효과를 나타내는 일련의 웨스턴 블럿이다. 세포를 RX-3117의 존재 및 부재하에서 방사선조사하였다(RT). 발현을 오디세이(Odyssey) 시스템을 사용하여 웨스턴 블럿팅에 의해 측정하였다.
도 21은 RX-3117의 개략적인 대사 경로를 나타낸다.
도 22는 RX-3117에 의한 DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT1) 유지의 하향조절 기전의 개략도를 나타낸다.
도 23은 A549 세포에서 DNMT1, DNMT3A, DNMT3B 및 β-액틴 발현 수준에 대한 RX-3117 1 μM, 5 μM, 25 μM 및 75 μM의 효과를 나타내는 일련의 웨스턴 블럿이다. RX-3117은 DNA 메틸트랜스퍼라제 1의 유지를 하향조절한다.
도 24는 세포주기 단백질에 대한 잠재적인 효과: 손상 유도 후 체크포인트 키나제 Chk1 및 Chk2에 의한 세포주기의 조절을 나타내는 도해이다.
도 25는 24 또는 48시간 동안 A549 및 SW1573 세포에 대한 RX-3117 5 μM, 10 μM, 20 μM 및 50 μM의 효과를 나타내는 일련의 그래프 및 관련된 웨스턴 블럿이다. 세포를 수확하고 단백질 발현을 웨스턴 블럿팅을 사용하여 측정하였다(A 및 B). RNA를 단리하고 유전자 발현을 RT-PCR을 사용하여 측정하였다(C 및 D). RX-3117은 DNMT1 단백질 및 유전자 발현을 하향조절한다.
도 26은 24시간 동안 A2780 난소암 세포에 대한 RX-3117(1 μM) 및 아자-dC(5 μM)의 효과를 나타내는 웨스턴 블럿 및 그래프이다. 핵 추출물을 단리하고 DNMT1 발현을 방법에 기재된 바와 같이 상업적인 키트에 의해 웨스턴 블럿(A) 및 활성(B)에 의해 측정하였다.
도 27은 A549 세포에 대한 RX-3711 및 아자-dC의 효과를 나타낸다. 전체적인 메틸화를 FACS(A) 또는 5-메틸-시토신에 대한 항체에 의한 면역형광(B)을 사용하여 측정하였다. 대조용 세포를 100%로 설정하였다(A). 웨스턴 블럿(C)은 RX-3117 및 아자-dC에 노출 후 A549 세포에서 MGMT 및 E-카데린, 및 SW1573 세포에서 p16의 발현을 나타낸다.
도 28은 24시간 동안 MTX의 PCFT 매개된 수송에 대한 RX-3117의 효과를 나타낸다. 폴산(FA)을 가하여 PCFT를 억제하고 L-LV를 가하여 RFC 매개된 MTX 수송을 억제하였다. 아자-CdR 및 아자-CR을 양성 대조용으로서 포함시켰다.
도 29는 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117의 1H NMR이다.
도 30은 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117의 13C NMR이다.
도 31은 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117의 19F NMR이다.
도 32는 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117의 질량 스펙트럼이다.
도 33은 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117의 질량 스펙트럼(ES-필터와 함께)이다.
도 34는 평면 편광(좌측 컬럼) 및 교차 편광(우측 컬럼)하의, 실시예 9의 공정에 따라 제조된(상부열) 및 실험규모 공정을 사용하여 제조된(하부열) RX-3117의 현미경검사 비교이다.
도 35는 실험규모 공정을 사용하여 제조된 RX-3117(상부 스펙트럼) 및 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117(기부 스펙트럼)을 비교하는 X-선 분말 회절 데이터이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 과학기술 용어의 의미는 개시된 발명의 요지가 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 것이다. 당해 분야의 통상적인 숙련가는 본 명세서에 기재된 방법 및 물질과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질을 또한 사용하여, 개시된 발명의 요지를 실행하거나 시험할 수 있다.
명백히 달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 바와 같은 하기의 용어들은 하기에 나타낸 의미들을 갖는다. 이들 의미는 당해 분야에서 이해되는 바와 같은 상기 용어들의 의미들을 변경시키기보다는 오히려 보충하고자 한다.
"Cmax"는 관찰된 최대 혈장 농도를 지칭한다.
"Tmax"는 Cmax가 획득되는 시간을 지칭한다.
"T½"는 약물의 혈장 농도가 원래 값의 절반에 도달하는데 필요한 시간을 지칭한다. "종말 T½"는 종말기의 T½를 지칭한다.
"AUC0-t"는 시간 0에서부터 시간 t까지의 혈장 농도 아래 면적 대 시간 곡선(AUC)을 지칭하며, 이때 "t"는 측정 가능한 농도를 갖는 최종 샘플링 시점이다. 예를 들어 AUC0-24 또는 AUC0-t(0 내지 24시간)는 시간 0에서부터 24시간까지의 AUC를 지칭한다.
"경구 투여형"은 경구 투여를 위해 제형화된 약학 조성물을 지칭한다. 상기 경구 투여형을 즉시, 지속적인, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출을 제공하기 위해 제형화할 수 있다. 경구 투여형의 예는 정제, 캡슐, 과립 및 젤-캡을 포함한다.
"유효량"은 화합물 또는 약학 조성물의 효능 및 독성에 대한 잠재성의 매개변수 및 당해 분야의 숙련가의 지식을 토대로 목적하는 효과, 예를 들어 상태의 치료 또는 예방을 생성시키는 상기 화합물 또는 약학 조성물의 양을 지칭한다. 유효량을 1회 이상의 용량으로 투여할 수 있다.
"접촉"은 화합물 및 세포를 목적하는 효과, 예를 들어 세포자멸의 유도 또는 단백질 키나제의 조절을 생성시키기에 충분히 가깝게 직접으로 또는 간접적으로 놓이게 함을 지칭한다. 상기 접촉을 시험관내에서 또는 생체내에서 수행할 수 있다. 예를 들어, 세포를 화합물과 접촉시킴은 상기 화합물을 공지된 기법, 예를 들어 미세주사를 사용하여 세포에 직접 전달하거나, 상기 화합물을 상기 세포를 갖는 피험자에게 투여하거나, 또는 상기 세포를 상기 화합물을 포함하는 배지에서 배양시킴을 포함할 수 있다.
"치료"는 이롭거나 목적하는 결과, 예를 들어 임상 결과를 획득함을 지칭한다. 일부 실시태양에서, 상기 이롭거나 목적하는 결과는 하기 중 임의의 하나 이상이다: 상태의 개시 또는 발생을 억제하거나 억누르고, 상기 상태의 중증도를 감소시키고, 상기 상태와 관련된 증상의 수 또는 중증도를 감소시키고, 상기 상태를 앓고 있는 피험자의 삶의 질을 증가시키고, 상기 상태의 치료에 필요한 또 다른 투약 용량을 감소시키고, 피험자가 상기 상태를 위해 복용하는 또 다른 투약의 효과를 증대시키고, 상기 상태를 갖는 피험자의 생존을 연장시킨다.
"예방"은 피험자가 발병하지 않았지만 발병의 위험성이 있는 상태를 나타낼 확률을 감소시킴을 지칭한다. "위험성이 있는"은 피험자가 상태의 발병과 관련되거나 당해 분야에 공지된 측정 가능한 매개변수인 하나 이상의 위험 인자를 가짐을 나타낸다. 위험 인자 중 하나 이상을 갖는 피험자는 상기와 같은 위험 인자가 없는 피험자보다 상기 상태를 나타낼 확률이 더 높다.
"피험자"는 포유동물, 예를 들어 비제한적으로 인간과 같은 동물을 지칭한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법은 인간 치료법 및 수의학 용도에 유용할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 피험자는 포유동물이다. 다른 실시태양에서, 상기 피험자는 인간이다.
"금식"은 치료에 앞서 적어도 8시간 동안 음식물을 금식한 피험자를 지칭한다.
"세포자멸" 또는 "세포자멸 과정"은, 세포가 내부 또는 외부 신호(세포자멸성 신호)를 받으면 시작하여 실행 단계를 촉발하는 일련의 생화학적 사건(신호 전달 단계)을 통해 진행하는 예정 세포사 과정을 지칭한다. 상기 실행 단계에서, 효과기 카스파제는 생명 유지에 필요한 세포 단백질을 절단하여, 세포자멸을 특성화하는 형태적 변화에 이르게 한다. 이들 변화는 예를 들어 세포 수축, 소포체의 확장, 세포 단편화, 막소포(세포자멸체)의 형성, 데옥시리보핵산(DNA) 단편화, 염색사 응축, 염색체 이동, 세포핵 중의 변연화, 미토콘드리아 팽창, 미토콘드리아 크리스테의 확장, 미토콘드리아 투과성 전이공의 개방, 미토콘드리아 양성자 구배의 소실, 및/또는 원형질막 물집을 포함할 수 있다. 세포자멸을 검출하고 측정하는데 사용되는 예시적인 분석은 색혈체의 현미경검사뿐만 아니라 효소적 분석, 예를 들어 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 단부 표지화(TUNEL), 카스파제 분석, 애넥신 분석 및 DNA 래더링을 포함한다. 세포자멸성 세포를 예를 들어 DNA 저배수성에 대한 프로피디움 요오다이드 염색된 세포의 FACS 분석에 의해 정량분석할 수 있다.
"세포자멸 유도"는 세포자멸을 직접적으로 또는 간접적으로 일으킴을 지칭하며, 주어진 세포 집단에서 세포자멸을 겪는 세포수의 증가, 세포가 세포자멸을 겪는 속도의 증가, 또는 세포자멸의 하나 이상의 형태적 특징의 발생 강도, 수 또는 속도의 증가를 특징으로 할 수 있다.
"감작"은 세포자멸성 신호에 대한 세포의 감도 증가, 또는 상기 신호에 응답하는 세포 내성의 감소를 지칭한다.
"세포자멸성 신호"는 세포자멸 신호전달 경로를 활성화시키는 자극을 지칭한다.
"세포자멸 신호전달 경로"는 세포자멸성 세포사를 촉발하는 일련의 분자 신호를 지칭한다. 상기 경로는 신호의 수용으로 출발하여, 세포자멸의 실행 단계가 촉발될 때 끝난다.
"조절"은 단백질 키나제와 같은 생물분자의 발현 및/또는 활성을 변경시킴을 지칭한다. 하나의 실시태양에서, 조절은 생물분자의 발현 및/또는 활성을 증가시킴을 지칭한다. 다른 실시태양에서, 조절은 생물분자의 발현 및/또는 활성을 감소시킴을 지칭한다.
"단백질 키나제"는 인산화에 의해 다른 단백질을 변형시키는 키나제 효소를 지칭한다. 단백질 키나제의 예는 세린/쓰레오닌 단백질 키나제(예를 들어 체크포인트 키나제 1, 체크포인트 키나제 2), 티로신-특이성 단백질 키나제, 히스티딘-특이성 단백질 키나제, 및 혼합된 키나제(예를 들어 미토젠-활성화된 단백질 키나제 키나제)를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 세린/쓰레오닌 단백질 키나제이다. 하나의 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 세린/쓰레오닌 단백질 키나제이다. 다른 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 체크포인트 키나제 1(Chk1) 또는 체크포인트 키나제 2(Chk2)이다. 다른 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 Chk1이다. 다른 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 Chk2이다.
"p53"은 p53 종양 억제인자 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다.
"UCK2"는 종양 세포 또는 조직에서 우세하게 발현되는 유리딘 시티딘 키나제 2를 지칭한다.
"종양 세포"는 종양으로부터 유래된 세포를 지칭한다.
"종양"은 양성이든 악성이든, 조직 또는 세포의 이상 성장을 지칭한다. 예로는 전립선, 폐, 뇌, 유방, 신장, 간, 폐, 장, 림프, 근육, 뼈, 골수, 자궁, 난소, 질, 음문, 췌장, 부신, 중추신경계, 말초신경계, 자궁경부, 방광, 자궁내막, 인후, 식도, 후두, 갑상선, 혈액, 음경, 고환, 흉선, 피부, 척추, 위, 담관, 소장, 간담즙성관, 결장직장, 결장, 직장, 항문, 내분비, 눈 및 담낭에서 발견되는 종양이 있다.
"암"은 악성 종양을 지칭한다. 암세포는 주변 조직을 침범하거나 침범하지 않을 수도 있으며, 따라서 새로운 신체 부위로 전이되거나 전이되지 않을 수 있다. 암은 상피세포의 암인 암종을 포함하며; 암종은 편평세포 암종, 선암종, 흑색종 및 간종양을 포함한다. 암은 또한 중간엽 기원 종양인 육종을 포함하며; 육종은 골원성 육종, 백혈병 및 림프종을 포함한다. 암은 하나 이상의 신생물 세포 유형을 수반할 수 있다.
"항-종양제"는 종양의 치료 또는 예방에 유용한 임의의 작용제를 지칭한다. 항-종양제의 예는 상기 약학 조성물에 기재된 활성제를 포함한다. 실시태양에서, 상기 항-종양제는 RX-3117 외에, 대사길항물질, DNA-단편화제, DNA-가교결합제, 삽입성 물질, 단백질 합성 억제제, 국소이성화효소 I 독, 국소이성화효소 II 독, 미세소관-지향제, 키나제 억제제, 폴리페놀, 호르몬, 호르몬 길항물질, 사멸수용체 작용물질, 면역 체크포인트 억제제, 항-예정세포사 1(PD-1) 수용체 항체 및 항-예정세포사 리간드 1(PD-L1) 항체 중에서 선택된다. 다른 실시태양에서, 상기 추가적인 항-종양제는 PD-1 수용체 항체이다. 다른 실시태양에서, 상기 추가적인 항-종양제는 펨브로리주맵이다. 다른 실시태양에서, 상기 추가적인 항-종양제는 니보루맵이다. 다른 실시태양에서, 상기 추가적인 항-종양제는 두리아루맵이다. 다른 실시태양에서, 상기 추가적인 항-종양제는 니보루맵과 펨브로리주맵의 조합이다.
"방사선"은 종양의 치료 또는 예방에 유용한 임의의 방사선을 지칭한다. 방사선의 예는 X-선, 감마선, 및 하전된 입자를 포함한다. 상기 방사선을 임의의 형태의 방사선요법, 예를 들어 외부 방사선조사 요법(EBRT, XBRT 또는 원격치료법), 근접방사선요법(내부 방사선 요법 또는 밀봉선원요법), 수술중 방사선요법, 또는 전신 방사선요법에 의해 전달할 수 있다.
"단리"는 중간체를 정제에 의해, 예를 들어 크로마토그래피, 증류, 여과, 추출, 건조 또는 재결정화에 의해 반응 혼합물로부터 분리시키는 임의의 공정을 지칭한다.
"고정된 반응기 또는 용기"는 설계상 제거될 수 없는 고정된 장소 중의 반응기 시스템을 지칭한다.
"와 같은"은 "비제한적으로 상기와 같은"과 동일한 의미를 갖는다. 유사하게, "포함하다"는 "비제한적으로 포함하다"와 동일한 의미를 갖는 반면, "포함하는"은 "비제한적으로 포함하는"과 동일한 의미를 갖는다.
단수형 "하나의" 및 "상기"는 문맥상 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어 "화합물"에 대한 언급은 하나 이상의 화합물(들) 및/또는 그의 균등물(들)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 숫자 범위는 달리 명시되지 않는 한, 상한 및 하한 및 각 사이값을 포함한다.
실행 실시예 외에, 또는 달리 지시되는 경우 외에, 명세서 및 청구범위에 사용되는 바와 같은 수치(예를 들어 성분의 양, 반응 조건을 나타내는 수)는 "약"이란 용어에 의해 변형된다. 상응하게, 반대되게 지시되지 않는 한, 상기와 같은 수는 획득하고자 하는 목적하는 성질들에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 및 청구항의 범위에 대한 균등론의 적용을 제한하고자 하는 시도로서가 아닌, 각 숫자 매개변수들은 유의수준 숫자의 수 및 통상적인 라운딩 기법에 비추어 해석되어야 한다.
개시된 발명의 요지의 범위를 제시하는 숫자 매개변수들은 근사치이지만, 실행 실시예에 제시된 수치들은 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치는 그의 각 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 발생하는 일부 오차를 본래적으로 함유한다.
세포자멸의 유도 또는 세포자멸성 신호에 대한 세포의 감작 방법
본 명세의 하나의 태양은 유효량의 하기 화학식 I의 화합물(RX-3117) 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 단계에 의해 세포자멸을 유도하는 방법을 제공한다:
화학식 I
Figure pct00007
실시태양에서, 상기 화학식 I의 화합물을 일수화물 또는 유리 형태로 투여할 수 있다.
본 명세의 또 다른 태양은 세포를 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염과 접촉시키는 단계에 의해 상기 세포에서 세포자멸을 유도하는 방법을 제공한다.
하나의 실시태양에서, 상기 방법은 단일가닥 파손(SSB) 또는 이중가닥 파손(DSB)을 통해 세포자멸을 유도한다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 SSB를 통해 세포자멸을 유도한다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 DSB를 통해 세포자멸을 유도한다.
본 명세의 또 다른 태양은 세포를 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염과 접촉시킴으로써 상기 세포를 세포자멸성 신호에 감작시키는 방법을 제공한다.
본 명세서에 제공된 임의의 방법들 중 하나의 실시태양에서, 상기 세포는 종양 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 악성 종양 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 폐암 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 비-소세포 폐암 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 췌장암 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 방광암 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 결장직장암 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 포유동물 세포 또는 포유동물 중의 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 인간 세포 또는 인간 중의 세포이다.
단백질 키나제의 조절 방법
본 명세의 또 다른 태양은 세포를 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염과 접촉시킴을 포함하는, 상기 세포 중의 단백질 키나제를 조절하는 방법을 제공한다. 실시태양에서, 상기 단백질 키나제를, 상기 단백질 키나제를 증가시킴으로써 조절한다. 상기 증가는 예를 들어 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상까지일 수 있다.
실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 체크포인트 단백질 키나제이다. 다른 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 체크포인트 키나제 1(Chk1) 또는 체크포인트 키나제 2(Chk2)이다. 다른 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 Chk1이다. 다른 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 Chk2이다.
실시태양에서, 상기 세포는 포유동물 중에 있다. 다른 실시태양에서, 상기 세포는 인간 중에 있다.
실시태양에서, 상기 방법은 단백질 키나제 발현 수준을 증가시킨다.
비-소세포 폐암의 치료 또는 예방 방법
본 명세의 또 다른 태양은
(i) 비-소 폐암 세포를 갖는 피험자를 진단하고;
(ii) 상기 피험자에게 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 투여하는
단계들에 의해 비-소세포 폐암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
치료 효능의 예측 방법
본 명세의 또 다른 태양은
(i) 피험자로부터 종양 세포 또는 조직의 샘플을 수집하고;
(ii) 상기 샘플 중의 단백질 키나제 또는 p53 발현 수준 중 하나를 측정하고,
(iii) 상기 종양 세포 또는 조직을 화학식 I의 화합물과 접촉시키고;
(iv) 상기 화학식 I의 화합물과의 접촉 후에 상기 종양 세포 또는 조직 중의 단백질 키나제 또는 p53 발현 수준 중 하나를 측정하는
단계들에 의해, 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로, 치료가 필요한 피험자의 치료 효능을 예측하는 방법을 제공하며; 여기에서 상기 단백질 키나제 또는 p53 발현 수준의 증가는 효능의 가능성을 가리킨다.
실시태양에서, 상기 종양 세포 또는 조직을 화학식 I의 화합물과 접촉시키는 것은 상기 종양 세포 또는 조직의 샘플을 접촉시킴으로써 수행된다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 화학식 I 화합물과의 접촉 후에 상기 종양 세포 또는 조직 중 단백질 키나제 또는 p53 발현 수준 중 하나의 측정을 상기 샘플 상에서 수행한다. 다른 실시태양에서, 상기 종양 세포 또는 조직을 상기 화학식 I 화합물과 접촉시키는 것을, 상기 화학식 I의 화합물을 상기 피험자에게 투여함으로써 수행한다. 상기와 같은 실시태양에서, 상기 화학식 I 화합물과의 접촉 후에 상기 종양 세포 또는 조직 중 단백질 키나제 또는 p53 발현 수준 중 하나의 측정을, 상기 피험자로부터 종양 세포 또는 조직의 제2 샘플을 수집하고 상기 제2 샘플 중의 단백질 키나제 또는 p53 발현 수준 중 하나를 측정함으로써 수행한다.
실시태양에서, 상기 방법은 단백질 키나제 또는 p53 발현 수준 중 하나의 증가가 검출되는 경우 상기 피험자에게 화학식 I의 화합물을 투여함을 또한 포함한다. 상기 단백질 키나제는, 상기 단백질 키나제의 양이 통계학적 유의수준의 양까지 더 큰 경우 증가된 것으로 간주된다. 따라서, 상기 증가는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 또는 25% 이상까지일 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 단계 (ii) 및 (iv)에서 샘플 중의 단백질 Cdc25C 또는 p-Cdc25C 발현 수준을 측정하는 단계를 또한 포함하며, 여기에서 단백질 Cdc25C 또는 p-Cdc25C 발현 수준의 감소는 효능의 가능성을 가리킨다. 상기 단백질 Cdc25C 또는 p-Cdc25C 발현 수준은, 상기 단백질 Cdc25C 또는 p-Cdc25C 발현 수준이 통계학적 유의수준의 양까지 감소하는 경우 감소된 것으로 간주된다. 따라서, 상기 감소는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 또는 25% 이상까지일 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 단백질 키나제 또는 p53 발현 수준 중 하나의 증가 및 단백질 Cdc25C 또는 p-Cdc25C 발현 수준의 감소가 검출되는 경우 상기 피험자에게 화학식 I의 화합물을 투여함을 또한 포함한다. 실시태양에서, 상기 화학식 I의 화합물을 일수화물로서 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 화학식 I의 화합물을 용매화물, 수화물 및 염 없이 투여한다.
실시태양에서, 상기 방법은 단계 (ii) 및 (iv)에서 단백질 키나제 발현 수준을 측정함을 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 체크포인트 키나제이다. 다른 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 Chk1 또는 Chk2이다. 다른 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 Chk1이다. 다른 실시태양에서, 상기 단백질 키나제는 Chk2이다.
본 명세의 또 다른 태양은
(i) 피험자로부터 종양 세포 또는 조직의 샘플을 수집하고;
(ii) 상기 종양 세포 또는 조직에서 UCK2 발현 수준을 측정하는
단계들에 의해, 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염으로, 치료가 필요한 피험자의 치료 효능을 예측하는 방법을 제공하며; 여기에서 상기 UCK2의 발현 수준은 화학식 I의 화합물에 의한 치료 효능의 가능성을 가리킨다.
실시태양에서, 상기 방법은 UCK2의 증가된 발현이 종양 세포 또는 조직에서 측정되는 경우 상기 피험자에게 화학식 I의 화합물을 투여함을 또한 포함한다. 실시태양에서, UCK2 발현을, 베타-액틴에 표준화된 UCK2의 단백질 수준을 면역블럿팅함으로써 측정한다. 상기 UCK2는, 상기 UCK2 발현의 양이 소정의 수준에 비해 통계학적 유의수준의 양까지 더 큰 경우 증가된 발현 수준을 갖는 것으로 간주된다. 따라서, 상기 증가는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상, 또는 25% 이상까지일 수 있다. 실시태양에서, 상기 소정의 수준은 비-종양 세포상에서의 UCK2 발현의 수준일 수 있다. 실시태양에서, 상기 소정의 수준은 상기 피험자의 비-종양 세포상에서의 UCK2 발현의 수준일 수 있다.
실시태양에서, 상기 피험자는 포유동물이다. 다른 실시태양에서, 상기 피험자는 인간이다.
실시태양에서, 상기 종양 세포는 폐암 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 종양 세포는 비-소세포 폐암 세포이다.
종양의 치료 또는 예방 방법
본 명세의 또 다른 태양은 종양의 치료 또는 예방이 필요한 피험자에게 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 경구 투여형을 약 300 내지 2,000 ㎎/일의 투여량으로 투여하는 단계에 의해 상기 종양을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다:
화학식 I
Figure pct00008
다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 400 내지 800 ㎎/일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 500 내지 700 ㎎/일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 300 ㎎/일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 400 ㎎/일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 500 ㎎/일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 600 ㎎/일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 700 ㎎/일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 800 ㎎/일이다.
약 300 내지 2,000 ㎎/일의 투여량은 약 60 내지 80 ㎏의 체중 또는 체질량을 갖는 성인 인간을 기준으로 한다. 따라서, 상기 투여량 범위는 약 5 내지 33 ㎎/㎏/일일 수 있다. 피험자 체중을 기준으로 하는 추가적인 투여량을 상기 값들로부터 쉽게 계산할 수 있다. 유사하게, 당해 분야의 숙련가는 인간 투여량에 대한 공지된 상관성을 토대로 다른 종들에 대한 투여량을 계산할 수 있을 것이다.
실시태양에서, 상기 경구 투여형을 주당 3 내지 7일 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 주당 4 내지 7일 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 주당 5 내지 7일 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 주당 5 또는 7일 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 주당 3일 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 주당 4일 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 주당 5일 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 주당 6일 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 주당 7일 투여한다.
실시태양에서, 전체 1일 용량을 1회 이상의 용량으로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 매일 1회 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 매일 2회 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 매일 3회 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 매일 4회 투여한다.
실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 20,000 ㎎/개월 이하의 투여량으로 투여한다. 전체 매월 용량을, 3주 동안에 이어서 1주일 휴식("중단") 또는 휴식 없이 4주 동안 주당 1 내지 7일 투여할 수 있다. 각 치료 주일 동안, 상기 경구 투여형을 주당 1 내지 7일 투여할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 3주 동안에 이어서 1주일 휴식으로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 3주 동안에 이어서 1주일 휴식으로 주당 3 내지 7일 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 3주 동안에 이어서 1주일 휴식으로 주당 5 내지 7일 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 3주 동안에 이어서 1주일 휴식으로 매일 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 28일 동안 매일 투여한다. 각 투여 주기는 3주 치료에 이어서 1주 휴식, 또는 4 연속/계속 치료 주일로 이루어진다. 상기 투여 주기를 당해 분야의 숙련가에 의해 판정되는 바와 같이 필요한 만큼 종종 반복할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 12 투여 주기 이하 동안 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 6 투여 주기 이하 동안 투여한다.
실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 300 내지 2,000 ㎎/주당 5 내지 7일의 투여량으로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 400 내지 800 ㎎/주당 5 내지 7일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 500 내지 700 ㎎/주당 5 내지 7일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 500 내지 700 ㎎/주당 5 또는 7일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 500 ㎎/주당 5일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 500 ㎎/주당 7일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 600 ㎎/주당 5일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 600 ㎎/주당 7일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 700 ㎎/주당 5일이다. 다른 실시태양에서, 상기 투여량은 약 70 ㎎/주당 7일이다.
실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 400 ㎎/주당 5일로 매일 1회 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 500 ㎎/주당 5일로 매일 1회 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 600 ㎎/주당 5일로 매일 1회 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 700 ㎎/주당 5일로 매일 1회 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 800 ㎎/주당 5일로 매일 1회 투여한다.
실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 400 ㎎/주당 7일로 매일 1회 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 500 ㎎/주당 7일로 매일 1회 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 600 ㎎/주당 7일로 매일 1회 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 700 ㎎/주당 7일로 매일 1회 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 800 ㎎/주당 7일로 매일 1회 투여한다.
실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 3 내지 35 ㎎/㎏/주당 5 내지 7일로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 3 내지 35 ㎎/㎏/주당 5일로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 3 내지 35 ㎎/㎏/주당 6일로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 3 내지 35 ㎎/㎏/주당 7일로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 6 내지 12 ㎎/㎏/주당 5 내지 7일로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 6 내지 12 ㎎/㎏/주당 5일로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 6 내지 12 ㎎/㎏/주당 6일로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 약 6 내지 12 ㎎/㎏/주당 7일로 투여한다.
일부 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 고체이다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 정제이다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 캡슐이다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 즉시 방출이다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 연장된 방출이다.
실시태양에서, 상기 경구 투여형을 피험자가 적어도 약 8시간 동안 음식물을 금식한 후에 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 피험자는 투여 후 적어도 약 1시간 동안 음식물을 계속 금식한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형을 상기 피험자에게 음식물과 함께 투여한다.
실시태양에서, 화학식 I의 화합물을 일수화물로서 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 화학식 I의 화합물을 용매화물, 수화물 및 염 없이 투여한다.
실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 3 내지 20시간의 T½을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 5 내지 10시간의 T½을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 6 내지 9시간의 T½을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 9 내지 11시간의 T½을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 6 내지 7시간의 T½을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 6시간의 T½을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 7시간의 T½을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 8시간의 T½을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 9시간의 T½을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 10시간의 T½을 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 11시간의 T½을 제공한다.
실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 2 내지 6시간의 Tmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 4 내지 6시간의 Tmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 2 내지 4시간의 Tmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 2시간의 Tmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 3시간의 Tmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 4시간의 Tmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 5시간의 Tmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 6시간의 Tmax를 제공한다.
실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 30 내지 3,000 ng/㎖의 Cmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 600 내지 2,000 ng/㎖의 Cmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 700 내지 1,500 ng/㎖의 Cmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 600 내지 1,100 ng/㎖의 Cmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 700 내지 1,100 ng/㎖의 Cmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 600 내지 700 ng/㎖의 Cmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 700 내지 800 ng/㎖의 Cmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 800 내지 900 ng/㎖의 Cmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 900 내지 1,000 ng/㎖의 Cmax를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 1,000 내지 1,100 ng/㎖의 Cmax를 제공한다.
실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 200 내지 18,000 hr·ng/㎖의 AUC0-t(0-24시간)를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 7,000 내지 14,000 hr·ng/㎖의 AUC0-t(0-24시간)를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 8,000 내지 12,000 hr·ng/㎖의 AUC0-t(0-24시간)를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 8,000 내지 10,000 hr·ng/㎖의 AUC0-t(0-24시간)를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 8,000 내지 9,000 hr·ng/㎖의 AUC0-t(0-24시간)를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 9,000 내지 10,000 hr·ng/㎖의 AUC0-t(0-24시간)를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 10,000 내지 11,000 hr·ng/㎖의 AUC0-t(0-24시간)를 제공한다. 다른 실시태양에서, 상기 경구 투여형은 단일 투여후 약 11,000 내지 12,000 hr·ng/㎖의 AUC0-t(0-24시간)를 제공한다.
실시태양에서, 상기 종양은 난소암; 전이성 유방암; 췌장의 선암종; 위장암, 예를 들어 결장직장 선암종 또는 식도, 위, 췌장, 소장, 간담즙성관, 결장, 직장 또는 항문의 암; 방광암, 예를 들어 전이성 방광암, 근육 침습성 방광암 또는 비-근육 침습성 방광암; 자궁경부암; 폐암; 비-소세포 폐암; 또는 신세포 암종이다. 다른 실시태양에서, 상기 종양은 췌장, 방광 또는 결장직장암이다. 다른 실시태양에서, 상기 종양은 췌장암이다. 다른 실시태양에서, 상기 암은 방광암이다. 다른 실시태양에서, 상기 암은 결장직장암이다. 다른 실시태양에서, 상기 암은 결장암이다. 다른 실시태양에서, 상기 암은 직장암이다. 다른 실시태양에서, 상기 종양은 비-소세포 폐암이고, 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 시스플라틴과 함께 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 종양은 젬시타빈에 내성이다. 문헌[Yang et al., Anticancer Research, 34:6951-6960 (2014)](다양한 이종이식편 모델에서, 심지어 젬시타빈에 내성인 종양에서조차 RX-3117의 효능을 보인다)을 참조하시오.
실시태양에서, 상기 피험자는 포유동물이다. 다른 실시태양에서, 상기 피험자는 인간이다.
치료 효능을 시험하기 위한 키트
본 명세의 또 다른 태양은 종양 세포의 샘플 중 단백질 키나제, p53 또는 UCK2 발현 수준 중 하나를 측정하는 분석을 사용하는, 종양의 치료에서 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 잠재적인 효능을 시험하기 위한 키트를 제공한다:
화학식 I
Figure pct00009
실시태양에서, 상기 키트는 종양 세포의 샘플 중 단백질 Cdc25C 또는 p-Cdc25C 발현 수준을 측정하는 분석을 또한 포함한다.
임의의 실시태양에서, 상기 종양 세포는 폐암 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 종양 세포는 비-소세포 폐암 세포이다. 다른 실시태양에서, 상기 종양 세포는 췌장암 세포 또는 방광암 세포이다.
약학 조성물
본 명세서에 제공된 방법 및 키트 중 어느 하나에서, 화학식 I의 화합물은 약학 조성물 중에 있을 수 있다. 상기와 같은 약학 조성물을 임의의 적합한 단위 투여형으로서 제조할 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물을 하기에 적합한 것들을 포함하여, 고체 또는 액체 형태로 투여하기 위해 제형화할 수 있다: (1) 경구 투여, 예를 들어 관주제, 정제(예를 들어 오버-캡슐화 정제를 포함하여, 구강, 설하 및 전신 흡수용으로 표적화된 것들), 캡슐(예를 들어 건조 충전된, 경질 젤라틴, 연질 젤라틴 또는 오버-캡슐화 캡슐), 캐플릿, 환괴, 분말, 사쉐, 과립, 페이스트, 구강 스프레이, 트로키제, 로젠지, 펠릿, 시럽, 현탁제, 엘릭서, 액체, 리포솜, 유화액 및 미세유화액; 또는 (2) 예를 들어 멸균 용액 또는 현탁액으로서, 예를 들어 피하, 근육내, 정맥내 또는 경막외 주사에 의한 비경구 투여. 추가로, 상기 약학 조성물을 즉시, 지속된, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출용으로 제형화할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 경구 투여용으로 제형화한다. 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 정제 또는 캡슐 형태 중에 존재한다. 다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 정제 형태 중에 존재한다. 다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 캡슐 형태 중에 존재한다. 다른 실시태양에서, 상기 정제 또는 캡슐을 즉시 방출용으로 제형화한다. 다른 실시태양에서, 상기 정제 또는 캡슐을 지속된, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출용으로 제형화한다.
정제를, 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압착 또는 성형에 의해 제조할 수 있다. 압착 정제를, 적합한 기계에서 화합물 I을, 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 표면-활성 또는 분산제와 함께 자유 유동 형태, 예를 들어 분말 또는 과립으로 압착시킴으로써 제조할 수 있다. 성형된 정제를, 적합한 기계에서 불활성 액체 희석제로 축축하게 한 분말화된 화합물의 혼합물을 성형함으로써 제조할 수 있다. 상기 정제를 임의로 코팅하거나 금을 새길 수 있으며 화합물 I의 지속된, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출을 제공하기 위해 제형화할 수 있다. 상기와 같은 지속된, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출 조성물의 제형화 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 허여된 미국특허, 예를 들어 비제한적으로 미국특허 제 4,369,174; 4,842,866 호; 및 상기 중에 인용된 참고문헌들에 개시되어 있다. 코팅제를 화합물의 장으로의 전달에 사용할 수 있다(예를 들어 미국특허 제 6,638,534; 5,217,720; 6,569,457 호; 및 상기 중에 인용된 참고문헌들을 참조하시오). 정제 외에, 다른 투여형들, 예를 들어 캡슐, 과립 및 젤-캡을, 화합물 I의 지속된, 연장된, 지연된 또는 조절된 방출을 제공하기 위해 제형화할 수 있다.
실시태양에서, 상기 약학 조성물을 비경구 투여용으로 제형화한다. 비경구 투여에 적합한 약학 조성물의 예는 수성 멸균 주사액 및 비-수성 멸균 주사액(이들은 각각 예를 들어 산화방지제, 완충제, 세균발육저지제 및/또는 제형을 목적하는 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유한다); 및 수성 멸균 현탁액 및 비-수성 멸균 현탁액(이들은 각각 현탁제 및/또는 증점제를 함유한다)을 포함한다. 상기 제형을 단위-용량 또는 수회-용량 용기, 예를 들어 밀폐된 앰풀 또는 바이알 중에서 제공할 수 있으며, 동결 건조된(동결건조된) 상태(사용 직전에 단지 멸균 액체 담체, 예를 들어 물의 첨가만을 필요로 한다)로 보관할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 약학 조성물을 정맥내 투여용으로 제형화한다.
실시태양에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 부형제를 또한 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는, 그 자체가 치료제가 아닌, 치료제를 환자에게 전달하기 위한, 또는 약학 조성물에 가하여 그의 취급 또는 저장 성질을 개선시키거나 화합물 또는 약학 조성물을 투여를 위해 단위 투여형으로 형성시키는 것을 용이하게 하기 위한 담체, 희석제, 보조제, 결합제 및/또는 비히클로서 사용되는 임의의 물질일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는 약학 분야에 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed. (Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2005)]에 개시되어 있다. 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 바와 같이, 약학적으로 허용 가능한 부형제는 다양한 기능을 제공할 수 있으며 습윤제, 완충제, 현탁제, 윤활제, 유화제, 붕해제, 흡수제, 보존제, 계면활성제, 착색제, 풍미제, 및 감미제로서 기재될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제의 예는 비제한적으로 (1) 당, 예를 들어 락토스, 글루코스 및 슈크로스; (2) 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 그의 유도체, 예를 들어 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 및 하이드록시프로필셀룰로스; (4) 분말화된 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 활석; (8) 부형제, 예를 들어 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예를 들어 땅콩 오일, 면실유, 잇꽃유, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 대두 오일; (10) 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예를 들어 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예를 들어 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 아가; (14) 완충제, 예를 들어 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열물질 제거수; (17) 등장성 염수; (18) 링거액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충된 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카보네이트 및/또는 다중무수물; 및 (22) 약학 제형에 사용되는 다른 무독성 상용성 물질을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 RX-3117 외에 적어도 하나의 활성제를 또한 포함한다. 상기 활성제는 항신생물제, 화학요법제, 세포독성제, 방사선요법제(외부 방사선조사 요법, 내부 방사선요법, 또는 전신 방사선요법), 또는 세포자멸을 유도하거나, 세포를 세포자멸에 감작시키거나, 단백질 키나제를 조절하거나 신생물, 종양 또는 암을 치료할 수 있는 임의의 다른 작용제일 수 있다. 상기 활성제의 예는 (1) 대사길항물질, 예를 들어 시타라빈, 플루다라빈, 5-플루오로-2'-데옥시유리딘, 젬시타빈, 하이드록시우레아 또는 메토트렉세이트; (2) DNA-단편화제, 예를 들어 블레오마이신, (3) DNA-가교결합제, 예를 들어 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드 및 질소 머스터드; (4) 삽입성 물질, 예를 들어 아드리아마이신(독소루비신) 및 미톡산트론; (5) 단백질 합성 억제제, 예를 들어 L-아스파라기나제, 사이클로헥시미드, 퓨로마이신 및 디프테리아 독소; (6) 국소이성화효소 I 독, 예를 들어 캄토테신 및 토포테칸; (7) 국소이성화효소 II 독, 예를 들어 에토포시드(VP-16) 및 테니포시드; (8) 미세소관-지향제, 예를 들어 콜세미드, 콜히친, 패클리탁셀, 빈블라스틴 및 빈크리스틴; (9) 키나제 억제제, 예를 들어 플라보피리돌, 스타우로스포린 및 7-하이드록시스타우로스포린; (10) 폴리페놀, 예를 들어 퀘르세틴, 레스베라트롤, 피세아타놀, 에피갈로카테킨 갈레이트, 테아플라빈, 플라바놀, 프로시아니딘, 테불린산 및 그의 유도체; (11) 호르몬, 예를 들어 글루코코르티코이드 및 펜레티니드; (12) 호르몬 길항물질, 예를 들어 타목시펜, 피나스테라이드 및 LHRH 길항물질; 및 (13) 사멸수용체 작용물질, 예를 들어 종양괴사인자 α(TNF-α), 종양괴사인자 β(TNF-β), LT-β(림포톡신-β), TRAIL(Apo2L, DR4 리간드), CD95(Fas, APO-1) 리간드, TRAMP(DR3, Apo-3) 리간드, DR6 리간드 및 그의 단편 및 유도체를 포함한다.
실시태양에서, 상기 약학 조성물 중 화학식 I의 화합물 또는 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 양은 약 0.1 내지 약 100 중량%이다. 다른 실시태양에서, 상기 량은 약 0.5 내지 약 99.5 중량%이다. 다른 실시태양에서, 상기 량은 약 10 내지 약 95 중량%이다. 다른 실시태양에서, 상기 량은 약 15 내지 약 90 중량%이다. 다른 실시태양에서, 상기 량은 약 80 내지 약 90 중량%이다. 다른 실시태양에서, 상기 량은 약 80 내지 약 85 중량%이다. 다른 실시태양에서, 상기 량은 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 또는 적어도 80%이다. 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 경구 투여형이다. 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 정제이다.
투여 방법
본 명세서에 제공된 방법들 중 어느 하나에서, 상기 화합물 또는 약학 조성물의 투여는 당해 분야에 공지된 임의의 허용된 방식을 통해서, 예를 들어 경구적으로 또는 비경구적으로일 수 있다. "비경구적으로"란 용어는 비제한적으로 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 방광내, 경막내, 심실내, 흉골내, 두개내, 골내 주사 및 주입 기법에 의함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 화합물 또는 약학 조성물을 경구로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 화합물 또는 약학 조성물을 비경구로 투여한다. 다른 실시태양에서, 상기 화합물 또는 약학 조성물을 정맥내로 투여한다.
하나의 실시태양에서, 상기 화합물 또는 약학 조성물을 본 명세서에 개시된 바와 같은, 예를 들어 상기 종양의 치료 또는 예방 방법에 개시된 바와 같은 용량 또는 투여량으로 경구 투여한다. 본 명세서에 개시된 방법들 중 어느 하나에서, 상기 화합물 또는 약학 조성물을 체중 기준 용량을 기준으로 투여할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 유효량은 약 0.01 내지 약 100 ㎎/㎏/일 또는 약 3 내지 약 35 ㎎/㎏/일이다. 실시태양에서, 상기 유효량은 약 6 내지 12 ㎎/㎏/일이다.
상기 용량 수준을 정맥내 투여를 위해 조절할 수 있다. 상기와 같은 경우에, 상기 화합물 또는 약학 조성물을 약 0.01 ㎍/㎏/분 내지 약 100 ㎍/㎏/분의 양으로 투여할 수 있다.
복합 요법
본 명세서에 제공된 종양의 치료 또는 예방 방법들 중 어느 하나에서, 상기 방법은 RX-3117을 하나 이상의 추가적인 항-종양제 또는 방사선과 함께 피험자에게 투여함을 또한 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 방사선을 상기 피험자에게 투여함을 또한 포함한다. 다른 실시태양에서, 상기 방법은 하나 이상의 추가적인 항-종양제를 상기 피험자에게 투여함을 또한 포함한다.
상기 추가적인 항-종양제 또는 방사선을 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 투여 전, 상기 투여 후 또는 상기 투여 중에 투여할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 상기 추가적인 항-종양제 또는 방사선을 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 투여 전에 투여할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 추가적인 항-종양제 또는 방사선을 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 투여 후에 투여할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 추가적인 항-종양제 또는 방사선을 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염의 투여 중에 투여할 수 있다. 다른 실시태양에서, 상기 추가적인 항-종양제 및 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 동반 투여용 약학 조성물로 제형화한다.
방사선감작 효과
RX-3117의 방사선감작 효과를 A2780 난소암 세포 및 NSCLC 세포주에서 연구하였다. RX-3117은 스케줄 의존적인 방사선감작 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다(그러나 오직 배양전에만)(용량 변형 인자: 1.4-1.8)(펄스 및 분할 조사에서 관찰됨). 방사선감작은 또한 3-차원 회전타원체 모델에서 관찰되었다. 낮은 방사선감작 농도에서, RX-3117은 방사선과 함께 S-기의 세포 축적을 유도하였으며, p-Chk2 및 p-cdc25C와 같은 모든 세포주기 단백질의 증가를 동반하였다. 또한, RX-3117은 DNA 손상으로 인한 세포 살해를 유발하였다. 결론적으로, 시험관내 실험은 RX-3117의 방사선감작 효과를 나타내었다.
폐암 환자는 표준적으로는 수술로 치료될 것이며 질병이 진행된 환자는 화학요법을 받는다(Baas P, Belderbos JSA, Senan S, Kwa HB, van Bochove A, van Tinteren H, Burgers JA and van Meerbeeck JP: Concurrent chemotherapy (carboplatin, paclitaxel, etoposide) and involved-field radiotherapy in limited stage small cell lung cancer: a Dutch multicenter phase II study. Br J Cancer 94: 625-30, 2006). 시티딘 유사체, 젬시타빈 및 시스플라틴의 조합이 임상에서 상기 질병의 치료에 사용되고 있다(El-Naggar M, Ebbing E, Bijnsdorp I, van den Berg J and Peters GJ: Radiosensitization by thymidine phosphorylase inhibitor in thymidine phosphorylase negative and overexpressing bladder cancer cell lines. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 33: 413-21, 2014). 그러나, 내성이 제한 인자이며, 따라서 상기 내성 기전을 우회하고 이상적으로는 유효한 복합 성질을 나타내는 신규의 약물이 필요하다.
RX-3117 작용 기전
RX-3117은 시티딘의 유사체이다(도 14). 상기는 산소 및 이중 결합 대신에 탄소-불소 결합으로 이루어지는 리보스 분자상의 변형을 갖는다((Choi WJ, Chung H-J, Chandra G, Alexander V, Zhao LX, Lee HW, Nayak A, Majik MS, Kim HO, Kim J-H, Lee YB, Ahn CH, Lee SK and Jeong LS: Fluorocyclopentenyl-cytosine with broad spectrum and potent antitumor activity. J Med Chem 55: 4521-5, 2012). 도 21에 나타낸 바와 같이, RX-3117은 인간 평형 뉴클레오시드 수송자(hENT)를 통해 세포에 진입한다(Peters GJ, Smid K, Vecchi L, Kathmann I, Sarkisjan D, Honeywell RJ, Losekoot N, Ohne O, Orbach A, Blaugrund E, Jeong LS, Lee YB, Ahn C-H and Kim DJ: Metabolism, mechanism of action and sensitivity profile of fluorocyclopentenylcytosine (RX-3117). Invest New Drugs 31: 1444-57, 2013). 세포에서 RX-3117은 유리딘/시티딘 키나제 2(UCK2)에 의해 그의 모노포스페이트 형태로 인산화된다, 즉 RX-3117은 UCK2에 의해 RX-3117 MP로 활성화된다. RX-3117 트리-포스페이트(RX-3117 TP)는 RNA에 통합된다. 그의 RX-3117 디포스페이트(RX-3117 DP)는 DNA에 통합되기 전에 리보뉴클레오티드 리덕타제(RR)에 의해 데옥시-디-포스페이트(dRX-3117 DP)로 환원된다. RX-3117은 시티딘 데아미나제(CDA)에 대해 불량한 기질이다(상기 동일). 젬시타빈 내성 마우스 모델에서 RX-3117에 의한 효능 있는 종양 성장 억제가 최근에 입증되었다(Yang MY, Lee YB, Ahn C-H, Kaye J, Fine T, Kashi R, Ohne O, Smid K, Peters GJ and Kim DJ: A novel cytidine analog, RX-3117, shows potent efficacy in xenograft models, even in tumors that are resistant to gemcitabine. Anticancer Res 34: 6951-9, 2014). RX-3117의 방사선감작 효과가 조사되었으며 결과를 하기에 나타낸다.
RX-3117은 다른 유사체, 예를 들어 젬시타빈 및 아자시티딘(이들은 임상에서 광범위하게 사용되고 있다)과 유사한, 피리미딘 유사체(Peters GJ: Novel developments in the use of antimetabolites. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 33: 358-74, 2014)로서 분류된다. 젬시타빈은 효능있는 방사선감작제로, 이온화 유도된 DNA 손상 수복을 증가시킨다(Morgan M a, Parsels L a, Maybaum J and Lawrence TS: Improving gemcitabine-mediated radiosensitization using molecularly targeted therapy: a review. Clin Cancer Res 14: 6744-50, 2008).
또한, 시티딘 유사체 5-아자시티딘(아자-C, 비다자(Vidaza(상표)) 및 5-아자-2'-데옥시-시티딘(데시타빈, 다코젠(Dacogen)(등록상표))이 골수이형성증후군(MDS)의 치료를 위해 임상에서 사용되고 있다(Peters GJ: Novel developments in the use of antimetabolites. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 33: 358-74, 2014). 이들 약물의 항-종양 효과의 2개의 주요 기전은 DNA 메틸트랜스퍼라제(DNMT) 억제 및 RNA 및/또는 DNA에의 세포독성 통합이다(Kaminskas E, Farrell A, Abraham S, Baird A, Hsieh L-S, Lee S-L, Leighton JK, Patel H, Rahman A, Sridhara R, Wang Y-C and Pazdur R: Approval summary: azacitidine for treatment of myelodysplastic syndrome subtypes. Clin Cancer Res 11: 3604-8, 2005). 아자-C는 세포내로 흡수 후에 UCK2에 의해 5-아자시티딘 모노포스페이트(아자-CMP)로, 및 피리미딘 뉴클레오티드 키나제에 의해 아자-CDP 및 아자-CTP로 인산화된다. 그러나, 아자-C는 CDA에 의한 데아민화에 의해 불활성화된다. RR은 아자-CDP를 아자-dCDP로 환원시키고, 상기 아자-dCDP는 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제에 의해 아자-dCTP로 인산화된다. 이어서 아자-dCTP는 DNA내로 통합되어, DNA 합성 억제를 생성시킨다(Vesely J: Mode of action and effects of 5-azacytidine and of its derivatives in eukaryotic cells. Pharmacol Ther 28: 227-35, 1985). 아자-dCTP와 DNMT와의 화학량론적 결합은 DNA 저메틸화를 생성시킬 것이다(Jones PA: Effects of 5-azacytidine and its 2'-deoxyderivative on cell differentiation and DNA methylation. Pharmacol Ther 28: 17-27, 1985). Aza-dCTP는 또한 데옥시시티딘 키나제(dCK) 및 뉴클레오티드 키나제에 의해 촉매화된 직접적인 인산화에 의해 5-아자-2'-데옥시시티딘으로부터 형성될 수 있다. CpG 섬에서의 DNA 고메틸화가 MDS를 포함한 상이한 암에서 기재되었다(Kaminskas E, Farrell A, Abraham S, Baird A, Hsieh L-S, Lee S-L, Leighton JK, Patel H, Rahman A, Sridhara R, Wang Y-C and Pazdur R: Approval summary: azacitidine for treatment of myelodysplastic syndrome subtypes. Clin Cancer Res 11: 3604-8, 2005). 다른 한편으로, 아자-CTP는 세포질 및 핵 RNA 단백질 합성의 RNA 붕괴 대사내로 통합된다(Glover AB and Leyland-Jones B: Biochemistry of azacitidine: a review. Cancer Treat Rep 71: 959-64, 1987). 아자시티딘에 대한 내성의 한 기전은 UCK2 유전자 중의 점 돌연변이이며, 이는 불활성 대사산물을 생성시킨다(Sripayap P, Nagai T, Uesawa M, Kobayashi H, Tsukahara T, Ohmine K, Muroi K and Ozawa K: Mechanisms of resistance to azacitidine in human leukemia cell lines. Exp Hematol 42: 294-306.e2, 2014). 아자-dCTP에 대한 내성에 근원하는 기전은 dCK의 결함이다(Peters GJ: Novel developments in the use of antimetabolites. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids 33: 358-74, 2014).
도 22에 나타낸 바와 같이, RX-3117은 또한 DNMT1을 하향조절할 수 있지만(Peters GJ, Smid K, Vecchi L, Kathmann I, Sarkisjan D, Honeywell RJ, Losekoot N, Ohne O, Orbach A, Blaugrund E, Jeong LS, Lee YB, Ahn C-H and Kim DJ: Metabolism, mechanism of action and sensitivity profile of fluorocyclopentenylcytosine (RX-3117). Invest New Drugs 31: 1444-57, 2013), 아자-C와 상이하게 작용하는 것처럼 보인다. 더욱 또한, 다수의 시티딘 유사체(전부는 아니지만)가 방사선감작 효과를 나타낸다. 따라서 RX-3117의 잠재적인 방사선감작 효과뿐만 아니라 잠재적인 기전, 예를 들어 세포주기 효과 및 세포 살해를 평가하였다. RX-3117은 상응하게 방사선감작 효과를 갖는 것으로 나타났다.
RX-3117과의 예비-배양이 최선의 방사선감작 효과를 가졌으며 시험된 5개의 세포주 중 4개가 RX-3117에 의해 감작되었다. 젬시타빈 내성 SW1573/G-는 RX-3117에 의해 감작되었으며 그의 야생형과 거의 동일한 효능을 가졌다. RX-3117은 또한 2개의 회전타원체 모델에서 방사선감작 효과를 나타내었다.
뉴클레오시드 유사체는 방사선조사 유도된 세포 살해를 증대시키는 것으로 나타났다(Shewach DS and Lawrence TS: Antimetabolite radiosensitizers. J Clin Oncol 25: 4043-50, 2007.). 상기 방사선감작 효과는 데옥시리보뉴클레오티드 생합성(DNA 복제에 필요하다) 또는 DNA 폴리머라제를 표적화함으로써 수행되는 것으로 생각된다(Shewach DS and Lawrence TS: Antimetabolite radiosensitizers. J Clin Oncol 25: 4043-50, 2007; Lawrence TS, Blackstock AW and McGinn C: The mechanism of action of radiosensitization of conventional chemotherapeutic agents. Semin Radiat Oncol 13: 13-21, 2003). 데옥시뉴클레오티드 풀 조절해제의 일례는 TS 억제제 5-플루오로-2'-데옥시유리딘(FdUrd)이다. TS 억제제는 데옥시뉴클레오티드 풀 불균형을 야기하여 DNA 합성 억제 및 S기 정지를 생성시킨다(Hwang HS, Davis TW, Houghton J a and Kinsella TJ: Radiosensitivity of thymidylate synthase-deficient human tumor cells is affected by progression through the G1 restriction point into S-phase: implications for fluoropyrimidine radiosensitization. Cancer Res 60: 92-100, 2000). 데옥시뉴클레오티드 풀의 불균형은 올바르지 않은 뉴클레오티드의 통합을 야기한다(Ingraham HA, Tseng BY and Goulian M: Nucleotide levels and incorporation of 5-fluorouracil and uracil into DNA of cells treated with 5-fluorodeoxyuridine. Mol Pharmacol 21: 211-6, 1982). 방사선감작 효과를 성취하기 위해 필요한 농도는 반드시 세포독성 효과에 필요한 농도는 아니다. 보다 낮은 농도의 약물이 상기 방사선감작을 확립시킬 수 있다(Hwang HS, Davis TW, Houghton J a and Kinsella TJ: Radiosensitivity of thymidylate synthase-deficient human tumor cells is affected by progression through the G1 restriction point into S-phase: implications for fluoropyrimidine radiosensitization. Cancer Res 60: 92-100, 2000). 저용량 RX-3117이 클론형성 분석, 3-차원 모델 및 분할조사 스케줄에서 방사선감작 효과를 유도하였다. 또한, RX-3117에 의해 유도된 이중가닥 DNA 파손은 용량 의존적이었다.
RX-3117은 5개의 세포주 중 4개에서 효능있는 스케줄 의존성 방사선감작제인 것으로 나타났으며, NSCLC에서 복합 치료가 고려되는 임상 용도에 대해 가능성을 갖는다. 상기 복합 치료를 다른 종양 유형(예를 들어 전립선, 피부, 두경부, 인후, 후두, 유방, 뇌, 결장직장, 뼈, 백혈병, 난소 및 자궁암)에 적용할 수 있다.
RX-3117의 제조 방법의 개선
미국특허 제 7,405,214 호는 D-리보스로부터 RX-3117의 11-단계 합성을 개시한다. 상기 합성은 대규모 플랜트 생산에서 실행하기에 도전이 되는 값비싼 촉매를 사용한다. 미국특허 제 9,150,520 호는 상기 합성을 개선시켰으며 (3R,4R,6aR)-3급-부틸-(5-플루오로-2,2-디메틸-6-트리틸옥시메틸-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[1,3]디옥솔-4-일옥시)디페닐실란(ASM11)에서 4-아미노-1-(3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(INT14)으로의 RX-3117의 보다 짧은 제조 경로를 개시한다. 그러나, ASM11에서 INT14로의 종래의 합성은 각 단계에서 중간체를 단리할 것을 요하였다. 따라서, 상기 방법은, 특히 상업적인 제조를 위해 규모를 확대시키는 경우 비용 및 시간 제약을 제기한다.
본 발명은 대규모 생산에 상업적으로 귀중한 RX-3117의 개선된 제조 공정을 제공한다. 상기 공정은 각각의 중간체 물질을 단리할 필요 없이 ASM11에서 INT14로의 합성을 단축시키며, 이에 의해 효율을 개선시키면서 비용을 감소시킨다. 보다 구체적으로, 본 발명은 3개의 단계를 갖는 연속 공정을 제공하여 ASM11에서 INT14로의 합성을 단축시킨다. 본 발명은 또한 고정된 용기에서 RX-3117 일수화물(RX-3117-MH)을 제공하여 제조 비용을 현저하게 감소시키는 공정을 제공한다. 3개의 단계를 단일 단계로 단축시킴으로써, 본 발명의 공정은 중간체를 잔사로 농축시킬 필요성을 제거한다. 이러한 개선은 시약 치환시의 뜻밖의 이점을 기반으로 하며, 이는 당해 분야의 숙련가에게 쉽게 자명하지 않다.
더욱 또한, 본 발명은 단계 3(여기에서 시토신을 (3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일 메탄설포네이트)(INT13)에 가하여 INT14를 제조한다)에서 질소 대 산소(N/O) 선택성을 증가시키기에 최적화된 반응 및 단리 조건을 제공한다. 상기 개선된 공정에서, 상기 N- 대 O-이성질체의 비가 88:12의 앞서 최적화된 값으로부터 99.03:0.97로 개선되었다. 본 발명의 고정된 용기 제조 공정은 일수화물 형태의 목적하는 생성물의 규모 확대된 제조 공정의 비용 이점을 성취한다.
하기 반응식 1은 RX-3117MH의 개선된 제조 공정을 예시한다.
[반응식 1]
Figure pct00010
단계 1 - INT12를 형성하기 위한 ASM11의 탈보호에 대한 공정 개선
상기 공정의 단계 1에서, 2-메틸-테트라하이드로푸란을 공정 용매로서 사용하였다. 상기 변형은 중간체 (3aS,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-올(INT12)을 농축시킬 필요 없이 후처리를 수행할 수 있게 하고 메틸 3급-부틸 에테르(MTBE)로의 상기 중간체의 용매 교환(이는 종래 공정에서 사용되었다)을 피할 수 있게 한다.
또한, 반응 공정 제어(IPC)를 TLC를 사용하는 것으로부터 정량적인 1H NMR 방법으로 변화시켰다. 상기 공정을, 화학적 건조 대신에 수분의 공비증류 제거를 사용함으로써 추가로 최적화시켰다. 상기 공정 용매로서 2-메틸-테트라하이드로푸란의 사용은 용액 중 INT12를 추가의 단리 또는 정제 없이 상기 공정의 단계 2에 직접 사용할 수 있게 하였다.
단계 2 - INT13을 형성하기 위한 INT12의 메실화에 대한 공정 개선
2-메틸-테트라하이드로푸란 중 INT12의 용액을 단계 2로 바로 단축시켜 (3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일 메탄설포네이트(INT13)를 제조하였다. 상기 개선된 공정은 반응 용매로서 환경적으로 바람직하지 못한 디클로로메탄의 사용을 제거하였다. 더욱 또한, 상기 공정은 염화 암모늄 세척을 사용하여 잔류 트리에틸 아민을 추가로 조절하였다. 후처리 부피를 14 부피로부터의 감소인 12.5 부피에서 최대 공정 부피로 감소시켰다. 다시, 화학적 건조 대신에 수분의 공비증류 제거를 사용함으로써 상기 공정을 더욱 최적화하였다. 상기 공정 용매로서 2-메틸-테트라하이드로푸란의 사용은 상기 공정의 단계 3에 용액 중 INT13 용액을 직접 사용할 수 있게 하였다.
단계 3 - INT14를 형성하기 위한 INT13에의 시토신의 부가에 대한 공정 개선
2-메틸-테트라하이드로푸란 중 INT13의 용액을 단계 3으로 바로 단축시켜 INT14를 제조하였다. 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 반응 용매로서 유지시켰고 2-메틸-테트라하이드로푸란의 제거를 증류에 의해 수행하였다. 27% w/w의 2-메틸-테트라하이드로푸란 대 생성물의 사양은 단계 3 반응을 잘 수행할 수 있게 하는 것으로 밝혀졌다. 발명자들은 염기(무기 및 아민)의 선별을 수행하였으며 세슘 카보네이트가 최고의 화학적-선택성 및 가장 빠른 반응속도를 제공함을 발견하였다. 발명자들은 또한 반응 용매의 선별을 수행하였으며 DMSO가 상기 반응에 가장 적합한 용매임을 발견하였다.
더욱 또한, 발명자들은 INT14의 N- 대 O-이성질체의 선택성에 대한 시약 충전, 온도 및 농도의 영향을 연구하였다. 본 발명의 개선된 공정에 따르면, 상기 N- 대 O-이성질체의 비는, SiO2 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 단리된, 앞서 최적화된 88:12로부터, 용매 추출 및 재결정화/침전을 사용하여 99.03:0.97로 개선되었다. 본 발명의 공정은 컬럼 크로마토그래피의 필요성을 제거하며 또한 99% 이상으로 목적하는 N-이성질체를 제공한다. 특히, 발명자들은 화학적 선택성이 주로 반응 온도에 의해 이행됨을 발견하였다. 특히, 반응 온도의 강하는 생성물로의 전환 속도를 늦추었다. 염기 및 시토신의 충전을 2.0 당량에서 2.5 당량으로 증가시킴으로써 반응 조건을 더욱 개선시켰다. 상기 반응 온도는 40 ℃에서 35 ℃로 감소시켰다. 또한, 후처리 공정을, 22 부피에서 12.5 부피로 전체 공정 부피가 감소하도록 변형시켜 처리율을 개선시켰다. 상기 후처리 용매를 에틸 아세테이트에서 이소프로필 아세테이트로 변화시켜 반응 혼합물이 용매 교환 요구 없이 바로 단리되게 하였다. 상기 후처리 공정을 또한, INT14가 아세트산 처리에 따라 보다 용해성인 것으로 밝혀짐에 따라, 토오토머화로 시작하도록 변형시켰다. 상기 INT14의 단리를, 부피의 감소 및 n-헵탄의 첨가에 앞서 생성물이 이소프로필 아세테이트로부터 높은 부피로 초기에 침전하도록 변형시켰다. 상기 개선은 단리에 앞서 오일링 및 용기에의 부착을 방지하는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 증가된 선택성과 함께 전체적으로 개선된 합성이, 다수의 반응 매개변수들을 동시에 변화시킴으로써 성취되었다. 온도 및 농도의 변형은 N/O 알킬화의 전환율 및 화학적선택성에 양의 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.
단계 4 - 무수 RX-3117을 형성하기 위한 INT14의 탈보호 공정
에탄올 중 2 M HCl의 최초 조건이 생성물에 가장 안정한 것으로 밝혀졌으며 이를 유지시켰다. 그러나, 반응 온도를 60 ℃에서 50 ℃로 감소시켜 용해도를 도움으로써 공정을 개선시켰다. 트리틸 알콜 부산물을 메틸 3급-부틸 에테르(MTBE) 세척을 사용하여 제거하였다. 수성상 중의 생성물을 수지염 방출에 따라 단계 5 단리로 직접 단축시켰다.
단계 5 - RX-3117 일수화물의 단리 공정
RX-3117MH의 용액을 단계 5로 직접 단축시켰다. 상기 과정에 대한 약간의 변형과 함께 병행된 단계 4 및 단계 5는 수율 및 규모에 대한 조작성을 최적화하였다. 상기 RX-3117-MH를 공기 중에서 필터상에서 건조시켰으며, 이는 수 함량을 유지시키면서 아세토니트릴 양을 ICH 지침 아래로 조절하였다. 상기 개선된 공정은 1차 건조에 대한 시간-소요 요구를 제거하고 이어서 생성물을 재-수화시켜 결정성 생성물을 제공하였다. 상기 개선된 공정을 사용하는 단리된 생성물은 (99.83%)의 순도를 가지며, 이는 소량의 상기 생성물의 맞춤 합성과 순도에 있어서 필적할만하였다.
RX-3117의 출발 물질의 제조 공정에 대한 다른 개선
RX-3117의 출발 물질의 합성에 대한 다른 공정 개선이 가능하다. 상이한 중간체 및 보호기를 사용하는 ASM11의 합성을 각각 하기 반응식 2 및 3에 나타낸다.
브로모 중간체에 의한 ASM11의 합성
[반응식 2]
Figure pct00011
미국특허 제 9,150,520 호에서, 요오도포름을 반응 단계 3에 사용하여 RXN-2를 RXN-3으로 전환시켰다. 본 발명에서, 브로모포름 또는 혼합된 브로모-요오도메탄을 사용하여 요오도중간체 대신에 브로모중간체를 제공한다. 상기 브로모중간체는 그의 요오도 유도체보다 더 안정성일 수 있다. 따라서, 전체적인 수율 및 순도가 결과적으로 증가할 수 있다.
5-하이드록실기의 벤질 보호에 의한 ASM11Bn의 합성
[반응식 3]
Figure pct00012
뜻밖에도, 초기 중간체에 놓인 보호기의 변화는 그 과정에서 다수의 단계들의 변형을 요구하지 않으면서 상기 공정에서 나중에 수행된 반응 단계에 극적인 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 단계 2에서 트리틸 보호기를 벤질로 변화시키는 것은 상기 반응의 단계 10에서 플루오르화에 대한 수율을 개선시킬 수 있었다. 상기 개선은 전체적인 과정의 추가적인 변형 없이 수행될 수 있다.
고리 닫힘 복분해에 의한 ASM11의 합성
본 발명의 발명자들은 고리 닫힘 복분해의 사용에 의해 ASM11의 합성 반응식을 개발하였다. 반응식 4에서, 고리 닫힘 복분해 반응을 사용하여 5-원 고리 부분을 형성시킨다. 그럽스 촉매의 루테늄은 회수 가능하며, 이는 폐기물 및 비용을 감소시킴으로써 규모확대 공정을 더욱 개선시킨다.
[반응식 4]
Figure pct00013
고리 닫힘 복분해에 의한 중간체 RXN-6의 합성
중간체 RXN-6의 합성을, RXN-5를 포함하고 5원 고리에 불소 원자를 도입시켜 플루오르화된 RXN-6을 제조함으로써 고리 닫힘 복분해에 의해 수행할 수 있다. 반응식 5에 나타낸 바와 같이, 고리 닫힘 복분해 반응을 사용하여 5-원 고리 부분(플루오로-RXN-6)을 형성시킨다. 반응식 4에서와 같이, 그럽스 촉매의 루테늄은 회수 가능하다.
[반응식 5]
Figure pct00014
에폭시드를 통한 친핵성 플루오르화에 의한 중간체 RXN-6의 합성
에폭시드를 통한 대안의 친핵성 플루오르화에 의한 중간체 RXN-6의 합성을 제공할 수 있다. 반응식 6은 출발 물질 (3aR,6aR)-6-(((3급-부틸디페닐실릴)옥시)메틸)-2,2-디메틸-3a,6a-디하이드로-4H-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-온으로부터의 에폭시드 고리의 형성을 나타낸다. 상기 에폭시드를, 예를 들어 칼륨 플루오라이드를 사용하는 친핵성 플루오르화에 의해 개방시킨다. 대안으로서, 다른 플루오라이드 공급원, 예를 들어 테트라부틸암모늄 플루오라이드를 또한 상기 에폭시드 고리의 개방에 사용할 수 있다. 수분의 제거는 상기 공정에서 어려운 단계이며 대안의 탈수제, 예를 들어 카보메톡시 설파모일 트리에틸암모늄염을 사용하여 변형된 중간체 플루오로-RXN6-TBDPS에 도달할 수 있다.
[반응식 6]
Figure pct00015
알돌 축합에 의한 중간체 RXN6의 합성
중간체 RXN6의 합성을 또한 알돌 축합을 사용하여 5원 고리에 불소 원자를 도입시켜 플루오르화된 RXN-6을 제조함으로써 수행할 수 있다. 반응식 7에 나타낸 바와 같이, 상기 불소 원자를 초기에 도입시켜 RXN6의 플루오르화된 유도체(플루오로-RXN6)를 형성시킨다. 내부 알돌 축합은 제자리에 비닐 불소 부분을 갖는 5-원 고리를 형성시킬 수 있다.
[반응식 7]
Figure pct00016
중간체 플루오로-RXN6의 대안의 합성
중간체 플루오로-RXN-6의 합성을 위한 추가적인 대안을 반응식 8 및 9에 나타낸다. 반응식 8에서, D-리보락톤 1을 포스포네이트 2와 반응시켜 중간체 3을 생성시킴으로써 보다 짧은 경로를 획득한다. 발명자들은 상기 D-리보락톤 유도체 1이 디메틸 플루오로알킬포스포네이트와 쉽게 반응하지 않지만, 디메틸 카브알콕시메틸포스포네이트를 사용하여 보다 양호한 반응성을 획득할 수 있음을 발견하였다. 이어서 중간체 3은 헌즈디커(Hundsdiecker) 요오도데카복실화를 겪어 중간체 4를 형성하고, 이어서 테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드(TBAF)를 사용하여 친핵성 치환을 겪는다.
[반응식 8]
Figure pct00017
반응식 9(하기)는 D-리보락톤 1과 알킬 페닐 설폰 7(친전자성 플루오르화된-시약을 통해 제조된다)과의 반응에 의해 중간체 8을 형성시킴으로써 훨씬 더 짧은 경로를 제공한다. 상기 D-리보락톤 유도체는 플루오로알킬포스포네이트보다 리티오 플루오로알킬 설폰 7과 더 쉽게 반응한다. 상기 중간체 8을 중간체 9로 전환시킬 수 있으며, 상기 중간체 9는 제거를 겪어 F-RXN6을 형성할 것이다. 한편으로, 보다 효율적이지만 보다 값비싼 선택권은 리티오 플루오로알킬 설폰 7 대신에 플루오르화된-테트라졸릴 설폰 10을 사용하는 것이다.
[반응식 9]
Figure pct00018
상이한 키랄 공급원을 사용하는 합성
본 발명의 합성을 또한, 출발 물질로서 상이한 키랄 공급원을 사용함으로써 성취할 수 있다.
반응식 10(하기)에서, (2S,3S,4R,5S,6R)-6-(하이드록시메틸)테트라하이드로-2H-피란-2,3,4,5-테트라올을 대안의 키랄 출발 물질로서 사용하여 ASM-11을 생성시킨다.
[반응식 10]
Figure pct00019
실시예
하기의 실시예는 예시를 목적으로 제공되며 개시된 발명의 요지의 범위를 제한하기 위해 제공되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 세포주 A549, SW1573 및 SW1573/G에 대한 IC50 값은 문헌[Peters et al., "Metabolism, mechanism of action and sensitivity profile of fluorocyclopentenylcytosine (RX-3117)," Investigational New Drugs, December 2013, Vol. 31, No. 6, pp. 1444-1457](http://link.springer.com/article/10.1007/s10637-013-0025-x에서 온라인으로 입수가능하다)에 보고된 바와 같이, 각각 8.3 μM, 13.7 μM 및 7.3 μM이다.
실시예 1: 비-소세포 폐암 세포주에 대한 RX-3117의 효과
인간 비-소세포 폐암(NSCLC) 세포주 A549(선암종), SW1573(폐포성 암종) 및 SW1573/G-(젬시타빈에 내성인 SW1573 세포주) 및 H460(대세포 암종)에서 세포주기 조절 및 세포사에 대한 RX-3117의 효과를 평가하였다. 상기 A549 및 H460 세포주를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(미국 버지니아주 마나사스 소재)으로부터 수득하였다. 요한 판 레인 박사(Dr. Johan van Rijn)로부터 수득한 SW1573 세포주(Keiser et al., Cancer Research, 49:2988-2993 (1989) 참조)가 또한 SW1573/G-에 대한 모 세포주로서 제공되었다. A549, SW1573 및 SW1573/G- 및 H460을 T25 플라스크(그라이너 바이오-원 게엠베하(Greiner Bio-One GmbH), 독일 프리켄하우젠 소재)에서 지수 증식기로 유지시키고 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청(FBS) 1% 스트렙토마이신 및 페니실린 20 mM HEPES가 보충된 둘베코의 최소 필수 배지(DMEM) 또는 RPMI 1640(A549)에서 배양하고 37 ℃ 수 중에서 5% CO2의 포화된 분위기하에 유지시켰다. 세포주기 분포를 위해서, 1.5x105 세포를 T25 플라스크(그라이너 바이오-원 게엠베하)에 시딩하고 72시간 동안 배양하고 그 후에 1 μM의 RX-3117을 가하고 24시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 수확하였다. 상기 처리 후에, 배지를 15 ㎖ 튜브(그라이너 바이오-원 게엠베하)에 수집하였다. 상기 세포를 빙냉 PBS로 세척하고 37 ℃에서 트립신처리하였다(론자(Lonza)). 상기 수집된 배지를 사용하여 상응하는 샘플의 트립신을 불활성화시키고 다시 15 ㎖ 튜브에 수집하였다. 상기 세포를 표준 원심분리 프로그램, 4 ℃ 및 12,000 rpm에서 5분으로 원심분리시켰다. 배지를 제거하고, 펠릿을 1 ㎖ PBS/0.01% BSA로 세척하고, 원심분리시켰다. 상등액 제거 후에, 세포를 1 ㎖의 70% 에탄올로 고정시키고 -20 ℃에서 적어도 24시간 동안 배양하였다. 후속으로, 상기 세포를 원심분리시키고, 1 ㎖ PBS/0.1% BSA로 세척하고, 팔콘 FACS 튜브(BD, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)로 옮겼다. 상기 세포를 원심분리시키고, 상등액을 제거한 다음 상기 샘플에 0.5 ㎍ 프로피디움 요오다이드(PI)(시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 0.1% 삼나트륨 시트레이트(리델-드 핸(Riedel-de Haen), 시그마-알드리치 라보르케미칼린 게엠베하(Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재), 0.1% 트리톤 X-100TM(메르크(Merck)) 및 0.1 ㎎/㎖ RNase(시그마)(PI 용액)를 가하였다. 후속으로, 적어도 15분 동안, 상기 세포를 상기 PI 용액과 함께 얼음상에서 배양하여, 분석을 시작하기 전에 상기 DNA를 염색하였다. 상기 PI 용액으로 염색된 세포를 FACSCalibur(상표)(BD 바이오사이언시즈(Biosciences), 미국 캘리포니아주 마운트뷰 소재)에 의해 분석하였다. 데이터를 셀퀘스트(CellQuest)(상표) 프로 소프트웨어로 분석하였다.
세포주기 정지 기전을 웨스턴 블럿팅을 사용하여 세포주기 단백질 발현을 측정함으로써 조사하였다. 상이한 처리 조건 중 단백질 발현에 대한 RX-3117의 영향을 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 세포를 얼음상에서 4% 프로테아제 억제제 칵테일(롯슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 독일 만하임 소재)을 함유하는 세포용해 완충제 1x(셀 시그널링(Cell Signaling), 미국 매사추세츠주 댄버 소재)를 사용하여 용해시키고 4 ℃에서 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리시켰다. 상기 단백질 함유 상등액을 수집하고 문헌[Lemos et al., Pharmacogenomics, 12(2):159-70 (2011)]에 기재된 바와 같이 바이오-래드(Bio-Rad) 분석을 수행하여 단백질량을 측정하였다. 하기의 항체들을 단백질 발현에 사용하였다: DNMT1 (셀 시그널링, 1:1000 #5032S), DNMT3A (셀 시그널링 1:1000 #2160S), DNMT3B (애브캠(Abcam), 1;1000), Chk2 (셀 시그널링 1:1000 #6334P), Chk1 (셀 시그널링 1:1000), p-CDC25C (셀 시그널링 1: 1000 #4901S), Cdk1 (셀 시그널링 1:1000 #9112S), Cdk2 (셀 시그널링 1:1000 #2546S), wee1 (셀 시그널링 1:1000), S139-γH2A.X (셀 시그널링, 1:1000), β 액틴 (시그마, 1: 10,000), 카스파제 9 (셀 시그널링, 1:1000), PARP (롯슈 2003, 1:1000), p53 (셀 시그널링, 1:1000, #9282). 상기 항체들을 1:1 용액 로크랜드(Rockland) 완충제(로크랜드 인코포레이티드, 미국 펜실바니아주 필라델피아 소재) 및 0.05% 트윈(등록상표) 20이 보충된 PBS에서 희석하였다. 상기 단백질들을 20% SDS-PAGE에서 분리시키고 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 형광 신호를 위해서 2차 항체 염소 항-마우스 인프라레드다이(InfraRedDye) 및 염소 항-토끼 인프라레드다이를 사용하였다. 상기 단백질들을 오디세이 인프라레드 이미저(Li-COR 바이오사이언스, 미국 네브라스카주 링컨 소재)에 의해 검출하였다.
본 명세서에 사용된 약어는 하기를 나타낸다:
BSA = 소 혈청 알부민
HEPES = 2-[4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-일]에탄설폰산
PBS = 포스페이트 완충된 염수
PVDF = 폴리비닐리덴 디플루오라이드
RPM = 분당 회전수
SDS-PAGE = 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동
세포 주기
1 μ의 용량에서, RX-3117은 24시간 노출 후에 G1 기의 A549, SW1573, SW1573/G- 및 H460 세포의 축적을 유도하였다(도 1). 5xIC50의 보다 높은 용량에서, RX-3117은 S-기의 A549, SW1573 및 SW1573/G- 세포의 축적을 유도하였다(도 2).
카스파제 활성화
RX-3117은 증가하는 농도의 RX-3117에 24시간 노출 후 SW1573 세포 및 A549 세포에서 프로-카스파제 9를 감소시켰다. 프로-카스파제 9의 감소는 카스파제의 활성화 및 후속적인 세포자멸 유도를 가리킨다(도 3 및 4).
DNMT 단백질
RX-3117은 보다 높은 용량에서 A549 세포 중 DNA 메틸트랜스퍼라제 1(DNMT1)의 유지를 하향조절하며(도 23) A549 세포 중 DNMT3A 및 DNMT3B 발현 수준을 증가시켰다. 상기 하향조절에 대해 제안된 기전을 도 22에 나타낸다.
DNA 손상
RX-3117은 48시간 노출 후 SW1573 세포에서 생물마커 γH2A.X(포스포 S139)에 의해 지시되는 바와 같이 이중가닥 파손(DSB)을 유도하였다(도 5). RX-3117은 증가하는 농도의 RX-3117에 24시간 노출 후 절단된 PARP를 유도하였다(도 6). 절단된 PARP는 세포자멸 세포에서 활성화된 카스파제 활성을 가리킨다. 1 μM 및 5 μM에서, RX-3117은 A549 세포에서 p53 발현 수준을 증가시켰다(도 7). 10 μM에서, RX-3117은 Chk1 및 Cdk2 발현 수준을 증가시킨 반면 48시간 노출 후에는 SW1573 세포에서 p-Cdc25C 발현 수준을 감소시켰다(도 8). RX-3117에 의해 유도되는 DNA 손상은 상기 Chk1 경로를 촉발한다. ATR/Chk1 경로는 DNA 복제 스트레스 및 DSB에 의해 유도된다. PX-3117은 증가하는 농도의 RX-3117에 24시간 노출 후 SW1573 세포에서 wee1 발현 수준을 감소시켰다(도 9). 도 24는 손상 유도 후 체크포인트 키나제 Chk1 및 Chk2에 의한 상기 세포 주기의 조절 및 세포 주기 단백질에 대한 잠재적인 효과를 나타내는 도해이며, RX-3117은 상기 경로 중 다수를 따라 활성을 가질 수 있다.
세포자멸 유도
5xIC50의 용량에서, RX-3117은 24 및 48시간 노출 후 서브-GI 기의 PI 염색된 A549 및 SW1573 세포에서 세포자멸을 유도하였다(도 10). 5 μM(A549의 경우) 및 10 μM(SW1573의 경우)에서, RX-3117은 24, 48, 72 및 96시간 노출 후 서브-GI 기의 애넥신 V 염색된 A549 및 SW1573 세포에서 세포자멸을 유도하였다(도 11).
결과
상기 결과는 세포 주기 정지가 시간, 농도 및 세포주 의존적임을 암시한다. A549, H460 및 SW1573 세포에서, 1 μM RX-3117에의 24시간 노출은 G1 기(약 20 내지 40%) 및 S-기(보다 적은 정도로)의 세포의 축적을 증가시켰으나, G2/M 기의 세포의 축적은 감소시켰다. 따라서, 저용량의 RX-3117은 G1 축적을 유도하고 고용량의 RX-3117은 S 기 축적을 유도한다. 24시간 노출시 세포살해는 관찰되지 않았으나, γH2AX 유도가 동반된 48시간 노출시 세포살해가 관찰되었다(SW1573에서 15% 및 A549 세포에서 8%). A549 세포에서, 세포 주기 분포에 대한 RX-3117의 효과는 S 기에서 45% 축적과 함께 48시간 노출시 가장 현저하였다. S-기 축적은 시간 의존적이다. RX3117에 의한 처리는 p53, Chk1, Chk2 및 Cdk2 발현 수준을 증가시켰으나, Cdc25C 및 p-Cdc25C 발현 수준은 감소시켰다. RX-3117은 대개 48시간 후에 wee1 발현 수준을 증가시켰다. RX-3117은 SSB 및 DSB를 통해 세포자멸을 유도하는 듯하였다. SW1573 세포에서 절단된 PARP는 세포자멸 세포에서 상향조절된 카스파제 활성을 가리킨다. A549 세포에서 프로-카스파제 9의 감소는 카스파제의 활성화 및 후속적인 세포자멸 유도를 가리킨다. 결론적으로, RX-3117에 의해 유도된 DNA 손상은 한편으로 세포자멸을 촉발하였으며 다른 한편으로는 Chk1 및 Chk2 발현 수준을 증가시켰다. 임의의 작용 기전에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 인산화된 Chk1 및 Chk2는 Cdc25C의 인산화를 촉발하고 그의 분해를 유발할 수도 있으며, 이는 감소된 Cdk1 수준 및 따라서 S-기 세포 축적을 생성시킬 수도 있는 것으로 여겨진다.
실시예 2: 동계유전자 MC38 쥐 결장암 이종이식편 모델에서 RX-3117의 효능
하기에 기재된 프로토콜에 따라, MC38 쥐 결장암을 갖는 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하는 동계유전자 모델에서 종양 성장에 대한 RX-3117의 효과를 검사하였다. 종양 성장을 대조용(비히클 처리된) 그룹과 비교하여 처리 그룹에서 측정하였다(투여 계획 및 처리 섭생에 대해서 하기 표 1을 참조하시오). 상기 연구의 결과(표 2)는 예정세포사 수용체 1(PD-1) 억제제, RMP1-14에의 RX-3117의 첨가가 종양 성장의 억제에 부가적인 효과를 가졌음을 입증한다(RX-3117 단독 80%, RMP1-14 단독 93%, 대 상기 두 작용제의 조합에서 99%). 상기 두 작용제의 조합은 또한 부분적인 역행 및 완전한 역행을 갖는 보다 높은 수의 마우스(9마리 마우스)를 생성시켰으며, 이때 7마리의 동물은 종양이 없는 생존을 나타내었고, 이에 비해 RMP1-14 단독 그룹에서는 4마리의 동물이 부분적인 역행 및 완전한 역행을 나타내었으며 이때 2마리는 종양이 없는 생존을 나타내었다. 모든 결과는 상기 조합 그룹에서 상기 마우스에게 어떠한 부작용도 없이 획득되었다.
간단히, 상기 방법을 하기와 같이 기재한다. 지수증식기 동안 세포를 수확하고 포스페이트 완충된 염수로 재-현탁시켰다. 각 시험 동물에게 우측 옆구리에서 1x106 종양 세포를 피하(s.c.) 주사하였고 평균 종양 크기가 60 내지 100 ㎣의 표적 범위에 도달할 때 종양 성장을 모니터하였다. 표 1을 토대로, 각 동물이 상기 표적 범위에 도달했을 때 투여를 시작하였다.
약물 및 처리 스케줄
Gr. N 섭생 1 섭생 2
작용제 ㎎/㎏ 경로 스케줄 작용제 ㎎/㎏ 경로 스케줄
1# 10 비히클 - Po (5/2) x 3 - - - -
2 10 RX-3117 60 Po (5/2) x 3 - - - -
4 10 항-PD-1 RMP1-14 100* Ip biwk x 2 - - - -
5 10 RX-3117 60 Po (5/2) x 3 항-PD-1 RMP1-14 100* Ip biwk x 2
# - 대조용 그룹, * - ㎍/동물
RX-3117과 PD-1 억제제와의 조합의 종양 성장 억제 및 생존 이득
Gr. 처리 그룹 28일째 TGI PR CR TFS
1 비히클 - 2 0 0
2 RX-3117 (60 ㎎/㎏) 80% 0 0 0
3 항-PD-1 RMP1-14 (100 ㎍) 93% 1 3 2
4 RX-3117 + 항-PD-1 99% 2 7 7
TGI: 종양 성장 억제; 28일째; PR: 부분 역행의 수; CR: 완전 역행의 수; TFS: 무종양 생존자의 수; 모두 45일째
종양을 캘리퍼를 사용하여 2차원으로 측정하고, 부피를 하기 식을 사용하여 계산하였다:
Figure pct00020
상기식에서, w는 종양의 너비이고 l은 길이(㎜)이다. 종양 중량을 1 ㎎이 1 ㎣의 종양 부피와 같은 것으로 가정하여 추정할 수 있다.
처리 효능을 45일째로부터의 데이터를 사용하여 측정하였다. 45일째, MTV(n), 동물수 n에 대한 중간 종양 부피를 각 그룹에 대해 측정하였다. 종양 성장 억제 퍼센트(%TGI)는 나타낸 대조용 그룹(비히클 투여)의 MTV와 약물-처리된 그룹의 MTV간의 차이로서 정의되며, 상기 대조용 그룹의 MTV의 백분율로서 나타낸다:
Figure pct00021
상기 TGI 분석용 데이터 세트는 그룹의 모든 동물을 포함하나, 단 처리-관련되거나(TR) 또는 처리-관련되지 않은(NTR) 원인으로 인해 죽은 동물은 제외한다. 상기 분석에서 적어도 60% TGI를 생성시키는 작용제는 잠재적으로 치료 활성인 것으로 간주된다.
상기 연구 프로토콜은 처리 그룹 대 대조용 그룹에서 종점까지의 중간 시간(TTE)을 기준으로 하는 종양 성장 지연 분석을 명시한다. 각 동물을 그의 종양이 1500 ㎣ 부피 종점에 도달하면 종양 진행(TP)을 위해 안락사시켰다. 각 마우스에 대한 종점까지의 시간(TTE)을 하기 식으로 계산한다:
Figure pct00022
상기식에서 b는 절편이고 m은 로그-변환된 종양 성장 데이터 세트의 선형 회귀에 의해 획득된 선의 기울기이다. 상기 데이터 세트는 연구 종점 부피를 초과하는 첫 번째 실측과 종점 부피 획득에 바로 선행하는 3개의 연속적인 실측으로 구성된다. 종점에 도달하지 않은 임의의 동물은 상기 연구의 끝에서 안락사시키고 연구 최종일(71일)과 동일한 TTE 값을 할당하였다. 상기 로그-변환된 계산된 TTE가 종점에 도달하기 전날을 선행하거나 종양 부피 종점에 도달한 날을 초과하는 경우에, 선형 보간법을 수행하여 TTE에 접근시킨다. 처리-관련된(TR) 원인으로부터 죽은 것으로 판정된 임의의 동물은 사망일과 동일한 TTE 값을 할당한다. 처리-관련되지 않은(NTR) 원인으로 죽은 임의의 동물은 TTE 분석에서 제외시킨다.
처리 효능을 역행 반응수로부터 측정하였다. 처리는 동물에서 종양의 부분적인 역행(PR) 또는 완전한 역행(CR)을 일으킬 수 있다. PR 반응에서, 종양 부피는 연구 과정 동안 3회의 연속 측정에 대한 그의 D1 부피의 50% 이하이고, 이들 3회 측정 중 하나 이상에 대해서 13.5 ㎣ 이상이다. CR 반응에서, 종양 부피는 연구 과정 동안 3회의 연속적인 측정에 대해서 13.5 ㎣ 미만이다. 최종 연구일에 CR 반응을 갖는 임의의 동물을 무종양-생존자로서 추가로 분류하였다.
독성 평가를 위해서, 동물을 처음 5 연구일 동안 매일 칭량하고 그 후에 매주 2회 칭량하였다. 상기 마우스를 임의의 불리한, 처리-관련된 부작용의 명백한 징후에 대해서 빈번히 관찰하였으며, 관찰되었을 때 독성의 임상 징후를 기록한다.
허용 가능한 독성은 연구 도중 20% 미만의 그룹 평균 체중 손실 및 10마리의 처리된 동물 중 한 마리 이하의 처리-관련된(TR) 사망으로서 정의된다. 보다 큰 독성을 생성시키는 임의의 투여 섭생은 최대 허용 용량(MTD) 초과로 간주된다. 사망은 임상적 징후 및/또는 부검에 의해 입증된 바와 같은 처리 부작용에 기인하거나, 또는 투여 기간 동안 또는 최종 용량 14일 이내에 미지의 원인으로 인한 경우 TR로서 분류된다. 사망이 처리 부작용과 관련된 증거가 존재하지 않는 경우 상기 사망은 처리-관련되지 않은 것(NTR)으로서 분류된다.
윈도우용 프리즘 6.05(그래프패드(GraphPad))를 통계 및 그래프 분석에 사용하였다. 다수 그룹에 대한 MTV 값을 비-모수 크루스칼-왈리스 검정 및 사후 듄스 다중 비교 검정으로 비교한다. 양방 통계분석을 P=0.05에서 수행하였다. 프리즘은 P>0.05에서 유의수준 아님(ns), 0.01<P≤0.05에서 유의수준("*"로 기호화함), 0.001≤P≤0.01에서 매우 유의수준("**") 및 P≤0.001에서 대단히 유의수준("***")으로서 결과를 보고한다. 통계학적 검정은 유의수준의 검정이며 그룹간 차이의 크기에 대한 평가를 제공하지 않기 때문에, 모든 유의수준을 상기 보고서의 본문 내에 유의수준으로서 또는 비-유의수준으로서 기재한다.
"상자수염도"는 D15에 그룹에 의한 개별 종양 부피의 분포를 나타내기 위해 작성되었다. 상자는 실측치의 25번째 내지 75번째 백분위수를 나타내며, 수평선은 중간값에 상응하고, "수염"은 최대 및 최소값을 가리킨다. 그룹 중간 종양 부피를 시간의 함수로서 플롯팅하였다. 그룹 평균 BW 변화를 D1으로부터의 변화 퍼센트, ±SEM으로서 그래프로 나타낸다. NTR 원인으로 죽은 동물은 모든 그래프 표현으로부터 제외시킨다.
생존을 TTE 값에 기반하여, 카플란-마이어 방법에 의해 분석하였다. 로그순위(만텔-콕스) 및 게한-브레슬로우-윌콕슨(Gehan-Breslow-Wilcoxon) 검정은 TTE 값에 기반하여, 2개 그룹의 전체 생존 경험(생존곡선)간 차이의 유의수준을 결정한다. 상기 카플란-마이어 플롯 및 통계학적 검정은 동일한 데이터 세트를 공유하며, NTR 사망으로서 기록된 임의의 동물을 제외시킨다. 산포도는 그룹에 의한, 개별적인 마우스에 대한 TTE 값을 나타내기 위해 작성되며; 상기 플롯은 NTR 사망(다른 모든 도면에서 제외된다)을 나타낸다. 그룹 평균 종양 부피를 시간의 함수로서 플롯팅한다. 동물이 종양 크기 또는 TR 사망으로 인해 상기 연구를 나갈 때, 그의 최종 기록된 종양 부피를 후속 시점에서의 중간 부피 계산에 사용되는 데이터와 함께 포함시킨다. 종양 성장 곡선은 동일한 그룹에서 2개의 TR 사망이 발생한 후에 끝을 잘라낸다. 상기 연구 과정에 걸친 그룹 평균 BW 변화를 1일로부터의 변화 퍼센트, ±SEM으로서 그래프로 나타낸다. 하나의 그룹에서 평가 가능한 마우스의 절반이 넘게 상기 연구를 나간 후에 종양 성장 및 BW 변화 곡선의 끝을 잘라낸다.
실시예 3: 인간에서 RX-3117의 약동학, 안전성 및 관용성
인간 최초, 개방-표지, 실험 연구에서, RX-3117의 약동학, 안전성 및 관용성을 평가하였다. 상기 연구 지속기간은 14 내지 15일이었다(7-일 선별 기간; 3-일 처리 기간; 4(+1)-일 안전성 추적 기간). 조직학적으로 확인된 고형 종양을 갖는 9명의 성인 남녀 피험자를 상기 연구에 등록시키고 상기 연구를 완료시켰다. 상기 피험자에게 RX-3117(n=3 피험자/용량)을 단일 경구 용량(50 ㎎ 또는 100 ㎎)으로서 또는 단일 정맥내 용량(20 ㎎)으로서 제공하였다.
약동학(PK)
경구 RX-3117에 대한 절대 생물학적이용효능(F)은 50 및 100 ㎎ 용량에 대해서 각각 55.67% 및 33.42%였다. 평균 Tmax는 상기 50 및 100 ㎎ 용량에 대해서 각각 2.16시간 및 2.49시간이었다. 평균 Cmax는 상기 50 및 100 ㎎ 용량에 대해서 각각 303.3 ng/㎖ 및 311.43 ng/㎖이었다. 상기 100 ㎎ 용량에 비해 상기 50 ㎎ 용량의 보다 큰 절대 생물학적이용효능 및 Cmax 결과는 혈장 중 RX3117의 경구 생물학적이용효능이 용량-비례적이지 않을 수도 있음을 암시한다. 상기 50 ㎎ 및 100 ㎎ 용량에 대한 T½은 각각 13.95시간 및 20.92시간이었으며, 이는 RX-3117이 시험된 용량에서 일부 모수에 대해서는 용량 비례를 나타낼 수 있지만 다른 경우에는 그렇지 않을 수도 있음을 나타낸다.
정맥내 RX-3117의 혈장 PK 프로파일은 경구 RX-3117의 혈장 PK 프로파일과 상이하였다. 정맥내 RX-3117의 20 ㎎ 용량은 일시주사 후 급속히 회복되었다(Tmax=0.25시간). 정맥내 RX-3117의 20 ㎎ 용량은 1143.63 ng/㎖의 평균 Cmax를 가졌으며, 이는 경구 용량의 피크 농도에 대해 대략 4-배 증가였다.
안전성 및 관용성
RX-3117은 모든 피험자에서 안전하고 매우-관용되었다. 부작용(AE), 처리-발생 부작용(TEAE) 또는 심한 부작용(SAE)이 발생하지 않았다.
상기 결과는 RX-3117이 경구 생물학적이용효능과 함께 안전하고 매우-관용되며, 보다 높은 용량의 연구를 지지함을 나타낸다.
실시예 4: 상이한 경구 용량에서 RX-3117의 약동학, 안전성 및 관용성
개방-표지, 용량-범위 연구에서, 다양한 경구 용량의 RX-3117의 약동학(PK)을 평가하였다. 진행된 악성 종양이 있는 피험자에게 각 4주 주기 중에 1주 쉬고 3주 동안 1주일에 3회(TIWK) 30 ㎎(N=1), 60 ㎎(N=1), 100 ㎎(N=3), 150 ㎎(N=3), 200 ㎎(N=3), 500 ㎎(N=3), 1000 ㎎(N=3), 1500 ㎎(N=4), 및 2000 ㎎(N=5 현재까지)의 1일 용량으로 RX-3117을 함유하는 캡슐을 투여하였다. 연속된 안전성 프로파일을 근거로, 매주 RX-3117 노출을 증대시키기 위해서, 보다 빈번한 투여를 또한 실행하였다. 상기 논의된 TIWK 투여 설계 외에, 피험자에게 각 4주 주기 중 1주 쉬고 3주 동안 1주일에 5회 500 ㎎ 및 700 ㎎, 및 1주일에 7회 500 ㎎을 또한 제공하였다. 용량 점증은 용량당 피험자 1명을 치료하는 가속화된 설계(Simon et al., J. Natl. Cancer Inst., 89(15):1138-47 (1997))로 시작하여 단일 관련된 등급 2 이상의 부작용 발생 후 변형된 피보나치 수열을 사용하는 표준 3+3 설계가 이어졌다. 표 3은 상기 투여 스케줄을 요약한다.
용량 점증 - 주당 3회
용량 그룹 실제 용량(㎎) 빈도 전체 매주 용량
(㎎)		 전체 주기 용량
(㎎)
1 30 주당 3회 90 270
2 60 주당 3회 180 540
3 100 주당 3회 300 900
4 150 주당 3회 450 1,350
5 200 주당 3회 600 1,800
6 500 주당 3회 1,500 4,500
7 1,000 주당 3회 3,000 9,000
8 1,500 주당 3회 4,500 13,500
9 2,000 주당 3회 6,000 18,000
10 500 주당 5회 2,500 7,500
11 700 주당 5회 3,500 10,500
12 500 주당 7회 3,500 10,500
약동학(PK)
PK 데이터를 표 4에 나타낸다.
RX-3117은 현저한 지체 시간 없이 신속하게 흡수되었으며, 이때 중간 Tmax는 대개 2 내지 3시간째에 관찰되었다. Tmax 후에, 제거는 처음 8시간 동안 관찰된 AUC0-t(0-24시간)의 대략 절반 및 24시간까지 80% 초과의 2상이었다. 겉보기 종말 T½는 용량-의존성 또는 시간-의존성 약동학을 나타내지 않았으며, 이때 상기 용량 범위 60 내지 2000 ㎎에 걸친 평균값은 첫 번째 용량 후 11.6 내지 16.7시간, 및 7번째 용량(투여 15일) 후 12.3 내지 20.2시간 범위였다. Cmax 및 AUC0-t(0-24시간)는 용량과 함께 완전히 선형으로, 그러나 비례 미만의 방식으로 증가하였으며, 가능하게는 1500 ㎎ 용량까지 평탄역에 도달하였다(도 12 및 13). 30 내지 2000 ㎎의 용량 범위에 걸쳐, 평균 Cmax 범위는 첫 번째 용량 후 32 내지 1858 ng/㎖, 및 7번째 용량 후 99 내지 1703 ng/㎖이었다(도 12). 동일한 용량 범위에 걸쳐, 평균 AUC0-t(0-24시간) 범위는 첫 번째 용량 후 164 내지 20,544 hr·ng/㎖, 및 7번째 용량 후 702 내지 20,919 hr·ng/㎖이었다(도 13). 축적은 일반적으로 최소였다.
상기 PK 데이터는 1000 ㎎ TIWK까지의 용량에 노출시 용량 의존적인 증가를 나타낸다. 500 ㎎ TIWK 초과의 용량에서, 7번째 용량 후 Cmax 및 AUC0-t(0-24시간)는 첫 번째 용량 후 측정된 경우보다 일관되게 더 낮다(도 12 및 13). 1000 ㎎ 초과 용량에서 Cmax 및 AUC0-t(0-24시간) 값의 평탄화로 인해, 매주 노출을 증대시키기 위해 보다 빈번한 투여 스케줄이 사용되었다(표 4). 상기 연구의 결과를 토대로, RX-3117에 대한 최대 관용 용량(MTD)은 4-주 주기당 1주 쉬고 3주 동안 제공된, 주당 5일에 매일 700 ㎎인 것으로 측정되었다. 이어서 상기 MTD를 추적 효능 연구에 사용하였다.
연구 1 및 15일 후 PK 데이터
빈도 용량 투여 일 용량 수 C max T max T 1/2 AUC 0-24
　 (㎎) 　 　 (ng/㎖) (hr) (hr) (hr*ng/㎖)
주당 3회 30 1 1 31.6 2 3.87 252
주당 3회 60 1 1 139 2 16.2 1164
주당 3회 100 1 1 357 2 15.4 2714
주당 3회 150 1 1 511 3 13.9 3546
주당 3회 200 1 1 637 2 13.3 4719
주당 3회 500 1 1 1104 2 16.7 7916
주당 3회 1000 1 1 1635 2 11.6 12218
주당 3회 1500 1 1 1622 3 11.8 15322
주당 3회 2000 1 1 1858 3 13.3 17044
주당 5회 500 1 1 1441 2 7.31 12373
주당 5회 700 1 1 989 3 9.05 8663
주당 7회 500 1 1 1269 3 8.28 10097
주당 3회 30 15 7 98.9 2 8.23 702
주당 3회 60 15 7 113 4 15.7 1566
주당 3회 100 15 7 460 2 20.2 3289
주당 3회 150 15 7 360 3 15.1 2437
주당 3회 200 15 7 643 3 16.2 4574
주당 3회 500 15 7 941 3 15.3 8275
주당 3회 1000 15 7 1210 3 14.9 9753
주당 3회 1500 15 7 883 2 13.8 7050
주당 3회 2000 15 7 1703 3 12.1 17403
주당 5회 500 15 11 1212 2 8.71 9201
주당 5회 700 15 11 674 4 11.2 6321
주당 7회 500 15 15 1363 2.5 9.45 14467
안전성 및 관용성
가장 빈번히 관찰된 부작용은 가벼운 내지 보통의 피로 및 오심, 가벼운 설사, 가벼운 구토, 가벼운 식욕부진 및 보통의 탈수였다. 용량 제한 독성은 3등급 빈혈, 혈소판감소증으로 제한되었다.
실시예 5: 인간에서 RX-3117의 효능, 안전성 및 관용성
다양한 용량 및 빈도에서 RX-3117의 효능, 안전성 및 관용성을 평가하였다(상기 실시예 4 참조). 진행된 악성 종양이 있는 피험자에게 각 4주 주기 중 1주 쉬고 3주 동안, TIWK 내지 주당 7회로, 다양한 용량의 RX-3117을 함유하는 캡슐을 투여하였다. 용량 점증은 용량당 피험자 1명을 치료하는 가속화된 설계(Simon et al., J. Natl. Cancer Inst., 89(15):1138-47 (1997))로 시작하여 단일 관련된 등급 2 이상의 부작용 발생 후 변형된 피보나치 수열을 사용하는 표준 3+3 설계가 이어졌다. 표 4(상기)는 상기 투여 스케줄을 요약한다.
상기 피험자를 RX-3117의 효능, 안전성 및 관용성에 대해 평가하였다. 총 48명의 피험자를 등록시켰다(여성 30, 남성 18). 17명의 피험자가 1 내지 10주기 동안 안정한 질병을 경험하였으며; 이때 10명의 피험자는 82 내지 276일 치료를 수용하였다. 종양 크기 감소가 췌장(종양 부피 및 CA19-9의 생물마커), 유방 및 중피종암이 있는 3명의 피험자에서 관찰되었다. 가장 빈번하게 관련된 부작용은 보통 내지 중증 빈혈, 가벼운 내지 보통의 피로 및 오심, 가벼운 설사, 구토 및 식욕부진이었다.
상기 연구의 또 다른 단계에서, RX-3117이 재발 또는 난치성 췌장암 또는 진행된 방광암(근육-침습성 방광암 포함)이 있는 암 환자에서 Ib/IIa 기 임상 시험으로 평가 중에 있다. 상기 Ib/IIa 기 임상 시험은 상기 표적 환자 집단에서 RX-3117의 안전성 및 효능을 평가하는 다-기관 연구이다. 2차 종점은 안전성 및 약동학적 분석을 포함한다. 상기 시험에서 환자에게 700 ㎎의 RX-3117의 1일 경구 용량을, 28일 주기 및 4 치료 주기 동안 또는 그의 질병 진행시까지 3주 동안 매주 5회 투여하고 있다.
실시예 6: 난소 및 폐암 세포주에서 플루오로사이클로펜테닐-시토신(RX-3117)의 방사선감작 효과
약물 및 화학물질
RX-3117의 모액을 탈이온수 중에서 제조하였다. 사용된 모든 다른 화학물질은 표준 품질을 가졌으며 상업적으로 입수할 수 있다.
세포 배양
인간 NSCLC 세포주 A549(선암종), H460(대세포 암종), SW1573(폐포성 암종) 및 SW1573/G-(젬시타빈에 내성인 SW1573 세포주) 및 난소암 세포주 A2780을 T25 플라스크(그라이너 바이오-원 게엠베하, 독일 프리켄하우젠 소재)에서 지수 증식기로 유지시키고 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청(FBS), 1% 스트렙토마이신 및 페니실린이 보충된 둘베코의 최소 필수 배지(DMEM) 또는 RPMI 1640에서 배양하고 37 ℃에서 5% CO2의 포화된 분위기하에 유지시켰다. 세포를 트립신 EDTA(인비트로젠(Invitrogen), 영국 페이즐리 소재)를 사용하여 수확하였다. 쿨터(Coulter)(등록상표) Z(상표) 시리즈 카운터를 사용하여 세포를 카운트하였다.
클론형성 분석
지수 증식하는 A2780, SW1573, A549, H460 및 SW1573/G- 세포를 24시간 동안 1 μM RX-3117에 노출시키거나 또는 처리하지 않고(대조용) 60Co 소스(감마셀(Gammacell) 200, 아토믹 에너지 오브 캐나다 리미티드(Atomic Energy of Canada, Ltd))를 사용하여 γ-선(0-6 Gy)으로 조사하였다. 후속으로 500 세포/T25 플라스크를 도말하고 콜로니가 형성되게 하였다. 10일 후에 콜로니를 100% 에탄올로 고정시키고 콜로니 카운팅을 위해 100% 김사 염색 용액(메르크 케미칼스 BV, 네덜란드 암스테르담 소재)으로 염색하였다. 도말 효율(PE)을, 도말된 세포수 전체를 통해 형성된 콜로니의 수를 나누어 계산하고 대조용에 의해 유발된 세포독성에 대해 표준화하였다. 방사선에 대한 RX-3117의 효과를 예시하기 위해서, 용량 변형 인자(DMF)를 앞서 기재된 바와 같이 계산하였다(Bijnsdorp I V, van den Berg J, Kuipers GK, Wedekind LE, Slotman BJ, van Rijn J, Lafleur MVM and Sminia P: Radiosensitizing potential of the selective cyclooygenase-2 (COX-2) inhibitor meloxicam on human glioma cells. J Neurooncol 85: 25-31, 2007).
회전타원체 분석
NSCLC 세포주 A549 및 SW1573을 저 부착 24웰 플레이트(코닝 인코포레이티드(Corning Incorporated), 미국 뉴욕주 코닝 소재)에 100,000 세포/웰의 밀도로 도말하고 회전타원체가 형성되게 하였다. 3일 후에, 단일 회전타원체를 새로운 24웰 저 부착 플레이트(하나의 회전타원체/웰)로 옮겼다. 전달 처리를 시작한 직후에, A549 및 SW1573 세포에 대해서 1 μM RX-3117을 분할 2 Gy 조사(5일 단일 2 Gy 용량)와 병행하였다. 상 콘트라스트 현미경(레이카(Leica)DMI300B 유니버셜 그랩(Universal Grab) 6.3 소프트웨어, 디지털 셀 이미징 랩스(Digital Cell Imaging Labs))을 사용하여 0일째(조사전) 및 3, 6, 9 및 15일 후에 사진을 촬영하였다. 상기 측정은 앞서 문헌[Galvani E, Giovannetti E, Saccani F, Cavazzoni A, Leon LG, Dekker H, Alfieri R, Carmi C, Mor M, Ardizzoni A, Petronini PG and Peters GJ: Molecular mechanisms underlying the antitumor activity of 3-aminopropanamide irreversible inhibitors of the epidermal growth factor receptor in non-small cell lung cancer. Neoplasia 15: 61-72, 2013]에 기재된 바와 같이 회전타원체 부피 계산(V = 4/3π(D/2)3)을 위해 이미지J 소프트웨어(ImageJ 1.45s, 웨인 래스밴드(Wayne Rasband), 국립보건원, 미국 메릴랜드주 베데스다 소재)에 의해 수행되었다.
유식 세포측정 분석
세포 주기 분포 및 세포자멸을, 세포를 편평 바닥 6웰 플레이트(그라이너 바이오-원 게엠베하, 독일 프리켄하우젠 소재)에 5,000 세포의 밀도로 도말함으로써 분석하고 24시간 동안 부착되게 하였다. 그 후에 5xIC50의 세포독성 농도를 가하였다. 노출 시간은 24시간 및 48시간이었으며 비교를 위해서 대조용 그룹을 포함시켰다. 각 시점에서 부착 및 부유 세포의 총량을 환저 팔콘(FALCON) 튜브(BD, 미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스 소재)에 수확하였다. 원심분리 후에, 세포 펠릿을 1.0 ㎖ 프로피디움 요오다이드(PI) 용액(50 ug/㎖ PI, 0.1% 나트륨 시트레이트 0.1% 트리톤 X-100, 0.1 ㎎/㎖ 리보뉴클레아제 A) 또는 10 ul 애넥신 V(cat# 31490014, 임뮤노툴스(Immunotools))에 재현탁시키고 얼음상에 30분 동안 두었다. 후속으로, 샘플을 FACSCalibur(BD 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 마운트뷰 소재)를 사용하여 분석하였다. 데이터 분석을 위해서 셀퀘스트(상표) 소프트웨어를, 서브-G1 기의 세포(세포자멸성 세포)의 양을 평가하기 위해 DNA 막대그래프상의 게이트를 사용하여 수행하였다.
단백질 발현 분석
상이한 처리 조건 중 단백질 발현에 대한 RX-3117의 영향을 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 세포를 얼음상에서 30분 동안 4% 프로테아제 억제제 칵테일(롯슈 다이아그노스틱스, 독일 만하임 소재)을 함유하는 1x 세포용해 완충제(셀 시그널링, 미국 매사추세츠주 댄버 소재)를 사용하여 용해시키고 4 ℃에서 14,000 rpm에서 10분 동안 원심분리시켰다. 앞서 기재된 바와 같이(Lemos C, Kathmann I, Giovannetti E, Calhau C, Jansen G and Peters GJ: Impact of cellular folate status and epidermal growth factor receptor expression on BCRP/ABCG2-mediated resistance to gefitinib and erlotinib. Br J Cancer 100: 1120-7, 2009) 바이오-래드 분석을 수행하여 상기 수집된 상등액 중의 단백질량을 측정하였다. 하기의 항체들을 단백질 발현에 사용하였다: γH2A.X (cat# 9718, 셀 시그널링, 1:1000), β-액틴 (시그마, 1: 10,000), Cdc25C Ser216 (cat# 4901, 셀 시그널링, 1:1000), Cdk1 Tyr15 (cat# 9111, 셀 시그널링, 1:1000), Chk1 Thr68 (cat# 2197S, 셀 시그널링, 1:1000), 히스톤 3 (cat# 4499, 셀 시그널링). 항체들을 로크랜드 완충제(로크랜드 인코포레이티드, 미국 펜실바니아주 필라델피아 소재) 및 0.05% 트윈 20이 보충된 포스페이트 완충된 염수(PBS)를 갖는 1:1 용액에서 희석하였다. 단백질들을 20% SDS-PAGE 젤에서 분리시키고 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮겼다. 형광 신호를 위해서 2차 항체 염소 항-마우스 인프라레드다이 및 염소 항-토끼 인프라레드다이를 사용하였다. 상기 단백질들을 오디세이 인프라레드 이미저(Li-COR 바이오사이언스, 미국 네브라스카주 링컨 소재)에 의해 검출하였다.
결과
RX-3117의 방사선감작 효과
방사선에 대한 RX-3117의 효과를 조사하기 위해서, 클론형성 분석을 수행하였다. 먼저, 발명자들은 RX-3117과 예비-배양 또는 후-배양이 방사선 효과를 증대시키는 지의 여부를 검사하였다. 4 Gy와 함께 RX-3117에 의한 처리-전 및 처리-후를 A2780 세포에서 비교하였다.
상기 클론형성 분석 데이터는 RX-3117과의 예비-배양이 방사선감작 효과에 가장 유효한 조건임을 나타내었다. 1 μM RX-3117과의 예비-배양은 대조용에 비해 5배 더 낮은 도말 효율을 가졌다(도 15).
상기 예비-배양 스케줄을 사용하여, 잠재적인 방사선감작 효과를 A2780 세포 및 비-소세포 폐암 세포주 A549, SW1573 및 SW1573/G- 및 H460에서 조사하였다. 일반적으로, 모든 세포주는 RX-3117 및 방사선으로 처리시 방사선감작 효과를 나타내었다. 가장 큰 방사선감작은 1.8의 DMF를 갖는 A2780 및 A549 세포주 및 1.5의 DMF를 갖는 SW1573에서 관찰되었다(도 16A, 16B, 16D). 젬시타빈 내성 세포주 SW1573/G-는 1.4의 DMF를 가졌지만(도 16E), H460 세포는 불충분한 방사선감작 효과를 나타내었다. 분할 조사가 임상에서 표준 과정이지만, SW1573 세포에서 5일 동안 2 Gy 방사선의 분할 용량을 또한 연구하였다. 5x 2 Gy의 분할 방사선요법에 앞서 1 μM의 RX-3117과의 배양은 가장 낮은 콜로니 성장을 나타내었다(도 16F).
회전타원체 분석을 사용하는 3-차원 모델에서 방사선조사와 함께 RX-3117의 방사선감작 능력을 또한 조사하였다. 상기 구 형성 분석은 SW1573 및 A549 회전타원체에서 구에 대한 RX-3117의 방사선감작 효과를 밝혀내었다(도 17). SW1573 구는 1 μM RX-3117 단독 및 방사선요법(RT) 단독(2 Gy 5일) 모두에 의해 매우 영향을 받았으며 그 효과는 상기 조합에 의해 증대되었다. A549 세포에서, RX-3117 처리 또는 방사선조사 단독은 부피 성장에 단지 작은 효과만을 갖는 반면 1 μM RX-3117은 2 Gy에 의한 5일 방사선조사 효과를 증대시켰다(도 17).
세포자멸 개시
세포자멸을 유발시키는 RX-3117의 가능성을 NSCLC 세포주에서 연구하였다. 세포자멸성 세포의 양을 24시간, 48시간 및 72시간의 노출 후에 애넥신 V 염색(도 18)에 의해 측정하였다. 애넥신 V 세포막 염색은 A549 세포 및 SW1573 세포의 경우 세포자멸성 세포의 점진적인 증가를 나타내었으며, 이는 A549의 경우보다 SW1573 세포의 경우 더 현저하였다.
DNA 손상 개시
DNA 손상은 세포사의 특징이다. DNA 손상을 γH2A.X 발현의 평가에 의해 연구하였다. A2780 세포주에서 0.1 μM에 의해 출발하는 RX-3117 농도를 10 μM RX-3117까지 점진적으로 증가시키는 것은 γH2A.X S139의 용량 의존적인 방식의 유도를 입증하였다(도 18A). SW1573 세포주에서 이중가닥 파손 손상 마커가 0.3 μM의 RX-3117에 48시간 노출 후 증가하였다(도 18B). 0.3 μM의 RX-3117과 방사선조사와의 조합은 보다 현저한 γH2A.X S139 단백질 발현을 나타내었다(도 18B). 예상된 바와 같이 방사선은 γH2A.X의 발현의 즉각적인 증가를 야기하였으며; RX-3117의 존재하에서 수복은 지연되었다.
세포 주기 분포 및 세포사에 대한 RX-3117 및 방사선 처리의 효과
세포 주기 분포의 동요가 다른 뉴클레오시드 유사체의 방사선감작 효과에 관련있음이 보고되었기 때문에(Shewach DS and Lawrence TS: Antimetabolite radiosensitizers. J Clin Oncol 25: 4043-50, 2007), 방사선과 병용된 RX-3117의 효과를 NSCLC 세포에서 FACS 분석을 사용하여 조사하였다. 비교적 낮은 농도의 1 μM RX-3117에서, S-기의 작지만 딱 유의수준인(p<0.05) 세포주 의존적인 증가가 4개의 세포주 중 3개에서 발견되었다. 모든 세포주에서 G1 기의 증가가 발견되었으며(도 19A) G2/M 기의 강한 감소가 발견되었다. 4 Gy의 방사선은 2개의 SW1573 세포 모두에서 S-기 세포량의 명백한 감소, G2/M 기의 증가를 야기하였고, A549 세포에서는 효과가 없었으나, H460 세포에서는 감소를 야기하였다(도 19A). 방사선과 RX-3117의 조합은 2개의 SW1573 변체 모두에서 S-기 세포수의 증가를 유도하였으나, H460 세포에서는 감소를 유도하였다. A549 세포에서 세포 살해(서브 G1)가 명백히 증가하였으나, 다른 세포에서는 그렇지 않았다(도 19A).
이러한 현상 중 일부를 이해하기 위해서, 일부 필수적인 세포 주기 단백질의 발현에 대한 RX-3117 및 방사선의 효과를 또한 조사하였다(도 19B 및 도 20). SW1573에서 RX-3117과 방사선 모두의 효과를 다양한 세포 주기 체크포인트 단백질에 대해서 검사하였다(도 20). 방사선은 48시간 후에 wee1, Chk2, CDC25c 및 p-CDC25c의 흥미로운 감소를 야기하였다. 2개의 SW1573 세포 모두에서 방사선은 Chk2의 인산화의 증가를 야기하였다(도 19B). 거의 모든 세포주(젬시타빈 내성 SW-1573/G 제외)에서 RX-3117은 Cdk1의 인산화를 감소시켰으며; 유사하게 방사선은 24시간 후에 cdc-25C의 인산화를 증가시켰다(그러나 SW1573/G-에서는 아니다)(도 19B). RX-3117과 함께 상기 효과가 유지되었다(도 19B).
실시예 7: RX-3117에 의한 DNA 메틸트랜스퍼라제의 억제는 저메틸화된 표적의 상향조절을 유도한다
RX-3117은 아자시티딘(아자-CR) 및 아자-데옥시시티딘(아자-CdR)을 닮는다. RX-3117은 인간 평형 뉴클레오시드 수송자(hENT)에 의해 흡수되며 유리딘-시티딘 키나제 2(UCK2)에 의해 RX-3117-MP로 활성화된다(도 21). RX-3117은 인간 평형 뉴클레오시드 수송자(hENT)에 의해 흡수되며 유리딘-시티딘 키나제 2(UCK2)에 의해 RX-3117-MP로 활성화된다. RX-3117은 DNA 메틸트랜스퍼라제 1(DNMT1)을 하향조절한다(Choi W.J., et al., J. Med. Chem. 55 (2012) 4521-4525; Peters G.J., et al., Invest New Drugs 31 (2013) 1444-1457). DNMT1은 S-기에서 새로 합성된 DNA의 메틸화 유지를 맡고 있으며 반메틸화된 DNA 중의 시토신 잔기를 메틸화한다. RX-3117의 데아민화 속도는 젬시타빈보다 훨씬 더 느리다.
RX-3117은 현재 I기 임상 연구에서 평가 중인, 경구로 생물학적 이용가능한 신규의 시티딘 유사체이다. 최대 관용 용량은 2,000 ㎎/일 초과이다. RX-3117에 의한 DNMT1의 하향조절은 상이한 조직학적 배경과 함께 다양한 세포주에서 입증되었다. 현재 UCK2 및 DNMT1은 모두 잠재적인 생물마커로서 평가 중이다. 본 실시예에서, DNA, RNA, 단백질 및 효소 활성에서 DNMT1에 대한 RX-3117의 효과, 및 p16INK4A, 메틸구아닌 메틸트랜스퍼라제(MGMT) 및 양성자 결합된 폴레이트 수송자(PCFT)를 포함한 억제된 표적 유전자의 재활성화를 측정하였다. PCFT는 pH 5.5 및 7.4에서 폴산, 메토트렉세이트(MTX) 및 페메트렉시드(PMX)를 수송하며, 상기 유전자는 고도로 메틸화된다. 또한, 양성자-결합된 폴레이트 수송자(PCFT)를 포함하여, 메틸화에 의해 조절되는 것으로 공지된 유전자에 대한 단백질의 기능을 연구한다. A549 세포주에서 E-카데린(부착 분자), p16INK(종양 억제인자 단백질) 및 O-6 메틸구아닌 DNA 메틸트랜스퍼라제(MGMT)(DNA 수복 유전자)의 발현을 또한 연구하였다.
방법
상기 연구에서, 하기의 세포주들이 사용되었다: (1) CCRF-CEM 세포 및 그의 MTX 내성 변체 CEM-MTX, 환원된 폴레이트 담체(RFC)의 결함을 특징으로 한다(Jansen G., et al., JBC 273 (1998) 30189-30198). CEM 세포에서 상기 PCFT 유전자는 고도로 메틸화된다(Gonen N., et al., BBRC 376 (2008) 787-92.); (2) 10% 소 태아 혈청(FBS)이 있는 RPMI 배지에서 배양된 CEM 세포; 및 (3) 10% FBS가 있는 DMEM 배지에서 배양된 A549 및 SW1573 비-소세포 폐암(NSCLC) 및 A2780 난소암 세포주.
DNMT1 단백질 발현을 RX-3117에 24 또는 48시간 노출 후 웨스턴 블럿팅에 의해 측정하였다. DNMT1 RNA 발현을 RX-3117에 24 및 48시간 노출 후 실시간 PCR에 의해 측정하였다. DNMT 효소 활성을, 메틸화된 DNA에 결합하는 CpG 결합 도메인의 능력을 사용하는 에피젠테크(EpiGentek)에 의해 제공된 DNA 메틸트랜스퍼라제 분석 키트를 사용하여 1 μM RX-3117 또는 5 μM 아자-CdR 노출 후 단리된 핵에서 측정하였다. A549 세포에서 전체적인 메틸화에 대한 5 μM RX-3117의 효과를 5-메틸-시토신에 대한 특이 항체로 측정하였다. 웨스턴 블럿상의 밴드를 오디세이 인프라레드 이미저를 사용하여 적합한 인프라레드다이로 가시화하였다.
MTX 수송을 CEM 야생형 및 CEM-MTX 세포주 중의 방사선표지된 MTX를 사용하여 측정하였다. CEM 세포는 높은 RFC 활성을 갖는다. CEM-MTX는 RFC-매개된 수송에 완전히 결함성이다. CEM 세포는 고도로 메틸화된 PCFT 수송자 및 매우 낮은 PCFT 매개된 수송을 갖는다(Gonen N., et al., BBRC 376 (2008) 787-92). pH 7.4에서 MTX 수송은 우세하게는 RFC 매개되며 PCFT에 의해 2% 미만이다. 폴산을 사용하여 PCFT 매개된 수송을 억제하였다. L-류코보린(L-LV)을 가하여 RFC 매개된 수송을 완전히 억제하였다. CEM 및 CEM-MTX 세포를 29.6 μM RX-3117 및 양성 대조용으로서 0, 19 μM 아자-CdR에 노출시켰다. MTX 수송을, 2 μM[3',5',7-3H]-MTX를 사용하여 3분 흡수 분석에서 상기 약물에 대해 24시간 후에 측정하였다.
스튜던츠 t-검정을 사용하여 통계분석을 수행하였다.
결과
보통으로 민감한 비-소세포 폐암(NSCLC) 세포주, 예를 들어 A549 및 SW1573에서, 5 내지 50 μM RX-3117은 DNMT1 단백질 발현을 24시간 노출 후 5 내지 20%까지 및 48시간 후 >90%까지 하향조절하였다(도 25A 및 B). DNMT1 mRNA는 24시간 노출 후에는 영향을 미치지 않았으나 48시간 후에는 보통으로 영향을 미쳤다(도 25C 및 D).
민감한 난소암 세포주 A2780에서, 단백질 하향조절은 이미 1 μM RX-3117에서 24시간 후에 관찰되었다(도 26A 및 B). DNMT1 활성은 1 μM RX-3117에 의해 32%까지 억제되었으며, 이는 참조 화합물 5-아자-2'-데옥시시티딘(DAC, 31%) 5 μM에 의한 억제 퍼센트와 유사하였다.
A549 세포에서, 5 μM RX-3117은 48시간 노출 후에 DNA의 전체적인 메틸화(5-메틸시토신에 대한 항체에 의해 검출됨)를 25%까지 감소시킨 반면, 5 μM DAC는 단지 9%만 억제하였다(도 27A). 메틸화에 의해 영향을 받는 것으로 공지된 다수의 유전자들에 대해서, 단백질 발현 및 활성을 평가하였다. A549 세포를 RX-3117에 노출시켰으며 5-메틸-시토신에 대한 항체로 면역형광을 사용하여 측정하였다(도 27B). A549 및 SW1573 세포에서 5 μM RX-3117에 대한 24시간 노출은 세포주기 단백질 p16INK4A 및 DNA 수복 효소 MGMT의 발현을 증가시켰다. 도 27C는 RX-3117 및 아자-dC에 노출 후 MGMT, E-카데린, 및 p16INK4의 발현을 나타낸다.
PCFT에 대해서, RX-3117의 기능 활성을, 고도로 메틸화된 PCFT 프로모터를 갖는 CCRF-CEM 백혈병 세포 및 환원된 폴레이트 담체(RFC)가 결핍된 CEM-MTX 세포에서 평가하였다. PCFT는 폴산 및 폴레이트 유사체 메토트렉세이트(MTX) 및 페메트렉시드의 흡수를 담당하는 특이적인 폴레이트 수송자이다. CEM 및 CEM-MTX 세포 모두와 29.6 μM RX-3117 또는 양성 대조용으로서 DAC와의 배양은 MTX의 PCFT 매개된 수송을 현저하게 증가시켰다. 이는 CEM 세포에서 4배 증가에 비해 CEM-MTX 세포에서 보다 현저하였으며, RX-3117 및 DAC 모두에 대해 10 내지 11배 증가하였다. 폴산(FA)을 가하여 PCFT를 억제하고 L-LV를 가하여 RFC 매개된 MTX 수송을 억제하였다. 아자-CdR 및 아자-CR을 양성 대조용으로서 포함시켰다(도 28A, B 및 C).
결론
결론적으로, RX-3117은 DNMT1 단백질 및 RNA 발현을 DNA 메틸화의 감소에 의해 하향조절한다. RX-3117 매개된 저메틸화는 MGMT, E-카데린, PCFT 및 종양 억제인자 유전자 p16INK4A의 발현을 증가시킨다. PCFT는 MTX의 수송을 매개하였다. 이들 데이터는 RX-3117의 새로운 기전으로서 DNMT1 억제를 강조한다. RX-3117은 신규의 후성적 조절인자이다.
실시예 8: RX-3117의 잠재적인 예측 생물마커로서 UCK2 단백질 발현의 평가
배경
신규의, 경구로 생물학적 이용 가능한 뉴클레오시드 유사체 RX-3117은 종양 조직에서 우세하게 발현되는 것으로 생각되는 유리딘 시티딘 키나제 2(UCK2)에 의해 세포내에서 활성화되는 전구약물이다. RX-3117은 현재, 진행된 췌장 및 방광암이 있는 환자에서 Ib/IIa기 다-기관, 개방-표지 임상 연구로 평가 중이다. 상기 연구에서, UCK2 조직 단백질 발현과 마우스 이종이식편 모델에서 RX-3117의 효능 및 또한 정상 조직에 비해 인간 암조직 패널에서 UCK2 단백질 발현간의 관계를 연구하였다.
방법
종양 조직에서 상기 UCK2 단백질 발현을 클론 22-1 토끼 단클론 항체를 사용하여 면역블럿팅에 의해 분석하였다. 클론 22-1과 함께 UCK2의 면역조직화학(IHC)에 대해 인증된 과정을 인간 포르말린-고정된 파라핀-포매(FFPE) 암 및 정상 조직 패널에서 수행하였다.
결과
베타-액틴에 표준화된 UCK2의 면역블럿팅 단백질 수준 및 상응하는 종양 성장 억제(500 ㎎/㎏의 경구 RX-3117 용량, TIWK)는 MiaPaCa2에서 각각 57 및 67%, BxPC3에서 30 및 -5%, Colo-205에서 199 및 92%, Caki-1에서 21 및 90%, A549에서 2 및 39%, 및 H460에서 146 및 79%였다. 이들 데이터는 UCK2-의존적인 방식의 항-종양 효능 성향을 가리킨다. 상기 UCK2의 IHC는 암 조직에서 UCK2의 양성 염색이 20/20 방광암 조직(100% 빈도), 19/20 CRC 조직(95% 빈도), 18/20 NSCLC 조직(90% 빈도), 및 19/20 췌장암 조직(95% 빈도)에서 관찰됨을 보였다. 암 조직 대 정상 조직에서 UCK2의 평균 H-점수는 폐에서 각각 104 대 9, 방광에서 97 대 20, 췌장에서 67 대 41 및 결장에서 39 대 21이었다.
결론
현재 데이터는 이종이식편 모델에서 UCK2 단백질 발현 수준과 RX-3117의 항종양 활성 정도간의 상관성 성향을 나타내었다. 상기는 또한 정상 조직에 비해 인간 암조직에서 보다 높은 UCK2 단백질 발현 수준을 지지한다. 이는 RX-3117 활성이 종양 조직에 특이적일 수 있으며 인간 암 조직에서 UCK2 발현의 정량분석이 차후 임상 연구에서 RX-3117에 대한 민감성에 대해서 환자를 선택하기 위한 예측 생물마커로서 유용할 수 있음을 암시한다.
실시예 9: RX-3117 일수화물의 합성
고정된 반응기에서 1 내지 3 단계의 연속적인 반응에 의한 ASM11로부터 INT14의 제조
ASM11, 3급-부틸(((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)옥시)디페닐실란(37.65 ㎏, 1 wt, 1 eq, 55 mol)을 2-메틸 테트라하이드로푸란(4.0 vol, 3.4 wt)에 용해시켰다. THF(테트라하이드로푸란, 1.61 vol, 1.45 wt, 1.1 eq) 중의 TBAF(테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드) 1.0 M을, 18 내지 23 ℃를 유지시키면서 15 내지 45분에 걸쳐 반응 용기에 1회 분취량(가벼운 발열 첨가가 조절됨)으로 가하였다. 2-메틸 테트라하이드로푸란(1.0 vol, 0.9 wt)을 18 내지 23 ℃를 유지하는 라인 세정제로서 상기 용액에 충전시키고 생성 용액을 18 내지 23 ℃에서 1H NMR에 의해 완료될 때까지 6시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 8% w/w 탄산수소나트륨(3.0 vol)으로 충전하고 18 내지 23 ℃에서 5 내지 10분 동안 교반하고(주의: 가벼운 발열) 상들이 분리되게 하고 보다 하부의 수성상(2x2.0 vol)을 제거하였다. 첫 번째 8% w/w 탄산수소나트륨 추출은 유백색 수성층을 제공하였으며 연장된 정치시간은 상기 유화액을 등명화하지 않았다. 조사는 상기 유화액이 수성층으로 국한되고 낮은 유기 함량을 가지며, 따라서 상기 공정이 계속됨을 나타내었다. 상기 첫 번째 추출의 총 분리는 5시간 29분이었다. 두 번째 8% w/w 탄산수소나트륨 추출은 문제 없이 단지 52분 걸려 분리시켰다. 수성상을 2-메틸 테트라하이드로푸란(2.0 vol, 1.7 wt)으로 추출하고 라인을 2-메틸 테트라하이드로푸란(2.0 vol, 1.7 wt)으로 세정하였다. INT12를 함유하는 합한 유기상을 40 내지 50 ℃로 가열하고 감압하에 40 내지 50 ℃에서 약 4 vol로 농축시켰다. 분석을 위해 샘플링을 수행하고 수 함량이 ≤0.2% w/w일 때까지 칼-피셔에 의해 분석하였다. 상기 공정은 15.3% w/w INT12 ASM11-알콜을 함유하는 2-메틸테트라하이드로푸란 중의 INT12 ASM11-알콜 158.8 ㎏ 순 중량을 제공하였으며, 이는 99.0% 총 수율과 같다. 92.83% 면적 순도 INT12 ASM11-알콜 ((3aS,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-올)이 HPLC 분석에 의해 측정되었다.
상기 INT12 용액을 상기 용기에 복귀시키고, 0 내지 5 ℃로 냉각시키고 트리에틸아민(0.41 vol, 0.30 wt, 2.0 eq)을 충전하였다. 라인을 2-메틸테트라하이드로푸란(1.0 vol, 0.9 wt)으로 세정한 후에, 상기 용액을 적어도 30분(발열성)에 걸쳐 0 내지 5 ℃를 유지하는 2-메틸 테트라하이드로푸란(1.0 vol, 0.9 wt) 중에 희석된 메탄설포닐 클로라이드(0.17 vol, 0.25 wt, 1.5 eq)로 충전하였다(헤더 용기에서 조심스럽게 혼합한다). 추가로 2-메틸 테트라하이드로푸란(0.5 vol, 0.4 wt)을 0 내지 5 ℃를 유지하는 라인 세정제로서 가하였다. 상기 용기의 내용물을 1시간 후에 1H NMR에 의해 반응이 완료될 때까지 0 내지 5 ℃에서 교반하였다. 1시간 후에 전형적인 샘플을 제거하고 대략 매 2시간마다, 그 후 필요한 경우, 상기 반응 용기로부터 점검하고 분석하여 남은 INT12를 점검하였다. 1H NMR 분석에 의해 100% 전환을 점검한 후에, 0 내지 10 ℃를 유지하는 물(4.0 vol)을 충전하고 반응 혼합물을 18 내지 23 ℃로 가온하고 18 내지 23 ℃에서 5 내지 10분 동안 교반하였다. 상기 용기 중 상부 유기상을 분리시키고 18 내지 23 ℃를 유지하는 8% w/w 탄산수소나트륨 용액(4.0 vol)을 충전하였다. 생성되는 2상 용액을 18 내지 23 ℃에서 1 내지 2시간 동안 교반하고 분리된 유기상을 20% w/w 수성 염화 암모늄(2.0 vol) 및 2-메틸 테트라하이드로푸란(2.0 vol, 1.7 wt)으로 충전하였다. 필요에 따라, 상기 온도를 18 내지 23 ℃로 조절하였다. 상기 20% w/w 염화 암모늄 세척은, 아마도 선행 단계로부터의 잔류 탄산수소나트륨과의 반응으로 인해, 격렬한 기체 발포를 생성시켰다. 18 내지 23 ℃에서 5 내지 10분 동안 교반한 후에 상부 유기상을 분리시키고 18 내지 23 ℃로 조절한 정제수(2.0 vol)를 충전하였다. INT13을 함유하는 상기 분리된 유기상을 감압하에 35 내지 45 ℃에서 약 2 vol으로 농축시켰다. 분석을 위한 샘플링을 수행하였다. 상기 공정은 34.9% w/w INT13 ASM11-메실레이트를 함유하는 2-메틸테트라하이드로푸란 중의 INT13 ASM11-메실레이트 78.4 ㎏ 순 중량을 제공하였으며, 이는 94.9% 총 수율과 같다. 62.91% 면적 순도 INT13 ASM11-메실레이트 ((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일 메탄설포네이트)가 HPLC 분석에 의해 측정되었으며, 이때 32.23% 면적 TBDPS 부산물이 존재하였다.
연속해서, 상기 INT13 용액을 DMSO(3.8 vol, 4.2 wt)로 충전하고 더 이상 용매(2-메틸테트라하이드로푸란)가 증류되지 않을 때까지 40 내지 45 ℃로 가열하여 감압하에 ≤45 ℃에서 유기상을 농축시켰다. 상기 농축을 5시간 25분 동안 계속하였으며 1H NMR에 의한 IPC는 8.3% w/w의 2-메틸테트라하이드로푸란 함량을 나타내었다. 상기 용액을 27 내지 33 ℃로 냉각시킨 후에, 세슘 카보네이트(1.2 wt) 및 시토신(0.41 wt)을 충전하였다. 상기 반응 혼합물을 33 내지 37 ℃까지 가열하고 HPLC에 의해 완료될 때까지 교반하였다. N/O-알킬화 비 분석을 위한 샘플링을 24시간 후 및 그 후 적합한 시점들에서 상기 반응 용기로부터 수행하였다. 33시간 47분 후에 상기 반응은 99.5% 전환의 IPC 결과와 함께 완료된 듯하였다. N- 대 O-이성질체의 비는 99.03:0.97이었다. 완료시, 상기 혼합물을 이소프로필 아세테이트(2.0 vol, 1.7 wt) 및 ≤50 ℃를 유지하는 정제수(4.0 vol, 4.0 wt)로 충전하였다(수 첨가는 발열성이다). 5 내지 15분 동안 교반 후에 상기 2상 혼합물을 10분 동안 정치시키고 이어서 상부 유기상을 분리시켰다. 수성상을, 40 내지 50 ℃에서 5 내지 15분 동안 교반하고 분리 전에 다시 10분 동안 정치시킴으로써, 이소프로필 아세테이트로 2회(각각 2.0 vol, 1.7 wt) 재-추출하여 생성물을 전부 회수하였다. 상기 합한 유기상을 25 내지 30 ℃로 냉각시키고 10% v/v 아세트산(3.0 vol) 및 25 내지 30 ℃를 유지하는 26% w/w 염수 용액(1.0 vol)으로 충전시키고 상기 2상 용액을 25 내지 30 ℃에서 30 내지 60분 동안 교반하였다. 상부 유기상을 10% v/v 아세트산(3.0 vol) 및 25 내지 30 ℃를 유지하는 26% w/w 염수 용액(1.0 vol)으로 3회 세척하였다. 각 세척 단계에서 상부의 유기 용액을 1H NMR 분석에 의해 샘플링하였다. 상기 유기상을 다시 약 3% w/w 염수 용액(3x2.0 vol)으로 25 내지 30 ℃에서 세척하고 1H NMR에 의해 아세트산 함량에 대해 샘플링하였다. INT14를 함유하는 상기 유기상을 35 내지 45 ℃로 가열하고 감압하에 35 내지 45 ℃에서 약 5 vol로 농축시켰다. 상기 용액을 이소프로필 아세테이트(3.0 vol, 2.6 wt)로 충전시키고 감압하에 35 내지 45 ℃에서 약 5 vol로 농축시켰다. 상기 용액을 다시 이소프로필 아세테이트(5.0 vol, 4.4 wt)로 충전시키고, 57 내지 63 ℃로 조절하고, 57 내지 63 ℃에서 1.5 내지 3시간 동안 교반하고 결정화/침전에 대해서 HPLC에 의해 점검하였다. 상기 슬러리를 35 내지 45 ℃로 냉각시키고 감압하에 35 내지 45 ℃에서 약 5 vol로 농축시켰다. 상기 슬러리를 1.0 내지 2.0시간에 걸쳐 18 내지 23 ℃로 추가로 냉각시키고 30 내지 90분에 걸쳐 18 내지 23 ℃를 유지하는 n-헵탄(7.0 vol, 4.8 wt)으로 충전시켰다. 18 내지 23 ℃에서 1 내지 2시간 후에 및 0 내지 5 ℃에서 1 내지 2시간 후에, 상기 슬러리를 20 ㎛ 천을 통해 여과시키고 0 내지 5 ℃에서 예비혼합된 n-헵탄/이소프로필 아세테이트(5:1, 2x1.0 vol)로 세척하였다. INT14를 함유하는 생성물을 진공하에 55 ℃이하에서 건조시키고 1H NMR에 의해 분석하였다. 통과 기준은 ≤2.0% w/w 이소프로필 아세테이트 및 ≤2.0% w/w n-헵탄이었다. 상기 공정은 24.27 ㎏ 순 중량의 INT14, 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(45 mol, 93.25% 순도)을 제공하였으며, 이는 82% 총 및 64% w/w 수율과 같다.
고정된 반응기에서 단계 4 내지 5의 연속적인 반응에 의한 INT14로부터의 RX-3117 일수화물의 제조
INT14, 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(24.27 ㎏, 45 mol, 1.0 wt)을 용기에 충전시킨 다음 메탄올(7.5 vol, 5.9 wt)을 충전시키고 반응 혼합물의 온도를 18 내지 23 ℃로 조절하였다. 상기 반응 용기에, 2 M HCl(1.1 vol, 1.2 eq)을 <50 ℃ 온도를 유지하면서 가하였다. 상기 슬러리 혼합물을 45 내지 55 ℃로 가열하고 2 내지 2.5시간 동안 45 내지 55 ℃(표적 50 ℃)에서 교반하였다. 용기 부피를 기록하고 반응 혼합물을, 45 내지 55 ℃를 유지하고 MeOH(5.0 vol, 4.0 wt)의 첨가에 의해 일정한 부피를 유지하면서 감압하에서 증류시켰다. 상기 혼합물을 샘플링하고, ≤1.0% 면적 아세토니드 중간체가 HPLC에 의해 나타날 때까지 45 내지 50 ℃에서 증류에 의해 일정한 부피를 유지하면서 MeOH(2.5 vol 2.0 wt)를 계속 충전시켰다. 일단 상기 전환이 완료되었으면, 반응 혼합물을 25 내지 30 ℃로 냉각되게 하였다. 상기 반응 혼합물을 35 내지 45 ℃를 유지하면서 감압하에서 5 부피로 농축시켰다. 상기 반응 혼합물을 25 내지 30 ℃로 냉각시켰다. 상기 반응 용기에 25 내지 30 ℃를 유지하는 TBME(메틸 3급-부틸 에테르)(5.0 vol, 3.7 wt) 및 물(5.0 vol)을 충전시켰다. 2상 용액을 25 내지 30 ℃에서 10 내지 20분 동안 교반하고 상들을 25 내지 30 ℃에서 분리시켜 하부 수성상을 유시켰다. 상기 유지된 하부상을 상기 용기로 옮기고 25 내지 30 ℃를 유지하는 TBME(5.0 vol, 3.7 wt)로 재충전시켰다. 상기 2상 용액을 25 내지 30 ℃에서 10 내지 20분 동안 교반 후에, 하부 수성상을 분리시켰다. 상기 하부 수성상을 상기 용기로 복귀시키고 라인을 주사용수(0.5 vol, 0.5 wt)로 세정하였다. 트리틸 알콜의 제거를 0.3% w/w/트리틸 알콜 함량으로 1H NMR 분석에 의해 점검하였다. 상기 분석 결과가 ≤0.5% w/w 트리틸 알콜이 아닌 경우, 수성상을 TBME(5.0 vol, 3.7 wt)로 충전시키고 25 내지 30 ℃에서 10 내지 20분 동안 교반하고 이어서 상기 분리를 반복하였다. 상기 합한 수용액을 18 내지 23 ℃로 조절하고, 전-처리된 앰버셉(Ambersep) 900(OH 형태) 수지(벌크 처리된 물질의 5/6)로 충전시키고, 15분 동안 교반하여 pH를 점검하였다. 상기 pH가 <8.0인 경우, 보다 많은 앰버셉 900 수지(OH 형태)를 가하고 18 내지 23 ℃에서 30 내지 45분 동안 상기 용액을 교반하였다. 상기 슬러리를 여과하고 주사용수(2x4.0 vol)로 세척당 15 내지 30분 동안 세척하였다. 상기 필터상의 수지 필터 케이크를, 각 세척에서 HPLC 분석에 의해 ≤1.0%의 결과가 획득될 때까지 세척당 15 내지 30분 동안 주사용수(3x4.0 vol)로 추가로 세척하였다. 상기 모액 및 ≥1.0%를 함유하는 수득된 임의의 세척물을 1 ㎛ 필터를 통해 등명화하였다. 상기 용액을 40 내지 45 ℃로 가열하고 감압하에 40 내지 45 ℃에서 1.5 vol로 농축시켰다. 상기 수성 용액을 2 내지 3시간에 걸쳐 18 내지 23 ℃로 냉각시킨 후에 상기 혼합물을 60분간 숙성시키고 1.5 내지 2시간에 걸쳐 대략적으로 일정한 속도로 18 내지 23 ℃를 유지하는 아세토니트릴(9.5 vol)로 충전시켰다. 상기 슬러리를 18 내지 23 ℃에서 2시간 동안 숙성시키고 0 내지 5 ℃에서 90분간 냉각시켰다. 고체를 20 ㎛ 천을 통해 여과시키고 MeCN/수(5:1, 1.5 vol)로 세척하고 MeCN 함량이 GC에 의해 <400 ppm일 때까지 공기 분위기하에서 건조시켰다. 상기 공정은 8.20 ㎏(99.83% 순도) 순 중량의 RX-3117 일수화물, 4-아미노-1-((1S,4R,5S)-2-플루오로-4,5-디하이드록시-3-(하이드록시메틸)사이클로펜트-2-엔-1-일)피리미딘-2(1H)-온 1H2O(29.8 mol, 99.83% 순도)를 제공하였으며, 이는 66% 총 및 34% w/w 수율과 같다.
도 29는 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117을 나타내는 1H NMR이다. 1H- NMR (400 MHz, DMSOd6), d 7.40ppm, (d, J=7.3Hz, 1H) CH 시토신, d 7.20ppm, (브로드 d, J=9.1Hz, 2H) NH2, d 5.74ppm, (d, J-7.3Hz, 1H) CH 시토신, d 5.30ppm, 브로드 s, 1H, CH, d 5.15ppm, (d, J=7.1Hz, 1H) (OH), d 5.00ppm, (d, J-6.1Hz, 1H) (OH), d 4.80ppm, (q, J=5.3Hz, 1H)(OH), d 4.48ppm, (q, J=5.3Hz, 1H) CH, d 4.17ppm, (dd, J=9.1Hz, 3.8Hz, 1H) CH, d 4.13ppm, (dt, J=6.1Hz, 5.8Hz, 1H) CH, d 3.91ppm, (브로드 d, J=12.9Hz, 2.8Hz, 1H) CH.
도 30은 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117의 13C NMR이다.
도 31은 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117의 19F NMR이다.
도 32는 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117의 질량 스펙트럼이다. 상기 질량 스펙트럼을 ES+ 필터를 사용하여 수행하였으며 이는 m/z=280.0에서 RX-3117 + 나트륨 부가물(M+나트륨)(상기 분석 방법 동안 보이는 공통 종)뿐만 아니라 RX-3117(M+H)의 양자화된 종을 나타낸다. 상기 나트륨은 제조 공정으로부터가 아닌, 상기 분석 방법으로부터 나온다.
도 33은 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117의 질량 스펙트럼이다. 상기 질량 스펙트럼을 ES-필터를 사용하여 수행하였으며, 이는 상기 분석 공정 동안 RX-3117의 M-H 종을 나타낸다. 상기 ES- 및 ES+ 필터 방법은 함께 RX-3117에 대한 완전한 질량 스펙트럼 증거를 제공한다.
상기 대규모 합성 공정에 따라 제조된 물질의 결정성 성질을 확인하기 위해서, 실험규모 고순도 공정에 의해 제조된 결정에 대해 현미경 비교뿐만 아니라 X-선 분말 회절 패턴의 비교를 수행하였다. 도 34는 평면 편광(좌측 컬럼) 및 교차 편광(우측 컬럼)하의, 실시예 9의 공정에 따라 제조된(상부열) 및 실험규모 공정을 사용하여 제조된(하부열) RX-3117의 현미경검사 비교이다. 도 35는 실험규모 공정을 사용하여 제조된 RX-3117(상부 스펙트럼) 및 실시예 9에 기재된 공정을 사용하여 제조된 RX-3117(기부 스펙트럼)을 비교하는 X-선 분말 회절 데이터이다.
상기 개시된 발명의 요지의 특정한 실시태양들이 상기- 및 하기-나타낸 실시태양들 중 하나 이상의 임의의 조합에 관한 것일 수 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다.
본 발명을 예시 및 실시예에 의해 일부 상세히 개시하였지만, 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 변화를 수행할 수 있고 균등물을 치환할 수 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 자명하다. 따라서, 상기 명세 및 실시예를 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석해서는 안 된다.
본 명세서에 개시된 모든 참고문헌, 공보, 특허 및 특허 출원들은 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된다.

Claims (33)

  1. 종양 치료에 사용하기 위한 하기 화학식 I의 화합물로서, 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 경구 투여형이 종양 치료가 필요한 피험자에게 약 300 내지 2,000 ㎎/일의 투여량으로 투여되는 화합물:
    Figure pct00023
  2. 제1항에 있어서,
    상기 투여량이 약 500 내지 700 ㎎/일인 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 투여량이 약 6 내지 12 ㎎/㎏/일인 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경구 투여형을 주당 5 내지 7일 투여하는 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경구 투여형을 4주 연속 또는 3주 연속 동안 주당 5 내지 7일 투여한 후 1주 동안 상기 경구 투여형을 투여하지 않는 (1 off-week) 용도.
  6. 제5항에 있어서,
    투여 주기가 3주 연속 치료에 이어서 1주 중단 (1 off-week), 또는 4주 연속 치료로 이루어지고, 경구 투여형을 최대 12 투여 주기 동안 투여하는 용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경구 투여형이, 단일 투여 후 약 700 내지 1,100 ng/㎖의 Cmax를 제공하는 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경구 투여형이 단일 투여 후 약 8,000 내지 10,000 hr·ng/㎖의 AUC0-t(0-24시간)를 제공하는 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양이 췌장, 방광 또는 결장직장암인 용도.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험자에게 방사선 또는 항-종양제를 투여함을 추가로 포함하는 용도.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    대사길항물질, DNA-단편화제, DNA-가교결합제, 삽입성 물질, 단백질 합성 억제제, 국소이성화효소 I 독, 국소이성화효소 II 독, 미세소관-지향제, 키나제 억제제, 폴리페놀, 호르몬, 호르몬 길항물질, 사멸수용체 작용물질, 면역 체크포인트 억제제, 항-예정세포사 1(PD-1) 수용체 항체 및 항-예정세포사 리간드 1(PD-L1) 항체로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 항-종양제를 투여함을 추가로 포함하는 용도.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험자에게 PD-L1 항체를 투여함을 추가로 포함하는 용도.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험자에게 PD-1 항체를 투여함을 추가로 포함하는 용도.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경구 투여형이 고체인 용도.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경구 투여형이 정제인 용도.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 경구 투여형이 캡슐인 용도.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험자가 인간인 용도.
  18. 치료가 필요한 피험자의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에 의한 치료 효능을 예측하는 방법으로서,
    (i) 상기 피험자로부터 종양 세포 또는 조직의 샘플을 수집하는 단계; 및
    (ii) 상기 종양 세포 또는 조직에서 UCK2 발현 수준을 측정하는 단계
    를 포함하고;
    상기 UCK2의 발현 수준이 화학식 I의 화합물에 의한 치료 효능의 가능성을 나타내는 방법:
    Figure pct00024
  19. 세포를 세포자멸성 신호에 감작시키는 방법으로서, 상기 세포를 유효량의 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염과 접촉시킴을 포함하는 방법:
    Figure pct00025
  20. 암의 하나 이상의 증상의 치료에 사용하기 위한 하기 화학식 I의 화합물로서, 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 수화물, 용매화물 또는 약학적으로 허용 가능한 염이 상기 피험자에서 메틸트랜스퍼라제를 억제하고 적어도 하나의 저메틸화된 표적물을 상향조절하기에 유효한 양으로 투여되는 화합물:
    Figure pct00026
  21. 임의의 중간체의 단리 없이 하나 초과의 단계를 갖는 연속적인 공정으로 3급-부틸(((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)옥시)디페닐실란(ASM11)을 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(INT14)으로 전환시킴을 포함하는, 4-아미노-1-((1S,4R,5S)-2-플루오로-4,5-디하이드록시-3-(하이드록시메틸)사이클로펜트-2-엔-1-일)피리미딘-2(1H)-온 1H2O(RX-3117-MH)의 제조 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    3급-부틸(((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)옥시)디페닐실란(ASM11)을 2-메틸 테트라하이드로푸란에 용해시키는 단계;
    테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드를 가하여 반응 용액 중에 ((3aS,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-올)(INT12)을 형성시키는 단계; 및
    유기상 중의 INT12를 회수하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 유기상 중의 INT12의 회수가
    상기 반응 용액을 수용액으로 세척하는 단계;
    상기 INT12를 갖는 유기상으로부터 수성 추출물을 분리시키는 단계;
    상기 수성 추출물을 2-메틸 테트라하이드로푸란으로 세척하여 상기 수성 추출물로부터 INT12를 추출하는 단계; 및
    상기 추출된 INT12를 상기 INT12를 갖는 유기상과 합하는 단계
    를 포함하는 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    2-메틸 테트라하이드로푸란 중의 트리에틸아민 및 메탄설포닐 클로라이드를 상기 유기상 중의 INT12에 가하여 제2 반응 용액 중에 ((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일 메탄설포네이트)(INT13)를 형성시키는 단계; 및
    DMSO 중의 INT13을 회수하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 DMSO 중의 INT13 회수가
    DMSO를 상기 INT13을 갖는 제2 반응 용액에 가하는 단계; 및
    증류에 의해 2-메틸 테트라하이드로푸란의 적어도 90% w/w를 제거하는
    단계
    를 포함하는 방법.
  26. 제24항에 있어서,
    2.5 당량의 세슘 카보네이트 및 시토신을 상기 DMSO 중의 INT13에 가하여 제3 반응 용액 중에 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(INT14)을 형성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서,
    반응 온도를 약 33 내지 37 ℃에서 유지시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제26항에 있어서,
    사기 INT14가 약 95:5 초과의 N- 대 O-이성질체의 비를 갖는 방법.
  29. 제26항에 있어서,
    산을 상기 INT14를 갖는 제3 반응 용액에 가하여 4-아미노-1-((1S,4R,5S)-2-플루오로-4,5-디하이드록시-3-(하이드록시메틸)사이클로펜트-2-엔-1-일)피리미딘-2(1H)-온(RX-3117)을 형성시키는 단계;
    상기 RX-3117을 메틸 3급-부틸 에테르 및 물로 세척하여 유기상 및 RX-3117을 갖는 수성상을 형성시키는 단계; 및
    상기 RX-3117을 정제하여 RX-3117-MH를 형성시카는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 반응 혼합물을 메탄올로 충전시키는 단계 및 세척 단계 전에 약 1.0% 미만 면적의 아세토니드가 검출될 때까지 상기 반응 혼합물을 증류시켜 상기 아세토니드를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 세척 단계가
    상기 유기상으로부터 상기 RX-3117을 갖는 수성상을 분리시키는 단계;
    상기 RX-3117을 갖는 수성상을, 상기 수성상 중에서 약 0.5% w/w 미만의 트리틸 알콜이 검출될 때까지, 메틸 3급-부틸 에테르로 세척하는 단계;
    염기성 음이온 수지를 상기 RX-3117을 갖는 수성상에 가하여 슬러리를 형성시키는 단계;
    상기 슬러리를 여과하여 모액을 유지시키는 단계;
    상기 모액을 농축시켜 농축물을 형성시키는 단계; 및
    아세토니트릴을 상기 농축물에 가하여 정제된 RX-3117-MH를 형성시키는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  32. 3급-부틸(((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)옥시)디페닐실란(ASM11)으로부터 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(INT14)을 제조하기 위한 연속적인 방법으로서,
    상기 ASM11을 2-메틸 테트라하이드로푸란에 용해시키는 단계;
    테트라-n-부틸암모늄 플루오라이드를 가하여 ((3aS,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-올)(INT12)을 형성시키는 단계;
    2-메틸 테트라하이드로푸란 중의 트리메틸아민 및 메탄설포닐 클로라이드를 상기 INT12에 가하여 ((3aR,4R,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일 메탄설포네이트)(INT13)를 형성시키는 단계; 및
    세슘 카보네이트 및 시토신을 상기 INT13에 가하여 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(INT14)을 형성시키는 단계
    를 포함하며;
    상기 단계들을 INT12 또는 INT13의 단리 없이 하나 이상의 고정된 반응기에서 수행하는 방법.
  33. 4-아미노-1-((3aS,4S,6aR)-5-플루오로-2,2-디메틸-6-((트리틸옥시)메틸)-4,6a-디하이드로-3aH-사이클로펜타[d][1,3]디옥솔-4-일)피리미딘-2(1H)-온(INT14)으로부터 4-아미노-1-((1S,4R,5S)-2-플루오로-4,5-디하이드록시-3-(하이드록시메틸)사이클로펜트-2-엔-1-일)피리미딘-2(1H)-온 1H2O(RX-3117-MH)를 제조하기 위한 연속적인 방법으로서,
    상기 INT14를 산과 반응시켜 4-아미노-1-((1S,4R,5S)-2-플루오로-4,5-디하이드록시-3-(하이드록시메틸)사이클로펜트-2-엔-1-일)피리미딘-2(1H)-온(RX-3117)을 형성시키는 단계;
    상기 RX-3117을 메틸 3급-부틸 에테르 및 물로 세척하여 유기상 및 RX-3117을 갖는 수성상을 형성시키는 단계;
    상기 유기상으로부터 상기 RX-3117을 갖는 수성상을 분리시키는 단계;
    상기 RX-3117을 갖는 수성상을, 상기 수성상 중에서 약 0.5% w/w 미만의 트리틸 알콜이 검출될 때까지, 메틸 3급-부틸 에테르로 세척하는 단계;
    강한 염기성 음이온 수지를 상기 RX-3117을 갖는 수성상에 가하여 슬러리를 형성시키는 단계;
    상기 슬러리를 여과하여 모액을 유지시키는 단계;
    상기 모액을 농축시켜 농축물을 형성시키는 단계;
    아세토니트릴을 상기 농축물에 가하여 정제된 RX-3117-MH를 형성시키는 단계; 및
    상기 정제된 RX-3117-MH를 단리시키는 단계
    를 포함하며;
    상기 단계들을 하나 이상의 고정된 반응기에서 수행하는 방법.
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