KR20180038414A - 면역학적 검출 방법 및 이것에 사용하는 테스트 스트립 - Google Patents

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Abstract

분변 유래의 샘플을 불용성 멤브레인 중에서 전개시킴으로써 샘플 중의 피검출 물질을 검출하는 면역 크로마토그래피를 이용한 검출 방법에 있어서, 분변에 특유한 비특이 반응을 억제하는 방법 및 이것에 사용하는 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 제공하는 것을 과제로 한다. 항IgA 항체의 존재하에서, 면역 크로마토그래피 반응을 행함으로써 분변 유래 샘플 중의 피검출 물질을, 비특이 반응의 영향을 받지 않고 검출하는 방법 및 이것에 사용하는 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 제공한다.

Description

면역학적 검출 방법 및 이것에 사용하는 테스트 스트립
본 발명은 분변 유래 샘플에서 기인하는 면역 반응에 있어서의 비특이 반응 억제제, 이것을 이용한 비특이 반응 억제 방법 및 면역학적 검출 방법에 관한 것이다.
특히, 면역 크로마토그래피를 이용한 면역 반응에 있어서의 비특이 반응 억제제, 이것을 이용한 비특이 반응 억제 방법, 검출 방법 및 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립에 관한 것이다.
면역학적 검출 방법은, 특이성이나 감도가 높은 검출이 가능한 점에서 널리 보급되어 있다. 특히, 면역 크로마토그래피를 이용한 검출 방법은, 간편성의 점에서 널리 보급되어 있다. 당해 검출에 적용되는 시료로서는, 오줌, 분변, 타액, 혈액, 혈청 등을 들 수 있고, 이들은 임상 검사 시료로서 적합하며, 진단상 유용한 시료로서 널리 이용되고 있다.
이들 시료 중에 포함되는 피검출 물질을 면역 크로마토그래피를 이용하여 검출하기 위해서는, 시료 중에 포함되는 다양한 검출 방해 물질을 배제할 필요가 있다. 방해 물질로서는, 면역 크로마토그래피에 의한 시료의 전개 그 자체를 방해하는, 즉, 전개용 불용성 멤브레인의 막힘의 원인이 되는 물질이나, 피검출 물질이 존재하지 않음에도 불구하고, 정색 반응을 나타내는, 소위 비특이 반응의 원인이 되는 물질을 들 수 있다.
일반적으로, 불용성 멤브레인 중의 막힘의 원인이 되는 물질을 배제하기 위해서는, 샘플 패드에 그 분리 기능을 담보시키거나, 전혈을 시료로 하는 경우에는, 혈구를 배제하기 위해 혈구 분리막을 샘플 첨가부의 하류에 배치하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 비특이 반응에 대해서는 각종 원인을 생각할 수 있지만 아직 명확하지 않고, 따라서 대응책도 확립되지 않은 것이 현상황이다.
이러한 항원 항체 반응에 있어서의 비특이 반응을 블로킹하는 시약으로서 일반적으로는, 젤라틴, 카제인, 소혈청 알부민, 합성 고분자 등이 알려져 있고, 이들을 면역 크로마토그래피를 이용한 반응의 계 내에 공존시키는 방법이 알려져 있다(특허문헌 1, 특허문헌 2).
이와 같이, 비특이 반응에 의한 영향을 배제하기 위한 방법은 여러 가지 알려져 있지만, 분변 유래 샘플에서 기인하는 비특이 반응의 억제에 대하여 효과가 있는 것인지 여부에 대해서는 불분명하였다.
그런데, 특허문헌 3에는, 분변을 검체에 사용한 ELISA 등에서는 검출 감도가 낮고, 또한 비특이 반응이 많은 점에서 결과의 판정에 고심이 있다는, 분변을 검체로 하는 경우의 문제점을 들고, 이것을 해결하기 위해, 노로바이러스 또는 사포바이러스를 면역 크로마토그래피를 이용하여 검출할 때, pH 9.0 내지 10.0의 검체용 희석액을 사용함으로써 비특이 반응을 억제하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 본 방법에서는 검체 희석액으로서 일반적이지 않은 알칼리성으로 할 필요가 있기 때문에, 취급의 측면에 있어서 문제가 있었다.
일본 특허 공개 제2003-344406호 공보 일본 특허 공개 제2002-148266호 공보 일본 특허 공개 제2004-301684호 공보
본 발명은, 분변 유래 샘플 중의 피검출 물질을 면역학적으로 검출하는 방법에 있어서, 분변에 특유한 비특이 반응을 억제하는 비특이 반응 억제제 및 이것을 이용한 비특이 반응 억제 방법, 면역학적 검출 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
특히, 분변 유래 샘플을 불용성 멤브레인 중에서 전개시킴으로써 샘플 중의 피검출 물질을 검출하는 면역 크로마토그래피를 이용한 검출 방법에 있어서의 비특이 반응 억제제, 비특이 반응 억제 방법, 면역 크로마토그래피 검출 방법 및 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은, 분변 유래 샘플 중의 피검출 물질을 면역학적으로 검출할 때, 지금까지 일반적으로 사용되어 온 블로킹제로는 일정한 샘플에 효과는 있지만, 어떤 블로킹제로도 비특이 반응이 억제되지 않는 샘플, 즉, 분변 유래 샘플에 특유한 비특이 반응 원인 물질이 존재하는 것을 밝혀냈다.
그리고, 이러한 특유의 원인 물질에 대하여, 비특이 반응을 억제하는 효과를 갖는 물질을 검색한바, 의외로 항IgA 항체를 존재시킨 조건하에서 면역 측정법을 이용한 반응을 행함으로써, 비특이 반응을 억제하여, 위양성 반응을 방지하여 대상 물질을 정확하게 검출할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하의 구성을 갖는다.
<1> 분변 유래 샘플 중의 피검출 물질을 면역학적으로 검출하는 방법으로서, 항IgA 항체 존재하, 면역 반응을 행하는 상기 방법.
<2> 면역 반응이 항IgA 항체 및 항IgM 항체의 존재에서 행해지는, <1>에 기재된 방법.
<3> 면역학적으로 검출하는 방법이, 분변 유래 샘플을 불용성 멤브레인 중에서 전개시킴으로써 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 검출하는 면역 크로마토그래피를 이용한 검출 방법이며, 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 방법인, <1>에 기재된 방법.
(a) 항IgA 항체 존재하, 샘플과, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 접촉시켜 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 형성하는 공정
(b) 상기 복합체를 불용성 멤브레인 중에서 전개시켜, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 고정화된 검출부에서, 상기 복합체를 검출하는 공정
<4> (a)의 공정이, 항IgA 항체 및 항IgM 항체의 공존하에서, 샘플과, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 접촉시켜 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 형성하는 공정인, <3>에 기재된 방법.
<5> 분변 유래 샘플 중의 피검출 물질을 면역학적으로 검출하는 방법에 있어서의 비특이 반응 억제 방법으로서, 항IgA 항체 존재하, 면역 반응을 행하는 상기 방법.
<6> 면역 반응이 항IgA 항체 및 항IgM 항체의 존재에서 행해지는, <5>에 기재된 방법.
<7> 면역학적으로 검출하는 방법이, 분변 유래 샘플을 불용성 멤브레인 중에서 전개시킴으로써 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 검출하는 면역 크로마토그래피를 이용한 검출에 있어서의 비특이 반응 억제 방법이며, 이하의 공정 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 방법인, <5>에 기재된 방법.
(a) 항IgA 항체 존재하, 샘플과, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 접촉시켜 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 형성하는 공정
(b) 상기 복합체를 불용성 멤브레인 중에서 전개시켜, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 고정화된 검출부에서, 상기 복합체를 검출하는 공정
<8> (a)의 공정이, 항IgA 항체 및 항IgM 항체의 공존하에서, 샘플과, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 접촉시켜 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 형성하는 공정인, <7>에 기재된 방법.
<9> 분변 유래 샘플을 불용성 멤브레인 중에서 전개시킴으로써, 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 검출하는 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립으로서, 콘쥬게이트는, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 것이며, 또한 이하의 구성 (1) 및 (2)를 포함하는, 상기 테스트 스트립.
(1) 샘플 공급부를 갖는 샘플 패드이며, 항IgA 항체가 용출 가능하게 유지되어 있는 상기 패드
(2) 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 고정화된, 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 검출하는 검출부를 갖는 불용성 멤브레인
<10> 콘쥬게이트가 용출 가능하게 유지되어 있는 콘쥬게이트 패드를 포함하는, <9>에 기재된 테스트 스트립.
<11> 샘플 패드에, 추가로 항IgM 항체가 용출 가능하게 유지되어 있는, <9> 또는 <10>에 기재된 테스트 스트립.
<12> 항IgA 항체를 유효 성분으로 하는, 분변 유래 샘플용 면역 반응에 있어서의 비특이 반응 억제제.
<13> 추가로 항IgM 항체를 함유하는, <12>에 기재된 비특이 반응 억제제.
항IgA 항체 존재하에서 면역 반응을 행함으로써, 분변 유래 샘플에서 기인하는 비특이 반응을 억제하여, 샘플 중의 피검출 물질을 정확하게 검출하는 것이 가능하게 되었다. 특히, 면역 반응으로서 면역 크로마토그래피를 이용함으로써, 분변 유래 샘플 중의 피검출 물질을 간편하면서도 정확하게 검출하는 것이 가능하게 되었다.
도 1은, 본 발명의 테스트 스트립의 모식 구성도이다.
도 2는, 본 발명의 비특이 반응 억제제를 첨가한 경우의 바이러스 검출 감도에 대한 영향을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
(항IgA 항체)
본 발명에 있어서의 항IgA 항체는, 분변 유래 샘플 중의 비특이 반응 원인 물질에 결합하여, 비특이 반응을 억제할 수 있는 항체이면 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 중 어느 것이든 된다. 항IgA 항체는 통상의 방법에 따라서 제조할 수 있다. 또한, 이들 항체의 분자 전체 외에도, 항원 항체 반응 활성을 갖는 항체의 기능성 단편도 본 발명에서는 동일하게 항체로서 취급한다. 항체의 기능성 단편으로서는, 예를 들어 F(ab')2, Fab' 등을 들 수 있다. 이들 기능성 단편은 상기 항체를 단백질 분해효소(예를 들어, 펩신이나 파파인 등)로 처리함으로써 제조할 수 있다. 또한, 항체는 수식하여 사용할 수도 있고, 고분자 화합물을 항체에 결합하거나, 화학 수식하여 유도체화한 것도 이용할 수 있다.
본 발명의 항IgA 항체는, 샘플 중의 비특이 반응을 억제할 수 있는 상태로 존재하면 되고, 면역 반응계에 첨가하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 샘플 희석액에 포함되어 있어도 되고, 또한 면역 크로마토그래피를 이용하는 경우에는, 샘플 패드, 제3 패드, 콘쥬게이트 패드, 검출 항체를 포함하는 불용성 멤브레인에 포함되어 있어도 된다.
불용성 멤브레인에 포함시키는 경우에는, 검출 항체의 존재 부위(검출부)보다도 상류측인 것이 바람직하다. 이 중에서도 특히, 샘플 희석액, 샘플 패드 또는 제3 패드에 포함되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 샘플 패드와 불용성 멤브레인이 동일한 패드를 포함하고, 동일 패드 상에서 상이한 부위에 샘플 공급부와 검출부의 역할을 담당시키는 경우에는, 항IgA 항체는 샘플 공급부에 존재하는 것이 바람직하다.
항IgA 항체는, 각 디바이스에 비특이 반응을 억제할 수 있는 양이 포함되어 있으면 되고, 예를 들어 1 디바이스당 함유량으로 10 내지 10000μg/테스트(test)를 들 수 있고, 10 내지 1000μg/테스트가 바람직하고, 25 내지 500μg/테스트가 더욱 바람직하고, 40 내지 200μg/테스트, 40 내지 100μg/테스트가 보다 한층 더 바람직하다.
또한, 분변 유래 샘플 중에 기인하는 비특이 반응을 보다 완전에 가까운 형태로 억제하기 위해, 본 발명의 항IgA 항체 이외에, 항IgA 항체의 비특이 반응 작용을 저해하지 않는 범위에서, 다른 비특이 반응 억제 물질과 조합하는 것도 가능하다. 그러한 물질로서는, 소위 시판되는 블로킹제나 항IgA 항체 이외의 항체, 예를 들어 항IgG 항체, 항IgM 항체, 항IgD 항체, 항IgE 항체 등을 들 수 있다. 해당 블로킹제로서는, 예를 들어 네오 프로테인 세이버(NEO PROTEIN SAVER)(도요보 엔자임 가부시키가이샤), 이뮤노블록TM(DS 파마바이오메디칼 가부시키가이샤), 어플리 블록(Applie Block)(세이카가쿠 바이오 비즈니스 가부시키가이샤), SEA BLOCKTM/EIA/WB(East Coast Biologics사), 블로킹 원(Blocking One)(나카라이테스크사), 소혈청 알부민(이하, 「BSA」라고 함), 블로킹 펩타이드 프래그먼트(Blocking Peptide Fragment)(도요보 엔자임 가부시키가이샤), 스타팅 블록(Starting Block)TM(PBS) 블로킹 버퍼(Blocking Buffer)(Thermo Fisher Scientific사), 스마트 블록(Smart Block)TM(CANDOR Bioscience사), 헤테로 블록(Hetero Block)(OMEGA Biologicals사) 등으로부터, 반응계에 영향이 없는 것을 적절히 선택 가능하다. 항체로서는, 상기 중에서도 특히 항IgM 항체가 바람직하다.
본 발명자들은, 항IgA 항체 단독 및 항IgM 항체 단독으로는 억제할 수 없으며, 양자를 존재시킴으로써 비로소 억제할 수 있는 비특이 반응이 있음을 밝혀내었기 때문에, 양자를 조합함으로써 원인 물질을 넓게 억제하는 것에 처음으로 성공하였다. 항IgM 항체는, 그것이 주성분인 시약으로서 시판되고 있는 것으로서, HBR(이호성 저지 시약, 스칸티보디사)을 들 수 있다(Clinical Chemistry 45:7, 942-956, 1999).
항IgM 항체는, 1 디바이스당 함유량이 5 내지 500μg/테스트가 바람직하고, 10 내지 250μg/테스트가 더욱 바람직하고, 20 내지 100μg/테스트, 40 내지 100μg/테스트가 한층 더 바람직하다.
(샘플)
본 발명에 있어서, 시료로서는 분변을 사용한다. 분변은, 그대로 샘플로서 사용해도 되고, 적절히 희석액에 의해 희석하여 샘플로서 사용해도 된다. 또한, 적절히 희석하여 여과한 것을 샘플로서 사용해도 된다.
(피검출 물질)
본 발명의 피검출 물질로서는, 시료인 분변 중에 포함되고, 항원 항체 반응을 이용하여 검출할 수 있는 것이면 어느 것이든 되고, 바이러스, 기생충, 단백질 등을 들 수 있다.
예를 들어 감염성 위장염은, 바이러스 및 기생충이 주된 원인이며, 피검출 물질이 되는 바이러스로서는, 노로바이러스, 아데노바이러스, 로타바이러스, 사포바이러스, 엔테로바이러스 등을 들 수 있고, 피검출 물질이 되는 기생충으로서는 크립토스포리듐, 아메바 이질, 지아르디아 등을 들 수 있다.
이 외에도, 피검출 물질이 되는 바이러스로서 인플루엔자 바이러스, 피검출 물질이 되는 단백질로서는, 인간 헤모글로빈, B형 간염 바이러스 항체, C형 간염 바이러스 항체, 인간 면역 부전 바이러스 항체 등을 들 수 있다.
(면역학적 검출 방법)
본 발명에 의해 제공되는 면역학적 검출 방법은, 면역 반응을 이용하는 검출 방법이면 어느 것이든 되고, 예를 들어 입자 응집 면역 검정법인 라텍스 면역 응집법(이하, LTIA법이라고 함), 대표적인 표지 면역 검정법인 ELISA법, 면역 크로마토그래피를 이용한 검출 방법 등을 들 수 있지만, 이 중에서도 특히 면역 크로마토그래피를 이용한 검출 방법이 바람직하다.
(LTIA법)
LTIA법은, 전형적으로는, 2종 이상의 항검출 대상 항체를 사용하여, 적어도 1종을 라텍스에 고정화시키고, 분변 샘플 중의 피검출 물질과 라텍스 고정화 항체와의 면역 복합체를 형성시켜 응집시킴으로써 대상 물질을 검출하는 방법이다.
임상 검사에서 사용되는 LTIA법의 시약은, 통상, 제1 시액, 제2 시액의 형태로 제공되고, 순차적으로 샘플과 혼합하여 사용된다.
본 발명의 항IgA 항체는, 제1 시액 또는 제2 시액 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 포함되는 경우가 있지만, 적어도 제1 시액에 포함되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명에 있어서 항IgM 항체를 포함하는 경우도, 제1 시액 또는 제2 시액 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 포함되는 경우가 있지만, 적어도 제1 시액에 포함되어 있는 것이 바람직하다.
LTIA법에 사용되는 라텍스 입자는, 감도 향상 등의 원하는 성능을 얻기 위해, 재질이나 입자 직경, 표면 하전량을 적절히 선택할 수 있다. 라텍스 입자로서는, 항검출 대상 항체의 담지에 적합한 것이면 된다. 예를 들어, 폴리스티렌, 스티렌-스티렌술폰산(염) 공중합체, 스티렌-메타크릴산 공중합체, 아크릴니트릴-부타디엔-스티렌 공중합체, 염화비닐-아크릴산에스테르 공중합체, 아세트산비닐-아크릴산에스테르 공중합체 등을 들 수 있다. 라텍스 입자의 형상은 특별히 한정되지 않지만, 그의 평균 입자 직경은, 라텍스 입자 표면의 항체와 검출 대상과의 응집 반응의 결과로 발생하는 응집체가, 육안 또는 광학적으로 검출되기에 충분한 크기를 갖는 것이 바람직하다. 바람직한 평균 입자 직경으로서는 0.02 내지 1.6㎛이며, 특히 0.03 내지 0.5㎛가 바람직하다. 또한, 금속 콜로이드, 젤라틴, 리포솜, 마이크로캡슐, 실리카, 알루미나, 카본 블랙, 금속 화합물, 금속, 세라믹스 또는 자성체 등의 재질로 이루어지는 입자를 라텍스 입자 대신에 사용할 수도 있다.
(ELISA법)
ELISA법은, 전형적으로는 2종의 항검출 대상 항체를 사용하여, (a) 제1 항검출 대상 항체를 고정화한 고상(플레이트 등)에 시료를 첨가하여 분변 유래 샘플 중의 대상물과 고정화 항체의 복합체를 형성하고, (b) 표지 물질로 표지된 제2 항검출 대상 항체에 의해 당해 복합체와 샌드위치를 형성하고, 이것을 검출하는 방법이다.
본 발명의 항IgA 항체는, 시료를 희석하는 희석액에 포함되어 있는 경우, (a)의 고상에 미리 첨가되어 액상으로 존재하는 경우, 첨가된 후 건조되어 사용될 때까지 건조 상태로 존재하는 경우, 또는 (b)의 항체를 함유하는 용액에 포함되어 있는 경우 등, 고상 상에서 면역 반응이 행해질 때에 존재하고 있으면, 어느 것이든 되고, 이 중 시료를 희석하는 희석액에 포함되어 있는 경우가 바람직하다.
보다 상세하게는, 제1 항검출 대상 항체를 고정화한 고상(플레이트 등)은, 분변 유래 샘플 중의 검출 대상을 포착하여 검출 대상-항체 복합체를 형성한다. 표지 물질로 표지된 제2 항검출 대상 항체는, 당해 검출 대상-항체 복합체에 반응하여 샌드위치를 형성하고, 표지 물질에 따른 방법으로 표지 물질의 양을 측정함으로써, 샘플 중의 검출 대상을 측정할 수 있다. 제1 항검출 대상 항체의 고상으로의 고정화 방법, 제2 항검출 대상 항체의 표지 물질에 의한 표지 방법 등, 측정 시약(키트)을 구성하기 위한 구체적인 방법은 본 명세서 중에 기재된 방법 이외에도, 당업자에게 주지된 방법을 제한없이 사용할 수 있다. 이 구성의 경우, 호모지니어스 측정계로서 구성할 수도 있지만, 헤테로지니어스 측정계로서 구성하는 것이 바람직하다.
(면역 크로마토그래피를 이용한 검출 방법)
면역 크로마토그래피를 이용한 검출 방법은, 전형적으로는, 이하와 같은 테스트 스트립을 이용한다.
본 발명의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립은, 분변 유래의 샘플을 불용성 멤브레인 중에서 전개시킴으로써, 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 검출하는 테스트 스트립으로서, 콘쥬게이트는, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 것이며, 또한 이하의 구성 (1) 및 (2)를 갖고 있다.
(1) 샘플 공급부를 갖는 샘플 패드이며, 항IgA 항체가 용출 가능하게 유지되어 있는 상기 패드
(2) 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 고정화된, 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 검출하는 검출부를 갖는 불용성 멤브레인
콘쥬게이트는, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 것이며, 콘쥬게이트의 존재 양식으로서는, 콘쥬게이트 패드에 함침된 상태로 존재해도 되고(타입 A), 샘플 패드의 일부에 콘쥬게이트부로서 존재해도 되며(타입 B), 나아가, 테스트 스트립과는 별도로, 검체와 혼합되도록 개별의 콘쥬게이트 시약으로서 존재해도 된다(타입 C).
이하, 콘쥬게이트의 존재 양식이 상기 타입 A인 테스트 스트립에 대하여 설명한다.
샘플의 흐름 방향의 상류로부터 하류를 향해, 샘플 패드, 콘쥬게이트 패드, 제3 패드, 불용성 멤브레인의 순서로 배치되고, 각각 상하의 층과 적어도 일부가 중복되도록 배치된다. 이러한 배치예의 테스트 스트립을 도 1에 도시한다.
이러한 테스트 스트립의 샘플 패드에, 피검출 물질을 함유하는 샘플이 공급되면, 피검출 물질은 샘플 패드를 통과하여 하류측의 콘쥬게이트 패드로 흐른다. 콘쥬게이트 패드에서는, 피검출 물질과 콘쥬게이트가 접촉하여 복합체(응집체)를 형성하면서 당해 패드를 통과한다. 그 후, 복합체는 콘쥬게이트 패드의 하면에 접촉되어 배치된 다공질 제3 패드를 통과하여, 불용성 멤브레인으로 전개된다.
불용성 멤브레인에는, 그의 일부에 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 고정화되어 있기 때문에, 해당 복합체가 여기에서 면역 반응에 의해 결합하여 고정화되게 된다. 고정화된 복합체는, 콘쥬게이트에서 유래되는 흡광도 또는 반사광을 검출하는 수단에 의해 검출된다.
이어서, 콘쥬게이트의 존재 양식이 타입 B인 테스트 스트립에 대하여 설명한다.
상기 타입 A인 테스트 스트립과의 차이는, 샘플 패드와 콘쥬게이트 패드가 일체로 된 점이며, 즉, 샘플 패드의 일부에 샘플 공급부 및 콘쥬게이트부가 구성되어 있는 점이다.
상기 샘플 공급부는, 피검출 물질을 함유하는 샘플을 공급하는 부위이며, 상기 콘쥬게이트부는, 콘쥬게이트를 함유하는 부위이며, 샘플 공급부가 콘쥬게이트부의 상류측이 된다.
이어서, 콘쥬게이트의 존재 양식이 타입 C인 테스트 스트립에 대하여 설명한다.
상기 타입 A인 테스트 스트립과의 차이는, 콘쥬게이트 패드가 존재하지 않으며, 콘쥬게이트는 개별의 콘쥬게이트 시약으로서 존재하는 점이다. 예를 들어, 필터 중에 콘쥬게이트가 내장된 필터 팁을 들 수 있다. 이러한 필터 팁을 사용하여, 검체 희석액을 통과시킴으로써 콘쥬게이트와 피검출 물질이 결합하여, 복합체(응집체)를 형성한다. 이것을, 콘쥬게이트 패드를 갖지 않는 것 이외에는 타입 A와 동일한 상기 테스트 스트립에 공급함으로써, 피검출 물질을 검출할 수 있다.
(샘플 패드)
본 발명에 사용되는 샘플 패드는, 샘플을 받아들이는 부위(샘플 공급부)를 갖는다. 패드 형상으로 성형된 상태에서 액체 샘플을 흡수하고, 액체와 검출 대상물이 빠져나갈 수 있는 어떤 물질 및 형태도 포함한다. 샘플 패드에 적합한 재료의 구체예로서, 유리 섬유(글래스 파이버), 아크릴 섬유, 친수성 폴리에틸렌재, 건조지, 종이 펄프, 직물 등이 포함되지만, 이들에 한정되지 않는다. 적합하게는, 유리 섬유제 패드가 사용된다. 해당 샘플 패드에는, 후술하는 콘쥬게이트 패드의 기능을 겸비시킬 수도 있다. 또한, 샘플 패드에는, 항체 고정화 멤브레인에 있어서의 비특이적 반응(흡착)을 방지·억제할 목적으로, 통상적으로 사용되는 블로킹 시약을 포함시킬 수 있다.
(제3 패드)
제3 패드는, 시료의 성상 등에 따라 필요에 따라서 배치되는 것이 바람직하고, 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트의 복합체를 투과시킬 수 있는 것이면 어느 것이든 된다. 구체적으로는, 유리 섬유(글래스 파이버), 아크릴 섬유, 친수성 폴리에틸렌재, 건조지, 종이 펄프, 직물 등이 포함되지만, 특히, 폴리술폰 또는 셀룰로오스아세테이트를 포함하는 다공질성 부재인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 다공질성 제3 패드의 구멍 직경은, 평균 구멍 직경으로 1 내지 100㎛인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 10 내지 100㎛, 한층 더 바람직하게는 20 내지 80㎛이며, 25 내지 70㎛가 가장 바람직하다. 1㎛ 미만에서는 막힘의 원인이 되어, 검체의 흐름 자체가 불량해지기 때문이고, 100㎛보다 크면 상기 비특이 반응 물질을 포착할 수 없다고 생각되기 때문이다.
(불용성 멤브레인)
본 발명에 사용되는 불용성 멤브레인은, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 고정화된 적어도 하나의 검출부를 갖는다. 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원의 불용성 멤브레인 담체로의 고정화는, 종래 공지된 방법으로 실시할 수 있다. 래터럴 플로우식 면역 크로마토그래피 시약의 경우에는, 상기 항체 또는 항원을 소정의 농도로 함유하는 액을 제조하고, 노즐로부터 액을 일정한 속도로 토출하면서 수평 방향으로 이동시킬 수 있는 기구를 갖는 장치 등을 사용하여, 상기 액을 라인 형상으로 불용성 멤브레인 담체에 도포하고, 건조시킴으로써 고정화시킬 수 있다. 상기 액의 항체 또는 항원의 농도는 0.1 내지 5mg/mL가 바람직하고, 0.5 내지 2mg/mL가 더 적합하다. 또한, 항체 또는 항원의 불용성 멤브레인 담체로의 고정화량은, 래터럴 플로우식의 경우에는 상기 장치의 노즐로부터의 토출 속도를 조절함으로써 최적화할 수 있고, 0.5 내지 2μL/cm가 적합하다.
또한, 상기 래터럴 플로우식 면역 크로마토그래피 시약을 사용한 측정 방법은, 샘플이 모세관 현상에 의해 불용성 멤브레인 담체에 대하여 병행 방향으로 이동하도록 전개하는 방식의 측정 방법이다.
또한, 상기 항체 또는 항원을 소정의 농도로 함유하는 액은, 완충액에 항체 또는 항원을 첨가함으로써 제조할 수 있다. 해당 완충액의 종류로서는, 인산 완충액, 트리스 완충액, 굿(Good) 완충액 등 통상적으로 사용되는 완충액을 들 수 있다. 완충액의 pH는 6.0 내지 9.5의 범위가 바람직하고, 6.5 내지 8.5가 보다 바람직하고, 7.0 내지 8.0이 더욱 바람직하다. 완충액에는, 추가로 염화나트륨 등의 염류, 수크로오스 등의 안정제나 보존제, 프로클린(등록 상표) 등의 방부제 등을 포함해도 된다. 염류는 염화나트륨 등과 같이 이온 강도의 조정을 위해 포함시키는 것 이외에도, 수산화나트륨 등 완충액의 pH를 조정할 목적으로 첨가하는 것도 포함된다.
불용성 멤브레인에 항체 또는 항원을 고정화한 후, 추가로, 통상 사용되는 블로킹제를 용액 또는 증기상으로서 항체 또는 항원을 고정화한 부위 이외를 피복하여, 블로킹을 행할 수도 있다.
또한, 불용성 멤브레인에는, 종래부터 면역 크로마토그래피 시약으로 사용되고 있는 컨트롤 포착 시약을 고정화해도 된다. 해당 컨트롤 포착 시약은, 검정의 신뢰성을 담보하기 위한 시약이며, 콘쥬게이트 패드에 포함시킨 컨트롤 시약을 포착하는 것이다. 예를 들어, 콘쥬게이트 패드에 표지된 열쇠구멍삿갓조개(Keyhole Limpet) 유래 헤모시아닌(이하, KLH라고 함)을 컨트롤 시약으로서 포함하는 경우에는, 항KLH 항체 등이 컨트롤 포착 시약에 해당한다. 컨트롤 포착 시약을 고정화하는 위치는, 검정계의 설계에 적합하도록 적절히 선택할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 불용성 멤브레인을 구성하는 멤브레인으로서는, 종래부터 면역 크로마토그래피 시약의 불용성 멤브레인 담체로서 사용되고 있는 공지된 멤브레인을 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 나일론류, 유리, 셀룰로오스나 셀룰로오스 유도체 등의 다당류, 세라믹스 등을 포함하는 섬유로 구성되는 멤브레인을 들 수 있다. 구체적으로는, 사토리우스사, 밀리포어사, 도요 로시사, 와트만사 등이 시판하고 있는 유리 섬유 여과지나 셀룰로오스 여과지 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 사토리우스사, UniSart CN140이 바람직하다. 또한, 이 불용성 멤브레인 담체의 구멍 직경과 구조를 적절히 선택함으로써, 콘쥬게이트와 샘플 중의 피검출 물질과의 복합체가 불용성 멤브레인 담체 중을 흐르는 속도를 제어하는 것이 가능하다.
상기 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립은, 플라스틱제 점착 시트와 같은 고상 지지체 상에 배치시키는 것이 바람직하다. 해당 고상 지지체는, 샘플 및 콘쥬게이트의 모관류를 방해하지 않는 물질로 구성한다. 또한, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 고상 지지체 상에 접착제 등으로 고정화해도 된다. 이 경우, 접착제의 성분 등에 있어서도 샘플 및 콘쥬게이트의 모관류를 방해하지 않는 물질로 구성한다. 해당 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립은, 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 크기, 샘플의 첨가 방법이나 첨가 위치, 불용성 멤브레인의 검출부 형성 위치, 시그널의 검출 방법 등을 고려한 적당한 용기(하우징)에 저장·탑재하여 사용할 수 있고, 이렇게 저장·탑재된 상태를 「디바이스」라고 한다.
(피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원)
본 발명에서 사용되는 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원은, 피검출 물질에 결합 가능한 항체 또는 항원이며, 피검출 물질이 바이러스나 항원인 경우에는 항체, 피검출 물질이 항체인 경우에는 항원이 바람직하다. 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원은, 후술하는 표지체 및 검출부에 고정화된다. 표지체 및 검출부에 고정화되는 항체 또는 항원은 동일해도 되지만, 표지체와 검출부에서 다른 것이면 바람직하다.
(표지체)
본 발명에서 사용되는 표지체는, 종래부터 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립에 사용되고 있는 공지된 표지체를 사용할 수 있다. 예를 들어, 금 콜로이드 입자나 백금 콜로이드 입자 등의 콜로이드상 금속 입자, 컬러 라텍스 입자, 자성 입자, 형광 입자 등이 바람직하고, 특히 금 콜로이드 입자, 컬러 라텍스 입자가 바람직하다.
(콘쥬게이트)
본 발명에서 사용되는 콘쥬게이트는, 상기와 같은 표지체에 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 고정화된 것이다. 콘쥬게이트는, 피검출 물질로서 노로바이러스를 검출하는 경우, 금 콜로이드 입자에 항노로바이러스 모노클로날 항체가 고정화된 것이 바람직하다.
피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원을 표지체에 고정화시키는 방법으로서는, 물리 흡착, 화학 결합 등을 들 수 있고, 물리 흡착에 의해 고정화시키는 것이 일반적이다.
(기타)
본 발명의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립은, 측정 조건, 샘플에 따라서 다른 시약이나 구성을 더 포함할 수 있다.
다른 시약으로서는, 예를 들어 비특이 반응을 방지하는 블로킹제를 들 수 있다.
다른 구성으로서는, 예를 들어 불용성 멤브레인을 이동·통과한 샘플을 흡수함으로써, 샘플의 전개를 제어하는 흡수 패드를 들 수 있다.
본 발명의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 제작은 실시예에 기재된 방법을 적절히 수식·개변하여 행할 수 있다.
(키트)
본 발명의 면역 크로마토그래피를 이용한 검출 키트는, 상기 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 포함하는 것이면 된다. 본 검출 키트는, 그 밖에 검출에 필요한 시약, 시료의 희석액, 시험용 튜브, 간편 채취용 면봉, 취급 설명서, 테스트 스트립 저장용 하우징 등을 포함해도 된다.
(기타)
본 명세서 중, 상류 또는 하류라는 의미는, 샘플이 흐르는 방향의 상류측, 하류측이라는 의미로 사용한다. 즉, 본 발명의 테스트 스트립에서 위로부터 샘플 패드, 콘쥬게이트 패드, 제3 패드, 불용성 멤브레인이 일부가 겹치도록 적층되어 있는 경우, 샘플 패드가 가장 상류이며, 불용성 멤브레인이 하류이게 된다. 또한, 불용성 멤브레인의 하류측 단부가 겹치도록 위에 엔드 패드가 적층되는 경우가 있는데, 이 경우, 엔드 패드가 가장 하류이다.
실시예
[실시예 1] 비특이 반응 억제제의 스크리닝
일반적으로 비특이 반응 억제제로서 알려져 있는 블로킹제나 계면 활성제와 함께 항IgA 항체의 비특이 반응 억제 효과를 조사하였다.
1. 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 제작
1) 금 콜로이드 표지 항노로바이러스 모노클로날 항체(항노로바이러스 항체 콘쥬게이트)의 제조
(i) 금 콜로이드 용액의 제조
80℃로 가온한 정제수 5,000mL에, 5.0％ 시트르산삼암모늄 수용액 및 5.0％ 테트라클로로금(III)산 수용액을 각각 10mL씩 첨가하여, 교반하면서 10분간 반응시켰다. 그 후 반응액을 다시 가온하고, 35분 후 빙수 중에서 냉각시켜 평균 입자 직경 50nm의 금 콜로이드 용액을 제작하였다. 당해 금 콜로이드 용액을, RO수로, 극대 흡수 파장에서의 흡광도가 1.0OD/mL인 평균 입자 직경 50nm 금 콜로이드 용액(pH 8.5)으로 조정하였다.
(ii) 항노로바이러스 항체 콘쥬게이트의 제조
상기 (i)에서 얻어진 금 콜로이드 용액(pH 8.5) 20mL에 대하여, 50μg/mL 항노로바이러스 항체(코스모바이오사)를 포함하는 2mmol/L 붕산 수용액(pH 8.5) 1.0mL를 첨가하여, 10분간 교반하였다. 그 후, 10％ BSA를 1.5mL 첨가하고, 추가로 5분간 교반하여 항체 감작 금 콜로이드 용액을 제작하였다. 항체 감작 금 콜로이드 용액을 10℃에서 10000rpm 45분간 원심하여, 상청을 제거하고, 원심에 의해 침전된 항체 감작 금 콜로이드를 콘쥬게이트용 희석액(Conjugate Dilution Buffer, SCRIPPS사)으로 희석하여 회수하였다. 회수한 항체 감작 금 콜로이드를 극대 흡수 파장의 흡광도가 1.5 O.D./mL가 되도록 0.5％ 카제인을 포함하는 콘쥬게이트용 희석액으로 희석하여, 콘쥬게이트 패드 도포액으로 하였다(콘쥬게이트 패드 도포액 1).
상기 10％ BSA 대신에 다른 블로킹제인 BPF(블로킹 펩타이드 프래그먼트)(도요보 엔자임사제 BPF-301) 또는 NPS(네오 프로테인 세이버)(도요보 엔자임사제 NPS-301)를 동일한 농도로 첨가한 것 이외에는 동일하게 하여 항체 감작 금 콜로이드 용액을 제작하였다(콘쥬게이트 패드 도포액 2, 3).
콘쥬게이트 패드 도포액 1에, 계면 활성제인 에판 U108(다이이찌 고교 세야꾸 가부시끼가이샤 제조), 에판 485(다이이찌 고교 세야꾸 가부시끼가이샤 제조), 플루로닉 F68(가부시키가이샤 ADEKA사제)을 각각 0.1％, 0.1％, 0.05％가 되도록 첨가한 것도 아울러 조정하였다(콘쥬게이트 패드 도포액 4, 5, 6).
(iii) 컨트롤 라인용 금 콜로이드 표지 KLH(KLH 콘쥬게이트)의 제조
상기 1.0 OD/mL의 금 콜로이드 용액(pH 6.1) 20mL에 대하여, 2mmol/L 인산 완충액(pH 6.1)으로 620μg/mL가 되도록 용해시킨 KLH(시그마사제)를 1mL 첨가하여, 실온에서 10분간 교반하였다. 당해 금 콜로이드와 KLH와의 혼합액에 대하여, 10％ BSA 수용액을 1mL 첨가하여, 실온에서 5분간 교반하였다.
그 후, 10℃에서 11900×g으로 45분간 원심하였다. 상청을 제거한 후, 얻어진 침전물에, 상기 콘쥬게이트 희석액을 1mL 첨가하여 콘쥬게이트를 현탁시켜, KLH 콘쥬게이트를 얻었다.
2) 콘쥬게이트 패드의 제작
상기 1)에서 제조한 각 항노로바이러스 항체 콘쥬게이트 패드 도포액을 3 OD/mL, KLH 콘쥬게이트를, 각각 1.33％ 카제인, 4％ 수크로오스 용액(pH 7.5)과 혼합하여 콘쥬게이트액을 제작하고, 일정 체적의 유리 섬유제 패드(Millipore사)에 해당 패드 체적의 1.13배 용량 스며들게 하였다. 70℃의 드라이 오븐 내에서 45분간 가온함으로써 건조시켜, 콘쥬게이트 패드로 하였다.
3) 항노로바이러스 모노클로날 항체 고정화 멤브레인(불용성 멤브레인)의 제작
표지 항체는, 에피토프를 다르게 한 항노로바이러스 항체(코스모바이오사)를 0.75mg/mL가 되도록 2.5％ 수크로오스를 포함하는 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.2)으로 제조하여, 테스트 라인 도포액으로 하였다. 또한, 동일하게 항KLH 항체(토끼 유래)를 0.75mg/mL가 되도록 2.5％ 수크로오스를 포함하는 10mmol/L 인산 완충액(pH 7.2)으로 제조하여, 컨트롤 라인 도포액으로 하였다.
테스트 라인 도포액 및 컨트롤 라인 도포액을 니트로셀룰로오스 막(Sartorius사제)에 폭 1mm의 라인 형상으로 간격을 두고 도포하였다. 도포는 면역 크로마토그래피법용 디스펜서 「XYZ3050」(BIO DOT사제)을 사용하고, 도포량을 1.0μL/cm로 설정하여 실시하였다. 70℃의 드라이 오븐 내에서 45분간 가온함으로써 건조시켜 항체 고상화 멤브레인을 제작하였다.
4) 샘플 패드의 제작
0.5％ 수크로오스, 250mmol/L NaCl을 포함하는, 20mmol/L 트리스 완충액(pH 7.2)을 제조하여, 샘플 패드 도포액으로 하였다(샘플 패드 도포액 1).
또한, 상기 샘플 패드 도포액 1에 항IgA 항체(코스모바이오사)를 1.5mg/mL(90.7mg/테스트)가 되도록 첨가한 것을 아울러 조제하였다(샘플 패드 도포액 2).
일정 체적의 유리 섬유제 패드(Lydall사제)에 해당 패드의 2.58배 용량이 되도록 샘플 패드 도포액 1 또는 샘플 패드 도포액 2를 도포하고, 70℃의 드라이 오븐 내에서 45분간 가온함으로써 건조시켜 각 샘플 패드를 제작하였다.
5) 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 조립
도 1에, 본 발명의 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 모식 구성도를 나타냈다.
플라스틱제 점착 시트(a)에 불용성 멤브레인(b)을 붙이고, 이어서, 제3 패드(Pall사제)(g), 콘쥬게이트 패드(d), 샘플 패드(e)를 순서대로 배치 장착하고, 반대측 단부에는 흡수 패드(Whatman사제)(f)를 배치 장착하였다. 콘쥬게이트 패드에는, 금 콜로이드에 항노로바이러스 항체를 감작시킨 콘쥬게이트가 함침되어 있으며, 불용성 멤브레인에는, 항노로바이러스 항체(c1) 및 컨트롤 시약(c2)이 흐름 방향에 대하여 수직으로 라인 상에 고정화되고, 테스트 라인이 흐름 방향의 상류측이 되도록 배치되어 있다. 각 패드는, 상하의 패드와 그 일부가 접하도록 적층하여 배치된다. 항노로바이러스 항체(c1)를 포함하는 라인을 테스트 라인, 컨트롤 시약(c2)을 포함하는 라인을 컨트롤 라인이라 한다. 제3 패드는 폴리술폰을 포함하고, 평균 구멍 직경 20 내지 50㎛의 다공질막을 사용하였다. 이렇게 각 구성 요소를 중첩시킨 구조물을 일정 폭으로 절단하여 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립을 제작하였다. 테스트 스트립을 전용 플라스틱제 하우징에 저장·탑재하여, 면역 크로마토그래피 테스트 디바이스(도시하지 않음)의 형태로 할 수도 있다.
2. 시험 수순
정상인 9명의 분변을 검체로서 사용하였다(검체는 모두 노로바이러스 프리의 음성 검체임). 각 검체를 계면 활성제를 포함하는 20mmol/L 인산 완충액(pH 7.6)으로 현탁시켜 0.1g/mL로 하고, 볼텍스에 의해 잘 교반한 후 3000rpm으로 10분간 원심 분리를 행하여, 얻어진 상청을 샘플로 하였다.
상기 (i)에서 제작한 각종 테스트 스트립에 상기 샘플 120μL를 적하하고, 15분 후에 위양성의 유무를 눈으로 관찰하였다.
3. 시험 결과
관찰 결과를 표 1에 나타낸다. 비특이 반응 억제 효과가 있는 경우를 ○, 효과가 없는 경우를 ×로 나타낸다. 시판되고 있는 블로킹제 또는 계면 활성제를 첨가한 경우에는 모두 비특이 반응 억제 효과가 보이지 않으며, 위양성이 관찰되었다. 이에 비해 항IgA 항체를 첨가한 경우에는, 비특이 반응이 억제되었다.
Figure pct00001
[시험예 2] 항IgA 항체의 비특이 반응 억제 효과의 확인 시험
1. 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 제작
샘플 패드 도포액으로서 이하 (1) 내지 (4), 콘쥬게이트 패드 도포액으로서 시험예 1의 콘쥬게이트 패드 도포액 1을 사용하여, 시험예 1과 동일하게 테스트 스트립을 제작하였다. 또한, HBR은, 유효 성분을 항IgM 항체로 하는 비특이 반응 억제제이다(Clinical Chemistry 45:7, 942-956, 1999).
(1) 시험예 1의 샘플 패드 도포액 1
(2) 시험예 1의 샘플 패드 도포액 1에 HBR(Scantibody사제)을 0.75mg/mL(45.4μg/테스트)가 되도록 첨가
(3) 시험예 1의 샘플 패드 도포액 1에 항IgA 항체(염소 유래)를 1.5mg/mL(90.7μg/테스트)가 되도록 첨가
(4) 시험예 1의 샘플 패드 도포액 1에 항IgA 항체(염소 유래)를 1.5mg/mL(90.7μg/테스트), HBR을 0.75mg/mL(45.4μg/테스트)가 되도록 첨가
2. 시험 수순
정상인 42명의 분변을 검체로서 사용하였다(검체는 모두 노로바이러스 프리의 음성 검체임). 각 검체를, 계면 활성제를 포함하는 20mmol/L 인산 완충액(pH 7.6)에 현탁시켜 0.1g/mL로 하고, 볼텍스에 의해 잘 교반한 후 3000rpm으로 10분간 원심 분리를 행하여, 얻어진 상청을 샘플로 하였다.
상기 (i)에서 제작한 테스트 스트립에 상기 샘플 120μL를 적하하고, 10, 15, 30분 후에 위양성의 유무를 눈으로 관찰하였다. 눈으로 관찰한 결과는, 테스트 라인의 발색 강도를 「컬러 차트」라는 색 견본을 사용하여 수치화하였다. 컬러 차트에 의한 발색 강도는 0 내지 4까지 0.25 간격의 값으로 수치화되어 있다. 발색 강도의 평가 결과로부터, 비특이 반응의 강도 평가를 행하였다.
각 평가 기준은, 이하와 같다.
++: 강한 비특이 반응 있음(1.0 이상)
+: 약한 비특이 반응 있음(0.25 이상 1.0 미만)
-: 비특이 반응 없음(0)
Figure pct00002
Figure pct00003
3. 시험 결과
(1) 비특이 반응 억제 효과
42검체 중, 항IgA 항체를 첨가하지 않은 경우에서도 비특이 반응이 관찰되지 않는 검체(즉, 음성 검체)가 있었다(결과는 표에 나타내지 않음). 이들 음성 검체를 제외한 나머지 17검체는, 항IgA 항체를 첨가하지 않은 경우에 비특이 반응이 일어나는 검체(위양성 검체)였다. 이 위양성 검체(검체 번호 1-17)에 대하여 HBR(주성분: 항IgM 항체)만 첨가, 항IgA 항체만 첨가, HBR 및 항IgA 항체의 양쪽을 첨가한 경우의 비특이 반응 억제 효과를 조사하고, 결과를 표 2에 나타냈다.
검체 번호 1-3에 대해서는, 항IgA 항체를 첨가한 경우에 효과가 있고, HBR을 첨가해도 비특이 반응은 억제되지 않았음을 알 수 있다.
검체 번호 4-7에 대해서는, HBR을 첨가한 경우에 비특이 반응 억제 효과가 있고, 항IgA 항체를 첨가해도 비특이 반응은 억제되지 않았음을 알 수 있다.
검체 번호 8-15에 대해서는, HBR 또는 항IgA 항체 중 어느 한쪽을 첨가하면 비특이 반응이 억제된 것을 알 수 있다.
검체 번호 16, 17에 대해서는, HBR만, 또는 항IgA 항체만의 한쪽의 첨가에서는 효과가 보이지 않으며, 양쪽을 첨가하여 비로소 비특이 반응이 억제된 것을 알 수 있다.
이상으로부터, 시판되고 있는 HBR과 동일하게, 항IgA 항체 단독으로도 약 70％의 위양성 검체에 효과가 있고, 양쪽을 조합함으로써 거의 모든 위양성 검체의 비특이 반응을 억제할 수 있었다.
[시험예 3] 바이러스 검출 감도에 대한 영향 확인 시험
항IgA 항체를 첨가하는 것에 의한 바이러스의 검출 감도에 대하여 조사하였다. 참고예로서 시판되고 있는 비특이 반응 억제제인 HBR을 첨가한 경우에 대해서도 조사하였다.
1. 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립의 제작
시험예 2와 같다.
2. 시험 수순
노로바이러스 양성 컨트롤을 생리 식염액으로 임의의 농도로 희석하였다. 희석한 노로바이러스 양성 컨트롤을 검체 희석액 1,000μL에 10μL 첨가하여, 샘플액으로 하였다.
상기 1.에서 제작한 테스트 스트립에 상기 샘플액을 120μL 적하하고, 15분 후의 테스트 라인에 있어서의 라인 강도를 컬러 차트를 사용하여 수치화하여 평가하였다.
3. 시험 결과
결과를 도 2에 도시한다. 항IgA 항체를 첨가한 것은, 노로바이러스 양성 컨트롤에 대한 감도의 저하가 보이지 않았다. 한편, 참고예의 HBR을 첨가한 예에서는, 검출 감도의 저하가 보였다.
이상으로부터, 항IgA 항체는 비특이 반응 억제제로서 실용성이 매우 높은 것을 알았다.
본 발명의, 항IgA 항체 존재하에서 면역 반응을 행함으로써, 분변 유래 샘플에서 기인하는 비특이 반응을 억제하고, 샘플 중의 피검출 물질을 정확하게 검출하는 것이 가능하게 되었다. 특히, 면역 반응으로서 면역 크로마토그래피를 이용함으로써, 분변 유래 샘플 중의 피검출 물질을 간편하면서도 정확하게 검출하는 것이 가능하게 되었다.
나아가, 항IgM 항체와 조합함으로써 매우 높은 확률로 비특이 반응을 억제할 수 있고, 검출 감도의 저하도 일어나지 않기 때문에 매우 유용한 면역학적 검출 방법을 제공할 수 있었다.
(a) 플라스틱제 점착 시트
(b) 불용성 멤브레인
(c1) 항노로바이러스 항체
(c2) 컨트롤 시약
(d) 콘쥬게이트 패드
(e) 샘플 패드
(f) 흡수 패드
(g) 제3 패드

Claims (13)

  1. 분변 유래 샘플 중의 피검출 물질을 면역학적으로 검출하는 방법으로서, 항IgA 항체 존재하, 면역 반응을 행하는, 상기 방법.
  2. 제1항에 있어서, 면역 반응이 항IgA 항체 및 항IgM 항체의 존재에서 행해지는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 면역학적으로 검출하는 방법이, 분변 유래 샘플을 불용성 멤브레인 중에서 전개시킴으로써 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 검출하는 면역 크로마토그래피를 이용한 검출 방법이며, 이하의 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 방법인, 방법.
    (a) 항IgA 항체 존재하, 샘플과, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 접촉시켜 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 형성하는 공정
    (b) 상기 복합체를 불용성 멤브레인 중에서 전개시켜, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 고정화된 검출부에서, 상기 복합체를 검출하는 공정
  4. 제3항에 있어서, (a)의 공정이, 항IgA 항체 및 항IgM 항체의 공존하에서, 샘플과, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 접촉시켜 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 형성하는 공정인, 방법.
  5. 분변 유래 샘플 중의 피검출 물질을 면역학적으로 검출하는 방법에 있어서의 비특이 반응 억제 방법으로서, 항IgA 항체 존재하, 면역 반응을 행하는, 상기 방법.
  6. 제5항에 있어서, 면역 반응이 항IgA 항체 및 항IgM 항체의 존재에서 행해지는, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 면역학적으로 검출하는 방법이, 분변 유래 샘플을 불용성 멤브레인 중에서 전개시킴으로써 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 검출하는 면역 크로마토그래피를 이용한 검출에 있어서의 비특이 반응 억제 방법이며, 이하의 공정 (a) 및 (b)의 공정을 포함하는 방법인, 방법.
    (a) 항IgA 항체 존재하, 샘플과, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 접촉시켜 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 형성하는 공정
    (b) 상기 복합체를 불용성 멤브레인 중에서 전개시켜, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 고정화된 검출부에서, 상기 복합체를 검출하는 공정
  8. 제7항에 있어서, (a)의 공정이, 항IgA 항체 및 항IgM 항체의 공존하에서, 샘플과, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 콘쥬게이트를 접촉시켜 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 형성하는 공정인, 방법.
  9. 분변 유래 샘플을 불용성 멤브레인 중에서 전개시킴으로써, 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 검출하는 면역 크로마토그래피용 테스트 스트립으로서, 콘쥬게이트는, 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 표지체에 고정화된 것이며, 또한 이하의 구성 (1) 및 (2)를 포함하는, 상기 테스트 스트립.
    (1) 샘플 공급부를 갖는 샘플 패드이며, 항IgA 항체가 용출 가능하게 유지되어 있는 상기 패드
    (2) 피검출 물질에 대하여 면역학적으로 반응하는 항체 또는 항원이 고정화된, 샘플 중의 피검출 물질과 콘쥬게이트와의 복합체를 검출하는 검출부를 갖는 불용성 멤브레인
  10. 제9항에 있어서, 콘쥬게이트가 용출 가능하게 유지되어 있는 콘쥬게이트 패드를 포함하는, 테스트 스트립.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 샘플 패드에, 추가로 항IgM 항체가 용출 가능하게 유지되어 있는, 테스트 스트립.
  12. 항IgA 항체를 유효 성분으로 하는, 분변 유래 샘플용 면역 반응에 있어서의 비특이 반응 억제제.
  13. 제12항에 있어서, 항IgM 항체를 더 함유하는, 비특이 반응 억제제.
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