KR20180016722A - 재조합 glut1 아데노-관련 바이러스 벡터 작제물 및 glut1 발현을 회복하기 위한 관련된 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 Glut1 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV) 작제물 및 Glut1 결핍 포유류에서 Glut1 발현을 회복하기 위한 관련된 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, rAAV는 닭 β-액틴 프로모터를 추가로 포함하되, rAAV는 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로지를 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 AAV를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 용기 하우징을 포함하는 키트에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 BBB에서 Glut1 수송을 회복시키는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 Glut1 결핍증의 치료가 필요한 대상체에서 Glut1 결핍 증후군을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 GLUT1 아데노-관련 바이러스 벡터 작제물 및 GLUT1 발현을 회복하기 위한 관련된 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2015년 3월 10일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/130,899호에 대한 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
정부 지원의 언급
본 발명은 미국 국립 보건원에 의해 부여된 등록번호 R01 NS057482 하에서 정부 지원에 의해 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 가질 수 있다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 본 명세서에 전체가 참고로 포함된 서열 목록을 포함한다. 2016년 3월 4일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 01001-003887-WO0_SL.txt이며, 용량이 189,953 바이트이다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 재조합 Glut1 아데노-관련 바이러스 벡터(AAV) 작제물 및 Glut1 결핍 포유류에서 Glut1 발현을 회복하기 위한 관련된 방법에 관한 것이다.
글루코스는 포유류 뇌에 대한 주된 에너지 공급원이다. 용질 담체 패밀리 2로서도 알려진 글루코스 수송체 1(Glut1)은 혈액-뇌 장벽(BBB)에서 발현된 우세한 글루코스 수송체이며, 뇌로의 글루코스 유입을 초래하고, 가능하게 된 글루코스 수송체 패밀리의 처음으로 동정된 구성원(SLC2A)이다. Glut1 단백질을 암호화하는 인간 유전자 SLC2A1은 염색체 1(1p34.2)의 짧은 아암(arm)으로 국소화되었고, 길이가 35kb이며, 492개 아미노산의 단백질을 암호화하는 10개 엑손을 함유한다(서열번호 79). 단백질은 인간, 래트, 마우스 및 돼지를 포함하는 상이한 종 중에서 고도로 보존된다. mGlut1 단백질을 암호화하는 마우스 Slc2a1 유전자는 염색체 4에 대해 국소화되며, 인간 SLC2A1에 대해 매우 유사한 유전자 구조를 가진다(마우스 게놈 정보학)(492개의 아미노산 mGlut1 서열은 서열번호 78이다). 마우스 Slc2a1 cDNA(NM 011400)는 인간 SLC2A1cDNA에 대해 97% 초과로 동일하다. (문헌[Mueckler M et al, 1985; Veggiotti, P et al, 2013; Seidner et al, 1998] 참조).
Glut1 결핍 증후군(Glut1 DS, OMIM 606777)은 SLC2A1 유전자의 단상 부족에 의해 야기되는 희귀하지만 쇠약하게 하는 아동기의 신경학적 장애이다. Glut1 결핍 증후군은 상염색체-우성 장애이다. 가장 우세한 환자 표현형은 영아 발작, 후천적 소두증, 발달지체 및 수액당감소증을 포함한다(De Vivo D.C. et al. 1991).
질환에 대한 현재의 치료는 케톤체 생성성 식사의 사용을 포함하는데, 케톤체가 뇌에서 뉴런에 대한 대안의 에너지 공급원을 형성하기 때문이다. 그러나, 식이요법은 다량의 오일을 삼키는 것을 수반하고, 신경거동적 증상에 대해 단지 보통의 효과를 갖는 것으로 보고된다. 더 양호한 치료에 대한, 특히 환자에서 Glut1 발현을 회복하기 위한 유전자 요법에 대한 진행 중인 필요가 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 Glut1을 암호화하는 이식유전자(transgene)를 포함하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 아데노-관련 벡터(recombinant adeno-associated vector: rAAV)에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, Glut1은 서열번호 78 또는 79를 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV는 닭 베타-액틴 프로모터를 추가로 포함하되, rAAV는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로지를 수 있다. 특정 실시형태에서, 이식유전자는 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있다. 특정 실시형태에서, 닭 베타-액틴 프로모터는 서열번호 31, 38, 45, 54, 62 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, rAAV는 AAV8 또는 AAV9이다. 특정 실시형태에서, rAAV는 서열번호 48, 56, 59, 64 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA 요소를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV는 miRNA 요소에 측접하는 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 AAV를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 조성물은 약제학적 담체를 추가로 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 용기 하우징을 포함하는 키트에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 용기는 주사기이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 BBB를 가로지를 수 있고 또한 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있는 유효량의 본 명세서에 기재된 유효량의 임의의 재조합 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 혈액 뇌 장벽(BBB)에서 Glut1 수송을 회복시키는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 BBB를 가로지를 수 있고 또한 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있는 유효량의 본 명세서에 기재된 유효량의 임의의 재조합 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 Glut1 결핍 증후군의 치료가 필요한 대상체에서 Glut1 결핍 증후군을 치료하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 대상체에서 수액당감소증, 후천적 소두증, 운동실조 및 실조성 운동 기능장애로 이루어진 군으로부터 선택된 Glut1 결핍 증후군과 관련된 증상 중 적어도 하나를 완화시키는 방법에 관한 것이되, 상기 방법은 BBB를 가로지를 수 있고 또한 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있는 본 명세서에 기재된 유효량의 임의의 재조합 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
특정 양상에서, 본 발명의 실시형태는 SLC2A1 유전자의 결함 또는 반수체부족성을 특징으로 하는 대상체에서 Glut1 DS를 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 목적으로 하는 세포에서 Glut1 생성물을 발현시키는 프로모터 서열의 제어 하에서 정상/야생형 Glut1 단백질을 암호화하는 핵산 서열(즉, 이식유전자)을 운반하는 유효량의 재조합 아데노 관련 바이러스를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 프로모터 서열은 BBB 세포 내 Glut1 생성물의 발현을 제공한다. 특정 실시형태에서, 발현은 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서이다. 특정 실시형태에서, 이식유전자의 발현은 대상체에서 목적으로 하는 Glut1 수준을 회복하거나 또는 유지하는 데 필수적인 생성물을 세포에 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 Glut1 DS의 치료를 위한 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 주사에 적합한 담체 및 추가적인 성분과 함께 제형화될 수 있다.
본 발명의 다른 양상 및 이점은 이의 바람직한 실시형태의 다음의 상세한 설명에서 추가로 기재된다.
도 1A 내지 도 1D는 (10개) Glut1 암호화 작제물의 플라스미드 맵을 도시한 도면. 도 1A는 2A 암호화 서열과 함께 Glut1 및 EGFP 리포터 유전자를 운반하는 2개의 EGFP-2A-Glut1 작제물을 나타낸다. 도 1B는 2가지의 Glut1-2A-EGFP 작제물을 나타낸다. 도 1C는 2가지의 천연 Glut1 작제물을 나타낸다. 도 1D는 간 조직 내 Glut1의 발현을 선택적으로 끄는(turn off) 작용을 하는 miRNA-122 결합 부위 (Mir-122BS)를 운반하는 4가지 작제물을 나타낸다.
도 2A 내지 도 2C는 시험관내 CHO 세포 분석에서 AAV9-hGlut1-eGFP(서열번호 80) 작제물 및 Glut1 기능의 발현을 나타내는 블롯 및 그래프를 도시한 도면. 도 2A는 AAV9-hGlut1-eGFP 작제물의 발현을 입증하는 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 2B는 AAV9-hGlut1-eGFP 작제물로 형질감염된 CHO 세포 내로의 글루코스의 향상된 흡수를 나타내고; 기능성 분석에서 그의 수행 능력을 입증하는 그래프를 나타낸다. 도 2C는 CHO 세포 내로 형질감염 후에 작제물의 GFP 형광을 나타낸다.
도 3A 내지 도 3B는 Glut1 DS 마우스 내로 뮤린 slc2a1 유전자의 재도입 후에 향상된 운동 성능을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 도 3A는 AAV9-mGlut1(서열번호 35) 처리 돌연변이체 마우스에서 개선된 로타로드(rotarod) 수행을 나타내는 그래프이다. 도 3B는 처리된 돌연변이체 마우스에서 mGlut1의 회복 후 개선된 수직 폴 클라이밍(vertical pole climbing)을 나타내는 그래프이다.
도 4A 내지 도 4B는 AAV9-mGlut1(서열번호 35) 처리된 마우스에서 Glut1의 향상된 조직 특이적 발현을 나타내는 그래프를 도시한 도면. 도 4A는 처리된 돌연변이체 및 적절한 대조군에서 상대적 slc2a1 유전자 발현을 나타내는 그래프이다. 도 4B는 야생형 Glut1+/+ 마우스의 발현 백분율로서 Glut1 발현을 나타내는 그래프이다.
도 5a 내지 도 5d는 AAV9-mGlut1-처리 돌연변이체 마우스에서 증가된 Glut1 단백질 및 CSF 글루코스 수준을 나타내고; Glut1의 회복이 Glut1 DS 모델 마우스에서 수액당감소증을 완화시킨다는 것을 나타내는 블롯 및 그래프이다. 도 5a는 처리된 Glut1 DS 돌연변이체 마우스 및 적절한 대조군의 뇌 조직에서 Glut1 단백질의 웨스턴 블롯이다. 도 5b는 처리 Glut1 DS 돌연변이체 마우스 및 대조군에서 단백질 수준의 정량화를 나타내는 그래프이다. 도 5c는 AAV9-mGlut1(서열번호 35) 처리 마우스 및 대조군에서 혈액 및 CSF 글루코스 농도를 나타내는 그래프이다. 도 5d는 다양한 마우스에서 CSF:혈당 농도의 비를 나타내는 상자 수염도이다. 주의: N.S. - 유의하지 않음, *, P < 0.05, **, P < 0.01, ***, P < 0.001, 일원 ANOVA, N ≥8.
SLC2A1(또한 Glut1로서 지칭됨) 유전자 내 돌연변이는 Glut1 결핍 증후군(Glut1 DS)(희귀하지만, 엄청난 손상을 가하는 장애)을 초래한다(De Vivo D.C. et al. 1991). 야생형 Glut1 단백질은 광범위하게 발현된다. 그러나, 그의 우세한 세포 작용 부위는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 글루코스의 촉진된 수송에서 작용하는 뇌 미세 혈관의 내피세포가 되는 것으로 나타난다. 단백질의 감소된 수준 또는 상실은 복잡한 표현형을 초래하는데, 이의 특징은 수액당감소증, 발달지체 및 후천적 소두증을 포함한다. 환자는 또한 운동실조뿐만 아니라 근긴장 이상인 운동 표현형을 나타낸다. slc2a1 유전자에 대한 마우스 반가불충분성(haploinsufficient)은 인간 질환의 다수의 특징을 나타낸다. 뮤린 slc2a1 유전자의 동형 접합적 넉아웃은 배아 치명적이다. 반가불충분성 동물 모델은 인간 질환의 다수의 양상을 나타낸다. 본 발명은 뇌에서 Glut1 단백질 발현을 회복하기 위해 AAV9-Glut1 작제물을 이용하는 것에 관한 것이다. 이러한 방법 및 AAV9-Glut1 작제물은 인간 질환에 대해 효과적인 치료일 수 있다는 것이 예상된다. 참고의 용이함을 위해, 본 명세서에 기재된 벡터 작제물은 다양한 AAV9-Glut1 작제물로서 지칭되는데, 이는 요소들 중에서도 마우스 또는 인간 Glut1 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 AAV9 작제물을 나타낸다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 SLC2A1은 인간 유전자를 지칭하는 반면, slc2a1은 각각의 Glut1 단백질을 암호화하는 마우스 유전자를 지칭한다.
정의
따라서 본 발명은 이하에 구체적으로 정의되는 특정 기술적 및 과학적 용어를 더 용이하게 이해할 수 있다. 본 문헌의 다른 곳에서 구체적으로 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 다른 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가진다.
첨부된 청구범위를 포함하는 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 단어의 단수 형태는 달리 문맥이 명확하게 표시하지 않는 한 그들의 대응하는 복수의 언급을 포함한다.
"활성화", "자극" 및 "치료"는 세포에 또는 수용체에 적용될 때, 문맥에 의해 다르게 또는 명확하게 표시되지 않는 한, 예를 들어 리간드에 의한 세포 또는 수용체의 활성화, 자극 또는 치료와 같은 동일한 의미를 가질 수 있다. "리간드"는 천연 및 합성 리간드, 예를 들어, 사이토카인, 사이토카인 변이체, 유사체, 뮤테인, 및 항체로부터 유래된 결합 성분을 포함한다. "리간드"는 또한 소분자, 예를 들어, 사이토카인의 펩타이드 모방체 및 항체의 펩타이드 모방체를 포함한다. "활성화"는 내부 메커니즘뿐만 아니라 외부 또는 환경 인자에 의해 조절되는 세포 활성화를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 세포, 조직, 기관 또는 유기체의 "반응"은 변화가 활성화, 자극 또는 치료와, 또는 유전적 프로그래밍과 같은 내부 메커니즘과 상관관계가 있는 경우, 생화학적 또는 생리학적 거동의 변화, 예를 들어, 농도, 밀도, 생물학적 구획 내의 부착 또는 이동, 유전자 발현 속도, 또는 분화 상태를 포함한다.
분자의 "활성"은 리간드에 또는 수용체에, 촉매적 활성에 대한 분자의 결합; 유전자 발현 또는 세포 신호전달, 분화 또는 성숙을 자극하는 능력; 항원 활성, 다른 분자의 활성 조절 등을 기재하거나 또는 지칭할 수 있다. 분자의 "활성"은 또한 세포 대 세포 상호작용을 조절하거나 또는 유지함에 있어서의 활성, 예를 들어, 세포 구조를 유지함에 있어서의 부착 또는 활성, 예를 들어, 세포막 또는 세포골격을 지칭할 수 있다. "활성"은 또한 특이적 활성, 예를 들어, [촉매적 활성]/[㎎ 단백질] 또는 [면역학적 활성]/[㎎ 단백질], 생물학적 구획 내 농도 등을 의미할 수 있다. "활성"은 선천성 또는 적응 면역계의 성분 조절을 지칭할 수 있다.
"투여" 및 "치료"는 그것이 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때, 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 대한 외인성 약제, 치료제, 진단제의 접촉을 지칭한다. "투여" 및 "치료"는, 예를 들어, 치료적, 약동학적, 진단적, 연구 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 세포에 대한 시약의 접촉뿐만 아니라 유체가 세포와 접촉되는 경우 유체에 대한 시약의 접촉을 포함한다. "투여" 및 "치료"는 또한 시약, 진단, 결합, 결합 화합물에 의한 또는 다른 세포에 의한, 예를 들어, 세포의 시험관내 또는 생체밖 치료를 의미한다. 용어 "대상체"는 임의의 유기체, 바람직하게는 동물, 더 바람직하게는 포유류(예를 들어, 래트, 마우스, 개, 고양이, 토끼) 및 가장 바람직하게는 인간 환자를 포함하여 인간을 포함한다.
"치료하다" 또는 "치료하는"은 치료제, 예컨대 본 발명의 임의의 rAAV 작제물을 함유하는 조성물을 내적으로 또는 외적으로 상기 제제가 치료적 활성을 갖는 하나 이상의 질환 증상을 갖거나, 또는 질환을 갖는 것으로 의심되거나, 또는 질환을 획득할 위험이 상승된 대상체 또는 환자에게 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 제제는 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도에 의해 이러한 증상(들)의 퇴보를 유도하는 것에 의하든 또는 이러한 증상의 진행을 저해하는 것에 의하든 치료되는 대상체 또는 집단에서 하나 이상의 질환을 완화시키는 데 유효한 양으로 투여된다. 임의의 특정 질환 증상을 완화시키는데 유효한 치료제의 양(또한 "치료적 유효량"으로서 지칭됨)은 질환은 질환 상태, 환자의 연령 및 체중 및 대상체에서 목적으로 하는 반응을 유발하는 약물의 능력과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 질환 증상이 완화될 수 있었는지의 여부는 해당 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 다른 숙련된 건강관리 제공자에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 임상적 측정에 의해 평가될 수 있다. 본 발명의 실시형태(예를 들어, 치료 방법 또는 제조 물품)는 모든 대상체에서 표적 질환 증상(들)을 완화시킴에 있어서 유효하지 않을 수도 있지만, 당업계에 공지된 임의의 통계학적 검정, 예컨대 스튜던트 t-검정, 카이2-검정, 만-휘트니에 따른 U-검정, 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정(H-검정), 존키어-터프스프라(Jonckheere-Terpstra) 및 윌콕슨(Wilcoxon)에 의해 결정된 바와 같은 통계학적으로 유의한 대상체의 수에서 표적 질환 증상(들)을 완화시켜야 한다.
"치료"는 인간, 수의학 또는 연구 대상체에게 적용된다면, 연구 및 진단적 적용에 대한 치료적 치료, 예방적 또는 방지적 측정을 지칭한다. "치료"는 인간, 수의학 또는 연구 대상체, 또는 세포, 조직 또는 기관에 적용된다면, 인간 또는 동물 대상체, 세포 조직, 생리적 구획 또는 생리적 유체에 적용되는 임의의 rAAV 작제물의 형질감염 또는 본 발명의 관련된 방법을 포함한다.
"단리된 핵산 분자"는 폴리뉴클레오타이드의 모두 또는 일부와 관련되지 않은 게놈의 DNA 또는 RNA, mRNA, cDNA, 또는 이들의 합성 기점 또는 일부 조합물을 의미하며, 이때 단리된 폴리뉴클레오타이드는 천연에서 발견되거나, 또는 그것이 천연에서 연결되지 않은 폴리펩타이드에 연결된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 특정 뉴클레오타이드 서열을 "포함하는 핵산 분자"는 무손상 염색체를 포함하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 특정 핵산 서열을 "포함하는" 단리된 핵산 분자는, 특정 서열에 추가로, 10개까지 또는 심지어 20개 이상의 다른 단백질 또는 이의 일부 또는 단편에 대한 암호 서열을 포함할 수 있거나, 또는 나열된 핵산 서열의 암호 영역의 발현을 제어하는 작동 가능하게 연결된 조절 서열을 포함할 수 있고/있거나, 벡터 서열을 포함할 수 있다.
어구 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동 가능하게 연결된 암호 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 지칭한다. 예를 들어, 원핵 생물에 적합한 제어 서열은 프로모터, 선택적으로 작동자(operator) 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 사용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여있을 때 "작동 가능하게 연결된다". 예를 들어, 전서열 또는 분비 리더에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현된다면 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동 가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 미친다면 암호 서열에 작동 가능하게 연결되거나; 또는 리보솜 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 위치된다면 암호 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동 가능하게 연결된"은 연결되는 DNA 서열이 인접해 있고, 분비 리더의 경우에, 인접하고, 리딩 상(reading phase)에 있다는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접해서는 안 된다. 연결은 편리한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커는 통상적인 실행에 따라 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 호환적으로 사용되며, 모든 이러한 표기는 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 전달 수와 관련 없이 주요 대상체 세포 및 그들로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한 의도적인 또는 의도하지 않는 돌연변이에 기인하여 모든 자손이 정확히 동일한 DNA 내용물을 갖지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 본래 형질전환된 세포에서 선별된 바와 같은 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 표기가 의도된다면, 문맥으로부터 분명하게 될 것이다.
재조합 AAV
일부 양상에서, 본 발명은 단리된 AAV를 제공한다. AAV에 대해 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "단리된"은 천연 환경으로부터(예를 들어, 숙주 세포, 조직 또는 대상체로부터) 단리되거나 또는 인공적으로 생성된 AAV를 지칭한다. 단리된 AAV는 재조합 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 이러한 AAV는 본 명세서에서 "재조합 AAV"로서 지칭된다. rAAV의 이식유전자가 하나 이상의 사전결정된 조직(들)에 특이적으로 전달되도록 재조합 AAV(rAAV)는 바람직하게는 조직-특이적 표적화 능력을 가진다. AAV 캡시드는 이들 조직-특이적 표적화 능력을 결정함에 있어서 중요한 요소이다. 따라서, 표적화된 조직에 적절한 캡시드를 갖는 rAAV가 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, rAAV는 서열번호 97에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 AAV9 캡시드를 암호화하는 서열(예컨대 서열번호 96), 또는 그에 대해 실질적인 상동성을 갖는 단백질을 포함한다.
Glut1 DS를 치료하는 것과 관련하여 목적으로 하는 조직을 표적화하기 위해, 바람직한 rAAV는 본 명세서에 기재된 다양한 rAAV를 생성하는 AAV9 캡시드와 AAV2 골격의 조합이다(표 1 및 서열 목록을 참조).
목적으로 하는 캡시드 단백질을 갖는 재조합 AAV를 얻기 위한 방법이 기재되었다(예를 들어, 미국 특허 제2003/0138772호, 이의 내용은 그의 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨). 다수의 상이한 AAV 캡시드 단백질은, 예를 들어, 문헌[G. Gao, et al., J. Virol, 78(12):6381-6388 (June 2004); G. Gao, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 100(10):6081-6086 (May 13, 2003)]; 미국 특허 제2003-0138772호, 미국 특허 제2007/0036760호, 미국 특허 제2009/0197338호에 개시된 것에서 설명되며, AAV 캡시드 단백질 및 관련된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 관한 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 현재 기재된 작제물의 요망되는 패키징 및 방법을 위해, AAV9 벡터 및 캡시드가 바람직하다. 그러나, 다른 적합한 AAV, 예컨대 rAAVrh.8 및 rAAVrh.10, 또는 다른 유사한 벡터가 본 발명에서 사용하기에 적합할 수 있다는 것을 주목한다. 전형적으로, 상기 방법은 AAV 캡시드 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산; 기능성 rep 유전자; AAV 역위 말단 반복부(ITR) 및 이식유전자로 구성된 재조합 AAV 벡터; 및 AAV 캡시드 단백질 내로 재조합 AAV 벡터의 패키징을 허용하는 충분한 헬퍼 기능을 포함하는 숙주 세포를 배양시키는 단계를 수반한다.
AAV 캡시드에서 rAAV 벡터를 패키징하기 위해 숙주 세포 내에서 배양될 성분은 도중에 숙주 세포에 제공될 수 있다. 대안적으로, 필요한 성분 중 임의의 하나 이상(예를 들어, 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열 및/또는 헬퍼 기능)은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 필요한 성분 중 하나 이상을 함유하도록 조작된 적합한 숙주 세포에 의해 제공될 수 있다. 가장 적합하게는, 이러한 안정한 숙주 세포는 유도성 프로모터의 제어 하에서 필요한 성분(들)을 함유할 것이다. 그러나, 필요한 성분(들)은 구성적 프로모터의 제어 하에 있을 것이다. 또 다른 대안에서, 선택된 안정한 숙주 세포는 구성적 프로모터의 제어 하에서 선택된 성분(들) 및 하나 이상의 유도성 프로모터의 제어 하에서 다른 선택된 성분(들)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 293 세포(구성적 프로모터의 제어 하에서 E1 헬퍼 기능을 포함)로부터 유래되지만, 유도성 프로모터의 제어 하에서 rep 및/또는 cap 단백질을 포함하는 적합한 숙주 세포가 생성될 수 있다.
rAAV를 생성하기 위한 재조합 AAV 벡터, rep 서열, cap 서열 및 헬퍼 기능은 임의의 적절한 유전자 요소(벡터)를 이용하여 패키징 숙주 세포에 전달될 수 있다. 선택된 유전자 요소는 본 명세서에 기재된 것을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, 문헌[K. Fisher et al, J. Virol., 70:520-532 (1993)] 및 미국 특허 제5,478,745호 참조.
일부 실시형태에서, 재조합 AAV는 삼중 형질감염 방법을 이용하여 생성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제6,001,650호에 상세하기 기재된 바와 같음, 삼중 형질감염 방법에 관한 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨). 전형적으로, 재조합 AAV는 AAV 입자 내로 패키징될 재조합 AAV 벡터(이식유전자를 포함), AAV 헬퍼 기능 벡터 및 부속 기능 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 생성된다. AAV 헬퍼 기능 벡터는 도중에 생산적 AAV 복제 및 캡시드화를 위해 작용하는 "AAV 헬퍼 기능" 서열(즉, rep 및 cap)을 암호화한다. 바람직하게는, AAV 헬퍼 기능 벡터는 임의의 검출 가능한 야생형 AAV 비리온(즉, 기능성 rep 및 cap 유전자를 함유하는 AAV 비리온)을 생성하는 일 없이 효율적인 AAV 벡터 생성을 지원한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 벡터의 비제한적 예는 미국 특허 제6,001,650호에 기재되어 있는 pHLP19 및 미국 특허 제6,156,303호에 기재되어 있는 pRep6cap6 벡터를 포함하며, 이들 둘 다의 전문은 본 명세서에 참고로 포함된다. 부속 기능 벡터는 비-AAV 유래 바이러스 및/또는 AAV가 복제를 위해 의존하는 세포 기능(즉, "부속 기능")에 대한 뉴클레오타이드 서열을 암호화한다. 부속 기능은 AAV 유전자 전사의 활성화에 수반되는 해당 모이어티, 단계 특이적 AAV mRNA 스플라이싱, AAV DNA 복제, cap 발현 산물의 합성, 및 AAV 캡시드 조립체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 AAV 복제에 필요한 해당 기능을 포함한다. 바이러스 기반 부속 기능은 임의의 공지된 헬퍼 바이러스, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스바이러스(단순포진 바이러스 1형 이외), 및 백시니아 바이러스로부터 유래될 수 있다.
형질감염된 숙주 세포에 대해, 용어 "형질감염"은 세포에 의한 외래 DNA의 흡수를 지칭하기 위해 사용되며, 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입되었을 때 세포는 "형질감염"되었다. 다수의 형질감염 기법은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13:197] 참조. 이러한 기법은 하나 이상의 외인성 핵산, 예컨대 뉴클레오타이드 통합 벡터 및 다른 핵산 분자를 적합한 숙주 세포 내로 도입하기 위해 사용할 수 있다.
"숙주 세포"는 관심 대상의 물질을 보유하거나 또는 보유할 수 있는 임의의 세포를 지칭한다. 종종 숙주 세포는 포유류 세포이다. 숙주 세포는 AAV 헬퍼 작제물, AAV 미니유전자 플라스미드, 부속 기능 벡터, 또는 재조합 AAV의 생성과 관련된 다른 전달 DNA의 수용자로서 사용될 수 있다. 상기 용어는 형질감염된 본래의 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 "숙주 세포"는 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭할 수 있다. 단일 모 세포의 자손은 자연적, 우연한 또는 고의적인 돌연변이에 기인하여 본래의 모체와 형태 또는 게놈 또는 총 DNA 상보체가 완전히 동일할 필요가 있지는 않다는 것이 이해된다.
세포에 대해, 용어 "단리된"은 그의 천연 환경으로부터(예를 들어, 조직 또는 대상체로부터) 단리된 세포를 지칭한다. 용어 "세포주"는 시험관 내에서 지속적 또는 장기간의 성장 및 분화를 할 수 있는 세포 집단을 지칭한다. 종종, 세포주는 단일 전구세포로부터 유래된 클론 집단이다. 자발적 또는 유도된 변화가 이러한 클론 집단의 저장 또는 전달 동안 핵형에서 일어날 수 있다는 것이 추가로 알려져 있다. 따라서, 세포주로부터 유래된 세포는 조상 세포 또는 배양물과 정확하게 동일하지 않을 수도 있는 것으로 언급되고, 세포주는 이러한 변이체를 포함하는 것으로 언급된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 세포"는 외인성 DNA 세그먼트, 예컨대 생물학적으로-활성인 폴리펩타이드의 전사 또는 생물학적으로 활성인 핵산, 예컨대 RNA의 생성을 야기하는 DNA 세그먼트가 도입되는 세포를 지칭한다.
용어 "벡터"는 적절한 제어 요소와 관련될 때 복제할 수 있고, 세포 사이에서 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 유전자 요소, 예컨대 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 염색체, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등을 포함한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝 및 발현 비히클뿐만 아니라 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유용한 벡터는 전사될 핵산 세그먼트가 프로모터의 전사적 제어 하에 위치되는 해당 벡터인 것으로 상정된다. "프로모터"는 유전자의 특정 전사를 개시하는 데 필요한 세포의 합성 기작, 또는 도입된 합성 기작에 의해 인식되는 DNA 서열을 지칭한다. 어구 "작동 가능하게 위치된", "작동 가능하게 연결된", "제어 하에서" 또는 "전사 제어 하에서"는 RNA 중합효소 개시 및 유전자의 발현을 제어하는 핵산과 관련하여 프로모터가 정확한 위치 및 배향에 있다는 것을 의미한다. 용어 "발현 벡터 또는 작제물"은 서열을 암호화하는 핵산의 일부 또는 모두가 전사될 수 있는 핵산을 함유하는 임의의 유형의 유전자 작제물을 의미한다. 일부 실시형태에서, 발현은, 예를 들어, 전사 유전자로부터 생물학적으로-활성인 폴리펩타이드 생성물 또는 저해 RNA(예를 들어, shRNA, miRNA)를 생성하기 위한 핵산의 전사를 포함한다.
재조합 AAV 벡터
본 명세서에 기재된 "재조합 AAV(rAAV) 벡터"는 전형적으로 최소로, 이식유전자(예를 들어, 암호화 Glut1) 및 그의 조절 서열, 및 5' 및 3' AAV 역위 말단 반복부(ITR)로 구성된다. 이는 캡시드 단백질 내로 패키징되고 선택된 표적 세포에 전달되는 이런 재조합 AAV 벡터이다. 일부 실시형태에서, 이식유전자는 폴리펩타이드, 단백질, 기능성 RNA 분자(예를 들어, miRNA, miRNA 저해제) 또는 관심 대상의 다른 유전자 산물(예를 들어, Glut1)을 암호화하는 벡터 서열에 대해 이종성인 핵산 서열이다. 핵산 암호 서열은 표적 조직 세포에서 이식유전자 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동 가능하게 연결된다.
벡터의 AAV 서열은 시스-작용성 5' 및 3' 역위 말단 반복부 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 문헌[B. J. Carter, "Handbook of Parvoviruses", ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155 168 (1990)] 참조). ITR 서열은 전형적으로 길이가 약 145bp이다. 바람직하게는, 실질적으로 ITR을 암호화하는 전체 서열은, 이들 서열의 일정 정도의 약간의 변형이 허용 가능하다고 할지라도, 분자에서 사용된다. (예를 들어, 문헌[Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring harbor Laboratory, New York (1989); 및 K. Fisher et al., J. Virol., 70:520 532 (1996)]과 같은 교재를 참조). 이러한 분자의 예는 이식유전자를 함유하는 "시스-작용성" 플라스미드이며, 이때 선택된 이식유전자 서열 및 관련된 조절 요소는 5' 및 3' AAV ITR 서열에 측접한다. AAV ITR 서열은 현재 동정된 포유류 AAV 유형을 포함하는 임의의 공지된 AAV로부터 얻을 수 있다.
재조합 AAV 벡터에 대해 상기 확인한 요소에 추가로, 벡터는 또한 플라스미드 벡터로 형질감염되거나 또는 본 발명에 의해 생성된 바이러스에 의해 감염된 세포에서 그의 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 이식유전자에 작동 가능하게 연결된 통상적인 제어 요소를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심 대상의 유전자와 인접한 발현 제어 서열과 도중에 또는 관심 대상의 유전자를 제어하기 위한 거리에서 작용하는 발현 제어 서열을 둘 다 포함한다. 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 가공 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 (polyA) 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉., 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 필요할 때 암호화된 산물의 분비를 향상시키는 서열을 포함한다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직 특이적인 프로모터를 포함하는 매우 다수의 발현 제어 서열이 당업계에 공지되어 있으며, 이용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 핵산 서열(예를 들어, 암호 서열) 및 조절 서열은 조절 서열의 영향 또는 제어 하에서 핵산 서열의 발현 또는 전사를 위치시키는 방법으로 그들이 공유적으로 연결될 때 작동 가능하게 연결되는 것으로 언급된다. 핵산 서열이 기능성 단백질로 번역되는 것이 요망된다면, 두 DNA 서열은 5' 조절 서열 내 프로모터의 유도가 암호 서열의 전사를 초래한다면, 그리고 두 DNA 서열 사이의 연결 특성이 (1) 프레임-이동 돌연변이의 도입을 초래하거나, (2) 암호 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하거나, 또는 (3) 단백질로 번역될 대응하는 RNA 전사체의 능력을 방해한다면, 작동 가능하게 연결되는 것으로 언급된다. 따라서, 얻어진 전사체가 목적으로 하는 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역되도록 프로모터 영역이 DNA 서열의 전사를 달성할 수 있다면, 프로모터 영역은 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 유사하게, 2 이상의 암호 영역은, 통상적인 프로모터로부터의 그들의 전사가 프레임 내에서 번역되는 2 이상의 단백질의 발현을 초래하는 방법으로 그들이 연결될 때에 작동 가능하게 연결된다. 일부 실시형태에서, 작동 가능하게 연결된 암호 서열은 융합 단백질을 수득한다. 일부 실시형태에서, 작동 가능하게 연결된 암호 서열은 기능성 RNA(예를 들어, shRNA, miRNA)를 수득한다.
단백질을 암호화하는 핵산에 대해, 폴리아데닐화 서열은 일반적으로 이식유전자 서열 다음에 그리고3' AAV ITR 서열 앞에 삽입된다. 본 발명에서 유용한 rAAV 작제물은 또한 프로모터/인핸서 서열과 이식유전자 사이에 바람직하게 위치되는 인트론을 함유할 수 있다. 하나의 가능한 인트론 서열은 SV-40으로부터 유래되고, SV-40 T 인트론 서열로서 지칭된다. 사용될 수 있는 다른 벡터 요소는 내부 리보솜 유입 부위(IRES)이다. 단일 유전자 전사체로부터 하나 초과의 폴리펩타이드를 생성하기 위해 IRES 서열을 사용한다. 하나 초과의 폴리펩타이드 사슬을 함유하는 단백질을 생성하기 위해 IRES 서열을 사용한다. 이들 및 다른 통상적인 벡터 요소의 선택은 통상적이며, 다수의 이러한 서열을 이용 가능하다[예를 들어, 문헌[Sambrook et al, 및 그의 참고문헌, 예를 들어, 페이지 3.18 3.26 및 16.17 16.27 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989] 참조]. 일부 상황에서, 구제역 바이러스 2A 서열은 폴리단백질에 포함될 수 있으며, 이는 폴리단백질의 절단을 매개하는 것으로 나타난 작은 펩타이드(길이가 대략 18개 아미노산)이다(Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; 및 Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459). 2A 서열의 절단 활성은 플라스미드 및 유전자 요법 벡터(AAV 및 레트로바이러스)를 포함하는 인공 시스템에서 이전에 입증되었다(Ryan, M D et al., EMBO, 1994; 4: 928-933; Mattion, N M et al., J Virology, November 1996; p. 8124-8127; Furler, S et al., Gene Therapy, 2001; 8: 864-873; 및 Halpin, C et al., The Plant Journal, 1999; 4: 453-459; de Felipe, P et al., Gene Therapy, 1999; 6: 198-208; de Felipe, P et al., Human Gene Therapy, 2000; 11: 1921-1931.; 및 Klump, H et al., Gene Therapy, 2001; 8: 811-817).
숙주 세포에서 유전자 발현에 필요한 조절 서열의 정확한 특성은 종, 조직 또는 세포 유형에 따라 다를 수 있지만, 일반적으로 필요하다면, 전사 및 번역의 개시에 각각 연루된 5' 비전사 및 5' 비번역 서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, CAAT 서열, 인핸서 요소 등을 포함한다. 특히, 이러한 5' 비전사 조절 서열은 작동 가능하게 결합된 유전자의 전사적 제어를 위해 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함할 것이다. 조절 서열은 또한 필요하다면 인핸서 서열 또는 상류의 활성체 서열을 포함한다. 벡터는 선택적으로 5' 리더 또는 신호 서열을 포함할 수 있다.
구성적 프로모터의 예는 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 지님), 거대세포바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 지님)[예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 다이하이드로엽산 환원효소 프로모터, 13-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, 및 EFla 프로모터[인비트로젠(Invitrogen)]를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고, 외인성으로 공급된 화합물, 환경 인자, 예컨대 온도, 또는 특정 생리학적 상태의 존재, 예를 들어, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해, 또는 복제 세포에서만 조절될 수 있다. 유도성 프로모터 및 유도성 시스템은 인비트로젠, 클론테크(Clontech) 및 아리아드(Ariad)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 상업적 공급원으로부터 입수 가능하다. 외인성으로 공급된 프로모터에 의해 조절되는 유도성 프로모터의 예는 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터(No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:3346-3351 (1996)), 테트라사이클린-억제 시스템(Gossen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라사이클린-유도 시스템(Gossen et al, Science, 268:1766-1769 (1995), 또한 Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:512-518 (1998) 참조), RU486-유도성 시스템(Wang et al, Nat. Biotech., 15:239-243 (1997) 및 Wang et al, Gene Ther., 4:432-441 (1997)) 및 라파마이신-유도성 시스템(Magari et al, J. Clin. Invest., 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 본 내용에서 유용할 수 있는 또 다른 유형의 유도성 프로모터는 특정 생리학적 상태, 예를 들어, 온도, 급성기, 세포의 특정 분화 상태에 의해 또는, 복제 세포에서만 조절되는 것이다.
다른 실시형태에서, 이식유전자에 대한 천연 프로모터, 또는 이들의 단편이 사용될 것이다. 천연 프로모터는 이식유전자의 발현이 천연 발현을 모방하여야 하는 것이 요망될 때 바람직하다. 이식유전자의 발현이 일시적으로 또는 진행적으로, 또는 조직 특이적 방식으로, 또는 특정 전사 자극에 반응하여 조절되어야 할 때, 천연 프로모터가 사용될 수 있다. 추가 실시형태에서, 다른 천연 발현 제어 요소, 예컨대 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 코작 공통 서열은 천연 발현을 모방하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조절 서열은 조직-특이적 유전자 발현 능력을 부여한다. 일부 경우에, 조직-특이적 조절 서열은 조직 특이적 방식으로 전사를 유도하는 조직 특이적 전사 인자에 결합한다. 이러한 조직-특이적 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서 등)은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예시적인 조직-특이적 조절 서열은 다음의 조직 특이적 프로모터: 뉴런, 예컨대 뉴런 특이적 엔올라제(NSE) 프로모터(Andersen et al., Cell. Mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), 신경세사 경쇄 유전자 프로모터(Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. IDSA, 88:5611-5 (1991)), 및 뉴런 특이적 vgf 유전자 프로모터(Piccioli et al., Neuron, 15:373-84 (1995))를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 조직-특이적 프로모터는 뉴런 핵(NeuN), 신경교 섬유질 산성 단백질(GFAP), 선종성 용종증(APC), 및 이온화된 칼슘-결합 연결자 분자 1(Iba-1)로부터 선택된 유전자의 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 닭 베타-액틴 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 miRNA에 대한 하나 이상의 결합 부위는 이식유전자, 예를 들어, 비-CNS 조직을 보유하는 대상체의 하나 이상의 조직에서 이식유전자의 발현을 저해하기 위해 rAAV 벡터의 이식유전자 내에 혼입된다. 당업자는 결합 부위가 조직 특이적 방식으로 이식유전자의 발현을 제어하기 위해 선택될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 이식유전자로부터 발현된 mRNA가 간에서 miR-122에 결합되고 이에 의해 저해되도록 miR-122에 대한 결합 부위를 혼입함으로써 간에서의 이식유전자 발현은 저해될 수 있다. 이식유전자로부터 발현된 mRNA가 심장에서 miR-133a 또는 miR-1에 결합하고, 이에 의해 저해되도록 심장 내 이식유전자의 발현은 miR-133a 또는 miR-1에 대한 결합 무위를 혼입함으로써 저해될 수 있다. mRNA 내의 miRNA 표적 부위는 5' UTR, 3' UTR에 또는 암호 영역에 있을 수 있다. 전형적으로, 표적 부위는 mRNA의 3' UTR에 있다. 더 나아가, 다중 miRNA가 동일 또는 다중 부위를 인식함으로써 mRNA를 조절하도록 이식유전자가 설계될 수 있다. 다중 miRNA 결합 부위의 존재는 다중 RISC의 협동 작용을 초래하고, 발현의 고도로 효율적인 저해를 제공할 수 있다. 표적 부위 서열은 총 5 내지 100, 10 내지 60개 이상의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표적 부위 서열은 표적 유전자의 결합 부위 서열의 적어도 5개 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
이식유전자 암호 서열
rAAV 벡터의 이식유전자 서열의 조성은 얻어진 벡터가 놓이는 용도에 의존할 것이다. 예를 들어, 이식유전자 서열 중 하나의 유형은 발현 시 검출 가능한 신호를 생성하는 리포터 서열을 포함한다. 다른 예에서, 이식유전자는 치료적 Glut1 단백질 또는 치료적 기능성 RNA를 암호화한다. 다른 예에서, 이식유전자는 연구 목적을 위해 사용되도록, 예를 들어, 이식유전자를 보유하는 신체 유전자이식 동물 모델을 생성하도록, 예를 들어, 이식유전자 산물의 기능을 연구하도록 의도되는 단백질 또는 기능성 RNA를 암호화한다. 다른 예에서, 이식유전자는 질환의 동물 모델을 생성하기 위해 사용되도록 의도되는 단백질 또는 기능성 RNA를 암호화한다. 적절한 이식유전자 암호 서열은 당업자에게 명확할 것이다.
일부 양상에서, 본 발명은 포유류에서의 SLC2A1 유전자 결함(예를 들어, 유전성 유전자 결함, 체세포 유전자 변경), 예컨대, 대상체에서 Glut1 폴리펩타이드 결핍증을 초래하는 유전자 결함을 예방 또는 치료하고, 특히 Glut1 결핍증 나타내는 대상체에서 결핍증의 중증도 또는 정도를 치료하거나 또는 감소시키기 위한 방법에서 사용하기 위한 rAAV 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 Glut1 장애를 치료하기 위한 충분한 양 및 시간 기간 동안 이러한 장애를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에서, 상기 대상체에게 약제학적으로 허용 가능한 담체 내에서 하나 이상의 치료적 펩타이드, 폴리펩타이드, shRNA, 마이크로RNA, 안티센스 뉴클레오타이드 등을 암호화하는 rAAV 벡터의 투여를 수반한다.
재조합 AAV 투여
rAAV는 목적으로 하는 조직 세포를 형질감염시키기 위한 그리고 과도한 부작용 없이 충분한 수준의 유전자 전달 및 발현을 제공하기 위한 충분한 양으로 투여된다. 통상적인 및 약제학적으로 허용 가능한 투여 경로는 선택된 조직(예를 들어, 대뇌내 투여, 척추 강내 투여), 정맥내, 경구, 흡입(비강내 및 기관내 전달), 안구내, 정맥내, 근육내, 피하, 진피내, 종양내, 및 다른 비경구 투여 경로에 대한 직접 전달을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 원한다면 투여 경로는 조합될 수 있다.
대상체에 대한 특정 rAAV의 전달은, 예를 들어, 대상체의 혈류 내로 투여에 의할 수 있다. 혈류 내로의 투여는 정맥, 동맥 또는 임의의 다른 혈관 내로 주사에 의할 수 있다. 게다가, 특정 예에서, 뇌 조직, 뇌막, 뉴런 세포, 신경교세포, 성상세포, 희돌기교세포, 뇌척수액(CSF), 사이질 공간 등에 rAAV를 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 AAV는 당업계에 공지된 신경수술 기법을 이용하여, 예컨대 정위 주사에 의해 바늘, 카테터 또는 관련된 장치를 이용하여 심실 영역뿐만 아니라 선조체(예를 들어, 미상핵 또는 선조체의 피곡), 및 신경근 접합부, 또는 소뇌 소엽 내로 주사에 의해 척수 또는 뇌에 직접적으로 전달될 수 있다(예를 들어, 문헌[Stein et al., J Virol 73:3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; 및 Alisky and Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000] 참조). 특정 상황에서, 피하로, 췌장내로, 비강내로, 비경구로, 정맥내로, 근육내로, 대뇌내로, 척추 강내로, 대뇌내로, 경구로, 복강내로 또는 흡입에 의해 본 명세서에 개시된 적합하게 제형화된 약제학적 조성물 중에서 rAAV-기반 치료적 작제물을 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 실시형태에서, 미국 특허 제5,543,158호; 제5,641,515호 및 제5,399,363호(각각 그의 전문이 본 명세서에 구체적으로 포함됨)에 기재된 바와 같은 투여 양상은 rAAV를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
재조합 AAV 조성물
rAAV는 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 따라 조성물로 대상체에게 전달될 수 있다. 바람직하게는 생리적으로 적합한 담체 중에서(예를 들어, 조성물 중에서) 현탁된 rAAV는 대상체, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 양, 토끼, 말, 소, 염소, 돼지, 기닉픽, 햄스터, 닭, 칠면조 또는 비인간 영장류(예를 들어, 마카크)에게 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 rAAV를 단독으로, 또는 하나 이상의 다른 바이러스(예를 들어, 하나 이상의 상이한 이식유전자를 갖도록 암호화한 제2 rAAV)와 조합하여 포함할 수 있다.
적합한 담체는 rAAV가 지시하는 표시를 고려하여 당업자에 의해 용이하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 적합한 담체는 식염수를 포함하는데, 이는 다양한 완충제(예를 들어, 인산염 완충 식염수)를 이용하여 제형화될 수 있다. 다른 예시적인 담체는 멸균 식염수, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참깨유 및 물을 포함한다. 담체의 선택은 본 발명의 제한이 아니다.
선택적으로, 본 발명의 조성물은 rAAV 및 담체(들)에 추가로 다른 통상적인 약제학적 성분, 예컨대 보존제 또는 화학적 아정제를 함유할 수 있다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 솔브산칼륨, 솔브산, 이산화황, 갈산프로필, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학적 안정제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
목적으로 하는 효과 또는 "치료적 효과"를 달성하기 위해 필요한 rAAV 비리온의 용량, 예를 들어, 벡터 게놈/체중 킬로그램(vg/㎏)에서 용량 단위는 rAAV 투여 경로, 치료 효과를 달성하는 데 필요한 유전자 또는 RNA 발현 수준, 치료 중인 특정 질환 또는 장애 및 유전자 또는 RNA 산물의 안정성을 포함하는 몇몇 인자에 기반하여 다를 것이다. 당업자는 앞서 언급한 인자에 기반한 특정 질환 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 rAAV 비리온 용량 범위뿐만 아니라 당업계에 잘 공지된 다른 인자를 용이하게 결정할 수 있다. 유효량의 rAAV는 일반적으로 약 109 내지 1016개 게놈 복제물/대상체를 함유하는 약 10㎕ 내지 약 100㎖ 용액의 범위에 있다. 다른 용적의 용액이 사용될 수 있다. 사용되는 용적은 전형적으로 특히 대상체의 크기, rAAV의 용량 및 투여 경로에 의존할 것이다. 예를 들어, 척추 강내 또는 대뇌내 투여에 대해, 1㎕ 내지 10㎕ 또는 10㎕ 내지 100㎕ 범위의 용적이 사용될 수 있다. 정맥내 투여에 대해, 10㎕ 내지 100㎕, 100㎕ 내지 1㎖, 1㎖ 내지 10㎖ 이상 범위의 용적이 사용될 수 있다. 일부 경우에, 대상체마다 약 1010 내지 1012개 rAAV 게놈 복제물의 투약량이 적절하다. 특정 실시형태에서, 대상체 당 1012개 rAAV 게놈은 CNS 조직을 표적화하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에서 rAAV는 대상체 당 1010, 1011, 1012, 1013, 1014 또는 1015개 게놈의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서 rAAV는 ㎏ 당 1010, 1011, 1012, 1013 또는 1014개 게놈의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, rAAV 조성물은, 특히 높은 rAAV 농도가 존재하는 경우(예를 들어, 약 1013개 GC/㎖ 이상), 조성물 중의 AAV 입자의 응집을 감소시키도록 제형화된다. rAAV의 응집을 감소시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 계면활성제의 첨가, pII 조절, 염 농도 조절 등을 포함한다. (예를 들어, 문헌[Wright F R, et al., Molecular Therapy (2005) 12, 171-178], 이의 내용은 본 명세서에 참고로 포함됨)
다양한 치료 요법에서 본 명세서에 기재된 특정 조성물을 이용하는 것에 대한 적합한 투약 및 치료의 개발되는 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 활성 성분(들)의 백분율은 물론 변할 수 있고, 편리하게는 총 제형의 중량 또는 용적의 약 1 또는 2% 및 약 70% 내지 80% 이상일 수 있지만, 이들 제형은 적어도 약 0.1% 이상의 활성 성분을 함유할 수 있다. 자연적으로, 적합한 투약량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량에서 얻어질 수 있도록 각각의 치료적으로 유용한 조성물 중의 활성 성분의 양이 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용 가능성, 생물학적 반감기, 투여 경로, 제품 보관 수명뿐만 아니라 다른 약학적 고려사항과 같은 인자는 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려될 것이며, 그 자체로, 다양한 투약량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.
주사 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 주사 용액 또는 분산물의 즉석의 제조를 위한 멸균 수용액 또는 분산물 및 멸균 분말을 포함한다. 분산물은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물 중에서 그리고 오일 중에서 제조될 수 있다. 보통의 저장 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위한 보존제를 함유한다. 다수의 경우에, 형태는 멸균이며, 용이한 주사능이 존재하는 정도로 유체이다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정하여야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산물 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산물의 경우에 필요한 입자 크기의 유지에 의해 그리고 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용 방지는, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔브산, 티메로살 등에 의해 초래될 수 있다. 다수의 경우에, 등장제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직하다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 조성물 중에서 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 초래될 수 있다.
주사 가능한 수용액의 투여를 위해, 예를 들어, 필요하다면 용액은 적절하게 완충될 수 있고, 액체 희석제는 충분한 식염수 또는 글루코스를 이용하여 처음에 등장성으로 제공된다. 이들 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 당업자에게 공지될 것이다. 예를 들어, 1회 투약량은 1㎖의 등장성 NaCl 용액 중에서 용해될 수 있고, 1000㎖의 피하 주입 유체에 첨가되거나 제안된 주입 부위에서 주사될 수 있다(예를 들어, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, 페이지 1035-1038 및 1570-1580] 참조). 투약량의 일부 변화는 필연적으로 숙주 조건에 따라서 일어날 것이다. 투여에 책임이 있는 사람은 임의의 사례에서 개개 숙주에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
멸균 주사 용액은 본 명세서에 열거된 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 중에서 필요한 양으로 활성 rAAV를 혼입한 다음, 필요하다면 멸균 여과에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산물은 염기성 분산 매질 및 상기 열거한 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 다양한 멸균 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사용 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 + 이의 이전의 멸균 여과된 용액으로부터의 임의의 추가적인 목적으로 하는 성분의 분말을 수득하는 진공 건조 및 냉동 건조 기법이다.
본 명세서에 개시된 rAAV 조성물은 또한 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로-허용 가능한 염은 산 부가염(단백질의 유리 아미노기에 의해 형성됨)을 포함하고, 무기산, 예를 들어, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등에 의해 형성된다. 유리 카복실기에 의해 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제2철 수산화물, 및 유기염기, 예컨대 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래될 수 있다. 제형화 시, 용액을 투약량 제형과 양립 가능한 방식으로 그리고 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 다양한 투약 형태, 예컨대 주사 가능한 용액, 약물 방출 캡슐 등으로 용이하게 투여된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "담체"는 임의의 그리고 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅, 희석제, 항박테리아 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 보충적인 활성 성분이 또한 조성물 내에 혼입될 수 있다. 어구 "약제학적으로-허용 가능한"은 숙주에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다.
전달 비히클, 예컨대 리포좀, 나노캡슐, 마이크로입자, 미소구체, 지질 입자, 소수포 등은 본 발명은의 조성물의 적합한 숙주 세포의 조성물의 도입을 위해 사용될 수 있다. 특히, rAAV 벡터 유래 이식유전자는 전달을 위해 지질 입자, 리포좀, 소수포, 나노구체 또는 나노입자 등에 캡슐화되어 제형화될 수 있다.
이러한 제형은 본 명세서에 개시된 핵산 또는 rAAV 작제물의 약제학적으로 허용 가능한 제형의 도입에 바람직할 수 있다. 리포좀의 형성 및 사용은 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 최근에, 혈정 안정성 및 순환 반감기가 개선된 리포좀이 개발되었다(미국 특허 제5,741,516호). 추가로, 잠재적 약물 담체로서 리포좀 및 리포좀 유사 제제의 다양한 방법이 기재되어 있다(미국 특허 제5,567,434호; 제5,552,157호; 제5,565,213호; 제5,738,868호 및 제5,795,587호).
리포좀은 다른 절차에 의해 형질감염에 대해 정상적으로 저항하는 다수의 세포 유형에 의해 성공적으로 사용되었다. 추가로, 리포좀은 전형적인 바이러스 기반 전달 시스템인 DNA 길이 제약이 없다. 리포좀은 유전자, 약물, 방사선치료제, 바이러스, 전사 인자 및 다른 자리 입체성 효과기를 다양한 배양 세포주 및 동물 내로 도입하기 위해 효과적으로 사용되었다. 추가로, 리포좀-매개 약물 전달의 유효성을 시험함에 있어서 몇몇 성공적인 임상 시험이 완료되었다.
리포좀은 수성 매질 중에서 분산되는 인지질로부터 형성되고, 자발적으로 멀티라멜라 구심성 이중층 소수포(또는 멀티라멜라 소수포(MLV)로 칭해짐)를 형성한다. MLV는 일반적으로 직경이 25㎚ 내지 4㎛이다. MLV의 음파처리는 코어에서 수용액을 함유하는 직경이 200 내지 500Å 범위인 작은 단일 라멜라 소수포(SUV)의 형성을 초래한다.
대안적으로, rAAV의 나노캡슐 제형이 사용될 수 있다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재생할 수 있는 방법으로 물질을 잡을 수 있다. 세포내 중합체 과부하에 기인하는 부작용을 피하기 위해, 이러한 초미세 입자(크기가 대략 0.1㎛)는 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 이용하여 설계되어야 한다. 이들 필요조건을 충족시키는 생분해성 폴리알킬-사이아노아크릴레이트 나노입자가 사용을 위해 상정된다.
상기 기재한 전달 방법에 추가로, 숙주에 rAAV 조성물을 전달하는 대안의 방법으로서 다음의 기법이 또한 상정된다. 초음파영동(즉, 초음파)이 사용되며, 이는 순환계 내로 그리고 순환계를 통해 약물 침투 속도 및 효율을 향상시키기 위한 장치로서 미국 특허 제5,656,016호에 기재되어 있다. 상정된 다른 약물 전달 대안은 골내 주사(미국 특허 제5,779,708호), 마이크로칩 장치(미국 특허 제5,797,898호), 안과 제형(Bourlais et al., 1998), 경피 매트릭스(미국 특허 제5,770,219호 및 제5,783,208호) 및 피드백-제어 전달(미국 특허 제5,697,899호)이다.
rAAV 조성물의 전달에 관한 일반적 방법
본 발명은 rAAV 비리온을 포함하는 안정한 약제학적 조성물을 제공한다. 조성물은 냉동/해동 주기를 실시할 때 그리고 유리를 포함하는 다양한 물질로 이루어진 용기 중에서 저장될 때조차 안정하고 활성으로 남아있다.
관심 대상의 이종성 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 재조합 AAV 비리온은 유전자 전달을 위해, 예컨대 유전자 요법 용도에서, 유전자이식 동물의 생성을 위해, 핵산 백신 접종, 리보자임 및 안티센스 요법에서뿐만 아니라 다양한 세포 유형에 대한 시험관내 유전자의 전달을 위해 사용될 수 있다.
일반적으로, rAAV 비리온은 생체내에서 또는 시험관내 형질도입 기법을 이용하여 대상체의 세포 내로 도입된다. 시험관내에서 형질도입된다면, 목적으로 하는 수용자 세포는 대상체로부터 제거되고, rAAV 비리온을 이용하여 형질도입되며, 대상체에게 재도입될 것이다. 대안적으로, 해당 세포가 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않는다면, 동질유전자적 또는 이종 발생적 세포가 사용될 수 있다.
대상체에게 형질도입된 세포의 전달 및 도입을 위한 적합한 방법이 기재되었다. 예를 들어, 세포는 시험관내에서 재조합 AAV 비리온을 세포와 함께, 예를 들어, 적절한 배지에서 조합함으로써, 그리고 통상적인 기법, 예컨대 사우던 블롯 및/또는 PCR을 이용하거나 또는 선택 가능한 마커를 이용하여 관심 대상의 DNA를 보유하는 해당 세포를 선별함으로써 형질도입될 수 있다. 이어서, 형질도입된 세포는 이하에 더 완전하게 기재되는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있으며, 상기 조성물은 다양한 경로에 의해, 예컨대 근육내, 정맥내, 동맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해, 또는 평활근 내로, 예를 들어, 카테터를 이용하여 주사에 의해, 또는 기관 내로 직접적으로 도입될 수 있다.
생체내 전달을 위해, rAAV 비리온은 약제학적 조성물 내로 제형화될 수 있고, 일반적으로 비경구로, 예를 들어, 골격근 내로 직접적으로 근육내 주사, 관절내, 정맥내 또는 기관내로 직접적으로 투여될 것이다.
적절한 용량은 특히 치료 중인 대상체(예를 들어, 인간 또는 비인간 영장류 또는 다른 포유류), 치료될 대상체의 연령 및 일반적 상태, 치료 중인 병태의 중증도, rAAV 비리온의 투여 방식에 의존할 것이다. 적절한 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
따라서, "치료적 유효량"은 상대적으로 광범위에 속할 것이며, 이는 임상 시험을 통해 결정될 수 있다. 예를 들어, 생체내 주사, 즉, 대상체에게 직접적으로 주사를 위해, 치료적 유효 용량은 대략 약 105 내지 1016개의 rAAV 비리온, 더 바람직하게는 108 내지 1014개의 rAAV 비리온일 것이다. 시험관내 형질도입을 위해, 세포에 전달될 유효량의 rAAV 비리온은 대략 105 내지 1013, 바람직하게는 108 내지 1013개의 rAAV 비리온일 것이다. 조성물이 대상체에게 다시 전달될 형질도입 세포를 포함한다면, 약제학적 조성물 중의 형질도입 세포의 양은 약 104 내지 1010개의 세포, 더 바람직하게는 105 내지 108 세포일 것이다. 용량은 물론 형질도입 효율, 프로모터 강도, 메시지의 안정성 및 단백질 암호화된 요법 등에 의존한다. 유효한 투약량은 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적인 시험을 통해 당업자에 의해 용이하게 확립될 수 있다.
투약 치료는 상기 구체화된 양을 궁극적으로 전달하기 위한 단일 용량 스케줄 또는 다회 용량 스케줄일 수 있다. 게다가, 대상체는 적절하다면 다회 용량으로 투여될 수 있다. 따라서, 대상체에게, 예를 들어, 단일 용량으로 105 내지 1016개 rAAV 비리온, 또는 총괄적으로, 예를 들어, 105 내지 1016개의 rAAV 비리온의 전달을 초래하는 2, 4, 5, 6회 이상의 용량이 제공될 수 있다. 당업자는 투여하기 위한 적절한 다회 용량을 용이하게 결정할 수 있다.
따라서 약제학적 조성물은 치료적 유효량의 관심 대상의 단백질, 즉, 당해 질환 상태의 증상을 감소시키거나 또는 개선시키기 위한 충분한 양 또는 목적으로 하는 이점을 부여하기에 충분한 양을 생성하기 위한 충분한 유전자 물질을 포함할 거싱다. 따라서, rAAV 비리온은 1회 이상의 용량으로 주어질 때 치료 효과를 제공하기에 충분한 양으로 대상 조성물 중에 존재할 것이다. rAAV 비리온은 동결건조 제제로서 제공되고, 즉시 또는 장래의 사용을 위해 비리온-안정화 조성물 중에서 희석될 수 있다. 대안적으로, rAAV 비리온은 생성 직후에 제공되고, 장래의 사용을 위해 저장될 수 있다.
또한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 함유할 것이다. 이러한 부형제는 그 자체가 조성물을 받는 개체에게 해로운 항체의 생성을 유도하지 않고, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약제학적 제제를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제는 액체, 예컨대 물, 식염수, 글리세롤 및 에탄올을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 그 안에, 예를 들어, 무기산 염, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등; 및 유기산의 염, 예컨대 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염, 벤조산염 등이 포함될 수 있다. 추가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 이러한 비히클 중에 존재할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 철저한 논의는 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용 가능하다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "중합효소 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 특정 핵산 서열, RNA 및/또는 DNA가, 예를 들어, 미국 특허 제4,683,195호에 기재된 바와 같이 증폭되는 절차 또는 기법을 지칭한다. 일반적으로, 관심 대상 영역의 말단 또는 그 이후로부터의 서열 정보를 사용하여 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 설계한다. 이들 프라이머는 증폭될 주형의 반대 가닥에 대한 서열에서 동일 또는 유사할 것이다. 두 프라이머의 5' 말단 뉴클레오타이드는 증폭 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 총 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 서열, 및 총 세포 RNA로부터 전사된 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭시키기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로 문헌[Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR Technology (Stockton Press, N.Y.)] 참조. 본 명세서에 사용된 바와 같은, PCR은 특정 핵산 조각을 증폭시키거나 생성하기 위해 프라이머 및 핵산 중합효소로서 공지된 핵산의 사용을 포함하는 핵산 시험 샘플을 증폭시키는 핵산 중합효소 반응 방법의 하나의 예(그러나 유일하지는 않음)인 것으로 고려된다.
핵산
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 Glut1 단백질을 암호화하는 특정 작제물 및 핵산을 포함한다. 서열번호 28 내지 75, 및 80 내지 97, 및 특정 양상에서 서열번호 2 내지 5, 7 내지 9, 11 내지 14, 16 내지 18, 20 내지 23, 25 내지 27 및 80 내지 95 중 하나 이상을 포함하는 표 1에 열거된 선택 서열을 포함하는 특정 작제물 및 서열은 본 발명의 실시형태에서 유용할 수 있다. 예상치 못하게, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 것이 목적으로 하는 수준의 Glut1을 발현시키지 않는다 것을 발견하였다. 따라서, 바람직한 rAAV 작제물은 핵산 서열번호 6, 15 및/또는 24이 없으며, 이들 모두는 2A 암호화 서열에 대응한다.
바람직하게는, 핵산은 낮은, 보통의 또는 고도로 엄격한 조건 하에서 혼성화하고, 생물학적 기능을 유지하는 Glut1 단백질을 암호화한다. 제1 핵산 분자는 제1 핵산 분자의 단일 가닥 형태가 온도 및 용액 이온 강도의 적절한 조건 하에서 제2 핵산 분자로 어닐링될 수 있을 때, 제2 핵산 분자에 "혼성화할 수 있다"(Sambrook, et al., 상기 참조). 온도 및 이온 강도 조건은 혼성화의 "엄격성"을 결정한다. 전형적인 낮은 엄격 혼성화 조건은 55℃, 5X SSC, 0.1% SDS(폼아마이드 없음); 또는 42℃에서 30% 폼아마이드, 5X SSC, 0.5% SDS를 포함한다. 전형적인 보통의 엄격 혼성화 조건은 42°C에서 5X 또는 6X SSC 및 0.1% SDS와 함께 40% 폼아마이드이다. 고 엄격 혼성화 조건은 42°C에서 또는, 선택적으로, 더 고온에서(예를 들어, 57℃, 59℃, 60℃, 62℃, 63℃, 65℃ 또는 68℃) 50% 폼아마이드, 5X 또는 6X SSC이다. 일반적으로, SSC는 0.15M NaC1 및 0.015M 시트르산 Na이다. 혼성화는 혼성화의 엄격도에 따라서, 염기 사이의 미스매치가 가능하다고 할지라도 두 핵산이 상보적 서열을 함유하는 것을 필요로 한다. 핵산을 혼성화하기 위한 적절한 엄격도는 핵산의 길이 및 상보성 정도, 당업계에 잘 공지된 변수에 의존한다. 두 뉴클레오타이드 서열 사이의 유사성 또는 상동성 정도가 클수록, 핵산이 혼성화할 수 있는 조건 하에 엄격도는 더 크다. 길이가 100개 초과인 뉴클레오타이드의 혼성체에 대해, 용융 온도를 계산하기 위한 식을 유도하였다(문헌[Sambrook, et al., 상기 참조, 9.50-9.51] 참조). 더 짧은 핵산, 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드를 이용하는 혼성화에 대해, 미스매치 위치는 더 중요하게 되며, 올리고뉴클레오타이드 길이는 그의 특이성을 결정한다(문헌[Sambrook, et al., 상기 참조, 11.7-11.8] 참조).
본 명세서에 제공된 mGlut1 또는 hGlut1 아미노산 서열(예를 들어, 서열번호 78 및 서열번호 79)에 대해 적어도 약 70% 동일한, 바람직하게는 적어도 약 80% 동일한, 더 바람직하게는 적어도 약 90% 동일한 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 동일한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) 아미노산 서열을 포함하는 Glut1 폴리펩타이드는 BLAST 알고리즘에 의해 비교를 수행할 때, Glut1 기능을 회복하는 것에 대해 상정되되, 알고리즘의 매개변수는 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 가장 큰 매칭을 제공하도록 선택된다. 비교가 BLAST 알고리즘에 의해 수행될 때 임의의 기준 Glut1 아미노산 서열에 대해 적어도 약 70% 유사한, 바람직하게는 적어도 약 80% 유사한, 더 바람직하게는 적어도 약 90% 유사한 그리고 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 유사한(예를 들어, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%) 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드가 또한 본 발명의 작제물 및 방법에 포함되되, 알고리즘의 매개변수는 각각의 기준 서열의 전체 길이에 걸쳐 각각의 서열 사이의 가장 큰 매칭을 제공하도록 선택된다.
서열 동일성은 두 서열이 최적으로 정렬될 때 동등한 위치에서 두 폴리펩타이드의 아미노산이 동일한 정도를 지칭한다. 서열 유사성은 동일한 잔기 및 비동일한, 생화학적으로 관련된 아미노산을 포함한다. 유사한 특성을 공유하고, 상호 호환가능할 수 있는 생화학적으로 관련된 아미노산은 상기 논의된다.
"상동성"은 최적으로 정렬될 때 두 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 또는 두 폴리펩타이드 서열 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 두 비교 서열 둘 다에서 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어, 각각의 두 DNA 분자 내 위치가 아데닌에 의해 점유된다면, 분자는 해당 위치에서 상동성이다. 상동성 백분율은 두 서열에 의해 공유되는 상동성 위치의 수를 비교되는 위치의 총 수로 나누고 ×100을 한 것이다. 예를 들어, 서열이 최적으로 정렬될 때 두 서열에서 위치의 10개 중 6개가 매칭되거나 상동성이라면, 두 서열은 60% 상동성이다. 일반적으로, 최대 상동성 백분율을 제공하도록 두 서열이 정렬될 때 비교가 이루어진다.
다음의 참고문헌은 서열 분석을 위해 종종 사용되는 BLAST 알고리즘에 관한 것이다: 문헌[BLAST ALGORITHMS: Altschul, S.F., et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W., et al., (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L., et al., (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F., et al., (1997) 핵산 Res. 25:3389-3402; Zhang, J., et al., (1997) Genome Res. 7:649-656; Wootton, J.C., et al., (1993) Comput. Chem. 17:149-163; Hancock, J.M. et al., (1994) Comput. Appl. Biosci. 10:67-70; ALIGNMENT SCORING SYSTEMS: Dayhoff, M.O., et al., "A model of evolutionary change in proteins." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3. M.O. Dayhoff (ed.), pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Schwartz, R.M., et al., "Matrices for detecting distant relationships." in Atlas of Protein Sequence and Structure, (1978) vol. 5, suppl. 3." M.O. Dayhoff (ed.), pp. 353-358, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, DC; Altschul, S.F., (1991) J. Mol. Biol. 219:555-565; States, D.J., et al., (1991) Methods 3:66-70; Henikoff, S., et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919; Altschul, S.F., et al., (1993) J. Mol. Evol. 36:290-300; ALIGNMENT STATISTICS: Karlin, S., et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268; Karlin, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877; Dembo, A., et al., (1994) Ann. Prob. 22:2022-2039; 및 Altschul, S.F. "Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments." Theoretical and Computational Methods in Genome Research (S. Suhai, ed.), (1997) pp. 1-14, Plenum, New York].
본 발명은 또한 다양한 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제공하되, 숙주 세포가 벡터에 의해 형질감염될 때 핵산은 숙주 세포에 의해 인식되는 제어 서열에 작동 가능하게 연결된다. 또한 재조합 AAV 9 및 특정 AAV2 서열뿐만 아니라 닭 -β-액틴 프로모터 및 CMV 인핸서의 지시 하에서 Glut-1을 발현시키기 위한 핵산 서열을 포함하는 비리온이 제공된다. 이들 작제물 내에서, rAAV2 서열은 5' 및 3' ITR 서열, 예를 들어, 서열번호 2, 9, 29, 34, 36, 41 및 표 1에 기재된 바와 같은 다른 것에 대응한다). 이들 서열은 본 발명에서 Glut-1 결핍증에 대한 치료제인 비리온을 형성하기 위해 AAV9 캡시드에 의해 패키징되었다.
약제학적 조성물 및 투여
본 발명의 조성물의 약제학적 또는 멸균 조성물을 제조하기 위해, AAV9 벡터 또는 관련된 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)] 참조.
치료제 및 진단제의 제형은, 예를 들어, 동결건조 분말, 슬러리, 수용액 또는 현탁액의 형태로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, NY; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, NY; Avis, et al. (eds.)(1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.)(1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, NY] 참조).
단독으로 또는 다른 제제와 조합하여 투여되는 치료 조성물의 독성 및 치료 효능은, 예를 들어, LD50(집단의 50%에 대한 치사 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유요한 용량)을 결정하기 위해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비는 치료 지수(LD50/ ED50)이다. 특정 양상에서, 높은 치료 지수를 나타내는 치료 조성물이 바람직하다. 이들 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에서 사용하기 위한 다양한 투약량을 제형화하는 데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투약량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 또는 전혀 없는 ED50을 포함하는 다양한 순환 농도 내에 있다. 투약량은 사용되는 투약 형태 및 투여경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다.
본 발명의 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 문헌[Physicians' Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57th edition (November 1, 2002))]에 따라 대상체에게 투여된다.
투여 방식은 다를 수 있다. 적합한 투여 경로는 경구, 직장, 경점막, 장, 비경구; 근육내, 피하, 진피내, 골수내, 척추 강내, 직접적 심실내, 정맥내, 복강내, 비강내, 안구내, 흡입, 흡입, 국소, 피부, 경피 또는 동맥내를 포함한다.
특정 실시형태에서, 조성물 또는 치료제는 침습적 경로에 의해, 예컨대 주사에 의해 투여될 수 있다(상기 참조). 본 발명의 추가적인 실시형태에서, 조성물, 이의 치료적 또는 약제학적 조성물은 정맥내, 피하, 근육내, 동맥내, 관절내(예를 들어, 관절 조직에서), 종양내 또는 흡입, 에어로졸 전달에 의해 투여된다. 비침습적 경로(예를 들어, 경구로; 예를 들어, 알약, 캡슐 또는 정제로)에 의한 투여는 또한 본 발명의 범주 내이다.
조성물은 당업자에 공지된 의료 장치를 이용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약제학적 조성물은, 예를 들어, 사전충전 주사기 또는 자동주사기를 포함하여 피하 주사기 바늘이 있는 주사에 의해 투여될 수 있다.
약제학적 본 발명의 조성물은 또한 무바늘 피하 주사 장치; 예컨대 미국 특허 제6,620,135호; 제6,096,002호; 제5,399,163호; 제5,383,851호; 제5,312,335호; 제5,064,413호; 제4,941,880호; 제4,790,824호 또는 제4,596,556호에 개시된 장치를 이용하여 투여될 수 있다.
대안적으로, 예를 들어, 목적으로 하는 표적 부위에 직접적으로 주사를 통해, 종종 데포 또는 지속 방출 제형으로 전신 방식보다는 국소로 AAV9 벡터 또는 관련된 화합물을 투여할 수 있다. 더 나아가, 예를 들어, 뇌를 표적화하는, 표적화된 약물 전달 시스템 중의, 예를 들어, 조직-특이적 항체로 코팅된 리포좀 중의 조성물을 투여할 수 있다. 리포좀은 목적으로 하는 조직에 대해 표적화되고, 이에 의해 선택적으로 취해질 것이다.
투여 요법은 치료 조성물의 혈청 또는 조직 전환율, 증상 수준 및 생물학적 기질 내 표적 세포의 접근 가능성을 포함하는 몇몇 인자에 의존한다. 바람직하게는, 투여 요법은 표적 질환 상태에서 개선을 달성하는 한편, 동시에 목적으로 하는 부작용을 최소화하기에 충분한 치료적 조성물을 전달한다. 따라서, 생물학적으로 전달되는 양은 특정 치료 조성물 및 치료 중인 병태의 중증도에 부분적으로 의존한다.
적절한 용량의 결정은 임상의에 의해, 예를 들어, 치료에 영향을 미치는 당업계에 알려지거나 또는 의심되는 매개변수 또는 인자를 이용하여 이루어진다. 일반적으로, 용량은 최적의 용량보다 다소 적은 양으로 시작하고, 이후에 임의의 부작용에 대해 목적으로 하는 또는 최적의 효과가 달성될 때까지 적은 증분에 의해 증가된다. 중요한 진단적 측정은, 예를 들어, 염증 또는 생성되는 염증 사이토카인 수준 증상의 측정을 포함한다. 일반적으로, 사용될 생물 물질은 치료를 위해 표적화된 동물과 동일한 종으로부터 유래되어, 시약에 대한 임의의 면역 반응을 최소화하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "저해하다" 또는 "치료하다" 또는 "치료"는 장애와 관련된 증상 발생의 연기 및/또는 이러한 장애의 중증도 감소를 포함한다. 상기 용어는 존재하는 제어되지 않거나 또는 원치않는 증상을 개선하며, 추가적인 증상을 예방하고, 이러한 증상의 근본적인 원인을 개선하거나 또는 방지하는 것을 추가로 포함한다. 따라서, 상기 용어는 장애, 질환 또는 증상을 갖거나, 또는 이러한 장애, 질환 또는 증상에 대한 가능성을 갖는 척추동물 대상체에 대해 유리한 결과가 부여되었다는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "치료적 유효량", "치료적 유효 용량" 및 "유효량"은 세포, 조직 또는 대상체에 대해 단독으로 또는 추가적인 치료제와 조합하여 투여될 때, 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상의 측정 가능한 개선 또는 이러한 질환 또는 병태의 진행을 야기하는 데 유효한 본 발명 rAAV9-Glut1 기반 화합물의 양을 지칭한다. 치료적 유효 용량은 추가로 증상의 적어도 부분적인 개선, 예를 들어, 적절한 의학적 병태의 치료, 치유, 예방 또는 개선, 또는 이러한 병태의 치료, 치유, 예방 또는 개선 속도의 증가를 초래하는 데 충분한 화합물의 양을 지칭한다. 단독으로 투여되는 개개의 활성 성분에 적용될 때, 치료적 유효 용량은 해당 성분 단독을 지칭한다. 조합물에 적용될 때, 치료적 유효 용량은 조합하여, 연속적으로 또는 동시에 투여되든 치료 효과를 초래하는 활성 성분의 조합된 양을 지칭한다. 치료제의 유효량은 적어도 10%만큼; 보통 적어도 20%만큼; 바람직하게는 적어도 약 30%; 더 바람직하게는 적어도 40%, 및 가장 바람직하게는 적어도 50%만큼 진단적 측정 또는 매개변수의 개선을 초래할 것이다. 질환 중증도를 평가하기 위해 주관적 측정이 사용되는 경우에 유효량은 또한 주관적 측정의 개선을 초래할 수 있다.
키트
본 발명은 또한 키트 형태에서 본 발명의 조합물의 성분을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본 명세서에 논의된 바와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 화학치료제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 추가적인 성분과 함께 본 명세서에 논의된 바와 같은 rAAV9-Glut1 기반 화합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 하나 이상의 성분을 포함한다. rAAV9-Glut1 기반 화합물 또는 조성물 및/또는 치료제는 순수한 조성물로서 또는 약제학적 조성물 중에서 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합하여 제형화될 수 있다.
일 실시형태에서, 키트는 하나의 용기에서(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알에서) 본 발명의 rAAV9-Glut1 기반 화합물/조성물 및 다른 용기에서(예를 들어, 멸균 유리 또는 플라스틱 바이알에서) 이의 약제학적 조성물 및/또는 화학치료제를 포함한다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 키트는 단일의 통상적인 용기에서 선택적으로, 약제학적 조성물 중에서 함께 제형화되는 1종 이상의 화학치료제 성분과 선택적으로 조합되는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 rAAV9-Glut1 기반 화합물을 포함하는 본 발명의 조합물을 포함한다.
키트가 대상체에게 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물을 포함한다면, 상기 키트는 이러한 투여를 수행하기 위한 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 피하 바늘 또는 상기 논의한 바와 같은 다른 주사 장치를 포함할 수 있다.
키트는 키트 내에 약제학적 조성물 및 투약 형태에 관한 정보를 포함하는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 정보는 동봉된 약제학적 조성물 및 투약 형태를 효과적이고 안전하게 이용함에 있어서 환자 및 의사에게 도움을 준다. 예를 들어, 본 발명의 조합물에 관한 다음의 정보는 삽입물로 공급될 수 있다: 약동학적, 약력학, 임상 연구, 효능 매개변수, 적응증 및 용법, 금기, 경고, 주의사항, 유해 반응, 과다복용, 적절한 투약량 및 투여, 공급되는 방법, 적절한 저장 조건, 참고사항, 제조업자/유통자 정보 및 환자 정보.
일반적 방법
분자 생물학에서 표준 방법은 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2nd Edition, 2001 3rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3 rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, CA)]에 기재되어 있다. 표준 방법은 또한 문헌[Ausbel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols.1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, NY]에서 나타나는데, 이는 박테리아 세포 및 DNA 돌연변이유발에서의 클로닝(Vol. 1), 포유류 세포 및 효모에서의 클로닝(Vol. 2), 글리코컨쥬게이트 및 단백질 발현(Vol. 3) 및 생물정보학(Vol. 4)을 기재한다.
면역침강법, 크로마토그래피, 전기영동, 원심분리 및 결정화를 포함하는 단백질 정제를 위한 방법이 기재된다(Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). 화학적 분석, 화학적 변형, 번역후 변형, 융합 단백질의 생성, 단백질의 글리코실화가 기재된다(예를 들어, 문헌[Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, MO; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391). Production, purification, and fragmentation of polyclonal and monoclonal antibodies are described (Coligan, et al. (2001) Current Protcols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Harlow and Lane, 상기 참조] 참조). 리간드/수용체 상호작용을 특성규명하기 위한 표준 기법을 이용 가능하다(예를 들어, 문헌[Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York] 참조).
약어
AAV: 아데노 관련 바이러스
rAAV 재조합 아데노-관련 바이러스 또는 바이러스 벡터
BBB: 혈액 뇌 장벽
FMDV: 구제역 바이러스
GFP: 녹색 형광 단백질
Glut1: 글루코스 수송체 막 1(SLC2A1)에 의해 촉진되는 용질 운반체 패밀리 2로서도 알려진 글루코스 수송체 1은 인간에서 SLC2A1 유전자에 의해 암호화되는 단일운반체 단백질이다. Glut1은 포유류 세포의 혈장막을 가로지르는 글루코스의 수송을 용이하게 한다. Glut1은 특성규명될 첫 번째 글루코스 수송체였다. Glut1 1은 98% 상동성을 공유하는 인간 Glut1 단백질(hGlut1)(수탁 번호: NP_006507.2; 서열번호 79) 및 마우스 Glut1 단백질(mGlut1)(수탁 번호: NP_035530.2; 서열번호 78)에 의해 고도로 보존된다. Glut1은 다른 Glut와 40% 상동성을 나타낸다.
SLC2A1: 인간 글루코스 수송체 1(hGlut1)을 암호화하는 유전자. 인간 SLC2A1(수탁 번호: NG_008232.1; 유전자 ID - 6513).
Slc2a1: 마우스 Glut1 (mGlut1)을 암호화하는 유전자(수탁 번호: 게놈 #: NC_000070.6; 유전자 ID - 20525).
GLUT1 DS: Glut1 결핍 증후군
PND: 출생일 후
PND3: 출생 3일 후
실시예
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재조합 AAV 작제물 연구
도 1A 내지 도 1B에 나타내는 바와 같은 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터를 암호화하는 뉴클레오타이드 카세트에 연결된 뮤린 또는 인간 SLC2A1 유전자 중 하나를 운반하는 4개의 DNA 작제물이 생성되었다. 이들 4가지 작제물은 또한 Glut1과 GFP 오픈 리딩 프레임 사이에 혼입된 구제역 바이러스(FMDV)로부터의 16개 아미노산 길이의 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유한다. 2A 펩타이드는 Glut1-GFP 융합 단백질이 Glut1 단백질의 구조 또는 활성을 변경할 가능성을 피하기 위해 작제물에 포함된다. 2A 펩타이드는 궁극적으로 성숙 FMDV 단백질을 생성하는 가공 사건의 캐스케이드에서 FMDV 폴리단백질의 1차 시스-'절단'을 매개한다(Donnelly, M.L. et al. (2001)). 이 전략은 Glut1 단백질이 그의 천연 상태에서 생성되는 작제물을 생성하는 것으로 예상된다. 그러나, 이하에 기재하는 바와 같이, 이들 작제물 중 어떤 것도 만족스러운 수준에서 Glut1을 발현시키지 않았다.
6개의 추가적인 DNA 작제물은 2A 펩타이드를 암호화하는 핵산 없이 발생되었는데(도 1C 내지 도 1D), 이중 몇몇은 SLC2A1 유전자의 발현이 간에서 선택적으로 일어나지 않도록 제공하는 요소를 포함한다(도 1D). 이들 작제물은 장래 유전자 요법 실험에서 SLC2A1 유전자를 전체적으로 증강시키는 것이 간에서 고수준의 단백질이 발현되는 것을 초래하고, 이것이 글리코겐 합성 과정을 증가시키고, 따라서 저혈당증 상태를 유도할 수 있다는 가능성을 처리하도록 발생되었다. 최종적으로, 천연 마우스 또는 인간 SLC2A1 유전자를 배타적으로 함유하는 작제물은 또한 제어 목적을 위해 생성되었다(도 1C). pAAV9 CB6 PI hGlut1, pAAV9 CB6 PI hGlut1 out3xmiR122BS, 및 pAAV9 CB6 PI hGlut1 in3xmiR122BS는 타당성 실험에서 이용될 것이다. 이들 작제물의 서열 및 중요한 특징을 표 1에서, 그리고 대응하는 서열목록 1 내지 97에서 열거한다.
CHO 세포 내로 형질감염된 rAAV 플라스미드의 초기 발현 분석
세포 배양물 중의 다양한 재조합 플라스미드를 평가하기 위해 2종의 세포주를 사용하였다. 하나의 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이고, 다른 하나는 Glut1 환자로부터 유래된 섬유아세포주이다(Yang et al. 2011). 세포 배양 실험 및 후속적 웨스턴 블롯은 2A 펩타이드를 함유하는 플라스미드 작제물이 Glut1도 GFP도 만족스러운 수준에서 발현시키지 않았다는 것을 나타내었다. 예상치 못하였지만, SLC2A1/slc2A1 유전자와 관련하여, 2A 펩타이드는 단백질의 발현에 유해하게 영향을 미칠 수 있다. 대조적으로, 마우스 또는 인간 SLC2A1 유전자만을 함유하는 대조군 작제물은 강한 수준의 단백질을 발현시키는 것을 발견하였다. Glut1 작제물을 함유하는 2A 중 어떤 것도(도 1A 내지 도 1B) 돌연변이체 모델 시스템에서 Glut1 발현을 회복하기 위해 추가로 추구하지 않았다.
처음 4가지 작제물 내 2A 펩타이드의 존재에 의해 도입된 발현 곤란을 회피하기 위해(도 1A 내지 도 1B), hGlut1-eGFP 융합 단백질(phGlut1::eGFP로서 지칭됨)을 시험하였다. 세포 배양 실험은 융합 단백질이 발현될 뿐만 아니라 글루코스 흡수 분석에서 기능적이라는 것을 나타내었다. 마우스 slc2a1 또는 인간 SLC2A1 유전자만을 함유하는 작제물과 함께 이 작제물(phGlut1::eGFP)은 Glut1 모델 마우스의 유전자 요법을 수반하는 생체내 실험에서 사용에 대해 상정된다.
AAV9 플라스미드 클로닝 및 후속적 바이러스 벡터 패키징
hGlut1-eGFP 융합 단백질 작제물(phGlut1::eGFP)은 바이러스 벡터 내로 후속적 패키징을 위해 AAV9 플라스미드 내로 재클로닝되었다. 재클로닝된 작제물이 단백질을 계속해서 발현시키는 것을 보장하기 위해, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 내로 일시적으로 형질감염시키고, 단백질 수준을 웨스턴 블롯 분석에 의해 시험하였다(도 2A). CHO 세포 내 단백질 발현 분석은 상이한 프로모터 요소에 의해 유발된 cDNA 또는 hGlut-eGFP 융합을 암호화하는 hGlut1만을 발현시키는 작제물에 대해, AAV9-hGlut1-eGFP 플라스미드가 더 낮은 수준의 Glut1을 발현시켰다는 것을 나타내었다(도 2A). 그러나, 변형된(AAV9-hGlut1-eGFP) 융합 작제물은 효과적이고 만족스러운 양으로 Glut1 단백질을 계속해서 발현시켰다. 더 나아가, 융합 단백질은 Glut1 cDNA의 3' 말단에서 GFP 태그에 기인하여 예상되는 바와 같이 천연 hGlut1 단백질보다 상당히 더 큰 것으로 나타났다(도 2A). 이들 결과는 글루코스 흡수 분석과 일치되는데, 이때 hGlut-eGFP 단백질은 CHO 세포 내로 글루코스의 흡수를 증가시키는 것을 발견하였다(도 2B). 도 2C는 CHO 세포 내로 형질감염 후에 이 작제물의 GFP 형광을 나타낸다. 병행해서, 인간 SLC2A1 및 마우스 slc2a1 유전자를 또한 AAV9 플라스미드 내로 클로닝시키고, 환자 섬유아세포 내로 형질감염 시, Glut1 발현을 유도하고 글루코스 흡수를 증가시키는 것을 발견하였다. 따라서, 각각을 AAV9 캡시드 내로 패키징하고 나서, 대략 1013개의 게놈 복제물을 Glut1 DS 모델 마우스 내로 투여를 위해 제조하였다. (미국 특허 제8,734,809호에서, 그리고 문헌[Grieger and Samulski 2005 및 Grieger and Samulski 2012]에 기재된 바와 같은 방법에 따름).
패키징 조건/분포
AAV9 벡터에서 패키징된 Glut1 발현 작제물의 투여를 위한 조건을 최적화시키기 위해, 야생형 마우스에서 AAV9-GFP(Foust, K.D. et al. 2009) 벡터의 분포를 분석하였다. (문헌[Gao, G.P., and Sena-Esteves, M. (2012), In Molecular Cloning, Vol 2: A Laboratory Manual (M.R. Green and J. Sambrook eds.)]에 기재된 바와 같은 방법에 따름).
야생형 성체 또는 신생아 마우스에서의 상이한 조직에서 AAV9-GFP 작제물의 분포를 평가하였다. AAV9-GFP 주사 마우스의 시험 조직에서 밝은 녹색 형광을 발견하였지만, PBS/대조군 주사 마우스에서는 발견하지 못하였다. 본질적으로, 벡터의 대략 4 x 1012개 게놈 복제물을 안구뒤 및 측두정맥을 통해 마우스 내로 대략 40㎕의 용적으로 전신 투여하였다. 이들 실험으로부터의 결과는 AAV9 바이러스가 다양한 신경 및 비신경 조직으로 분포한다는 것을 나타낸다. 특히, 골격근, 심장 및 간을 표적화하기 위한 고수준을 발견하였다. 그러나, 실질적인 GFP 형광은 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 Glut1-양성 내피세포에서를 포함하여, 뇌조직에서 보였다. 중요하게는, 이들 세포는 Glut1 DS에 대한 표적화된 요법의 추정 부위이다.
대조군 AAV9-mGlut1 작제물
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목적으로 하는 양의 mGlut1 단백질을 발현시킨 작제물 중 하나를 AAV9 바이러스 벡터 내로 패키징하였다. 이 작제물은 표지된 태그(예를 들어, GFP)를 갖지 않지만, 모델 마우스에서 이 작제물로부터의 Glut1 발현 다음에 웨스턴 블롯 분석 및 면역조직 화학적 실험에 의해 총 mGlut1 단백질을 평가하는 것이 이어질 수 있다.
작제물 pAAV9 CB6 PI mGlut1(서열번호 35)을 2 돌연변이체 Glut1 마우스 새끼에게 출생 후(PND) 안구뒤를 통해 도입하였다. 이 작제물을 주사한 마우스는 AAV9-hGlut1-eGFP 주사 돌연변이체에 대한 대조군으로서 작용한다(서열번호 80; 특징 서열번호 81 내지 87을 참조). 9마리의 돌연변이체 마우스에게 AAV9-mGlut1 작제물 pAAV9 CB6 PI mGlut1을 주사하였다(표 2). 추가적인 대조군으로서, 7마리 돌연변이체에게 비히클(PBS) 단독을 주사하였다. 이들 마우스는 질환 표현형의 기능성 개선에 대해 시험할 것이다. 이를 PET 스캔에 의해, 그리고 표준 기법에 따라 로타로드 또는 수직 막대 시험에 대한 수행을 모니터링함으로써 뇌조직 내 글루코스 흡수 수준을 결정함으로써 수행할 것이다(문헌[Kariya et al, 2012] 참조).
Glut1DS 모델 마우스에 의한 유전자 대체 실험에서 사용하는 작제물 중 하나는 AAV9-hGlut1-eGFP 작제물이다(서열번호 80). 이 작제물로부터 생성된 태그된 Glut1 단백질은 실험 마우스 뇌의 Glut1-발현 내피세포를 포함하는 이어질 다음의 기관계에서 단백질의 분포를 허용할 것이다. 이는 마우스 뇌에서 mGlut1의 검출을 위한 최적화 조건을 허용할 것이다. 뇌에서 mGlut1 단백질의 강한 발현은 특정 항체를 이용하여 검출 가능하다.
Glut1 DS 돌연변이체 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것은 보행 기능장애를 구하는 것으로 예시되는 바와 같이 질환 표현형을 구한다
다중 세포 유형을 감염시키는 재조합 아데노-관련 바이러스 9(rAAV9)의 능력을 인간 질환의 마우스 모델 내로 뮤린 Slc2a1 유전자를 재도입하기 위한 특징으로서 이용하였다. 하나의 야생형 Slc2a1 대립유전자가 없을 때, Glut1 DS 마우스는 로타로드 분석에서 운동 거동 결함을 모델링하는 것으로 여겨지는 결과 측정, 즉, 인간 환자에서 관찰된 운동 표현형을 불량하게 수행한다. 돌연변이체 마우스에 PND3에 작제물 pAAV9 CB6 PI mGlut1(서열번호 35)에 의해 제공되는 AAV9-Glut1의 대략 4 x 1011개 게놈 복제물, 또는 비히클(PBS)을 주사하였다. 일원 ANOVA를 이용하여 P값을 계산하였다. PND3에 돌연변이체 마우스 내로 Slc2a1 유전자를 회복시키는 것은 6주령만큼 일찍 로타로드에서 수행의 상당한 개선을 초래하였다(표준 조건 하에 수행--문헌[Wang et al. 2006] 참조)(도 3A). 실험을 종료한 시점인 20주령까지 향상된 수행은 지속되었다.
로타로드 분석에 대한 개선된 수행에 추가로(도 3A), 치료 마우스는 또한 그들의 비히클 처리 상대보다 더 큰 민첩성으로 수직 막대를 넘는다(도 3B). 코호트를 6 내지 12주령에 시험하였을 때 야생형 대조군 한배새끼와 구별되게 처리 돌연변이체를 수행하였다. 이들 결과는 Glut1 DS 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것은 인간 질환의 운동 표현형 특징을 완화시킨다는 강한 증거를 제공하는데, 이는 돌연변이체 모델 마우스에 대해 Slc2a1 유전자를 회복시키는 것이 치료적 값을 나타낸다는 것을 표시한다.
Glut1 DS 돌연변이체 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것은 다중 조직에서 유전자의 향상된 발현을 초래한다 .
AAV9-Glut1 처리 동물의 개선된 성능의 분자적 기반을 탐구하기 위해, 동물의 뇌 및 간 조직에서 뮤린 Slc2a1 유전자의 발현을 평가하였다. pAAV9 CB6 PI mGlut1(서열번호 35)로 처리한 돌연변이체 동물은 뇌 및 간 조직에서 더 큰 수준의 Slc2a1 유전자를 압박하였다(도 4A 내지 도 4B). 뇌 및 간 조직을 처리 및 대조군 마우스로부터 추출하고 나서, RNA를 준비하고, 이어서, Q-PCR 분석에서 Slc2a1 전사체를 증폭시키기 전에 역전사시켰다. β-액틴을 사용하여 Slc2a1 유전자 발현을 정규화시켰다. 도 4A는 처리 돌연변이체 및 적절한 대조군에서의 상대적 Slc2a1 유전자 발현을 나타낸다. 도 4B는 야생형 Glut1+/+ 마우스에서 발현 백분율로서 Slc2a1 발현을 나타낸다. 처리 돌연변이체(Glut1+/-) 및 적절한 대조군(Glut1+/+ 및 PBS 처리 Glut1+/- 돌연변이체)에서 정량적 PCR에 의해 Glut1 암호화 전사체를 증폭시키기 위해 인트론 1을 확장하는 프라이머를 사용하였다. 마우스를 안락사시키고 나서, PBS를 이용하는 경심 관류 후에 조직을 추출하였다. 제조업자의 설명서에 따라 RNAeasy 키트(캘리포니아주 발렌시아에 소재한 퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 RNA를 준비하였다. 표준 절차에 따라 RNA를 역전사시키고, 다음 프라이머를 사용하여 Glut1 암호화 전사체를 증폭시켰다: Glut1QPCR F1: 5' CTT GCT TGT AGA GTG ACG ATC 3' (서열번호 76) 및 Glut1QPCR R1: 5' CAG TGA TCC GAG CAC TGC TC 3' (서열번호 77). 예상된 212bp 밴드를 에펜도르프 리얼플렉스 사이클러(Eppendorf Realplex Cycler)(독일에 소재한 에펜도르프(Eppendorf))에서 정량화하였다.
예상치 못하게, 처리 돌연변이체 간에서 유전자의 발현은 Glut1+/+ 대조군의 동일한 조직에서의 수준을 초과하였는데, 이는 AAV9-Glut1 바이러스가 간에 대한 특정 굴성을 가진다는 이전의 보고(Foust et al, 2010)와 일치된다. WT 마우스 투여 바이러스의 작은 코호트에서, 이는 또한 이 조직에서 Slc2a1 상향조절의 결과와 유사하게 저혈당증을 유도하며, 따라서 혈액으로부터 글루코스의 제거를 유도한다. 따라서, miRNA-122 결합 부위를 함유하는 작제물(도 1D에 나타내고 서열번호 42 내지 75에 의해 포함되는 바와 같음)을 이용하여 Slc2a1의 발현 억제를 상정한다. miRNA-122는 간에서 특이적으로 발현되며, 그의 전사체가 결합하는 유전자의 발현을 억제한다(Xie et al, 2011). 이 발견의 생리적 결과는 추가적인 연구 대상일 것이다.
AAV9-Glut1로 처리한 돌연변이체 마우스에서 향상된 Glut1 뇌 단백질 및 CSF 글루코스 ; Glut1을 회복시키는 것은 Glut1 DS 모델 마우스에서 수액당감소증을 완화시킨다.
Glut1 DS의 정의적 세부 특징은 수액당감소증(저 뇌척수액 글루코스)이다. Glut1 DS 모델 마우스는 이 표현형을 나타낸다. 모델 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것이 수액당감소증을 반전시키거나 또는 완화시키는지의 여부를 결정하기 위해, 혈액 및 뇌척수액(CSF)을 동물로부터 추출하고 나서, 글루코스 수준을 측정하였다. 측정하기 전에 모든 마우스를 밤새 금식시켰다. 본질적으로 앞서 기재한 바와 같이 CSF를 소뇌연수조로부터 단리시켰다(Wang et al., 2006; Fleming et al., 1983). 간략하게, 두개골 상부로부터 등쪽 흉곽까지 절개하고 나서, 두개골의 기저로부터 제1 척추골까지의 근육계를 제거하여 소뇌연수조 위에 가로놓인 뇌척수막을 노출시켰다. 반투명 뇌척수막에 구멍을 내지 않도록 조심하면서 소뇌연수조 위의 조직을 절개하였다. 일단 주위 영역에서 잔여 혈액/사이질액을 세정하면, 30G 바늘에 부착된 마이크로피펫을 사용하여 소뇌연수조을 뒤덮고 있는 지주막에 구멍을 내고, 5 내지 15㎕의 CSF를 뽑아내었다. 전체 절차를 5분 내에 완료하고 나서, 아센시아 엘리트 XL 글루코스 미터(Ascensia Elite XL glucose meter)(바이엘 코포레이션(Bayer Corp.))를 이용하여 CSF 글루코스를 측정하였다 CSF 추출 전에 꼬리 절개로부터 대략 10㎕의 혈액을 뽑아냄으로써 유사하게 혈당을 결정하였다. 2회 판독(각각의 마우스에 대한 각각 혈액 및 CSF 글루코스 농도)을 평가하였다. 평균 값을 보고할 것이다.
CSF 글루코스 값 및 병기에 대해, 다음의 범위가 전형적이다: Glut1 환자의 90% 이상은 CSF 글루코스 값이 40㎎/㎗(2.2mM) 미만이며, 남아있는 환자는41 내지 52㎎/㎗ 범위에 속한다. 따라서, CSF 글루코스 수준에 대한 정상 범위는 약 53㎎/㎗ 이상이다. Glut1 DS 모델 마우스에 대해, 전형적인 CSF 글루코스 수준은 약 23.3±7.17㎎/㎗(25.0±8.00㎎/㎗ 미만의 범위에 속함)인 반면; 야생형 마우스에 대한 수준은 약 74.6±14.1㎎/㎗(약 70.0±15.0㎎/㎗ 이상의 범위 내에 속함)이다.
추가적으로, RBC 글루코스 흡수 기능 분석을 종종 Glut1 반수체부족성에 대한 대용으로 사용한다. 이 분석에서, Glut1 DS를 나타내는 환자는 36 내지 73% 범위로 대략 50% 흡수에서 무리를 이룬다. 75% 이상의 활성은 정상 범위와 일치되는 것으로 추정된다. 25% 미만은 중증이며, 배아 치사율은 0%에 접근한다는 것을 주목한다.
작제물 pAAV9 CB6 PI mGlut1(서열번호 35)을 이용하는 형질감염에 의해Glut1 DS 돌연변이체 마우스에 대해 slc2a1 유전자를 회복시키는 것은 Glut1의 증가된 발현을 초래한다(도 5a). 추가적으로, 처리된 Glut1 DS 돌연변이체 마우스는 뇌 조직에서 증가된 수준의 Glut1 단백질을 발현시킨다(도 5b). 도 5c에서, 처리된 돌연변이체에서 CSF 글루코스 농도는 비처리 돌연변이체의 농도보다 상당히 더 높았지만, 야생형 대조군에서 관찰된 수준에 도달되지 않았다. 회복된 slc2a1 돌연변이체 마우스는 증가된 수준의 CSF/혈당을 나타내었다(도 5d). 샘플 크기는 비처리 돌연변이체 마우스에 대해 n=8이고, 처리된 돌연변이체 마우스에 대해 n=9이다. 추가적으로, 야생형 코호트는 n=18이다. 이들 데이터는 Glut1 DS 돌연변이체 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것이 CSF 글루코스 수준을 증가시키고 병에 걸린 동물의 수액당감소증을 완화한다는 것을 나타낸다. 종합적으로, 이들 결과는 Glut1 결여 대상체에서 Glut1을 회복시키는 것의 치료적 이점의 분명한 표시이다. 이들 실험으로부터의 예비적 결과는 이들 증상을 나타내는 성체 마우스에 대해 Glut1을 회복시키는 것이 마우스에서 그리고, 인간도 유사하게 제한된 기회의 치료적 창을 나타내는 질환 표현형을 구하지 못한다는 것을 나타낸다.
징후를 나타내는 마우스에 대한 Glut1의 회복―Glut1 투여 시간 .
Glut1 DS 마우스에서 질환 과정 동안 초기에 모델 마우스에 대한 Glut1 발현의 회복(AAV9-mGlut1 작제물의 PN3 주사에 의해 예시)은 분명한 치료적 값을 가진다. 징후를 나타내는 마우스에서 Glut1 회복 기간을 결정하기 위해, 8주령의 돌연변이체 마우스에게 pAAV CB6 PI mGlut1 작제물(서열번호 35)을 주사하는 단계를 수반하는 실험을 개시하였다. Glut1 DS 마우스는 이 시점에서 분명하게 징후를 나타내며 로타로드 상에서 대조군인 야생형 한배새끼보다 잘 수행하지 못하였다. 따라서, Glut1 DS 마우스의 코호트에게 비히클 또는 AAV9-mGlut1의 1 x 1012개 게놈 복제물을 전신 주사하였다. 모든 마우스 성체 설치류에서 바이러스 주사가 안전하다는 것을 나타내는 절차를 견뎠다. Glut1 결핍증 증상을 치료/완화하는 것을 허용하는 기간뿐만 아니라 질환 표현형의 과정을 반전시키기 위한 임의의 시간 제한을 결정하기 위해 상기 기재한 것과 유사한 분자적, 세포적 및 거동적 분석을 평가하였다.
Glut1 DS 모델에서 기회의 치료적 창의 개선
본 데이터는 신생아(PND3) Glut1 DS 마우스에서 Glut1(뮤린) 단백질의 AAV9-매개 고갈이 Glut1 발현을 증가시키고, 질환에서 특징적으로 관찰된 수액당감소증을 완화하며, 뇌 크기를 회복시키고, 운동 성능의 현저한 개선을 초래한다는 것을 입증한다. 대조적으로, 8주령에 Glut1 고갈은 질환 표현형을 구하지 못한다. 이들 결과는 인간 병태를 반영할 가능성이 있는 발견인 Glut1 DS 모델 마우스에서 제한된 기회의 치료적 창이 있다는 것을 시사한다. 예비 데이터는 또한 2주령의 돌연변이체 마우스에서 상당히 저하된 CSF 글루코스 수준을 나타낸다(돌연변이체: 23.25±3.77㎎/㎗; 대조군: 53.33±5.20㎎/㎗, P < 0.01, t 검정). 또한, 식별할 수 있는 명시적 표현형 전에 이 시점에 Glut1을 회복하는 것이 치료적 이점을 제공하는지의 여부는 불분명하다.
질환의 이런 초기 단계에서 Glut1을 회복하는 것의 결과를 결정하기 위해 - 아동기에 진단되었지만 영아기 동안 Glut1 결핍증의 질환의 원인이 되는 효과가 결코 실행된 적이 없는 환자를 치료하는 것과 유사, 돌연변이체 마우스에 pAAV9 CB6 PI mGlut1 벡터(서열번호 35)를 전신으로 형질도입할 것이다. 간략하게, 대략 50㎕ 용적 중의 비히클의 치료 벡터의 대략 1012개 게놈 복제물을 2주령 마우스의 측두정맥에 주사할 것이다. 동물을 후속적으로 분자의 포괄적 배터리(웨스턴 블롯 분석, Q-PCR 분석, CSF 및 혈당 수준), 영상화(PET 스캔) 및 거동(로타로드 분석, 수직 막대 시험) 분석을 이용하여 평가하여 마우스에서 이런 "청소년" 기에 기능성 단백질을 회복하는 것의 결과를 결정하였다. 이들 실험은 한편으로 신생아(PND3) 에서 다른 한편으로 성체 모델(8주)에서 치료 후에 얻은 결과를 보충하며, Glut1 DS에 대한 기회의 치료적 창을 개선한다.
Glut1 DS 모델 마우스에서 케톤체 생성성 식사에 의한 초기 치료와 Glut1 단백질의 후기 만복의 조합 효과의 평가
성체 마우스(8주)에 대해 Glut1을 회복시키는 것은 Glut1 DS 표현형을 완화시키지 않는다는 것이 분명하지만, 고지방식에 의한 이들 마우스의 사전 처리는 더 바람직한 결과를 생성할 수 있다. 이러한 식이요법 중인 마우스는 처리의 이상적인 치료적 창이 상실될 수 있지만 케톤체 생성성 식사의 초기 보호 효과에 기인하여 Glut1 단백질의 후기 회복에 결코 유리하지 않은 더 고령의 Glut1 DS 환자 코호트를 더 정확하게 나타낸다. 이러한 식이요법은 단일 카복실산 수송체를 통해 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 불완전한 에너지 공급원일지라도, 교번으로 뇌에 케톤체를 공급한다. 따라서, 2주령의 마우스에서 본 발명자들의 실험에 추가로, 본 발명자들은 (PND7에 시작해서) 7C 트라이글라이세라이드 트라이헵타노인을 받은 성체(6 내지 8주령) 돌연변이체에 대해 Glut1을 회복시키는 효과를 시험할 것이다. 현재 Glut1 DS에 대한 임상 시험에서 트라이헵타노인은 TCA 회로에 대해 아세틸 CoA로 대사될 뿐만 아니라, 세포 에너지 필요를 공급하기 위해 영양소가 종국적으로 분해됨에 따라 회로에 대한 본질적인 보충 경로 물질을 제공하는 것으로 생각된다. 간략하게, 이 실험은 그들에게 AAV9-Glut1(pAAV9 CB6 PI mGlut1) 작제물을 투여할 때까지 트라이헵타노인(82㎎/g)으로 또는 트라이헵타노인 없이 돌연변이체를 처리하는 단계를 수반할 것이다. 이어서, 현재 이용 가능한(케톤체 생성성 식사) 치료에 대해 더 고령의 환자에서 Glut1 발현을 회복시킨 것의 치료적 결과를 예측하는 수단으로서 마우스의 상이한 코호트를 상기 기재한 바와 같이 평가할 것이다.
임상 시험을 위한 Glut1 작제물의 최적화
지금까지 Glut1 DS 마우스에서 slc2a1 발현의 뜻밖의 효과는 관찰되지 않았지만, 작제물 pAAV9 CB6 PI mGlut1 벡터(서열번호 35)을 투여한 야생형 마우스의 작은 샘플에 대한 예비 연구는 더 낮은 CSF 및 혈당 수준을 나타내었다. 이 예상치 못한 사건은 바람직한 AAV9 표적 기관인 간에서의 증가된 slc2a1 발현으로부터 초래되고, 결과적으로 이 조직 내로 글루코스의 수송을 향상시킬 수 있었다. 순 결과는 저혈당 상태에서 반영된 순환 글루코스에 속한다. 이러한 사건의 예상에서, hGlut1 작제물(pAAV CB6 PI hGlut1)은 간(AAV9이 특히 높은 굴성을 갖는 기관)에서 고수준으로 그의 발현을 불가능하게 하도록 변형될 것이다(Zincarelli et al, 2008; Pacak et al, 2006). 그렇게 하기 위해, miRNA에 대한 결합 부위(BS)(miR-122)(간세포에서 특이적으로 발현됨)는 작제물 내로 도입될 것이다. 이 전략은 이전에 성공적으로 실행되었고(문헌[Xie et al, 2011] 참조), 표적 mRNA의 miRNA-매개 내부핵산 절단의 이점을 취하고, 관심대상의 조직에 대한 전사체의 발현을 제한한다. 도 1D 및 표 1에 나타낸 이러한 작제물(pAAV CB6 PI hGlut1-in3xmiR-122 BS, pAAV CB6 PI hGlut1-out3xmiR-122 BS, pAAV CB6 PI mGlut1-in3xmiR-122, pAAV CB6 PI mGlut1-out3xmiR-122)은 마우스 마우스의 서브세트에서 본래의 (비변형) Glut1 발현 벡터와 나란히 시험하여, Glut1 발현 수준 및 치료 효능에 대해 각각 시험할 것이다. 본래의 작제물이 저혈당증을 야기하는 것의 증가된 경향은 후속 실험 및 시행에서 새로운 Glut1-miRNA-BS 작제물을 이용하는 것의 이점을 나타낼 것이다.
제조 과정 동안 바이러스 역가를 감소시키는 수단으로서뿐만 아니라, 큰 농도의 바이러스와 관련된 안전성 문제를 처리하기 위해 본 명세서에 기재된 시험 작제물의 발현을 최적화하기 위하여, 자유롭게 이용 가능한 소프트웨어를 이용하여 코돈 최적화 과정을 이용해서 SLC2A1 및 slc2a1 유전자를 평가할 것이다(https://www.idtdna.com/CodonOpt). 추가로, 필요하다면 공통 코작 서열을 작제물 내로 도입할 것이다. 따라서, 표 1에 기재한 임의의 작제물 또는 요소는 이런 방식으로 코돈 최적화될 수 있다. 각각의 변형된 작제물은 마우스에서 모 작제물과 병행하여 시험할 것이다. 간략하게, PND3 마우스 새끼 내로 측두 정맥을 통해 작제물을 전신으로 투여할 것이다. 이어서, 동물들을 2주 또는 3주 후에 안락사시키고, Q-PCR 및 웨스턴 블롯팅에 의해 각각의 작제물로부터의 단백질 수준을 결정하였다. 가장 빠르고 높은 발현 수준을 전달하는 작제물은 비인간 영장류 연구에서 종국 적인 용도에 대해 그리고 종국적으로 인간 환자에 대한 임상 시험에서 고려할 것이다.
비-인간 영장류 연구
거대 포유류 모델에서 본 발명자들의 선택 작제물(들)의 생체 분포, 발현 및 독성을 결정하기 위해, 바이러스 벡터를 사이노몰거스 원숭이의 코호트에 투여할 것이다. 간략하게, PND1, PND90 및 2세의 각각 6마리 동물에 5 x 1013개 게놈 복제물/㎏의 용량으로 AAV9 벡터를 전신으로 투여할 것이다. 작제물(들)의 정확한 독성을 결정하기 위해, 벡터 투여 후 1일, 3일 및 7일에 동물을 방혈시킬 것이다. 추가적으로, 벡터 주사 후 2, 3 및 4주에 동물을 방혈시킬 것이다. 모든 경우에, 중요한 임상 화학 및 혈액학 매개변수를 평가할 것이다. AAV9에 대한 중화 항체의 역가는 형질도입 기반 정량적 중화 항체 분석에 의해 혈청 샘플에서 모니터링할 것이며(Rapti et al, 2012), ELISPOT, 세포내 사이토카인 염색 기법 및 유세포 분석을 이용하여 PBMC에서 이식유전자 또는 캡시드 특이적 T 세포의 존재를 결정한다(Walker et al, 2001). 상기 면역학적 연구를 보완하기 위해, 모든 주요 기관계에서의 조직 병리학, 벡터 생체 분포 연구 및 이식유전자 발현 분석을 위해 각각의 코호트로부터의 3마리 동물을 4주에 안락사시킬 것이다. 이들 실험은 또한 바이러스 투여 후 초기 대 후기에 혈청, 림프구 및 PBMC에서 캡시드 또는 이식유전자에 대한 B 및 T 세포 면역 반응의 시험 및 비교를 가능하게 할 것이다. 장기간 안전성 연구를 수행하기 위해, 각각의 그룹에서 남아있는 3마리 동물은 그들이 상기 기재한 바와 같은 임상 화학 및 혈액학 연구를 위해 매달 방혈시키는 동안 3개월의 기간에 걸쳐 따를 것이다. 이들 동물을 종국적으로 주사 3개월 후에 안락사시키고, 급성 독성 연구에서 기재한 바와 같이 분석할 것이다. 사이노몰거스 Glut1과 대략 99% 상동성을 공유함에도 불구하고 인간 Glut1 단백질은 공격적 면역 반응을 유발할 수 있다. 이를 불가능하게 하기 위해, miR-142-3p 및 miR-155에 대한 두 miRNA 결합 부위를 시험 작제물 내로 도입할 것이다. 독립적 연구로부터의 예비 결과는 이들 miRNA가 항원 제시 세포에서 발현되고, 결과적으로, 전사체가 miRNA에 대한 결합 부위를 함유하는 단백질의 발현을 억제한다는 것을 나타낸다. 종합적으로, 이들 연구는 인간 임상 시험에서 본 명세서에 기재된 시험 Glut1 작제물의 종국적인 사용을 용이하게 할 것이다.
참고문헌
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당업자에게 명확한 바와 같이 본 발명의 다수의 변형 및 변화가 그의 정신과 범주로부터 벗어나는 일 없이 이루어질 수 있다. 본 발명은 청구범위가 자격을 부여하는 동등물의 완전한 범주와 함께 첨부되는 청구범위에 대해 정해진다. 다음의 예를 포함하는 본 명세서에 기재된 구체적 실시형태는 단지 예로서 제공되며, 그들의 상세한 설명에 의해 본 발명의 범주를 제한하지는 않는다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 각각의 개개 간행물, 데이터베이스 가입(예를 들어, 젠뱅크(Genbank) 서열 또는 GeneID 가입), 특허 출원 또는 특허가 참고로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 참고로 포함된다. 참고로 포함의 이러한 언급은 출원인에 의해 37 C.F.R. §1.57(b)(1)에 의하여, 각각의 그리고 모든 개개 간행물, 데이터베이스 가입(예를 들어, 젠뱅크 서열 또는 GeneID 가입), 특허 출원 또는 특허에 관해 의도되며, 이러한 인용이 참고로 포함의 전용 언급에 바로 근접하지 않는다고 할지라도, 이들 각각은 37 C.F.R. §1.57(b)(2)에 따라 명확하게 동정된다. 명세서 내에서 참고로 포함의 전용 언급의 포함은, 만약에 있다면, 참고로 포함의 이런 일반적인 언급을 임의의 방법으로 약화시키지 않는다. 본 명세서의 참고문헌의 인용은 참고문헌이 적절한 선행 기술이라는 용인으로서 의도되지도 않고, 또는 이들 간행물 또는 문헌의 내용 또는 날짜에 대한 임의의 용인을 구성하지도 않는다.
본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 실시형태에 의해 범주에서 제한되어서는 안 된다. 사실, 본 명세서에 기재된 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형은 앞서 언급한 설명 및 수반하는 도면으로부터 당업자에게 명확하게 될 것이다. 이러한 변형은 첨부하는 청구범위의 범주 내에 속하는 것으로 의도된다.
앞서 기재한 명세서는 당업자가 본 발명을 실행하는 것을 가능하게 하기에 충분한 것으로 고려된다. 본 명세서에 나타내고 기재한 것에 추가로 본 발명의 다양한 변형은 앞서 언급한 설명으로부터 당업자에게 명확하게 될 것이고, 첨부하는 청구범위 내에 속할 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> THE TRUSTEES OF COLUMBIA UNIVERSITY IN THE CITY OF NEW YORK UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS MEDICAL CENTER <120> RECOMBINANT GLUT1 ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR CONSTRUCTS AND RELATED METHODS FOR RESTORING GLUT1 EXPRESSION <130> WO/2016/145217 <140> PCT/US2016/021810 <141> 2016-03-10 <150> US 62/130,899 <151> 2015-03-10 <160> 97 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 7109 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> pAAV CB6 PI EGFP-2A-hGlut1 <400> 1 gccttaatta ggctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg cccgggcaaa gcccgggcgt 60 cgggcgacct ttggtcgccc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagaga gggagtggcc 120 aactccatca ctaggggttc cttgtagtta atgattaacc cgccatgcta cttatctacc 180 agggtaatgg ggatcctcta gaactatagc tagtcgacat tgattattga ctagttatta 240 atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 300 acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 360 aatgacgtat gttcccatag 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<210> 2 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> 5'ITR <400> 2 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 3 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CMV IE enhancer <400> 3 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 4 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CB promoter <400> 4 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 5 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> eGFP <400> 5 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg 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ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120 gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180 ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240 ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300 ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360 atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgtg gcctgaccac aggcttcgtg 420 cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480 cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540 ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600 tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660 gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720 ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780 gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840 tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900 gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc 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caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca 1740 ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct 1800 gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct 1860 ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agaattttga 1920 ccttcttaag cttgcgggag acgtcgagtc caaccctggg cccatggatc ccagcagcaa 1980 gaaggtgacg ggccgcctca tgttggctgt gggaggagca gtgctcggat cactgcagtt 2040 cggctataac actggtgtca tcaacgcccc ccagaaggtt attgaggagt tctacaatca 2100 aacatggaac caccgctacg gagagcccat cccatccacc acactcacca cgctttggtc 2160 tctctccgtg gccatcttct ctgtcggggg catgattggt tccttctctg tcggcctctt 2220 tgttaatcgc tttggcaggc ggaactccat gctgatgatg aacctgttgg cctttgtggc 2280 tgctgtgctt atgggcttct ccaaactggg caagtccttt gagatgctga tcctgggccg 2340 cttcatcatc ggtgtgtact gcggcctgac tactggcttt gtgcccatgt atgtgggaga 2400 ggtgtcacct acagctctac gtggagccct aggcacactg caccagctgg gaatcgtcgt 2460 tggcatcctt attgcccagg tgtttggctt agactccatc atgggcaatg cagacttgtg 2520 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tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac 6780 cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc 6840 gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc 6900 ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 6960 cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 7020 tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 7080 ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 7140 ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 7200 ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc 7260 gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg 7320 acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca 7380 ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg 7440 tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc agatttaatt 7500 aag 7503 <210> 11 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> 5'ITR <400> 11 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 12 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CMV IE enhancer <400> 12 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 13 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CB promoter <400> 13 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 14 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> eGFP <400> 14 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717 <210> 15 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 2A-linker <400> 15 aattttgacc ttcttaagct tgcgggagac gtcgagtcca accctgggcc c 51 <210> 16 <211> 2353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> mGlut1 cDNA and 3'UTR <400> 16 atggatccca gcagcaagaa ggtgacgggc cgcctcatgt tggctgtggg aggagcagtg 60 ctcggatcac tgcagttcgg ctataacact ggtgtcatca acgcccccca gaaggttatt 120 gaggagttct acaatcaaac atggaaccac cgctacggag agcccatccc atccaccaca 180 ctcaccacgc tttggtctct ctccgtggcc atcttctctg tcgggggcat gattggttcc 240 ttctctgtcg gcctctttgt taatcgcttt ggcaggcgga actccatgct gatgatgaac 300 ctgttggcct ttgtggctgc tgtgcttatg ggcttctcca aactgggcaa gtcctttgag 360 atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgactac tggctttgtg 420 cccatgtatg tgggagaggt gtcacctaca gctctacgtg gagccctagg cacactgcac 480 cagctgggaa tcgtcgttgg catccttatt gcccaggtgt ttggcttaga ctccatcatg 540 ggcaatgcag acttgtggcc tctgctgctc agtgtcatct tcatcccagc cctgctacag 600 tgtatcctgt tgcccttctg ccccgagagc ccccgcttcc tgctcatcaa tcgtaacgag 660 gagaaccggg ccaagagtgt gctgaagaag cttcgaggga cagccgatgt gacccgagac 720 ctgcaggaga tgaaagaaga gggtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcttg 780 gagctgttcc gctcacccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840 tcccagcagc tgtcgggtat caatgctgtg ttctactact caacgagcat cttcgagaag 900 gcaggtgtgc agcagcctgt gtacgccacc atcggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960 actgtggtgt cgctgtttgt tgtagagcga gctggacgac ggaccctgca cctcattggc 1020 ctggctggca tggcaggctg tgctgtgctc atgaccatcg ccctggcctt gctggaacgg 1080 ctgccttgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140 gtaggccctg gtcctattcc atggttcatt gtggccgagc tgttcagcca ggggccccgt 1200 cctgctgcta ttgctgtggc tggcttctcc aactggacct caaacttcat tgtgggcatg 1260 tgcttccagt atgtggagca actgtgcggc ccctacgtct tcatcatctt cacggtgctc 1320 ctcgtgctct tcttcatctt cacctacttc aaagtccctg agaccaaagg ccgaaccttc 1380 gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggtgccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440 gagctcttcc accctctggg ggcggactcc caagtgtgag gagccccaca cccagcccgg 1500 cctgctccct gcagcccaag gatctctctg gagcacaggc agctagatga gacctcttcc 1560 gaaccgacag atctcgggca agccgggcct gggcgccttt cctcagccag cagtgaagtc 1620 caggaggata ttcaggactt tgatggctcc agaattttta atgaaagcaa gactgctgct 1680 cagatctatt cagataagca gcaggtttta taattttttt attactgatt ttgttatttt 1740 ttttttttat cagccactct cctatctcca cactgtagtc ttcaccttga ttggcccagt 1800 gcctgagggt ggggaccacg ccctgtccag acacttgcct tctttgccaa gctaatctgt 1860 agggctggac ctatggccaa ggacacacta ataccgaact ctgagctagg aggctttacc 1920 gctggaggcg gtagctgcca cccacttccg caggcctgga cctcggcacc ataggggtcc 1980 ggactccatt ttaggattcg cccattcctg tctcttccta cccaaccact caattaatct 2040 ttccttgcct gagaccagtt ggaagcactg gagtgcaggg aggagaggga agggccaggc 2100 tgggctgcca ggttctagtc tcctgtgcac tgagggccac acaaacacca tgagaaggac 2160 ctcggaggct gagaacttaa ctgctgaaga cacggacact cctgccctgc tgtgtataga 2220 tggaagatat ttatatattt tttggttgtc aatattaaat acagacacta agttatagta 2280 tatctggaca aacccacttg taaatacacc aacaaactcc tgtaacttta cctaagcaga 2340 tataaatggc tgg 2353 <210> 17 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> Poly A signal <400> 17 gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60 tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120 tcactcg 127 <210> 18 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> 3' ITR <400> 18 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag 130 <210> 19 <211> 6844 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> pAAV CB6 PI hGlut1-2A-EGFP <400> 19 cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60 ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120 ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180 ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240 agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca 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cacccgcgta cccggcgcag ccagagccac cagcgcagcg ctgccatgga gcccagcagc 1380 aagaagctga cgggtcgcct catgctggcc gtgggaggag cagtgcttgg ctccctgcag 1440 tttggctaca acactggagt catcaatgcc ccccagaagg tgatcgagga gttctacaac 1500 cagacatggg tccaccgcta tggggagagc atcctgccca ccacgctcac cacgctctgg 1560 tccctctcag tggccatctt ttctgttggg ggcatgattg gctccttctc tgtgggcctt 1620 ttcgttaacc gctttggccg gcggaattca atgctgatga tgaacctgct ggccttcgtg 1680 tccgccgtgc tcatgggctt ctcgaaactg ggcaagtcct ttgagatgct gatcctgggc 1740 cgcttcatca tcggtgtgta ctgtggcctg accacaggct tcgtgcccat gtatgtgggt 1800 gaagtgtcac ccacagccct tcgtggggcc ctgggcaccc tgcaccagct gggcatcgtc 1860 gtcggcatcc tcatcgccca ggtgttcggc ctggactcca tcatgggcaa caaggacctg 1920 tggcccctgc tgctgagcat catcttcatc ccggccctgc tgcagtgcat cgtgctgccc 1980 ttctgccccg agagtccccg cttcctgctc atcaaccgca acgaggagaa ccgggccaag 2040 agtgtgctaa agaagctgcg cgggacagct gacgtgaccc atgacctgca ggagatgaag 2100 gaagagagtc ggcagatgat gcgggagaag aaggtcacca tcctggagct gttccgctcc 2160 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gaccacccat aatacccatt accctggtag ataagtagca tggcgggtta atcattaact 3900 acaaggaacc cctagtgatg gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg 3960 aggccgggcg accaaaggtc gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg 4020 agcgagcgcg cagccttaat taacctaatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 4080 gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 4140 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 4200 gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca 4260 gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct 4320 ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt 4380 tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac 4440 gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct 4500 ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt 4560 ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac 4620 aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgcttac aatttaggtg gcacttttcg 4680 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tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac 5580 ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact 5640 gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa 5700 acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa 5760 aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg 5820 atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc 5880 gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac 5940 tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca 6000 ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt 6060 ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc 6120 ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg 6180 aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc 6240 cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac 6300 gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct 6360 ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc 6420 cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt 6480 tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac 6540 cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg 6600 cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga 6660 caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac 6720 tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt 6780 gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca gatttaatta 6840 aggc 6844 <210> 20 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> 5'ITR <400> 20 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 21 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CMV IE enhancer <400> 21 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 22 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CB promoter <400> 22 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 23 <211> 1479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> hGlut1 cDNA <400> 23 atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60 cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120 gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180 ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240 ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300 ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360 atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgtg gcctgaccac aggcttcgtg 420 cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480 cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540 ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600 tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660 gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720 ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780 gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840 tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900 gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960 actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020 ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080 ctaccccgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140 gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200 ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260 tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt cactgtgctc 1320 ctggttctgt tcttcatctt cacctacttc aaagttcctg agactaaagg ccggaccttc 1380 gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggagccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440 gagctgttcc atcccctggg ggctgattcc caagtgtga 1479 <210> 24 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 2A-linker <400> 24 aattttgacc ttcttaagct tgcgggagac gtcgagtcca accctgggcc c 51 <210> 25 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> eGFP <400> 25 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717 <210> 26 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> Poly A signal <400> 26 gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60 tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120 tcactcg 127 <210> 27 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> 3' ITR <400> 27 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag 130 <210> 28 <211> 6568 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> pAAV CB6 PI hGlut1 <400> 28 cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60 ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120 ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180 ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240 agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600 cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660 tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720 gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780 agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg 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gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 30 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CMV IE enhancer <400> 30 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 31 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CB promoter <400> 31 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata 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Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> pAAV CB6 PI mGlut1 <400> 35 cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60 ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120 ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180 ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240 agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600 cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660 tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720 gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780 agcggcgcgc 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ctgcaggaga tgaaagaaga gggtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcttg 780 gagctgttcc gctcacccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840 tcccagcagc tgtcgggtat caatgctgtg ttctactact caacgagcat cttcgagaag 900 gcaggtgtgc agcagcctgt gtacgccacc atcggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960 actgtggtgt cgctgtttgt tgtagagcga gctggacgac ggaccctgca cctcattggc 1020 ctggctggca tggcaggctg tgctgtgctc atgaccatcg ccctggcctt gctggaacgg 1080 ctgccttgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140 gtaggccctg gtcctattcc atggttcatt gtggccgagc tgttcagcca ggggccccgt 1200 cctgctgcta ttgctgtggc tggcttctcc aactggacct caaacttcat tgtgggcatg 1260 tgcttccagt atgtggagca actgtgcggc ccctacgtct tcatcatctt cacggtgctc 1320 ctcgtgctct tcttcatctt cacctacttc aaagtccctg agaccaaagg ccgaaccttc 1380 gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggtgccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440 gagctcttcc accctctggg ggcggactcc caagtgtga 1479 <210> 40 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: 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ctccacaggt gtccactccc agttcagctc ttaaggctag 1140 agtacttaat acgactcact ataggctagc gcgccgaatt ggccgccagt gtgatggata 1200 tctgcagaat tcgcccttag caggagacca aacgacgggg gtcggagtca gagtcgcagt 1260 gggagtcccc ggaccggagc acgagcctga gcgggagagc gccgctcgca cgcccgtcgc 1320 cacccgcgta cccggcgcag ccagagccac cagcgcagcg ctgccatgga gcccagcagc 1380 aagaagctga cgggtcgcct catgctggcc gtgggaggag cagtgcttgg ctccctgcag 1440 tttggctaca acactggagt catcaatgcc ccccagaagg tgatcgagga gttctacaac 1500 cagacatggg tccaccgcta tggggagagc atcctgccca ccacgctcac cacgctctgg 1560 tccctctcag tggccatctt ttctgttggg ggcatgattg gctccttctc tgtgggcctt 1620 ttcgttaacc gctttggccg gcggaattca atgctgatga tgaacctgct ggccttcgtg 1680 tccgccgtgc tcatgggctt ctcgaaactg ggcaagtcct ttgagatgct gatcctgggc 1740 cgcttcatca tcggtgtgta ctgtggcctg accacaggct tcgtgcccat gtatgtgggt 1800 gaagtgtcac ccacagccct tcgtggggcc ctgggcaccc tgcaccagct gggcatcgtc 1860 gtcggcatcc tcatcgccca ggtgttcggc ctggactcca tcatgggcaa caaggacctg 1920 tggcccctgc tgctgagcat 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Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CMV IE enhancer <400> 44 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 45 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CB promoter <400> 45 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 46 <211> 1479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> hGlut1 cDNA <400> 46 atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60 cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120 gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180 ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240 ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300 ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360 atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgtg gcctgaccac aggcttcgtg 420 cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480 cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540 ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600 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atcccctggg ggctgattcc caagtgtga 1479 <210> 47 <211> 482 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> 3'UTR <400> 47 gtcgccccag atcaccagcc cggcctgctc ccagcagccc taaggatctc tcaggagcac 60 aggcagctgg atgagacttc caaacctgac agatgtcagc cgagccgggc ctggggctcc 120 tttctccagc cagcaatgat gtccagaaga atattcagga cttaacggct ccaggatttt 180 aacaaaagca agactgttgc tcaaatctat tcagacaagc aacaggtttt ataatttttt 240 tattactgat tttgttattt ttatatcagc ctgagtctcc tgtgcccaca tcccaggctt 300 caccctgaat ggttccatgc ctgagggtgg agactaagcc ctgtcgagac acttgccttc 360 ttcacccagc taatctgtag ggctggacct atgtcctaag gacacactaa tcgaactatg 420 aactacaaag cttctatccc aggaggtggc tatggccacc cgttctgctg gcctggatct 480 cc 482 <210> 48 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 3xmiR-122 BS <400> 48 cgaaacaaac accattgtca cactccaaca aacaccattg tcacactcca acaaacacca 60 ttgtcacact 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<400> 55 atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60 cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120 gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180 ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240 ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300 ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360 atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgtg gcctgaccac aggcttcgtg 420 cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480 cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540 ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600 tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660 gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720 ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780 gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840 tcccagcagc 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aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 62 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CB promoter <400> 62 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 63 <211> 1479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> mGlut1 cDNA <400> 63 atggatccca gcagcaagaa ggtgacgggc cgcctcatgt tggctgtggg aggagcagtg 60 ctcggatcac tgcagttcgg ctataacact ggtgtcatca acgcccccca gaaggttatt 120 gaggagttct acaatcaaac atggaaccac cgctacggag agcccatccc atccaccaca 180 ctcaccacgc tttggtctct ctccgtggcc atcttctctg tcgggggcat gattggttcc 240 ttctctgtcg gcctctttgt taatcgcttt ggcaggcgga actccatgct gatgatgaac 300 ctgttggcct ttgtggctgc tgtgcttatg ggcttctcca aactgggcaa gtcctttgag 360 atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgactac tggctttgtg 420 cccatgtatg tgggagaggt gtcacctaca gctctacgtg gagccctagg cacactgcac 480 cagctgggaa tcgtcgttgg catccttatt gcccaggtgt ttggcttaga ctccatcatg 540 ggcaatgcag acttgtggcc tctgctgctc agtgtcatct tcatcccagc cctgctacag 600 tgtatcctgt tgcccttctg ccccgagagc ccccgcttcc tgctcatcaa tcgtaacgag 660 gagaaccggg ccaagagtgt gctgaagaag cttcgaggga cagccgatgt gacccgagac 720 ctgcaggaga tgaaagaaga gggtcggcag 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<223> 3'UTR and 3x-miR122BS <400> 64 ggagccccac acccagcccg gcctgctccc tgcagcccaa ggatctctct ggagcacagg 60 cagctagatg agacctcttc cgaaccgaca gatctcgggc aagccgggcc tgggcgcctt 120 tcctcagcca gcagtgaagt ccaggaggat attcaggact ttgatggctc cagaattttt 180 aatgaaagca agactgctgc tcagatctat tcagataagc agcaggtttt ataatttttt 240 tattactgat tttgttattt ttttttttta tcagccactc tcctatctcc acactgtagt 300 cttcaccttg attggcccag tgcctgaggg tggggaccac gccctgtcca gacacttgcc 360 ttctttgcca agctaatctg tagggctgga cctatggcca aggacacact aataccgaac 420 tctgagctag gaggctttac cgctggaggc ggtagctgcc acccacttcc gcaggcctgg 480 acctcggcac cataggggtc cggactccat tttaggattc gcccattcct gtctcttcct 540 acccaaccac tcaattaatc tttccttgcc tgagaccagt tggaagcact ggagtgcagg 600 gaggagaggg aagggccagg ctgggctgcc aggttctagt ctcctgtgca ctgagggcca 660 cacaaacacc atgagaagga ccgaaacaaa caccattgtc acactccaac aaacaccatt 720 gtcacactcc aacaaacacc attgtcacac tccattcgga cctcggaggc tgagaactta 780 actgctgaag acacggacac tcctgccctg ctgtgtatag atggaagata 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<220> <223> pAAV CB6 PI mGlut1-out3xmiR-122 BS <400> 67 cttaattagg ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg 60 ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa 120 ctccatcact aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag 180 ggtaatgggg atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat 240 agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac 300 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa 360 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600 cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660 tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720 gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780 agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg 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ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 5040 gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 5100 acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 5160 cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 5220 catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 5280 tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc 5340 cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 5400 accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 5460 cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 5520 ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 5580 accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat 5640 ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 5700 attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 5760 ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 5820 tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc 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<400> 69 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 70 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CB promoter <400> 70 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 71 <211> 1479 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> mGlut1 cDNA <400> 71 atggatccca gcagcaagaa ggtgacgggc cgcctcatgt tggctgtggg aggagcagtg 60 ctcggatcac tgcagttcgg ctataacact ggtgtcatca acgcccccca gaaggttatt 120 gaggagttct acaatcaaac atggaaccac cgctacggag agcccatccc atccaccaca 180 ctcaccacgc tttggtctct ctccgtggcc atcttctctg tcgggggcat gattggttcc 240 ttctctgtcg gcctctttgt taatcgcttt ggcaggcgga actccatgct gatgatgaac 300 ctgttggcct ttgtggctgc tgtgcttatg ggcttctcca aactgggcaa gtcctttgag 360 atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgactac tggctttgtg 420 cccatgtatg tgggagaggt gtcacctaca gctctacgtg gagccctagg cacactgcac 480 cagctgggaa tcgtcgttgg catccttatt gcccaggtgt ttggcttaga ctccatcatg 540 ggcaatgcag acttgtggcc tctgctgctc agtgtcatct tcatcccagc cctgctacag 600 tgtatcctgt tgcccttctg ccccgagagc ccccgcttcc tgctcatcaa tcgtaacgag 660 gagaaccggg ccaagagtgt gctgaagaag cttcgaggga cagccgatgt gacccgagac 720 ctgcaggaga tgaaagaaga gggtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcttg 780 gagctgttcc gctcacccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840 tcccagcagc tgtcgggtat caatgctgtg ttctactact caacgagcat cttcgagaag 900 gcaggtgtgc agcagcctgt gtacgccacc atcggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960 actgtggtgt cgctgtttgt tgtagagcga gctggacgac ggaccctgca cctcattggc 1020 ctggctggca tggcaggctg tgctgtgctc atgaccatcg ccctggcctt gctggaacgg 1080 ctgccttgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140 gtaggccctg gtcctattcc atggttcatt gtggccgagc tgttcagcca ggggccccgt 1200 cctgctgcta ttgctgtggc tggcttctcc aactggacct caaacttcat tgtgggcatg 1260 tgcttccagt atgtggagca actgtgcggc ccctacgtct tcatcatctt cacggtgctc 1320 ctcgtgctct tcttcatctt cacctacttc aaagtccctg agaccaaagg ccgaaccttc 1380 gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggtgccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440 gagctcttcc accctctggg ggcggactcc caagtgtga 1479 <210> 72 <211> 955 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> 3'UTR <400> 72 ggagccccac acccagcccg gcctgctccc tgcagcccaa ggatctctct ggagcacagg 60 cagctagatg agacctcttc cgaaccgaca gatctcgggc aagccgggcc tgggcgcctt 120 tcctcagcca gcagtgaagt ccaggaggat attcaggact ttgatggctc cagaattttt 180 aatgaaagca agactgctgc tcagatctat tcagataagc agcaggtttt ataatttttt 240 tattactgat tttgttattt ttttttttta tcagccactc tcctatctcc acactgtagt 300 cttcaccttg attggcccag tgcctgaggg tggggaccac gccctgtcca gacacttgcc 360 ttctttgcca agctaatctg tagggctgga cctatggcca aggacacact aataccgaac 420 tctgagctag gaggctttac cgctggaggc ggtagctgcc acccacttcc gcaggcctgg 480 acctcggcac cataggggtc cggactccat tttaggattc gcccattcct gtctcttcct 540 acccaaccac tcaattaatc tttccttgcc tgagaccagt tggaagcact ggagtgcagg 600 gaggagaggg aagggccagg ctgggctgcc aggttctagt ctcctgtgca ctgagggcca 660 cacaaacacc atgagaagga cctcggaggc tgagaactta actgctgaag acacggacac 720 tcctgccctg ctgtgtatag atggaagata tttatatatt ttttggttgt caatattaaa 780 tacagacact aagttatagt atatctggac aaacccactt gtaaatacac caacaaactc 840 ctgtaacttt acctaagcag atataaatgg ctggttttta gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 955 <210> 73 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <223> 3xmiR-122BS <400> 73 cgaaacaaac accattgtca cactccaaca aacaccattg tcacactcca acaaacacca 60 ttgtcacact ccattcg 77 <210> 74 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> Poly A signal <400> 74 gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60 tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120 tcactcg 127 <210> 75 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> 3'ITR <400> 75 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag 130 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <223> Glut1QPCR F1 <400> 76 cttgcttgta gagtgacgat c 21 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <220> <223> Glut1QPCR R1 <400> 77 cagtgatccg agcactgctc 20 <210> 78 <211> 492 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> mGlut1 amino acid sequence; solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1 <400> 78 Met Asp Pro Ser Ser Lys Lys Val Thr Gly Arg Leu Met Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Thr Gly Val 20 25 30 Ile Asn Ala Pro Gln Lys Val Ile Glu Glu Phe Tyr Asn Gln Thr Trp 35 40 45 Asn His Arg Tyr Gly Glu Pro Ile Pro Ser Thr Thr Leu Thr Thr Leu 50 55 60 Trp Ser Leu Ser Val Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Gly Ser 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492 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> hGlut1 amino acid sequence; solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1 <400> 79 Met Glu Pro Ser Ser Lys Lys Leu Thr Gly Arg Leu Met Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Thr Gly Val 20 25 30 Ile Asn Ala Pro Gln Lys Val Ile Glu Glu Phe Tyr Asn Gln Thr Trp 35 40 45 Val His Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Leu Pro Thr Thr Leu Thr Thr Leu 50 55 60 Trp Ser Leu Ser Val Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Gly Ser 65 70 75 80 Phe Ser Val Gly Leu Phe Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Met 85 90 95 Leu Met Met Asn Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala Val Leu Met Gly Phe 100 105 110 Ser Lys Leu Gly Lys Ser Phe Glu Met Leu Ile Leu Gly Arg Phe Ile 115 120 125 Ile Gly Val Tyr Cys Gly Leu Thr Thr Gly Phe Val Pro Met Tyr Val 130 135 140 Gly Glu Val Ser Pro Thr Ala Leu Arg Gly Ala Leu Gly Thr Leu His 145 150 155 160 Gln Leu Gly Ile Val Val Gly Ile Leu Ile Ala Gln Val Phe Gly Leu 165 170 175 Asp Ser Ile Met Gly Asn 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ggctagagta cttaatacga ctcactatag gctagcgcgc cgaattcggc acgaggaaaa 1200 aggcagctcc gcgcgctctc ccccaagagc agaggcttgc ttgtagagtg acgatctgag 1260 ctacggggtc ttaagtgcgt cagggcgtgg aggtctggcg ggagacgcat agttacagcg 1320 cgtccgttct ccgtctcgca gccggcacag ctagagcttc gagcgcagcg cggccatgga 1380 tcccagcagc aagaaggtga cgggccgcct catgttggct gtgggaggag cagtgctcgg 1440 atcactgcag ttcggctata acactggtgt catcaacgcc ccccagaagg ttattgagga 1500 gttctacaat caaacatgga accaccgcta cggagagccc atcccatcca ccacactcac 1560 cacgctttgg tctctctccg tggccatctt ctctgtcggg ggcatgattg gttccttctc 1620 tgtcggcctc tttgttaatc gctttggcag gcggaactcc atgctgatga tgaacctgtt 1680 ggcctttgtg gctgctgtgc ttatgggctt ctccaaactg ggcaagtcct ttgagatgct 1740 gatcctgggc cgcttcatca tcggtgtgta ctgcggcctg actactggct ttgtgcccat 1800 gtatgtggga gaggtgtcac ctacagctct acgtggagcc ctaggcacac tgcaccagct 1860 gggaatcgtc gttggcatcc ttattgccca ggtgtttggc ttagactcca tcatgggcaa 1920 tgcagacttg tggcctctgc tgctcagtgt catcttcatc ccagccctgc tacagtgtat 1980 cctgttgccc ttctgccccg agagcccccg cttcctgctc atcaatcgta acgaggagaa 2040 ccgggccaag agtgtgctga agaagcttcg agggacagcc gatgtgaccc gagacctgca 2100 ggagatgaaa gaagagggtc ggcagatgat gcgggagaag aaggtcacca tcttggagct 2160 gttccgctca cccgcctacc gccagcccat cctcatcgct gtggtgctgc agctgtccca 2220 gcagctgtcg ggtatcaatg ctgtgttcta ctactcaacg agcatcttcg agaaggcagg 2280 tgtgcagcag cctgtgtacg ccaccatcgg ctccggtatc gtcaacacgg ccttcactgt 2340 ggtgtcgctg tttgttgtag agcgagctgg acgacggacc ctgcacctca ttggcctggc 2400 tggcatggca ggctgtgctg tgctcatgac catcgccctg gccttgctgg aacggctgcc 2460 ttggatgtcc tatctgagca tcgtggccat ctttggcttt gtggccttct ttgaagtagg 2520 ccctggtcct attccatggt tcattgtggc cgagctgttc agccaggggc cccgtcctgc 2580 tgctattgct gtggctggct tctccaactg gacctcaaac ttcattgtgg gcatgtgctt 2640 ccagtatgtg gagcaactgt gcggccccta cgtcttcatc atcttcacgg tgctcctcgt 2700 gctcttcttc atcttcacct acttcaaagt ccctgagacc aaaggccgaa ccttcgatga 2760 gatcgcttcc ggcttccggc aggggggtgc cagccaaagt gacaagacac ccgaggagct 2820 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actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata 4560 agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa 4620 cgcgaatttt aacaaaatat taacgcttac aatttaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 4680 cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 4740 caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 4800 ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca 4860 gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 4920 gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 4980 atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg 5040 caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 5100 gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 5160 accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 5220 ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 5280 gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 5340 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cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 82 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CMV IE enhancer <400> 82 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 83 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CB promoter <400> 83 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 84 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> eGFP <400> 84 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa 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gggccctggg caccctgcac 480 cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540 ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600 tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660 gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720 ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780 gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840 tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900 gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960 actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020 ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080 ctaccccgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140 gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200 ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260 tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt 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360 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt 420 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc 480 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat 540 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgtcgaggc 600 cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt 660 tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggcgcgc gccaggcggg 720 gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag 780 agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa 840 aagcgaagcg cgcggcgggc gggagcaagc tttattgcgg tagtttatca cagttaaatt 900 gctaacgcag tcagtgcttc tgacacaaca gtctcgaact taagctgcag aagttggtcg 960 tgaggcactg ggcaggtaag tatcaaggtt acaagacagg tttaaggaga ccaatagaaa 1020 ctgggcttgt cgagacagag aagactcttg cgtttctgat aggcacctat tggtcttact 1080 gacatccact ttgcctttct ctccacaggt gtccactccc agttcaatta cagctcttaa 1140 ggctagagta cttaatacga ctcactatag gctagcgcgc cgaattcggc acgaggaaaa 1200 aggcagctcc 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agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac 6300 aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga 6360 aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt 6420 ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta 6480 cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat 6540 tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg 6600 accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct 6660 ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa 6720 gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct 6780 ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 6840 acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc agatttaatt aaggc 6885 <210> 89 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> 5'ITR <400> 89 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct 130 <210> 90 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CMV IE enhancer <400> 90 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 91 <211> 382 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> CB promoter <400> 91 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt ac 382 <210> 92 <211> 717 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> eGFP <400> 92 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717 <210> 93 <211> 1476 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> mGlut1 cDNA and 3'UTR <400> 93 atggatccca gcagcaagaa ggtgacgggc cgcctcatgt tggctgtggg aggagcagtg 60 ctcggatcac tgcagttcgg ctataacact ggtgtcatca acgcccccca gaaggttatt 120 gaggagttct acaatcaaac atggaaccac cgctacggag agcccatccc atccaccaca 180 ctcaccacgc tttggtctct ctccgtggcc atcttctctg tcgggggcat gattggttcc 240 ttctctgtcg gcctctttgt taatcgcttt ggcaggcgga actccatgct gatgatgaac 300 ctgttggcct ttgtggctgc tgtgcttatg ggcttctcca aactgggcaa gtcctttgag 360 atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgactac tggctttgtg 420 cccatgtatg tgggagaggt gtcacctaca gctctacgtg gagccctagg 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ctcgtgctct tcttcatctt cacctacttc aaagtccctg agaccaaagg ccgaaccttc 1380 gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggtgccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440 gagctcttcc accctctggg ggcggactcc caagtg 1476 <210> 94 <211> 127 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> Poly A signal <400> 94 gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga gcatctgact 60 tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt tttgtgtctc 120 tcactcg 127 <210> 95 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> 3' ITR <400> 95 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag 130 <210> 96 <211> 2208 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <223> AAV9 DNA <400> 96 atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca accttagtga aggaattcgc 60 gagtggtggg ctttgaaacc tggagcccct caacccaagg caaatcaaca acatcaagac 120 aacgctcgag gtcttgtgct tccgggttac aaataccttg gacccggcaa cggactcgac 180 aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240 cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300 caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360 gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420 ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480 aaatcgggtg cacagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540 tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600 cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660 gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720 accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780 tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840 tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900 ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960 caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020 acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080 gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140 acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200 ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260 cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320 gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380 ctaaaattca gtgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440 ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500 tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560 ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620 ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680 accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740 gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800 atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860 aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc tgatgggagg gtttggaatg 1920 aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980 gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040 gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100 tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160 tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctg 2208 <210> 97 <211> 736 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <220> <223> AAV9 protein <400> 97 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser 1 5 10 15 Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro 20 25 30 Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro 35 40 45 Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro 50 55 60 Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp 65 70 75 80 Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala 85 90 95 Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly 100 105 110 Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro 115 120 125 Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg 130 135 140 Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly 145 150 155 160 Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr 165 170 175 Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser 210 215 220 Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile 225 230 235 240 Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu 245 250 255 Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn 260 265 270 Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg 275 280 285 Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn 290 295 300 Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile 305 310 315 320 Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn 325 330 335 Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu 340 345 350 Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro 355 360 365 Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp 370 375 380 Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe 385 390 395 400 Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu 405 410 415 Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu 420 425 430 Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser 435 440 445 Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser 450 455 460 Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro 465 470 475 480 Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn 485 490 495 Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn 500 505 510 Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys 515 520 525 Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly 530 535 540 Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile 545 550 555 560 Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser 565 570 575 Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln 580 585 590 Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln 595 600 605 Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His 610 615 620 Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met 625 630 635 640 Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala 645 650 655 Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr 660 665 670 Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln 675 680 685 Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn 690 695 700 Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val 705 710 715 720 Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu 725 730 735

Claims (23)

  1. Glut1을 암호화하는 이식유전자(transgene)를 포함하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 아데노-관련 벡터(recombinant adeno-associated vector: rAAV).
  2. 제1항에 있어서, 닭 베타-액틴 프로모터를 더 포함하되, 상기 rAAV는 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier: BBB)을 가로지를 수 있는, 재조합 AAV.
  3. 제2항에 있어서, 상기 이식유전자는 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있는, 재조합 AAV.
  4. 제2항에 있어서, 상기 닭 베타-액틴 프로모터는 서열번호 31, 38, 45, 54, 62 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택된, 재조합 AAV.
  5. 제1항에 있어서, 상기 AAV는 AAV8 또는 AAV9인, 재조합 AAV.
  6. 제1항에 있어서, 상기 Glut1은 서열번호 78 또는 79를 포함하는, 재조합 AAV.
  7. 제1항에 있어서, 서열번호 48, 56, 59, 64 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA 요소를 더 포함하는, 재조합 AAV.
  8. 제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 miRNA 요소에 측접하는 역위 말단 반복부(inverted terminal repeat: ITR)를 더 포함하는, 재조합 AAV.
  9. 제1항의 재조합 AAV를 포함하는 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 약제학적 담체를 더 포함하는, 조성물.
  11. 제9항의 조성물을 포함하는 용기 하우징을 포함하는 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 용기는 주사기인, 키트.
  13. 대상체의 혈액 뇌 장벽(BBB)에서 Glut1 수송을 회복하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제1항의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. Glut1 결핍 증후군의 치료가 필요한 대상체에서 Glut1 결핍 증후군을 치료하는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제1항의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 대상체에서 수액당감소증, 후천적 소두증, 운동실조 및 실조성 운동 기능장애로 이루어진 군으로부터 선택된 Glut1 결핍 증후군과 관련된 증상 중 적어도 하나를 완화시키는 방법으로서, 상기 대상체에게 유효량의 제1항의 재조합 AAV 벡터를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV는 닭 베타-액틴 프로모터를 더 포함하고, 상기 rAAV는 상기 혈액-뇌 장벽(BBB)을 가로지를 수 있는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 이식유전자는 뇌 미세혈관계의 내벽을 이루는 내피세포에서 발현될 수 있는, 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 닭 베타-액틴 프로모터는 서열번호 31, 38, 45, 54, 62 및 70으로 이루어진 군으로부터 선택된, 방법.
  19. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV는 AAV8 또는 AAV9인, 방법.
  20. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Glut1은 서열번호 78 또는 79를 포함하는, 방법.
  21. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV는 서열번호 48, 56, 59, 64 및 73으로 이루어진 군으로부터 선택된 miRNA 요소를 더 포함하는, 방법.
  22. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 상기 miRNA 요소에 측접하는 역위 말단 반복부(ITR)를 더 포함하는, 방법.
  23. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 AAV는 약제학적 담체를 더 포함하는 조성물 내에 포함되는, 방법.
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