JP6884430B2 - ハンチントン病のaav処置 - Google Patents
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Description
本出願は、2016年9月22日に出願され、表題が「ハンチントン病のAAV処置」である米国仮出願第62/398,487号(この内容全体は参照により本明細書に組み込まれる)の出願日の利益を35 U.S.C. 119(e)の下、主張するものである。
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたNS038194下の政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
ハンチントン病(HD)は、ハンチントン遺伝子のエキソン1中CAG反復領域の拡大によって引き起こされる深刻な遺伝性神経変性疾患である。ハンチントンタンパク質(HTT)が全身で発現されている間、ポリグルタミンが伸長したタンパク質は、線条体の中型有棘ニューロン(medium spiny neurons)およびそれらの皮質結合(cortical connections)に対し、とくに毒性を示す。患者は、落ち込み(depression)および不安(anxiety)を包含する情動性症状(emotional symptoms)に、ならびに特徴的な運動障害(movement disturbances)および舞踏病に、苦しむ。これまでのところ、ハンチントン病に対する治療法はない;治療の選択肢は、病徴を和らげることに限定されている。
本開示の側面は、ハンチントン病(HD)を処置するのに有用な組成物および方法に関する。いくつかの態様において、ヒトハンチントン(HTT)に対し特異的にハイブリダイズしてその発現を阻害する阻害性核酸(例として、人工miRNAなどのmiRNA)が提供される。
いくつかの態様において、導入遺伝子はさらに、プロモーターをコードする核酸配列を含む。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチン(CBA)プロモーターまたはU6プロモーターである。
いくつかの態様において、第1または第2ITRバリアントは、機能的な末端解離部位(TRS)を欠き、任意にITRバリアントは、ΔTRS ITRである。
いくつかの側面において、本開示は、本開示によって記載されるとおりの単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミドである。
いくつかの側面において、本開示は、カプシドタンパク質;および本開示によって記載されるとおりの単離された核酸、を含む組み換えAAV(rAAV)を提供する。
いくつかの態様において、rAAVは、自己相補的なAAV(scAAV)である。
いくつかの態様において、rAAVは、中枢神経系(CNS)への送達のために製剤化されている。
いくつかの態様において、導入遺伝子は、プロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチン(CBA)プロモーターまたはU6プロモーターである。
いくつかの態様において、導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)またはそれらのバリアントに隣接する。いくつかの態様において、ITRバリアントは、機能的な末端解離部位(TRS)を欠く。いくつかの態様において、TRSを欠くITRバリアントは、ΔTRS ITRである。
いくつかの態様において、導入遺伝子は、プロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチン(CBA)プロモーターまたはU6プロモーターである。
いくつかの態様において、導入遺伝子は、アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)またはそれらのバリアントに隣接する。いくつかの態様において、ITRバリアントは、機能的な末端解離部位(TRS)を欠く。いくつかの態様において、TRSを欠くITRバリアントは、ΔTRS ITRである。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、AAV9カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、配列番号20に規定される配列を含む。
いくつかの態様において、対象は、36超のCAG反復、40超の反復、または100超の反復を有するハンチントン遺伝子を含む。いくつかの態様において、対象は、20年齢未満である。
本発明の側面は、対象へ送達されたとき、対象における病原性のハンチントンタンパク質(HTT)の発現を低減させるのに有効な、ある干渉RNA(例として、人工miRNAなどのmiRNA)に関する。その結果、本開示によって記載される方法および組成物は、いくつかの態様において、ハンチントン病の処置に有用である。
対象へ導入遺伝子(例として、miRNAなどの阻害性RNA)を送達するための方法は、本開示によって提供される。方法は、典型的には、有効量の、ハンチントン(htt)タンパク質の発現を低減することができる干渉RNAをコードする単離された核酸、またはハンチントンタンパク質の発現を低減することができる阻害性RNAを発現するための核酸を含むrAAVを、対象へ投与することを伴う。
いくつかの側面において、本開示は、ヒトハンチントン(HTT)の発現を低減させる(例として、阻害する)のに有用な単離された核酸を提供する。「核酸」配列は、DNA配列またはRNA配列を指す。いくつかの態様において、本開示のタンパク質および核酸は、単離されている。本明細書に使用されるとき、用語「単離された(isolated)」は、人工的に生産されたことを意味する。核酸に関し本明細書に使用されるとき、用語「単離された」は、以下を意味する:(i)例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、in vitroで増幅された;(ii)クローニングによって、組み換えで生産された;(iii)たとえば切断およびゲル分離によって、精製された;または(iv)例えば化学合成によって、合成された。単離された核酸は、当該技術分野において周知の組み換えDNA技法による容易な操作が可能なものである。
いくつかの側面において、本開示は、単離されたAAVを提供する。AAVに関して本明細書で使用されるとき、用語「単離された」は、人工的に生産されたかまたは得られたAAVを指す。単離されたAAVは、組み換え方法を使用して生産されてもよい。かかるAAVは、本明細書中「組み換えAAV」として言及される。組み換えAAV(rAAV)は好ましくは、rAAVのヌクレアーゼおよび/または導入遺伝子が1以上の既定組織(単数または複数)へ特異的に送達されるような、組織特異的な標的能を有する。AAVカプシドは、これらの組織特異的な標的能を決定するのに重要な要素である。よって、標的にされる組織にとって適切なカプシドを有するrAAVが、選択され得る。
本開示のrAAVは、組成物中、当該技術分野において知られているいずれの適切な方法にも従って、対象へ送達されてもよい。例えば、rAAVは、好ましくは、生理学的に適合性のある担体中に(すなわち、組成物中に)懸濁されており、対象、すなわち、ヒト、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、モルモット、ハムスター、ニワトリ、シチメンチョウ、または霊長目の非ヒト動物(例として、マカク)などの宿主動物へ投与されてもよい。いくつかの態様において、宿主動物は、ヒトを包含しない。
本明細書に記載の剤は、いくつかの態様において、治療の、診断のまたは調査の用途におけるそれらの使用を容易にするための、医薬または診断または調査キットにまとめられてもよい。キットは、本開示の構成成分および使用のための指示を収容する1以上の容器を包含していてもよい。具体的には、かかるキットは、本明細書に記載の1以上の剤を、これらの剤の意図する適用および適した使用を記載する指示と一緒に包含していてもよい。ある態様において、キットにおける剤は、具体的な適用におよび剤の投与の方法に好適な医薬製剤および投薬量であってもよい。調査目的のためのキットは、様々な実験を実行するのに適切な濃度または分量で構成成分を含有していてもよい。
例1:材料および方法
細胞培養物およびスクリーニングアッセイ
HeLa細胞を、10%熱不活化FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを含むDMEM高グルコース(ThermoFisher)中に維持した。トランスフェクションの24時間前に、細胞を0.8〜1.0×106細胞/ウェルで6ウェルプレートに播種した。トランスフェクションの日、増殖培地は、1.6mlのOpti-MEM(ThermoFisher)と交換した。プラスミドは、2μl/ウェルのDharmaFECT Duo(Dharmacon)を使用してトランスフェクトした。各ウェルは、0.6μgのプラスミドDNAを受容した。トランスフェクションの48時間後、細胞を収集し、全RNAを、MirVana RNA単離キットを使用して抽出した。cDNAをoligo-dTおよびSuperscript III(Invitrogen)を使用する、1μgのRNA/反応を使用して産生した。ハンチントンmRNAは、TaqMan assay(ThermoFisher)を使用して測定した。ハンチントンmRNAの相対的なレベルは、ハウスキーピング遺伝子としてヒトヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT)を用いるΔΔC(T)方法を使用して計算した。
YAC128および野生型FVBマウスを得た。マウスは、野生型雄性マウスとYAC128雌性マウスを交配することにより、FVBバックグラウンドで飼育した。得られた異種接合YAC128および野生型マウスを、12:12明スケジュールで維持し、食餌および水は自由にアクセスさせた。遺伝子型を、尾小片(tail snip)または耳パンチ(ear punch)から抽出したDNAのPCRによって確認した。マウスは、UMPC3またはUMPC4微量注入器(World Precision Instruments, Sarasota, FL)によって補助した小動物定位固定(stereotax)SAS-4100(ASI Instruments, Warren, MI)の手段により、線条体に選択したAAVを直接注射した。マウスは、284mg/kgのトリブロモエタノールで麻酔して、定位固定に配置した。前側1.0mm、外側2.0mmを計測し、33ゲージの針を線条体に3.0mm低下させて、0地点として、前項を使用して手術を実施した。125nl/分の速度で3.0ulを送達するように、ポンプを設定した。注射後に、マウスを加温パッド上で回復させ、次いで、住居領域内のケージに戻した。
適切な時点で、マウスを屠殺して、組織をRNA分析または免疫組織化学のために抽出した。RNA抽出のために、マウスは麻酔して、頸部脱臼により殺傷した。脳を取り出し、線条体を解剖した。利用可能な場合、GFP発現を使用して、GFP陽性組織のみが分析できるように、解剖を誘導した。組織は直ぐに、RNALater(Ambion)に配置した。引き続き、これらを−80°Cに凍結貯蔵した。実験の終わりに、免疫組織化学を意味したマウスを深く麻酔し、心臓内に生理食塩水、続いて、4%パラホルムアルデヒドを灌流させた。サンプルを、冷2%パラホルムアルデヒド中で終夜固定し、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水に貯蔵した。冠状切片を、Leica VT1000sビブラトーム上で40ミクロンの切片をスライスすることにより、作製した。
平均台渡り(beam walking):マウスは、平均台(平均台の大きさ(size of beam))を渡るように訓練された。訓練後、マウスは、平均台の一端から他端へと渡る際に記録した。1匹のマウス当たり3回の試験を記録した。記録に基づいて、マウスが平均台の一端の印から他端へ渡るのにかかる時間を測定した。
固定化組織切片を3%過酸化水素で3分間ブロックし、次いで、0.5%トリトンxと共に20分間インキュベートした。免疫組織化学を、DARPP32(Abcam ab40801;1:10,000希釈)、Iba1(Wako 019-19741;1:1,000希釈)、GFP(Life Technologies G10362;1:1000希釈)およびNeuN(EMD Millipore MAB377;1:1000希釈)に対するウサギまたはマウス由来抗体について、Laboratories Elite ABCキット試薬を使用して実施した。切片は、Metal Enhanced DAB Substrate Kit(Pierce)を使用するジアミノベンジジンを用いて2分間染色した。
全RNAを、MirVana RNA単離キットを使用して抽出した。18〜30ヌクレオチドRNAのサイズ選択を、15%変性ポリアクリルアミドゲル上で、5μgの全RNAを使用して実施した。サイズ選択後、小分子RNAを、エタノール沈殿し、アデニル化前の3’−アダプター(5’−rAppTGGAATTCTCGGGTGCCAAGG/ddC/−3’;配列番号11)に連結させた。連結生成物を、RTプライマー(5’−CCTTGGCACCCGAGAATTCCA−3’;配列番号12)にアニーリングし、5’−アダプター(RNA:5’−GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC−3’;配列番号13)に連結した。逆転写を、AMV Reverse transcriptase mix(NEB)を使用して実施し、1つのユニバーサルプライマー(5’−AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA−3’;配列番号14)および1つのバーコードプライマー(5’−CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA−3’;配列番号15)とともにAccuPrime Pfx DNA Polymerase(Invitrogen)を使用してPCR増幅した。ライブラリーは、配列決定し、mm9ゲノムおよびAAVゲノムに対してマッピングした。miRNA種は、miRNAヘアピンに関する5’末端マッピングの位置に基づいて分類し、したがって、各種は、共通のシード配列を有する全ての小分子RNAからなる。3’末端は、種の割り当てにおいて考慮しなかった。内因性miRNAの差次的発現を、edgeRパッケージを使用して分析した。
RNAは、上記のとおり抽出した。ライブラリーは、標準的な方法によって構築した。読み取りデータは、topHat2を使用してマッピングし、差次的発現は、deseq2パッケージを使用して計算した。
ハンチントン病のトランスジェニックヒツジモデル(例として、病原性ヒトハンチントンタンパク質を発現するトランスジェニックヒツジ)に、scAAV9-CBA-mir-HTT(mir-155バックボーンにmiRNA 6433を含む)、scAAV-U6-mir-HTT(mir-155バックボーンにmiRNA 6433を含む)、または空のscAAV9対照ベクターのいずれかを注射した。ヒツジを注射の1カ月後または6カ月後のいずれかに屠殺した。組織および核酸サンプルを調製し、定量的PCRおよび免疫組織化学によって分析した。
ハンチントン標的化人工miRNAの設計および選択
ヒトハンチントンmRNAを標的化する9つの配列(表1、図1)を試験した。9つの標的化配列の位置を示す概略図を図4Aに提供する。2コピーの人工miRNAを、内因性miRNA-155またはmiR-30に基づくバックボーンに直列にクローニングし、人工miRNA全体を、EGFPの3’−UTRに挿入した(図5A、上図)。mir-155ベースの、およびmir-30ベースの抗HTT amiRNAの予想されるヘアピン構造をそれぞれ図25A〜25Bに示す。得られたプラスミドを、Hela細胞にトランスフェクトした。48時間後、細胞を収集し、内因性ハンチントンmRNAのレベルを、定量的RT−PCR(qRT−PCT)によって測定した。9つの人工miRNAのうちの3つが、50%を超えてハンチントンを減少させた(図1〜2および4B〜4C)。
単一コピーの最も強力なmiRNA(HTT-6433)を、U6プロモーターの制御下でAAV9ベクターにクローニングした(図5A、下図)。マウスを、最初の2コピーのAAV9-CBA-抗HTT-6433(配列番号XXを含む)、AAV9-CBA-抗HTT-5155、AAV9-U6-抗HTT-6433(配列番号XXを含む)またはAAV9-U6-抗HTT-5155のいずれかを片側注射した。1カ月後、線条体を回収し、GFP発現を確認し、ハンチントンmRNAレベルをqRT−PCRによって測定した。人工miRNAの配列に関わらず、AAV9-U6-抗HTTおよびAAV9-CBA-抗HTTで処置したマウス間で、ノックダウンにおける有意差は観察されなかった。AAV9-U6-抗HTT-6433およびAAV9-CBA-抗HTT-6433で処置したマウスの両方において、注射した側のハンチントンmRNAの量は、非注射側の量の約50%であった(図5B)。
AAV9-U6-抗HTT-6433またはAAV9-CBA-抗HTT-6433を、Yac128マウスの線条体に片側注射した。注射の6カ月後、AAV9-U6-抗HTT-6433を注射したマウスは、巣作りせず(not nesting)、いくつかは活動亢進表現型を示したことが観察された。これらの異常を実証するために、各ケージの小さな巣を置き換えた。24時間後、AAV9-U6-抗HTT-6433の新しい小さな巣は未使用であったが、PBSおよびAAV9-CBA-抗HTT-6433を注射されたマウスは、予想されたとおり、巣を作製した(図6A)。ホームケージモニタリングシステムを使用して、マウスは、24時間記録された。AAV9-U6-抗HTT-6433処置したマウスは、PBSまたはAAV9-CBA-抗HTT-6433処置したマウスよりも、ホームケージを動き回るのに有意に多くの時間を費やした(図6B)。
マウスの群に、U6およびCβAプロモーターから人工miRNAを発現するscAAV9ベクターで片側注射した。注射の2週間に生成された小分子RNAをクローニングして配列決定した。両方の群において、AAVゲノムにマッピングする配列の96パーセントは、予想される小分子RNA産物にマッピングし、わずか数パーセントのみが不正確なDicerまたはDrosha切断を表していた。U6プロモーター推進人工miRNAを注射した群において、ハンチントン標的化配列は、配列決定の結果を支配し、マッピング可能な全ての配列の半分(50%)を占めていたが、CBAベクターを注射したマウスでは、配列の5%のみが、ベクターにコードされる小分子RNAに適合していた(図9A)。よって、潜在的に、センス鎖および翻訳スリップ生成物を含む、代替的なシード配列を有する小分子RNAは、機能的な内因性miRNAのものと比較可能なレベルで存在し得る(図9A)。ハンチントン標的化小分子RNAの相対的な量は、qPCRによって測定し、ハンチントン標的化配列の過剰発現を確認した。小分子RNAの発現は、U6プロモーター推進構築物で注射したマウスにおけるよりも150〜250倍高いことが観察された(図9B)。
AAV9-U6-抗HTT-6433またはAAV9-CBA-抗HTT-6433のいずれかで処理したマウスの線条体のRNA配列分析を実施して、ハンチントン標的化miRNAの過剰発現の結果を調査した。注射の2週間後、注射側および非注射側の線条体mRNAプロファイルを比較した。データは、CBA-mirHTT-6433で処置したマウスにおいて有意差がほとんどないことを示す(図14A)。AAV9-U6-抗HTT-6433で処置したマウスにおいて、処置に応答して、増加するmRNAおよび減少するmRNAの両方が観察された(図14B)。AAV9-U6-抗HTT-6433およびAAV9-CBA-抗HTT-6433のプロファイルが、2週間の時点で比較される場合、8つのみのmRNAが、2つの群間で、有意に差次的に発現されることが観察された。
ヒトハンチントン病のヒツジモデルをこの例において使用した。簡潔には、ヒトハンチントン(ヒトhtt)タンパク質を発現するトランスジェニックヒツジを作製した。ヒツジに、scAAV9 CBA-mir-HTT(「CBAプロモーター」)、scAAV9 U6-mir-HTT(「U6プロモーター」)、または空のscAAV9対照ベクターのいずれかを線条体内注射した。各構築物は、それぞれCBAプロモーターまたはU6プロモーターとβグロブリンポリアデニル化配列との間に存在するイントロン内に位置するmir-155バックボーンに挿入された、単一コピーの抗ハンチントン mir-6433配列(配列番号7)を含む。この実験において投与されたrAAVを生成するために使用された構築物は、配列番号18(scAAV9 CBA-mir-HTT)および19(scAAV9 U6-mir-HTT)に規定される。
動物および動物手順
メリノヒツジをこの例において使用した。麻酔の投与前に、動物は、終夜約8時間絶食させた。動物は、心拍数、呼吸数、体温および重量を含む手術前の身体的特徴を得た。血清(5ml)およびCSFのベースラインサンプルを収集した。
組織学的分析のための組織の薄片作成の前に、線条体を、OCTで優しくカバーした脳から単離し、24時間、−20℃で貯蔵した。40μmの厚みのある冠状切片を、線条体全体を通して、スライドするミクロトーム(Reichert-Jung Tetrander sliding microtome)用いて切断した。切片は、4℃で1×リン酸緩衝化生理食塩水中の0.01%アジ化ナトリウム中に貯蔵した。
第一のスタディのために、試験ベクターは、内因性mir155バックボーン(AAV9-U6-miRHTT)に基づいて人工miRNAを推進するU6プロモーターを含んでいた。この人工miRNAは、ヒツジではなく、ヒトハンチントンを標的化する。キメラサイトメガロウイルスエンハンサー/ニワトリβアクチン(CBA)プロモーター推進キメライントロンは、AAVパッケージングを改善するために含まれた。対照ベクター(AAV9)は、空のCBAプロモーターのみおよびイントロンを含んでいた。第二のスタディのために、試験ベクターは、CMVエンハンサーおよびCBAプロモーター、イントロンおよびmiRNA-155ベースの人工miRNA(AAV9-CBA-miRHTT)を含んでいた。
後に保存されたRNAサンプル中のRNAレベルを、分岐DNAアッセイ(bDNA)を使用して分析した。サンプルは、後にRNAで貯蔵される組織からの組織ホモジネートの調製のための製造業者のガイドラインに従って処理した(Affymetrix eBioscience, Quantigene(登録商標)Sample Processing Kit)。ホモジナイズしたサンプルは、bDNAアッセイのための製造業者のガイドラインに従って分析した(QuantiGene(登録商標) 2.0 Reagent System)。サンプルは、ヒトハンチントン(Human HD、QuantigeneからのSA-50339 from)、ヒツジハンチントン(Sheep Huntingin、QuantigeneからのSF-10586 from)、およびハウスキーピング遺伝子としてのヒツジカルネキシン(Sheep Calnexin、QuantigeneからのSF-10622 from)を検出するためのプローブを用いて分析した。アッセイ結果は、Tecan Infinite M1000 PRO ルミノメーター(統合時間は200msに設定)を用いて測定した。
生検パンチ(2mm)を、凍結ブロックからの、外側尾状および内側被殻からサンプリングした。RNA抽出は、いくらか改変したTRIzol製造業者ガイドライン(Ambion)を使用して実施した。TRIzol抽出中の相分離後、水相をRNA Clean & Concentrator(Zymo)カラムに移し、そのプロトコールに従った。RNAは分析まで−80℃に貯蔵した。RNAの量および濃度は、Fragment Analyzer (Advanced Analytical Technologies Inc.)に基づいて測定した。分析の直前に、RNAを20ng/μlに希釈した。人工miRNAガイド鎖は、製造業者の指示書に従って、TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Cat# 4366596、Thermo Scientific)、2μlのRNAおよびガイド鎖特異的ステムループプライマー(ThermoFisher custom assay targeting UAAGCAUGGAGCUAGCAGGCU(配列番号25)またはassay id 002407、let7e*)を使用して逆転写した。ddPCR反応は、5μlのRT生成物、1×濃度のmiR-Httアッセイおよび0.3×濃度のlet-7e*アッセイを使用して設定し、マルチプレックスを可能にした。液滴は、QX200 Droplet Generator(Cat# 1864002、Biorad)を用いて産生し、エンドポイントPCR増幅(40サイクル)後の陽性シグナルについてモニタリングした。miRHTTの相対発現を、miRHTTおよびlet-7e*の絶対濃度間の比を算出することによって決定した。
ゲノムDNAは、Gentra Puregene Tissue kit(Qiagen)を使用して、液体窒素中で即時凍結したサンプルから抽出した。ゲノムDNA濃度は、NanoDrop ONEc分光光度計を使用して測定した。Droplet Digital PCR (ddPCR、Biorad)を、インプットとしての50ngのDNAおよびTaqManアッセイを使用して、製造業者の推薦に従って実施し、ベクター特異的CBおよびU6プロモーターおよびHPRT参照遺伝子を検出した。結果は、二倍体ゲノム当たりのベクターゲノム(vg/dg)として表す。
線条体サンプルは、10mM HEPES、250mM スクロース、1mM EDTAおよびプロテアーゼ阻害剤(Roche)から構成される緩衝液中でホモジナイズし、10%振幅で10秒間超音波処理した。タンパク質濃度は、Bradfordアッセイを使用して測定した。96ウェルQuicPlex標準プレート(MSD)を、4℃で終夜、PBS中ウサギモノクローナル抗HTTプロリン1220領域抗体(D7F7、Cell Signaling、1:250)でコーティングした。プレートは、PBST(PBS+0.05% Tween20)を用いて、3×10分洗浄し、RTで2時間、PBS中の3%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロッキングした。PBSTで3×10分洗浄した後、25μLの均質化緩衝液またはブランク(均質化緩衝液)中に20μgのタンパク質を含む技術的二連のサンプルをプレートに分配して、オービタルシェイカー上で、4℃で終夜インキュベートした。プレートは、PBST中で3×10分洗浄し、以下のとおり、二次/検出抗体ミックス中でインキュベートした:mHTTの検出のために、マウスモノクローナル抗ポリQ抗体MW1(DSHB)を、PBS中1%BSA中1μg/mLの各抗体で、抗マウスSulfoTag検出抗体(MSD)と混合した。1ウェル当たり30μLの検出抗体ミックスを適用し、オービタルシェイカー上で、RTで3時間インキュベートした。プレートは、PBST中3×10分洗浄し、1ウェル当たり150μLの2×Read Buffer(MSD)を、QuickPlex SQ120(MSD)での読み取りの直前に適用した。
組織小片を、凍結ブロックから取り出し、200μl 10mM HEPES pH7.2、250mM スクロース、1mM EDTA+プロテアーゼ阻害剤タブレット(mini, complete, EDTA-free Roche #11836170001)中、氷上でホモジナイズした。サンプルは、10秒間超音波処理し、タンパク質濃度は、Bradford方法(BioRad #500-0006)を使用して決定した。同濃度のタンパク質(25μg)を3〜8%Tris-Acetateゲル(Life Technologies #EA03785BOX)上のSDS−PAGEによって分離し、TransBlot Turbo(BioRad)を使用してニトリセルロースに移した。ブロットは、トリス緩衝化生理食塩水中の5%脱脂粉乳+0.1% Tween-20(TBST)中で1時間ブロックし、ブロッキング溶液中で4℃で、一次抗体中に終夜インキュベートした。使用された一次抗体は以下であった:抗ポリQ(MW1、Coriell、1:500または3B5H10、Sigma、1:1000)、抗ハンチントン(MAB2166、EMD Millipore、1:1000またはAb1、DiFiglia et al., 1995、1:1000)、抗DARPP32(#ab40801、Abcam、1:10,000)、抗アクチン(A4700、Sigma、1:1000)、および抗スペクトリン(MAB1622、EMD Milliopore、1:4000)。ブロットは、TBST中で洗浄し、ブロッキング溶液中1:5000希釈したペルオキシダーゼ標識二次抗体中に室温で1時間インキュベートし、TBST中で洗浄し、そして、SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate(Pierce #34080)中でインキュベートした。画像は、CCD画像化システム(Alpha Innotech)およびHyperfilm ECL(GE Healthcare)を用いて得た。濃度測定は、ImageJ software(NIH)を使用するデジタル画像で実施した。統計学的分析は、独立t検定を使用して実施し、結果は、注射側の平均値として表した。
DARPP32陽性細胞を定量するために、20番目毎の切片を、1×PBS中3%過酸化水素中で3分間、0.5% Triton-X-100中で20分間、次いで、1×PBS中1.5%正常ヤギ血清(Vector Labs、S-1000)中で4時間インキュベートした。切片は、4℃で終夜、1.5%正常ヤギ血清中抗DARPP32(AbCam、ab40801、1:1,000希釈)中にインキュベートした。次いで、切片は、1×PBS中ビオチン化ヤギ抗ウサギIgG抗体(Vector Labs、AP-1000、1:200希釈)中に10分間インキュベートした。切片は、1×PBS中、Vectastain Elite ABC Kit(Vector Labs、PK-6100)からの2% Elite Aおよび2% Elite B試薬とともに5分間インキュベートした。Metal Enhanced DAB kit(ThermoFisher Scientific、34065)を使用して、DARPP32陽性細胞を可視化した。切片は、安定なペルオキシド緩衝液中の1×3,3’−ジアミノベンジジン中にインキュベートした。
HDのノックインモデルにおける拡大されたマウスハンチントンおよびHDのトランスジェニックマウスモデルにおけるヒトmHTT導入遺伝子mRNAのサイレンシングを観察した。この例において、2つのコホートのHDヒツジ(スタディ1およびスタディ2)は線条体に片側注射した。スタディ1において、scAAV9-U6-miRHTT(AAV9miRHTT)または非コードスタッファー配列がプロモーターとポリAシグナルとの間に挿入されているscAAV9-CBA-empty(AAV9)を、8〜9カ月齢のヒツジに注射した。スタディ2において、ヒツジは、14カ月齢で、scAAV9-CBA-miRHTTまたはscAAV9-CBA-empty(AAV9)を注射した。脳は、AAV9-miRHTT投与の1カ月後または6カ月後に回収した。
前線条体および線条体中央部におけるHTT mRNAは、ヒツジではなくヒトHTT mRNAを特異的に認識する分岐DNA(bDNA)アッセイを使用して測定した。このアッセイは、RNA単離を必要とせず、全てのサンプルが分析に含まれる。注射の1カ月後、ブロック中央部における注射に最も近く、scAAV9-U6-miRHTT(スタディ1)は、尾状および被殻の両方において、50%を超えて、ヒトHTT mRNAを低減させた(図28)。有意なサイレンシングは、注射部位からさらに離れている、前線条体において検出されなかった(図28)。注射の6カ月後、mRNAサイレンシングは、尾状において明白であった(図28)。scAAV9-CβA-miRHTTコホートにおいて(スタディ2)、HTT mRNAの顕著なサイレンシングが、注射の1カ月後、尾状中央部、被殻中央部、および前線条体において発生し(図28)、注射の6カ月後、尾状中央部においておよび被殻中央部の一部において発生した。前線条体は、6カ月において有意な低下を示さなかった。内因性ヒツジHTT miRNAの有意なサイレンシングは存在しなかった(図29A)。
HTTタンパク質は、同じサンプル調製物において、ウエスタンブロット(図30)および電気化学発光(Meso Scale Discovery(MSD、図30))によって検出された。スタディ1では、野生型HTTと比較してmHTT(変異HTT)を優先的に検出する3BH510抗体を使用して、ウエスタンブロット(図30)によりmHTTタンパク質を検出した。scAAV9-U6-miRHTTを用いる処置の1カ月後、尾状、被殻、よび前線条体において、そして、処置の6カ月後に被殻において、miRHTTを欠くAAV9での処置と比較して、mHTTタンパク質の有意な低減が存在した。スタディ2(図30、下図)において、scAAV9-CβA-miRHTT処置は、尾状において注射の一カ月後、そして、尾状、被殻および前線条体において注射の6カ月後、mHTTを有意にサイレンシングした。
AAVベクターの注射の安全性を調査するために、中型有棘神経細胞のマーカーであるDARPP32についての免疫組織化学を実施して、DARPP32陽性細胞の数を計数した。AAV9-miRHTT処置群の細胞数とAAV9処置群の細胞数との間に有意差は存在せず(表3)、神経細胞のマーカーであるNeuNについて染色された細胞の数の処置群間に有意差は存在しなかった。線条体容積は、DARPP32標識切片における線条体の断面領域の測定値を使用して決定し、miRNA処置後、対照と比較して変化していないことが見い出された(表4)。
マイクログリアに局所化して活性化の際にアップレギュレートされるタンパク質である、Iba1の免疫組織化学的局在化を調査した。標識された細胞は、休止または活性型マイクログリアとして形態に基づいて同定された(表5)。scAAV9-U6-miRHTTまたは対応する対照ベクターの注射により、注射の1カ月後に注射部位における活性型マイクログリアの数を増加させたが、注射の6カ月後、注射側および非注射側は区別できなかった。第二のスタディにおいて、マイクログリア応答は、スタディのエンドポイント(6カ月)においてのみ調査し、この時点では、群間で有意差は存在しなかった。この発見は、活性型マイクログリアにおける一過性の増加は、AAVカーゴと独立しており、ベクターまたは手術単独で生じ得ることを示唆する。
血液サンプルは、4回採取した:ベースライン(処置前)、処置後28(または30)日、90日、および180日。完全な血球数、電解質を測定し、肝臓および腎臓機能試験を実施した(表6)。これらの測定値のいずれにおいても、AAV9-miRHTT注射ヒツジと対照との間で、変化は見出されなかった。さらに、これらの時点で重量の変化は存在しなかった。
>配列番号1 ハンチントンmRNA;NCBI Ref. Seq NM_002111.8)
GCTGCCGGGACGGGTCCAAGATGGACGGCCGCTCAGGTTCTGCTTTTACCTGCGGCCCAGAGCCCCATTCATTGCCCCGGTGCTGAGCGGCGCCGCGAGTCGGCCCGAGGCCTCCGGGGACTGCCGTGCCGGGCGGGAGACCGCCATGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAACAGCCGCCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCTCCTCAGCTTCCTCAGCCGCCGCCGCAGGCACAGCCGCTGCTGCCTCAGCCGCAGCCGCCCCCGCCGCCGCCCCCGCCGCCACCCGGCCCGGCTGTGGCTGAGGAGCCGCTGCACCGACCAAAGAAAGAACTTTCAGCTACCAAGAAAGACCGTGTGAATCATTGTCTGACAATATGTGAAAACATAGTGGCACAGTCTGTCAGAAATTCTCCAGAATTTCAGAAACTTCTGGGCATCGCTATGGAACTTTTTCTGCTGTGCAGTGATGACGCAGAGTCAGATGTCAGGATGGTGGCTGACGAATGCCTCAACAAAGTTATCAAAGCTTTGATGGATTCTAATCTTCCAAGGTTACAGCTCGAGCTCTATAAGGAAATTAAAAAGAATGGTGCCCCTCGGAGTTTGCGTGCTGCCCTGTGGAGGTTTGCTGAGCTGGCTCACCTGGTTCGGCCTCAGAAATGCAGGCCTTACCTGGTGAACCTTCTGCCGTGCCTGACTCGAACAAGCAAGAGACCCGAAGAATCAGTCCAGGAGACCTTGGCTGCAGCTGTTCCCAAAATTATGGCTTCTTTTGGCAATTTTGCAAATGACAATGAAATTAAGGTTTTGTTAAAGGCCTTCATAGCGAACCTGAAGTCAAGCTCCCCCACCATTCGGCGGACAGCGGCTGGATCAGCAGTGAGCATCTGCCAGCACTCAAGAAGGACACAATATTTCTATAGTTGGCTACTAAATGTGCTCTTAGGCTTACTCGTTCCTGTCGAGGATGAACACTCCACTCTGCTGATTCTTGGCGTGCTGCTCACCCTGAGGTATTTGGTGCCCTTGCTGCAGCAGCAGGTCAAGGACACAAGCCTGAAAGGCAGCTTCGGAGTGACAAGGAAAGAAATGGAAGTCTCTCCTTCTGCAGAGCAGCTTGTCCAGGTTTATGAACTGACGTTACATCATACACAGCACCAAGACCACAATGTTGTGACCGGAGCCCTGGAGCTGTTGCAGCAGCTCTTCAGAACGCCTCCACCCGAGCTTCTGCAAACCCTGACCGCAGTCGGGGGCATTGGGCAGCTCACCGCTGCTAAGGAGGAGTCTGGTGGCCGAAGCCGTAGTGGGAGTATTGTGGAACTTATAGCTGGAGGGGGTTCCTCATGCAGCCCTGTCCTTTCAAGAAAACAAAAAGGCAAAGTGCTCTTAGGAGAAGAAGAAGCCTTGGAGGATGACTCTGAATCGAGATCGGATGTCAGCAGCTCTGCCTTAACAGCCTCAGTGAAGGATGAGATCAGTGGAGAGCTGGCTGCTTCTTCAGGGGTTTCCACTCCAGGGTCAGCAGGTCATGACATCATCACAGAACAGCCACGGTCACAGCACACACTGCAGGCGGACTCAGTGGATCTGGCCAGCTGTGACTTGACAAGCTCTGCCACTGATGGGGATGAGGAGGATATCTTGAGCCACAGCTCCAGCCAGGTCAGCGCCGTCCCATCTGACCCTGCCATGGACCTGAATGATGGGACCCAGGCCTCGTCGCCCATCAGCGACAGCTCCCAGACCACCACCGAAGGGCCTGATTCAGCTGTTACCCCTTCAGACAGTTCTGAAATTGTGTTAGACGGTACCGACAACCAGTATTTGGGCCTGCAGATTGGACAGCCCCAGGATGAAGATGAGGAAGCCACAGGTATTCTTCCTGATGAAGCCTCGGAGGCCTTCAGGAACTCTTCCATGGCCCTTCAACAGGCACATTTATTGAAAAACATGAGTCACTGCAGGCAGCCTTCTGACAGCAGTGTTGATAAATTTGTGTTGAGAGATGAAGCTACTGAACCGGGTGATCAAGAAAACAAGCCTTGCCGCATCAAAGGTGACATTGGACAGTCCACTGATGATGACTCTGCACCTCTTGTCCATTGTGTCCGCCTTTTATCTGCTTCGTTTTTGCTAACAGGGGGAAAAAATGTGCTGGTTCCGGACAGGGATGTGAGGGTCAGCGTGAAGGCCCTGGCCCTCAGCTGTGTGGGAGCAGCTGTGGCCCTCCACCCGGAATCTTTCTTCAGCAAACTCTATAAAGTTCCTCTTGACACCACGGAATACCCTGAGGAACAGTATGTCTCAGACATCTTGAACTACATCGATCATGGAGACCCACAGGTTCGAGGAGCCACTGCCATTCTCTGTGGGACCCTCATCTGCTCCATCCTCAGCAGGTCCCGCTTCCACGTGGGAGATTGGATGGGCACCATTAGAACCCTCACAGGAAATACATTTTCTTTGGCGGATTGCATTCCTTTGCTGCGGAAAACACTGAAGGATGAGTCTTCTGTTACTTGCAAGTTAGCTTGTACAGCTGTGAGGAACTGTGTCATGAGTCTCTGCAGCAGCAGCTACAGTGAGTTAGGACTGCAGCTGATCATCGATGTGCTGACTCTGAGGAACAGTTCCTATTGGCTGGTGAGGACAGAGCTTCTGGAAACCCTTGCAGAGATTGACTTCAGGCTGGTGAGCTTTTTGGAGGCAAAAGCAGAAAACTTACACAGAGGGGCTCATCATTATACAGGGCTTTTAAAACTGCAAGAACGAGTGCTCAATAATGTTGTCATCCATTTGCTTGGAGATGAAGACCCCAGGGTGCGACATGTTGCCGCAGCATCACTAATTAGGCTTGTCCCAAAGCTGTTTTATAAATGTGACCAAGGACAAGCTGATCCAGTAGTGGCCGTGGCAAGAGATCAAAGCAGTGTTTACCTGAAACTTCTCATGCATGAGACGCAGCCTCCATCTCATTTCTCCGTCAGCACAATAACCAGAATATATAGAGGCTATAACCTACTACCAAGCATAACAGACGTCACTATGGAAAATAACCTTTCAAGAGTTATTGCAGCAGTTTCTCATGAACTAATCACATCAACCACCAGAGCACTCACATTTGGATGCTGTGAAGCTTTGTGTCTTCTTTCCACTGCCTTCCCAGTTTGCATTTGGAGTTTAGGTTGGCACTGTGGAGTGCCTCCACTGAGTGCCTCAGATGAGTCTAGGAAGAGCTGTACCGTTGGGATGGCCACAATGATTCTGACCCTGCTCTCGTCAGCTTGGTTCCCATTGGATCTCTCAGCCCATCAAGATGCTTTGATTTTGGCCGGAAACTTGCTTGCAGCCAGTGCTCCCAAATCTCTGAGAAGTTCATGGGCCTCTGAAGAAGAAGCCAACCCAGCAGCCACCAAGCAAGAGGAGGTCTGGCCAGCCCTGGGGGACCGGGCCCTGGTGCCCATGGTGGAGCAGCTCTTCTCTCACCTGCTGAAGGTGATTAACATTTGTGCCCACGTCCTGGATGACGTGGCTCCTGGACCCGCAATAAAGGCAGCCTTGCCTTCTCTAACAAACCCCCCTTCTCTAAGTCCCATCCGACGAAAGGGGAAGGAGAAAGAACCAGGAGAACAAGCATCTGTACCGTTGAGTCCCAAGAAAGGCAGTGAGGCCAGTGCAGCTTCTAGACAATCTGATACCTCAGGTCCTGTTACAACAAGTAAATCCTCATCACTGGGGAGTTTCTATCATCTTCCTTCATACCTCAAACTGCATGATGTCCTGAAAGCTACACACGCTAACTACAAGGTCACGCTGGATCTTCAGAACAGCACGGAAAAGTTTGGAGGGTTTCTCCGCTCAGCCTTGGATGTTCTTTCTCAGATACTAGAGCTGGCCACACTGCAGGACATTGGGAAGTGTGTTGAAGAGATCCTAGGATACCTGAAATCCTGCTTTAGTCGAGAACCAATGATGGCAACTGTTTGTGTTCAACAATTGTTGAAGACTCTCTTTGGCACAAACTTGGCCTCCCAGTTTGATGGCTTATCTTCCAACCCCAGCAAGTCACAAGGCCGAGCACAGCGCCTTGGCTCCTCCAGTGTGAGGCCAGGCTTGTACCACTACTGCTTCATGGCCCCGTACACCCACTTCACCCAGGCCCTCGCTGACGCCAGCCTGAGGAACATGGTGCAGGCGGAGCAGGAGAACGACACCTCGGGATGGTTTGATGTCCTCCAGAAAGTGTCTACCCAGTTGAAGACAAACCTCACGAGTGTCACAAAGAACCGTGCAGATAAGAATGCTATTCATAATCACATTCGTTTGTTTGAACCTCTTGTTATAAAAGCTTTAAAACAGTACACGACTACAACATGTGTGCAGTTACAGAAGCAGGTTTTAGATTTGCTGGCGCAGCTGGTTCAGTTACGGGTTAATTACTGTCTTCTGGATTCAGATCAGGTGTTTATTGGCTTTGTATTGAAACAGTTTGAATACATTGAAGTGGGCCAGTTCAGGGAATCAGAGGCAATCATTCCAAACATCTTTTTCTTCTTGGTATTACTATCTTATGAACGCTATCATTCAAAACAGATCATTGGAATTCCTAAAATCATTCAGCTCTGTGATGGCATCATGGCCAGTGGAAGGAAGGCTGTGACACATGCCATACCGGCTCTGCAGCCCATAGTCCACGACCTCTTTGTATTAAGAGGAACAAATAAAGCTGATGCAGGAAAAGAGCTTGAAACCCAAAAAGAGGTGGTGGTGTCAATGTTACTGAGACTCATCCAGTACCATCAGGTGTTGGAGATGTTCATTCTTGTCCTGCAGCAGTGCCACAAGGAGAATGAAGACAAGTGGAAGCGACTGTCTCGACAGATAGCTGACATCATCCTCCCAA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GGCCTGGGTCTCCCTGGTGGGGTGTGCATGCCACGCCCCGTGTCTGGATGCACAGATGCCATGGCCTGTGCTGGGCCAGTGGCTGGGGGTGCTAGACACCCGGCACCATTCTCCCTTCTCTCTTTTCTTCTCAGGATTTAAAATTTAATTATATCAGTAAAGAGATTAATTTTAACGTAACTCTTTCTATGCCCGTGTAAAGTATGTGAATCGCAAGGCCTGTGCTGCATGCGACAGCGTC
CGGGGTGGTGGACAGGGCCCCCGGCCACGCTCCCTCTCCTGTAGCCACTGGCATAGCCCTCCTGAGCACCCGCTGACATTTCCGTTGTACATGTTCCTGTTTATGCATTCACAAGGTGACTGGGATGTAGAGAGGCGTTAGTGGGCAGGTGGCCACAGCAGGACTGAGGACAGGCCCCCATTATCCTAGGGGTGCGCTCACCTGCAGCCCCTCCTCCTCGGGCACAGACGACTGTCGTTCTCCACCCACCAGTCAGGGACAGCAGCCTCCCTGTCACTCAGCTGAGAAGGCCAGCCCTCCCTGGCTGTGAGCAGCCTCCACTGTGTCCAGAGACATGGGCCTCCCACTCCTGTTCCTTGCTAGCCCTGGGGTGGCGTCTGCCTAGGAGCTGGCTGGCAGGTGTTGGGACCTGCTGCTCCATGGATGCATGCCCTAAGAGTGTCACTGAGCTGTGTTTTGTCTGAGCCTCTCTCGGTCAACAGCAAAGCTTGGTGTCTTGGCACTGTTAGTGACAGAGCCCAGCATCCCTTCTGCCCCCGTTCCAGCTGACATCTTGCACGGTGACCCCTTTTAGTCAGGAGAGTGCAGATCTGTGCTCATCGGAGACTGCCCCACGGCCCTGTCAGAGCCGCCACTCCTATCCCCAGGCCAGGTCCCTGGACCAGCCTCCTGTTTGCAGGCCCAGAGGAGCCAAGTCATTAAAATGGAAGTGGATTCTGGATGGCCGGGCTGCTGCTGATGTAGGAGCTGGATTTGGGAGCTCTGCTTGCCGACTGGCTGTGAGACGAGGCAGGGGCTCTGCTTCCTCAGCCCTAGAGGCGAGCCAGGCAAGGTTGGCGACTGTCATGTGGCTTGGTTTGGTCATGCCCGTCGATGTTTTGGGTATTGAATGTGGTAAGTGGAGGAAATGTTGGAACTCTGTGCAGGTGCTGCCTTGAGACCCCCAAGCTTCCACCTGTCCCTCTCCTATGTGGCAGCTGGGGAGCAGCTGAGATGTGGACTTGTATGCTGCCCACATACGTGAGGGGGAGCTGAAAGGGAGCCCCTCCTCTGAGCAGCCTCTGCCAGGCCTGTATGAGGCTTTTCCCACCAGCTCCCAACAGAGGCCTCCCCCAGCCAGGACCACCTCGTCCTCGTGGCGGGGCAGCAGGAGCGGTAGAAAGGGGTCCGATGTTTGAGGAGGCCCTTAAGGGAAGCTACTGAATTATAACACGTAAGAAAATCACCATTCCGTATTGGTTGGGGGCTCCTGTTTCTCATCCTAGCTTTTTCCTGGAAAGCCCGCTAGAAGGTTTGGGAACGAGGGGAAAGTTCTCAGAACTGTTGGCTGCTCCCCACCCGCCTCCCGCCTCCCCCGCAGGTTATGTCAGCAGCTCTGAGACAGCAGTATCACAGGCCAGATGTTGTTCCTGGCTAGATGTTTACATTTGTAAGAAATAACACTGTGAATGTAAAACAGAGCCATTCCCTTGGAATGCATATCGCTGGGCTCAACATAGAGTTTGTCTTCCTCTTGTTTACGACGTGATCTAAACCAGTCCTTAGCAAGGGGCTCAGAACACCCCGCTCTGGCAGTAGGTGTCCCCCACCCCCAAAGACCTGCCTGTGTGCTCCGGAGATGAATATGAGCTCATTAGTAAAAATGACTTCACCCACGCATATACATAAAGTATCCATGCATGTGCATATAGACACATCTATAATTTTACACACACACCTCTCAAGACGGAGATGCATGGCCTCTAAGAGTGCCCGTGTCGGTTCTTCCTGGAAGTTGACTTTCCTTAGACCCGCCAGGTCAAGTTAGCCGCGTGACGGACATCCAGGCGTGGGACGTGGTCAGGGCAGGGCTCATTCATTGCCCACTAGGATCCCACTGGCGAAGATGGTCTCCATATCAGCTCTCTGCAGAAGGGAGGAAGACTTTATCATGTTCCTAAAAATCTGTGGCAAGCACCCATCGTATTATCCAAATTTTGTTGCAAATGTGATTAATTTGGTTGTCAAGTTTTGGGGGTGGGCTGTGGGGAGATTGCTTTTGTTTTCCTGCTGGTAATATCGGGAAAGATTTTAATGAAACCAGGGTAGAATTGTTTGGCAATGCACTGAAGCGTGTTTCTTTCCCAAAATGTGCCTCCCTTCCGCTGCGGGCCCAGCTGAGTCTATGTAGGTGATGTTTCCAGCTGCCAAGTGCTCTTTGTTACTGTCCACCCTCATTTCTGCCAGCGCATGTGTCCTTTCAAGGGGAAAATGTGAAGCTGAACCCCCTCCAGACACCCAGAATGTAGCATCTGAGAAGGCCCTGTGCCCTAAAGGACACCCCTCGCCCCCATCTTCATGGAGGGGGTCATTTCAGAGCCCTCGGAGCCAATGAACAGCTCCTCCTCTTGGAGCTGAGATGAGCCCCACGTGGAGCTCGGGACGGATAGTAGACAGCAATAACTCGGTGTGTGGCCGCCTGGCAGGTGGAACTTCCTCCCGTTGCGGGGTGGAGTGAGGTTAGTTCTGTGTGTCTGGTGGGTGGAGTCAGGCTTCTCTTGCTACCTGTGAGCATCCTTCCCAGCAGACATCCTCATCGGGCTTTGTCCCTCCCCCGCTTCCTCCCTCTGCGGGGAGGACCCGGGACCACAGCTGCTGGCCAGGGTAGACTTGGAGCTGTCCTCCAGAGGGGTCACGTGTAGGAGTGAGAAGAAGGAAGATCTTGAGAGCTGCTGAGGGACCTTGGAGAGCTCAGGATGGCTCAGACGAGGACACTCGCTTGCCGGGCCTGGGCCTCCTGGGAAGGAGGGAGCTGCTCAGAATGCCGCATGACAACTGAAGGCAACCTGGAAGGTTCAGGGGCCGCTCTTCCCCCATGTGCCTGTCACGCTCTGGTGCAGTCAAAGGAACGCCTTCCCCTCAGTTGTTTCTAAGAGCAGAGTCTCCCGCTGCAATCTGGGTGGTAACTGCCAGCCTTGGAGGATCGTGGCCAACGTGGACCTGCCTACGGAGGGTGGGCTCTGACCCAAGTGGGGCCTCCTTGTCCAGGTCTCACTGCTTTGCACCGTGGTCAGAGGGACTGTCAGCTGAGCTTGAGCTCCCCTGGAGCCAGCAGGGCTGTGATGGGCGAGTCCCGGAGCCCCACCCAGACCTGAATGCTTCTGAGAGCAAAGGGAAGGACTGACGAGAGATGTATATTTAATTTTTTAACTGCTGCAAACATTGTACATCCAAATTAAAGGAAAAAAATGGAAACCATCAAAAAAAAAAAAAAAAAA
TAAATGTGCCTGTTGAAGGGC
AAGAGGTGCAGAGTCATCATC
TTCTGGAGGACATCAAACCAT
TGAACTGGCCCACTTCAATGT
TTCCATTGGCAACTGGGCCAT
TAAGCATGGAGCTAGCAGGCT
TAGCGTTGAAGTACTGTCCCC
TTGAGGCAGCAGCGGCTGTGC
TTCATCAGCTTTTCCAGGGTC
TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
CCTTGGCACCCGAGAATTCCA
GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA
LOCUS dsCB-GFP-mir155- 5483 bp DNA circular SYN 11-OCT-2012
DEFINITION Ligation of 6433 into dsCB-GFP-mirFlank-ployA*
ACCESSION dsCB-GFP-mir155-
KEYWORDS .
SOURCE Unknown.
ORGANISM Unknown
Unclassified.
REFERENCE 1 (bases 1 to 5483)
AUTHORS Self
JOURNAL Unpublished.
COMMENT SECID/File created by SciEd Central, Scientific & Educational Software
COMMENT SECNOTES|Vector molecule: dsCB-GFP-mirFlank-ployA*
Fragment ends: BsmBI
Fragment size: 5419
Insert molecule: 6433
Fragment ends:
Fragment size: 64
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 662..767
/gene=“mutated ITR”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 814..1093
/gene=“CMV enhancer”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 870..899
/gene=“tentative for”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1100..1126
/gene=“Probe”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1100..1369
/gene=“B-Actin promotor”
/product=“Chicken"
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature complement (1168..1190)
/gene=“rev”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1435..1465
/gene=“SV40_late_19s_int”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1435..1531
/gene=“modSV40_late_16s_int”
/SECDrawAs=“Region”
CDS 1605..2314
/gene=“GFP'”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_feature 2341..2357
/gene=“'MCS”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 2372..2395
/gene=“5'miR Flank'”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 2460..2504
/gene=“3'miR Flank”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 2573..2699
/gene=“Poly A signal”
/product=“Rabbit globin poly A"
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature complement (2788..2917)
/gene=“3' ITR”
/SECDrawAs=“Region”
CDS 3680..4537
/gene=“Amp(R)”
/SECDrawAs=“Gene”
ORIGIN
61 aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg
121 cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc
181 cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc
241 ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct
301 cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac
361 ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac
421 tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat
481 ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa
541 aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt
601 ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc
661 cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt
721 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tcacgcgtgg
781 atctgaattc aattcacgcg tggtacctct ggtcgttaca taacttacgg taaatggccc
841 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat
901 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc
961 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga
1021 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg
1081 gcagtacatc tactcgaggc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca
1141 cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg
1201 gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg
1261 agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg
1321 cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagc gggatcagcc
1381 accgcggtgg cggcctagag tcgacgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt
1441 ttagtctttt tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact
1501 gctcctcagt ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta
1561 aaagctgcgg aattgtaccc gcggccgatc caccggtcgc caccatggtg agcaagggcg
1621 aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc
1681 acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga
1741 agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga
1801 cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca
1861 agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca
1921 actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc
1981 tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact
2041 acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact
2101 tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga
2161 acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt
2221 ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga
2281 ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaaagcggc cctagcgttt
2341 ccggcgacgg tgctagcgtc gaccagtgga tcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg
2401 taagcatgga gctagcaggc tgttttggcc actgactgac agcctgctct ccatgcttac
2461 aggacacaag gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccagatc tggccgcact
2521 cgaaaacggg ccctctagac tcgaggacgg ggtgaactac gcctgaggat ccgatctttt
2581 tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta
2641 ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg
2701 aagcaattcg ttgatctgaa tttcgaccac ccataatacc cattaccctg gtagataagt
2761 agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct
2821 ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct
2881 ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagcct taattaacct aattcactgg
2941 ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg
3001 cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt
3061 cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg
3121 cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg
3181 ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc
3241 taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa
3301 aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc
3361 ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac
3421 tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt
3481 ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc
3541 ttacaattta ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt
3601 ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata
3661 atattgaaaa aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt
3721 tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc
3781 tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat
3841 ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct
3901 atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca
3961 ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg
4021 catgacagta agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa
4081 cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg
4141 ggatcatgta actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga
4201 cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg
4261 cgaactactt actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt
4321 tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg
4381 agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc
4441 ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca
4501 gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc
4561 atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat
4621 cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc
4681 agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg
4741 ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct
4801 accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct
4861 tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct
4921 cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg
4981 gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc
5041 gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga
5101 gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg
5161 cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta
5221 tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg
5281 ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg
5341 ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat
5401 taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc
5461 agtgagcgag gaagcggaag agc
//LOCUS pdsU6-Mir-htt-64 5686 bp DNA circular SYN 17-SEP-2013
DEFINITION Ligation of 6433 into pU6-miRNAFlank-GFP*
ACCESSION pdsU6-Mir-htt-64
KEYWORDS .
SOURCE Unknown.
ORGANISM Unknown
Unclassified.
REFERENCE 1 (bases 1 to 5686)
AUTHORS Self
JOURNAL Unpublished.
COMMENT SECID/File created by SciEd Central, Scientific & Educational Software
COMMENT SECNOTES|Vector molecule: pU6-miRNAFlank-GFP*
Fragment ends: BsmBI
Fragment size: 5622
Insert molecule: 6433
Fragment ends:
Fragment size: 64
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 662..767
/gene=“mutated ITR”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 777..1041
/gene=“U6 promotor”
/SECDrawAs=“Region”
misc_signal 1041..1041
/gene=“Pol III Start”
/product=“Transcriptional Start”
/SECDrawAs=“Label”
CDS 1042..1065
/gene=“5' miR Flank'”
/SECDrawAs=“Gene”
CDS 1130..1175
/gene=“miR 3' Flank”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_signal 1176..1181
/gene=“Pol III term”
/product=“pol III terminator”
/SECDrawAs=“Label”
misc_feature 1199..1478
/gene=“CMV enhancer”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1255..1284
/gene=“tentative for”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1485..1754
/gene=“B- Actin promotor”
/product=“Chicken”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1485..1511
/gene=“Probe”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature complement (1553..1575)
/gene=“rev"
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1820..1916
/gene=“modSV40_late_16s_int”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1820..1850
/gene=“SV40_late_19s_int”
/SECDrawAs=“Region”
CDS 1990..2699
/gene=“GFP'”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_feature 2726..2737
/gene=“'MCS'”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 2776..2902
/gene=“Poly A signal”
/product=“Rabbit globin poly A”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature complement (2991..3120)
/gene=“3' ITR”
/SECDrawAs=“Region”
CDS 3883..4740
/gene=“Amp(R)”
/SECDrawAs=“Gene”
ORIGIN
61 aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg
121 cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc
181 cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc
241 ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct
301 cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac
361 ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac
421 tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat
481 ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa
541 aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt
601 ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc
661 cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt
721 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tctataaagg
781 tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg
841 ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata
901 cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa
961 tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct
1021 tgtggaaagg acgaaacacc gcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg taagcatgga
1081 gctagcaggc tgttttggcc actgactgac agcctgctct ccatgcttac aggacacaag
1141 gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccttttt tctagtggta cctctggtcg
1201 ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga
1261 cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat
1321 gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa
1381 gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca
1441 tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctactc gaggccacgt tctgcttcac
1501 tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt
1561 ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg
1621 cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct
1681 ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc
1741 gcggcgggcg ggagcgggat cagccaccgc ggtggcggcc tagagtcgac gaggaactga
1801 aaaaccagaa agttaactgg taagtttagt ctttttgtct tttatttcag gtcccggatc
1861 cggtggtggt gcaaatcaaa gaactgctcc tcagtggatg ttgcctttac ttctaggcct
1921 gtacggaagt gttacttctg ctctaaaagc tgcggaattg tacccgcggc cgatccaccg
1981 gtcgccacca tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc
2041 gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat
2101 gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc
2161 tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac
2221 cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc
2281 accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc
2341 gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga cggcaacatc
2401 ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag
2461 cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga cggcagcgtg
2521 cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc
2581 gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat
2641 cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg
2701 tacaagtaaa gcggccctag cgtttccggc gacggtgcta gactcgagga cggggtgaac
2761 tacgcctgag gatccgatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc
2821 cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg
2881 aattttttgt gtctctcact cggaagcaat tcgttgatct gaatttcgac cacccataat
2941 acccattacc ctggtagata agtagcatgg cgggttaatc attaactaca aggaacccct
3001 agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc
3061 aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag
3121 ccttaattaa cctaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg
3181 cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga
3241 agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc
3301 gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac
3361 acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt
3421 cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc
3481 tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc
3541 gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact
3601 cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg
3661 gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc
3721 gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc
3781 ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa
3841 taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc
3901 cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa
3961 acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa
4021 ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg
4081 atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa
4141 gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc
4201 acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc
4261 atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta
4321 accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag
4381 ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca
4441 acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata
4501 gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc
4561 tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca
4621 ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca
4681 actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg
4741 taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa
4801 tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt
4861 gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat
4921 cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg
4981 gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga
5041 gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac
5101 tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt
5161 ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag
5221 cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc
5281 gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag
5341 gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca
5401 gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt
5461 cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc
5521 tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc
5581 cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc
5641 cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagc
LOCUS pCVscAsaq+-mir64 5155 bp DNA circular SYN 17-SEP-2013
DEFINITION Ligation of 6433 into pCVscAsaq+-mirFlank*
ACCESSION pCVscAsaq+-mir64
KEYWORDS .
SOURCE Unknown.
ORGANISM Unknown
Unclassified.
REFERENCE 1 (bases 1 to 5155)
AUTHORS Self
JOURNAL Unpublished.
COMMENT SECID/File created by SciEd Central, Scientific & Educational Software
COMMENT SECNOTES|Vector molecule: pCVscAsaq+-mirFlank*
Fragment ends: BsmBI
Fragment size: 5090
Insert molecule: 6433
Fragment ends:
Fragment size: 64
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 1..105
/gene=“ITR”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 182..449
/gene=“CMV”
/product=“CMV enhancer”
/SECDrawAs=“Region”
CDS 448..753
/gene=“CB promotor”
/product=“Promotor Eukaryotic”
/SECDrawAs=“Gene”
CDS 754..1819
/gene=“Intron”
/product=“Intron”
/SECDrawAs=“Gene”
CDS 1820..1839
/gene=“MCS”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_feature 1843..1847
/gene=“''MCS”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1862..1885
/gene=“5'miR Flank'”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1950..1994
/gene=“3'miR Flank”
/SECDrawAs=“Region”
CDS 2002..2128
/gene=“RBG pA”
/product=“PolyA Signal”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_feature complement (2002..2128)
/gene=“RBG\pA”
/SECDrawAs=“Info only”
misc_feature 2139..2281
/gene=“3'ITR”
/SECDrawAs=“Region”
CDS 2317..2509
/gene=“lacZ”
/SECDrawAs=“Gene”
CDS 2510..2965
/gene=“f1 ori”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_feature 3097..3957
/gene=“bla-AmpR”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 4117..4731
/gene=“rep-pMB1”
/SECDrawAs=“Region”
ORIGIN
61 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg
121 aagatcaatt caattcacgc gtcgacattg attattgact agctctggtc gttacataac
181 ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa
241 tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt
301 atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtccgcccc
361 ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttac
421 gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg
481 tgagccccac gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt
541 atttatttat tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg
601 cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg
661 cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg cggcggcggc
721 ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgcgctgc cttcgccccg
781 tgccccgctc cgccgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc
841 cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat
901 gacggcttgt ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttga ggggctccgg gagggccctt
961 tgtgcggggg ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg tgtgcgtggg gagcgccgcg
1021 tgcggctccg cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc gcggcgcggg gctttgtgcg
1081 ctccgcagtg tgcgcgaggg gagcgcggcc gggggcggtg ccccgcggtg cggggggggc
1141 tgcgagggga acaaaggctg cgtgcggggt gtgtgcgtgg gggggtgagc agggggtgtg
1201 ggcgcgtcgg tcgggctgca accccccctg cacccccctc cccgagttgc tgagcacggc
1261 ccggcttcgg gtgcggggct ccgtacgggg cgtggcgcgg ggctcgccgt gccgggcggg
1321 gggtggcggc aggtgggggt gccgggcggg gcggggccgc ctcgggccgg ggagggctcg
1381 ggggaggggc gcggcggccc ccggagcgcc ggcggctgtc gaggcgcggc gagccgcagc
1441 cattgccttt tatggtaatc gtgcgagagg gcgcagggac ttcctttgtc ccaaatctgt
1501 gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg ggcgaagcgg
1561 tgcggcgccg gcaggaagga aatgggcggg gagggccttc gtgcgtcgcc gcgccgccgt
1621 ccccttctcc ctctccagcc tcggggctgt ccgcgggggg acggctgcct tcggggggga
1681 cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc ctctgctaac
1741 catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt tattgtgctg
1801 tctcatcatt ttggcaaaga attcatcgat accgtcgacg atctagcgtc gaccagtgga
1861 tcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg taagcatgga gctagcaggc tgttttggcc
1921 actgactgac agcctgctct ccatgcttac aggacacaag gcctgttact agcactcaca
1981 tggaacaaat ggcccagatc cgatcttttt ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg
2041 aagccccttg agcatctgac ttctggctaa taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg
2101 tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgat cagatctgag gaacccctag tgatggagtt
2161 ggccactccc tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gcccgggcaa agcccgggcg
2221 tcgggcgacc tttggtcgcc cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagag agggagtggc
2281 cccccccccc ccccccccct gcattctaga gagctccaat tcgccctata gtgagtcgta
2341 ttacgcgcgc tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac
2401 ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc
2461 ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgga aattgtaagc
2521 gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa
2581 taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt
2641 gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg
2701 cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt
2761 ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga
2821 gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg
2881 ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg
2941 cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc
3001 cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc
3061 tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc
3121 gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg
3181 gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat
3241 ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc
3301 acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa
3361 ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa
3421 aagcatctta cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt
3481 gataacactg cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct
3541 tttttgcaca acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat
3601 gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg
3661 cgcaaactat taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg
3721 atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt
3781 attgctgata aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg
3841 ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg
3901 gatgaacgaa atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg
3961 tcagaccaag tttactcata tatactttag attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa
4021 aggatctagg tgaagatcct ttttgataat ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt
4081 tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt
4141 tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt
4201 ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag
4261 ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa gaactctgta
4321 gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat
4381 aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg
4441 ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc agcttggagc gaacgaccta caccgaactg
4501 agatacctac agcgtgagct atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac
4561 aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct tccaggggga
4621 aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt
4681 ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta
4741 cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat
4801 tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg
4861 accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct
4921 ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa
4981 gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct
5041 ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac
5101 acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc agatttaatt aaggccttaa ttagg
LOCUS U6-mir6433-BGHpA 5223 bp DNA circular SYN 12-SEP-2013
DEFINITION Ligation of dsAAV CB MCS** into U6-MiRBA-6433-GFP**
ACCESSION U6-mir6433-BGHpA
KEYWORDS .
SOURCE Unknown.
ORGANISM Unknown
Unclassified.
REFERENCE 1 (bases 1 to 5223)
AUTHORS Self
JOURNAL Unpublished.
COMMENT SECID/File created by SciEd Central, Scientific & Educational Software
COMMENT SECNOTES|Vector molecule: U6-MiRBA-6433-GFP**
Fragment ends: blunt and EagI
Fragment size: 4954
Insert molecule: dsAAV CB MCS**
Fragment ends: EagI and blunt
Fragment size: 269
FEATURES Location/Qualifiers
misc_feature 662..767
/gene=“mutated ITR”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 777..1041
/gene=“U6 promotor”
/SECDrawAs=“Region”
misc_signal 1041..1041
/gene=“Pol III Start”
/product=“転写al Start”
/SECDrawAs=“Label”
CDS 1042..1065
/gene=“5' miR Flank'”
/SECDrawAs=“Gene”
CDS 1130..1175
/gene=“miR 3' Flank”
/SECDrawAs=“Gene”
misc_signal 1176..1181
/gene=“Pol III term”
/product=“pol III terminator”
/SECDrawAs=“Label”
misc_feature 1199..1478
/gene=“CMV enhancer”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1255..1284
/gene=“tentative for”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1485..1511
/gene=“Probe"
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1485..1754
/gene=“B-Actin promotor”
/product=“Chicken”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature complement (1553..1575)
/gene=“rev”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1820..1850
/gene=“SV40_late_19s_int”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 1820..1916
/gene=“modSV40_late_16s_int”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 2034..2230
/gene=“BGHpA”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 2263..2274
/gene=“'MCS'”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature 2313..2439
/gene=“Poly A signal”
/product=“Rabbit globin poly A”
/SECDrawAs=“Region”
misc_feature complement (2528..2657)
/gene=“3' ITR”
/SECDrawAs=“Region”
CDS 3420..4277
/gene=“Amp(R)”
/SECDrawAs=“Gene”
ORIGIN
61 aacgaggaaa gcacgttata cgtgctcgtc aaagcaacca tagtacgcgc cctgtagcgg
121 cgcattaagc gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc
181 cctagcgccc gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc
241 ccgtcaagct ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct
301 cgaccccaaa aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac
361 ggtttttcgc cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac
421 tggaacaaca ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat
481 ttcggcctat tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa
541 aatattaacg cttacaattt aaatatttgc ttatacaatc ttcctgtttt tggggctttt
601 ctgattatca accggggtac atatgattga catgctagtt ttacgattac cgttcatcgc
661 cctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc gggcgacctt
721 tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggaat tctataaagg
781 tcgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg
841 ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata
901 cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa
961 tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct
1021 tgtggaaagg acgaaacacc gcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg taagcatgga
1081 gctagcaggc tgttttggcc actgactgac agcctgctct ccatgcttac aggacacaag
1141 gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccttttt tctagtggta cctctggtcg
1201 ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga
1261 cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat
1321 gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa
1381 gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca
1441 tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctactc gaggccacgt tctgcttcac
1501 tctccccatc tcccccccct ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt
1561 ttgtgcagcg atgggggcgg gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg
1621 cgaggggcgg ggcggggcga ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct
1681 ccgaaagttt ccttttatgg cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc
1741 gcggcgggcg ggagcgggat cagccaccgc ggtggcggcc tagagtcgac gaggaactga
1801 aaaaccagaa agttaactgg taagtttagt ctttttgtct tttatttcag gtcccggatc
1861 cggtggtggt gcaaatcaaa gaactgctcc tcagtggatg ttgcctttac ttctaggcct
1921 gtacggaagt gttacttctg ctctaaaagc tgcggaattg tacccgcggc cgcgtttaaa
1981 ccctgcaggt ctagaaagct tatcgatacc gtcgactaga gctcgctgat cagcctcgac
2041 tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct
2101 ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct
2161 gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg
2221 ggaagacaat agcagggtac aagtaaagcg gccctagcgt ttccggcgac ggtgctagac
2281 tcgaggacgg ggtgaactac gcctgaggat ccgatctttt tccctctgcc aaaaattatg
2341 gggacatcat gaagcccctt gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca
2401 ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc tctcactcgg aagcaattcg ttgatctgaa
2461 tttcgaccac ccataatacc cattaccctg gtagataagt agcatggcgg gttaatcatt
2521 aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc
2581 actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg
2641 agcgagcgag cgcgcagcct taattaacct aattcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt
2701 gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc
2761 agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg
2821 aatggcgaat gggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg
2881 cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct
2941 tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta
3001 gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt
3061 tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg
3121 ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat
3181 tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt
3241 taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaattta ggtggcactt
3301 ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt
3361 atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta
3421 tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg
3481 tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac
3541 gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg
3601 aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc
3661 gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg
3721 ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat
3781 gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg
3841 gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg
3901 atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc
3961 ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt
4021 cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct
4081 cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc
4141 gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca
4201 cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct
4261 cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt
4321 taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga
4381 ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca
4441 aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac
4501 caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg
4561 taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag
4621 gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac
4681 cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt
4741 taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg
4801 agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc
4861 ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc
4921 gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc
4981 acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa
5041 acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt
5101 tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg
5161 ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag
5221 agc
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALKPGAPQPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLGLVEEAAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSAGIGKSGAQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPIGEPPAAPSGVGSLTMASGGGAPVADNNEGADGVGSSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNSTSGGSSNDNAYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTDNNGVKTIANNLTSTVQVFTDSDYQLPYVLGSAHEGCLPPFPADVFMIPQYGYLTLNDGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYEFENVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSKTINGSGQNQQTLKFSVAGPSNMAVQGRNYIPGPSYRQQRVSTTVTQNNNSEFAWPGASSWALNGRNSLMNPGPAMASHKEGEDRFFPLSGSLIFGKQGTGRDNVDADKVMITNEEEIKTTNPVATESYGQVATNHQSAQAQAQTGWVQNQGILPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGMKHPPPQILIKNTPVPADPPTAFNKDKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSNNVEFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
GCCTGGAGGCTTGCTGAAGGCTGTATGCTGTAAGCATGGAGCTAGCAGGCTGTTTTGGCCACTGACTGACAGCCTGCTCTCCTAGCTTACAGGACACAAGGCCTGTTACTAGCACTCACATAACAAATGGCCCTTTT
GCTCGAGTGAGCGCAGCCTGCTAGCTCCATGCTTACTGTAAAGCCACCAGATGGGTAAGCATGGAGCTAGCAGGCTTCGCCTACTAGTTTT
Claims (22)
- 1以上の成熟した、一本鎖のmiRNAをコードする導入遺伝子を含む単離された核酸であって、ここで、各成熟した、一本鎖のmiRNAをコードする導入遺伝子の核酸配列が、配列番号7に規定される配列を含み、そして、異種のmiRNAバックボーン配列に隣接している、前記核酸。
- 各異種のmiRNAバックボーン配列が、mir−155バックボーン配列、mir−30バックボーン配列、またはmir−64バックボーン配列である、請求項1に記載の単離された核酸。
- 導入遺伝子が、プロモーターを含む、請求項1に記載の単離された核酸。
- プロモーターが、ニワトリベータ−アクチン(CBA)プロモーターまたはU6プロモーターである、請求項3に記載の単離された核酸。
- 導入遺伝子が、配列番号21または22に規定される配列を含む、請求項1に記載の単離された核酸。
- 導入遺伝子が、アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)、またはそのバリアントに隣接している、請求項1に記載の単離された核酸。
- ITRバリアントが、機能的な末端解離部位(TRS)を欠く、請求項6に記載の単離された核酸。
- TRSを欠くITRバリアントが、ΔTRS ITRである、請求項7に記載の単離された核酸。
- 1以上の成熟した、一本鎖のmiRNAをコードする導入遺伝子を含む単離された核酸を含むベクターであって、ここで、各成熟した、一本鎖のmiRNAをコードする導入遺伝子の核酸配列が、配列番号7に規定される配列を含み、そして、異種のmiRNAバックボーン配列に隣接している、前記ベクター。
- ベクターが、プラスミドである、請求項9に記載のベクター。
- 各異種のmiRNAバックボーン配列が、mir−155バックボーン配列、mir−30バックボーン配列、またはmir−64バックボーン配列である、請求項1に記載のベクター。
- 導入遺伝子が、プロモーターを含む、請求項10に記載のベクター。
- プロモーターが、ニワトリベータ−アクチン(CBA)プロモーターまたはU6プロモーターである、請求項12に記載のベクター。
- 導入遺伝子が、配列番号21または22に規定される配列を含む、請求項10に記載のベクター。
- 導入遺伝子が、アデノ随伴ウイルス(AAV)逆方向末端反復(ITR)、またはそのバリアントに隣接する、請求項10に記載のベクター。
- ITRバリアントが、機能的な末端解離部位(TRS)を欠く、請求項15に記載のベクター。
- TRSを欠くITRバリアントが、ΔTRS ITRである、請求項16に記載のベクター。
- (i)カプシドタンパク質;および、
(ii)1以上の成熟した、一本鎖のmiRNAをコードする導入遺伝子を含む単離された核酸を含む、組み換えAAV(rAAV)であって、ここで、各成熟した、一本鎖のmiRNAをコードする導入遺伝子の核酸配列が、配列番号7に規定される配列を含み、そして、異種のmiRNAバックボーン配列に隣接している、前記組み換えAAV(rAAV)。 - 導入遺伝子が、完全長AAV ITR配列に隣接する、請求項18に記載のrAAV。
- 導入遺伝子が、完全長AAV ITRおよびΔTRS ITRに隣接する、請求項18に記載のrAAV。
- カプシドタンパク質が、AAV9カプシドタンパク質である、請求項18に記載のrAAV。
- カプシドタンパク質が、配列番号20に規定される配列を含む、請求項21に記載のrAAV。
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