KR20180008347A

KR20180008347A - 신규 재조합 엑소좀 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20180008347A
Application number: KR1020170089840A
Authority: KR
Inventors: 홍연선; 양유수; 정철현; 김인산
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2017-07-14
Publication date: 2018-01-24
Also published as: KR102128887B1; US20210393736A1; KR102052204B1; KR20190119009A; US20180028600A1

Abstract

본 발명은 재조합 엑소좀에 관한 것으로서, 더 상세하게는 포도당 수송체 단백질(GLUT) 및 막 융합 단백질을 발현하도록 형질 전환된 진핵세포로부터 수득된 재조합 엑소좀(recombinant exosome) 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

신규 재조합 엑소좀 및 그의 용도{A novel recombinant exosome and use thereof}

본 발명은 신규 재조합 엑소좀 및 그의 용도에 관한 것이다.

지난 10년 이상, 치료용 단백질이 약학 분야에서 선도적인 돌파구로 인식되어 왔고, 130개 이상의 단백질에 대한 임상시험이 허가되어 왔다. 기능성 단백질을 세포내로 전달하는 것은 결핍되거나, 비정상적이거나 또는 빈약하게 발현되는 단백질을 대체하고/거나 중요 세포내 경로를 길항하기 위한 효과적인 도구가 될 수 있다. 치료용 단백질의 지속적인 발전에도 불구하고, 단백질-기반의 치료제의 사용은 막 단백질을 세포막에 전달할 수 있는 약물 전달체의 필요성으로 인해 제한을 받아 왔다. 막단백질 결함은 조절, 물질의 수송 또는 조직의 세포 무결성에 있어서 문제를 일으켜서 다양한 인간 질환에 기여를 하고 있다. 천연적인 세포막의 어머어마한 복잡성때문에, 막단백질에 대한 연구는 인공막의 재구축을 필요로 한다. 몇몇 지질계열의 소포체 시스템이 막단백질의 전달을 위해 기술되고 있다. 그러나, 생리-활성 막단백질의 인공 소포체로의 삽입을 위한 적절한 조건을 찾기 매우 어렵다는 점이 밝혀진 바 있다(Liguori et al., Expert Rev. Proteomics, 4: 79-90, 2007; Liguori et al., J. Control. Release 126: 217-227, 2008; Biner et al., FEBS Lett. 590: 2051-2062, 2016). 따라서, 이러한 단점들은 생물학적 및/또는 의학적으로 중요한 막단백질의 기능을 조절하기 위한 대안적인 전략의 탐색에 대한 동기를 부여하고 있다.

현대사회에서 비만 및 당뇨로 대표되는 대사질환은 그 유병률이 급속도로 증가하고 있으며, 세계보건기구 발표에 따르면 2006년 기준 전 세계 인구 중 약 4억 명 정도가 비만이며, 2011년 National diabetics statics 발표 기준 미국 인구의 8.3%가 당뇨 환자이다. 당뇨는 인슐린 분비의 이상이나 인슐린 수용체의 이상에 의해서 발생되며 이에 따라 체내 혈당의 수치가 정상적으로 조절되어지지 않아서 발생하며 혈관질환, 시력저하와 같은 합병증이 존재한다. 대표적인 당뇨 치료법으로는 인슐린 의존적인 치료법과 혈중 당 강하를 통한 치료법이 있다. 혈중 당 강하를 통한 치료법을 위한 종래의 물질로는 비구아나이드 계열의 화합물과 치아졸리딘디온 계열의 화합물, 레즈베라트롤, 황련추출물 등이 알려져 있다. 식약청 보고에 의하면 국내 당뇨병 치료제는 약 470여 종이 허가를 받아 유통되고 있다.

최근 로지글리타존(미국 특허 제5,002,953호), 부트포민, 멧포민(metformin) 등의 일부 당뇨병 치료제에서 심혈관계 질환, 젖산산증(lactic acidosis) 등의 부작용이 발견 되어, 해당 치료제를 복용하는 환자들은 다른 치료제에 의존을 해야 한다. 또한 기존에 가장 많이 사용되는 멧포민의 경우 상대적 복용 농도가 높기 때문에 당뇨병 치료에 드는 일인당 비용 또한 높아진다. 또한 경구용 당뇨병 치료제는 설포닐 유레아 등이 있으나 당뇨병 치료에 대한 기전에 있어서 인슐린 분비를 촉진시키는 것으로, 당 흡수를 촉진 시키는 방법과는 상이하다.

한편, 물리적인 손상 또는 퇴행성 질환에 의해 조직이 손상된 경우 손상된 조직을 회복 또는 수복하기 위한 방법으로 각종 인공관절 등 임플란트의 삽입, 해당 조직 유래의 세포(연골세포, 근육세포 등) 또는 줄기세포의 투여, 그리고 각종 조직의 세포 성장을 촉진하는 다양한 성장인자(TGF-β, BMP-2, BMP-4, EGFP, FGF, VEGF 등)의 투여 등의 방법들이 사용되고 있다. 그러나, 인공관절 등의 임플란트 삽입술의 경우 매우 침습적인데다가 회복이 되는데 장시간이 소요되는 단점이 있고, 해당 조직 유래의 세포 투여나 줄기세포의 투여의 경우 비용이 많이 드는데다가 줄기세포의 경우 암 발생 등의 부작용이 나타날 수 있으며, 성장인자 역시 비용이 많이 들고 그 치료효과가 제한적이라는 문제점이 있다.

아울러, 근이영양증(muscular dystrophy), 더쉔 근이영양증(Duchenne muscular dystrophy), 샤르코-마리-투스병(Charcot Marie Tooth disease, CMT), 폼페병(pompe disease), 파브리병(Farbry's disease), 척수성 근육위축증(Spinal muscular atrophy, SMA), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 염증성 근육병(inflammatory myopathy), 중증근무력증(myasthenia gravis) 등은 말초신경과 근육에 발생하는 주요 희귀난치성 근육질환들이다. 이러한 근육질환의 경우, 유전자 이상이나, 근육의 손상, 신경퇴화에 따른 근육 위축, 당뇨병, 요독증 등과 같은 대사성 질환의 합병증 등 다양한 원인에 의해 발생하고 있으며, 일부 수술에 의한 치료가 가능하기는 하나 대부분은 난치성인 경우가 많다. 이들 근육질환들의 경우 처음에는 감각이 무뎌지거나 통증이 발생하고, 점차 팔과 다리의 근육이 소실돼 움직임이 어려워지며, 호흡이 어렵고 움직일 수 없는 심각한 장애도 나타난다. 근육질환의 경우 현재까지 완치가 거의 불가능하며 다만, 조기에 진단이 될 경우 병의 진행을 지연시켜 장애를 최소화하는 것을 치료 목표로 삼고 있는 실정이다. 현재 더쉔 근이영양증을 적응증으로 하는 시험약물인 Sarepta사의 eteplirsen과 GSK사의 drisapersen 등에 대한 임상시험이 진행되고 있으나, GSK사의 drisapersen의 경우 독성 때문에 승인이 거절되는 등, 아직 판매 승인이 된 약물은 존재하지 않는 실정이다.

본 발명은 상기 문제점을 포함한 다양한 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 당 흡수를 촉진시킴으로써 보다 효율적인 혈당 조절 및 근육을 비롯한 다양한 조직의 재생을 위해 사용 가능한 재조합 엑소좀 및 그의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면 막에 포도당 수송체 단백질(GLUT) 및 막 융합 단백질이 포함된 재조합 엑소좀(recombinant exosome)이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 혈당강하용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 엑소좀 또는 막에 막 융합 단백질이 포함된 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 근육질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 엑소좀 또는 막에 막 융합 단백질을 포함하는 재조합 엑소좀을 포함하는 조직재생 촉진용 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 엑소좀을 혈당 조절을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 혈당 조절방법이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 유전자의 전달과 같은 복잡한 기전에 의하지 않고도 개체의 상승된 혈당을 용이하게 조절할 수 있어, 제1형 당뇨병은 물론 제2형 당뇨병 환자의 혈당 조절에 매우 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 근육을 포함한 다양한 조직의 재생을 촉진하기 때문에, 손상된 조직의 재생을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 GLUT 및 VSV-G를 발현하도록 형질전환 된 세포로부터 수득된 재조합 엑소좀(좌측) 및 상기 재조합 엑소좀이 표적 세포와 융합하여 상기 표적 세포의 세포막에 GLUT를 전달하는 과정(우측)을 개략적으로 나타낸 개요도이다.
도 2a는 본 발명의 일실시예에 따라 막단백질이 표적 세포의 세포막으로 잘 전달되는지 확인하기 위해 제작된 VSV-G 발현 컨스트럭트와 CD63-GFP 융합 단백질 발현 컨스트럭트를 공형질 감염시킨 HEK293T 세포로부터 재조합 엑소좀을 분리하는 과정을 나타내는 공정도이고, 도 2b는 상기 분리된 재조합 엑소좀에 대하여 VSV-G 및 CD63-GFP의 발현여부를 확인한 웨스턴 블랏 분석결과를 나타내는 사진이며, 도 2c는 분리된 재조합 엑소좀의 입자크기 분포를 나타내는 히스토그램이고, 도 2d는 상기 재조합 엑소좀에 대한 투과 전자현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 VSV-G 단백질 및 CD63-GFP를 공발현하는 HEK293T 세포로부터 분리된 재조합 엑소좀(상단) 및 대조군으로 CD63-GFP만 발현하는 HEK293T 세포로부터 분리된 재조합 엑조좀(하단)을 표적세포인 HEK293T 세포와 융합시킨 후 GFP의 분포양상을 촬영한 형광현미경 사진이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 VSV-G 단백질 및 GLUT4-GFP를 공발현하는 HEK293T 세포로부터 재조합 엑소좀을 분리하는 과정을 나타내는 공정도이고, 도 4b는 상기 분리된 재조합 엑소좀에 대하여 VSV-G 및 GLUT4-GFP의 발현여부를 확인한 웨스턴 블랏 분석결과를 나타내는 사진이며, 도 4c는 상기 분리된 재조합 엑소좀의 입자크기 분포를 나타내는 히스토그램 및 엑소좀에 대한 투과 전자현미경 사진이고, 도 4d는 표적세포와의 융합 후 형광의 분포 양상을 촬영한 형광현미경 사진이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합성 엑소좀의 리포좀과의 결합 및 융합을 확인하기 위해 사용된 단일-소포 조영 분석의 과정을 개략적으로 나타낸 개요도이고, 도 5b는 상기 단일-소포 조영 분석을 통해 확인된 융합성 리포좀의 pH 조건에 따른 FRET 효율을 나타내는 유세포 분석 결과이며, 도 5c는 상기 도 5b의 유세포분석 결과, 저-FRET군, 중-FRET 군 및 고-FRET군 사이의 분율을 나타내는 그래프이고, 도 5d는 VSV-G의 수용체로서 LDLR을 보유하고 있는 엑소좀과 LDLR을 보유하지 않은 엑소좀의 pH의 변화에 따른 리포좀과의 지질 혼합에 따른 결합율을 비교한 그래프이다.
도 6a는 인슐린을 근육세포주(C2C12)에 처리 후 상기 세포주에서의 포도당 흡수 정도를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타내는 히스토그램이고, 도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 VSV-G 단백질 및 GLUT4-GFP를 공발현하는 HEK293T 세포로부터 수득된 재조합 엑소좀 및 GLUT4-GFP만을 발현하는 HEK293T 세포로부터 수득된 대조군 엑소좀을 각각 근육세포주(C2C12)에 처리하였을 때 상기 세포주에서의 포도당 흡수 정도를 유세포 분석으로 분석한 결과를 나타내는 히스토그램이다.
도 7은 GLUT1 발현 저해제인 아피게닌을 사전 처리하거나 처리하지 않은 HEK293T 세포에 VSV-G 단백질 및 GLUT4-GFP를 공발현하는 HEK293T 세포로부터 수득된 재조합 엑소좀 및 GLUT4-GFP만을 발현하는 HEK293T 세포로부터 수득된 대조군 엑소좀을 각각 처리한 후 2-NBDG 처리에 따른 포도당 흡수율의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다(*: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001).
도 8a는 실제 동물실험의 다리 근육에 본 발명의 재조합 엑소좀을 주사한 후 포도당 흡수정도를 [¹⁸F]-FDG PET 조영술로 관찰한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 8b는 상기 PET 조영 영상이다(*: P < 0.05, **: P < 0.01)이며, 도 8c는 본 발명의 재조합 엑소좀을 근육 내 주사 후 VSV-G 단백질의 유무에 따른 GLUT4 단백질의 근육 세포막으로의 제시여부를 확인하기 위한 공초점 면역형광 현미경 사진이다. 상기 도 8a에서 그래프의 세로축 값은 조직에서의 방사선량의 비율인 SUV로 조직에서의 방사선량(MBq/cc)/체중 당 투여 방사선량(MBq/g)으로 계산된다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀을 CTX로 손상을 유발한 근육 내에 투여하는 투여 스케쥴이고, 도 9b는 상기 재조합 엑소좀의 투여에 따른 근육 재생 효과를 관찰한 근육조직에 대한 현미경 촬영 사진이며, 도 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀 및 VSV-G 포함 융합성 엑소좀을 근육세포에 처리 시 근육세포 융합을 관찰한 결과를 나타내는 형광현미경 사진이다.

용어의 정의

본 문서에서 사용되는 용어 "포도당 수용체(glucose transporter)"는 포도당을 세포막에 통과시켜 세포내에 이입시키는 단백질을 의미하는데, 포도당 수용체는 12개의 막 통과나선을 포함하는 막 단백질로 아미노 말단과 카르복시 말단 모두 세포질 방면에 노출되어 있다. 포도당 수용체는 인간의 경우 현재까지 14종이 보고된 바 있고, 아미노산 서열의 상동성에 따라 GLUT1 내지 GLUT4, 및 GLUT14가 속한 계열 I(class I), GLUT5, GLUT7, GLUT9 및 GLUT11이 속한 계열 II(class II) 그리고 GLUT6, GLUT8, GLUT10, GLUT12, HMIT(H⁺/myoinositol transporter)가 포함된 계열 III(class III)이 포함된다.

본 문서에서 사용되는 용어 "막 융합단백질(membrane fusogenic protein)"은 원형질막(plasma membrane)으로 둘러싸인 세포 또는 막 소포체(membrane vesicle)간의 동종 또는 이종 융합을 유발하는 단백질을 의미한다. 이러한 "막 융합단백질(membrane fusogenic protein)"에는 대표적으로 VSV-G(vesicular stomatitis virus glycoprotein)가 존재하며 그 외에도, HIV의 tat 단백질, HSV-1 gB와 같은 헤르페스바이러스의 당단백질 B(herpesvirus gB), EBV gB, 토고토바이러스 G 단백질, AcMNPV gp64와 같은 배큘로바이러스 gp64 단백질 및 보르나병 바이러스 당단백질(BDV G) 등이 존재한다.

본 문서에서 사용되는 용어 "수포성 구내염바이러스의 외피 당단백질(VSV-G 단백질)"은 수포성 구내염바이러스의 바이러스 입자(virion) 막에 존재하는 유일한 바이러스 당단백질로 바이러스의 표적세포로의 부착 및 융합단백질로 작용한다. 상기 VSV-G 단백질은 두 개의 N-연결 글리칸을 포함하는 막 통과 단백질로, 다른 바이러스 단백질이 존재하지 않을 경우 저-pH-의존적인 방식으로 막 융합을 개시할 수 있다. VSV-G 단백질은 DNA 등 핵산분자와 복합체를 형성하기 때문에 직접적인 유전자 전달용 담체로 사용되거나, 보다 안정적이고 고역가의 위형(pseudotyped) 생쥐 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MLV)-기반 레트로바이러스 및 렌티바이러스-기반 벡터를 생산함으로써 유전자 치료에 효과적으로 사용되어 왔다. 그러나, 최근에 유전자 외에 다양한 단백질을 표적세포로 전달하는 용도로 이용가능성이 제시된 바 있다(Mangeot et al., Mol. Ther. 19(9): 1656-1666, 2011).

본 문서에서 사용되는 용어 "엑소좀(exosome)"은 혈액, 소변, 및 세포배양의 배양배지를 포함하는 모든 생물학적 액체에 존재하는 세포-유래의 소포(vesicle)로 세포외 소포(extracellular vesicle) 또는 소수포(microvesicle)라고도 불리운다. 엑소좀의 크기는 30 및 100 nm 사이인 것으로 알려지고 있으며, 다소포체(multivesicular body)가 세포막과 융합할 때 세포로부터 분비되거나 세포막을 통해 직접 분비된다. 엑소좀은 응고, 세포 간 신호전달, 및 대사폐기물의 관리와 같은 다양한 과정에서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려지고 있다.

본 문서에서 사용되는 용어 "재조합 엑소좀(recombinant exosome)"은 인위적으로 생산된 엑소좀을 의미하며, 엑소좀을 생산할 수 있는 숙주세포(host cell)에 유전자공학(genetic engineering)의해 외래 단백질을 암호화하는 유전자를 형질 도입하여 형질전환 숙주세포를 제조한 후 상기 형질전환 숙주세포를 배양한 후 그 배양액으로부터 수득된 엑소좀이다. 상기 재조합 엑소좀에는 형질도입된 외래 단백질이 내부 또는 엑소좀 막에 포함되어 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 일 관점에 따르면, 막에 포도당 수송체 단백질(GLUT) 및 막 융합 단백질이 포함된 재조합 엑소좀(recombinant exosome)이 제공된다.

상기 재조합 엑소좀은 상기 포도당 수송체 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1유전자 컨스트럭트 및 상기 막 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2유전자 컨스트럭트로 형질 전환되어 상기 포도당 수송체 단백질 및 상기 막 융합 단백질을 과 발현하는 포유동물 세포 바람직하게는 인간 세포로부터 분리·정제된 것일 수 있고, 선택적으로는 상기 포도당 수송체 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 막 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 모두 포함된 단일 유전자 컨스트럭트로 형질 전환되어 상기 당 수송체 단백질 및 상기 막 융합 단백질을 과 발현하는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포로부터 분리·정제된 것일 수 있으며, 상기 단일 유전자 컨스트럭트에 포함된 두 폴리뉴클레오티드는 각각 다르거나 같은 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 발현되거나, 하나의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 하나의 전사체로 발현된 후 두 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입된 리보좀 진입 부위(IRES)에 의해 분리되어 각각의 단백질로 번역되는 것도 가능하다.

상기 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 포도당 수송체 단백질은 GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4, GLUT5, GLUT6, GLUT7. GLUT8, GLUT9, GLUT10, GLUT11, GLUT12, HMIT(H⁺/myoinositol transporter), 또는 GLUT14 일 수 있다.

상기 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 막 융합 단백질은 VSV-G(vesicular stomatitis virus glycoprotein), HIV의 tat 단백질, HSV-1 gB, EBV gB, 토고토바이러스 G 단백질, 또는 AcMNPV gp64일 수 있다.

상기 재조합 엑소좀은 상기 포도당 수송체 단백질 및 막 융합 단백질이 발현되도록 형질 전환된 세포로부터 수득된 것일 수 있다.

상기 재조합 엑소좀은 내부에 하나 이상의 다른 당뇨병 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 당뇨병 치료제는 메트포민(Metformin), 부포민(Buformin), 펜포민(Phenformin), 로지글리타존(rosiglitazone), 피오글리타존(pioglitazone), 트로글리타존(troglitazone), 톨부타마이드(tolbutamide), 아세토헥사마이드(acetohexamide), 톨라자마이드(tolazamide), 클로르프로파마이드(chlorpropamide), 글리벤크라마이드(glibenclamide), 미티글리나이드(mitiglinide), 글리피자이드(glipizide), 글리부라이드(glyburide), 글리메피라이드(glimepiride), 글리클라자이드(gliclazide), 글리코피라마이드(glycopiramide), 글리퀴돈(gliquidone), 레파글리나이드(repaglinide), 나테글리나이드(nateglinide), 미글리톨(miglitol), 아카르보스(acarbose), 보글리보스(voglibose), 글르카곤유사 펩타이드-1(GLP-1) 또는 그의 유도체, 빌다글립틴(vildagliptin), 스타글립틴(stagliptin), 삭사글립틴(saxagliptin), 리나글립틴(linagliptin), 알로글립틴(alogliptin), 셉타글립틴(septagliptin) 또는 테네글립틴(tenegliptin)일 수 있다.

상기 재조합 엑소좀으로의 약물의 함입은 약물이 용해된 세포배양 배지 내에서 재조합 엑소좀을 생산하도록 유전자 조작된 세포를 배양함으로써 달성될 수 있고, 분리된 재조합 엑소좀을 당뇨병 치료제 용해된 용매에 넣고 초음파를 처리하여 엑소좀을 재구축함으로써 생성할 수 있다(Kim et al., Nanomedicine, 12(3): 655-664, 2016). 선택적으로 엑소좀에 약물을 담지 할 때 단순히 분리된 엑소좀을 약물과 적절한 용매 또는 배지 내에서 혼합한 후 적절한 시간동안 교반하여 혼합하는 방법을 사용할 수 있고(Sun et al., Mol. Ther. 18(9): 1606-1614, 2010), 혹은 핵산과 같은 친수성 약물의 경우 전기천공법(electroporation)을 이용하여 엑소좀 내에 함입시킬 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 재조합 엑소좀 또는 막 융합 단백질을 발현하도록 형질 전환된 진핵세포로부터 수득된 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 근육질환 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

상기 근육질환 치료용 약학적 조성물에서, 상기 근육질환은 섬유근종(fibromyalgia), 염증성 근육병(inflammatory myopathy), 근이영양증(muscular dystrophy), 듀시엔형 근이영양증(Duchenn muscular dystrophy), 헌팅턴병(Huntington's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근육통(myalgia), 연조직육종(soft tissue sarcoma), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatic), 근육경련(musle cramps), 샤르코 마리 투스병(Charcot Marie Tooth disease, CMT), 폼페병(pompe disease), 파브리병(Farbry's disease), 코리 또는 포비병(Cori's or Forbe's disease), 타루이병(Tarui's disease), 맥아디병(McArdie's disease), 근염(myositis), 봉입체근염(inclusion body myositis), 샤프증후군(Sharp's syndrome), 다발성근염(mutiple myositis), 수근관증후군(carpal tunnel syndrome), 다발성 말초신경증(multiple peripheral neuropathy), 척수성 근육위축증(spinal muscular atrophy, SMA), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 염증성 근육병(inflammatory myopathy), 중증근무력증(myasthenia gravis) 또는 근육파열(muscle tear)일 수 있다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 막에 GLUT4 및 막 융합 단백질을 포함하는 재조합 엑소좀을 포함하는 세포재생 촉진용 조성물이 제공된다.

상기 세포재생 촉진용 조성물은 뼈, 연골, 근육, 간, 힘줄, 인대, 치주, 신경, 림프, 각막, 폐, 신장, 대장, 위, 소장, 췌장, 갑상선 및 전립선으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조직의 재생에 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 비경구를 위한 제형인 것이 바람직하다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있는데, 비경구로 투여되는 경우, 정맥 내 주사, 비강 내 흡입, 근육 내 투여, 복강 내 투여, 경피 흡수 등 다양한 경로를 통해 투여하는 것이 가능하다.

상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다.

본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 당뇨병 치료제 또는 근육질환 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 상기 재조합 엑소좀(recombinant exosome)을 혈당의 조절이 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상기 개체의 혈당의 조절방법이 제공된다.

본 발명자들은 기능성 막단백질을 세포막으로 전달하기 위해 재조합된 엑소좀을 이용한 새로운 생적합성 나노플랫폼을 연구하였다. 이러한 세포막의 변형을 본 발명자들은 "막-편집(membrane-editing)"이라 명명하였다(도 1). 엑소좀은 작은 막 소포체로 일반적으로 직경이 30-150 nm 정도로, 모세포(parental cells)의 다낭체(mutivesicular bodies)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 세포 사이에 기능성 생체분자(예컨대, siRNA, miRNA, mRNA 및 단백질 등)의 전달 가능성 및 조작에 대한 높은 용이성 때문에, 천연 또는 표면 조작된 엑소좀의 치료적 사용이 최근 주목받고 있다(Andaloussi et al., Nat. Rev. Drug Discovery 12: 347-357, 2013; Ferguson et al., J. Control. Release 228: 179-190, 2016; Vader et al., Adv. Drug Delivery Rev. 106: 148-156, 2016).

본 발명자들은 막단백질을 상기 재조합 엑소좀을 이용하여 막 결함을 가진 세포의 세포막에 효율적으로 전달하기 위한 기술을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 바이러스성 융합매개원(fusogen)인 수포성 구내염바이러스의 외피 당단백질(VSV-G)를 표면에 발현하도록 제조된 재조합 엑소좀에 전달 대상인 막단백질을 적재하여 세포 또는 개체에 처리할 경우, 당해 전달 대상 막단백질을 효율적으로 상기 세포 또는 개체에 전달할 수 있을 것이라는 가설을 수립하였다(도 1). 본 발명자들은 상기 가설을 검증하기 위해, 막 융합 단백질인 VSV-G 단백질과 목적 막 단백질로서 CD63 또는 GLUT-4 단백질을 발현하도록 형질 전환된 HEK293T 세포를 배양하여 그로부터 분비된 엑소좀을 분리 정제하여 엑소좀 표면에 상기 목적 단백질이 정상적으로 위치함을 확인하였고(도 2a 내지 4d), VSV-G 단백질 및 GLUT-4를 막에 포함하고 있는 재조합 엑소좀을 HEK293T 세포에 처리한 결과 상기 HEK293T 세포가 대조군에 비해 포도당 흡수율이 현저하게 향상됨을 확인함으로써(도 6a 내지 7), 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 표적세포의 막과 융합되어 표적세포의 세포막에 목적 막단백질을 효과적으로 전달할 수 있음을 입증하였다. 뿐만 아니라, 본 발명의 일 실시예에 따른 VSV-G 단백질 또는 상기 VSV-G 단백질 및 GLUT-4를 막에 포함하고 있는 재조합 엑소좀을 근육 손상을 유도한 동물 모델의 손상된 부위에 직접 투여하였을 때, 대조군에 비해 근육 손상을 더 빨리 회복시킬 수 있고, 이러한 조직재생 능력은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀에 의해 손상조직의 세포막에 전달된 GLUT-4를 통한 포도당의 흡수 촉진은 물론, VSV-G 단백질에 의한 막 융합 활성에 따른 근육세포의 융합의 촉진, 즉, 융합유도 효과(fusion-inducing effect)에 의한 것임을 입증하였다(도 8a 내지 9c). 상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 개체의 혈당조절은 물론 뼈, 인대, 연골, 및 근육 등 다양한 조직의 재생에 활용될 수 있음을 시사하는 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명의 재조합 엑소좀은 상기 GLUT-4 외에도 다른 치료용 막단백질을 표적 세포 및 기관에 효율적으로 전달할 수 있는 매우 유용한 플랫폼 기술로 활용될 수 있다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: VSV-G 및 CD63을 포함하는 재조합 엑소좀의 제조 및 표적세포로의 도입

본 발명자들은 막단백질을 VSV-G 단백질을 포함하는 엑소좀에 포함시킨 후 엑소좀을 표적세포와 접촉시켜서 상기 막단백질을 표적세포의 세포막으로 전달할 수 있을 것이라는 가설을 세우고(도 1 참조), 상기 가설이 실제 타당한지 여부를 조사하기 위해 형광단백질인 GFP를 막단백질인 CD63과 융합시킨 융합단백질을 VSV-G를 포함하는 엑소좀에 도입시킨 후 표적세포와의 접촉 이후 형광의 분포 양상을 관찰하였다.

구체적으로, 본 발명자들은 VSV-G 단백질을 암호화하는 유전자(서열번호 1)가 삽입된 pCMV-VSV-G Envelope Vector(RV-110, Cell Biolabs, 이하, 'VSV-G 컨스트럭트'로 약칭함)를 구매하였고, CD63-GFP 융합 단백질을 엑소좀으로 위치시키는 pCT-CD63-GFP 벡터(이하, 'CD63-GFP 컨스트럭트'로 약칭함)을 System Bioscience사(San Fransico, USA)로부터 구매하였다. 상기 두 유전자 컨스트럭트를 HEK293T 세포에 공형질 감염시킨 후, 48시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포배양액을 회수하여 300 g에서 10분간, 2,000 g에서 10분, 10,000 g에서 30분의 순차적 원심분리를 수행한 후, 0.2 μm 필터를 이용하여 여과한 후, 다시 100,000 g에서 90분간 한외여과를 수행하여 펠렛을 회수하였다(도 2a).

그런 다음 엑소좀 내에 VSV-G 단백질 및 CD63-GFP가 포함되어 있는지 확인하기 위해 상기 회수된 엑소좀 일부를 파쇄한 후 항-VSV-G 항체(Abcam, ab50549), 항-CD63 항체(Abcam, ab8219), 항-Alix 항체(엑소좀 마커, Santacruz, sc99010)를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다(도 2b). 그 결과 도 2B에 나타난 바와 같이, 비형질 감염 HEK293T 세포(대조군) 유래의 엑소좀에서는 CD63만이 검출되었고, VSV-G 컨스트럭트로만 형질 감염된 세포로부터 유래한 엑소좀에서는 VSV-G 단백질과 CD63만이 검출되었으며, CD63-GFP 컨스트럭트로만 형질 감염된 HEK293T 세포 유래의 엑소좀에서는 CD63 및 CD63-GFP만 검출되었고, VSV-G 컨스트럭트 및 CD63-GFP 컨스트럭트로 공형질 감염된 HEK293T 세포로부터 유래한 엑소좀에서는 VSV-G, CD63, CD63-GFP 모두가 검출되었다. 이는 본 발명의 일 실시예에 따른 VSV-G 및 막 단백질을 발현하도록 형질 전환된 세포로부터 유래한 엑소좀에 상기 VSV-G 및 막 단백질이 정상적으로 포함되어 있음을 의미하는 것이다.

이어, 본 발명자들은 상기 회수된 엑소좀의 입도를 동적 광산란(dynamic light scattering, DLS) 분석 장치(Malvern zetasizer nano ZS, UK)을 이용하여 분석하는 한편(도 2c 참조), 투과 전자현미경으로 생성된 엑소좀을 촬영하였다(도 2d 참조). 그 결과 도 2c 및 2d에 나타난 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 엑소좀은 그 크기가 100 nm 내외의 상당히 좁은 스펙트럼을 갖고 있는 것으로 나타났다.

이어, 본 발명자들은 상기에서 수득된 엑소좀을 표적세포인 HEK293T 세포에 처리한 후 엑소좀 막에 존재하고 있는 상기 막단백질(CD63-GFP)이 표적세포의 어느 곳에 분포하는지 형광현미경을 이용하여 관찰하였다(도 3 참조). 한편, 상기 막단백질이 세포막에 위치하는지 확인하기 위해 CellLight^TM Plasma Membrane-RFP(BacMam 2.0, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 상기 세포를 형질 전환함으로써 상기 세포의 세포막을 RFP로 사전염색을 하였다.

그 결과 도 3에서 나타난 바와 같이, 융합성 엑소좀(VSV-G 단백질 및 CD63-GFP 모두를 발현하도록 형질전환된 세포로부터 수득된 엑소좀)이 처리된 세포의 경우 세포막을 미리 염색한 RFP에 의한 형광 분포와 GFP에 의한 녹색 형광 분포가 일치하는 것으로 나타나 CD63-GFP가 표적세포의 세포막으로 제대로 전달됨을 확인할 수 있었다. 반면 VSV-G 없이 CD63-GFP만을 발현하는 세포로부터 수득된 대조 엑소좀을 처리한 세포의 경우 세포막이 아닌, 세포내부의 조기 엔도좀(early endosome)에 분포하는 것으로 확인되어, 내세포작용(endocytosis)에 의해 세포내로 포획됨을 알 수 있었다.

실시예 2: VSV-G 및 GLUT4을 포함하는 재조합 엑소좀의 제조 및 표적세포로의 도입

본 발명자는 상기 실시예 1의 결과로부터, 포도당 수송체인 GLUT4의 표적세포의 세포막으로의 특이적인 전달 및 이를 통해 표적세포 및 표적 조직에서의 포도당 흡수조절이 가능한지 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로 본 발명자들은 구체적으로, 본 발명자들은 인간 GLUT4를 암호화 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 GFP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 연결하여 GLUT4-GFP 융합 컨스트럭트(HG13123-ACG, Sino Biological)로부터 구매하였다. 상기 GLUT4-GFP 컨스트럭트와 상기 실시예 1에서 제조된 VSV-G 컨스트럭트를 HEK293T 세포에 공형질 감염시킨 후, 48시간 동안 배양하였다. 그런 다음 세포배양액을 회수하여 300 g에서 10분간, 2000 g에서 10분, 10,000 g에서 30분의 순차적 원심분리를 수행한 후, 0.2 μm 필터를 이용하여 여과한 후, 다시 100,000 g에서 90분간 한외여과를 수행하여 펠렛을 회수하였다(도 4a).

그런 다음 엑소좀 내에 VSV-G 단백질 및 GLUT4-GFP가 포함되어 있는지 확인하기 위해 상기 회수된 엑소좀 일부를 파쇄한 후 항-VSV-G 항체(Abcam, ab50549), 및 항-GFP 항체(Abcam, ab290)를 이용하여 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다(도 4b). 그 결과 도 4b에 나타난 바와 같이, GLUT4-GFP 컨스트럭트로만 형질 감염된 HEK293T 세포 유래의 엑소좀에서는 GLUT4-GFP만이 검출되었고, VSV-G 컨스트럭트 및 GLUT4-GFP 컨스트럭트로 공형질 감염된 HEK293T 세포로부터 유래한 엑소좀에서는 VSV-G, GLUT4-GFP 모두가 검출되었다.

이어, 본 발명자들은 상기 회수된 엑소좀의 크기를 입도분석을 통해 분석하는 한편, 투과 전자현미경으로 생성된 엑소좀을 촬영하였다(도 4c 참조). 그 결과 도 4c에 나타난 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 엑소좀은 실시예 1의 결과와 큰 차이가 없는 크기를 갖는 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터 본 발명자들은 상기에서 회수된 엑소좀을 표적세포에 처리시 GLUT4 단백질을 표적세포의 세포막으로 잘 전달되는지 여부를 확인하기 위해 상기 엑소좀을 표적세포인 C2C12 세포에 처리한 후 GLUT4의 세포내 분포 양상을 형광현미경으로 확인하였다(도 4d 참조). 그 결과 도 4d에서 확인되는 바와 같이 VSV-G 컨스트럭트 및 GLU4-GFP 컨스트럭트로 공형질 감염된 세포로부터 수득된 엑소좀을 상기 C2C12세포에 처리 시 GFP에 의한 형광 분포가 세포막 표지자인 PM-RFP와 공위치화함을 확인할 수 있었고, 조기 엔도좀 마커인 EE-RFP의 형광분포와는 일치하지 않음을 확인하였다.

실험예 1: 엑소좀 융합능력 평가

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제조된 재조합 엑소좀에 포함된 VSV-G 단백질의 융합 활성에 의해 막단백질의 전달이 이루어지는지 확인하기 위해, 세포막 지질 조성을 모사하는 인공 리포좀과 단일 엑소좀 입자의 융합 효율을 분석하기 위해 시험관내 단일-소포 조영분석(single-vesicle imaging analysis)을 개발하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 엑소좀과 인공 리포좀 사이의 평균 융합 횟수를 제공할 수 있는 전체 내부 반사 형광 현미경을 이용하여 형광 공명 에너지 전이(FRET) 분석을 수행하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 리포좀을 VSV-G의 세포 진입 창구 역할을 하는 His-표지 저밀도 지질단백질 수용체(low-density lipoprotein receptor, LDLR)을 결합시키기 위해, 1% Ni-니트릴로트리아세트산(nitrologtriacetic acid, NTA)으로 도핑하였다. 최근 연구를 통해 VSV-G가 편재 세포표면(universal cell surface) LDLR 및 다른 LDL 계열 구성원과 결합함으로써 VSV의 결합 및 표적 세포막으로의 융합을 가능케 하는 것으로 보고된 바 있다. 상기 단일-소포 조영 분석에서 소포들은 공여 형광단(donor fluorophore, DiI) 및 수용 형광단(acceptor fluorophore, DiD)을 가지는 다른 소포 중 어느 하나와 짝을 이루었다(도 5a). 도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 단일-소포 조영분석을 개략적으로 나타낸 개요도이다. FERT 효율은 각 소포의 쌍이 평형상태를 이루고 쌍을 이루지 않은 소포들이 제거된 이후에 측정하였으며, 상기 쌍을 이룬 소포들로부터 측정된 데이터를 통해 융합된 집단(저-FRET) 및 완전히 지질-혼합된 집단(고-FRET)을 구분하였다. 도 5a에 나타난 바와 같이, 유세포 분석기의 플로셀(flow cell)에서 DiD-표지 리포좀을 PEG-코팅된 표면에 고정한 후, DiI 표지된 엑소좀을 첨가하고 단일 엑소좀-리포좀 복합체를 형성시킨 후, pH 5.5의 산성조건에서 지질 혼합을 촉발시킨 결과 86%에 가까운 고정된 소포들이 지질-혼합을 형성하는 등 FRET 효율이 증가되었다(도 5b 하단 및 도 5c). 도 5c에서, 저-FRET은 FRET 효율이 0.4 미만일 때를 나타내고, 중간-FRET은 FRET 효율이 0.4 이상 0.65 미만일 때를 나타내며, 고-FRET은 FRET 효율이 0.65 이상인 경우를 나타낸다. 반면, 중성 pH에서는 30분간 반응 후에도 리포좀-엑소좀 융합이 거의 일어나지 않았다(도 5b 상단). 더 나아가, 본 발명자들은 LDLR이 리포좀과 엑소좀 사이의 결합을 촉진시키며, 이는 VSV-G 의존적임을 확인하였다(도 5d 및 표 1). 도 5d는 결합 부집단의 분율을 나타내는 그래프이다. 상기 결과들은, 엑소좀의 구성성분이 안정적인 엑소좀 결합을 달성하기에 충분하지 않음을 시사하는 것이다.

지질 혼합에 대한 결합 횟수 및 총 리포좀의 수

pH	DiI 채널	DiD 채널	결합 엑소좀 ^a	비오틴화 리포좀 ^b
7.4	대조 엑소좀	리포좀	6.9	257
7.4	융합성 엑소좀		84	211
5.5	대조 엑소좀		8	202.7
5.5	융합성 엑소좀		96	238.4
7.4	대조 엑소좀	LDLR을 가진 리포좀	33	281
7.4	융합성 엑소좀		169	208.4
5.5	대조 엑소좀		28	267
5.5	융합성 엑소좀		180	226.6
a: DiI-표지된 엑소좀을 플로우셀에 흘려보내 소포 결합을 유도하였다. b: DiD-표지된 로포좀을 스트렙타비딘-바이오틴 지질 결합을 통해 플로우셀의 PEG-코팅된 표면에 고정하였음

실험예 2: 시험관내 포도당 흡수능 평가

상기 실시예 2의 결과로부터 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀에 처리에 의해 표적세포의 포도당 흡수능이 증가되는지 실험적으로 조사하였다.

구체적으로 본 발명자들은 표적세포인 근육세포주 C2C12 세포를 24웰 플레이트에 10⁵ cells/ml의 농도로 파종한 후, 포도당 및 혈청이 없는 DMEM 배지로 배지를 교체하고, 상기 실시예 2에서 수득된 엑소좀 20 μg/ml 또는 인슐린 1 μg/ml을 1시간동안 처리하였다. 그런 다음, 포도당 표적 형광 리간드인 2-NBDG[2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose] 150 μg/ml를 처리하고 포도당 흡수 세포-기반 분석 키트(Cayman Chemical, USA)를 이용한 유세포분석(여기광: 488 nm)을 통해 포도당 흡수 여부를 측정하였다(도 6a 내지 6c 참조).

상기 분석 결과 도 6a 내지 6c에서 나타난 바와 같이, 융합성 엑소좀(VSV-G 단백질 및 GLUT4-GFP 포함)을 처리한 C2C12 세포는 대부분 2-NBDG에 의한 형광값이 인슐린 처리시와 비슷한 정도로 증가되는 것으로 나타났고, 비융합성 엑소좀(GLUT4-GFP만 포함)을 처리한 C2C12 세포는 대조군 세포(엑소좀 미처리) 세포와 동일한 정도의 2-NBDG에 의한 형광값을 나타났다. 이는 GLUT4만 포함하는 엑소좀으로는 포도당 흡수능 개선이 어려움을 시사하는 것이다.

이에, 본 발명자들은 상기 분석결과가 실제 GLUT4의 세포막으로 전달에 의한 효과에 기인한 것인지 조사하기 위해, GLUT1 특이적 저해제인 아피게닌(Apigenin)으로 포도당 흡수를 저해 시 포도당 흡수정도의 변화를 분석하였다.

구체적으로 본 발명자들은 표적 세포인 HEK293T 세포를 24웰 플레이트에 6x10⁴ cells/ml의 농도로 파종한 후, 배지를 포도당과 혈청이 제거된 배지로 교체하였다. 그런 다음 엑소좀 처리 4시간 전에 GLUT1의 발현억제제인 apigenin을 100 μM의 농도로 사전 처리하였다. 이어 상기 실시예 2에서 제조된 융합성 엑소좀 10 및 20 ㎍/ml 및 대조군으로 비융합성 엑소좀 20 ㎍/ml을 처리하고 30분후 2-NBDG 150 ㎍/ml를 처리하고 포도당 흡수 세포-기반 분석 키트(Cayman Chemical, USA)를 이용한 유세포분석(여기광: 488 nm)을 통해 포도당 흡수 여부를 측정하였다(도 7a 및 7b 참조).

그 결과, 도 7a 및 7b에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합성 엑소좀 처리 세포에서는 엑소좀 농도 의존적으로 포도당 흡수율이 증가하였고, Apigenin 처리시에는 포도당 흡수율이 다소 감소하기는 하였으나, 20 ㎍/ml 처리군의 경우 아무것도 처리하지 않은 음성대조군 대비 더 높은 포도당 흡수율을 나타내어, GLUT1의 발현저해에도 불구하고 포도당 흡수효율이 증가됨이 확인되었으며, 이는 엑소좀에 의해 GLUT4가 표적세포의 세포막에 전달되어 GLUT4에 의해 포도당이 세포내로 흡수되었기 때문임을 시사하는 것이다.

실험예 3: 생체내 포도당 흡수능 평가

이에 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀을 실제 동물에 투여 시 해당 동물의 포도당 흡수능이 개선되는지 확인하기 위한 동물실험을 수행하였다.

구체적으로 상기 실시예 2에서 제조된 융합성 엑소좀 및 비융합성 엑소좀 각각 100 ㎍을 BABL/c 누드마우스 마우스의 오른쪽 및 왼쪽 넓적다리에 각각 근육 내 주사한 후 2, 4, 6 및 16시간 경과 후 PET 영상을 수득하였다. PET 촬영 60분 전에 2% 이소플루란으로 마취시킨 후 [¹⁸F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose([¹⁸F]FDG) 7.3-8 MBq의 방사선량으로 꼬리정맥 주사하였고, 소동물 PET 장치(nanoScanPET/MRI system 1T, Mediso, Hungary)를 이용하여 PET 영상을 수득하였다.

그 결과 도 8a 및 8b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 융합성 엑소좀이 투여된 경우 근육 내에서의 포도당 흡수능이 향상됨을 확인할 수 있었으며, 특히 엑소좀 투여 후 4시간 경과 시 포도당 흡수효율이 최대에 도달하는 것으로 나타났으며, 엑소좀 투여 후 6시간까지 유의한 차이를 나타냈다.

아울러, 본 발명자들은 본 발명의 일 실시예에 따른 융합성 엑소좀에 의해 전달된 GLUT4 단백질이 생체 내에서 정확한 세포막 위치로 이동하는지 확인하기 위해, 상기 실시예 2에서 제조된 GLUT4-GFP 융합단백질을 포함하는 융합성 엑소좀을 마우스에 근육 내 주사하고 4시간 경과 후 전경골근(tibialis anterior, TA) 근섬유를 적출하여, 공초점 면역형광 현미경 분석을 수행하였다(도 8c). 그 결과, 도 8c에서 나타난 바와 같이, 대조군 엑소좀(VSV-G를 포함하지 않는 GLUT4-GFP 포함 엑소좀)을 처리한 근섬유에서는 다소 약한 GFP 신호가 관찰된 반면(도 8c의 좌측 칼럼), 본 발명의 GLUT4 포함 융합성 엑소좀을 처리시에는 TA 근육의 표면 막 상에서 강력한 GFP 신호가 관찰되었다(도 8c의 우측 칼럼). 상술한 실험결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 융합성 엑소좀이 포도당 수송체 단백질을 표적세포 및 표적조직의 세포막에 효율적으로 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 그에 의해 포도당 흡수능을 개선시킬 수 있음을 입증하는 것이다. 따라서 본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 당뇨병 환자의 혈당조절에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

실험예 4: 근육재생 효과 평가

4-1: 독소 유발 손상 근육의 재생 촉진 효과

본 발명자들은 상기 실시예 4의 결과로부터 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 생체 내 조건에서 GLUT4를 근육세포에 적절하게 전달한다는 것을 확인하였다. 실험동물의 다리 전경골근(tibialis anteror muscle)에 CTX(Cardiotoxin)를 투여하여 근육 손상을 유도할 때 약 2-3주가 경과하면 자연적으로 치유가 된다. 본 발명자들은 엑소좀에 의한 GLUT4의 근육세포로의 전달에 의해 상기 근육 재생이 더 촉진되는지 여부를 확인하고자 하였다(Moreno H et al., J. Biol. Chem., 2003, 278(42): 40557-40564). 구체적으로 본 발명자들은 Lee 등이 보고한 바와 같이, 8 내지 10주령의 C57BL/6 웅성 마우스의 양쪽 전경골근(tibialis anteror muscle)에 근육독소인 10 μM 농도의 cardiotoxin(CTX) 50 μl를 근육 내 주사하여 근육 손상을 유도하였다(Lee et al., Scientific Reports, 5: 16523, 2015). CTX 주입 1일째 융합성 엑소좀 및 대조군으로 비융합성 엑소좀을 각각 100 ㎍을 근육 내 주입한 후, 이틀 간격으로 각각의 엑소좀을 6차례 더 100 ㎍씩 근육 내 투여하였다(도 9a).

CTX 투여 4일째, 9일째 및 14일째에 실험동물을 희생시키고, 양쪽 전경골근을 수득하여, OCT 화합물에 포매한 후 4 내지 6 μm 두께로 절편을 제조하였으며, 상기 제조된 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한 후 현미경으로 조직학적 분석을 수행하였다(도 9b). 그 결과 도 9b에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 융합성 엑소좀을 처리한 경우 비융합성 엑소좀을 투여한 경우보다 더 빨리 근육 손상이 치유됨을 확인할 수 있었다.

4-2: 근육세포 융합에 미치는 영향

본 발명자들은 상시 실험예 5-1의 분석에 이어, 본 발명의 일 실시예에 따른 VSV-G 포함 융합성 엑소좀의 근육 세포의 융합에 미치는 영향을 조사하였다.

구체적으로, 근육세포주 C2C12 세포를 24웰 플레이트에 10⁵ cells/ml의 농도로 파종한 후, 포도당 및 혈청이 없는 DMEM 배지로 배지를 교체하고, 대조군(VSV-G 및 GLUT를 모두 포함하지 않는 엑소좀), GLUT4만 포함하고 VSV-G가 포함되지 않는 비융합성 엑소좀(Glut4-Control exosome), GLUT4 없이 VSV-G만 포함하는 융합성 엑소좀(fusogenic exosome) 및 상기 실시예 2에서 수득된 GLUT4 및 VSV-G 포함 융합성 엑소좀(Glut4-fusogenic exosome)을 각각 20 μg/ml 처리하였다. 그런 다음, 1일, 3일, 및 5일째 미오신 중쇄에 특이적으로 결합하는 항체(DSHB, MF-20)를 이용하여 면역형광분석을 수행하였다. 그 결과, 도 9c에서 나타난 바와 같이, 대조군과 비융합성 GLUT4 포함 엑소좀의 경우 유의한 차이를 보이지 않았으나, 융합성 엑소좀을 처리한 경우 근육다발의 크기가 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 융합성 엑소좀 처리만으로도 근육세포의 융합을 촉진시키는 기능이 있음을 보여주는 것으로서, 융합성 엑소좀의 표면에 존재하는 VSV-G가 엑소좀의 근육세포로의 융합뿐만 아니라 근육세포끼리의 융합을 유도하기 때문인 것으로 판단된다. 이에 본 발명자들은, 근육세포 융합을 촉진시키는 본 발명의 융합성 엑소좀을 융합-유도 엑소좀(fusion-inducing exosome)이라 명명하였다. 아울러, GLUT4를 포함하는 융합성 엑소좀의 경우 GLUT4에 의한 포도당 흡수가 증가되는 효과와 VSV-G에 의한 융합-유도 효과(fusion-inducing effect)가 합쳐져서 근육세포의 융합을 더욱 촉진시킴을 확인할 수 있었다.

상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀이 소상된 근육의 재생에 효과적으로 사용될 수 있음을 시사하는 것으로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 엑소좀은 각종 물리적인 손상에 의한 것은 물론 파킨슨병이나 헌팅턴병과 같은 퇴행성 신경질환에 의한 근육의 감퇴, 근위축성 축삭경화증과 같은 난치성 근육질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허 청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> A novel recombinant exosome and use thereof <130> PD17-5513 <150> KR 2016-0090232 <151> 2016-07-15 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1536 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding VSV-G protein <400> 1 atgaagtgcc ttttgtactt agccttttta ttcattgggg tgaattgcaa gttcaccata 60 gtttttccac acaaccaaaa aggaaactgg aaaaatgttc cttctaatta ccattattgc 120 ccgtcaagct cagatttaaa ttggcataat gacttaatag gcacagcctt acaagtcaaa 180 atgcccaaga gtcacaaggc tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg 240 gtcactactt gtgatttccg ctggtatgga ccgaagtata taacacattc catccgatcc 300 ttcactccat ctgtagaaca atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg 360 ctgaatccag gcttccctcc tcaaagttgt ggatatgcaa ctgtgacgga tgccgaagca 420 gtgattgtcc aggtgactcc tcaccatgtg ctggttgatg aatacacagg agaatgggtt 480 gattcacagt tcatcaacgg aaaatgcagc aattacatat gccccactgt ccataactct 540 acaacctggc attctgacta taaggtcaaa gggctatgtg attctaacct catttccatg 600 gacatcacct tcttctcaga ggacggagag ctatcatccc tgggaaagga gggcacaggg 660 ttcagaagta actactttgc ttatgaaact ggaggcaagg cctgcaaaat gcaatactgc 720 aagcattggg gagtcagact cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc 780 tttgctgcag ccagattccc tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag 840 acctcagtgg atgtaagtct aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc 900 caagaaacct ggagcaaaat cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat 960 cttgctccta aaaacccagg aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa 1020 tactttgaga ccagatacat cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc 1080 ggaatgatca gtggaactac cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa 1140 gacgtggaaa ttggacccaa tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta 1200 tacatgattg gacatggtat gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg 1260 ttcgaacatc ctcacattca agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt 1320 tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt 1380 tggaaaagct ctattgcctc ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg 1440 gttctccgag ttggtatcca tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt 1500 tatacagaca tagagatgaa ccgacttgga aagtaa 1536

Claims

막에 포도당 수송체 단백질(GLUT) 및 막 융합 단백질이 포함된 재조합 엑소좀(recombinant exosome).
제1항에 있어서,
상기 포도당 수송체 단백질은 GLUT1, GLUT2, GLUT3, GLUT4, GLUT5, GLUT6, GLUT7. GLUT8, GLUT9, GLUT10, GLUT11, GLUT12 HMIT(H⁺/myoinositol transporter), 또는 GLUT14인, 재조합 엑소좀.
제1항에 있어서,
상기 막 융합 단백질은 VSV-G(vesicular stomatitis virus glycoprotein), HIV의 tat 단백질, HSV-1 gB, EBV gB, 토고토바이러스 G 단백질, 또는 AcMNPV gp64인, 재조합 엑소좀.
제1항에 있어서,
상기 포도당 수송체 단백질 및 막 융합 단백질이 발현되도록 형질 전환된 세포로부터 수득된, 재조합 엑소좀.
제1항에 있어서,
내부에 하나 이상의 다른 당뇨병 치료제를 추가로 포함하는, 재조합 엑소좀.
제5항에 있어서,
상기 당뇨병 치료제는 메트포민(Metformin), 부포민(Buformin), 펜포민(Phenformin), 로지글리타존(rosiglitazone), 피오글리타존(pioglitazone), 트로글리타존(troglitazone), 톨부타마이드(tolbutamide), 아세토헥사마이드(acetohexamide), 톨라자마이드(tolazamide), 클로르프로파마이드(chlorpropamide), 글리벤크라마이드(glibenclamide), 미티글리나이드(mitiglinide), 글리피자이드(glipizide), 글리부라이드(glyburide), 글리메피라이드(glimepiride), 글리클라자이드(gliclazide), 글리코피라마이드(glycopiramide), 글리퀴돈(gliquidone), 레파글리나이드(repaglinide), 나테글리나이드(nateglinide), 미글리톨(miglitol), 아카르보스(acarbose), 보글리보스(voglibose), 글르카곤유사 펩타이드-1(GLP-1) 또는 그의 유도체, 빌다글립틴(vildagliptin), 스타글립틴(stagliptin), 삭사글립틴(saxagliptin), 리나글립틴(linagliptin), 알로글립틴(alogliptin), 셉타글립틴(septagliptin) 또는 테네글립틴(tenegliptin)인, 재조합 엑소좀.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 치료용 약학적 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 혈당강하용 약학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 엑소좀 또는 막에 막 융합 단백질을 포함하는 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 근육질환 치료용 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 막 융합 단백질은 VSV-G(vesicular stomatitis virus glycoprotein), HIV의 tat 단백질, HSV-1 gB, EBV gB, 토고토바이러스 G 단백질, 또는 AcMNPV gp64인, 약학적 조성물.
제9항에 있어서,
상기 근육질환은 섬유근종(fibromyalgia), 염증성 근육병(inflammatory myopathy), 근이영양증(muscular dystrophy), 듀시엔형 근이영양증(Duchenn muscular dystrophy), 헌팅턴병(Huntington's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근육통(myalgia), 연조직육종(soft tissue sarcoma), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatic), 근육경련(musle cramps), 샤르코 마리 투스병(Charcot Marie Tooth disease, CMT), 폼페병(pompe disease), 파브리병(Farbry's disease), 코리 또는 포비병(Cori's or Forbe's disease), 타루이병(Tarui's disease), 맥아디병(McArdie's disease), 근염(myositis), 봉입체근염(inclusion body myositis), 샤프증후군(Sharp's syndrome), 다발성근염(mutiple myositis), 수근관증후군(carpal tunnel syndrome), 다발성 말초신경증(multiple peripheral neuropathy), 척수성 근육위축증(spinal muscular atrophy, SMA), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 염증성 근육병(inflammatory myopathy), 중증근무력증(myasthenia gravis)또는 근육파열(muscle tear)인, 약학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 재조합 엑소좀 또는 막에 막 융합 단백질을 포함하는 재조합 엑소좀을 포함하는 조직재생 촉진용 조성물.
제12항에 있어서,
뼈, 연골, 근육, 간, 힘줄, 인대, 치주, 신경, 림프, 각막, 폐, 신장, 대장, 위, 소장, 췌장, 갑상선 및 전립선으로 구성되는 군으로부터 선택되는 조직의 재생에 사용되는 조성물.