JP6620129B2

JP6620129B2 - 新規な組換えエキソソーム及びその用途

Info

Publication number: JP6620129B2
Application number: JP2017151429A
Authority: JP
Inventors: ホン，ヨン−ソン; スーヤン，ユー; ヒョンジョン，チョル; キム，イン−サン
Original assignee: タンデムカンパニー，リミテッド
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2019-12-11
Anticipated expiration: 2037-08-04
Also published as: JP2019031447A

Description

本発明は、新規な組換えエキソソーム及びその用途に関する。

ここ１０年以上、治療用タンパク質が薬学分野で先導的な突破口として認識され、１３０個以上のタンパク質に対する臨床試験が許可された。機能性タンパク質を細胞内に伝達することは、欠乏されるか、非正常であるか、または貧弱に発現されるタンパク質を代替し／するか、重要細胞内経路を拮抗するための効果的なツールになりうる。治療用タンパク質の持続的な発展にもかかわらず、タンパク質基盤の治療剤の使用は、膜タンパク質を細胞膜に伝達することができる薬物伝達体の必要性によって制限を受けた。膜タンパク質の欠陥は、調節、物質の輸送または組織の細胞無欠性において、問題を起こして、多様なヒト疾患に寄与している。天然的な細胞膜のものすごい複雑性のために、膜タンパク質についての研究は、人工膜の再構築を必要とする。いくつかの脂質系の小胞体システムが、膜タンパク質の伝達のために記述されている。しかし、生理活性膜タンパク質の人工小胞体への挿入のための適切な条件を非常に探しにくいという点が明かになった（Ｌｉｇｕｏｒｉｅｔａｌ．，ＥｘｐｅｒｔＲｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，４：７９−９０，２００７；Ｌｉｇｕｏｒｉｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ１２６：２１７−２２７，２００８；Ｂｉｎｅｒｅｔａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．５９０：２０５１−２０６２，２０１６）。したがって、このような短所は、生物学的及び／または医学的に重要な膜タンパク質の機能を調節するための代案的な戦略の探索に対する動機を付与している。

現代社会において、肥満及び糖尿病に代表される代謝疾患は、その有病率が急速に増加しており、世界保健機構の発表によれば、２００６年基準、全世界人口のうち、約４億人程度が肥満であり、２０１１年Ｎａｔｉｏｎａｌｄｉａｂｅｔｉｃｓｓｔａｔｉｃｓ発表基準、米国人口の８．３％が糖尿病患者である。糖尿病は、インスリン分泌の異常やインスリン受容体の異常によって発生し、これにより、体内血糖の数値が正常に調節されなくて発生し、血管疾患、視力低下のような合併症が存在する。代表的な糖尿病の治療法としては、インスリン依存的な治療法と血中糖降下を通じた治療法とがある。血中糖降下を通じた治療法のための従来の物質としては、ビグアナイド系の化合物とチアゾリジンジオン系の化合物、レスベラトロール、オウレン抽出物などが知られている。大韓民国の食品医薬品安全庁の報告によれば、国内糖尿病治療剤は、約４７０余種が許可を受けて流通している。

最近、ロシグリタゾン（米国特許第５，００２，９５３号）、ブトホルミン、メトホルミン（Ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）などの一部糖尿病治療剤で心血管系疾患、乳酸アシドーシス（ｌａｃｔｉｃａｃｉｄｏｓｉｓ）などの副作用が発見されて、当該治療剤を服用する患者は、他の治療剤に依存しなければならない。また、既存に最も多く使われるメトホルミンの場合、相対的服用濃度が高いために、糖尿病治療にかかる１人当たりコストも高くなる。また、経口用糖尿病治療剤は、スルホニルウレアなどがあるが、糖尿病治療に対する機転において、インスリン分泌を促進させるものであって、糖吸収を促進させる方法とは異なる。

一方、物理的な損傷または退行性疾患によって組織が損傷された場合、損傷された組織を回復または修復するための方法として、各種の人工関節などインプラントの挿入、当該組織由来の細胞（軟骨細胞、筋細胞など）または幹細胞の投与、そして、各種の組織の細胞成長を促進する多様な成長因子（ＴＧＦ−β、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＥＧＦＰ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦなど）の投与などの方法が使われている。しかし、人工関節などのインプラント挿入術の場合、非常に侵襲的であり、回復に長時間がかかるという短所があり、当該組織由来の細胞投与や幹細胞の投与の場合、コストが多くかかり、幹細胞の場合、癌発生などの副作用が表われ、成長因子も、コストが多くかかり、その治療効果が制限的であるという問題点がある。

また、筋異栄養症（ｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、デュシェンヌ型筋異栄養症（Ｄｕｃｈｅｎｎｅｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣｈａｒｃｏｔＭａｒｉｅＴｏｏｔｈｄｉｓｅａｓｅ、ＣＭＴ）、ポンペ病（ｐｏｍｐｅｄｉｓｅａｓｅ）、ファブリー病（Ｆａｒｂｒｙ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、脊髄性筋萎縮症（Ｓｐｉｎａｌｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ、ＳＭＡ）、ルーゲーリック病（ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、ＡＬＳ）、炎症性筋肉病（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｍｙｏｐａｔｈｙ）、重症筋無力症（ｍｙａｓｔｈｅｎｉａｇｒａｖｉｓ）などは、末梢神経と筋肉とに発生する主要稀貴難治性筋疾患である。

このような筋疾患の場合、遺伝子異常や、筋肉の損傷、神経退化による筋萎縮、糖尿病、***のような代謝性疾患の合併症など多様な原因によって発生しており、一部手術による治療が可能ではあるが、ほとんどは難治性である場合が多い。

これら筋疾患の場合、初めには感覚が鈍くなるか、疼痛が発生し、次第に腕と足との筋肉が消失して動きが難しくなり、呼吸が難しく、動けない深刻な障害も表われる。筋疾患の場合、現在まで完治がほとんど不可能であり、但し、早期に診断される場合、病の進行を遅延させて、障害を最小化することを治療目標としている実情である。現在、デュシェンヌ型筋異栄養症を適応症とする試験薬物であるＳａｒｅｐｔａ社のｅｔｅｐｌｉｒｓｅｎとＧＳＫ社のｄｒｉｓａｐｅｒｓｅｎなどに対する臨床試験が進められているが、ＧＳＫ社のｄｒｉｓａｐｅｒｓｅｎの場合、毒性のために承認が拒絶されるなど、まだ販売承認された薬物は存在しない実情である。

本発明は、前記問題点を含んだ多様な問題点を解決するためのものであって、糖吸収を促進させることによって、より効率的な血糖調節及び筋肉を含めた多様な組織の再生のために使用可能な組換えエキソソーム及びその用途を提供することを目的とする。しかし、このような課題は、例示的なものであって、これにより、本発明の範囲が限定されるものではない。

本発明の一観点によれば、膜にグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）及び膜融合タンパク質が含まれた組換えエキソソーム（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｏｓｏｍｅ）が提供される。

本発明の他の一観点によれば、前記組換えエキソソームを有効成分として含む糖尿病治療用組成物が提供される。

本発明の他の一観点によれば、前記組換えエキソソームを有効成分として含む血糖降下用薬学的組成物が提供される。

本発明の他の一観点によれば、前記組換えエキソソームまたは膜に膜融合タンパク質が含まれた組換えエキソソームを有効成分として含む筋疾患治療用薬学的組成物が提供される。

本発明の他の一観点によれば、前記組換えエキソソームまたは膜に膜融合タンパク質を含む組換えエキソソームを含む組織再生促進用組成物が提供される。

本発明の他の一観点によれば、前記組換えエキソソームを血糖調節を必要とする個体に投与する段階を含む前記個体の血糖調節方法が提供される。

前記のようになされた本発明の一実施例によれば、本発明は、遺伝子の伝達のような複雑な機転によらずとも、個体の上昇した血糖を容易に調節することができて、第１型糖尿病はもとより、第２型糖尿病患者の血糖調節に非常に有用に使われるだけではなく、筋肉を含んだ多様な組織の再生を促進するために、損傷された組織の再生のために有用に使われる。

本発明の実施例は、本明細書に伴われる図面についての下記の説明によってより詳しく説明される：
本発明のＧＬＵＴ及びＶＳＶ−Ｇを発現するように形質転換された細胞から収得された組換えエキソソーム（左側）及び前記組換えエキソソームが標的細胞と融合して、前記標的細胞の細胞膜にＧＬＵＴを伝達する過程（右側）を概略的に示す概要図である。本発明の一実施例によって膜タンパク質が標的細胞の細胞膜によく伝達されるかを確認するために製作されたＶＳＶ−Ｇ発現コンストラクトとＣＤ６３−ＧＦＰ融合タンパク質発現コンストラクトとを共形質感染させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から組換えエキソソームを分離する過程を示す工程図である。前記分離された組換えエキソソームに対してＶＳＶ−Ｇ及びＣＤ６３−ＧＦＰの発現の有無を確認したウェスタンブロットの分析結果を示す写真である。分離された組換えエキソソームの粒子サイズの分布を示すヒストグラムである。前記組換えエキソソームに対する透過電子顕微鏡写真である。本発明の一実施例によるＶＳＶ−Ｇタンパク質及びＣＤ６３−ＧＦＰを共発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から分離された組換えエキソソーム（上端）及び対照群としてＣＤ６３−ＧＦＰのみ発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から分離された組換えエキソソーム（下端）を標的細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞と融合させた後、ＧＦＰの分布態様を撮影した蛍光顕微鏡写真である。本発明の一実施例によるＶＳＶ−Ｇタンパク質及びＧＬＵＴ４−ＧＦＰを共発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から組換えエキソソームを分離する過程を示す工程図である。前記分離された組換えエキソソームに対してＶＳＶ−Ｇ及びＧＬＵＴ４−ＧＦＰの発現の有無を確認したウェスタンブロットの分析結果を示す写真である。前記分離された組換えエキソソームの粒子サイズの分布を示すヒストグラム及びエキソソームに対する透過電子顕微鏡写真である。標的細胞との融合後、蛍光の分布態様を撮影した蛍光顕微鏡写真である。本発明の一実施例による融合性エキソソームのリポソームとの結合及び融合を確認するために使われた単一小胞体造影分析の過程を概略的に示す概要図である。前記単一小胞体造影分析を通じて確認された融合性リポソームのｐＨ条件によるＦＲＥＴ効率を示す柔細胞分析結果である。前記図５Ｂの柔細胞分析結果、低ＦＲＥＴ群、中ＦＲＥＴ群及び高ＦＲＥＴ群の間の分率を示すグラフである。ＶＳＶ−Ｇの受容体としてＬＤＬＲを保有しているエキソソームとＬＤＬＲを保有していないエキソソームとのｐＨの変化によるリポソームとの脂質混合による結合率を比較したグラフである。インスリンを筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）に処理後、前記細胞株でのブドウ糖吸収程度を柔細胞分析で分析した結果を示すヒストグラムである。本発明の一実施例によるＶＳＶ−Ｇタンパク質及びＧＬＵＴ４−ＧＦＰを共発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から収得された組換えエキソソーム及びＧＬＵＴ４−ＧＦＰのみを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から収得された対照群エキソソームをそれぞれ筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）に処理した時、前記細胞株でのブドウ糖吸収程度を柔細胞分析で分析した結果を示すヒストグラムである。ＧＬＵＴ１発現阻害剤であるアピゲニンを事前処理するか、処理していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＶＳＶ−Ｇタンパク質及びＧＬＵＴ４−ＧＦＰを共発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から収得された組換えエキソソーム及びＧＬＵＴ４−ＧＦＰのみを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞から収得された対照群エキソソームをそれぞれ処理した後、２−ＮＢＤＧ処理によるブドウ糖吸収率の変化を分析した結果を示すグラフである（^＊：Ｐ＜０．０５、^＊＊：Ｐ＜０．０１、^＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。実際動物実験の足の筋肉に本発明の組換えエキソソームを注射した後、ブドウ糖吸収程度を［１８Ｆ］−ＦＤＧＰＥＴ造影術で観察した結果を示すグラフである。前記ＰＥＴ造影映像である（^＊：Ｐ＜０．０５、^＊＊：Ｐ＜０．０１）。本発明の組換えエキソソームを筋肉内注射後、ＶＳＶ−Ｇタンパク質の有無によるＧＬＵＴ４タンパク質の筋細胞膜への提示の有無を確認するための共焦点免疫蛍光顕微鏡写真である。前記図８Ａでグラフの縦軸の値は、組織での放射線量の比率であるＳＵＶで組織での放射線量（ＭＢｑ／ｃｃ）／体重当たり投与放射線量（ＭＢｑ／ｇ）で計算される。本発明の一実施例による組換えエキソソームをＣＴＸで損傷を誘発した筋肉内に投与する投与スケジュールである。前記組換えエキソソームの投与による筋肉再生効果を観察した筋肉組織に対する顕微鏡撮影写真である。本発明の一実施例による組換えエキソソーム及びＶＳＶ−Ｇ含む融合性エキソソームを筋細胞に処理時に、筋細胞の融合を観察した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。

以下、具体的な実施態様が伴われる図面についての参照と共に詳しく説明される。

（用語の定義）
本明細書で使われる用語“グルコース輸送体（ｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）”は、ブドウ糖を細胞膜に通過させて細胞内に移入させるタンパク質を意味するが、グルコース輸送体は、１２個の膜通過螺旋を含む膜タンパク質であって、アミノ末端とカルボキシ末端いずれも細胞質方面に露出されている。グルコース輸送体は、ヒトの場合、現在まで１４種が報告されており、アミノ酸配列の相同性によって、ＧＬＵＴ１ないしＧＬＵＴ４、及びＧＬＵＴ１４が属した系列Ｉ（ｃｌａｓｓＩ）、ＧＬＵＴ５、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ９及びＧＬＵＴ１１が属した系列ＩＩ（ｃｌａｓｓＩＩ）、そして、ＧＬＵＴ６、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ１０、ＧＬＵＴ１２、ＨＭＩＴ（Ｈ^＋／ｍｙｏｉｎｏｓｉｔｏｌｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）が含まれた系列ＩＩＩ（ｃｌａｓｓＩＩＩ）が含まれる。

本明細書で使われる用語“膜融合タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅｆｕｓｏｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）”は、原形質膜（ｐｌａｓｍａｍｅｍｂｒａｎｅ）で取り囲まれた細胞または膜小胞体（ｍｅｍｂｒａｎｅｖｅｓｉｃｌｅ）間の同種または異種融合を誘発するタンパク質を意味する。このような“膜融合タンパク質”には、代表的にＶＳＶ−Ｇ（ｖｅｓｉｃｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）が存在し、その他にも、ＨＩＶのｔａｔタンパク質、ＨＳＶ−１ｇＢのようなヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｂ（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｇＢ）、ＥＢＶｇＢ、トゴトウイルスＧタンパク質、ＡｃＭＮＰＶｇｐ６４のようなバキュロウイルスｇｐ６４タンパク質及びボルナ病ウイルス糖タンパク質（ＢＤＶＧ）などが存在する。

本明細書で使われる用語“水疱性口内炎ウイルスの外被糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇタンパク質）”は、水疱性口内炎ウイルスのウイルス粒子（ｖｉｒｉｏｎ）膜に存在する唯一のウイルス糖タンパク質であって、ウイルスの標的細胞への付着及び融合タンパク質として作用する。前記ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、２つのＮ連結クリカンを含む膜通過タンパク質であって、他のウイルスタンパク質が存在しない場合、低ｐＨ依存的な方式で膜融合を開始することができる。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、ＤＮＡなど核酸分子と複合体を形成するために、直接的な遺伝子伝達用担体として使われるか、より安定的であり、高力価の偽型（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）マウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ、ＭＬＶ）基盤レトロウイルス及びレンチウイルス基盤ベクターを生産することによって、遺伝子治療に効果的に使われてきた。しかし、最近、遺伝子以外に多様なタンパク質を標的細胞に伝達する用途として利用可能性が提示されている（Ｍａｎｇｅｏｔｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１９（９）：１６５６−１６６６，２０１１）。

本明細書で使われる用語“エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）”は、血液、尿、及び細胞培養の培養培地を含むあらゆる生物学的液体に存在する細胞由来の小胞体（ｖｅｓｉｃｌｅ）であって、細胞外小胞体（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅ）または小水泡（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）とも呼ばれる。エキソソームのサイズは、３０ｎｍ及び１００ｎｍの間であると知られており、多小胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒｂｏｄｙ）が細胞膜と融合する時、細胞から分泌されるか、細胞膜を通じて直接分泌される。エキソソームは、凝固、細胞間信号伝達、及び代謝廃棄物の管理のような多様な過程で重要な役割を果たしていると知られている。

本明細書で使われる用語“組換えエキソソーム”は、人為的に生産されたエキソソームを意味し、エキソソームを生産することができる宿主細胞（ｈｏｓｔｃｅｌｌ）に遺伝子工学（ｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）によって外来タンパク質を暗号化する遺伝子を形質導入して、形質転換宿主細胞を製造した後、前記形質転換宿主細胞を培養した後、その培養液から収得されたエキソソームである。前記組換えエキソソームには、形質導入された外来タンパク質が内部またはエキソソーム膜に含まれている。

本発明の一観点によれば、膜にグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）及び膜融合タンパク質が含まれた組換えエキソソームが提供される。

前記組換えエキソソームは、前記グルコース輸送体タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む第１遺伝子コンストラクト及び前記膜融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを含む第２遺伝子コンストラクトに形質転換されて、前記グルコース輸送体タンパク質及び前記膜融合タンパク質を過発現する哺乳動物細胞、望ましくは、ヒト細胞から分離・精製されたものであり、選択的には、前記グルコース輸送体タンパク質を暗号化するポリヌクレオチド及び前記膜融合タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドがいずれも含まれた単一遺伝子コンストラクトに形質転換されて、前記糖輸送体タンパク質及び前記膜融合タンパク質を過発現する哺乳動物細胞、望ましくは、ヒト細胞から分離・精製されたものであり、前記単一遺伝子コンストラクトに含まれた２本のポリヌクレオチドは、それぞれ異なるか、同じである別個のプロモーターに作動可能に連結されて発現されるか、１つのプロモーターに作動可能に連結されて、１つの転写体に発現された後、２本のポリヌクレオチドの間に挿入されたリボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）によって分離されて、それぞれのタンパク質として翻訳されることも可能である。

前記組換えエキソソームにおいて、前記グルコース輸送体タンパク質は、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ５、ＧＬＵＴ６、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９、ＧＬＵＴ１０、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ１２、ＨＭＩＴ、またはＧＬＵＴ１４であり得る。

前記組換えエキソソームにおいて、前記膜融合タンパク質は、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＩＶのｔａｔタンパク質、ＨＳＶ−１ｇＢ、ＥＢＶｇＢ、トゴトウイルスＧタンパク質、またはＡｃＭＮＰＶｇｐ６４であり得る。

前記組換えエキソソームは、前記グルコース輸送体タンパク質及び膜融合タンパク質が発現されるように形質転換された細胞から収得されたものであり得る。

前記組換えエキソソームは、内部に１つ以上の他の糖尿病治療剤をさらに含みうる。前記糖尿病治療剤は、メトホルミン、ブホルミン（Ｂｕｆｏｒｍｉｎ）、フェンホルミン（Ｐｈｅｎｆｏｒｍｉｎ）、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、トログリタゾン（ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、トルブタミド（ｔｏｌｂｕｔａｍｉｄｅ）、アセトヘキサミド（ａｃｅｔｏｈｅｘａｍｉｄｅ）、トラザミド（ｔｏｌａｚａｍｉｄｅ）、クロルプロパミド（ｃｈｌｏｒｐｒｏｐａｍｉｄｅ）、グリベンクラミド（ｇｌｉｂｅｎｃｌａｍｉｄｅ）、ミチグリニド（ｍｉｔｉｇｌｉｎｉｄｅ）、グリピジド（ｇｌｉｐｉｚｉｄｅ）、グリブリド（ｇｌｙｂｕｒｉｄｅ）、グリメピリド（ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）、グリクラジド（ｇｌｉｃｌａｚｉｄｅ）、グリクロピラミド（Ｇｌｙｃｌｏｐｙｒａｍｉｄｅ）、グリキドン（ｇｌｉｑｕｉｄｏｎｅ）、レパグリニド（ｒｅｐａｇｌｉｎｉｄｅ）、ナテグリニド（ｎａｔｅｇｌｉｎｉｄｅ）、ミグリトール（ｍｉｇｌｉｔｏｌ）、アカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）、ボグリボース（ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ）、グルカゴン類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはその誘導体、ビルダグリプチン（ｖｉｌｄａｇｌｉｐｔｉｎ）、シタグリプチン（Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）、サキサグリプチン（ｓａｘａｇｌｉｐｔｉｎ）、リナグリプチン（ｌｉｎａｇｌｉｐｔｉｎ）、アログリプチン（ａｌｏｇｌｉｐｔｉｎ）、セプタグリプチン（ｓｅｐｔａｇｌｉｐｔｉｎ）またはテネグリプチン（ｔｅｎｅｇｌｉｐｔｉｎ）であり得る。

前記組換えエキソソームへの薬物の陥入は、薬物が溶解された細胞培養培地内で組換えエキソソームを生産するように遺伝子操作された細胞を培養することで達成され、分離された組換えエキソソームを糖尿病治療剤が溶解された溶媒に入れ、超音波を処理してエキソソームを再構築することで生成することができる（Ｋｉｍｅｔａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２（３）：６５５−６６４，２０１６）。選択的に、エキソソームに薬物を担持する時、単に分離されたエキソソームを薬物と適切な溶媒または培地内で混合した後、適切な時間の間に撹拌して混合する方法を使用し（Ｓｕｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８（９）：１６０６−１６１４，２０１０）、あるいは核酸のような親水性薬物の場合、電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてエキソソーム内に陥入させることができる。

本発明の他の一観点によれば、前記組換えエキソソームを有効成分として含む糖尿病治療用薬学的組成物が提供される。

本発明の他の一観点によれば、前記組換えエキソソームまたは膜融合タンパク質を発現するように形質転換された真核細胞から収得された組換えエキソソームを有効成分として含む筋疾患治療用薬学的組成物が提供される。

前記筋疾患治療用薬学的組成物で、前記筋疾患は、線維筋腫（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）、炎症性筋肉病、筋異栄養症、デュシェンヌ型筋異栄養症、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、筋肉痛（ｍｙａｌｇｉａ）、軟部組織肉腫（ｓｏｆｔｔｉｓｓｕｅｓａｒｃｏｍａ）、リウマチ性多発性筋肉痛（ｐｏｌｙｍｙａｌｇｉａｒｈｅｕｍａｔｉｃ）、筋肉痙攣（ｍｕｓｌｅｃｒａｍｐｓ）、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、ポンペ病、ファブリー病、コリまたはフォーブズ病（Ｃｏｒｉ’ｓｏｒＦｏｒｂｅ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、タルイ病（Ｔａｒｕｉ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、マッカードル病（ＭｃＡｒｄｉｅ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、筋炎（ｍｙｏｓｉｔｉｓ）、封入体筋炎（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｍｙｏｓｉｔｉｓ）、シャープ症候群（Ｓｈａｒｐ’ｓｓｙｎｄｒｏｍｅ）、多発性筋炎（ｍｕｔｉｐｌｅｍｙｏｓｉｔｉｓ）、手根管症候群（ｃａｒｐａｌｔｕｎｎｅｌｓｙｎｄｒｏｍｅ）、多発性末梢神経症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ルーゲーリック病（ＡＬＳ）、炎症性筋肉病、重症筋無力症または筋肉破裂（ｍｕｓｃｌｅｔｅａｒ）であり得る。

本発明の一観点によれば、膜にＧＬＵＴ４及び膜融合タンパク質を含む組換えエキソソームを含む細胞再生促進用組成物が提供される。

前記細胞再生促進用組成物は、骨、軟骨、筋肉、肝、筋、靭帯、歯周、神経、リンパ、角膜、肺、腎臓、大腸、胃、小腸、膵臓、甲状腺及び前立腺で構成される群から選択される組織の再生に使われる。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体を含みうる。薬学的に許容可能な担体を含む前記組成物は、経口または非経口のさまざまな剤型であり得るが、非経口のための剤型であることが望ましい。製剤化する場合には、通常の充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固型製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固型製剤は、１つ以上の化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例を挙げれば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロースまたはラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使われる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが当該するが、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィンの以外に、さまざまな賦形剤、例を挙げれば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれうる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われる。座剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、トウイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使われる。

前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤及び座剤からなる群から選択される何れか１つの剤型を有しうる。

本発明の薬学的組成物は、経口または非経口投与されうるが、非経口投与される場合、静脈内注射、鼻腔内吸入、筋肉内投与、腹腔内投与、経皮吸収など多様な経路を通じて投与することが可能である。

前記本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与される。

本発明において、用語“薬学的に有効な量”は、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／危険の比率で疾患の治療に十分な量を意味し、有効容量レベルは、個体の種類及び重症度、年齢、性別、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使われる薬物を含んだ要素及びその他の医学分野によく知られた要素によって決定されうる。本発明の薬学的組成物は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇの容量で投与され、さらに望ましくは、１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇの投与量で投与される。一方、前記投与量は、患者の年齢、性別及び状態によって適切に調節される。

本発明の薬学的組成物は、個別治療剤として投与するか、他の糖尿病治療剤または筋疾患治療剤と併用して投与され、従来の治療剤と順次または同時に投与される。そして、単一または多重投与される。前記要素をいずれも考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定されうる。

本発明の一観点によれば、前記組換えエキソソームを血糖の調節が必要な個体に投与する段階を含む前記個体の血糖の調節方法が提供される。

本発明者らは、機能性膜タンパク質を細胞膜に伝達するために組み替えられたエキソソームを利用した新たな生適合性ナノプラットフォームを研究した。このような細胞膜の変形を、本発明者らは、“膜編集（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｅｄｉｔｉｎｇ）”と名付けた（図１）。エキソソームは、小さな膜小胞体であって、一般的に直径が３０ｎｍ〜１５０ｎｍ程度で、母細胞（ｐａｒｅｎｔａｌｃｅｌｌｓ）の多嚢体（ｍｕｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒｂｏｄｉｅｓ）から由来するものと知られている。細胞の間に機能性生体分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びタンパク質など）の伝達可能性及び操作に対する高い容易性のために、天然または表面操作されたエキソソームの治療的使用が最近注目されている（Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．ＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖｅｒｙ１２：３４７−３５７，２０１３；Ｆｅｒｇｕｓｏｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ２２８：１７９−１９０，２０１６；Ｖａｄｅｒｅｔａｌ．，Ａｄｖ．ＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＲｅｖ．１０６：１４８−１５６，２０１６）。

本発明者らは、膜タンパク質を前記組換えエキソソームを用いて膜欠陥を有した細胞の細胞膜に効率的に伝達するための技術を開発するために鋭意努力した結果、ウイルス性融合媒介源（ｆｕｓｏｇｅｎ）である水疱性口内炎ウイルスの外被糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を表面に発現するように製造された組換えエキソソームに伝達対象である膜タンパク質を積載して細胞または個体に処理する場合、当該伝達対象膜タンパク質を効率的に前記細胞または個体に伝達することができるという仮説を樹立した（図１）。本発明者らは、前記仮説を検証するために、膜融合タンパク質であるＶＳＶ−Ｇタンパク質と目的膜タンパク質としてＣＤ６３またはＧＬＵＴ−４タンパク質を発現するように形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養して、それから分泌されたエキソソームを分離精製して、エキソソーム表面に前記目的タンパク質が正常に位置することを確認し（図２Ａないし図４Ｄ）、ＶＳＶ−Ｇタンパク質及びＧＬＵＴ−４を膜に含んでいる組換えエキソソームをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に処理した結果、前記ＨＥＫ２９３Ｔ細胞が対照群に比べて、ブドウ糖吸収率が顕著に向上することを確認することによって（図６Ａないし図７）、本発明の一実施例による組換えエキソソームが標的細胞の膜と融合されて、標的細胞の細胞膜に目的膜タンパク質を効果的に伝達することができるということを立証した。それだけではなく、本発明の一実施例によるＶＳＶ−Ｇタンパク質または前記ＶＳＶ−Ｇタンパク質及びＧＬＵＴ−４を膜に含んでいる組換えエキソソームを筋肉損傷を誘導した動物モデルの損傷された部位に直接投与した時、対照群に比べて、筋肉損傷をさらに早く回復させ、このような組織再生能力は、本発明の一実施例による組換えエキソソームによって損傷組織の細胞膜に伝達されたＧＬＵＴ−４を通じたブドウ糖の吸収促進はもとより、ＶＳＶ−Ｇタンパク質による膜融合活性による筋細胞の融合の促進、すなわち、融合誘導効果（ｆｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔ）によるものであることを立証した（図８Ａないし図９Ｃ）。前記結果は、本発明の一実施例による組換えエキソソームが個体の血糖調節はもとより、骨、靭帯、軟骨、及び筋肉など多様な組織の再生に活用されうるということを示唆するものである。

それだけではなく、本発明の組換えエキソソームは、前記ＧＬＵＴ−４以外にも他の治療用膜タンパク質を標的細胞及び器官に効率的に伝達することができる非常に有用なプラットフォーム技術として活用されうる。

以下、実施例及び実験例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、以下で開示される実施例及び実験例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態として具現可能なものであって、以下の実施例及び実験例は、本発明の開示を完全にし、当業者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。
（実施例１：ＶＳＶ−Ｇ及びＣＤ６３を含む組換えエキソソームの製造及び標的細胞への導入）
本発明者らは、膜タンパク質をＶＳＶ−Ｇタンパク質を含むエキソソームに含ませた後、エキソソームを標的細胞と接触させて、前記膜タンパク質を標的細胞の細胞膜に伝達することができるという仮説を立て（図１参照）、前記仮説が実際妥当であるか否かを調査するために、蛍光タンパク質であるＧＦＰを膜タンパク質であるＣＤ６３と融合させた融合タンパク質をＶＳＶ−Ｇを含むエキソソームに導入させた後、標的細胞との接触以後、蛍光の分布態様を観察した。

具体的に、本発明者らは、ＶＳＶ−Ｇタンパク質を暗号化する遺伝子（配列番号１）が挿入されたｐＣＭＶ−ＶＳＶ−ＧＥｎｖｅｌｏｐｅＶｅｃｔｏｒ（ＲＶ−１１０、ＣｅｌｌＢｉｏｌａｂｓ、以下、‘ＶＳＶ−Ｇコンストラクト’と略称する）を購入し、ＣＤ６３−ＧＦＰ融合タンパク質をエキソソームで位置させるｐＣＴ−ＣＤ６３−ＧＦＰベクター（以下、‘ＣＤ６３−ＧＦＰコンストラクト’と略称する）をＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社（ＳａｎＦｒａｎｓｉｃｏ，ＵＳＡ）から購入した。前記２つの遺伝子コンストラクトをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共形質感染させた後、４８時間培養した。その後、細胞培養液を回収して、３００ｇで１０分間、２，０００ｇで１０分、１０，０００ｇで３０分の順次遠心分離を行った後、０．２μｍフィルターを用いて濾過した後、再び１００，０００ｇで９０分間限外濾過を行って、パレットを回収した（図２Ａ）。

その後、エキソソーム内にＶＳＶ−Ｇタンパク質及びＣＤ６３−ＧＦＰが含まれているかを確認するために、前記回収されたエキソソーム一部を破砕した後、抗ＶＳＶ−Ｇ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ５０５４９）、抗ＣＤ６３抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ８２１９）、抗Ａｌｉｘ抗体（エキソソームマーカー、Ｓａｎｔａｃｒｕｚ、ｓｃ９９０１０）を用いてウェスタンブロット分析を行った（図２Ｂ）。その結果、図２Ｂに示されたように、非形質感染ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（対照群）由来のエキソソームでは、ＣＤ６３のみが検出され、ＶＳＶ−Ｇコンストラクトのみ形質感染された細胞から由来したエキソソームでは、ＶＳＶ−Ｇタンパク質とＣＤ６３のみが検出され、ＣＤ６３−ＧＦＰコンストラクトのみ形質感染されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のエキソソームでは、ＣＤ６３及びＣＤ６３−ＧＦＰのみ検出され、ＶＳＶ−Ｇコンストラクト及びＣＤ６３−ＧＦＰコンストラクトに共形質感染されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から由来したエキソソームでは、ＶＳＶ−Ｇ、ＣＤ６３、ＣＤ６３−ＧＦＰいずれもが検出された。これは、本発明の一実施例によるＶＳＶ−Ｇ及び膜タンパク質を発現するように形質転換された細胞から由来したエキソソームに、前記ＶＳＶ−Ｇ及び膜タンパク質が正常に含まれているということを意味するものである。

引き続き、本発明者らは、前記回収されたエキソソームの粒度を動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）分析装置（ＭａｌｖｅｒｎｚｅｔａｓｉｚｅｒｎａｎｏＺＳ，ＵＫ）を用いて分析する一方（図２Ｃ参照）、透過電子顕微鏡で生成されたエキソソームを撮影した（図２Ｄ参照）。その結果、図２Ｃ及び図２Ｄに示されたように、本発明の一実施例によって製造されたエキソソームは、そのサイズが１００ｎｍ内外の非常に狭いスペクトルを有しているものと表われた。

引き続き、本発明者らは、前記から収得されたエキソソームを標的細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞に処理した後、エキソソーム膜に存在している前記膜タンパク質（ＣＤ６３−ＧＦＰ）が、標的細胞のどちらに分布するかを蛍光顕微鏡を用いて観察した（図３参照）。一方、前記膜タンパク質が細胞膜に位置するかを確認するために、ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ^ＴＭＰｌａｓｍａＭｅｍｂｒａｎｅ−ＲＦＰ（ＢａｃＭａｍ２．０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、前記細胞を形質転換することによって、前記細胞の細胞膜をＲＦＰで事前染色を行った。

その結果、図３で示すように、融合性エキソソーム（ＶＳＶ−Ｇタンパク質及びＣＤ６３−ＧＦＰいずれもを発現するように形質転換された細胞から収得されたエキソソーム）が処理された細胞の場合、細胞膜をあらかじめ染色したＲＦＰによる蛍光分布とＧＦＰによる緑色蛍光分布とが一致するものと表われて、ＣＤ６３−ＧＦＰが標的細胞の細胞膜に正しく伝達されることを確認することができた。一方、ＶＳＶ−ＧなしにＣＤ６３−ＧＦＰのみを発現する細胞から収得された対照エキソソームを処理した細胞の場合、細胞膜ではない、細胞内部の初期エンドソーム（ｅａｒｌｙｅｎｄｏｓｏｍｅ）に分布するものと確認されて、内細胞作用（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって細胞内に捕獲されることが分かった。
（実施例２：ＶＳＶ−Ｇ及びＧＬＵＴ４を含む組換えエキソソームの製造及び標的細胞への導入）
本発明者らは、前記実施例１の結果から、グルコース輸送体であるＧＬＵＴ４の標的細胞の細胞膜への特異的な伝達、及びこれを通じて標的細胞及び標的組織でのブドウ糖吸収調節が可能であるか否かを確認しようとした。

具体的に、本発明者らは、ヒトＧＬＵＴ４を暗号化ポリヌクレオチドの３’末端にＧＦＰを暗号化するポリヌクレオチドを連結して、ＧＬＵＴ４−ＧＦＰ融合コンストラクト（ＨＧ１３１２３−ＡＣＧ、ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）から購入した。前記ＧＬＵＴ４−ＧＦＰコンストラクトと前記実施例１から製造されたＶＳＶ−ＧコンストラクトとをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共形質感染させた後、４８時間培養した。その後、細胞培養液を回収して、３００ｇで１０分間、２０００ｇで１０分、１０，０００ｇで３０分の順次遠心分離を行った後、０．２μｍフィルターを用いて濾過した後、再び１００，０００ｇで９０分間限外濾過を行って、パレットを回収した（図４Ａ）。

その後、エキソソーム内にＶＳＶ−Ｇタンパク質及びＧＬＵＴ４−ＧＦＰが含まれているかを確認するために、前記回収されたエキソソーム一部を破砕した後、抗ＶＳＶ−Ｇ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ５０５４９）、及び抗ＧＦＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２９０）を用いてウェスタンブロット分析を行った（図４Ｂ）。その結果、図４Ｂに示されたように、ＧＬＵＴ４−ＧＦＰコンストラクトのみ形質感染されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞由来のエキソソームでは、ＧＬＵＴ４−ＧＦＰのみが検出され、ＶＳＶ−Ｇコンストラクト及びＧＬＵＴ４−ＧＦＰコンストラクトに共形質感染されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から由来したエキソソームでは、ＶＳＶ−Ｇ、ＧＬＵＴ４−ＧＦＰいずれもが検出された。

引き続き、本発明者らは、前記回収されたエキソソームのサイズを粒度分析を通じて分析する一方、透過電子顕微鏡で生成されたエキソソームを撮影した（図４Ｃ参照）。その結果、図４Ｃに示されたように、本発明の一実施例によって製造されたエキソソームは、実施例１の結果と大きな差がないサイズを有するものと確認された。

前記結果から、本発明者らは、前記から回収されたエキソソームを標的細胞に処理時に、ＧＬＵＴ４タンパク質を標的細胞の細胞膜によく伝達されか否かを確認するために、前記エキソソームを標的細胞であるＣ２Ｃ１２細胞に処理した後、ＧＬＵＴ４の細胞内分布態様を蛍光顕微鏡で確認した（図４Ｄ参照）。その結果、図４Ｄから確認されるように、ＶＳＶ−Ｇコンストラクト及びＧＬＵ４−ＧＦＰコンストラクトに共形質感染された細胞から収得されたエキソソームを、前記Ｃ２Ｃ１２細胞に処理時に、ＧＦＰによる蛍光分布が細胞膜標識子であるＰＭ−ＲＦＰと共位置化することを確認することができ、初期エンドソームマーカーであるＥＥ−ＲＦＰの蛍光分布とは一致しないということを確認した。
（実験例１：エキソソーム融合能の評価）
本発明者らは、前記実施例１から製造された組換えエキソソームに含まれたＶＳＶ−Ｇタンパク質の融合活性によって、膜タンパク質の伝達がなされるかを確認するために、細胞膜脂質組成を模写する人工リポソームと単一エキソソーム粒子の融合効率を分析するために、試験管内の単一小胞体造影分析（ｓｉｎｇｌｅ−ｖｅｓｉｃｌｅｉｍａｇｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓ）を開発した。具体的に、本発明者らは、エキソソームと人工リポソームとの間の平均融合回数を提供することができる全体内部反射蛍光顕微鏡を用いて蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）分析を行った。このために、本発明者らは、リポソームをＶＳＶ−Ｇの細胞進入窓口役割を行うＨｉｓ標識低密度脂質タンパク質受容体（ｌｏｗ−ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＬＤＬＲ）を結合させるために、１％Ｎｉ−ニトリロ三酢酸（ｎｉｔｒｏｌｏｇｔｒｉａｃｅｔｉｃａｃｉｄ、ＮＴＡ）でドーピングした。最近、研究を通じてＶＳＶ−Ｇが偏在細胞表面（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅ）ＬＤＬＲ及び他のＬＤＬ系の構成員と結合することによって、ＶＳＶの結合及び標的細胞膜への融合を可能にするものと報告されている。前記単一小胞体造影分析で小胞は、供与蛍光団（ｄｏｎｏｒｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ、ＤｉＩ）及び受容蛍光団（ａｃｃｅｐｔｏｒｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ、ＤｉＤ）を有する他の小胞体のうち何れか１つと対を成した（図５Ａ）。図５Ａは、本発明の一実施例による前記単一小胞体造影分析を概略的に示す概要図である。ＦＥＲＴ効率は、各小胞体の対が平衡状態を成し、対を成していない小胞体が除去された以後に測定し、前記対を成した小胞体から測定されたデータを通じて融合された集団（低ＦＲＥＴ）及び完全に脂質混合された集団（高ＦＲＥＴ）を区分した。図５Ａに示されたように、柔細胞分析器のフローセル（ｆｌｏｗｃｅｌｌ）でＤｉＤ−標識リポソームをＰＥＧコーティングされた表面に固定した後、ＤｉＩ標識されたエキソソームを添加し、単一エキソソーム−リポソーム複合体を形成させた後、ｐＨ５．５の酸性条件で脂質混合を触発させた結果、８６％に近い固定された小胞体が脂質混合を形成するなどＦＲＥＴ効率が増加した（図５Ｂの下端及び図５Ｃ）。図５Ｃで、低ＦＲＥＴは、ＦＲＥＴ効率が０．４未満である時を示し、中間ＦＲＥＴは、ＦＲＥＴ効率が０．４以上０．６５未満である時を示し、高ＦＲＥＴは、ＦＲＥＴ効率が０．６５以上である場合を示す。一方、中性ｐＨでは、３０分間反応後にもリポソーム−エキソソーム融合がほとんど起きなかった（図５Ｂの上端）。さらに、本発明者らは、ＬＤＬＲがリポソームとエキソソームとの間の結合を促進させ、これは、ＶＳＶ−Ｇ依存的であることを確認した（図５Ｄ及び表１）。図５Ｄは、結合副集団の分率を示すグラフである。前記結果は、エキソソームの構成成分が安定したエキソソーム結合の達成には十分ではないということを示唆するものである。

（実験例２：試験管内のブドウ糖吸収能の評価）
前記実施例２の結果から、本発明者らは、本発明の一実施例による組換えエキソソームの処理によって標的細胞のブドウ糖吸収能が増加するかを実験的に調査した。

具体的に、本発明者らは、標的細胞である筋細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を２４ウェルプレートに１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で播種した後、ブドウ糖及び血清のないＤＭＥＭ培地に培地を取り替え、前記実施例２から収得されたエキソソーム２０μｇ／ｍｌまたはインスリン１μｇ／ｍｌを１時間処理した。その後、ブドウ糖標的蛍光リガンドである２−ＮＢＤＧ［２−（Ｎ−（７−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌ−４−ｙｌ）Ａｍｉｎｏ）−２−Ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｏｓｅ］１５０μｇ／ｍｌを処理し、ブドウ糖吸収細胞基盤分析キット（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）を利用した柔細胞分析（励起光：４８８ｎｍ）を通じてブドウ糖吸収の有無を測定した（図６Ａ及び図６Ｂ参照）。

前記分析結果、図６Ａ及び図６Ｂで示すように、融合性エキソソーム（ＶＳＶ−Ｇタンパク質及びＧＬＵＴ４−ＧＦＰ含む）を処理したＣ２Ｃ１２細胞は、ほとんど２−ＮＢＤＧによる蛍光値がインスリン処理時と同様の程度に増加するものと表われ、非融合性エキソソーム（ＧＬＵＴ４−ＧＦＰのみ含む）を処理したＣ２Ｃ１２細胞は、対照群細胞（エキソソーム未処理）細胞と同じ程度の２−ＮＢＤＧによる蛍光値を示した。これは、ＧＬＵＴ４のみ含むエキソソームとしてはブドウ糖吸収能の改善に困難を示唆するものである。

これにより、本発明者らは、前記分析結果が、実際ＧＬＵＴ４の細胞膜に伝達による効果に起因したものであるかを調査するために、ＧＬＵＴ１特異的阻害剤であるアピゲニン（ａｐｉｇｅｎｉｎ）でブドウ糖吸収を阻害時に、ブドウ糖吸収程度の変化を分析した。

具体的に、本発明者らは、標的細胞であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートに６ｘ１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で播種した後、培地をブドウ糖と血清が除去された培地に取り替えた。その後、エキソソーム処理４時間前にＧＬＵＴ１の発現抑制剤であるアピゲニンを１００μＭの濃度で事前処理した。引き続き、前記実施例２から製造された融合性エキソソーム１０μｇ／ｍｌ及び２０μｇ／ｍｌ及び対照群として非融合性エキソソーム２０μｇ／ｍｌを処理し、３０分後、２−ＮＢＤＧ１５０μｇ／ｍｌを処理し、ブドウ糖吸収細胞基盤分析キット（ＣａｙｍａｎＣｈｅｍｉｃａｌ，ＵＳＡ）を利用した柔細胞分析（励起光：４８８ｎｍ）を通じてブドウ糖吸収の有無を測定した（図７参照）。
その結果、図７で示すように、本発明の一実施例による融合性エキソソーム処理細胞では、エキソソーム濃度依存的にブドウ糖吸収率が増加し、アピゲニン処理時には、ブドウ糖吸収率が多少減少したが、２０μｇ／ｍｌ処理群の場合、何も処理していない陰性対照群に比べて、さらに高いブドウ糖吸収率を示して、ＧＬＵＴ１の発現阻害にもかかわらず、ブドウ糖吸収効率が増加することが確認され、これは、エキソソームによってＧＬＵＴ４が標的細胞の細胞膜に伝達されて、ＧＬＵＴ４によってブドウ糖が細胞内に吸収されたためであることを示唆するものである。
（実験例３：生体内ブドウ糖吸収能の評価）
これにより、本発明者らは、本発明の一実施例によるエキソソームを実際動物に投与時に、当該動物のブドウ糖吸収能が改善されるかを確認するための動物実験を行った。

具体的に、前記実施例２から製造された融合性エキソソーム及び非融合性エキソソームをそれぞれ１００μｇをＢＡＢＬ／ｃヌードマウスの右側及び左側の大腿にそれぞれ筋肉内注射した後、２、４、６及び１６時間経過後、ＰＥＴ映像を収得した。ＰＥＴ撮影６０分前に２％イソフルランで麻酔させた後、［^１８Ｆ］２−ｆｌｕｏｒｏ−２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ（［^１８Ｆ］ＦＤＧ）７．３〜８ＭＢｑの放射線量でしっぽ静脈注射し、小動物ＰＥＴ装置（ｎａｎｏＳｃａｎＰＥＴ／ＭＲＩｓｙｓｔｅｍ１Ｔ、Ｍｅｄｉｓｏ，Ｈｕｎｇａｒｙ）を用いてＰＥＴ映像を収得した。

その結果、図８Ａ及び８Ｂに示されたように、本発明の一実施例による融合性エキソソームが投与された場合、筋肉内でのブドウ糖吸収能が向上することを確認することができ、特に、エキソソーム投与後、４時間経過時に、ブドウ糖吸収効率が最大に到達すると表われ、エキソソーム投与後、６時間まで有意な差を示した。

また、本発明者らは、本発明の一実施例による融合性エキソソームによって伝達されたＧＬＵＴ４タンパク質が生体内で正確な細胞膜位置に移動するかを確認するために、前記実施例２から製造されたＧＬＵＴ４−ＧＦＰ融合タンパク質を含む融合性エキソソームをマウスに筋肉内注射し、４時間経過後、前脛骨筋（ｔｉｂｉａｌｉｓａｎｔｅｒｉｏｒ、ＴＡ）の筋繊維を摘出して、共焦点免疫蛍光顕微鏡分析を行った（図８Ｃ）。その結果、図８Ｃで示すように、対照群エキソソーム（ＶＳＶ−Ｇを含まないＧＬＵＴ４−ＧＦＰ含むエキソソーム）を処理した筋繊維では、多少弱いＧＦＰ信号が観察された一方（図８Ｃの左側カラム）、本発明のＧＬＵＴ４含む融合性エキソソームを処理時には、ＴＡ筋肉の表面膜上で強力なＧＦＰ信号が観察された（図８Ｃの右側カラム）。前述した実験結果は、本発明の一実施例による融合性エキソソームがグルコース輸送体タンパク質を標的細胞及び標的組織の細胞膜に効率的に伝達することができるだけではなく、それによりブドウ糖吸収能を改善させることができるということを立証するものである。したがって、本発明の一実施例による組成物は、糖尿病患者の血糖調節に非常に有用に使われる。
（実験例４：筋肉再生効果の評価）
＜４−１：毒素誘発損傷筋肉の再生促進効果＞
本発明者らは、前記実施例４の結果から、本発明の一実施例による組換えエキソソームが生体内条件でＧＬＵＴ４を筋細胞に適切に伝達するということを確認した。実験動物の足の前脛骨筋（ｔｉｂｉａｌｉｓａｎｔｅｒｏｒｍｕｓｃｌｅ）にＣＴＸ（Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ）を投与して筋肉損傷を誘導する時、約２〜３週が経過すれば、自然的に治癒になる。本発明者らは、エキソソームによるＧＬＵＴ４の筋細胞への伝達によって、前記筋肉再生がさらに促進されるか否かを確認しようとした（ＭｏｒｅｎｏＨｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８（４２）：４０５５７−４０５６４）。具体的に、本発明者らは、Ｌｅｅらが報告したように、８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウスの両側前脛骨筋に筋肉毒素である１０μＭの濃度のｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ（ＣＴＸ）５０μｌを筋肉内注射して、筋肉損傷を誘導した（Ｌｅｅｅｔａｌ．，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓ，５：１６５２３，２０１５）。ＣＴＸ注入１日目に、融合性エキソソーム及び対照群として非融合性エキソソームをそれぞれ１００μｇを筋肉内注入した後、２日おきにそれぞれのエキソソームを６回さらに１００μｇずつ筋肉内投与した（図９Ａ）。

ＣＴＸ投与４日目、９日目及び１４日目に実験動物を犠牲させ、両側前脛骨筋を収得して、ＯＣＴ化合物に包埋した後、４μｍ〜６μｍの厚さで切片を製造し、前記製造された切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した後、顕微鏡で組織学的分析を行った（図９Ｂ）。その結果、図９Ｂで示すように、本発明の融合性エキソソームを処理した場合、非融合性エキソソームを投与した場合よりもさらに早く筋肉損傷が治癒されることを確認することができた。
＜４−２：筋細胞の融合に及ぼす影響＞
本発明者らは、前記実験例４−１の分析に続き、本発明の一実施例によるＶＳＶ−Ｇ含む融合性エキソソームの筋細胞の融合に及ぼす影響を調査した。

具体的に、筋細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を２４ウェルプレートに１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で播種した後、ブドウ糖及び血清のないＤＭＥＭ培地に培地を取り替え、対照群（ＶＳＶ−Ｇ及びＧＬＵＴをいずれも含まないエキソソーム）、ＧＬＵＴ４のみ含み、ＶＳＶ−Ｇが含まれない非融合性エキソソーム（Ｇｌｕｔ４−Ｃｏｎｔｒｏｌｅｘｏｓｏｍｅ）、ＧＬＵＴ４なしにＶＳＶ−Ｇのみ含む融合性エキソソーム（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃｅｘｏｓｏｍｅ）及び前記実施例２から収得されたＧＬＵＴ４及びＶＳＶ−Ｇ含む融合性エキソソーム（Ｇｌｕｔ４−ｆｕｓｏｇｅｎｉｃｅｘｏｓｏｍｅ）をそれぞれ２０μｇ／ｍｌ処理した。その後、１日、３日、及び５日目にミオシン重鎖に特異的に結合する抗体（ＤＳＨＢ、ＭＦ−２０）を用いて免疫蛍光分析を行った。その結果、図９Ｃで示すように、対照群と非融合性ＧＬＵＴ４とを含むエキソソームの場合、有意な差を示さなかったが、融合性エキソソームを処理した場合、筋肉束のサイズが増加するということを確認することができた。これは、本発明の融合性エキソソーム処理のみでも、筋細胞の融合を促進させる機能があることを示すものであって、融合性エキソソームの表面に存在するＶＳＶ−Ｇがエキソソームの筋細胞への融合だけではなく、筋細胞どうしの融合を誘導するためであると判断される。これにより、本発明者らは、筋細胞の融合を促進させる本発明の融合性エキソソームを融合誘導エキソソーム（ｆｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇｅｘｏｓｏｍｅ）と名付けた。また、ＧＬＵＴ４を含む融合性エキソソームの場合、ＧＬＵＴ４によるブドウ糖吸収が増加する効果とＶＳＶ−Ｇによる融合誘導効果（ｆｕｓｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｉｎｇｅｆｆｅｃｔ）とが合わせられて筋細胞の融合をさらに促進させることを確認することができた。前記結果は、本発明の一実施例による組換えエキソソームが損傷された筋肉の再生に効果的に使われうるということを示唆するものであって、本発明の一実施例による組換えエキソソームは、各種の物理的な損傷によるものはもとより、パーキンソン病やハンチントン病のような退行性神経疾患による筋肉の減退、筋萎縮性側索硬化症のような難治性筋疾患の治療に有用に使われる。

本発明は、実施例を参考にして説明されたが、これは例示的なものに過ぎず、当業者ならば、これより多様な変形及び均等な他実施例が可能であるという点を理解できるであろう。したがって、本発明の真の技術的保護範囲は、特許請求の範囲の技術的思想によって決定されるべきである。

Claims

膜にグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）及び膜融合タンパク質が含まれた組換えエキソソームを有効成分として含む糖尿病の治療のための薬学的組成物。
前記グルコース輸送体タンパク質は、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ２、ＧＬＵＴ３、ＧＬＵＴ４、ＧＬＵＴ５、ＧＬＵＴ６、ＧＬＵＴ７、ＧＬＵＴ８、ＧＬＵＴ９、ＧＬＵＴ１０、ＧＬＵＴ１１、ＧＬＵＴ１２、ＨＭＩＴ、またはＧＬＵＴ１４である請求項１に記載の薬学的組成物。
前記膜融合タンパク質は、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＩＶのｔａｔタンパク質、ＨＳＶ−１ｇＢ、ＥＢＶｇＢ、トゴトウイルスＧタンパク質、またはＡｃＭＮＰＶｇｐ６４である請求項１に記載の薬学的組成物。
前記グルコース輸送体タンパク質及び膜融合タンパク質が発現されるように形質転換された細胞から収得された請求項１に記載の薬学的組成物。
前記組換えエキソソームの内部に１つ以上の他の糖尿病治療剤をさらに含む請求項１に記載の薬学的組成物。
前記糖尿病治療剤は、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン、トログリタゾン、トルブタミド、アセトヘキサミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、ミチグリニド、グリピジド、グリブリド、グリメピリド、グリクラジド、グリクロピラミド、グリキドン、レパグリニド、ナテグリニド、ミグリトール、アカルボース、ボグリボース、グルカゴン類似ペプチド−１（ＧＬＰ−１）またはその誘導体、ビルダグリプチン、シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチン、セプタグリプチンまたはテネグリプチンである請求項５に記載の薬学的組成物。
膜にグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）及び膜融合タンパク質が含まれた組換えエキソソームまたは上記組換えエキソソームの内部に別の糖尿病治療薬が追加された組換えエキソソームを有効成分として含む血糖降下用薬学的組成物。
膜にグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）及び膜融合タンパク質が含まれた組換えエキソソームまたは膜に膜融合タンパク質を含む組換えエキソソームを有効成分として含む筋疾患治療用薬学的組成物。
前記膜融合タンパク質は、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＩＶのｔａｔタンパク質、ＨＳＶ−１ｇＢ、ＥＢＶｇＢ、トゴトウイルスＧタンパク質、またはＡｃＭＮＰＶｇｐ６４である請求項８に記載の薬学的組成物。
前記筋疾患は、線維筋腫、炎症性筋肉病、筋異栄養症、デュシェンヌ型筋異栄養症、ハンチントン病、パーキンソン病、筋肉痛、軟部組織肉腫、リウマチ性多発性筋肉痛、筋肉痙攣、シャルコー・マリー・トゥース病（ＣＭＴ）、ポンペ病、ファブリー病、コリまたはフォーブズ病、タルイ病、マッカードル病、筋炎、封入体筋炎、シャープ症候群、多発性筋炎、手根管症候群、多発性末梢神経症、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ルーゲーリック病（ＡＬＳ）、炎症性筋肉病、重症筋無力症または筋肉破裂である請求項８に記載の薬学的組成物。
膜にグルコース輸送体タンパク質（ＧＬＵＴ）及び膜融合タンパク質が含まれた組換えエキソソームまたは膜に膜融合タンパク質を含む組換えエキソソームを含む筋肉再生促進用組成物。