KR20170135904A - 항-혈관신생 및 표적화된 암 치료법을 위한 항-vegfr2 인간 항체 - Google Patents

항-혈관신생 및 표적화된 암 치료법을 위한 항-vegfr2 인간 항체 Download PDF

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Abstract

인간 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2; 서열번호 74)의 도메인 1 또는 도메인 3 내부에 위치한 에피토프에 대하여 특이적 결합 친화성을 가지는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 개시된다. VEGFR2의 도메인 3 내부의 에피토프는 서열번호 74의 아미노산 잔기 250번 내지 270번 사이에 위치한다. 종양 성장, 종양 혈관신생의 억제 및/또는 암 세포 세포독성의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장, 종양 혈관신생을 억제하고/억제하거나 암 세포 세포독성을 유도하기 위한 의약의 제조에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도가 또한 개시된다. 또한, 생물학적 샘플에서 종양 혈관 내피 세포 또는 암 세포에서 VEGFR2의 존재를 검출하는 방법이 개시된다.

Description

항-혈관신생 및 표적화된 암 치료법을 위한 항-VEGFR2 인간 항체
본 발명은 일반적으로 항암 활성을 가지는 항체, 보다 구체적으로는 항-VEGFR2 항체에 관한 것이다.
혈관신생은 성인의 건강한 조직에서 드물게 일어난다. 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(vascular endothelial growth factor receptor 2: VEGFR2)는 종양-연관 내피 세포와 비교하여, 정상 내피 세포에서 드물게 그리고 낮은 수준으로 발현된다. VEGFR2 발현은 정상 혈관에서보다 종양 혈관에서 3 내지 5배 더 높다. 암 환자의 생검에서의 면역조직화학으로, 종양 영역에 인접한 정상 조직의 혈관 내피와 비교할 때 종양 혈관에서 VEGFR2 발현이 상당히 상승됨을 추가로 확인하였다. 특히, VEGFR2의 발현은 저-전이성 종양 혈관에서보다 고-전이성 종양 혈관에서 더 많다.
VEGFR2 발현은 원래 종양 조직의 혈관으로 제한되는 것으로 나타났다. 그러나, 최근 연구는 VEGFR2가 또한 악성 종양 세포에도 존재한다는 증거를 제공하였다. 유방암 환자의 혈액에서 순환하는 종양 내피 세포는 VEGFR2를 발현하는 것으로 밝혀졌으며, 따라서 이와 같은 발현은 종양 전이 및 예후와 연관되어 있다. 그러므로, VEGFR2-매개 신호 변환을 차단하여 부수적으로 종양 내피 세포 및 악성 세포를 억제하는 것은 항암 치료제의 개발을 위한 우수한 전략으로 고려된다.
임상 연구로부터의 결과는, VEGFR2에 대한 완전 인간 치료용 항체가 안전하고 내약성이 우수하다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 종양 혈관신생을 차단함으로써 암에 대한 새로운 치료법으로서의 가능성을 나타낸다. 그러므로, 향상된 치료 효능을 가지는 신규한 항-VEGFR2 인간 항체의 개발은 암 환자에게 유익할 것이다.
일 양상에서, 본 발명은 인간 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2: 서열번호 74)의 도메인 1 또는 도메인 3 내부에 위치한 에피토프에 대하여 특이적 결합 친화성을 가지는 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이되, VEGFR2의 도메인 3 내부의 에피토프는 서열번호 74의 아미노산 잔기 250번 내지 270번 사이에 위치한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 에피토프는 NWEYPS(서열번호 66)의 아미노산 서열을 포함한다. 에피토프는 GID, KH, 또는 GLMTK(서열번호 75)의 아미노산 서열을 포함하지 않는다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 종양 혈관 내피 세포에 대하여 특이적 결합 친화성을 나타낸다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하되,
(i) VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 4, Ala Ala Ser, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나;
(ii) VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3은 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 9, Asp Ala Ser, 및 서열번호 10 또는 73의 아미노산 서열을 포함하거나;
(iii) VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 14, Asp Ala Ser, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나;
(iv) VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 19, Gly Ala Ser, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(v) VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 서열번호 21, 서열번호 22, 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 24, 서열번호 25, 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고; VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 9, Asp Ala Ser, 및 서열번호 10 또는 73의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 (a) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및 (b) 서열번호 77 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 단쇄 가변 단편, Fab 단편, 또는 Fv 단편이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 완전 인간 항체이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 검출 가능한 화합물 또는 효소로 표지화된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 비히클 또는 담체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 조성물은 화학요법제를 추가로 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, 화학요법제는 도세탁셀이다.
또한 또 다른 양상에서, 본 발명은 종양 성장, 종양 혈관신생의 억제 및/또는 암 세포 세포독성의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장, 종양 혈관신생을 억제하고/억제하거나 암 세포 세포독성을 유도하기 위한 의약의 제조에 있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 조성물의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시형태에서, 종양 및/또는 암 세포는 VEGFR2를 발현한다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도는 종양 성장, 종양 혈관신생의 억제 및/또는 암 세포 세포독성의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장, 종양 혈관신생을 억제하고/억제하거나 암 세포 세포독성을 유도하기 위한 의약의 제조에 있어서, 추가적인 화학요법제, 예컨대 도세탁셀의 용도를 추가로 포함할 수 있다.
대안적으로, 본 발명은 종양 성장, 종양 혈관신생의 억제 및/또는 암 세포 세포독성의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장, 종양 혈관신생을 억제하고/억제하거나 암 세포 세포독성을 유도함에 있어서 사용하기 위한 본 발명의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 치료적 유효량의 본 발명의 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계, 및 이에 의해 종양 성장, 종양 혈관신생의 억제 및/또는 암 세포 세포독성의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장, 종양 혈관신생을 억제하고/억제하거나 암 세포 세포독성을 유도하는 단계를 포함하는, 종양 성장, 종양 혈관신생을 억제하고/억제하거나, 암 세포 세포독성을 유도하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 치료적 유효량의 화학요법제, 예컨대 도세탁셀을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 화학요법제는 이를 필요로 하는 대상체에게 동시에 투여된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 종양 또는 암은 췌장암, 유방암, 폐암, 백혈병, 전립선암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다.
또한, 또 다른 양상에서, 본 발명은, 하기 단계들을 포함하는, 생물학적 샘플에서 종양 혈관 내피 세포 또는 암 세포 상에서 VEGFR2의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다:
(i) 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 생물학적 샘플과 혼합하는 단계;
(ii) 생물학적 샘플 중 종양 혈관 내피 세포 또는 암 세포 상의 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 VEGFR2를 상호작용시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및
(iii) 복합체 중 상기 종양 혈관 내피 세포 또는 암 세포 상에서 VEGFR2의 존재를 검출하는 단계.
본 발명의 일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 환자로부터의 조직 표본이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 복합체 중 종양 혈관 내피 세포 또는 암 세포 상 VEGFR2의 존재는 면역분석법에 의해 검출된다.
이들 및 다른 양상은 하기 도면과 함께 취해지는 바람직한 실시형태에의 하기 설명으로부터 명백해질 것이지만, 본 개시내용의 신규 개념의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 그 안에서 변화 및 변형이 가해질 수 있다.
첨부된 도면은 본 발명의 하나 이상의 실시형태를 예시하고, 기재된 설명과 함께, 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다. 가능하다면, 실시형태의 동일 또는 유사한 요소를 지칭하기 위하여 도면 전체에 걸쳐 동일한 참조 번호가 사용된다.
도 1A 내지 도 1E는 VEGFR2에 대한 파지-디스플레이된 scFv의 선택 및 동정의 결과를 나타낸다. 파지는 VEGFR2-Fc 재조합 단백질에 대한 바이오패닝(biopanning)을 디스플레이한다. 4 라운드의 바이오패닝 후, 파지의 회수율은 제1 라운드의 것보다 3,455배만큼 증가되었다. cfu, 콜로니 형성 단위(colony-forming unit). (B) 1×109 cfu 파지 역가로 ELISA에 의한, 선택된 파지 클론의 VEGFR2-Fc 단백질에 대한 결합 비교. (C) 파지 클론의 세포 VEGFR2 결합 친화성은 1×1010 cfu로 유동세포계수법에 의해 HUVEC 상에서 평가하였다. (D) 가용성 항-VEGFR2 scFv를 정제하고 쿠마시 블루(Coomassie blue) 염색을 이용하여 SDS-PAGE로 분석하였다. (E) 인간 종양 혈관구조에 대한 면역형광 염색. 폐암 환자의 수술 표본의 동결 절편을 항-VEGFR2 scFv로 탐침한 다음, 항-E 태그 항체 및 로다민-접합 2차 항체 염색을 수행하였다. 혈관 내피를 항-인간 CD31 항체로 염색한 다음, FITC-접합 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 핵을 DAPI로 염색하였다; Con-scFv, 대조 scFv.
도 2A 내지 도 2F는, 항-VEGFR2 scFv가 HUVEC에서 VEGF-A 결합 및 VEGFR2의 활성화를 억제함을 나타낸다. (A) ELISA에 의한 항-VEGFR2 scFv의 VEGF-A와의 경쟁 능력 분석. 경쟁자의 부재 하에서 고정화된 VEGFR2에 대한 VEGF-A 결합량을 100%인 것으로 간주하였다. (B) VEGF-A 및 scFv 경쟁자로 처리한 HUVEC에서 인산화된 VEGFR2(Pho. VEGFR2) 발현을 웨스턴블롯에 의해 검출하였다. 인산화된 VEGFR2의 정량화는 발광 강도에 기초하였고, 총 VEGFR2에 대해 정규화하였다. (C 내지 F) R2S12의 에피토프 맵핑. (C) 인간(서열번호 74의 221번 아미노산 내지 320번 아미노산) 및 마우스(서열번호 80의 223번 아미노산 내지 322번 아미노산)의 VEGFR2 도메인 3(VEGFR2-D3)의 서열 정렬. 두 종 사이에서 상이한 잔기는 박스로 표시되어 있다. 돌연변이체 M1 및 M2에 포함된 잔기는 밑줄이 그어져 있다. 채워진 원과 개방된 원을 사용하여 각각 1121B 및 6.64 항체와 접촉하는 인간 VEGFR2-D3 잔기를 나타낸다. (D) VEGFR2-D3 백본을 묘사한 그래픽; R2S12 결합을 담당하는 NWEYPS(서열번호 66) 잔기(M1)가 강조되어 있다. (E) VEGFR2-D3의 표면 모델. NWEYPS(서열번호 66) 잔기, 즉 M1 영역은 검정 선으로 그려져 있다. (F) VEGFR2-D3의 표면 상에서 1121B 및 6.64와 접촉하는 잔기가 나타나 있다. M1 영역에 국한되어 있는 1121B의 접촉 잔기가 또한 나타나 있다(N, N 말단; C, C 말단).
도 3A 내지 도 3D는 항-VEGFR2 hAb의 친화성 성숙, 및 항-VEGFR2-AF hAb 활성의 분석을 나타낸다. (A) R2S12(서열번호 10) 및 R2S12AF(서열번호 73)의 CDR3(VL-CDR3)의 경쇄 가변 도메인의 아미노산. R2S12 및 R2S12AF 사이에서 상이한 잔기는 박스로 표시되어 있다. (B) 정제된 IgG 및 비아코어(BIACORE) T100(상표명)을 사용하여 결정된 바와 같은, 항-VEGFR2 및 항-VEGFR2-AF hAb의 동적 상수. 비아코어 T100(상표명) 평가 소프트웨어를 사용하여 K d 값을 계산하였다. (C) 인간 항체의 의한 VEGFR2에 대한 VEGF-A의 용량-의존성 억제를 검사하기 위해 경쟁 ELISA를 실행하였다. 100%의 값은 경쟁자의 부재 하에서 고정화된 VEGFR2에 대한 4 nM VEGF-A의 결합에 기인한 것이었다. 오차막대, SD; n=4. (D) 유동세포계수 분석법에 의한 HUVEC에 대한 항-VEGFR2 항체의 결합 활성의 결정. 항체 농도: 0.1 ㎍/㎖.
도 4A 및 도 4B는, 항-VEGFR2-AF hAb가 VEGFR2 신호전달 경로를 억제하고 HUVEC에서 모세혈관 구조 형성을 방해한다는 것을 나타낸다. (A) 매트리젤(MATRIGEL)(등록상표)-코팅된 μ-슬라이드를 사용하여 모세혈관 구조 형성 분석을 실행하였다. HUVEC(웰 당 4×104개 세포)를 0.2% FBS와 함께 인큐베이션하였고, 40 ng/㎖ VEGF-A, 또는 NHIgG, IMC-1121B, 또는 항-VEGFR2-AF 항체와 함께 40 ng/㎖ VEGF-A로 5시간 동안 37℃에서 처리하였다. 위상차 하에서 관상 구조를 관찰하였고, 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 이용하여 상대적인 새싹 길이(하부 패널) 및 분기점(상부 패널)을 정량적으로 측정하였다. 모든 데이터는 3번의 독립적인 실험으로부터 얻어졌다. (B) HUVEC를 50 ng VEGF-A 또는 100 nM 항-VEGFR2-AF 또는 IMC-1121B로 10분 동안 37℃에서 처리하였다. 처리된 HUVEC로부터 총 단백질을 준비하고 웨스턴블롯 분석에 의해 검사하였다. α-튜불린을 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 5A 내지 도 5F는, 인간 전립선 암 세포에서 VEGFR2 활성의 특징을 나타낸다. (A) 표시된 세포주에서 정량적 RT-PCR에 의한 VEGFR2 발현의 분석. 293T 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. VEGFR2의 발현을 GAPDH의 발현에 대하여 정규화하였다. (B) VEGF-A로 처리한 PC-3 세포에 콜로니 형성, MTT, 및 침윤 분석을 수행하였다. 각각의 그룹에서 n=6. (C) PC-3 세포를 VEGFR2-표적화된 shRNA(shVEGFR2)로 처리하고, VEGFR2 발현을 정량적 RT-PCR로 분석하였다. 루시페라제 shRNA(shLuc)를 음성 대조군으로 사용하였다. (D) MTT, 콜로니 형성, 및 트랜스웰(Transwell) 침윤 분석을 실행하여 VEGF-A로 처리한 shVEGFR2-PC-3 세포를 분석하였다. (E) 공공 마이크로어레이 데이터베이스를 사용하여 결정된 바와 같이, 양성 및 원발성 종양과 비교하여 전이성 전립성 종양에서의 상대적인 VEGFR2 발현을 나타내는 박스 플롯. (F) 인간 정상 및 종양 전립선 조직에서 VEGFR2 단백질 발현을 분석하기 위한 항-VEGFR2 항체(55B11, 셀 시그널링(Cell Signaling))를 사용한 인간 전립선 암 조직 어레이(PRC481, 판토믹스(Pantomics))의 면역조직화학적 염색.
도 6a 내지 도 6e는 PC-3 마우스 이종이식 모델에서 항-VEGFR2-AF hAb의 처치 효능의 분석을 나타낸다. (a) 처치 스케쥴. (b) 각각의 그룹의 마우스의 종양 성장 프로파일. (c) 각각의 그룹의 체중. (d) 처치 기간의 종료시, 각각의 마우스로부터 종양 덩어리를 절단하였다. (e) 처치 기간의 종료시에 종양 중량을 측정하였다. 모든 데이터는 그룹 당 9마리의 마우스의 평균으로 표시되어 있다; 막대, SE; *, P< 0.05.
도 7A 내지 도 7E는, 항-VEGFR2-AF hAb가 HL60 마우스 이종이식 모델에서 IMC-1121B보다 더 큰 항종양 활성을 보여주는 것을 나타낸다. (A) 각각의 그룹의 마우스의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 생존 분석. 생존율은 로그 순위 검정을 기반으로 하여 IMC-1121B 그룹과 비교하여 항-VEGFR2-AF hAb 그룹에서 유의하게 연장되었다(P =0.0284). (B) 각각의 그룹의 마우스의 체중. (C) 사망 후 각각의 마우스로부터 난소를 절단하였다. 백혈병이 없는 NSG 마우스로부터의 난소를 정상 대조군으로 사용하였다. (D) IMC-1121B 또는 항-VEGFR2-AF로 처리한 마우스에서 난소 부피. (E) 백혈병-종양 보유 마우스에서 림프절(LN) 변화의 형태측정 분석. 림프절로 전이된 백혈병 세포를 표시된 그룹의 마우스로부터 절단하였다(각각의 그룹에 있어서 n=9).
도 8은 VEGFR2-발현 벡터의 구성을 나타낸다. 인간 VEGFR2 도메인의 결실 또는 치환 돌연변이를 발현하는 구조물의 개략적인 제시. VEGFR2의 세포외 영역에는 7개의 면역글로불린-유사 도메인이 있으며, 이들은 I 내지 VII로 표지화된다. TM: 막관통 도메인.
도 9A 및 도 9B는 파지-디스플레이된 합성 scFv 라이브러리를 사용하여 VEGFR2에 대한 scFv의 선택 및 동정의 결과를 나타낸다. (A) R2S12에 대한 친화성 성숙. 파지-디스플레이된 R2S12-VL-CDR3 돌연변이성 scFv 라이브러리를 단백질 G 다이나비즈(DYNABEADS)(등록상표) 상에 고정화된 0.1 ㎍ VEGFR2-Fc와 함께 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 비즈를 1% 트윈(TWEEN)(상표명) 20을 함유하는 PBS로 4회 세척하였다. 4 라운드의 바이오패닝 후, 파지의 회수율은 제1 라운드의 것보다 929배만큼 증가되었다. (B) ELISA로 분석된 바와 같이, 표시된 농도의 R2S12 및 R2S12-AF scFv의 VEGFR2-Fc 단백질에 대한 결합 활성의 비교. 오차막대, SE.
도 10A 내지 도 10C는, 항-VEGFR2-AF hAb가 PC-3 세포에서 VEGF-A 매개된 세포 활성을 길항시킨다는 것을 나타낸다. (A) 표시된 처리를 한 PC-3 세포의 침윤 능력을 검사하기 위하여 트랜스웰 분석을 수행하였다. 상부 패널: 침윤 세포의 김자액(Giemsa) 염색. 100× 배율; 각각의 그룹에서 n=3; 스케일바, 150㎛. (B) 총 1×103개 PC-3 세포를 6-웰 플레이트에 파종하고, 100 ng/㎖ VEGF-A 및 10 ㎍/㎖의 NHIgG, IMC-1121B, 또는 항-VEGFR2-AF 항체로 또는 이들 없이 처리하였다. 플레이트를 7일 동안 인큐베이션하여 콜로니가 형성되게 하였다. 세포 콜로니를 크리스털 바이올렛 염색으로 시각화하였다. 크리스털 바이올렛 용액의 용리 후 각각의 웰에서 콜로니의 상대적인 수를 계산하였다. 각각의 그룹에서 n=3. (C) 상처 치유 분석. PC-3 세포를 2% FBS와 함께 RPMI 중에서 인큐베이션하고, 개별적으로 10 ㎍/㎖ NHIgG, IMC-1121B, 또는 항-VEGFR2-AF의 존재 또는 부재 하에서 100 ng/㎖ VEGF-A로 처리하여 자극하였다. 0, 16, 및 36시간의 인큐베이션 후에 이미지를 얻었다. 스케일바, 150㎛. 각각의 그룹에서 n=3. 오차막대, SE.
도 11A 및 도 11B는 약물 처치 후 종양 조직에서 혈관 내피 및 아폽토시스 세포의 조사를 나타낸다. 처치 기간 종료시 각각의 그룹의 마우스로부터 동결 종양 절편을 준비하였다. (A) 절편을 항-CD31 항체로 염색하여 종양 혈관을 시각화하였다. 이미지제이 소프트웨어를 사용하여 CD-31 양성 내피를 정량적으로 측정하였다. (B) TUNEL 분석법을 사용하여 동결 종양 절편 중 아폽토시스 세포를 분석하였다. 이미지제이 소프트웨어를 사용하여 아폽토시스 세포를 정량화하였다. 모든 세포의 표시를 위하여 절편을 DAPI로 염색하였다. n=5; 스케일바, 100㎛; 200× 배율; 오차막대, SE. **, P < 0.01; ***, P < 0.001.
도 12A 및 도 12B는 항체 처리 후 인간 백혈병 이종이식 마우스의 난소의 조직병리학적 표현형을 나타낸다. 식염수, NHIgG, IMC-1121B, 또는 항-VEGFR2-AF hAb로 처리 후 HL-60 종양-보유 마우스로부터 난소를 수확하였다. 조직을 슬라이싱하고 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하여, 백혈병 세포에 의한 침윤을 나타내었다. 항-VEGFR2-AF로 처리된 그룹은 더 적은 혈관을 나타내었으며, 일부 1차 난모세포를 유지하였다. 각각의 그룹에서 n=9. (A) 200× 배율에서의 난소. 스케일바, 500㎛. (B) 스케일바, 150㎛.
이제 본 발명의 다양한 실시형태가 상세히 기재된다. 도면을 참조할 때, 유사한 번호는 도면 전반에 걸쳐 유사한 구성요소를 나타낸다. 본 명세서의 기재에서 및 하기 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 단수 용어의 의미는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, 복수 대상을 포함한다. 또한, 본 명세서의 기재에서 및 하기 청구범위 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, "에서(in)"의 의미는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한, "에서" 및 "상에서(on)"를 포함한다. 추가적으로, 본 명세서에서 사용된 일부 용어는 하기에서 보다 구체적으로 정의된다.
정의
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로, 당업계에서, 본 발명의 문맥 내에서, 그리고 각각의 용어가 사용된 구체적인 문맥에서 통상적인 의미를 가진다. 본 발명을 기재하기 위해 사용된 특정 용어는 하기에서, 또는 본 명세서의 다른 부분에서 논의되어, 본 발명의 기재에 관하여 실시자에게 추가적인 지침을 제공한다. 편의를 위하여, 특정 용어는, 예를 들어 이탤릭체 및/또는 따옴표를 사용하여 강조될 수 있다. 강조표시의 사용은 용어의 범주와 의미에 전혀 영향을 미치지 않으며; 용어의 범주 및 의미는 강조되어 있는지 여부와 상관없이, 동일한 문맥에서 동일하다. 동일한 것이 다양한 방법으로 언급될 수 있음이 이해될 것이다. 결과적으로, 대체 언어 및 동의어가 본 명세서에서 논의된 용어 중 임의의 하나 이상에 사용될 수 있으며, 용어가 본 명세서에서 상술되거나 논의되었는지 여부에 대한 어떠한 특별한 중요성은 없다. 특정 용어에 대한 동의어가 제공된다. 하나 이상의 동의어에 대한 상술은 다른 동의어의 사용을 배제하는 것이 아니다. 본 명세서에서 논의된 임의의 용어의 예를 포함하여 본 명세서의 어느 곳에서 예의 사용은 단지 설명을 위한 것이며, 결코 본 발명 또는 임의의 예시된 용어의 범주 및 의미를 제한하는 것이 아니다. 마찬가지로, 본 발명은 본 명세서에 주어진 다양한 실시형태로 제한되지 않는다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함하여 본 문서가 우선할 것이다.
용어 "치료하는" 또는 "치료"는, 질환, 질환의 증상, 또는 이에 대한 소인을 치유, 경감, 완화, 처치, 개선, 또는 예방의 목적으로, 암, 또는 이와 같은 질환에 대한 증상 또는 소인을 가진, 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 화합물을 투여하는 것을 말한다. 이와 같은 대상체는 임의의 적합한 진단 방법의 결과를 기반으로 보건 전문가에 의해 식별될 수 있다.
"유효량"은 치료된 대상체에 대하여 치료 효과를 부여하는 데 필요한 활성 화합물의 양을 말한다. 유효 용량은, 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 투여 경로, 부형제 용법, 및 다른 치료적 처치와의 병용 가능성에 따라서 다양할 것이다.
용어 "화학요법제"는 암의 치료에 사용되는 것으로 알려진 약리학적 제제를 말한다.
미국 보건 복지부 식품의약국(U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration)에 의해 발행된 "성인 건강한 지원자에서 치료를 위한 임상 시험에서 안전한 시작 용량을 추산하는 산업 및 검토자를 위한 지침(Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)"은, "치료적 유효량"이 다음의 수식으로부터의 계산에 의해 얻어질 수 있음을 개시한다:
HED = 동물 용량(단위: ㎎/㎏)×(동물 중량(단위: ㎏)/인간 중량(단위: ㎏))0.33.
라무시루맵(ramucirumab)(즉, IMC-1121B) 상표명은 사이람자(CYRAMZA)(등록상표)이다.
인간 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2) 도메인 1 영역은 45번 아미노산 내지 110번 아미노산이고, 도메인 3은 224번 아미노산 내지 320번 아미노산이다.
서열 식별자:
QQLDDIPIT(R2S12AF 가변 경쇄 CDR3; 서열번호 73); VGFR2(인간 혈관 내피 성장 인자 수용체 2; 서열번호 74); GLMTKK (서열번호 75);
R2S12 및 R2S12-AF의 VH 영역은 동일함(서열번호 76):
QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFGSYTMNWVRQAPGKGLEWVASITSGSSYIFYTDSVKGRFTISRDNSRSSLFLQMNSLRAEDTAIYYCARGSASAFDIWGQGTMVTVSS;
R2S12의 VL 영역(서열번호 77):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDDIINYLNWYQQKPGEAPKLLIYDASILETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQ Y D IL P L TFGGGTKLEIK;
R2S12AF의 VL 영역(서열번호 78):
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDDIINYLNWYQQKPGEAPKLLIYDASILETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQ L D DI P I TFGGGTKLEIK;
R2S12 VL 및 R2S12AF VL 사이에서 상이한 아미노산 잔기는 상기에 밑줄이 그어져 있다.
인간 IgG1 불변 영역(서열번호 79); 마우스 VEGFR2 아미노산 서열(서열번호 80).
약어: 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR); Fab(단편, 항원-결합 영역); FV 영역(가변 영역).
실시예
본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 실시형태에 따른 예시적인 기구, 장치, 방법 및 이와 관련된 결과가 하기에서 제공된다. 독자의 편의를 위하여 실시예에서 표제 또는 부제를 사용할 수 있으며, 이는 결코 본 발명의 범주를 제한하지 않는 것임을 주목한다. 더욱이, 특정 이론이 본 명세서에서 제안되고 개시되지만; 결코 이들은 옳은지 틀린지 여부에 관계없이, 임의의 특정 이론 또는 작용 계획을 무시하고 본 발명이 본 발명에 따라 실시되는 한 본 발명의 범주를 제한해서는 안 된다.
재료 및 방법
파지-디스플레이된 scFv 라이브러리로부터 VEGFR2에 결합하는 파지의 단리
본 발명자들의 실험실에서 이전에 확립된 6×1010의 복잡성을 지닌 인간 천연 파지-디스플레이된 scFv 라이브러리를 선택에 사용하였다. scFv 라이브러리에서 단백질 G 다이나비즈(등록상표)(인비트로겐(Invitrogen))과의 비특이적 결합을 제거하고, 이어서 VEGFR2-Fc 재조합 단백질(알앤디 시스템즈(R&D Systems))-고정화된 다이나비즈(등록상표)와 함께 인큐베이션하였다. 0.1% 트윈(상표명) 20을 함유하는 PBS(PBST0.1)로 세척한 후, VEGFR2-Fc에 결합된 파지를 이. 콜라이(E. coli) TG1 세포로 감염시킴으로써 회수하였다. 파지 역가의 결정 후, 다음 라운드의 바이오패닝을 실행하였다.
경쟁적 VEGF 결합 분석
다양한 농도의 항-VEGFR2 scFv를 3 nM 인간 VEGF-A(페프로테크(Peprotech))와 혼합하고, 1 ㎍/㎖의 VEGFR2-Fc로 코팅되고 1% BSA 중에서 사전 차단된 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하고 PBST로 세척한 후, 항-VEGF mAb(진텍스(GeneTex)) 및 HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG를 사용하여 결합된 VEGF 분자를 검출하였다. OPD 및 H2O2의 혼합물을 이용하여 반응을 전개시켰고, 이어서 3 N HCl로 종결시켰다. 490 ㎚에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 흡광도를 결정하였다.
항- VEGFR2 scFv를 이용한 인간 종양 혈관 염색
국립 대만 대학 병원(National Taiwan University Hospital)의 병리과에서 인간 폐암 수술 표본을 얻었다. 동결 절편 슬라이드를 PBS로 세척한 다음, 파라폼알데하이드로 고정시켰다. PBS로 세척한 후, 슬라이드를 정상 말 혈청(벡터(Vector))로 차단시키고, scFv와 함께 인큐베이션하였다. PBST로 세척한 후, 토끼 항-E 태그 항체(베틸 라보라토리즈(Bethyl Laboratories)) 및 마우스 항-인간 CD31 mAb(BD)의 혼합물을 첨가하고, 슬라이드를 1시간 동안 인큐베이션하였다. 커버슬립을 FITC-표지화된 항-마우스 IgG, 로다민-표지화된 염소 항-토끼 IgG, 및 DAPI로 1시간 동안 염색하고, 도립 형광현미경(Inverted Fluorescence Microscope)(자이스(Zeiss), 악시오버트(Axiovert) 200M)을 사용하여 캡처하였다.
관 형성 분석
매트리젤(등록상표)(BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))을 4℃에서 밤새 해동시키고, 10 ㎕ 매트리젤(등록상표)을 사전 냉각한 μ-슬라이드 혈관신생(이비디(Ibidi))의 각각의 웰에 첨가한 다음; 슬라이드를 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 40 ng/㎖ VEGF-A 및 항-VEGFR2 항체를 포함하거나 포함하지 않는 0.2% 혈청을 함유하는 EBM-2에 굶주린 HUVEC(4×104개 세포)를 첨가하였다. 24시간의 인큐베이션 후, 올림푸스(OLYMPUS) 도립 현미경 및 디지털 카메라(올림푸스, DP-12)를 이용하여 내피 세포 관 형성을 평가하였다. 이미지제이 소프트웨어를 이용하여 관 길이 및 분기점을 정량적으로 평가하였다. 항체에 의한 억제 백분율을 경쟁자가 없는 VEGF-A-처리된 웰에서의 백분율로 표현하였다.
임상 데이터 세트 분석
미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI) 웹사이트에서의 유전자 발현 옴니버스(Gene Expression Omnibus)로부터 원 마이크로어레이 데이터를 다운로드하였다. 원 데이터를 정규화하였다. GEO 프로파일 GDS2545 / 1954_at / KDR을 전이성 전립선 암 분석에 사용하였다.
항-VEGFR2 인간 항체의 구성 및 발현
R2S12, R2S12-AF, 및 IMC-1121B의 VH 영역(Lu et al., (2003) "Tailoring in vitro selection for a picomolar affinity human antibody directed against vascular endothelial growth factor receptor 2 for enhanced neutralizing activity" J Biol Chem 278, 43496-43507)을 AgeI 및 NheI 부위를 사용하여, 신호 펩타이드 및 인간 IgG1 불변 영역을 가지는 변형된 발현 벡터 pcDNA5-FRT-감마1 내로 개별적으로 클로닝하였다. 추가적으로, R2S12, R2S12-AF, 및 IMC-1121B의 VL 영역을 AgeI 및 EcoRV 부위를 사용하여, 변형된 발현 벡터 p-카파-HuG 내로 개별적으로 클로닝하였다. 중쇄 및 경쇄 유전자-함유 플라스미드 둘 다를 양시스트론성(biscistronic) 벡터 내로 조합하여 단일 벡터 시스템을 생성하였다. 플라스미드를 플핀(FLPIN)(상표명)-CHO 세포(인비트로겐) 내에 형질감염시켰다. 2 내지 3주 후에 하이그로마이신 B를 사용하여 형질감염된 세포를 선택하여 안정적인 클론을 확립하고; 이들 클론을 SFM4CHO 배지(써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 중에서 배양하여 인간 항체를 생산하였다. 2주의 인큐베이션 후, 안정적인 클론의 배양 배지를 수집하고, 원심분리한 다음, 0.45㎛ 막을 통해 여과하였다. 그 다음, 항-VEGFR2 인간 IgG의 정제를 위하여 상청액에 단백질 G 컬럼 크로마토그래피(GE 헬스케어(GE healthcare))를 적용하였다. 용리액을 PBS로 투석한 후, 브래드포드(Bradford) 시약(써모 사이언티픽) 및 분광광도계를 사용하여 항체의 농도를 평가하였다.
항- VEGFR2 인간 IgG의 친화성 성숙
앞서 기재한 바와 같이 친화성 성숙을 실행하였다. 간단히 말해, 본 발명자들은 VL-CDR3의 7개의 아미노산 잔기에서 무작위 돌연변이가 도입된, R2S12의 VH 및 VL 유전자 레퍼토리로 구성된 합성 파지-디스플레이된 scFv 라이브러리를 구성하였다. VEGFR2-Fc-고정화된 다이나비즈(등록상표)에 대한 바이오패닝을 실행하기 위해 이러한 합성 라이브러리를 사용하였다. 4 내지 5 라운드의 엄격한 시험관내 바이오패닝 후, 양성 클론을 스크리닝하고 ELISA로 동정하였다. 각각의 부모 클론과의 비교를 통해 우수한 VEGFR2-결합 클론을 동정하였다.
결합 동역학의 측정
비아코어 T100(상표명)(GE 헬스케어)에서 표면 플라스몬 공명에 의해 항-VEGFR2 항체의 친화성 및 동력학을 측정하였다. VEGFR2-Fc 단백질을 비아코어 유동 세포에서 EDC- 및 NHS-활성화된 CM5 센서 칩에 커플링시킨 다음, 제조자의 지시에 따라서 에탄올아민으로 차단시켰다. 0.1 내지 100 nM의 범위의 항체 농도를 사용하여 5분 동안, 30 ㎕/분의 연속 흐름 하에서 회합 및 해리된 상을 모니터링하였다. 재생 완충액(0.2M NaCl, 10mM 글리신, pH 2.7)의 주입에 의해 재생을 실행하였다. 결합 상수를 결정하기 위하여, 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 소프트웨어(GE 헬스케어)를 사용하여 샘플 1:1 상호작용 모델에 센서그램을 전체적으로 적용하였다.
동물 모델
국내 및 국제법 및 정책에 따른 대만 중앙연구원의 실험동물관리위원회(Academia Sinica Institutional Animal Care and Utilization Committee)의 지침에 따라서 동물 및 이의 치유와 관련된 절차를 수행하였다. 비-비만 당뇨병-중증 복합성 면역결핍(NOD/SCID) 마우스를 국립 실험 동물 센터(National Laboratory Animal Center)(대만)로부터 구입하였다. 6주령 수컷 마우스의 등쪽 옆구리에 2×106개 PC-3 세포를 피하 주입함으로써 인간 전립선 암 이종이식 종양 모델을 개발하였다. 일반 건강에 대하여 동물을 매일 모니터링하고, 매주 2회 체중을 측정하였다. 슬라이드 캘리퍼스를 이용하여 종양 크기를 측정하고, 길이×폭2×0.52로 계산하였다. 크기가 일치하는 종양(50 ㎣)을 가지는 마우스를 상이한 치료 그룹에 무작위로 할당하고(n=9), 꼬리 정맥을 통하여 정상 인간 IgG(NHIgG; 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)), IMC-1121B, 항-VEGFR2-AF 항체, 또는 동등한 부피의 PBS로 정맥 주사하였다. 매주 2회 4주 동안 20 ㎎/㎏의 항체 용량을 주사하였다. 병용 요법에 있어서, 매주 1회 3주 동안 5 ㎎/㎏의 용량으로 도세탁셀(시노팜 타이완(ScinoPharm Taiwan))을 또한 정맥 투여하였다. 실험 종료시, 종양 조직 및 내장 기관을 제거하고 조직학적 분석을 위해 고정시켰다.
전신 백혈병 생착 연구를 위하여, NOD/SCID/IL2Rγ-/-(NSG) 마우스를 세포 및 유기체 생물학 연구소의 동물 센터, 대만 중앙연구원(Animal Center of the Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica)으로부터 입수하였다. 6주령된 암컷에게 꼬리 정맥을 통해 5×106개 HL-60 세포를 정맥 주사하였다. 일반 건강에 대하여 동물을 매일 모니터링하고, 매주 2회 체중을 측정하였다. 종양 접종 3일 후, 매주 2회 20 ㎎/㎏ NHIgG, IMC-1121B, 항-VEGFR2-AF 항체, 또는 동등한 부피의 PBS의 정맥 주사에 대하여 마우스를 무작위로 선택하였다(n=9). 독성의 징후에 대하여 마우스를 매일 관찰하고, 생존 시간을 기록하였다. 처치 종료 시점에서, 각각의 마우스의 내장 기관을 제거하고, 추가의 조직학적 검사를 위해 고정시켰다.
세포 배양
론자(LONZA)로부터 HUVEC(human umbilical vascular endothelial cell; 인간 제대 혈관 내피 세포)를 구입하였다. 미국 균주은행(American Type Culture Collection; ATCC(등록상표))으로부터 HL-60(인간 전골수구성 백혈병), PC-3(인간 전립선 암), EA.hy926(인간 제대 정맥 세포주), 및 293T(인간 배아 신장 세포) 세포주를 입수하였다. hESC-H9(인간 배아 줄기 세포) 계통을 위셀(WiCell)로부터 구입하였고, FLP-IN(상표명)-CHO 세포주를 인비트로겐으로부터 입수하였다. 내피 성장 배지(EBM-2, 론자) 중에서 HUVEC를 배양하였다. RPMI 1640 배지(깁코(GIBCO)(상표명)) 중에서 HL-60 및 PC-3 세포를 배양하였다. DMEM(깁코(상표명)) 중에서 EA.hy926 및 293T 세포를 배양하였다. 햄 F12 배지(Ham's F12 medium) 중에서 FLP-IN(상표명)-CHO 세포를 유지시켰다. 앞서 기재한 바와 같이 hESC-H9 계통을 배양하였다. 37℃에서 5% CO2가 있는 가습된 인큐베이터에서 10% 소태아혈청(FBS; 깁코(상표명)) 및 100 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신(P/S; 깁코(상표명))이 보충된 조건 배지 중에서 모든 세포주를 유지시켰다.
ELISA에 의한 항- VEGFR2 파지 클론의 스크리닝
선택된 파지를 ELISA 스크리닝에 의해 추가로 검사하였다. 4℃에서 밤새 0.1M 중탄산나트륨 중에서 1 ㎍/㎖의 VEGFR2-Fc, Met-Fc(알앤디), 또는 BSA(시그마(Sigma)) 단백질로 96-웰 플레이트를 코팅하였다. 2시간 동안 실온에서 PBS(w/v) 중에서 1% BSA로 차단한 후, 70개의 무작위로 선택된 파지 클론을 1% BSA 중 1:2 희석액으로 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. PBST로 세척한 다음, 1시간 동안 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-접합된 마우스 항-M13 파지 항체(GE)의 1:2000 희석액과 함께 플레이트를 인큐베이션하였다. PBST로 세척한 후, 15분 동안 퍼옥시다제 기질인 오르토-페닐렌다이아민(OPD; 시그마)과 H2O2와 함께 비색계 반응을 전개시킨 다음, 3N HCl을 첨가시킴으로써 종결시켰다. 마이크로플레이트 판독기(스펙트라맥스(SpectraMax), 모레큘러 디바이스(Molecular Devices))를 사용하여 490 ㎚에서의 흡광도를 결정하였다. 양성 클론의 플라스미드 DNA를 단리하고 pCANTAB5 서열결정 프라이머 세트를 사용하여 서열결정하였다.
플라스미드 구성
써모 사이언티픽으로부터 전장 VEGFR2 서열을 암호화하는 인간 cDNA 클론(NM_002253.2)을 구입하고, 하기 구조물에 대한 PCR 주형으로 사용하였다. 신호 펩타이드, 막관통 도메인, 및 절단된 세포질 도메인을 가지는 다양한 길이의 VEGFR2 세포외 영역을 다음과 같이 구성하였다(또한, 도 8 참조): Met1 내지 Leu813 잔기 유래의 도메인 1 내지 7로 구성된, VEGFR2의 전장 세포외 영역인 VEGFR2(1-7); Ala111 내지 Leu813 잔기 유래의 도메인 2 내지 7을 포함하는, VEGFR2(2-7); Ser208 내지 Leu813 잔기 유래의 도메인 3 내지 7을 포함하는, VEGFR2(3-7); Phe321 내지 Leu813 잔기 유래의 도메인 4 내지 7을 포함하는, VEGFR2(4-7); VEGFR2(del2-3), 여기서 VEGFR2의 도메인 2 및 3은 도메인 1(Met1 내지 Glu140) 및 도메인 4 내지 7(Phe321 내지 Leu813)을 암호화하는 2개의 단편의 결찰에 의해 결실됨; VEGFR2(del3), 여기서 VEGFR2의 도메인 3은 도메인 1 내지 2(Met1 내지 Arg222) 및 도메인 4 내지 7(Phe321 내지 Leu813)을 암호화하는 2개의 단편의 결찰에 의해 결실됨; VEGFR2의 전장 세포외 영역의 7개 모든 도메인(Met1 내지 Leu813)을 포함하는 돌연변이 구조물인 VEGFR2(M1), 여기서 도메인 3의 259NWEYPS264는 마우스 상동체의 261TWHSPP266로 대체됨; 및 VEGFR2의 전장 세포외 영역의 7개 모든 도메인(Met1 내지 Leu813)을 포함하는 돌연변이 구조물인 VEGFR2(M2), 여기서 도메인 3의 279TQSGSEM285은 마우스 상동체의 281PFPGTVA287로 대체됨.
가용성 scFv의 발현 및 정제
이. 콜라이 균주 HB2151을 항-VEGFR2 scFv 파지 클론 PC-8, 12, 28, 29, 또는 45로 감염시키고, 박테리아의 주변세포질 추출물을 준비하였다. 제조자의 지시에 따라서 단백질 L 아가로스 컬럼(써모 사이언티픽)을 사용하여 주변세포질 추출물 중 가용성 scFv를 정제하였다. 정제된 scFv를 PBS로 완전히 투석하고, 환원성 SDS-PAGE 다음 쿠마시 블루 염색에 의해 분석하였다.
증식 분석
총 1×104개 HUVEC를 96-웰 플레이트 상에 밤새 파종하였다. 그 다음, 세포를 무혈청 EBM-2 중에서 밤새 굶겼다. 이어서, 저혈청 EBM-2(0.2%) 중 40 ng/㎖ VEGF와 함께 8 ㎍/㎖의 선택된 scFv를 웰에 첨가한 다음, 48시간 동안 인큐베이션하였다. 제조자의 지시에 따라서 MTT 시약(인비트로겐)을 사용하여 세포 증식을 평가하였다.
유동세포계수 분석법
약 1×104개 HUVEC를 4℃에서 1시간 동안 FACS 완충액(1% 소태아혈청을 함유하는 PBS) 중에서 선택된 항-VEGFR2 파지 클론과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 FACS 완충액으로 세척한 후, 이들 세포를 우선 1시간 동안 4℃에서 마우스 항-M13 파지 Ab와 함께 인큐베이션한 다음, 30분 동안 4℃에서 R-피코에리트린-접합된 염소 항-마우스 IgG(잭슨 이뮤노 리서치)와 함께 인큐베이션하였다. FACSCantoII(BD)를 이용하여 유동세포계수법을 실행하고, FACS 디바 소프트웨어(FACS Diva software; BD)를 이용하여 방출 형광 강도를 측정하여 결합 친화성을 정량적으로 비교하였다.
렌티바이러스 -매개 짧은 헤어핀 RNA( shRNA ) 녹다운
shRNA 서열, 즉 ccggcgctgacatgtacggtc tat gctcgagca tag accgta cat gtcagcgttttttg(서열번호 70)를 암호화하고, 인간 VEGFR2를 표적화하는, 렌티바이러스 벡터 pLKO_TRCN0000199129를 국립 RNAi 중요 시설(National RNAi Core Facility)(대만 중앙연구원, 대만)로부터 입수하였다. 반딧불이 루시퍼라제에 대한 shRNA를 암호화하는 pLKO_TRCN0000072249 벡터를 음성 대조군으로 사용하였다. 바이러스 생산을 위하여, pLKO 벡터, 외피(envelope) 플라스미드 pMD.G, 및 포장 플라스미드 pCMV-△R8.91을 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)(등록상표) 2000(인비트로겐)을 사용하여 293T 세포 내로 10:1:9의 비율로 공동 형질감염시켰다. 형질감염 후 18시간 째에, 배양 배지를 새로운 DMEM + 10% FBS 및 1% BSA로 대체하였다. 인큐베이션 24 및 48시간 후에 바이러스 입자를 함유하는 상청액을 수확하였다.
렌티바이러스 형질도입 전날 60 ㎜ 접시에 1×106개 세포의 밀도로 PC-3 세포를 파종하였다. 8 ㎍/㎖ 폴리브렌(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))이 보충된 바이러스-포함 배지를 PC-3 세포에 첨가하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 3일 동안 2 ㎍/㎖ 퓨로마이신을 함유하는 성장 배지 중에서의 인큐베이션에 의해 형질도입된 세포를 선택하였다.
면역조직화학 염색
앞서 기재한 바와 같이 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. 간략하게, 절편을 탈파라핀화하고 재수화시킨 다음, 트릴로지(Trilogy) 완충액(셀 마크(Cell Marque))을 사용하여 항원 회수를 부수적으로 실행하였다. 그 다음, 메탄올 중 3% H2O2 중에서 30분 동안 인큐베이션함으로써 내인성 퍼옥시다제 활성을 차단시켰다. PBS로 세척한 후, 30분 동안 1% BSA와 함께 절편을 인큐베이션하여 비특이적 결합을 차단시켰다. 그 다음, 1시간 동안 실온에서 항-VEGFR2 항체(55B11, 셀 시그널링)와 함께 절편을 인큐베이션하였다. PBST0.1로 세척한 후, 제조자의 지시에 따라서 중합체-기반 슈퍼 센서티브 IHC 검출 시스템(바이오제넥스(Biogenex), 샌 라몬 소재)으로 절편을 처리하였다. 발색 제거 다이아미노벤지딘 하이드로클로라이드(DAB)(0.02%)를 이용한 색상 전개에 의해 호스래디쉬 퍼옥시다제 활성을 검출하였다. 헤마톡실린(시그마-알드리치)으로 슬라이드를 가볍게 대비염색하고, 퍼마운드(피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))로 고정시켰으며, 광학 현미경으로 검사하였다.
웨스턴블롯 분석
앞서 기재한 바와 같이, 표준 프로토콜을 사용하여 웨스턴블롯을 실행하였다. 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)로부터 1차 항체를 구입하고, 단백질 검출을 위하여 1,000배 희석액으로 사용하였으며; 사용된 항체는 다음과 같다: 항-VEGFR2(클론 55B11), 항-포스포-VEGFR2(Tyr1175; 클론 19A10), 항-FAK, 항-포스포-FAK(Tyr397; 클론D20B1), 항-p42/44 MAPK, 항-포스포-p42/44 항-MAPK(Thr202/Tyr204; 클론D13.14.4E), 항-Akt, 및 항-포스포-Akt(Ser473).
동결 조직 절편의 면역형광 분석
종양 혈관 연구를 위하여, 샘플을 OCT 중에 고정시켰다. 냉동 블록을 50㎛ 절편으로 자르고, 동결 종양 조직 절편을 1% 파라폼알데하이드로 고정시킨 다음, 0.1% 트리톤(TRITON)(상표명)-X 100으로 침투성으로 만든 후, 정상 말 혈청(벡터)으로 차단시킨 다음, 1시간 동안 실온(RT)에서 1차 항체(래트 항-마우스 CD31(PECAM-1); BD 바이오사이언시스)의 1:100 희석액과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 조직 절편을 실온에서 1시간 동안 알렉사(Alexa) 549-접합된 염소 항-래트 항체(인비트로겐)와 함께 인큐베이션하였다. 핵을 DAPI로 염색한 다음, 절편을 형광 봉입(mounting) 용액으로 봉입시켰다. 자이스 악시오버트 200M 현미경을 사용하여 면역형광 이미지를 획득하였다. 픽셀 영역 계수에 의해 CD31 내피 세포의 양성 영역을 정량화하고 저전력 배율 하에 이미지제이 소프트웨어를 사용하여 DAPI 염색으로 정규화하였다.
말단 데옥시뉴클레오타이딜트랜스퍼라제 -매개 dUTP 닉(nick) 말단 표지화(TUNEL)
동결된 종양 조직 절편을 1% 파라폼알데하이드로 고정시키고, 0.1% 트리톤(상표명)-X 100으로 침투성으로 만든 후, 37℃에서 1시간 동안 말단 데옥시뉴클레오타이딜트랜스퍼라제-매개 dUTP 닉 말단 표지화 반응 혼합물(로쉐 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics))과 함께 인큐베이션하였다. PBS로 3회 세척한 후, 슬라이드를 FITC-항-DIG 항체(1: 2000) 및 DAPI(1: 500)와 함께 인큐베이션하였다. 슬라이드를 봉입 용액으로 봉입시키고, 형광 현미경 하에서 시각화하였다. 슬라이드를 3명의 개인이 독립적으로 검사하였다. TUNEL-양성 세포가 있는 영역을 픽셀 영역 계수에 의해 정량화하고, 이미지제이 소프트웨어를 사용하여 DAPI 염색에 대해 정규화하였다.
헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색
종양 및 표시된 조직을 마우스로부터 절단하고 4% 파라폼알데하이드로 밤새 고정시켰다. 표준 절차에 따라서 표본의 고정 및 가공을 실행하였다. 표본을 파라핀 중에 포매시키고 50㎛ 절편으로 잘랐다. 재수화된 파라핀-포매된 조직 절편을 마이어(Mayer's) 헤마톡실린 용액(와코(Wako))으로 5분 동안 염색하고, 1 내지 2분 동안 물로 세척하였다. 그 다음, 슬라이드를 에오신 용액(와코)으로 10분 동안 염색하였다. 조직을 티슈 그노스틱스(Tissue Gnostics) 현미경으로 시각화하였다.
정량적 RT- PCR
트리졸RNA(TrizolRNA) 분리 시약(인비트로겐)을 사용하여 총 RNA 추출을 실행하였다. 이어서, 제조자의 지시에 따라서, 올리고(dT) 프라이머(퍼멘타스(Fermentas)) 및 슈퍼 스크립트(Super Script) III 역전사효소(인비트로겐)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR을 통해 VEGFR2 cDNA를 증폭시키기 위하여 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 다음과 같다: VEGFR2-F: gaacatttgggaaatctcttgc(서열번호 71); VEGFR2-R: cggaagaacaatgtagtctttgc(서열번호 72). 라이트사이클러480(LightCycler480) 시스템(로쉐 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))을 사용하여 정량적 PCR을 실행하였다. VEGFR2의 전사 수준을 동일한 샘플의 GAPDH의 전사 수준에 대해 정규화하였다. 각각의 샘플에 따라서 비율 값을 계산하였다. 반응은 3중으로 실행하였다.
결과
VEGFR2에 결합하는 파지-디스플레이된 scFv의 동정
파지-디스플레이된 인간 천연 scFv 라이브러리를 사용하여 VEGFR2 재조합 단백질에 결합하는 파지를 단리하였다. 4 라운드의 친화성 선택(바이오패닝) 후, 결합된 파지의 역가는 3,455배만큼 증가하였다(도 1A). ELISA 스크리닝 및 DNA 서열결정을 통하여, 본 발명자들은 VEGFR2-Fc에 고도로 결합하지만, c-Met-Fc 대조 단백질에는 결합하지 않는 5가지 별개의 파지 클론(R2PC8, R2PC12, R2PC28, R2PC29, R2PC45; 표 1)을 동정하였다(도 1B). 그 다음, 본 발명자들은 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 FACS 분석을 사용하여 5가지 모든 클론이 세포 표면 상에서 VEGFR2에 결합하는 능력을 가지며; 5가지 클론 중에서, R2PC12가 가장 큰 반응성을 나타낸다는 것을 확인하였다(도 1C). 표 1은 항-VEGFR2 scFv의 VH 및 VL 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
V H 도메인
FR1
(서열번호)		 CDR1
(서열번호)		 FR2
(서열번호)		 CDR2
(서열번호)
R2PC8 qvqlvqsggglvkpggslrlscaas (26) GFTFSSYS
( 1)		 mswvrqapgkglewvss (27) ISSSSSYI
(2)
R2PC12 qvnlresggglvkpggslrlscaas (34) GFTFGSYT
(6)		 mnwvrqapgkglewvas (35) ITSGSSYI
(7)
R2PC28 evqlvesggalvqpggslrlscvgs (42) EFTFSHYN
(11)		 lhwvrqapgkglewlav (43) ISDDGRNK
(12)
R2PC29 qvqlqqsgaemkksgssvkvsckas (50) GGNFISKG
(16)		 iswvrqapgqglew㎎g (51) IIPLFGTG
(17)
R2PC45 qvnlresgggvvqpgrslrlscaas (58) GFTFSSYA
(21)		 mhwvrqapgkglewvav (59) ISYDGSNK
(22)
FR3 CDR3 FR4 패밀리
R2PC8 yyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyyc (28) ARSTDAFDI
(3)		 wgqgtmvtvss (29) V H 3
R2PC12 fytdsvkgrftisrdnsrsslflqmnslraedtaiyyc (36) ARGSASAFDI
(8)		 wgqgtmvtvss (37) V H 3
R2PC28 yygdsvkgrftisrdnskntlylqmnglraedtavyyc (44) ARVPTVWRGGVYDI
(13)		 wgqgtmvtvss (45) V H 3
R2PC29 nyaqkfqgrvtitadestttvylqltsltpedtamyfc
(52)		 ATADVDYSDSLEAFDM
(18)		 wgqgtmvtvss
(53)		 V H 1
R2PC45 yyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyyc (60) AREQDYGSSSGDAFDI
(23)		 wgqgtmvtvss (61) V H 3
V L 도메인
FR1 CDR1 FR2 CDR2
R2PC8 divmtqspsslsasvgdrvtitcras (30) QRISNY
(4)		 lnwyqhksgedpklliy (31) AAS
(Ala Ala Ser)
R2PC12 diqmtqspsslsasvgdrvtitckas (38) DDIINY
(9)		 lnwyqqkpgeapklliy (39) DAS
(Asp Ala Ser)
R2PC28 eivltqspatlslspgeratlscras (46) QSVGSY
(14)		 lawyqqrpgqpprlliy (47) DAS
(Asp Ala Ser)
R2PC29 divmtqspsslsasvgdrvtitcras (54) QSINNY
(19)		 lnwyqqkpgkapnlliy (55) GAS
(Gly Ala Ser)
R2PC45 diqmtqspsslsasvgdrvtitcras (62) QRISSY
(24)		 lnwyqqkpgkapklliy (63) DAS
(Asp Ala Ser)
FR3 CDR3 FR4 패밀리
R2PC8 slqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyyc (32) QQYDRYPPT
(5)		 fgqgtkleik (33) V κ 1
R2PC12 iletgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyyc (40) QQYDILPLT
(10)		 fgggtkleik (41) V κ 1
R2PC28 nratgvaarfsgsgsgtdftltidsleaedaatyyc (48) HQSSSLPRT
(15)		 fgqgtkleik
(49)		 V κ 3
R2PC29 slqsgvpsrfrgsgsgtdftltisslqpedfatyyc (56) QQSYSTPL
(20)		 fgqgtkleik
(57)		 V κ 1
R2PC45 nlqsgvpsrfsgsgsgtdftltinglqpddfaiyfc (64) hqsysappt
(25)		 fgqgtkveik
(65)		 V κ 1
VH 및 VL 도메인 둘 다에 대한 상보성-결정 영역 1 내지 3(CDR1-3) 및 프레임워크 영역 1 내지 4(FW1-4)가 표시되어 있다. V 도메인 패밀리는 IMGT 데이터베이스에 의해 정렬되었다.
이어서, 본 발명자들은, R2S8, R2S12, R2S28, R2S29, 및 R2S45로 명명된 5가지 VEGFR2-결합 파지 클론으로부터 가용성 scFv 단백질을 생성하였다(도 1D). 인간 폐암 수술 표본에서 종양 혈관 내피에 대한 항-VEGFR2 scFv의 결합 능력을 면역형광 염색 분석의 사용을 통해 조사하였다. 본 발명자들은, 항-VEGFR2 scFv의 형광 신호가 내피 세포 마커 CD31과 명백하게 공존한다는 것을 관찰하였으며(도 1E), 이는 이들 scFv가 종양 혈관구조를 특이적으로 인지할 수 있음을 시사한다.
항- VEGFR2 scFv는 VEGF -A/ VEGFR2 상호작용 및 VEGF -A-유도된 VEGFR2 인산화를 길항시켰다
항-VEGFR2 scFv가 VEGFR2에 대한 VEGF-A 결합을 차단할 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 고정화된 VEGFR2에의 결합에 대하여 증가하는 농도의 scFv가 VEGF-A와 경쟁하는 플레이트-기반 경쟁 결합 분석을 실행하였다. VEGF-A의 VEGFR2와의 상호작용은 R2S8 및 R2S12에 의해 강하게 억제되었으며, 이 때 반수 최대 억제 농도(IC50)는 각각 7.03 및 3.26 nM인 반면, R2S28 및 R2S29는 비교적 약한 경쟁 능력을 나타내었다(도 2A). 다음으로 본 발명자들은, scFv가 HUVEC에서 VEGFR2의 VEGF-A-매개된 활성화를 길항시킬 수 있는지 여부를 조사하였으며; R2S8 및 R2S12는 VEGF-A에 의해 VEGFR2의 티로신 인산화를 명백하게 억제하였고, R2S12는 가장 강한 억제 활성을 나타내었다(도 2B).
항-VEGFR2 scFv의 결합 에피토프의 동정
항-VEGFR2 scFv를 담당하는 결합 도메인을 맵핑하기 위하여, 본 발명자들은 신호 펩타이드 및 막관통 도메인으로 이루어지는 일련의 VEGFR2 결실 돌연변이체를 생성하였다(도 8). 이들 단백질 돌연변이체는 293T 세포에서 이소성으로 발현되었고, R2S8, R2S12, 및 R2S28을 이용한 면역형광 염색에 의해 검사되었다(표 2). 본 발명자들은, R2S28이 VEGFR2(1-7)를 발현하는 세포에 결합하지만, VEGFR2(2-7) 또는 VEGFR2(4-7)를 발현하는 세포에는 결합하지 않는다는 것을 발견하였으며, 이는 VEGFR2의 도메인 1이 R2S28 결합에 필수적이라는 것을 시사한다. R2S8 및 R2S12는 VEGFR2(1-7) 및 VEGFR2(2-7)를 발현하는 293T 세포에 결합하지만, 도메인 3이 없는 구조물, 예를 들어 VEGFR2(4-7), VEGFR2(del2-3), 또는 VEGFR2(del3)를 발현하는 세포에는 결합하지 않으며, 이는 이들의 결합 에피토프가 도메인 3 내에 위치한다는 것을 추가로 나타낸다. 표 2는 항-VEGFR2 scFv의 에피토프 맵핑을 나타낸다.
　 R2S8 R2S12 R2S28
VEGFR2(1-7) + + +
VEGFR2(2-7) + + -
VEGFR2(3-7) nd* nd* nd*
VEGFR2(4-7) - - -
VEGFR2(del2-3) - - +
VEGFR2(del3) - - +
VEGFR2(M1) - - +
VEGFR2(M2) + + +
*nd, 구조물이 발현되지 않았기 때문에 결합이 결정되지 않음.
또한, 본 발명자들은, 중화 scFv인 R2S8 및 R2S12가 뮤린 VEGFR2 단백질과 교차 반응을 하지 않는다는 것을 발견하였다. 인간과 뮤린 VEGFR2 사이의 아미노산 서열 정렬은 단지 67% 동일성을 가지는 도메인 3이 VEGFR2의 세포외 영역의 7개 도메인 중에서 가장 다양하다는 것을 밝혀내었다. 따라서, 본 발명자들은 인간 VEGFR2의 도메인 3에서 R2S8 및 R2S12의 별개의 에피토프가 뮤린 VEGFR2에서 디스플레이되지 않는다고 추측하였다. 인간 및 마우스의 도메인 3의 비교로, 30개의 잔기가 상이하다는 것, 및 이들 잔기가 클러스터로 그룹화되어 있다는 것을 나타내었다. R2S8 및 R2S12 결합에 중요한 도메인 3에서 아미노산 잔기를 동정하기 위하여, 본 발명자들은 다음과 같이, 돌연변이유발에 대한 2가지 주요 클러스터(M1 및 M2)를 선택하였다: 인간 NWEYPS(서열번호 66) 및 TQSGSEM(서열번호 67) 잔기는 각각 마우스 TWHSPP(서열번호 68) 및 PFPGTVA(서열번호 69) 잔기로 대체되었다(도 2C). 면역형광 염색의 결과는, R2S8 및 R2S12가 VEGFR2-M1 돌연변이체 단백질을 발현하는 293T 세포를 인식하지 않는다는 것을 나타낸다. 대조적으로, VEGFR2의 M2 영역에서의 돌연변이는 R2S8 및 R2S12에의 결합에 영향을 미치지 않았다(표 2).
본 발명자들은 앞서 보고된 결정 구조 정보 및 본 발명자들의 돌연변이유발 데이터로부터 VEGFR2 도메인 3의 분자 모델을 수립하였다. 리본 및 표면 모델은, NWEYPS(서열번호 66) 잔기(M1 영역)가 VEGFR2 도메인 3의 β-스트랜드 및 중간 표면에 국한한다는 것을 나타낸다(도 2D 및 도 2E). 중화 항-VEGFR2 항체인 IMC-1121B 및 6.64의 접촉 잔기 및 결합 표면은 VEGFR2 도메인 3 상에 위치한다(도 2C 및 도 2F). 본 발명자들은, M1 영역이 IMC-1121B 및 6.64 항체의 결합 에피토프에 근접한다는 것을 관찰하였다. IMC-1121B 항체의 2개의 결합 잔기, 즉 Asn259 및 Glu261은 M1 영역에 위치하는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명자들의 결과는, R2S8 및 R2S12의 결합 에피토프가 IMC-1121B 및 6.64 항체의 결합 에피토프와 상이할 가능성이 있다는 것을 시사한다.
R2S12의 친화성 성숙을 실행하여 더 높은 결합 활성을 가지는 항- VEGFR2 - AF 인간 항체를 생성하였다
높은 친화성을 가지는 중화 항체는 치료 효능에 중요하다. R2S12가 검사된 scFv의 가장 큰 결합 및 길항 활성을 나타내는 것으로 입증되었으므로, 본 발명자들은 파지 디스플레이-기반 친화성 성숙을 사용하여 scFv의 결합 활성을 추가로 개선시켰다. 4 라운드의 엄격한 시험관내 선택 후, 우수한 결합 활성을 가지는 클론(R2S12AF)을 동정하였다(도 9A 및 도 9B). R2S12-AF의 VL-CDR3 내의 4개 잔기는 R2S12-AF의 부모 클론인 R2S12와 상이하다(도 3A). scFv 구성형태는 짧은 혈청 반감기(대략 3.5시간) 및 인간 이펙터 작용을 촉발하는 것과 관련된 불능으로 인하여 제한된 임상 용도를 가지는 것으로 나타났다. 이러한 과제를 극복하기 위하여, 본 발명자들은 R2S12 및 R2S12-AF scFv의 암호화 서열을 인간 IgG1 백본으로 분자적으로 조작하여 각각 항-VEGFR2 및 항-VEGFR2-AF 완전 인간 항체(hAb)를 형성하였다.
본 발명자들은 비아코어 T100(상표명)을 사용하여 VEGFR2에 대한 2가지 인간 항체의 친화성을 분석하였다. 항체-항원의 동력학 파라미터의 측정은, 항-VEGFR2-AF hAb가 이의 부모 클론 항-VEGFR2 hAb(K d = 2.1 nM; 도 3B)에 비하여 VEGFR2에 대한 결합 친화성에서 8배 증가 및 nmol 이하/ℓ 친화성 상수(K d = 0.264 nM)를 가진다는 것을 나타내었다. 본 발명자들은 개별 항체에 의한 VEGF-A/VEGFR2 결합의 파괴를 정량적으로 평가하기 위하여 고상 경쟁 분석을 실행하였다. 도 3C는, VEGFR2에 대한 VEGF-A 결합의 IC50 값이 항-VEGFR2-AF hAb에 대하여 0.88 nM이고, 항-VEGFR2 hAb에 대하여 1.87 nM이며, IMC-1121B에 대하여 1.42 nM인 것을 나타낸다. 이러한 데이터는, 항-VEGFR2-AF hAb가 VEGF/VEGFR2 상호작용의 차단 시 IMC-1121B보다 우수하다는 것을 나타낸다. HUVEC의 FACS 분석의 결과는, 세포-표면 VEGFR2에 대하여 항-VEGFR2-AF hAb가 IMC-1121B보다 더 강한 결합을 나타냄을 추가로 입증한다(도 3D).
항-VEGFR2 - AF hAb는 VEGFR2 -매개 신호전달 경로의 활성화를 억제하고, HUVEC 에서 모세혈관 구조 형성을 방해한다
VEGFR2-AF hAb의 항-혈관신생 잠재력을 밝히기 위하여, 본 발명자들은 HUVEC 성장, 이동, 및 관 형성에 대한 항-VEGFR2-AF hAb의 영향을 분석하였다. 본 발명자들은, 각각 MTT 및 상처-치유 분석을 사용하여 항-VEGFR2-AF hAb가 VEGF-A-유도된 HUVEC 증식 및 이동을 억제한다는 것을 발견하였다. 내피 세포 관 형성(혈관신생에서 중요한 단계)에 대한 항-VEGFR2-AF hAb의 영향을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 항-VEGFR2-AF hAb를 가지는 VEGF-A의 부재 또는 존재 하에서 매트리젤(등록상표) 층 상에서 HUVEC를 검사하였다(도 4A). 도립 현미경 사진기를 사용하여 모세혈관-유사 구조로 이동하고 조직화하는 내피 세포의 능력을 평가하고 정량화하였다. 본 발명자들은, 관 길이 및 분지점 수의 측정을 기반으로 하여, VEGF-A-촉발된 모세혈관-유사 구조를 억제함에 있어서 항-VEGFR2-AF hAb가 IMC-1121B보다 더 효과적이라는 것을 증명하였다(도 4A).
항-VEGFR2-AF hAb의 항-혈관신생 특성의 기초가 되는 분자 메커니즘을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 웨스턴블롯팅에 의해 신호전달 분자 및 경로를 검사하였다(도 4B). 본 발명자들은, 항-VEGFR2-AF hAb가 VEGFR-2의 VEGF-A-유도된 인산화 및 이의 하류 신호전달 분자, 예컨대 Akt, MAPK, 및 FAK를 효과적으로 감소시키는 것을 발견하였다. 특히, 항-VEGFR2-AF-처리 그룹에서 인산화된 VEGFR2, Akt, 및 MAPK의 수준이 IMC-1121B-처리 그룹에서보다 더 낮은 반면, FAK 인산화는 어느 한 항체로 처리함으로써 단지 약간 감소되었다(도 4B). 결과는, 항-VEGFR2-AF hAb가 혈관 내피 세포 혈관신생의 몇 가지 필수 단계를 상당하 억제한다는 것을 나타내며, 이는 이러한 항체가 생체내에서 항-혈관신생 잠재력을 가질 수 있다는 것을 시사한다.
항- VEGFR2 - AF hAb는 VEGFR2 -발현 인간 전립선 암 세포에서 VEGF -A-유도된 세포 작용을 억제한다
본 발명자들은 종양 성장을 억제함에 있어서 항-VEGFR2-AF hAb의 치료 효능을 연구하기 위한 모델로서 인간 전립선 암 세포주 PC-3을 선택하였다. 본 발명자들은 정량적 역전사-PCR(qRT-PCR) 분석을 실행하여 PC-3 세포에서 VEGFR2의 내인성 발현을 조사하였다(도 5A). HUVEC, EA.hy926, 및 hESC-H9 세포는 VEGFR2 mRNA의 높은 발현을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 따라서 양성 대조군으로 사용되었다. 본 발명자들은 VEGFR2 mRNA가 PC-3 세포에서 용이하게 검출 가능하지만, 음성 대조군 293T 세포에서는 거의 검출 가능하지 않았다는 것을 발견하였다.
PC-3 세포 상에서 VEGF-A/VEGFR2의 기능적 중요성을 특징규명하기 위하여, 본 발명자들은 VEGF-A 처리시 PC-3 세포 활성을 분석하였다. 본 발명자들은, VEGF-A로의 처리가, 증식, 콜로니 형성, 및 침윤 능력을 포함하여 PC-3 세포의 다양한 세포 활성을 향상시킬 수 있다는 것을 발견하였다(도 5B). 본 발명자들은 렌티바이러스-매개 shRNA를 가지는 VEGFR2-녹다운 PC-3 세포(shVEGFR2; 도 5C)를 확립하였고, 대조군 shRNA로 감염된 PC-3 세포(shLuc; 도 5D)와 비교하여 VEGFR2의 녹다운이 PC-3 세포의 증식, 콜로니 형성, 및 침윤 능력을 감소시킨다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 항-VEGFR2-AF hAb로 PC-3 세포를 처리하고, VEGF-A-유도된 세포 활성이 항-VEGFR2-AF hAb에 의해 억제될 수 있다는 것을 입증하였다(도 10A 내지 도 10C). 따라서, 이들 데이터는, VEGF/VEGFR2 축이 PC-3 세포의 클론형성 및 종양형성 능력에 결정적이라는 것을 나타낸다.
본 발명자들은 공중이 이용가능한 관련 마이크로어레이 데이터 세트에서 VEGFR2 발현 패턴을 조사하였다. 본 발명자들은, 전이성 전립선 종양에서 VEGFR2 전사체의 양이 원발성 종양에서의 양보다 더 높다는 것을 발견하였다(도 5E). 본 발명자들은 상업적 항-VEGFR2 항체를 사용하여 인간 전립선 암 조직 어레이를 염색하였으며, VEGFR2가 종양 세포에서 검출 가능하고, 이의 발현 수준이 등급 I과 비교하여 등급 III 전립선 선암에서 상승된다는 것을 나타내었다(도 5F). 정상 전립선 조직 표본에서, VEGFR2는 혈관 내피에 존재하지만, 정상 전립선 세포에는 존재하지 않는다.
인간 전립선 암 이종이식편에서 항- VEGFR2 - AF의 치료 효능
본 발명자들은 PC-3 이종이식 전립선 종양 모델을 사용하여 항-VEGFR2-AF hAb 대 IMC-1121B의 생체내 항종양 활성을 밝혔다. 도세탁셀은 전이성 성선 파괴-저항성 전립선 암을 가지는 환자를 위한 1차 화학요법제이다. 따라서, 본 발명자들은 또한 도세탁셀 및 항-VEGFR2-AF hAb 또는 IMC-1121B를 병용하는 치료 효과를 조사하였다. PC-3 이종이식편을 보유하는 NOD/SCID 마우스에 IMC-1121B, 항-VEGFR2-AF hAb, 도세탁셀, 항-VEGFR2-AF hAb + 도세탁셀, 또는 IMC-1121B + 도세탁셀을 투여하였다(도 6A). 38일째에, 종양 성장 감소가 항-VEGFR2-AF hAb + 도세탁셀의 조합물로 처리한 마우스의 경우 90%, IMC-1121B + 도세탁셀의 조합물로 처리한 마우스의 경우 82%, 도세탁셀로 처리한 마우스의 경우 70%, 항-VEGFR2-AF hAb로 처리한 마우스의 경우 52%, 그리고 IMC-1121B로 처리한 마우스의 경우 45%에 이르렀다(도 6b). 마우스의 건강 상태의 대리 지표로서 체중을 사용하였다(도 6c). 항-VEGFR2-AF hAb 및 IMC-1121B 그룹은 NHIgG 그룹과 비교하여 처리 기간 동안 체중에서 유의한 변화를 나타내지 않았다. 도세탁셀의 단독 처리는 현저한 체중 감소를 유발하였다(약 20%). 다른 항체와 조합하여 도세탁셀을 처리한 마우스는 도세탁셀을 단독 처리한 마우스와 유사한 양의 체중을 손실하였으며, 이는 항-VEGFR2-AF hAb 및 IMC-1121B가 도세탁셀-유도 독성을 증가시키지 않음을 나타낸다.
종양 중량을 측정하였으며, 종양 중량은 종양 부피와 일치하는 것으로 확인되었다(도 6d 및 도 6e). 본 발명자들은 종양 혈관을 검출하기 위하여 항-CD31 항체를 사용하고 아폽토시스 세포를 동정하기 위하여 TUNEL 분석법을 사용함으로써 각각의 그룹에서 종양 조직을 추가로 검사하였다. 본 발명자들은 종양 혈관 밀도를 감소시키고 암 세포 아폽토시스를 증가시킬 때 항-VEGFR2-AF hAb가 IMC-1121B보다 우수하다는 것을 발견하였다(도 11A 및 도 11B). 이러한 결과는, 종양 성장을 약화시킬 때 항-VEGFR2-AF hAb가 IMC-1121B보다 더 효과적이고, 마우스에서 인간 전립선 종양의 치료에 있어서 항-VEGFR2-AF hAb가 도세탁셀의 유효성을 상당히 향상시킨다는 것을 나타낸다.
항- VEGFR2 - AF hAb는 HL -60 백혈병 이종이식편을 보유하는 마우스의 생존을 연장시켰다
VEGF-A/VEGFR2 경로는 고형 종양에서뿐만 아니라, 액상 종양, 예컨대 백혈병 또는 림프종에서도 결정적인 작용을 한다. 이전의 연구들은, 마우스 모델에서 IMC-1121B가 HL-60 백혈병 성장을 억제하고, 생존을 연장시킨다는 증거를 제공하였다. IMC-1121B의 항-백혈병 효과를 항-VEGFR2-AF hAb와 비교하기 위하여, 본 발명자들은 NSG 마우스에서 HL-60 백혈병 이종이식 모델을 개발하였다. 마우스에 5×106개 HL-60 세포를 정맥 주사하였고, 3일 후 IMC-1121B, 항-VEGFR2-AF, NHIgG, 또는 PBS로 처리하였다. 도 7A에 나타낸 바와 같이, 모든 PBS- 또는 NHIgG-처리된 마우스는 36일 내에 죽었으나; VEGFR2에 대한 항체로 처리한 백혈병-보유 마우스는 생존 시간에서 현저한 연장을 나타내었다. 항-VEGFR2-AF hAb로 처리한 마우스는, IMC-1121B로 처리한 마우스(56일; 중앙값 = 43일)보다 더 오래 생존하였다(70일; 중앙값 = 53일). 그룹 간에 체중에 있어서의 유의한 변화는 발견되지 않았다(도 7B).
모든 마우스의 사후 분석 조직병리학적 검사는, 각각의 그룹에서 마우스의 간, 비장, 심장, 또는 신장에서 어떠한 명백한 병리학적 변화가 발견되지 않았다는 것을 나타내었다. 백혈병-보유 마우스의 난소는 정상 난소와 비교하여 팽창되었다(도 7C). H&E 염색은, 난소가 전이성 백혈병 세포에 의해 침윤되었다는 것을 나타내었다(도 12A 및 도 12B). 항-VEGFR2-AF hAb-처리된 군의 평균 난소 부피는 IMC-1121B-처리 군의 평균 난소 부피보다 상당히 더 작았다(도 7D).
또한, 항-VEGFR2-AF hAb로 처리된 9마리의 마우스 중의 1마리에서 백혈병 침윤이 있는 림프절을 확인한 반면, 백혈병 침윤이 있는 림프절은 IMC-1121B로 처리된 9마리의 마우스 중의 5마리에 존재하였다(도 7E).
종양 내피 상에서 VEGFR2의 항-VEGFR2-AF hAb-매개 표적화는 VEGF-A-유도된 신호전달을 방해할 뿐만 아니라, 항체-의존성 세포-매개(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC) 또는 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity: CDC)을 촉발하여 표적화된 세포를 직접 사멸시키며, 이는 현재 항-혈관신생 치료법을 향상시킬 수 있다.
종양 세포는 또한 VEGFR2를 발현하므로, 항-VEGFR2-AF hAb는 종양 혈관 및 악성 세포 둘 다에 대하여 이중 표적화 및 억제 효과를 발휘할 수 있다. 이중 표적화 능력은 암 치료법에 대하여 상승 효과를 가질 수 있다. 본 발명자들은 완전 인간 항체인 항-VEGFR2-AF를 제조하였으며, 이는 VEGFR2에 대하여 우수한 결합을 나타내어 이 수용체의 활성을 길항시킨다. IMC-1121B와 유사하게, 항-VEGFR2-AF hAb는 인간 VEGFR2에는 특이적으로 결합하였으나, 뮤린 VEGFR2에는 결합하지 않았다. IMC-1121B와 비교하여, 항-VEGFR2-AF hAb는, VEGF-A/VEGFR2 축-매개 신호전달을 중단시킴으로써, 시험관내 및 생체내에서 더 큰 항종양 효능을 제시하였다. 본 발명자들은, 항-VEGFR2 항체가 전립선 암의 치료에서 도세탁셀의 치료 효능을 향상시킬 수 있다는 것을 최초로 입증한다. 연구결과는, 항-VEGFR2-AF hAb가 혈관신생 및 VEGFR2-발현 종양 세포를 동시에 그리고 직접적으로 억제함으로써 암 치료에 대한 치료 항체로서 잠재적으로 사용될 수 있다는 것을 시사한다.
요약하면, FDA-승인된 항-VEGFR2 인간 항체 IMC-1121B(라무시루맵)와 비교하여, 항-VEGFR2-AF hAb는 현저하게 우수한 활성을 가지며, 시험관내에서 VEGF-A-매개 모세혈관 구조 형성을 억제하였다. 본 발명자들은 인간 전립선 암 세포주(PC-3) 및 백혈병 세포주(HL-60)에서 VEGFR2 발현을 관찰하고, VEGFR2 발현이 인간 전립선 암의 악성 및 전이와 연관이 있다는 것을 입증하였다. PC-3-유래 이종이식 마우스 모델에서, 항-VEGFR2-AF hAb로의 처리(단일요법 또는 도세탁셀과의 병용)는 IMC-1121B로의 처리보다 더 효과적으로 종양 성장 및 혈관신생을 억제하였다. HL-60-유래 백혈병을 가지는 마우스에서, 생존 연장 및 백혈병 세포의 난소 및 림프절로의 전이 감소에 있어서 항-VEGFR2-AF hAb는 IMC-1121B보다 더 상당한 효능을 나타내었다.
본 발명의 예시적인 실시형태의 전술한 설명은 단지 예시 및 설명의 목적으로 제시된 것이며, 이는 포괄적인 것이거나 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 상기 교시내용에 비추어 다수의 변형 및 변화가 가능하다. 본 명세서에 언급되고 논의된 모든 참고문헌은 본 명세서에 참고로 그 전문이 포함되며, 각각의 참고문헌이 개별적으로 참고로 포함된 것과 동일한 정도로 포함되어 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ACADEMIA SINICA <120> ANTI-VEGFR2 HUMAN ANTIBODY FOR ANTI-ANGIOGENIC AND TARGETED CANCER THERAPY <130> WO2016/168159 <150> PCT/US2016/027057 <151> 2016-04-12 <150> US 62/147,344 <151> 2015-04-14 <160> 80 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R2PC8 VH CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R2PC8 VH CDR2 <400> 2 Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R2PC8 VH CDR3 <400> 3 Ala Arg Ser Thr Asp Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R2PC8 VL CDR1 <400> 4 Gln Arg Ile Ser Asn Tyr 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R2PC8 V L CDR3 <400> 5 Gln Gln Tyr Asp Arg Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> R2PC12 VH CDR1 <400> 6 Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr Thr 1 5 <210> 7 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Ala Ser Arg Lys 1010 1015 1020 Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu 1025 1030 1035 Lys Asn Val Val Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile 1040 1045 1050 Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro 1055 1060 1065 Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr 1070 1075 1080 Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile 1085 1090 1095 Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu 1100 1105 1110 Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro 1115 1120 1125 Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met Tyr Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp 1130 1135 1140 His Gly Glu Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Ser Glu Leu Val Glu 1145 1150 1155 His Leu Gly Asn Leu Leu Gln Ala Asn Ala Gln Gln Asp Gly Lys 1160 1165 1170 Asp Tyr Ile Val Leu Pro Ile Ser Glu Thr Leu Ser Met Glu Glu 1175 1180 1185 Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro Thr Ser Pro Val Ser Cys Met Glu 1190 1195 1200 Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala 1205 1210 1215 Gly Ile Ser Gln Tyr Leu Gln Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro 1220 1225 1230 Val Ser Val Lys Thr Phe Glu Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu 1235 1240 1245 Val Lys Val Ile Pro Asp Asp Asn Gln Thr Asp Ser Gly Met Val 1250 1255 1260 Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys Thr Leu Glu Asp Arg Thr Lys Leu 1265 1270 1275 Ser Pro Ser Phe Gly Gly Met Val Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser 1280 1285 1290 Val Ala Ser Glu Gly Ser Asn Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly 1295 1300 1305 Tyr His Ser Asp Asp Thr Asp Thr Thr Val Tyr Ser Ser Glu Glu 1310 1315 1320 Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ile Glu Ile Gly Val Gln Thr Gly Ser 1325 1330 1335 Thr Ala Gln Ile Leu Gln Pro Asp Ser Gly Thr Thr Leu Ser Ser 1340 1345 1350 Pro Pro Val 1355 <210> 75 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Gly Leu Met Thr Lys 1 5 <210> 76 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH region of R2S12 or R2S12-AF <400> 76 Gln Val Asn Leu Arg Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Ser Gly Ser Ser Tyr Ile Phe Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Ser Ser Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Ala Ser Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 77 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL region of R2S12 <400> 77 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Asp Ile Ile Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ile Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 78 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL region of R2S12AF <400> 78 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp Asp Ile Ile Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ile Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Asp Ile Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 79 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 80 <211> 1340 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 80 Met Glu Ser Lys Ala Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Phe Cys Val Glu 1 5 10 15 Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Gly Asp Phe Leu His Pro Pro 20 25 30 Lys Leu Ser Thr Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Leu Ala Asn Thr Thr 35 40 45 Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro 50 55 60 Asn Ala Gln Arg Asp Ser Glu Glu Arg Val Leu Val Thr Glu Cys Gly 65 70 75 80 Gly Gly Asp Ser Ile Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Arg Val Val 85 90 95 Gly Asn Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Ser Tyr Arg Asp Val Asp Ile 100 105 110 Ala Ser Thr Val Tyr Val Tyr Val Arg Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile 115 120 125 Ala Ser Val Ser Asp Gln His Gly Ile Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys 130 135 140 Asn Lys Thr Val Val Ile Pro Cys Arg Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn 145 150 155 160 Val Ser Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly 165 170 175 Asn Arg Ile Ser Trp Asp Ser Glu Ile Gly Phe Thr Leu Pro Ser Tyr 180 185 190 Met Ile Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp 195 200 205 Glu Thr Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Val Ile 210 215 220 Leu Ser Pro Pro His Glu Ile Glu Leu Ser Ala Gly Glu Lys Leu Val 225 230 235 240 Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Leu Asp Phe Thr 245 250 255 Trp His Ser Pro Pro Ser Lys Ser His His Lys Lys Ile Val Asn Arg 260 265 270 Asp Val Lys Pro Phe Pro Gly Thr Val Ala Lys Met Phe Leu Ser Thr 275 280 285 Leu Thr Ile Glu Ser Val Thr Lys Ser Asp Gln Gly Glu Tyr Thr Cys 290 295 300 Val Ala Ser Ser Gly Arg Met Ile Lys Arg Asn Arg Thr Phe Val Arg 305 310 315 320 Val His Thr Lys Pro Phe Ile Ala Phe Gly Ser Gly Met Lys Ser Leu 325 330 335 Val Glu Ala Thr Val Gly Ser Gln Val Arg Ile Pro Val Lys Tyr Leu 340 345 350 Ser Tyr Pro Ala Pro Asp Ile Lys Trp Tyr Arg Asn Gly Arg Pro Ile 355 360 365 Glu Ser Asn Tyr Thr Met Ile Val Gly Asp Glu Leu Thr Ile Met Glu 370 375 380 Val Thr Glu Arg Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu Thr Asn Pro 385 390 395 400 Ile Ser Met Glu Lys Gln Ser His Met Val Ser Leu Val Val Asn Val 405 410 415 Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ala Leu Ile Ser Pro Met Asp Ser Tyr 420 425 430 Gln Tyr Gly Thr Met Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr Ala Asn Pro 435 440 445 Pro Leu His His Ile Gln Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu Ala Cys Ser 450 455 460 Tyr Arg Pro Gly Gln Thr Ser Pro Tyr Ala Cys Lys Glu Trp Arg His 465 470 475 480 Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys Ile Glu Val Thr Lys Asn Gln 485 490 495 Tyr Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys Thr Val Ser Thr Leu Val Ile 500 505 510 Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr Lys Cys Glu Ala Ile Asn Lys 515 520 525 Ala Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser Phe His Val Ile Arg Gly Pro 530 535 540 Glu Ile Thr Val Gln Pro Ala Ala Gln Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val 545 550 555 560 Ser Leu Leu Cys Thr Ala Asp Arg Asn Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp 565 570 575 Tyr Lys Leu Gly Ser Gln Ala Thr Ser Val His Met Gly Glu Ser Leu 580 585 590 Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Ala Leu Trp Lys Leu Asn Gly Thr 595 600 605 Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile Leu Ile Val Ala Phe Gln Asn 610 615 620 Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr Val Cys Ser Ala Gln Asp Lys 625 630 635 640 Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Leu Val Lys Gln Leu Ile Ile Leu Glu 645 650 655 Arg Met Ala Pro Met Ile Thr Gly Asn Leu Glu Asn Gln Thr Thr Thr 660 665 670 Ile Gly Glu Thr Ile Glu Val Thr Cys Pro Ala Ser Gly Asn Pro Thr 675 680 685 Pro His Ile Thr Trp Phe Lys Asp Asn Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser 690 695 700 Gly Ile Val Leu Arg Asp Gly Asn Arg Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val 705 710 715 720 Arg Lys Glu Asp Gly Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Cys Asn Val Leu 725 730 735 Gly Cys Ala Arg Ala Glu Thr Leu Phe Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu 740 745 750 Lys Thr Asn Leu Glu Val Ile Ile Leu Val Gly Thr Ala Val Ile Ala 755 760 765 Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu Val Ile Val Leu Arg Thr Val Lys Arg 770 775 780 Ala Asn Glu Gly Glu Leu Lys Thr Gly Tyr Leu Ser Ile Val Met Asp 785 790 795 800 Pro Asp Glu Leu Pro Leu Asp Glu Arg Cys Glu Arg Leu Pro Tyr Asp 805 810 815 Ala Ser Lys Trp Glu Phe Pro Arg Asp Arg Leu Lys Leu Gly Lys Pro 820 825 830 Leu Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gln Val Ile Glu Ala Asp Ala Phe Gly 835 840 845 Ile Asp Lys Thr Ala Thr Cys Lys Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys 850 855 860 Glu Gly Ala Thr His Ser Glu His Arg Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys 865 870 875 880 Ile Leu Ile His Ile Gly His His Leu Asn Val Val Asn Leu Leu Gly 885 890 895 Ala Cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu Met Val Ile Val Glu Phe Cys 900 905 910 Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu Arg Gly Lys Arg Asn Glu Phe 915 920 925 Val Pro Tyr Lys Ser Lys Gly Ala Arg Phe Arg Gln Gly Lys Asp Tyr 930 935 940 Val Gly Glu Leu Ser Val Asp Leu Lys Arg Arg Leu Asp Ser Ile Thr 945 950 955 960 Ser Ser Gln Ser Ser Ala Ser Ser Gly Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu 965 970 975 Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Ser Glu Glu Leu Tyr Lys Asp Phe 980 985 990 Leu Thr Leu Glu His Leu Ile Cys Tyr Ser Phe Gln Val Ala Lys Gly 995 1000 1005 Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala 1010 1015 1020 Ala Arg Asn Ile Leu Leu Ser Glu Lys Asn Val Val Lys Ile Cys 1025 1030 1035 Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Ile Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr Val 1040 1045 1050 Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu 1055 1060 1065 Thr Ile Phe Asp Arg Val Tyr Thr Ile Gln Ser Asp Val Trp Ser 1070 1075 1080 Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser Leu Gly Ala Ser Pro 1085 1090 1095 Tyr Pro Gly Val Lys Ile Asp Glu Glu Phe Cys Arg Arg Leu Lys 1100 1105 1110 Glu Gly Thr Arg Met Arg Ala Pro Asp Tyr Thr Thr Pro Glu Met 1115 1120 1125 Tyr Gln Thr Met Leu Asp Cys Trp His Glu Asp Pro Asn Gln Arg 1130 1135 1140 Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Glu His Leu Gly Asn Leu Leu Gln 1145 1150 1155 Ala Asn Ala Gln Gln Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Val Leu Pro Met 1160 1165 1170 Ser Glu Thr Leu Ser Met Glu Glu Asp Ser Gly Leu Ser Leu Pro 1175 1180 1185 Thr Ser Pro Val Ser Cys Met Glu Glu Glu Glu Val Cys Asp Pro 1190 1195 1200 Lys Phe His Tyr Asp Asn Thr Ala Gly Ile Ser His Tyr Leu Gln 1205 1210 1215 Asn Ser Lys Arg Lys Ser Arg Pro Val Ser Val Lys Thr Phe Glu 1220 1225 1230 Asp Ile Pro Leu Glu Glu Pro Glu Val Lys Val Ile Pro Asp Asp 1235 1240 1245 Ser Gln Thr Asp Ser Gly Met Val Leu Ala Ser Glu Glu Leu Lys 1250 1255 1260 Thr Leu Glu Asp Arg Asn Lys Leu Ser Pro Ser Phe Gly Gly Met 1265 1270 1275 Met Pro Ser Lys Ser Arg Glu Ser Val Ala Ser Glu Gly Ser Asn 1280 1285 1290 Gln Thr Ser Gly Tyr Gln Ser Gly Tyr His Ser Asp Asp Thr Asp 1295 1300 1305 Thr Thr Val Tyr Ser Ser Asp Glu Ala Gly Leu Leu Lys Met Val 1310 1315 1320 Asp Ala Ala Val His Ala Asp Ser Gly Thr Thr Leu Arg Ser Pro 1325 1330 1335 Pro Val 1340

Claims (14)

  1. 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    인간 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2; 서열번호 74)의 도메인 1 또는 도메인 3 내부에 위치한 에피토프에 대하여 특이적 결합 친화성을 갖되,
    상기 VEGFR2의 상기 도메인 3 내부의 상기 에피토프는 서열번호 74의 아미노산 잔기 250번 내지 270번 사이에 위치하는, 단리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 에피토프는 NWEYPS(서열번호 66)의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항에 있어서, 중쇄 가변 영역(VH) 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, VH는 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하고, VL은 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하되,
    (i) 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 4, Ala Ala Ser, 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (ii) 상기 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3은 각각 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 9, Asp Ala Ser, 및 서열번호 10 또는 73의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (iii) 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 서열번호 11, 서열번호 12, 및 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 14, Asp Ala Ser, 및 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (iv) 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 서열번호 16, 서열번호 17, 및 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 19, Gly Ala Ser, 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (v) 상기 VH CDR1, VH CDR2 및 VH CDR3은 각각 서열번호 21, 서열번호 22, 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하고; 상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 24, Asp Ala Ser, 및 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3은 각각 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하고;
    상기 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3은 각각 서열번호 9, Asp Ala Ser, 및 서열번호 73의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    (a) 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH); 및
    (b) 서열번호 77 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)
    을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 단쇄 가변 단편, Fab 단편, 또는 Fv 단편인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제3항, 및 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 완전 인간 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 치료적 유효량의 제7항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용 가능한 비히클 또는 담체를 포함하는 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 치료적 유효량의 화학요법제를 더 포함하는, 조성물.
  10. 종양 성장, 종양 혈관신생의 억제 및/또는 암 세포 세포독성의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장, 종양 혈관신생을 억제하고/억제하거나 암 세포 세포독성을 유도하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제7항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제9항의 조성물의 용도.
  11. 종양 성장, 종양 혈관신생의 억제 및/또는 암 세포 세포독성의 유도를 필요로 하는 대상체에서 종양 성장, 종양 혈관신생을 억제하고/억제하거나 암 세포 세포독성을 유도하기 위한 의약의 제조에 있어서의, 제4항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도로서, 상기 항체는 완전 인간 항체인, 용도.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 종양 또는 암은 췌장암, 유방암, 폐암, 백혈병, 전립선암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 용도.
  13. 하기 단계들을 포함하는, 생물학적 샘플에서 종양 혈관 내피 세포 또는 암 세포 상에서 VEGFR2의 존재를 검출하는 방법:
    (i) 제1항 내지 제3항, 및 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생물학적 샘플과 혼합하는 단계;
    (ii) 상기 생물학적 샘플 중 종양 혈관 내피 세포 또는 암 세포 상의 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 VEGFR2를 상호작용시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및
    (iii) 상기 복합체 중 상기 종양 혈관 내피 세포 또는 암 세포 상에서 VEGFR2의 존재를 검출하는 단계.
  14. 하기 단계들을 포함하는, 생물학적 샘플에서 종양 혈관 내피 세포 또는 암 세포 상에서 VEGFR2의 존재를 검출하는 방법:
    (i) 제4항 또는 제5항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생물학적 샘플과 혼합하는 단계;
    (ii) 상기 생물학적 샘플 중 종양 혈관 내피 세포 또는 암 세포 상의 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 VEGFR2를 상호작용시켜 복합체를 형성시키는 단계; 및
    (iii) 상기 복합체 중 상기 종양 혈관 내피 세포 또는 암 세포 상에서 VEGFR2의 존재를 검출하는 단계.
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