KR101906558B1 - Tspan8에 특이적인 신규 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TSPAN8 (tetraspanin 8)에 특이적으로 결합하는 신규 항체 및 그의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, TSPAN8의 LEL (large extracellular loop)에 특이적으로 결합하는 항체, 상기 항체의 제조방법, 상기 항체를 포함하는 암 및 또는 암전이 억제용 조성물,　상기 항체 또는 조성물을 투여하여 암 및/또는 암전이를 억제하는 방법, 상기 항체를 포함하는 암 및 또는 암전이를 예방 또는 치료하기 위한 조성물, 상기 항체 또는 조성물을 투여하여 암 및/또는 암전이를 예방 또는 치료하는 방법, 상기 항체를 포함하는 암 및/또는 암전이의 진단을 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트, 상기 조성물을 이용한 암을 진단하는 방법, TSPAN8의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 암 및 또는 암전이 억제용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 및/또는 암전이 키트, 상기 조성물을 이용한 암 및/또는 암전이 억제 또는 암을 치료하는 방법, 및 암 및/또는 암전이를 억제하는 항체에 대한 에피토프로 TSPAN8의 LEL의 용도에 관한 것이다.

Description

TSPAN8에 특이적인 신규 항체 및 이의 용도 {Novel Antibody Specific For TSPAN8 and Uses Thereof}
본 발명은 TSPAN8 (tetraspanin 8)에 특이적으로 결합하는 신규 항체 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 TSPAN8의 LEL (large extracellular loop)에 특이적으로 결합하는 항체, 항체를 제조하는 방법, 항체를 포함하는 암 및/또는 암 전이의 억제를 위한 조성물, 항체 또는 조성물을 투여하여 암 및/또는 암 전이를 억제하는 방법, 항체를 포함하는 암 및/또는 암 전이를 예방 또는 치료하기 위한 조성물, 항체 또는 조성물을 투여하여 암 및/또는 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법, 항체를 포함하는 암 및/또는 암 전이 진단용 조성물, 조성물을 포함하는 암 진단용 키트, 조성물을 사용하여 암을 진단하는 방법, TSPAN8의 발현을 억제하기 위한 물질을 포함하는 암 및/또는 암 전이를 억제하기 위한 조성물, 조성물을 포함하는 암 및/또는 암 전이용 키트, 조성물을 사용하여 암 및/또는 암 전이를 억제하거나 치료하는 방법 및 암 및/또는 암 전이의 억제를 위한 항체를 위해 TSPAN8의 LEL을 에피토프로 사용하는 용도에 관한 것이다.
전이는 전세계적으로 암 발병률과 사망률의 주요 원인이다. 지난 수십년 동안, 소화합물과 치료용 항체의 급속한 개발을 통해 암 치료에서 현저한 향상이 있어 왔다. 그러나, 현재의 방법으로 종양 전이를 성공적으로 극복하지는 못하였다. 따라서, 치료 효과를 높이기 위한 합리적인 방법은 종양 전이와 연관성 있는 신규 치료 표적의 발견 및 이러한 인자를 구체적 표적으로 하는 치료제의 후속 개발에 달려있다.
테트라스파닌 슈퍼패밀리는 4개의 막관통 도메인, SEL (small extracellular loop) 및 LEL (large extracellular loop)를 포함하는 2개의 세포외 루프 및 3의 시토졸 도메인을 포함하는 구성원으로 구성되어 있다.
현재까지의 증거는 테트라스파닌이 종양의 진행에 밀접하게 관련되어 있음을 시사하고 있다. 테트라스파닌 CD20이 악성 인간 B 세포에서 지배적으로 과발현된다. CD20에 대한 재조합 마우스/인간 키메라 단클론 항체인 리툭시맙은 비호지킨 B-세포 림프종 환자를 치료하기 위해 임상적으로 사용되어 왔고, CD20에 대한 몇가지 추가적인 치료용 항체가 현재 임상 개발중이다. 다른 테트라스파닌인 CD81은 간세포 암종 (hepatocellular carcinoma)에서 과발현되고, 또한 C형 간염 바이러스 유도 간암에 대한 수용체로서 중요한 역할을 하고 있다. 테트라스파닌 CD151의 과발현은 또한 침윤성 유방암, 전립선암 및 피부 편평세포 암종 등 몇 가지 암 종류에서 관찰되고 있다. 특히 유방암의 경우, CD151은 잠재적으로 신규 예후 마커 역할을 하는 것으로 확인되었기에, 치료를 위한 표적을 제공하고 있다.
TSPAN8 (CO-029)은 또한 테트라스파닌 슈퍼 패밀리의 구성원이다. 이전 연구는 D6.1A의 쥐 상동체와 약 70%의 서열 상동성을 가지는 인간 TSPAN8의 생물학적 기능을 제시한 바 있다. D6.1A이 전이 관련 테트라스파닌 분자로 분류 되었다는 보고가 있었다. D6.1A과 α6β4 인테그린의 연관성이 세포 운동성 및 간 전이의 형성을 위해 중요하다는 것이 보고된 바 있다. 더 최근에, 몇몇 보고에 의하면 TSPAN8이 종양 전이에 직접 연관되어 있음을 보여주었다.
TSPAN8의 상향 조절은 간세포 암종, 대장암 및 췌장 선암에서 관찰되었다. 안정적으로 형질감염된 TSPAN8을 포함하는 비전이성 간세포 암종 세포주의 직교이방성 이식 (orthotropic implantation)을 통해 간암 세포의 혈행성 간내 전이에 TSPAN8이 관여함을 보여주었다.
이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 종양 진행에서 TSPAN8의 임상적 의의를 확인하고, 암 및/또는 암 전이를 효과적으로 억제할 수 있는 TSPAN8에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하였다.
기술적 배경 항목에 공개된 상기 정보는 본 발명의 배경에 대한 이해를 높이기 위한 것이며, 따라서 이미 당업자에게 알려진 종래 기술을 형성하지 않는 정보를 포함할 수도 있다.
본 출원의 발명자들은 임상 샘플 및 암세포주를 사용하여, 증식에 영향을 미치거나 내피세포에 결합하지 않고, 암 세포의 침윤을 조절하는데 TSPAN8이 중요함을 확인하였다.
또한, 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 본 출원의 발명자들은 TSPAN-LEL에 특이적인 재조합 인간 항체를 개발하고, 암세포 상의 세포 표면 TSPAN8을 하향 조절하여 종양의 침윤을 특이적으로 저해할 수 있는지 이들 분자의 효능을 평가하였다.
마지막으로, 동물 전이 모델을 사용하여, 본 출원의 발명자들은 종양 전이 억제와 관련하여 개발된 항체들의 생체 내에서의 효능을 입증하였다. 요약하면, 본 연구를 통해 개발한 인간 항체의 진단 및 치료 가능성을 뒷받침하기 위한 정보 뿐 아니라, 종양 전이에 대한 치료 표적으로서 TSAPN8-LEL에 대하여 더 이해하기 위한 증거를 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TSPAN8 (tetraspanin 8)에 특이적으로 결합하는 항체로, TSPAN8의 LEL (large extracellular loop)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, TSPAN8에 특이적으로 결합하는 항체로, 서열번호 7로 표시되는 TSPAN8 아미노산 서열 중 110번 내지 205번의 아미노산 단편을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, TSPAN8에 특이적으로 결합하는 항체로, 서열번호 9로 표시되는 TSPAN8 내 LEL의 아미노산 서열 중 31번 내지 96번의 아미노산 단편을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 벡터 또는 핵산을 포함하는 숙주세포를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 숙주세포를 배양하여 핵산 발현에 의해 항체를 생산하는 것을 포함하는, 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 약물이 결합된 상기 항체를 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체를 포함하는 암 또는 암 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 상기 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 및/또는 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체를 포함하는 암 및/또는 암 전이 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이 억제용 조성물의 제조를 위한 상기 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이 억제에 사용하기 위한 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체 또는 상기 약학 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 및/또는 암 전이 억제 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 항체를 포함하는 암 및/또는 암 전이 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이에 대한 진단용 조성물을 제조하기 위한 상기 항체의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이의 in-vitro 진단을 위한 항체를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 진단용 조성물을 포함하는 암 및/또는 암 전이에 대한 진단 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이 의심 개체로부터 분리된 생물학적 샘플 중 항원-항체 복합체를 통해 TSPAN8을 검출하는 것을 포함하는 암 및/또는 암 전이 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이를 억제하는 항체의 생산을 유도할 수 있는 에피토프로 기능하는 분리된 TSPAN8의 LEL을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이를 억제하는 항체의 생산을 유도할 수 있는 에피토프로서 분리된 TSPAN8 LEL의 N-말단 또는 C-말단을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이를 억제하는 항체의 생산을 유도할 수 있는 에피토프로서 TSPAN8의 LEL 중 110번 내지 205번의 아미노산 단편을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 폴리펩티드를 에피토프로 사용하여 바이오패닝하는 것을 포함하는 TSPAN8에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, TSPAN8의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 암 및/또는 암 전이를 억제하기 위한 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 암 및/또는 암 전이를 억제하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 및/또는 암 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 암 및/또는 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 암 및/또는 암 전이 억제용 조성물의 제조를 위한 TSPAN8의 발현을 억제하는 물질의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이 억제에 사용하기 위한 TSPAN8의 발현을 억제하는 물질을 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 TSPAN8의 LEL 및 Fc 융합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 암 및/또는 암 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 TSPAN8의 LEL 및 Fc 융합 단백질을 제공한다.
기타 본 발명의 구성 및 실시예는 아래의 상세한 설명 및 출원중인 청구항으로부터 더욱 명확하게 될 것이다.
TSPAN8의 LEL이 암 및 암전이에 중요한 역할을 한다는 신규한 발견에 기초하여, 본 발명은 암 및 / 또는 암 전이 억제에서 TSPAN8의 LEL에 대한 신규 항체의 기능을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 암 및 / 또는 암 전이를 억제할 수 있는 신규 표적 영역을 제공한다. 또한, 본 발명의 항체는 암 및 / 또는 암전이의 예방 또는 치료에 효과적 일 수 있다.
도 1a 내지 도 1d는 TSPAN8이 대장암에서 과발현 된다는 것을 보여준다. 항-TSPAN8 항체로 면역조직화학 염색을 수행하였고, TSPAN8의 발현(N = 59)을 정상 샘플(N = 59)과 대장암 샘플(N = 59)에서 측정하였다. (도 1a 및 도 1b) 정상 및 대장 암 조직에서 TSPAN8의 대표적인 면역조직화학 염색. 막대 그래프는 TSPAN8에 대한 양성 염색의 비율을 보여준다. (도 1c 및 도 1d) 정상 샘플과 대장암의 1-4기 샘플에서 TSPAN8의 대표적인 면역조직화학 염색. 막대 그래프는 TSPAN8에 대한 양성 염색의 비율을 보여준다. TSPAN8의 발현은 DAB에 의해 갈색으로 염색되어 검출되었다. 사각형은 20 X 배율의 영역을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM 로 표시된다. * P < 0.05.
도 2a 내지 도 2b는 TSPAN8의 과발현이 HUVEC의 증식과 접착에 영향을 주지 않고 COS-7 세포의 침윤을 촉진한다는 것을 보여준다. 도 2a: mock 또는 TSPAN8으로 형질감염 된 COS-7 세포의 용해물을 항-TSPAN8 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석. 도 2b: 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 마트리겔이 코팅 된 트랜스웰 챔버를 사용하여 TSPAN8이 형질감염 된 COS-7 세포에서 침윤 활성을 측정 하였다. 이미지는 막에서 침윤하는 세포를 나타낸다. 막대 그래프는 대조군의 백분율로써 결과를 나타내었다. 도 2c: 48시간 배양 후 TSPAN8이 형질감염 된 COS-7 세포 증식의 셀 카운팅 키트-8 (CCK-8) 분석. 도 2d: 인간 제대정맥내피세포 (HUVEC)에 부착한 TSPAN8 형질감염 COS-7 세포. 데이터는 평균 ± SEM 로 표시된다. * P < 0.05.
도 3a 내지 도 3d는 TSPAN8의 녹다운이 HUVEC의 증식 및 접착에 영향을 주지 않고 HCT-8 대장 암 세포의 침윤을 감소시켰다는 것을 보여준다. 도 3a: TSPAN8 siRNA가 형질감염 된 HCT-8 세포의 용해물을 항-TSPAN8 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석. 도 3b: 재료 및 방법에서 설명한 바와 같이 마트리겔이 코팅 된 트랜스웰 챔버를 사용하여 TSPAN8 siRNA가 형질감염 된 HCT-8 세포에서 침윤 활성을 측정 하였다. 이미지는 막에서 침윤하는 세포를 나타낸다. 막대 그래프는 대조군의 백분율로써 결과를 나타내었다. 도 3c: 48시간 배양 후 TSPAN8 siRNA가 형질감염 된 HCT-8 세포 증식의 셀 카운팅 키트-8 (CCK-8) 분석. 도 3d: 인간 제대정맥내피세포 (HUVEC)에 부착한 TSPAN8 siRNA 형질감염 HCT-8 세포. 데이터는 평균 ± SEM 로 표시된다. * P < 0.05.
도 4a 내지 도 4c는 HCT-8 셀 침윤 시 TSPAN8-LEL의 기능적인 역할 및 TSPAN8-LEL에 특이적인 인간 항체 (scFv-FC)의 특징을 보여준다. 도 4a: 침윤 분석은 정제된 TSPAN1-LEL-FC, TSPAN8-SEL-FC, TSPAN8-LEL-FC, 또는 대조군 Fc의 존재 시, HCT-8 대장암 세포로 수행하였다. 이미지는 막에서 침윤하는 세포를 나타낸다. 결과는 대조군의 백분율로 나타내었다. 데이터는 평균 ± SEM 로 표시된다. * P < 0.05. 도 4b: TSPAN8 scFv-FC 클론의 결합 특이성은 Fc, TSPAN1-LEL-FC, TSPAN8-SEL-FC 및 TSPAN8-LEL-FC를 사용하여 간접 ELISA에 의해 결정되었다. 도 4c: 비-감소 조건에서 TSPAN8-LEL에 결합한 TSPAN8 scFv-FC 클론의 웨스턴 블롯 분석.
도 5a 내지 도 5c는 TSPAN8 scFv-FC가 전이성 대장암 세포주의 침윤을 억제한다는 것을 보여준다. 도 5a: HCT-8 세포에서 P120의 카테닌의 하향 조절. p120 카테닌 siRNA가 형질감염된 HCT-8 세포의 용해물을 항-p120 카테닌 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석. 도 5b: 침윤 활성은 대조군 scFv-FC 또는 TSPAN8 scFv-FC를 처리한 다음 p120 카테닌 siRNA가 형질감염 된 HCT-8세포에서 측정하였다. 침윤은 마트리겔이 코팅된 트랜스웰 챔버를 사용하여 측정하였다. 도 5c: HCT116, LoVo 및 SW480 세포는 대조군 scFv-FC 또는 TSPAN8 scFv-FC 중 하나로 처리하고, 마트리겔이 코팅된 트랜스웰 챔버를 사용하여 침윤 분석을 수행하였다. 이미지는 막에서 침윤하는 세포를 나타낸다. 결과는 대조군의 백분율로 나타내었다. 데이터는 평균 ± SEM 로 표시된다. * P < 0.05.
도 6은 TSPAN8 scFv-FC가 U87 및 PANC-1을 포함한 다른 전이성 암세포의 침윤을 억제하는 것을 보여준다. TSPAN8 scFv-FC (100 ㎍/㎖)의 효과를 결정하기 위해 전이성 U87 뇌 교종 및 PANC-1 췌장암 세포주에서 침윤 분석을 하였다. 이미지는 막에서 침윤하는 세포를 나타낸다. 결과는 대조군의 백분율로 나타내었다. 데이터는 평균 ± SEM 로 표시된다. * P < 0.05.
도 7은 TSPAN8 IgG가 전이성 HCT116 대장암 세포의 침윤을 억제한다는 것을 보여준다. TSPAN8 IgG (20 ㎍/㎖) 또는 얼비툭스 (20 ㎍/㎖)의 효과를 측정하기 위하여 전이성 대장암 HCT116 세포에서 침윤 분석을 하였다. 이미지는 막에서 침윤하는 세포를 나타낸다. 막대 그래프는 측정되어 대조군의 백분율로 결과를 나타내었다. 데이터는 평균 ± SEM 로 표시된다. * P < 0.05.
도 8은 난소암에서 향상된 TSPAN8의 발현을 보여준다. 난소암 진행에 관련된 TSPAN8 발현의 임상적 중요성을 예측하기 위하여 정상 (N=5) 및 난소암 조직 (N=55)에서 항-TSPAN8 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 다양한 조직 샘플에서 염색 강도의 전형적인 예들이 보여진다. 파란색은 핵을 나타내고, 갈색은 TSPAN8 발현을 나타낸다. 값은 다양한 조직 샘플로부터 측정되어 평균 ± SEM로 나타내었다. * P <0.05
도 9는 난소암에서 향상된 TSPAN8의 발현을 보여준다. 난소암 진행에 관련된 TSPAN8 발현의 임상적 중요성을 예측하기 위하여 정상(N=5) 및 난소암 조직 (N=55)에서 항-TSPAN8 항체를 사용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. TSPAN8의 상대적 발현은 대조군(정상)의 백분율로 표현된다. 값은 다양한 조직 샘플로부터 측정되어 평균 ± SEM로 나타내었다. * P <0.05
도 10a 내지 도 10b는 세포 침윤에서 TSPAN8 녹다운의 억제 효과를 보여준다. 도 10a: 스크램블 또는 TSPAN8 siRNA로 형질감염 된 SK-OV-3 세포 용해물은 항-TSPAN8 또는 항-β-액틴 항체로 면역 블롯팅하여 분석하였다. 도 10b: 스크램블 또는 TSPAN8 siRNA로 형질감염 된 SK-OV-3 세포의 세포 침윤을 조사 하였다. 형질도입 22 시간 후, 이미지를 촬영하였다. 왼쪽은 세포 침윤 분석 사진이다. 오른쪽은 침윤 세포의 수를 백분율로 나타낸 것이다. 값은 3 개의 독립적 실험 중 하나로부터 3회 반복 측정한 평균 ± SEM로 나타낸다.
도 11a 내지 11b는 세포 침윤에서 TSPAN8 항체의 억제 효과를 보여준다. 도 11a: 마트리겔이 코팅된 멤브레인 필터 인서트가 장착된 변형된 Boyden 챔버로 난소암 세포 침윤을 측정하였다. 왼쪽은 대조군 IgG를 처리한 SK-OV-3 세포. 오른쪽은 TSPAN8 IgG를 처리한 SK-OV-3 세포 (100 X 배율). 도 11b: 세포 침윤은 세포 계수에 의해 정량되고, 세 개의 독립적 실험 중 하나에서 임의의 3 필드에서 대조군의 백분율로 표현된다.
도 12는 대장암 및 난소암 세포주에서 TSPAN8 IgG가 세포 표면 TSPAN8의 내재화를 유도한다는 것을 보여준다. 정해진 조건의 존재 또는 부재 시, TSPAN8 IgG로 처리된 HCT116 또는 SK-OV-3 세포의 FACS 분석. 파선은 염색되지 않은 대조군을 나타내고, 실선은 DyLight-488 TSPAN8 IgG를 나타낸다.
도 13a 내지 도 13c는 SK-OV-3 세포의 생체내 전이에서 TSPAN8 항체의 억제 효과를 보여준다. 도 13a: 상단, 난소암 이종이식 동물모델의 생성에 대한 개략적인 그림. 하단, TSPAN8 항체의 복강 주입 스케줄. 검은색 화살표는 항체 주입한 날을 나타낸다. 도 13b: SK-OV-3 세포에서 루시퍼라제 시그날의 생체 분자 이미징. 루시퍼라제를 발현하는 종양을 복강내 주사를 통해 Balb/c 누드 마우스의 복막에 투여하여 이종이식 동물을 만들었다. 도 13c: 대장직장, 간, 신장 및 난소 포함하는 복막 주변 기관에서 루시퍼라 신호의 분자 이미징.
도 14a 내지 14c는 상피성 난소암 세포주의 TSPAN8-매개 침윤에서 TSPAN8-LEL IgG의 효과를 보여준다. 도14a: 상피성 난소암 세포주에 TSPAN8 발현을 나타내는 면역 블롯 분석. 도 14b: 침윤 상피성 난소암 세포주의 수는 대조군 IgG 또는 TSPAN8-LEL IgG 존재하에 측정되었고 대조군 침윤의 백분율로 나타내었다. 모든 값은 3개의 독립적 실험 중 하나로부터 삼중 측정의 평균값 ± SEM로 나타낸다.
도 15a 내지 15c는 TSPAN8-LEL에 있는 TSPAN8-LEL IgG의 결합 부위의 확인을 보여준다. 도 15a: 야생형 및 FC 융합 단백질과 같은 TSPAN8-LEL (TSPAN8-LEL-N1, -N2, -N3 및 -C1)의 N- 또는 C- 말단 결실 돌연변이체의 도식도. 입체구조를 형성하기 위한 디설파이드 브릿지에 참여하는 시스테인 잔기는 C42, C43, C62, C64, C71 및 C84로 도시된다. 도 15b: TSPAN8-LEL, TSPAN8-LEL-N1, TSPAN8-LEL-N2, TSPAN8-LEL-N3 및 TSPAN8 LEL-C1은 96-웰 마이크로 타이터 플레이트 상에 코팅 되었다. 이러한 단백질에 TSPAN8-LEL IgG의 결합 특이성은 ELISA에 의해 측정 되었다. 값들은 3개의 독립적 실험 중 하나로부터 삼중 측정의 평균값 ± SEM로 나타낸다. 도 15c: 이러한 정제된 단백질에 대한 항체의 결합은 면역블롯 분석에 의해 확인되었다.
도 16a 내지 16c는 SK-0V3 세포에서 TSPAN8의 내재화 및 하향 조절시 TSPAN8-LEL IgG의 효과를 보여준다. 도 16a: 대조군 IgG (■) 또는 TSPAN8-LEL IgG (□) 존재시 SK-0V3 세포에서 TSPAN8의 하향 조절은 시간-의존적으로 세포 ELISA로 측정되었다. 값은 3 개의 독립적 실험 중 하나로부터 삼중 측정의 평균값 ± SEM로 나타낸다. 도 16b: SK-0V3 세포 (상판)에서 TSPAN8의 하향 조절시 대조군 IgG 또는 TSPAN8-LEL IgG의 효과를 보여주는 면역블롯 분석. 밴드 강도는 그래프 바 (하단 패널)로 도시되었다. 도 16c: SKOV3 세포는 FITC가 표지된 TSPAN8-LEL IgG 처리 후, lysotracker로 고정되고 염색되었다. TSPAN8-LEL IgG의 위치는 공초점 현미경을 사용하여 조사되었다. 결과는 세 개의 개별 실험을 대표한다.
도 17a 내지 17c는 SK-OV3 세포 전이의 빈도에서 TSPAN8-LEL IgG의 효과를 보여준다. 도 17a: 대조군 IgG 또는 TSPAN8-LEL IgG 처리 프로토콜의 도식도. 도 17b: 인간 난소암의 복막 전이 마우스 모델은 SK-OV3-luc을 주입하여 만들었다. 항체 처리 후, 대조군 IgG- 또는 TSPAN8-LEL IgG를 처리한 군에서 SK-OV3-luc 전이의 빈도는 생물발광 영상 (bioluminescence imaging)에 의해 모니터링 되었다. 도 17c: SK-OV3-luc 전이 빈도는 분리된 장기에서 발광 신호가 검출되는 마우스의 수로 나타내며, SK-OV3-luc 전이의 대조군 빈도의 백분율로 표현된다.
일 관점에서, 본 발명은 TSPAN8 (tetraspanin 8)에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체는 TSPAN8의 LEL (large extracellular loop)에 특이 적으로 결합하는 항체일 수 있다.
종양 전이는 많은 조정 신호 분자에 의해 조절되는 복잡한 과정이다. 따라서, 종양 치료를 위하여 신규 치료 표적의 발견이 필수적이다. 여기서 본 발명자들은 먼저 정상 및 대장암에서 TSPAN8의 발현을 비교함으로써 TSPAN8의 임상적 중요성을 확인하였다. 본 출원의 발명자들은 TSPAN8의 이소성(ectopic) 발현 또는 녹다운을 이용하여, TSPAN8이 대장암 세포 침윤에 중요하지만 내피세포의 증식 또는 접착에는 중요하지 않다는 것을 입증하였다. 더 구체적으로, 본 출원의 발명자들은 TSPAN8의 large extracellular loop (LEL; 아미노산 110-205)가 대장암 세포의 침윤에 중요한 역할을 한다는 것을 입증하였다.
다음으로, 파지 디스플레이 기술을 사용하여 TSPAN8의 LEL에 특이적인 재조합 인간 항체를 인간 합성 항체 라이브러리로부터 선별하였으며 비-전이성 대장암 세포의 침윤에 비해 전이성 대장암 세포의 침윤을 더 강력하게 억제하는 것으로 확인되었다. 그 다음, 본 출원의 발명자는 난소암에 대한 TSPAN8의 임상적 관련성을 검증하기 위해 면역조직화학 염색 (immunohistochemical staining)을 실시했다.
또한, 본 출원의 발명자들은 TSPAN8 또는 항-TSPAN8 항체의 녹다운을 이용하여 난소암 세포 침윤에 TSPAN8의 기능적 관련성을 확인했다. 흥미롭게도, 유세포분석 (flow cytometry)의 결과는 항-TSPAN8 항체가 내재화를 통해 대장암 및 난소암 세포에서 세포 표면 TSPAN8을 하향 조절하는 것으로 나타났다.
마지막으로, 본 출원의 발명자들은 난소 종양 전이 동물 모델을 이용하여, 항-TSPAN8 항체가 난소암 세포의 전이를 상당히 감소시키는 것을 확인하였다. 종합하면, 이들 결과는 TSPAN8의 LEL는 전이성 대장암 및 난소암의 진행을 변경하기 위한 치료의 표적이 될 수 있고 이 도메인을 표적하는 인간 항체는 치료 및 진단 가능성을 가지고 있다는 것을 시사하고 있다.
본 발명의 용어 "항체"는 항원을 특이적으로 인식하는 수용체로 기능하는 특정 항원에 대해 면역학적으로 반응하는 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체, 전체 항체 및 항체 단편을 포함하도록 의도된 단백질 분자를 의미한다. 또한, 키메라 항체 (예를 들어, 인간화 뮤린 항체), 2가 또는 이중특이적 분자 (예를 들어, 이중특이적 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디는 본 발명에 유용한 항체의 범위 내에 속한다. 전체 항체는 경쇄 및 중쇄 사이의 이황화 결합과, 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄로 구성된다. 포유류에는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG로 알려진 5개 항체 이소타입이 있으며, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 의 4가지 아형으로 더 분류된다. 본 발명에서 "항체 단편"은 적어도 항원 결합 기능을 보유하는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv를 포함할 수 있다. Fab은 항원 결합 부위로, 각각 중쇄 및 경쇄의 한 가변부위, 경쇄의 불변부위 및 중쇄의 제1 불변부위 (CH1)로 구성된다. Fab '는 상기 중쇄의 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함한다는 것이 Fab과는 다르다. F(ab')2는 힌지 부위의 시스테인 잔기 사이에 이황화 결합을 한 2개의 Fab' 분자로 구성된다. 중쇄 및 경쇄 각각의 하나의 가변 부위로 구성된 FV (가변 단편)는 모 면역글로불린의 원래의 특이성을 함유하는 최소 항체 단편이다. 디설파이드가 안정화된 FV (hsFv)은 이황화 결합을 통하여 경쇄의 가변부위에 중쇄의 가변부위가 연결되어 형성된다. 단일 사슬 FV (scFv)는 중쇄 및 경쇄의 각각의 가변부위가 펩티드 링커에 의해 공유결합으로 연결되어 있는 FV이다. 이러한 항체 단편은 단백질 분해 효소를 이용하여 얻을 수 있고 (예를 들어, 전체 항체는 파파인 또는 펩신으로 분해되어 Fab 또는 F(ab') 각각을 얻을 수 있고), 바람직하게는 유전자 재조합 기술에 의해 제작될 수 있다.
통상적으로, 항체 스크리닝은 표적 단백질의 전체 세포외 부위를 사용하여 수행되어왔고, 결과적으로 항체의 분리에 문제를 초래하였다. 본 발명에 있어서, 보다 신속하게 항체를 생산하기 위하여 표적 단백질의 기능적 도메인을 이용한 항체 스크리닝의 개선이 이루어졌다. 본 발명의 일 실시예에서, TSPAN8의 LEL은 암 및 / 또는 암 전이에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었고, 항체 스크리닝에 사용 되었다. 항체 스크리닝의 과정은 도 4에 개략적으로 도시된다.
본 발명의 용어 "단클론 항체"는 단일 에피토프에 대해 결합 특이성 및 친화성을 나타내는 항체의 실질적으로 동일한 집단으로부터 얻어진 균일한 분자 조성의 항체 분자를 의미한다.
일반적으로, 면역글로불린은 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄로 구성되는 기본 구조 단위를 가지고 있다. 각 중쇄는 하나의 가변부위 ("부위"라고도 함) 와 세 개의 불변부위를 포함하는 반면, 각 경쇄는 하나의 가변부위와 하나의 불변부위로 구성되어 있다. 경쇄 및 중쇄의 각각의 가변부위는 세 개의 상보성 결정부위 (이하 "CDR"이라 한다) 및 네 개의 프레임워크 부위를 포함한다. CDR은 항체의 에피토프에 결합하는 작용을 한다. 각각의 사슬에 있는 CDR은 N 말단에서부터 시작하고 CDR1, CDR2 및 CDR3로 순차적으로 배치된다. 이들은 그들이 배치되는 사슬에 의해 판별된다.
본 발명의 용어 "인간 항체"는 CDR, 프레임워크 부위 등을 포함하는 인간 면역 글로불린의 모든 성분의 아미노산 서열로 전적으로 구성된 분자이다. 인간 질환의 치료에서, 인간 항체는 적어도 세가지 잠재적 이점을 갖는다. 우선, 더욱 바람직하게 인간 항체는 예를 들면, 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC)에 의해 보다 효과적으로 표적 세포를 파괴하는 인간의 면역 시스템과 상호 작용한다. 또 다른 이점은 인간의 면역 시스템은 인간 항체를 외부 분자로 인식하지 않는다. 또한, 이들은 더 작은 용량 또는 이하의 빈도로 투여되는 경우에도 인간 항체의 반감기는 인간 순환계에서는 자연적으로 발생하는 항체의 것과 유사하다. 따라서, 본 발명에 따른 항체는 TSPAN8에 대해 강력한 친화성을 가지기 때문에 바람직하게는 암 및/또는 암 전이 관련 질병 또는 암의 치료에 유용할 수 있는 인간 모노클로날 항체일 수 있으며, TSPAN8-매개의 암 또는 암 전이를 효과적으로 억제하는 인간 내피세포에서 발현되는 TSPAN8-LEL이 바람직하다.
본 발명의 용어 "TSPAN8"는 테트라스파닌 (tetraspanin) 상과의 구성원을 의미한다. TSPAN8 은 네 개의 막 횡단 도메인, 작은 세포외 루프 (SEL) 및 큰 세포외 루프 (LEL)를 포함하는 두 개의 세포외 루프 및 세 개의 세포질 도메인을 포함하는 구성원으로 이루어져 있다. TSPAN8 대한 정보는 NCBI의 GenBank와 같은 공공 데이터베이스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 유전자 TSPAN8은 Gene ID No 7103일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, TSPAN8은 인간, 침팬지 또는 마우스로부터 얻을 수 있다.
본 발명에서 "TSPAN8의 큰 세포외 루프 (LEL)"는 "TSPAN8-LEL" 또는 "TSPAN8 LEL"와 상호교환이 가능하다.
다른 관점에서, 본 발명은 암 및/또는 암 전이 억제가 가능한 에피토프로서 TSPAN8-LEL의 분리된 폴리펩티드를 제공하고, 특히, 본 발명은 암 및/또는 암 전이를 억제하는 항체의 생산을 유도할 수 있는 에피토프로서 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 TSPAN8의 110번 내지 205번 아미노산 단편을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 서열번호 9로 표시되는 TSPAN8 내 LEL 아미노산 서열 중 31번 내지 96번의 아미노산 단편을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명자들은 먼저 LEL, 즉 TSPAN8의 아미노산 서열 중 110번 내지 205번의 도메인, 특히 TSPAN8 내 LEL 아미노산 서열 중 31번 내지 96 번의 아미노산 단편이 암 및/또는 암 전이에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다.
본 발명에서 "에피토프"는 항원 특이성을 결정하는 항체의 부분을 말하고, 항원 결정기 또는 항원 결정부위로 상호교환 할 수 있도록 사용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여 에피토프는 TSPAN8의 아미노산 서열 중 110번 내지 205번의 아미노산을 가지는 LEL, 특히 암 및/또는 암 전이 억제에 이용 가능한 TSPAN8 내 LEL 아미노산 서열 중 31번 내지 96 번의 아미노산 단편을 말하며, 또는 LEL과 동일한 기능을 갖는 폴리펩티드를 지칭할 수 있다. 따라서 LEL의 추가 부위가 포함될 수 있다. LEL에서 동일한 역할을 하는 한 임의의 폴리펩티드, 예를 들면, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99 % 또는 그 이상의 아미노산 서열 상동성을 가지는 폴리펩티드가 에피토프로 사용될 수 있다. 인간, 마우스 및 침팬지의 LEL 아미노산 서열인 TSPAN8 아미노산 서열 중 110번 내지 205번 서열은 표 1과 같고, 각각 서열번호 7 (TSPAN8의 아미노산 서열) 및 서열번호 9 (LEL의 아미노산 서열)로 표시된다. 본 발명자들은 서열번호 7 및 서열번호 9의 아미노산 서열이 암 및/또는 암 전이를 억제하는 항체를 생산하는데 이용되는 에피토프로 사용될 수 있다는 것을 처음으로 확인하였다.
또한, 하나의 바람직한 실시예에서, LEL의 N 말단 또는 C 말단이 암 및/또는 암 전이를 억제하는 항체를 생산하는데 이용될 수 있는 에피토프로 역할을 할 수 있다고 제안하였다. 바람직하게는, LEL 내 아미노산 서열 중 31번 내지 96 번의 아미노산 단편을 포함하는 부위가 항체에 대한 에피토프일 수 있다.
항체는 암 및/또는 암 전이를 억제하기 위한 TSPAN8-LEL 또는 이의 유효단편에 특이적으로 결합할 수 있고, 본 발명자들은 TSPAN8-LEL이 암 및/또는 암 전이를 조절하는 독특한 영역이라고 제안하였다.
종양의 전이는 전 세계적으로 암 사망의 주요 원인이다. 종양의 이동 및 말초 기관으로 침입, 및 종양 전이 경로에 대한 메커니즘이 암 치료를 위한 유망한 타겟으로 관심 집중되고 있다; 그러나, 종양 전이는 복잡하며 많은 신호전달 분자의 조정 작용을 초래한다. 본 연구에서는 종양 세포 침윤에서 TSPAN8-LEL에 대한 생물학적 역할을 확인하였다. 그 다음, TSPAN8-LEL을 표적하는 재조합 인간 항체를 개발하였고, 그 효능과 작용 메커니즘을 평가하였다. TSPAN8-LEL은 종양 전이에 중요한 요소이고, TSPAN8-LEL 특이 항체는 치료 가능성을 가질 수 있다고 추측 할 수 있다.
몇몇 보고에서는 TSPAN8이 세포 운동성을 조절하는데 중요한 역할을 한다고 시사했다; 그러나, 이러한 기능의 기초가 되는 분자 메카니즘은 명확히 알려지지 않았다. 본 출원의 발명자들은 TSPAN8-LEL (아미노산 110-205)이 종양 전이 동안 암세포 침윤을 조절하는 고유 도메인이 될 수 있음을 시사한다. 몇 가지 증거들이 이러한 개념을 뒷받침하고 있다. 첫째, COS-7 세포에서 TSPAN8의 과발현은 세포의 침윤을 촉진하지만 HUVEC으로 세포 증식 또는 접착은 촉진할 수 없다. 둘째, HCT-8 대장암 세포주에서 TSPAN8 녹다운은 HCT-8 세포 침윤을 억제한 반면, HUVEC으로 증식 및 접착은 영향을 받지 않았다. 셋째, HCT-8 세포 침윤은 TSPAN8-SEL이 아니라 TSPAN8-LEL에 의하여 억제되었다. 넷째, SKOV3 난소암 세포주에서 TSPAN8의 녹다운 또한 SK-0V3 세포 침윤을 억제하였다.
지난 20년 동안, 재조합 항체 기술의 급속한 발전은 치료 항체 시장의 놀랄만한 증가를 이루었다. 최근, 재조합 치료용 항체는 종양치료를 위하여 임상적으로 사용되고 있지만, 여전히 많은 개발 중이다. 많은 의료적 수요는 충족되지 않고 있으므로, 약물내성 및 부작용에 대응하는 개선된 종양치료를 위한 신규한 치료 표적의 확인이 무엇보다 중요하다. 본 연구에서, 발명자들은 종양의 전이 동안 치료 표적으로 TSPAN8의 기능적 관련성을 뒷받침하는 몇 가지 증거를 제공한다. 그 임상적 중요성은 TSPAN8이 대장암 및 난소암에서 과발현되면 나타나는 면역조직화학 염색에 의해 확인되었다. 특히 대장암에서, TSPAN8 과발현은 임상 단계에 의존적인 것으로 보인다. 이소성 (ectopic) 발현 또는 TSPAN8의 유전자 침묵 (silencing)을 통해 암세포 침윤의 생물학적 기능을 확인하였다. 또한 TSPAN8-LEL을 표적하는 것으로 확인된 인간 재조합 항체는 대장암 세포주 HCT-8, HCT116, LoVo 및 SW480 뿐만 아니라 SK-0V3, U87 및 PANC-1를 포함하는 췌장암 세포주, 난소 및 뇌 세포주의 침윤을 상당히 억제하였다. 또한, 생체내 효능 연구에서도 항체가 SKOV3 난소암 세포의 전이를 억제하였다. 따라서 이러한 결과로 TSPAN8이 종양 치료에 적합한 치료 표적이 될 수 있음을 추정할 수 있다.
테트라스파닌 (tetraspanin)은 큰 분자 복합체를 합치기 위해서 분자웹을 형성하고 그것의 효율적인 기능을 촉진시키는 분자 촉진자로 중요한 역할을 한다. 상호 작용하는 분자에 따라 테트라스파닌 은 접착, 운동성 및 세포 융합과 같은 많은 다른 세포기능에 관여하고 있다. 이전 연구는 TSPAN8이 EpCAM, 클라우딘-7 및/또는 CD44v6을 포함한 여러 결합 파트너와 복합체를 형성하고, 암세포의 운동성을 조절한다는 것을 보여주었다. 본 연구에서는 TSPAN8-LEL을 표적하는 인간 항체가 내면화 과정을 통해 세포표면 TSPAN8을 하향조절 하였고, 이 과정은 치료용 항체-약물 복합체로 적합할 수 있음을 시사하였다. 현재의 증거를 기반으로, 본 출원의 발명자들은 항-TSPAN8 항체의 작용 메커니즘이 TSPAN8의 크로스-링킹을 수반하고, 신속한 내면화 및 암세포에서 TSPAN8 시그널링 복합체의 하향조절을 유도한다고 추정하고 있다. 이러한 효과는 TSPAN8 시그널링-매개된 암세포 침윤의 억제를 초래한다. 비록 최근 연구는 항-TSPAN8 IgG1 항체에 의해 유도된 내재화 과정에 집중되어 있지만, 본 출원의 발명자들은 이들 항체가 항체-의존적 세포독성 및/또는 보체-의존적 세포독성 또한 유도한다는 가능성을 배제하지 않았다.
현재 이용 가능한 증거를 기반으로, 본 출원의 발명자들은 종양의 전이 동안 암세포 침윤에서 TSPAN8-LEL에 대한 기능적 역할을 제안하였다. 본 출원의 발명자들이 개발한 TSPAN8-LEL 항체는 내재화를 통해 암세포에서 세포-표면 TSPAN8을 특이적으로 하향조절 하여 암세포 침윤을 효과적으로 억제한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR1을 포함하는 중쇄 가변부위를 포함할 수 있고;
서열번호 13 내지 서열번호 16의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR2를 포함; 및
서열번호 17 내지 서열번호 20의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR3을 포함한다; 그리고
경쇄 가변부위는 서열번호 29 내지 서열번호 32의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR1을 포함하고;
서열번호 33 내지 서열번호 35의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR2를 포함; 및
서열번호 36 내지 서열번호 39의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR3을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 실시예에서, 항체는 서열번호 21 내지 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변부위를 포함하는 항체로 구성되는 군; 및 서열번호 40 내지 서열번호 43으로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체로 구성되는 군에서 선택된다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변부위를 포함할 수 있고, 서열번호 29의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 36의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함하는 인간 단클론 항체는 클론1으로 지정된다. 항체를 코딩하는 핵산은 서열번호 25의 핵산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 44의 핵산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 한정되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변부위를 포함할 수 있고, 서열번호 30의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR1, 서열번호 34의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 37의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있다.
테트라스파닌 (tetraspanin)은 큰 분자 복합체를 합치기 위해서 분자웹을 형성하고 그것의 효율적인 기능을 촉진시키는 분자 촉진자로 중요한 역할을 한다. 상호 작용하는 분자에 따라 테트라스파닌 은 접착, 운동성 및 세포 융합과 같은 많은 다른 세포기능에 관여하고 있다. 이전 연구는 TSPAN8이 EpCAM, 클라우딘-7 및/또는 CD44v6을 포함한 여러 결합 파트너와 복합체를 형성하고, 암세포의 운동성을 조절한다는 것을 보여주었다. 본 연구에서는 TSPAN8-LEL을 표적하는 인간 항체가 내면화 과정을 통해 세포표면 TSPAN8을 하향조절 하였고, 이 과정은 치료용 항체-약물 복합체로 적합할 수 있음을 시사하였다. 현재의 증거를 기반으로, 본 출원의 발명자들은 항-TSPAN8 항체의 작용 메커니즘이 TSPAN8의 크로스-링킹을 수반하고, 신속한 내면화 및 암세포에서 TSPAN8 시그널링 복합체의 하향조절을 유도한다고 추정하고 있다. 이러한 효과는 TSPAN8 시그널링-매개된 암세포 침윤의 억제를 초래한다. 비록 최근 연구는 항-TSPAN8 IgG1 항체에 의해 유도된 내재화 과정에 집중되어 있지만, 본 출원의 발명자들은 이들 항체가 항체-의존적 세포독성 및/또는 보체-의존적 세포독성 또한 유도한다는 가능성을 배제하지 않았다.
현재 이용 가능한 증거를 기반으로, 본 출원의 발명자들은 종양의 전이 동안 암세포 침윤에서 TSPAN8-LEL에 대한 기능적 역할을 제안하였다. 본 출원의 발명자들이 개발한 TSPAN8-LEL 항체는 내재화를 통해 암세포에서 세포-표면 TSPAN8을 특이적으로 하향조절 하여 암세포 침윤을 효과적으로 억제한다.
일 실시예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 11 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR1을 포함하는 중쇄 가변부위를 포함할 수 있고;
서열번호 13 내지 서열번호 16의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR2를 포함; 및
서열번호 17 내지 서열번호 20의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR3을 포함한다; 그리고
경쇄 가변부위는 서열번호 29 내지 서열번호 32의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR1을 포함하고;
서열번호 33 내지 서열번호 35의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR2를 포함; 및
서열번호 36 내지 서열번호 39의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR3을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 실시예에서, 항체는 서열번호 21 내지 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 중쇄 가변부위를 포함하는 항체로 구성되는 군; 및 서열번호 40 내지 서열번호 43으로 구성되는 군에서 선택되는 아미노산 서열을 가지는 경쇄 가변부위를 포함하는 항체로 구성되는 군에서 선택된다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변부위를 포함할 수 있고, 서열번호 29의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR1, 서열번호 33의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 36의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 40의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함하는 인간 단클론 항체는 클론1으로 지정된다. 항체를 코딩하는 핵산은 서열번호 25의 핵산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 44의 핵산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR1, 서열번호 14의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 18의 아미노산 서열로 한정되는 CDR3을 포함하는 중쇄 가변부위를 포함할 수 있고, 서열번호 30의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR1, 서열번호 34의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 37의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 22의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 41의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함하는 인간 단클론 항체는 클론 2로 지정된다. 항체를 코딩하는 핵산은 서열번호 26의 핵산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 45의 핵산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 12의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR1, 서열번호 15의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 19의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변부위, 및 서열번호 31의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR1, 서열번호 35의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 38의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 42의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함하는 인간 단클론 항체는 클론 3으로 지정된다. 항체를 코딩하는 핵산은 서열번호 27의 핵산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 46의 핵산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시예에서, 본 발명의 항체는 서열번호 11의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR1, 서열번호 16의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR2 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 한정되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변부위 및 서열번호 32의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR1, 서열번호 35의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR2 및 서열번호 39의 아미노산 서열로 한정되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있다.
본 발명의 항체는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 43의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함하는 인간 단클론 항체는 클론 4로 지정된다. 항체를 코딩하는 핵산은 서열번호 28의 핵산 서열을 갖는 중쇄 가변부위 및 서열번호 47의 핵산 서열을 갖는 경쇄 가변부위를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이와 같이, 이종 서열로 구성된 항체는 TSPAN8-LEL를 특이적으로 인식하는 한 암 및/또는 암 전이를 억제하는 것으로 확인되었다. 따라서, 이들은 암 및/또는 암 전이의 예방 또는 치료에 효과적으로 적용될 수 있다고 확인되었다.
본 발명의 항체가 불변부위를 포함하는 경우, 이는 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 또는 이들의 조합 또는 혼합 (hybrid)으로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서 "조합"은 동일한 기원의 단쇄 면역글로불린 Fc 단편을 코딩하는 폴리펩티드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩티드와 연결되어 이량체 또는 다량체를 형성하는 것을 의미한다. 즉, 이량체 또는 다량체는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변부위로 구성된 군으로부터 선택된 둘 또는 그 이상의 불변부위로부터 형성될 수 있다.
본 발명의 용어 "하이브리드"는 상이한 기원의 두 개 이상의 중쇄 불변부위를 코딩하는 서열이 단쇄 면역글로불린 중쇄 불변부위에 존재한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 도메인 하이브리드는 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 구성된 군에서 선택된 1 내지 4 개의 도메인으로 구성될 수 있다. 또한, 결합 또는 하이브리드는 IgG의 아형 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 중쇄 불변부위로부터 만들어 질 수 있다. 조합 및 하이브리드는 상기와 같이 정의된다.
또한, 본 발명의 항체가 경쇄 불변부위를 더 포함할 때, 이는 람다 (λ) 또는 카파 (κ) 경쇄로부터 유래될 수 있다.
바람직하게는, 상기 항체는 인간 TSPAN8-LEL 뿐만 아니라 뮤린 TSPAN8-LEL에 특이적으로 결합하는 인간 단클론 항체일 수 있으며 암 및/또는 암 전이를 억제한다. 인간 및 마우스 모두에서 작동할 수 있는 인간 항체의 능력 즉, 상기 교차-반응성은 마우스의 전임상 연구에 적용할 수 있는 인간 항체를 렌더링하는 장점을 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 벡터 및 상기 벡터 또는 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 TSPAN8, 바람직하게는 인간 TSPAN8-LEL 또는 인간 및 뮤린 TSPAN8-LEL에 특이적으로 결합하는 항체 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체는 인간 단클론 항체일 수 있다. 항체의 제조방법은 기능성 도메인을 사용한 바이오패닝 (biopanning)을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 항체를 생성하기 위해 핵산이 발현되는 상기 숙주세포 배양을 포함하는 상기 항체 제조방법을 제공한다.
본 발명의 단클론 항체는 공지된 기술을 이용하여 쉽게 제조될 수 있다. 예를 들면, 단클론 항체의 생산은 면역화된 동물로부터의 B 림프구로 구성되는 하이브리도마 (Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495) 또는 파아지 디스플레이 기술에 의해 달성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명의 단클론 항체의 제조는 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 구현될 수 있다. 본 발명의 방법은 예를 들면, Barbas et al. (METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 2: 119, 1991 및 J. Virol. 2001 Jul;75(14):6692-9), 및 Winter et al. (Ann. Rev. Immunol. 12:433, 1994)를 참조하여 단계적으로 수행될 수 있다. 항체 라이브러리의 구축에 유용한 파지는 예를 들어 fd, M13, f1, If1, Ike, Zj/Z, Ff도 Xf, Pf1 및 Pf3와 같은 사상파지일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 사상파지의 표면상의 왜래 유전자를 디스플레이하는데 사용될 수 있는 벡터의 예는 fUSE5, fAFF1, fdCAT1 및 fdtetDOG과 같은 파지 벡터, 또는 pHEN1, pComb3, pComb8 및 pSEX와 같은 파지미드 벡터를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 헬퍼 파지는 증폭을 위한 재조합 파지의 성공적인 재감염에 필요한 피막 단백질의 야생형 버전을 제공하는 데 사용되고, 예를 들어 M13K07 및 VSCM13일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 하이브리도마-유래 단클론 항체 또는 파지 디스플레이 클론을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 용이하게 분리되고 통상적인 과정을 이용하여 서열이 분석될 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 및 파지 DNA 주형으로부터 중쇄- 및 경쇄 코딩 부위를 증폭하기 위해 특이적으로 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 이용될 수 있다. 일단 분리되면, 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입될 수 있는 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 그 결과 숙주세포 (예를 들어, 형질전환체)는 표적 단클론 항체를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체 제조방법은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 운반하는 발현벡터를 증폭하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 재조합 항체는 인간 scFv 라이브러리로부터 Fc 바인더를 전처리 및 특정 클론을 선택하는 기능성 도메인을 가진 바이오패닝 기법을 수행함으로써 제조될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 에피토프 또는 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 운반하는 발현벡터 및 내부에 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 항체는 위에 전술 한 바와 같다.
본 발명에 따른 에피토프 또는 항체를 운반하는 발현벡터는 포유동물 세포 (예를 들면, 인간, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스, 등), 식물세포, 이스트, 곤충세포 및 박테리아 세포 (예를 들면, E. coli)와 같은 진핵세포 또는 원핵세포에서 폴리뉴클레오티드의 복제 및/또는 발현을 허용하는 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 벡터는 목적 유전자의 발현을 유도하기 위해서 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 적절한 프로모터 및 적어도 하나의 선택 마커를 가진다. 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드는 파지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터 내로 도입될 수 있다.
상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 발현벡터는 항체의 중쇄 및 경쇄를 각각 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 발현벡터의 조합일 수 있으며, 또는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 모두가 도입된 발현벡터일 수 있다.
본 발명에 따른 발현벡터의 도입으로 형성된 형질전환체의 예로는 대장균, 스트렙토마이세스, 살모넬라 티피무리움과 같은 박테리아세포, 효모, 피키아 파스토리아와 같은 곰팡이, 초파리, 스포도프테라 Sf9 같은 곤충 세포, CHO (Chinese hamster ovary cells), SP2/0 (마우스 골수종), 인간 림프아구세포, COS, NSO (마우스 골수종), 293T, 흑색종세포, HT-1080, BHK (baby hamster kidney cells), HEK (인간 배아 신장세포) 및 PERC.6 (인간 망막세포)과 같은 동물세포 및 식물세포를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "도입"은 에피토프 또는 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 전달을 의미한다. 도입은 칼슘 포스페이트 DNA 공동 침전, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 폴리브렌 매개 형질감염, 전기천공, 미세주입, 리포좀 융합, 리포펙타민 형질감염 및 원형질체 융합을 포함한 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 형질도입은 감염에 기초하여 바이러스 벡터를 통해 외래 DNA를 다른 세포로 전달시키는 과정을 의미한다. 또한, 숙주세포 내로 벡터의 전달은 유전자 충격 (bombardment)에 의해 달성될 수 있다. 본 발명에서, 도입은 형질전환과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암 및/또는 암 전이를 예방 또는 치료하기 위한 항체를 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명의 항체는 암 및/또는 암 전이를 효과적으로 억제할 수 있기 때문에, 활성성분으로서 상기 항체를 포함하는 조성물은 암 및/또는 암 전이를 억제하고 더 나아가 암 및/또는 암 전이를 예방하거나 치료하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "암 및/또는 암 전이 억제"는 당해 기술분야에서의 일반적인 의미를 가지고, 암의 형성 또는 성장의 억제 및/또는 하나의 장기 또는 부분에서부터 다른 인접하지 않은 장기 또는 부분까지의 종양의 확산 억제를 의미한다.
본 발명의 목적을 위해, 암 및/또는 암 전이 억제는 TSPAN8, 특히 TSPAN8 LEL의 발현을 억제함으로써 달성된다.
본 발명의 용어 "암 및/또는 암 전이는" 그 발병 또는 진행에서 암 및/또는 암 전이를 포함하는 질병을 의미한다. 항체로 치료 될 수 있는 한, 암 및/또는 암 전이 관련 질환 범위 내의 임의의 질환은 제한되지 않는다. 암의 예로는 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 대장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골수암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨 림프종, 림프종 및 다중 골수성 혈액암, 대장암, 난소암, 뇌암 또는 췌장암을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 대장암, 난소암, 뇌암 또는 췌장암인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "예방" 또는 "질병 예방"은 본 발명에 따른 항체 또는 조성물의 투여에 의해 발병 또는 전이의 지연 또는 억제를 초래하는 어떤 작용을 의미한다. 본 발명에서 "치료" 또는 "치료법"은 본 발명에 따른 항체 또는 조성물의 투여에 의해 증상의 개선 또는 증상의 호전을 초래하는 어떤 작용을 의미한다.
본 발명의 항체를 포함하는 조성물은 바람직하게는 약학적 조성물이며, 더욱 바람직하게는 당업계에서 통상적으로 사용되는 적합한 비히클, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 비히클을 포함하는 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁액, 내부용액, 에멀젼, 시럽, 멸균된 수용액, 비수용액, 현탁액, 동결건조제, 및 좌제와 같은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태일 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 약학적 조성물은 충전제, 증점제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등과 같은 희석제 또는 부형제와 함께 제제화 될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐 형태 등이 있다. 이러한 고형제제에 관해서, 본 발명의 화합물은 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 또는 젤라틴과 같은 적어도 하나의 부형제와 함께 제제화된다. 단순한 부형제 이외에, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제가 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액체제제 중에는 현탁액, 내복용액, 에멀젼, 시럽 등이 있다. 물 또는 액상 파라핀과 같은 단순 희석제 이외에도, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등의 각종 첨가제 등이 액체제제에 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 멸균된 수용액, 비수 성용제, 현탁제, 에멀젼, 동결건조제, 좌제 등과 같은 비경구 투여 형태일 수 있다. 주사 가능한 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일 및 에틸 올레이트와 같은 에스테르는 비수성용제 및 현탁제에 적합할 수 있다. 좌약의 기본재료는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지 및 글리세로젤라틴을 포함한다.
본 발명의 조성물은 약학적 유효량으로 투여된다.
본 발명의 용어 "약학적 유효량"은 임의의 의학적 치료에 적용되는 합리적인 이익/위험 비율에서, 충분히 질환을 치료할 수 있는 약학적 조성물의 양을 의미한다. 유효량은 질병의 심각성을 포함하여 환자의 연령 및 성별, 질병의 종류, 약물 활성, 약물에 대한 민감도, 투여시간, 투여경로, 배설속도, 치료기간, 약물의 공동투여 및 당업계에 잘 알려진 다른 파라미터들과 같은 다양한 인자들에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 이 경우, 상기 투여는 종래의 치료제와 함께 순차적으로 또는 동시에 수행될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 일회 투여 또는 다회로 나누어 투여될 수 있다. 이러한 요소 전체를 고려하여, 부작용 없이 최대 효과를 야기하기에 충분한 최소한의 용량을 투여하는 것이 중요하다. 투여량은 당해 분야의 전문가에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량에는 특별한 제한이 없으나, 환자의 건강상태 및 체중, 질병의 심각성, 약물의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 다양한 요인에 따라 달라진다. 조성물은 예를 들면, 경구, 직장, 정맥 내, 피하, 자궁 내, 또는 뇌혈관 내와 같은 임의의 통상적인 경로를 통해 래트, 가축, 인간 등을 포함한 포유동물에 일일 일회 투여 또는 다회 투여로 투여될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 이를 필요로 하는 대상에게 상기 항체 또는 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 및/또는 암 전이 억제 방법을 제공한다.
항체, 조성물 및 암 및/또는 암 전이의 억제는 전술한 바와 같이 밝혀져 있다.
구체적으로, 본 발명의 억제방법은 암 및/또는 암 전이의 억제를 필요로 하는 대상에게 약학적으로 유효한 양의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 대상체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 쥐, 닭, 인간과 같은 포유동물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약학 조성물은 비경구, 피하, 복강내, 폐내 또는 비강 또는 국소 치료를 위해 필요한 경우 병변 내 주사를 포함하는 적절한 방법에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 대상의 건강상태 및 체중, 질병의 심각성, 약물의 종류, 투여경로 및 투여시간을 포함한 여러 요인에 따라 달라지고 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암 및/또는 암 전이의 예방 또는 치료하기 위한 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 "항체", "예방" 및 "치료"는 전술한 바와 같다.
본 발명의 펩티드로 치료할 수 있는 한, 암은 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 TSPAN8 매개로 종양 진행이 일어나는 암이다. 구체적으로, 암의 발병 또는 진행은 본 발명의 항체로 암 및/또는 암 전이를 억제함으로써 예방된다. 암의 예로는 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 대장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골수암, 결합조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨 림프종, 림프종 및 다중 골수성 혈액암을 할 수 있으며, 바람직하게는 대장암, 난소암, 뇌암 또는 췌장암일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 항체는 다른 항체 또는 생물학적으로 활성제 또는 다양한 목적을 위한 재제들과 함께 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명의 항체는 암 및/또는 암 전이를 억제하여 결국 암 발병 또는 진행을 지연 또는 예방하는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 항체는 암의 예방 및 치료에 효과적으로 적용할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 이를 필요로 하는 대상에 암을 예방하거나 치료하기 위하여 상기 항체 또는 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 암 및/또는 암 전이를 예방 또는 치료하기 위한 방법을 제공한다.
항체, 조성물 및 암은 상기 기술한 바와 같다.
암 및/또는 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법에서, 약학적 조성물은 암 의심 대상에게 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 대상은 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 래트, 닭 및 인간과 같은 포유동물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 약학 조성물은 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 또는 비강 또는 국소 치료를 위해 필요한 경우 병변 내 주사를 포함하는 적절한 방법에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 대상의 건강 상태 및 체중, 질병의 심각성, 약물의 종류, 투여경로, 및 투여시간을 포함한 다양한 인자에 따라 변하고, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 항체를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.
항체 및 암은 상기 기술한 바와 같다.
바람직하게는 TSPAN8이 특이적으로 발현되는 암이다.
본 발명의 용어 "진단"은 병리상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적에서, 진단은 암 또는 암 전이의 발생을 결정하는 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 진단용 조성물을 포함하는 암 및/또는 암 전이의 진단 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 암 및/또는 암 전이를 위한 마커로 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8의 LEL을 검출할 수 있다. 본 발명의 검출 키트는 분석방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 조성물, 용액 또는 장치뿐만 아니라 마커를 선택적으로 인식하는 항체를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 진단 키트는 매트릭스, 적합한 완충용액, 발색효소 또는 형광물질, 발색기질 또는 항체의 면역학적 검출을 위한 것들로 표지된 이차항체를 포함할 수 있다. 매트릭스로서, 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 만든 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 만든 96 웰 플레이트 및 슬라이드 글라스가 사용될 수 있다. 발색효소로서 페록시다제 및 알칼리성 포스파타제가 사용될 수 있다. 형광기질로서, FITC 및 RITC가 사용될 수 있고, 발색기질 용액으로서, ABTS (2, 2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)), OPD (o-phenylenediamine), 또는 TMB (tetramethyl benzidine)이 사용될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 대상으로부터 분리된 생물학적 시료에서 항원-항체 복합체를 통해 검출하는 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL을 검출하는 것을 포함하는, 암 및/또는 암 전이 진단방법을 제공한다.
상기 항체, 암 및 진단은 상기 기술한 바와 같다.
더 구체적으로는, 생물학적 시료에서의 단백질 분리는 공지의 과정을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 용어 "생물학적 샘플"은 암 마커 TSPAN8, 더 바람직하게는 TSPAN8-LEL의 발현 수준의 차이를 나타내는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 샘플들을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
검출방법으로 정상 대조군 및 환자에서의 TSPAN8, 더 바람직하게는 TSPAN8-LEL 발현수준을 비교함으로써 암의 발생을 진단할 수 있다. 즉, 환자의 의심 세포 내에서 본 발명의 마커의 발현 수준은 정상 세포의 것과 비교된다. 만약 환자의 의심 세포에서 마커의 발현수준의 상당한 증가가 관찰되는 경우, 암 또는 암 전이 위험으로 진단할 수 있다.
단백질 수준을 측정하기 위한 분석방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역측정법, 방사선면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직염색, 면역침전분석법, 보완고정분석법, FACS, 및 단백질 칩분석을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 분석방법으로 형성된 항원-항체 복합체의 양에 대해 정상 대조군과 암으로 의심되는 환자를 비교하고, 암마커 유전자의 단백질 발현양에 있어서 현저한 증가를 평가함으로써 암으로 의심되는 환자로 진단한다.
본 발명의 용어 "항원-항체 복합체"는 이러한 특이적인 항체에 암마커 단백질 제품이 결합하는 것을 의미한다. 형성된 항원-항체 복합체의 양은 검출 라벨의 신호 강도를 측정함으로써 정량적으로 결정될 수 있다.
이러한 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자, 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 본 발명은 이들 예에 의해 한정되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 사용 가능한 효소의 예로는, β-글루쿠로니다아제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 유라제 (urase), 페록시다아제 또는 알칼리 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제 및 GDPase, RNase, 글루코오스, 옥시다제 및 루시페라제, 포스포프락토키나아제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 아스파르테이트 아미노전이효소, 포스포에놀피루베이트 디카르복실라아제 및 β-라타마아제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 형광물질의 예로는, 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈알데하이드 및 플루오레스카민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 리간드의 예로는 바이오틴 유도체들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 발광물질의 예로는, 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 미소입자의 예로는 콜로이드 금 및 착색된 라텍스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 레독스 분자의 예로는 페로센, 루테늄 복합체, 비올로겐, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2 +, 및 [MO(CN)8]4 -를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 방사선 동위원소의 예로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 및 186Re를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 단백질 발현수준은 ELISA에 의해 측정된다. ELISA의 예는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지항체를 이용한 직접적인 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원과 복합체를 형성하는 포획항체를 인지하는 표지항체를 이용한 간접 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원-항체 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 표지항체를 이용한 직접 샌드위치 ELISA 및 고체 지지체에 부착된 항원-항체 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 표지항체를 반응시킨 다음 또 다른 표지항체를 인식하는 2차 표지항체를 이용한 간접적 샌드위치 ELISA를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 단백질 발현수준은 시료가 고체 지지체에 부착된 항체와 반응하여 샌드위치 ELISA에 의해 검출되며, 생성된 항원-항체 복합체는 항원 특이적 표지항체를 첨가하여 효소발색을 한 다음 검출되거나, 또는 항원-항체 복합체의 항원을 인식하는 항체에 특이적인 2차 표지항체를 첨가하여 효소발색을 한 다음 검출된다. 암의 빈도는 암마커 단백질의 복합체 형성 정도 및 이에 대한 항체를 측정하여 진단될 수 있다.
또한, 바람직하게는 단백질 발현수준은 암마커에 대한 하나 또는 그 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏에 의해 측정된다. 샘플로부터 분리된 총 단백질들은 크기에 따라 구별될 수 있도록 전기영동되고, 니트로셀룰로오스 막으로 이동하여 항체와 반응한다. 유전자 발현에 의해 생성된 단백질 양은 표지항체를 이용하여 생성된 항원-항체 복합체의 양을 측정함으로써 결정되고, 따라서 암의 발병을 진단할 수 있다. 검출방법은 대조군 및 암이 발생하는 세포에서 마커 유전자의 발현수준을 조사하는 방법들로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 마커 단백질 양의 절대적 (예를 들면: ㎍/㎖) 또는 상대적 (예를 들면, 신호의 상대적 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
또한, 상기 단백질 발현수준은 암마커에 대한 하나 또는 그 이상의 항체를 이용한 면역조직염색으로 측정하는 것이 바람직하다. 정상 상피조직과 암 의심 조직을 수집하여 고정시킨 다음, 널리 공지된 방법에 따라 파라핀 블록을 준비하였다. 블록은 작은 부분 (두께가 수 ㎛)으로 절단되고, 공지된 방법에 따른 항체로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 것과 반응되기 위해서 유리 슬라이드에 부착되었다.
이어서, 미반응 항체는 세척되고, 반응된 항체는 상기 언급한 검출표지로부터 선택된 것으로 표지된 다음 현미경으로 관찰되었다.
암마커에 대한 하나 또는 그 이상의 항체가 기질의 결정된 위치에 고밀도로 배치되고 고정되어있는 단백질 칩을 이용하여 단백질 수준을 분석하는 것 또한 바람직하다. 이러한 점에서, 단백질은 샘플로부터 분리되고 항원-항체 복합체를 형성하는 단백질 칩과 혼성화된 후, 관심 단백질의 존재 또는 발현수준을 조사하기 위해 판독되고, 그렇게 함으로써 암 발생을 진단한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, TSPAN8의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 암 및/또는 암 전이를 억제하는 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 물질은 TSPAN8의 LEL 발현을 억제하기 위한 물질일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, TSPAN8의 LEL은 암 및 암 침윤에 중요한 역할을 하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL의 발현을 억제하는 물질이 암 및/또는 암 전이를 억제 할 수 있음을 시사하고 있다.
TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL의 발현을 억제하는 물질은 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 올리고뉴클레오티드, 항체, 앱타머, 단일사슬 가변부위 단편, 펩티드, 저분자량 화합물 및 천연 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL의 발현을 억제하는 물질은 TSPAN8, 바람직하게는 서열번호 10으로 표시되는 TSPAN8-LEL 유전자의 발현을 억제하는 물질에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드 또는 siRNA 올리고 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
본 발명에서 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 DNA 또는 RNA 또는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산서열을 갖는 이의 유도체를 의미하며, 단백질로 mRNA가 번역되는 것을 억제하기 위하여 mRNA 내의 상보적인 서열에 결합한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드 서열은 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL의 mRNA에 상보적이고, TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL의 mRNA에 결합 할 수 있는, DNA 또는 RNA 서열이 될 수 있고, TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL의 mRNA의 번역, 세포질 이동 또는 성숙 또는 전체 생물학적 기능에 필수적인 다른 모든 활동을 억제할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 10 내지 40 염기길이를 갖는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 개선된 효과를 가지기 위하여 염기, 당 또는 백본의 하나 또는 그 이상의 위치에서 변형될 수 있다 (De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55(1995)). 올리고뉴클레오티드 백본은 예를 들면, 포스포로티오에이트, phosphotriesters, 메틸포스포네이트, 단쇄 알킬, 사이클로알킬 또는 단쇄 heteroatomic 또는 heterocyclic intersugar 결합을 사용하여 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 치환된 당 잔기를 가질 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 변형된 염기 또한 가질 수 있다. 변형된 염기의 예는 하이포잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘 (특히, 5-메틸시토신), 5-하이드로메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC, 젠티오바이오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-aminohexyl) 아데닌 및 2, 6-디아미노퓨린을 포함한다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 그 이상의 잔기 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성 및 세포흡수를 향상시키는 복합체에 화학적으로 결합될 수 있다. 예를 들어, liphophilic 잔기는 콜레스테롤 잔기, 콜레스테릴 잔기, 콜산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 인지질, 폴리아민 사슬, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아 다만 아세트산, 팔미틸 잔기, 옥타데실아민 잔기 및 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 잔기를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 지질 잔기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 제조방법은 당해 기술 (US 특허 제 5,138,045, 5,218,105 및 5,459,255)에 잘 알려져 있다. 변형된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제의 존재 시에 안정성이 향상될 수 있으며, 표적 mRNA에 대한 결합 친화성이 향상될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 인체에 투여되거나 생체 내에서 합성될 될 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 RNA 폴리머라제 I을 사용하는 것이다. 생체 내 안티센스 RNA의 합성방법은 역방향의 다중 클로닝 부위 (MCS)을 포함하는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA 전사를 수행하는 것을 수반한다. 이러한 안티센스 RNA는 펩타이드 서열로 번역을 차단하기 위해 그 서열에 번역 종결 코돈을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명에 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인은 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL (Weiss, B. (ed.): Antisense Oligodeoxynucleotides and Antisense RNA: Novel Pharmacological and Therapeutic Agents, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997; Weiss, B., et al., Antisense RNA gene therapy for studying and modulating biological processes. Cell. Mol. Life Sci., 55:334-358(1999))의 염기서열을 참조하여 당해 분야에 공지된 방법에 의해 쉽게 수행될 수 있다.
본 발명의 용어 "siRNA"는 RNA 간섭 또는 유전자 침묵(참고: WO 00/44895, WO 01/36646, WO 99/32619, WO 01/29058, WO 99/07409 및 WO 00/44914)을 매개할 수 있는 핵산분자를 의미한다. siRNA는 표적유전자의 발현을 억제 할 수 있기 때문에, 유전자 녹다운 또는 유전자 치료의 효과적인 방법을 제공한다. 우선 식물, 벌레, 초파리 및 기생충에서 발견된 siRNA는 최근에 개발되었고 포유동물 세포의 연구에 이용되고 있다.
본 발명에 사용된 siRNA 분자의 경우, 그것의 센스가닥 (TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL mRNA 서열에 상응하는 서열) 및 그것의 안티센스 가닥 (TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL mRNA에 상보적인 서열)이 이중가닥을 형성하는 구조를 가질 수 있다. 대안적으로, 자가 보완적인 센스 및 안티센스 가닥을 갖는 단일가닥 구조를 가질 수 있다.
siRNA는 이중가닥 RNA 부분이 전체 쌍을 구성하는 것에 한정되지 않고, mismatch (상응하는 염기들이 상보적이지 않음), bulge (한 체인에서도 상응 염기가 없음) 등과 같은 짝이 없는 잔기를 포함한다. siRNA의 총 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기일 수 있다.
siRNA의 말단은 RNA 간섭 (RNAi) 통해 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL 유전자의 발현을 억제할 수 있는 한, blunt 또는 cohesive일 수 있다. 상기 cohesive는 3'- 또는 5'- cohesive 중 어느 하나가 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 siRNA분자는 자가 보완적인 센스 및 안티센스 가닥 사이에 삽입된 짧은 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 약 5 내지15 뉴클레오타이드)을 가질 수 있다. 이 경우, 상기 뉴클레오티드 서열의 발현으로부터 형성된 siRNA분자는 분자 내 혼성화 통해 헤어핀 구조를 형성하고, 그 결과 stem-and-loop 구조 전체가 된다. Stem-and-loop 구조는 생체 외 또는 생체 내 과정을 거쳐 RNAi를 매개할 수 있는 활성화된 siRNA 분자가 된다.
본 발명의 용어 "앱타머"는 특정 표적분자를 위한 결합 친화도를 갖는 핵산분자를 지칭한다. 앱타머는 특정 표적분자에 결합하여 특정 표적분자의 활성을 억제도 할 수 있다. 본 발명의 앱타머는 RNA, DNA, 변형된 핵산 또는 이의 혼합물 일 수 있다. 본 발명의 앱타머는 선형 또는 원형도 될 수 있다. 본 발명의 앱타머는 특히 길이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 약 15 내지 200개의 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있는데 예를 들면, 약 100개의 뉴클레오티드 또는 그 이하, 바람직하게는 약 80개의 뉴클레오티드 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 약 45개의 뉴클레오티드 또는 그 이하를 가질 수 있다. 본 발명의 앱타머는 약 18, 20 또는 25 개의 뉴클레오티드 또는 그 이상의 길이를 가질 수 있다. 뉴클레오티드의 총 갯수가 작은 경우, 화학적 합성 및 대량생산이 용이할 것이며, 주요 이점은 비용 면에 있다. 화학적 변형도 용이하고, 인체의 안정성이 높고, 독성이 낮다.
본 발명의 앱타머는 SELEX 방법 또는 향상된 이의 버전 (예를 들면, Ellington et al., Nature, 1990 346, 818-822; Tuerk et al., Science, 1990 249, 505-510)을 이용하여 제조될 수 있다. SELEX 방법은 10 내지 14개의 상이한 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 풀에서 표적분자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드를 선택하는 방법이다. 사용된 올리고뉴클레오티드는 프라이머 서열에 의해 있는 약 40 개 잔기의 임의 서열을 가지고 있다. 이 올리고뉴클레오티드 풀은 표적분자와 혼합할 수 있으며, 필터 또는 그와 같은 것을 사용하여 표적분자에 결합된 RNA만 수집된다. 수집된 올리고뉴클레오티드는 RT-PCR에 의해 증폭되고, 이는 다음 라운드를 위한 주형으로 사용된다. 이 조작을 10 회 반복함으로써, 표적분자에 특이적으로 결합하는 앱타머를 얻을 수 있다. 라운드의 수를 증가시키거나 경쟁물질을 사용함으로써, 표적분자에 대한 결합 가능성을 나타내는 앱타머가 농축되고 선택된다. 따라서, SELEX 의 라운드 수를 조절하거나 및/또는 경쟁 상태를 바꾸면서, 상이한 결합힘 또는 결합모드를 갖는 앱타머 및 동일한 결합력 또는 결합 모드 그러나 서로 다른 염기서열을 갖는 앱타머가 몇몇 경우에서 얻을 수 있다. SELEX 방법은 PCR에 의한 증폭과정을 포함한다; 그 과정에서, 망간이온 또는 그와 같은 것을 이용하여 돌연변이를 야기함으로써, 높은 다양성을 갖는 SELEX를 수행할 수 있는 것이 가능하다.
알려진 SELEX 방법 뿐만아니라, 앱타머는 복잡한 표적들, 살아있는 세포 및 조직 (Guo et al. Int. J. Mol. Sci., 9(4): 668, 2008)을 위한 Cell-SELEX 방법을 이용하여 얻을 수 있고, Cell-SELEX 방법은 표면에 표적분자의 사전지식 없이 질병에 대한 앱타머를 직접 선택하는 장점을 가진다. 또한, Cell-SELEX 방법은 분리되었을 때 고유의 특성을 보이지 않을 수 있기 때문에 선택과정 동안 생리학적 상태에 있는 표적 단백질을 위한 기능적 접근이 가능한 종래의 SELEX 방법 보다 유리하다.
한편, 앱타머는 인산기의 음전하를 기초로 한 이온결합, 리보오스를 기초로 한 소수성결합 및 수소결합 그리고 핵산염기를 기초로 한 스태킹 상호작용과 같은 매우 다양한 결합모드에 있는 표적분자와 결합한다. 특히, 구성하는 뉴클레오티드의 수와 동일한 수로 존재하는 인산기의 음전하에 기초로 한 이온결합은 강하고, 단백질의 양전하의 표면에 존재하는 리신 및 아르기닌과 결합한다. 이러한 이유로, 표적분자로 직접결합에 관여하지 않는 핵산염기가 치환될 수 있다. 특히, 스템 구조의 부위는 이미 염기쌍을 형성했고, 이중나선 구조의 내부를 대향하기 때문에, 핵산염기들이 표적분자에 직접 결합할 것 같지 않다. 따라서, 염기쌍이 다른 염기쌍으로 대체되는 경우에도, 상기 앱타머의 활성은 종종 감소하지 않는다. 루프구조와 같이, 어떠한 염기쌍도 형성되지 않는 구조에서, 상기 핵산염기가 표적분자에 직접결합 하는 것에 관여하지 않을 때, 염기치환이 가능하다. 예를 들어, 리보오스의 2'-위치에서 하이드록실 기는 원자 또는 기로 치환된다. 원자 또는 기의 예로는 수소원자, 불소원자 또는 -O-알킬기 (예를 들어, -O-CH3) -O-아실기 (예를 들면, -O-CHO) 및 아미노기 (예를 들어, -NH2)를 들 수 있다. 만약 표적분자로 직접 결합하는 것에 관여하는 기능기가 치환되거나 삭제되지 않는다면, 앱타머는 종종 이의 활성을 유지한다.
또한, 앱타머들은 화학적 합성을 허용하기 때문에 쉽게 변형될 수 있다. 앱타머를 위해서, MFOLD 프로그램을 이용한 2 차 구조를 예측하고, 또는 X 선 분석 이나 NMR 분석에 의한 입체구조를 예측함으로써, 핵산이 치환될 수 있거나 삭제될 수 있는 정도를 예측하는 것이 가능하고 새로운 염기로 삽입되는 것이 가능하다. 새로운 서열로 예측된 앱타머는 화학적으로 쉽게 합성될 수 있고, 기존 분석 시스템을 이용하여 활성을 유지할지 여부를 판정할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 각 뉴클레오티드의 당 잔기 (예를 들어, 리보스)가 결합 활성, 안정성, 약물 공급능력 또는 그와 같은 것을 높이기 위하여 변형된 것의 하나일 수 있다. 당 잔기에서 변형 예로서, 다른 원자를 가진 당 잔기의 2'-위치 3'-위치 및/또는 4'-위치 또는 그와 같은 것에서의 산소원자의 치환이 언급될 수 있다. 변형의 종류로서, 플루오르화, O-알킬화 (예를 들면, O-메틸화, O-에틸화), Oarylation, S-알킬화 (예를 들면, S-메틸화, S-에틸화), S-아릴화 및 아민화 (예를 들면, -NH)가 언급될 수 있다. 당 잔기에서 이러한 변화는 그 자체가 알려진 방법에 의해서 수행될 수 있다 (e.g., Sproat et al., Nucle. Acid. Res. 1991 19, 733-738; Cotton et al., Nucl. Acid. Res. 1991 19, 2629-2635; Hobbs et al., Biochemistry 1973 12, 5138-5145).
본 발명의 앱타머는 결합활성을 증가시키기 위하여 핵산염기 (예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘)를 가질 수도 있고, 변할 수도 (예를 들면: 화학적 치환에 의해) 있다. 그런 변형의 예로, 5-위치에 있는 피리미딘 변형, 6- 및/또는 8-위치에 있는 퓨린 변형, extracyclic 아민으로 변형, 4- thiouridine로 변형 및 5-브로모 또는 5-이오도-우라실로 치환이 언급될 수 있다.
본 발명의 앱타머에 함유되어 있는 인산기는 뉴클레아제 가수분해에 대한 내성을 부여하기 위해 변경될 수 있다. 예를 들어, P(O)O 기는 P(O)S (티오에이트), P(S)S (디티오에이트), P(O)NR2 (아미데이트), P(O)R, R(O )OR ', CO 또는 CH2 (formacetal) 또는 3'-아민 (-NH-CH2-CH2-) [각각의 R 또는 R' 단위가 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환된 알킬 (예들 들면, 메틸, 에틸)인 곳] 과 치환될 수 있다. 예를 들면, 결합기는 -O-, -S- 또는 -N-이고, 뉴클레오타이드는 이러한 결합기를 통하여 인접한 뉴클레오타이드에 결합할 수 있다.
변형은 또한 3' 및 5'에서 capping과 같은 변형을 포함할 수 있다. 변형은 또한 말단에 폴리에틸렌글리콜, 아미노산, 펩티드, inverted DT, 핵산, 뉴클레오사이드, 미리스토일, Lithocolic-oleyl, Docosanyl, 라우로일, 스테아로일, 팔미토일, 올레일, 리놀레일, 다른 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 안료, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성물질, 비오틴과 같은 것을 말단에 첨가함으로써 수행될 수 있다. 이러한 변형을 위하여 예를 들어, 미국 특허 제 5,660,985 및 5,756,703을 참조한다.
또한, 앱타머는 항암제, 독소, 종양억제 유전자 및 리포좀 또는 나노입자로 캡슐화된 siRNA (small interfering RNA)를 상기 표적세포로 운반하는 리포좀 또는 나노입자의 표면에 부착된다.
본 발명에서, TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL의 발현을 억제하는 물질은 특히, 그 물질의 활성은 항체, 펩티드, 저분자량 화합물, 또는 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8 - LEL에 특이적으로 결합하는 천연 추출물인 것이 바람직하다.
특히 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL에 특이적으로 결합할 수 있는 항체는, 상기와 같이 설명된다.
그 활성을 억제하기 위해 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL에 특이적으로 결합하는 펩티드는 당업계에 알려진 통상적인 방법 예를 들면, 파지 디스플레이 (Smith GP, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface". Science 228 (4705):1315-1317(1985); Smith GP, Petrenko VA, "Phage display". Chem. Rev. 97(2):391-410(1997))에 의해 얻을 수 있다.
바람직하게는, 암 및/또는 암 전이를 억제하기 위한 조성물은 암 및/또는 암 전이를 억제함으로써 암 및/또는 암 전이를 억제할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 암 및/또는 암 전이를 억제하기 위한 키트를 제공하며, 상기 조성물은 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL의 발현을 억제하는 물질을 포함한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 이를 필요로 하는 개체에 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암 및/또는 암 전이를 억제하는 방법을 제공하며, 그 점에서 상기 조성물은 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL 의 발현을 억제하는 물질을 포함한다. 본 발명은 또 다른 관점에서, 이를 필요로 하는 개체에 상기 조성물을 투여하는 것을 포함하는 암 치료법을 제공하며, 그 점에서 상기 조성물은 TSPAN8, 바람직하게는 TSPAN8-LEL 의 발현을 억제하는 물질을 포함한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 약물에 연결된 1항 내지 제 17 항 중 어느 하나의 상기 항체를 포함하는 항체-약물 결합체를 제공한다. 상기 약물은 독소, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-리보실 전이효소, 방사성 동위원소 및 핵산분해효소로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 항체-약물 결합체는 세포로 내재화될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 세포는 암세포가 될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, TSPAN8-LEL IgG는 암 세포와 같은 TSPAN8를 발현하는 세포로 내재화될 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암 및/또는 암 전이를 예방하거나 치료하기 위한 약학 조성물을 제조하기 위하여 TSPAN8 및 Fc의 LEL의 상기 융합 단백질의 용도를 제공한다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 암 및/또는 암 전이를 예방하거나 치료하기 위한 약학 조성물 제조의 용도를 위하여 TSPAN8 및 Fc의 LEL의 상기 융합 단백질을 제공한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 일들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 세포배양 및 형질감염
인간 대장암 세포주 (HCT-8, HCT116, SW 480 및 LoVo), 췌장암 세포주 (PANC-1), 아교모세포종 세포주 (U87), 난소암 세포주 (SK-OV-3) 및 COS-7 세포는 모두 KCLB (대한민국 세포주은행)로부터 분양 받았다. 세포주는 사용설명서에 따라 10% 소태아 혈청 (FBS; Gibco) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신 (Gibco)을 포함하는 RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) 또는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco) 배지로 배양하여 준비하였다. HUVECs (Lonza, Baltimore, MD, USA)는 EGM-2 (endothelial growth medium-2)에서 유지되었다. 모든 세포는 CO2 (5%) 가 공급되는 37℃ 배양기 (Sanyo, Panasonic Healthcare Company, Wood Dale, IL, USA)에서 유지되었다. Expi293 세포는 8% CO2가 공급되는 37℃의 Multitron 진탕배양기 (Infors HT, Switzerland)에서 FreestyleTM 발현 배지 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로 배양하였다.
형질감염 24시간 전에 세포는 50 - 80% 로 배양되고, 제조업체의 지시에 따라 Lipofectamine 2000 transfection reagent (Invitrogen)를 이용하여, TSPAN8 (Thermo scientific, Pittsburgh, PA, USA)에 특이적인 ON-TARGET plus Smart pool siRNA 및 TSPAN8-플라스미드를 일시적으로 형질감염 시켰다. TSPAN8 녹다운 및 과발현을 검사하기 위해, 형질감염 2일 후 세포를 수거하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
세포는 RIPA 용해 완충액 (150 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS), 1% Triton X-100 [TX-100], 및 protease inhibitor cocktail [GenDEPOT, Barker, TX, USA])을 이용하여 4℃에서 30분 동안 용해시키고, 13,000 rpm에서 39분간 원심분리 하였다. 용해물은 12% 폴리아크릴아미드 겔의 각 웰에 로딩하였다. 전기영동 후, 단백질은 습식 트랜스퍼 시스템 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)를 이용하여 니트로셀룰로스 멤브레인으로 옮겨 주었다. 멤브레인은 5% 스킴밀크를 포함하는 TBST (10 mM Tris/HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; and 0.05% Tween 20)에 상온에서 1시간 동안 반응시키고, 5% 스킴밀크를 포함하는 TBST에서 래트 항-TSPAN8 모노클로날 항체 (2 ㎍/ml; R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA), 마우스 항-p120 catenin 모노클로날 항체 (1:1,000; BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 및 마우스 항-β-액틴 모노클로날 항체 (1:5,000; Applied Biological Materials Inc., Richmond, BC, Canada)를 4℃로 하룻밤 동안 반응시켰다. 멤브레인을 TBST로 세척하고, horseradish peroxidase (HRP)-conjugated 고트 항-래트 IgG (1:3,000; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) 및 HRP-conjugated 고트 항-마우스 IgG (1:3,000; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 5% 스킴밀크를 포함하는 TBST에 희석하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. TBST로 여러 번 세척하고, 제조업체의 지시에 따라 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA)를 이용하여 단백질 밴드를 시각화 하였다.
포르말린으로 고정하고, 파라핀으로 embed된 섹션은 전자레인지 700W에서 5분 동안 0.01 M 시트레이트 완충액 pH 6.0으로 처리한 후, 300W에서 5분 동안 처리하였다. 섹션에서 내인성 알칼리 포스파타제 활성은 6분 동안 3 % 과산화수소로 처리하여 억제시켰다. 슬라이드를 5분 동안 블록킹 한 후, 1:200의 비율로 희석한 항-TSPAN8 항체 (Abcam, Cambridge, MA, USA)로 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. PBS로 완전히 세척한 후, 슬라이드는 1:200의 비율로 희석한 비오틸레이티드 2차 항-래빗 항체 (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)와 30분 동안 반응한 후 다시 아비딘-비오틴 페록시다아제로 30분 동안 반응하였다. 발색반응을 위하여, 슬라이드는 DAB (3.3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드) 용액과 2분 동안 반응시켰다. 모든 샘플은 탈수 및 마운팅하기 전에 Meyer's hematoxylin으로 10 초 동안 가볍게 대조염색하였다. 샘플은 위상차 현미경 (BX51, Olympus, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
실시예 2: Fc 융합 단백질의 설계 및 제작
TSPAN8-LEL (아미노산 110 내지 205, 서열번호 9)는 다음의 프라이머를 이용하여 증폭시켰다: 5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCAAATCTAAGTCTGATCGCATTG-3' (서열번호: 1) 및 5'-TCGCGGCCGGCCTGGCCATTTTTTGCCAAGAAGTC-3' (서열번호: 2). TSPAN8-SEL (아미노산 34 내지 57) 구조체는 다음과 같은 프라이머를 이용하여 생성되었다: 5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCCGAGTAAGCAATGACTCTCAAG-3' (서열번호: 3) 및 5'-TCGCGGCCGGCCTGGCCGTCCACAGCAACGTAGGAG-3' (서열번호: 4). TSPAN1-LEL (아미노산 110 내지 211) 구조체는 다음과 같은 프라이머를 이용하여 생성되었다: 5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCAAATCTAAGTCTGATCGCATTG-3' (서열번호: 5) 및 5'-TCGCGGCCGGCCTGGCCATTTTTTGCCAAGAAGT-3' (서열번호: 6). 모든 프라이머는 양쪽 5 ' 및 3' 말단에 SfiI 제한 사이트를 추가하도록 설계되었다. PCR 절편은 SfiI (NEB, Ipswich, MA, USA) 로 절단되고, 클로닝 부위의 3'말단에 있는 힌지 및 인간 IgG1의 CH2-CH3 도메인 (한국, 서울대학교 Dr. 정에게 받음)을 코딩하는 변형된 pCEP4 포유동물 발현벡터 (Invitrogen)에 클로닝 하였다. 접합된 산물은 염화칼슘-competent 대장균 DH5α세포로 형질전환 시키고, 플라스미드 DNA는 이들 세포로부터 분리하였다. HEK293F 세포 (6 X 108 세포)에 1.5 mg의 폴리에틸렌이민 (Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA)을 이용하여 각 DNA 0.75 mg을 형질도입 하였다. 형질도입된 세포는 FreestyleTM 발현 배지에 유지시켰다. 7일 후, 배양 배지를 수거하고, 융합 단백질은 단백질 A 세파로스 (GenScript, Piscataway, NJ, USA)로 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. NanoDrop 분광광도계 (Wilmington, DE, USA)를 이용하여 단백질 농도를 정량하고 PBS에서 투석한 후, 샘플의 순도는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE) 및 쿠마시 브릴리언트 블루염색으로 분석하였다.
최종 분획을 소분하여 -80℃에 보관 하였다.
서열의 종류 세부사항
TSPAN8의 아미노산 서열
(인간TSPAN8)
서열번호: 7		 MAGVSACIKYSMFTFNFLFWLCGILILALAIWVRVSNDSQAIFGSEDVGSSSYVAVDILIAVGAIIMILGFLGCCGAIKESRCMLLLFFIGLLLILLLQVATGILGAVFKSKSDRIVNETLYENTKLLSATGESEKQFQEAIIVFQEEFKCCGLVNGAADWGNNFQHYPELCACLDKQRPCQSYNGKQVYKETCISFIKDFLAKNLIIVIGISFGLAVIEILGLVFSMVLYCQIGNK
TSPAN8의 핵산 서열
(인간TSPAN8)
서열번호: 8		 ATGGCAGGTGTGAGTGCCTGTATAAAATATTCTATGTTTACCTTCAACTTCTTGTTCTGGCTATGTGGTATCTTGATCCTAGCATTAGCAATATGGGTACGAGTAAGCAATGACTCTCAAGCAATTTTTGGTTCTGAAGATGTAGGCTCTAGCTCCTACGTTGCTGTGGACATATTGATTGCTGTAGGTGCCATCATCATGATTCTGGGCTTCCTGGGATGCTGCGGTGCTATAAAAGAAAGTCGCTGCATGCTTCTGTTGTTTTTCATAGGCTTGCTTCTGATCCTGCTCCTGCAGGTGGCGACAGGTATCCTAGGAGCTGTTTTCAAATCTAAGTCTGATCGCATTGTGAATGAAACTCTCTATGAAAACACAAAGCTTTTGAGCGCCACAGGGGAAAGTGAAAAACAATTCCAGGAAGCCATAATTGTGTTTCAAGAAGAGTTTAAATGCTGCGGTTTGGTCAATGGAGCTGCTGATTGGGGAAATAATTTTCAACACTATCCTGAATTATGTGCCTGTCTAGATAAGCAGAGACCATGCCAAAGCTATAATGGAAAACAAGTTTACAAAGAGACCTGTATTTCTTTCATAAAAGACTTCTTGGCAAAAAATTTGATTATAGTTATTGGAATATCATTTGGACTGGCAGTTATTGAGATACTGGGTTTGGTGTTTTCTATGGTCCTGTATTGCCAGATCGGGAACAAA
TSPAN8 LEL의 아미노산 서열
(인간TSPAN8 LEL)
서열번호: 9		 KSKSDRIVNETLYENTKLLSATGESEKQFQEAIIVFQEEFKCCGLVNGAADWGNNFQHYPELCACLDKQRPCQSYNGKQVYKETCISFIKDFLAKN
TSPAN8 LEL의 핵산 서열
(인간 TSPAN8 LEL)
서열번호: 10		 AATCTAAGTCTGATCGCATTGTGAATGAAACTCTCTATGAAAACACAAAGCTTTTGAGCGCCACAGGGGAAAGTGAAAAACAATTCCAGGAAGCCATAATTGTGTTTCAAGAAGAGTTTAAATGCTGCGGTTTGGTCAATGGAGCTGCTGATTGGGGAAATAATTTTCAACACTATCCTGAATTATGTGCCTGTCTAGATAAGCAGAGACCATGCCAAAGCTATAATGGAAAACAAGTTTACAAAGAGACCTGTATTTCTTTCATAAAAGACTTCTTGGCAAAAAAT
실시예 3: 파지 디스플레이 기술을 이용한 TSPAN8-LEL scFvs의 선정
인간 합성의 scFv 항체 라이브러리의 Fc 바인더 프리-클리어링은 상기 기술한 바와 같이 수행되었다. 바이오패닝의 각 라운드를 위해서, 자기비드 (Dynabeads M-270 epoxy, Invitrogen)는 4㎍의 인간 TSPAN8-LEL-FC로 코팅되고, 이 코팅된 비드는 상기 기술한 바와 같이 여섯 라운드의 바이오패닝을 실시하였다. 바이오패닝의 최종 라운드 후, 아웃풋 플레이트에서 자란 콜로니로부터 임으로 선별된 scFv를 표시한 96개의 개별 파지클론은 효소면역측정법을 이용하여 인간 TSAN8-LEL-Fc에 대한 그들의 활성을 조사하였다. 최종 scFv 클론의 DNA는 DNA 염기서열을 분석하고, 상보성 결정부위 (CDR) 서열이 다른 네 개의 scFv 클론으로 분류되었다.
TSPAN8 LEL IgG의 VH 도메인의 아미노산 서열
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
클론1
(서열번호: 21)		 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSNYAMS
(서열번호: 11)		 WVRQAPGKGLEWVS GISPNSGNKYYADSVKG
(서열번호: 13)		 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR RSTIFDY
(서열번호: 17)		 WGQGTLVTVSS
클론2
(서열번호: 22)		 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSNYAMS
(서열번호: 11)		 WVRQAPGKGLEWVS AISPGSGNTYYADPVKG
(서열번호: 14)		 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR RSSVFDY
(서열번호: 18)		 WGQGTLVTVSS
클론3
(서열번호: 23)		 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSSYSMS
(서열번호: 12)		 WVRQAPGKGLEWVS AISPGSSNTYYADSVKG
(서열번호: 15)		 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR KHMPFDY
(서열번호: 19)		 WGQGTLVTVSS
클론 4
(서열번호: 24)		 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAAS GFTFSNYAMS
(서열번호: 11)		 WVRQAPGKGLEWVS AISPGSSNKYYADSVKG
(서열번호: 16)		 RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR KHLPFDY
(서열번호: 20)		 WGQGTLVTVSS
TSPAN8 LEL IgG의 VL 도메인의 아미노산 서열
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
클론1
(서열번호: 40)		 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC TGSSSNIGSNDVS
(서열번호: 29)		 WYQQLPGTAPKLLIY DNSHRPS
(서열
번호: 33)		 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC GAWDASLSGYV
(서열번호: 36)		 FGGGTKLTV
클론2
(서열번호: 41)		 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGSNDVT
(서열번호: 30)		 WYQQLPGTAPKLLIY SNSHRPS
(서열
번호: 34)		 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC GTWDSSLSGYV
(서열번호: 37)		 FGGGTKLTV
클론3
(서열번호: 42)		 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGNNSVY
(서열번호: 31)		 WYQQLPGTAPKLLIY SDSQRPS
(서열
번호: 35)		 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC GTWDYSLNGYV
(서열번호: 38)		 FGGGTKLTV
클론4
(서열번호: 43)		 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGNNDVY
(서열번호: 32)		 WYQQLPGTAPKLLIY SDSQRPS
(서열
번호: 35)		 GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC GSWDYSLSGYV
(서열번호: 39)		 FGGGTKLTV
TSPAN8 LEL IgG 의 VH 도메인의 뉴클레오티드 서열
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
클론1
(서열번호: 25)		 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT GGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA GGGATCTCTCCTAATAGTGGTAATAAATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGT CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGA CGGAGTACGATTTTCGACTAC TGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
클론2
(서열번호: 26)		 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT GGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA GCGATCTCTCCTGGTAGTGGTAATACATATTACGCTGATCCTGTAAAAGGT CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGA AGGTCTAGTGTTTTCGACTAC TGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
클론3
(서열번호: 27)		 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT GGATTCACCTTTAGCAGTTATTCTATGAGC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA GCGATCTCTCCTGGTAGTAGTAATACATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGT CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGA AAGCATATGCCGTTCGACTAC TGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
클론4
(서열번호: 28)		 GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCT GGATTCACCTTTAGCAATTATGCTATGAGC TGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCA GCGATCTCTCCTGGTAGTAGTAATAAATATTACGCTGATTCTGTAAAAGGT CGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGA AAGCATTTGCCGTTCGACTAC TGGGGCCAGGGTACACTGGTCACCGTGAGCTCA
TSPAN8 LEL IgG 의 VL 도메인의 뉴클레오티드 서열
FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
클론1
(서열번호: 44)		 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGT ACTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGATGTCTCC TGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTAT GATAATAGTCATCGGCCAAGC GGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGT GGTGCTTGGGATGCTAGCCTGAGTGGTTATGTC TTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTA
클론2
(서열번호: 45)		 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGT AGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAGTAATGATGTCACC TGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTAT TCTAATAGTCATCGGCCAAGC GGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGT GGTACTTGGGATTCTAGCCTGAGTGGTTATGTC TTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTA
클론3
(서열번호: 46)		 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGT AGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATTCTGTCTAC TGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTAT TCTGATAGTCAGCGGCCAAGC GGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGT GGTACTTGGGATTATAGCCTGAATGGTTATGTC TTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTA
클론4 (서열번호: 47) CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGT AGTGGCTCTTCATCTAATATTGGCAATAATGATGTCTAC TGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTAT TCTGATAGTCAGCGGCCGAGC GGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGT GGTTCTTGGGATTATAGCCTGAGTGGTTATGTC TTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACGGTCCTA
실시예 4: 세포 침윤 분석
세포침윤 분석은 변형된 Boyden 챔버법을 이용하여 수행되었다. 24-웰 세포배양 플레이트 (BD Biosciences, Bedford, MA)에 8 ㎛의 기공을 갖는 마트리겔이 코팅된 트랜스웰 인서트 막이 상기 기술한 바와 같이 사용되었다 (참조. 침윤 분석을 위해). Mock- 또는 TSPAN8이 형질도입 된 COS-7 세포 (1 X 105 세포/웰) 또는 RNA 또는 TSPAN8 siRNA (Dharmacon, Chicago, IL, USA)가 형질도입 된 HCT-8 (1 X 105 세포/웰) 또는 SK-OV (5 X 104 세포/웰) 세포를 무혈청 배지로 상부 챔버에 분주하고 하부 챔버는 화학 유인물질로써 10% FBS를 포함하는 완전배지를 충전하였다. 대조군 항체와 TSPAN8 scFv-FC (100 ㎍/㎖)는 HCT-116 (1 X 105 세포/웰), LoVo (1 X 105 세포/웰), SW480 (1 X 105 세포/웰), U87 (3 X 104 세포/웰) 및 PANC-1 (1 X 105 세포/웰) 세포주에 첨가되었고, 대조군 IgG 또는 TSPAN8 IgG (20 ㎍/㎖)는 무혈청 배지로 상부 챔버에서 HCT-8 (1 X 105 세포/웰) 및 SK-OV-3 (5 X 104 세포/웰) 세포와 함께 배양되었다. HCT-8 세포는 TSPAN8-LEL의 억제효과를 시험하기 위하여 무혈청 배지에서 Fc, TSPAN1-LEL-Fc, TSPAN8-SEL-Fc 및 TSPAN8-LEL-Fc (25 ㎍/㎖) 가 존재하는 상부 챔버에 분주되었다. 37℃의 5% CO2 챔버에서 22 내지 48시간 동안 배양한 후, 비-침윤 세포는 면봉으로 막의 상부면을 닦아 제거하고, 그 막은 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하여 실온에서 20분 동안 0.2% 크리스탈바이올렛으로 염색하였다. 세포침윤의 정도는 필터당 세개의 랜덤필드 (X 200)에서 막을 통해 이동한 세포를 카운팅하여 정량하였다. 실험은 삼중으로 3 회 반복 되었다.
실시예 5: 부착 분석
약간의 변형된 상기 기술 한 바와 같이, 백혈구 부착 분석을 수행하였다. 간단히, 6 X 104의 HUVECs은 24-웰 플레이트에 미리 분주되었다. 동시에, mock- 또는 TSPAN8이 형질도입 된 COS-7 세포 또는 스크램블된 RNA- 또는 TSPAN8 siRNA가 형질도입 된 HCT-8 세포는 5, 6-carboxy-fluorescein succimidyl ester (CFSE; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)로 표지 되었고, 6 X 104, 1.2 X 105, 2.4 X 105 또는 4.8 X 105 세포가 각 웰에 첨가되었다. CFSE로 표지된 세포는 37℃의 5% CO2 배양기에서 1 시간 동안 HUVEC와 함께 배양되었다. 결합되지 않은 세포를 제거하기 위해, 웰을 0.2 mM CaCl2 및 0.1 mM MgCl2를 포함하는 PBS로 5 회 세척하였다. 결합된 세포는 trypsin/EDTA (Gibco, Toronto, Ontario, Canada)로 5 분 처리하여 탈착한 후, 10% FBS를 포함하는 DMEM으로 2 회 세척하였다. 유세포 분석에서, 형광을 가진 세포는 HUVEC에 부착한 CFSE로 표지된 세포로써 카운팅 되었다. 상기 분석은 여기 488 nm에서 FACS Calibur instrument (BD Biosciences)를 이용하여 수행되었고, 방출 필터는 530/30 bandpass로 설정되었다. 각각의 측정을 위해, 10,000개의 세포가 게이팅 없이 카운팅 되었다. 결과는 총 카운팅 된 이벤트 중 카운팅 된 CFSE-양성 세포의 비율로 표시하였다.
실시예 6: 세포 생존율 측정
약 6 X 103개의 mock- 또는 TSPAN8가 형질도입 된 COS-7 세포 또는 2 X 104개의 스크램블 RNA- 또는 TSPAN8 siRNA가 형질도입 된 HCT-8 세포를 96 웰 플레이트에 분주하였다. 그 다음, 2일 후 제조업체의 지시에 따라 Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 최종 흡광도는 spectrophotometer (VICTOR™ X4, Perkin Elmer, MA, USA)로 450 nm에서 측정되었다.
실시예 7: 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA)
4개의 선택된 클론의 특이성 측정을 위해, 재조합 TSPAN8-LEL-Fc, TSPAN8-SEL-Fc, TSPAN1-LEL-Fc, 또는 IgG1의 Fc 단편 0.1 ㎍이 용해된 100 ㎕의 PBS를 96 웰 마이크로 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 하룻밤 배양하여 PBST (0.05% Tween 20를 포함하는 PBS)로 3회 세척한 후, 플레이트를 2% 스킴밀크가 포함된 PBS로 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 다음, 3% BSA를 포함하는 PBST에서 37℃로 2시간 동안 관련 없는 scFv-Fc 또는 TSAN8-LEL scFv-Fcs 0.1 ㎍과 배양하였다. 2시간 후 PBST로 세척하고, 3% BSA를 포함하는 PBST에서 HRP-conjugated anti-human lambda light Chain antibody (1:5,000; Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA)와 반응시켰다. PBST로 3회 세척하고, 100 ㎕l의 3,3',5,5'- 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 용액(BD Biosciences)을 각 웰에 첨가하였다. 마이크로 플레이트에 동량의 1N H2SO4를 첨가하여 반응을 종료시켰다. 마이크로 리더 (VICTOR™ X4, Perkin Elmer)를 이용하여 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
실시예 8: 유세포 분석
세포를 수확하고 4% 포름알데하이드 (PFA)로 30분간 상온에서 고정시켰다. 세척 후, 1% BSA가 포함된 PBS 염색 버퍼에서 20 ㎍/ml TSPAN8 IgG로 상온에서 1시간 동안 염색하였다. 염색 버퍼로 3회 세척하여 1,000 X g로 10분간 원심분리하고, DyLight-488 표지된 항-인간 Fc 항체 (1:1,000; Jackson Immunoresearch Laboratory Inc., West Grove, PA, USA)로 염색 버퍼에서 상온으로 1시간 동안 세포를 반응시켰다. 유세포 분석기 (BD FACSCalibur, BD Bioscience)로 세포를 수집한 다음, FlowJo 소프트웨어 (TreeStar, Ashland, OR, USA)를 사용하여 분석을 수행하였다.
실시예 9: TSPAN8 - LEL IgG 항체의 제조 및 생산
선택된 scFv 클론 4개의 가변 중쇄 유전자는 프라이머 5'-CGGGAATTCGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTCTTCTTCCTGTCAGTAACTACAGGTGTCCTCTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTG-3' (서열번호 48) 및 5'-GGCGGGCCCTTG GTGGAGGCTGAGCTCACGGTGACCAGTGTACCCTG-3' (서열번호 49)를 이용하여 증폭하였다. 클론의 가변 경쇄 유전자는 프라이머 5'-CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGAAGGACCAGTCTGTGCTGACTCAGCC-3' (서열번호 50) 및 5'- GGCCGTACGTAGGACCGTCAGCTTGGTGCCTCCGCC-3' (서열번호 51)를 이용하여 증폭하였다. 가변 중쇄 프라이머는 5' 및 3'의 양 말단에 EcoRI 및 ApaI 제한 사이트를 추가하도록 설계하였다. 가변 경쇄 프라이머는 5' 및 3'의 양 말단에 HindIII 및 BsiWI 제한 사이트를 추가하도록 설계하였다. PCR 단편을 적절한 제한효소 (NEB)로 절단하고, 가변 중쇄 클로닝 부위의 인간 IgG1 3'의 힌지와 CH2-CH3 도메인을 암호화하는 bicistronic 포유동물 발현벡터 pCDNA3.1 (Invitrogen)에 클로닝 하였다. TSPAN8-LEL IgG을 생산한 다음, 항체는 Ultra Protein A 레진 (GeneScript USA Inc., Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 친화성 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. PBS에서 투석 후 NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Boston, MA, USA)을 사용하여 단백질을 정량하고, 항체를 소분하여 -80℃에 저장하였다.
실시예 10: 면역블롯 분석
인간 상피성 난소암 세포주, 또는 대조군 IgG- 또는 TSPAN8-LEL IgG-처리한 SK-OV3 세포의 용해물 30 ㎍을 폴리아크릴아마이드 겔의 웰 각각에 넣고, 전기영동 후 습식 트랜스퍼 시스템 (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)을 이용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 트랜스퍼 시켰다. 5%(w/v) 스킴밀크가 포함된 TTBS (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 및 0.05% (v/v) Tween 20)에서 블로킹한 후, 멤브레인을 래빗 항-TSPAN8 폴리클로날 항체(1:1,000; Abcam) 또는 마우스 항-β-액틴 모노클로날 항체(1:5,000; Applied Biological Materials Inc., Richmond, BC, Canada)와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음, horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-ratbbit IgG 또는 goat anti-mouse IgG antibody (1:5,000; Santa Cruz Biotechnology, Inc)와 반응시켰다.
TSPAN8-LEL에 TSPAN8-LEL IgG의 결합 특이성을 검증하기 위해, 네이티브 또는 변성 상태의 TSPAN8-LEL의 정제된 야생형 또는 결실 돌연변이 0.1 ㎍을 전기영동으로 분리하여 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 트랜스퍼 시켰다. 블로킹한 후, 멤브레인을 20 ㎍/ml의 TSPAN8-LEL IgG와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 다음, HRP-conjugated mouse anti-human Fab (1:1,000; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)과 반응시켰다. TTBS로 여러 번 세척 후, SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 단백질 밴드를 시각화 하였다.
실시예 11: 세포 침윤 분석
상피성 난소암 세포주의 침윤에 TSPAN8-LEL IgG의 효과를 평가하기 위해, 20 ㎍/ml의 대조군 IgG 또는 TSPAN8-LEL IgG가 존재할 때 5 X 104의 SK-OV3 및 SNU-251 또는 1 X 105의 SNU-8의 세포 침윤을 개별적으로 확인하였다. 면봉으로 막의 상부 표면을 닦아 비-침윤 세포를 제거한 후, 멤브레인을 4% 파라포름알데하이드 (PFA)로 고정하고 0.2% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 세포 침윤의 정도는 필터 당 3개의 임의의 필드 (X 200) 내 막을 통해 마이그레이션 한 세포의 수를 계산하여 정량하였다.
실시예 12: Fc 융합 단백질로서의 TSPAN8 - LEL의 N- 또는 C- 말단 결실 돌연변이의 제조 및 준비
TSPAN8-LEL-N1 (아미노산 11-96), TSPAN8-LEL-N2 (아미노산 21-96), TSPAN8-LEL-N3 (아미노산 31-96), 및 TSPAN8-LEL-C1 (아미노산 1-30)를 암호화하는 DNA 염기서열을 다음 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다: TSPAN8-LEL-N1을 위한 5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCACTCTCTATGAAAACACAAAG-3' (서열번호 52) 및 5'-TCGCGGCCGGCCTGGCCATTTTTTGCCAAGAAGTCTTTTATG-3' (서열번호 53), TSPAN8-LEL-N2를 위한 5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCGCCACAGGGGAAAGTGAAAAAC-3' (서열번호 54) 및 5'-TCGCGGCCGGCCTGGCCATTTTTTGCCAAGAAGTCTTTTATG-3' (서열번호 55), TSPAN8-LEL-N3를 위한 5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCGAAGCCATAATTGTGTTTC-3' (서열번호 56) 및 5'- TCGCGGCCGGCCTGGCCATTTTTTGCCAAGAAGTCTTTTATG-3' (서열번호 57), 및 TSPAN8-LEL-C1를 위한 5'-TCGCGGCCCAGGCGGCCAAATCTAAGTCTGATCGCATTG-3' (서열번호 58) 및 5'-TCGCGGCCGGCCTGGCCCTGGAATTGTTTTTCACTTTC-3' (서열번호 59). PCR 산물은 클로닝 부위 3' 말단에 인간 IgG1의 힌지와 CH2-CH3 도메인을 암호화하는 변형된 pCEP4 포유동물 발현벡터 (Invitrogen)의 SfiI 부위에 서브 클로닝 하였다. Fc 융합 단백질을 제조한 다음, 항체 정제 프로토콜과 동일하게 친화성 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 단백질을 정제하였다.
실시예 13: 세포 ELISA
SK-OV3 세포에서 TSPAN8을 하향 조절하는 TSPAN8-LEL IgG의 효과를 검증하기 위해, 104의 SK-OV3 세포를 96-웰 플레이트에 올리고 20 ㎍/ml의 대조군 IgG 또는 TSPAN8-LEL IgG이 존재하에 37℃에서 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 또는 3 시간 동안 배양하였다. 그 다음 4% PFA로 고정시키고, 2㎍/ml의 HRP-conjugated TSPAN8-LEL IgG와 반응시켜 SK-OV3 세포에서 TSPAN8의 발현을 검출하였다. 차가운 PBS로 3번 세척 후, TMB 용액으로 세포를 배양하였다. 마이크로타이터 플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 광학 밀도를 측정하였다.
실시예 14: 면역세포화학
SK-OV3 세포에서 TSPAN8-LEL IgG에 의해 유도된 TSPAN8의 내재화를 검출하기 위해, 세포를 poly-L-lysine이 코팅된 커버글라스 바닥 접시 (SPL Lifesciences, Gyeonggi-Do, Korea)에서 37℃로 18시간 동안 성장시켰다. 세포는 20㎍/mL의 FITC-표지된 TSPAN8-LEL IgG과 37℃에서 30, 60, 또는 120 분 동안 반응시켰다. 자극하기 전에 LysoTracker Red DND-99 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)을 1 시간 동안 세포에 첨가 (최종 농도 200nM)하였다. 세포는 PBS로 2번 세척하였다. 이미지는 올림푸스 FV300 레이저 스캐닝 공초점 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 얻었다.
실시예 15: In vivo 효능 테스트
7주령 암컷 BALB/c-nude 마우스 (SLC Inc, Seoul, Korea)는 특정 병원균이 없는 조건에서 사육하고 사용하기 전에 최소 1 주일 동안 실험실 조건에 적응시켰다. AAALAC 국제 동물 보호 정책에 따라, 국립 암 센터의 동물 시설에서 유지시켰다 (국립 암 센터 연구소의 공인된 유닛; 유닛 번호, NCC-13-163B). 마우스에 200㎕ PBS 내 2 X 106 SK-OV3-luc를 복강주사 하였다. SK-OV3-luc를 접종하기 전에, 10 mg/kg의 대조군 IgG 또는 TSPAN8-LEL IgG를 42일째까지 일주일에 2번 정맥주사 하였다.
실험예 1: TSPAN8 - LEL scFv - Fc는 비-전이성 대장암 세포주의 침윤보다 전이성 대장암 세포주의 침윤을 더욱 강하게 억제함
P120의 카테닌의 비정상적 발현은 암세포 및 종양 전이에서 E-카드헤린의 발현을 하향 조절하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. HCT-8 대장암 세포에서 siRNA에 의해 p120 카테닌 유전자를 침묵시킨 다음, 면역블롯 분석을 수행하여 p120 카테닌의 녹다운은 E-카드헤린의 발현을 하향 조절하는 것을 발견하였다 (도 5A). TSPAN-8-LEL scFv-Fc의 존재 또는 부재시 HCT-8 세포 침윤에서 확인된 항체의 중화 효과를 비교하였다. TSPAN-8-LEL scFv-Fc는 Erbitux®과 유사하게 p120 카테닌 siRNA가 형질감염 된 HCT-8 세포의 침윤을 강하게 억제하지만, 스크램블 RNA가 형질감염 된 HCT-8 세포의 침윤은 덜 강하게 억제하였다 (도 5B). 이는 전이성 대장암 세포 침윤 억제에 TSPAN-8-LEL scFv-Fc가 관련되어 있음을 알 수 있다.
TSPAN-8-LEL scFv-Fc에 의한 전이성 및 비-전이성 대장암 세포 침윤의 억제에 대한 차이를 직접 조사하기 위해, TSPAN-8-LEL scFv-Fc의 존재 또는 부재 하에 전이성 LoVo 및 HCT-116 세포주 및 비-전이성 SW480 세포주의 침윤을 조사하였다. 본 실험에서, TSPAN-8-LEL scFv-Fc는 비-전이성 HCT-8 세포 침윤에 미치는 효과와 유사한 방식 (도 5B)의 비-전이성 SW480 세포주의 침윤보다 전이성 LoVo 및 HCT-116 세포주의 침윤을 더욱 강하게 특이적으로 억제하였다 (도 5C). 종합적으로, 이러한 결과는 TSPAN-8-LEL scFv-Fc가 전이성 대장암 세포의 침윤을 강력하게 억제한다는 것을 나타낸다.
실험예 2: TSPAN8 - LEL scFv - Fc는 U87 악성 뇌교종 및 PANC -1 췌장암 세포 침윤을 억제함
다른 전이성 종양 세포에서 TSPAN8-LEL scFv-Fc의 효과를 알아보기 위해, U87 악성 뇌교종 및 PANC-1 췌장암 세포주의 침윤에서 TSPAN8-LEL scFv-Fc의 억제 효과를 조사하였다. 실제로, TSPAN8 항체는 U87 악성 뇌교종 및 PANC-1 췌장암 세포주 모두의 침윤을 현저히 억제하였다.
실험예 3: TSPAN8 IgG은 전이성 HCT-116 대장암 세포주의 침윤을 더욱 강하게 억제함
TSPAN8 IgG 생성 후, 이 항체는 과잉 생산되고 친화성 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제되었다. 순도는 >90%인 것을 확인하였다 (data not shown). 그 다음 HCT116 대장암 세포주의 침윤에서 정제된 TSPAN8 IgG의 억제 효과를 확인하였다. TSPAN8 IgG는 전이성 HCT116 세포 침윤에 대해 억제 효과가 있었다 (도 7). 비록 TSPAN8 IgG는 TSPAN8 scFv-Fc 보다 5 배 낮은 농도에 상응하는 효과를 나타내지만, 이러한 효과는 TSPAN8 scFv-Fc에 의해 생성된 것과 유사한 효과이다 (도 5C).
실험예 4: TSPAN8은 난소암에서 과발현 됨
난소암의 진행과 TSPAN8의 임상적 의의를 확인하기 위해, 60개의 임상 검체 (정상, n=5 및 난소암, n=55)를 상업적으로 판매되는 항-TSPAN8 항체로 면역화학염색을 수행하였다. 전체 신호강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 노이즈 신호를 제거하고 수동으로 획득하였다. 난소암의 전체 신호강도는 정상 시료와 비교하여 약 1.8 배 증가하였다. 대부분 구별되는 신호는 유두 장액성 cytoadenocarcinoma, 장액성 adenocarcinoma, 자궁내막 암종 및 미분화 세포종을 포함하는 난소암의 특정 유형에서는 관찰되지만, 정상 샘플 또는 clear cell carcinoma 및 fibrothema를 포함하는 다른 암 유형에서는 신호가 검출되지 않았다 (도 8-9). 이러한 결과는 난소암 진행에서 TSPAN8이 관련되어 있음을 나타낸다.
실험예 5: 녹다운 또는 TSPAN8 항체는 난소암 세포의 침윤을 특이적으로 저해함
난소암 세포 침윤에서 TSPAN8의 생물학적 역할을 조사하기 위해, 스크램블 RNA 또는 TSPAN8 siRNA를 전이성 SK-OV3 세포주에 형질감염시킨 다음 TSPAN8의 녹다운을 면역블롯 분석으로 확인하였다 (도 10A). 그리고, 이 세포 유형의 침윤에서 TSPAN8 유전자 침묵의 효과를 측정하였다. TSPAN8의 녹다운은 SK-OV3 난소암 세포의 침윤을 특이적으로 억제하였다 (도 10B). 난소암 세포 침윤에서 TSPAN8의 기능적 관련성을 확인하기 위해, TSPAN8-LEL scFv-Fc의 존재 도는 부재시 침윤 분석을 수행하였다. 여기서, TSPAN8-LEL scFv-Fc는 SK-OV3 난소암 세포 침윤을 특이적으로 억제하였다 (도 11). 요약하면, 이들 결과는 TSPAN8이 난소암 세포 침윤에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다.
실험예 6: TSPAN8 IgG는 내재화를 통해 대장암 및 난소암 세포의 세포-표면 TSPAN8을 하향 조절함
종양 세포의 침윤에서 TSPAN8 항체의 억제 메커니즘을 이해하기 위해, HCT116 대장암 및 SK-OV3 난소암 세포주를 기본 또는 고정된 조건하에서 TSPAN8-LEL scFv-Fc로 처리하고 유세포 분석으로 세포를 조사하였다. TSPAN8-LEL scFv-Fc은, 기본 조건하에서 HCT116 대장암 및 SK-OV3 난소암 세포의 세포-표면 TSPAN8을 하향 조절하였으나, 고정된 조건하에서 두개의 세포주 모두 표면 TSPAN8의 발현 수준에 거의 영향을 미치지 않았다 (도 12). 이는 세포-표면 TSPAN8의 하향 조절은 내재화에 의존하는 것을 알 수 있었다.
실험예 7: TSPAN8 IgG는 난소 종양 전이 동물 모델에서 SK-OV3 세포의 in vivo 전이를 감소시킴
난소 종양 전이 동안 TSPAN8 IgG의 in vivo 효능을 알아보기 위해, Balb/c 누드 마우스의 복막 내로 SK-OV3 세포를 주입하여 동물 모델의 난소 종양 전이를 확인하였다. 그 다음, 대조군 IgG 또는 TSPAN8 IgG를 1달까지 일주일에 2번 정맥주사 하였다 (도 13A). 대조군 IgG를 처리한 마우스 10 마리 중 2 마리에서 SK-OV3 세포의 전이가 관찰되지 않았으나, TSPAN8 IgG를 처리한 마우스 9 마리 중 6 마리에서 전이가 관찰되지 않았다. 이는 난소암 세포 전이에서 TSPAN8 IgG의 억제 효과를 확인한 것이다 (도 13B). 또한, 대조군 IgG를 처리한 그룹에서 SK-OV3 세포의 전이는 결장, 간, 신장, 및 난소와 같은 복막 주변 기관뿐만 아니라 말단 전이를 나타내는 횡격막에서 관찰되었다. 그러나, TSPAN8 IgG를 처리한 그룹에서는 횡격막을 향한 말단 전이는 관찰되지 않았다 (도 13C). 종합하면, 이들 결과는 TSPAN8 IgG이 난소암 세포의 in vivo 전이를 현저히 억제할 수 있음을 나타낸다.
실험예 8: TSPAN8 - LEL IgG는 상피성 난소암 세포주의 TSPAN8 -매개 침윤을 억제함
상피성 난소암 침윤에서 TSPAN8-LEL IgG의 효과를 조사하기 위해, SNU-8 cystadenocarcinoma, SNU-251 자궁내막 암종, 또는 SK-OV3 선암종 세포주를 포함한 상피성 난소암 세포주에서 TSPAN8 발현을 면역블롯 분석을 사용하여 분석하였다 (도 14A). 그 결과, 이들 세포주에서 TSPAN8의 현저한 발현을 볼 수 있었다. 그 다음, TSPAN8-LEL IgG의 존재 또는 부재시 이들 세포주의 종양 세포 침윤 분석을 수행하였다 (도 14B). 그 결과, 항체는 SNU-8, SNU-251, 및 SK-OV3 세포를 포함한 모든 상피성 난소암 세포주의 TSPAN8-매개 침윤을 상당히 억제하는 것을 보여준다. 따라서, 이 결과는 TSPAN8-LEL 항체가 종양 전이 동안 TSPAN8-매개 상피성 난소암 세포 침윤을 상당히 억제한다는 것을 나타낸다.
실험예 9: TSPAN8 - LEL IgG 항체는 TSPAN8 - LEL의 아미노산 31-96 부위에 결합함
TSPAN8-LEL IgG 항체 결합 부위를 확인하기 위해, SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색 (data not shown)으로 >90% 순도를 확인한 TSPAN8-LEL의 야생형 및 N- 또는 C- 말단 연속 결실 돌연변이의 fc 융합 형태를 구축하고 생산하였다 (도 17A). 그 다음, 정제된 단백질을 ELISA 및 면역블롯을 수행하였다 (도 15B 및 15C). 그 결과, 항체는 TSPAN8-LEL의 아미노산 31-96 부위에 결합하는 것으로 나타났다.
실험예 10: TSPAN8 - LEL IgG는 상피성 난소암에서 내재화 및 TSPAN8을 하향 조절함
상피성 난소암에 TSPAN8의 하향 조절에서 TSPAN8-LEL IgG의 효과를 조사하기 위해, TSPAN8-LEL IgG를 SK-OV3 세포에 처리한 다음 HRP-conjugated TSPAN8-LEL IgG를 이용한 ELISA를 수행하여 세포의 표면에서 TSPAN8의 발현을 측정하였다 (도 16A). 여기서, ELISA를 이용한 TSPAN8-LEL에 대한 TSPAN8-LEL IgG 또는 HRP-conjugated TSPAN8-LEL IgG의 활성을 비교하여 TSPAN8-LEL에 결합하는 항체에 HRP 접합은 거의 영향이 없다는 것을 확인하였다 (data not shown). 그 결과, TSPAN8은 SK-OV3 세포의 표면에서 대조군 IgG에 의해서가 아니라 TSPAN8-LEL IgG에 의해 시간-의존적으로 상당히 하향 조절된다. TSPAN8-LEL IgG에 의한 TSPAN8 발현의 하향 조절을 확인하기 위해, 같은 실험 조건에서 면역불롯을 수행하였다 (도 16B). 그 결과, TSPAN8-LEL IgG에 의해 세포의 TSPAN8이 하향 조절된 것을 볼 수 있었다. 항체가 내재화를 유도할 수 있는지 확인하기 위해, TSPAN8-LEL IgG를 SK-OV3 세포에 처리 한 후 면역세포화학법으로 항체의 내재화를 모니터링 하였다 (도 16C). 여기서, TSPAN8-LEL IgG의 리소솜 지역화를 검출하기 위해 lysotracker를 사용하였다. 그 결과, TSPAN8-LEL IgG는 SK-OV3 세포 내부에 LAMP1 항체와 빠르게 공동-지역화되고, 리소솜으로 TSPAN8-LEL IgG의 빠른 내재화를 확인하였다. 결론적으로, 이 결과는 상피성 난소암 세포의 표면에서 TSPAN8-LEL 항체의 신속한 내재화 및 TSPAN8의 하향 조절을 유도할 수 있다.
실험예 11: TSPAN8 - LEL IgG는 in vivo에서 상피성 난소암 세포의 전이를 억제함
상피성 난소암 전이에서 TSPAN8-LEL IgG의 in vivo 효능을 조사하기 위해, 누드 마우스의 복강에 루시페라제-발현 SK-0V3 세포 (SK-0V3-luc)를 주입하여 상피성 난소암 세포 전이 동물 모델을 확립하였다. 그 다음, 42일째까지 일주일에 2번 대조군 IgG 및 TSPAN8-LEL IgG을 정맥주사하고, 생물발광 영상을 이용하여 전이를 관찰하였다 (도 17A). 여기서, 세포의 전이 발생은 난소, 췌장, 결장, 심장, 간, 비장, 및 신장을 포함하여 제거된 기관에서 발광신호가 검출된 마우스의 수로 나타내었다 (data not shown). 대조군 IgG 처리 그룹에서 SK-OV3-luc 전이는 31마리 마우스 중 24 마리에서 발생하였으나, TSPAN8-LEL IgG 처리 그룹에서 세포 전이는 30마리 마우스 중 15 마리로 약 36% 정도를 나타내며, TSPAN8-LEL IgG에 의한 SK-OV3 세포 전이 발생이 상당히 억제되었다 (도 17B 및 17C). 이러한 결과는 자체 개발된 항체가 in vivo에서 TSPAN8-매개 상피성 난소암 세포 전이를 억제할 수 있음을 보여주는 것이다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Scripps Korea Antibody Institute <120> NOVEL ANTIBODY SPECIFIC FOR TSPAN8 AND USES THEREOF <130> 1554 <150> 61/946,236 <151> 2014-02-28 <160> 59 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying TSPAN8-LEL (amino acids 110-205) <400> 1 tcgcggccca ggcggccaaa tctaagtctg atcgcattg 39 <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying TSPAN8-LEL (amino acids 110-205) <400> 2 tcgcggccgg cctggccatt ttttgccaag aagtc 35 <210> 3 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying TSPAN8-SEL (amino acids 34-57) <400> 3 tcgcggccca ggcggcccga gtaagcaatg actctcaag 39 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying TSPAN8-SEL (amino acids 34-57) <400> 4 tcgcggccgg cctggccgtc cacagcaacg taggag 36 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for amplifying TSPAN1-LEL (amino acids 110-211) <400> 5 tcgcggccca 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Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Trp Asp Ala Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 <210> 41 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain of TSPAN8 LEL IgG for clone 2 <400> 41 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asp Val Thr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 <210> 42 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain of TSPAN8 LEL IgG for clone 3 <400> 42 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Ser Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 <210> 43 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain of TSPAN8 LEL IgG for clone 4 <400> 43 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Asp Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp Ser Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val 100 105 <210> 44 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain of TSPAN8 LEL IgG for clone 1 <400> 44 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtactg gctcttcatc taatattggc agtaatgatg tctcctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat gataatagtc atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt gcttgggatg ctagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 45 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain of TSPAN8 LEL IgG for clone 2 <400> 45 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc agtaatgatg tcacctggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tctaatagtc atcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt acttgggatt ctagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 46 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain of TSPAN8 LEL IgG for clone 3 <400> 46 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc aataattctg tctactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tctgatagtc agcggccaag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt acttgggatt atagcctgaa tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 47 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VL domain of TSPAN8 LEL IgG for clone 4 <400> 47 cagtctgtgc tgactcagcc accctcagcg tctgggaccc ccgggcagag ggtcaccatc 60 tcttgtagtg gctcttcatc taatattggc aataatgatg tctactggta ccagcagctc 120 ccaggaacgg cccccaaact cctcatctat tctgatagtc agcggccgag cggggtccct 180 gaccgattct ctggctccaa gtctggcacc tcagcctccc tggccatcag tgggctccgg 240 tccgaggatg aggctgatta ttactgtggt tcttgggatt atagcctgag tggttatgtc 300 ttcggcggag gcaccaagct gacggtccta 330 <210> 48 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for variable heavy chain gene <400> 48 cgggaattcg ccgccaccat ggaatggagc tgggtctttc tcttcttcct gtcagtaact 60 acaggtgtcc tctccgaggt gcagctgttg gagtctg 97 <210> 49 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for variable light chain gene <400> 49 ggcgggccct tggtggaggc tgagctcacg gtgaccagtg taccctg 47 <210> 50 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for variable light chain gene <400> 50 cccaagcttg ccgccaccat ggagacacat tctcaggtct ttgtatacat gttgctgtgg 60 ttgtctggtg ttgaaggacc agtctgtgct gactcagcc 99 <210> 51 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for variable light chain gene <400> 51 ggccgtacgt aggaccgtca gcttggtgcc tccgcc 36 <210> 52 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for TSPAN8-LEL-N1 <400> 52 tcgcggccca ggcggccact ctctatgaaa acacaaag 38 <210> 53 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for TSPAN8-LEL-N1 <400> 53 tcgcggccgg cctggccatt ttttgccaag aagtctttta tg 42 <210> 54 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for TSPAN8-LEL-N2 <400> 54 tcgcggccca ggcggccgcc acaggggaaa gtgaaaaac 39 <210> 55 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for TSPAN8-LEL-N2 <400> 55 tcgcggccgg cctggccatt ttttgccaag aagtctttta tg 42 <210> 56 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for TSPAN8-LEL-N3 <400> 56 tcgcggccca ggcggccgaa gccataattg tgtttc 36 <210> 57 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for TSPAN8-LEL-N3 <400> 57 tcgcggccgg cctggccatt ttttgccaag aagtctttta tg 42 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for TSPAN8-LEL-C1 <400> 58 tcgcggccca ggcggccaaa tctaagtctg atcgcattg 39 <210> 59 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for TSPAN8-LEL-C1 <400> 59 tcgcggccgg cctggccctg gaattgtttt tcactttc 38

Claims (22)

  1. 다음의 중쇄가변 영역 및 경쇄 가변영역을 포함하는 TSPAN8 (tetraspanin 8)의 LEL (large extracellular loop)에 특이적으로 결합하는 항체로,
    (a) 상기 중쇄 가변영역은
    i) 각각 서열번호 11, 13 및 17의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역;
    ii) 각각 서열번호 11, 14 및 18의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역;
    iii) 각각 서열번호 12, 15 및 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 및
    iV) 각각 서열번호 11, 16 및 20의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역;
    으로 구성된 군에서 선택되는 것이고,
    (b) 상기 경쇄 가변영역은
    i) 각각 서열번호 29, 33 및 36의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
    ii) 각각 서열번호 30, 34 및 37의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
    iii) 각각 서열번호 31, 35 및 38의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 및
    iv) 각각 서열번호 32, 35 및 39의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
    으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 7로 표시되는 TSPAN8 아미노산 서열 중 110번 내지 205번의 아미노산 단편을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 9로 표시되는 TSPAN8 내 LEL의 아미노산 서열 중 31번 내지 96번의 아미노산 단편을 포함하는 부위에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  4. 제1항에 있어서,
    i) 각각 서열번호 11, 13 및 17의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역 및 각각 서열번호 29, 33 및 36의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
    ii) 각각 서열번호 11, 14 및 18의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역 및 각각 서열번호 30, 34 및 37의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
    iii) 각각 서열번호 12, 15 및 19의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역 및 각각 서열번호 31, 35 및 38의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
    iv) 각각 서열번호 11, 16 및 20의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역 및 각각 서열번호 32, 35 및 39의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  5. 제1항에 있어서,
    서열번호 21 내지 24로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열의 중쇄 가변영역; 및
    서열번호 40 내지 43으로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열의 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  6. 제1항의 항체를 코딩하는 핵산.
  7. 제6항의 핵산을 포함하는 벡터.
  8. 제7항의 벡터 또는 제6항의 핵산을 포함하는 숙주세포.
  9. 제8항의 숙주세포를 배양하여 핵산 발현에 의해 항체를 생산하는 것을 포함하는, 제1항에 따른 항체의 제조방법.
  10. 약물이 결합된 제1항의 항체를 포함하는 항체-약물 접합체로, 상기 약물은 톡신, 화학요법제, 항암제, 항생제, ADP-라이보실 트랜스퍼라제 (ADP-ribosyl transferase), 방사성 동위원소 및 핵산 분해 효소 (nucleolytic enzyme)로 구성된 군에서 선택된 하나인 것을 특징으로 하는 항체-약물 접합체.
  11. 제1항의 항체를 포함하는 암 또는 암 전이의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 암은 대장암, 난소암, 뇌종양 또는 췌장암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  13. 제5항에 있어서,
    서열번호 21의 아미노산 서열의 중쇄 가변영역 및 서열번호 40의 아미노산 서열의 경쇄 가변영역;
    서열번호 22의 아미노산 서열의 중쇄 가변영역 및 서열번호 41의 아미노산 서열의 경쇄 가변영역;
    서열번호 23의 아미노산 서열의 중쇄 가변영역 및 서열번호 42의 아미노산 서열의 경쇄 가변영역; 또는
    서열번호 24의 아미노산 서열의 중쇄 가변영역 및 서열번호 43의 아미노산 서열의 경쇄 가변영역;
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  14. 삭제
  15. 제1항의 항체를 포함하는 암 및/또는 암 전이 진단용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 대장암, 난소암, 뇌종양 또는 췌장암인 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
  17. 삭제
  18. 제15항의 진단용 조성물을 포함하는 암 및/또는 암 전이 진단 키트.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
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