ES2882276T3

ES2882276T3 - Anticuerpo humano anti-VEGFR2 para terapia antiangiogénica y terapia dirigida contra el cáncer

Info

Publication number: ES2882276T3
Application number: ES16780542T
Authority: ES
Inventors: Han-Chung Wu; Ruei-Min Lu; Chiung-Yi Chiu; I-Ju Liu; Yu-Ling Chang
Original assignee: Academia Sinica
Current assignee: Academia Sinica
Priority date: 2015-04-14
Filing date: 2016-04-12
Publication date: 2021-12-01
Anticipated expiration: 2036-04-12
Also published as: EP3283528A4; EP3283528B1; US20180127504A1; KR20170135904A; TW201712033A; CN107531789B; BR112017022205A2; WO2016168159A1; MX2017013177A; SG11201707949XA; CN107531789A; JP2018512434A; TWI621629B; PT3283528T; AU2016249991A1; AU2016249991B2; JP6542383B2; US10196447B2; CA2981883A1; EP3283528A1

Abstract

Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene una afinidad de unión específica a un epítope que se encuentra dentro del dominio 3 del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGFR2; SEQ ID NO: 74), en donde el epítope dentro del dominio 3 del VEGFR2 se encuentra entre los residuos de aminoácidos 250 y 270 de SEQ ID NO: 74, y además en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (VH) y una región variable de cadena ligera (VL), la VH comprende VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 y la VL comprende VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3, en donde: la VH CDR1, VH CDR2 y VH CDR3 comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente; y la VL CDR1, VL CDR2 y VL CDR3 comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, Asp Ala Ser y SEQ ID NO: 73, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo humano anti-VEGFR2 para terapia antiangiogénica y terapia dirigida contra el cáncer.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a anticuerpos con actividades anticancerígena y, más específicamente, a anticuerpos anti-VEGFR2.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis rara vez ocurre en tejidos adultos sanos. El receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2) se expresa con poca frecuencia y en niveles bajos en las células endoteliales normales, en comparación con las células endoteliales asociadas a tumores. La expresión de VEGFR2 es de 3 a 5 veces mayor en los vasos sanguíneos del tumor que en los vasos sanguíneos normales. La inmunohistoquímica en biopsias de pacientes con cáncer confirmó además que la expresión de VEGFR2 está significativamente elevada en los vasos sanguíneos del tumor en comparación con el endotelio vascular en los tejidos normales adyacentes a la región tumoral. En particular, la expresión de VEGFR2 es mayor en los vasos sanguíneos de tumores altamente metastásicos que en los vasos sanguíneos de tumores que presentan baja metástasis.

Originalmente se demostró que la expresión de VEGFR2 estaba restringida a los vasos de los tejidos tumorales. Sin embargo, estudios recientes han proporcionado evidencia de que VEGFR2 también está presente en células tumorales malignas. Se encontró que las células epiteliales tumorales circulantes en la sangre de pacientes con cáncer de mama expresan VEGFR2 y, por lo tanto, dicha expresión está asociada con metástasis tumoral y pronóstico. Por lo tanto, el bloqueo de la transducción de la señalización mediada por VEGFR2 para inhibir concomitantemente las células endoteliales y malignas tumorales se considera una estrategia excelente para el desarrollo de terapias anticancerígenas.

Los resultados de los estudios clínicos indican que los anticuerpos terapéuticos totalmente humanos contra VEGFR2 son seguros y bien tolerados. Se muestran prometedores como una terapia emergente contra el cáncer al bloquear la angiogénesis tumoral. Por lo tanto, el desarrollo de un nuevo anticuerpo humano anti-VEGFR2 con eficacia terapéutica mejorada beneficiará a los pacientes con cáncer.

Lu Dan y otros ("Identification of the residues in the extracellular region of KDR important for interaction with vascular endothelial growth factor and neutralizing anti-KDR antibodies" J Biol Chem. 2000; 275(19):14321-14330) describen que los anticuerpos neutralizantes anti-VEGFR2 MAB383 y MAB664 se unen dentro del dominio 3 de Ve Gf R2.

Fuh G. y otros ("Requirements for binding and signaling of the kinase domain receptor for vascular endothelial growth factor" J. Biol Chem. 1998; 273(18):11197-11204) describen que los anticuerpos anti-VEGFR2/KDR MAKD1 y MAKD5 se unen a un epítope dentro del dominio 1 de VEGFR2.

Spannuth WA y otros (Functional significance of VEGFR-2 on ovarian cancer cells" Int J Cancer 2009;124(5):1045-1053) describen un anticuerpo específico contra VEGFR-2 humano, 1121B, con actividad antitumoral en células de cáncer de ovario.

Resumen de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene una afinidad de unión específica a un epítope que se encuentra dentro del dominio 3 del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGFR2; SEQ ID NO: 74), en donde el epítope dentro del dominio 3 del VEGFR2 se encuentra entre los residuos de aminoácidos 250 y 270 de SEQ ID NO: 74, y además en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (Vh) y una región variable de cadena ligera (Vl), la Vh que comprende Vh CDR1, Vh CDR2 y Vh CDR3 y la Vl que comprende Vl CDR1, Vl CDR2 y Vl CDR3, en donde: la Vh CDR1, Vh CDR2 y Vh CDR3 comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente; y la Vl CDR1, Vl CDR2 y Vl CDR3 comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, Asp Ala Ser y SEQ ID NO: 73, respectivamente. La invención también proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que comprende:

(a) una región variable de cadena pesada (Vh) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; y (b) una región variable de cadena ligera (Vl) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78.

En una modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un fragmento variable de cadena sencilla, un fragmento Fab o un fragmento Fv.

En otra modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo completamente humano.

En otra modalidad, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se marca con un compuesto detectable o una enzima.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención y un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.

En una modalidad, la composición comprende además un agente quimioterapéutico. En otra modalidad, el agente quimioterapéutico es docetaxel.

Además, en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo o una composición de la invención para su uso en el tratamiento de un tumor en un sujeto que lo necesite.

En una modalidad, el tumor expresa VEGFR2.

En otra modalidad, el tumor es al menos uno seleccionado dentro del grupo que consiste en cáncer de páncreas, mama, pulmón, leucemia, próstata y ovario.

En otro aspecto más, la invención proporciona un método para detectar la presencia de VEGFR2 en células endoteliales vasculares del tumor o células cancerosas en una muestra biológica, que comprende:

(i) mezclar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención con la muestra biológica;

(ii) permitir que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el VEGFR2 en las células endoteliales vasculares del tumor o células cancerosas en la muestra biológica interactúen y formen un complejo; y

(iii) detectar la presencia del VEGFR2 en las células endoteliales vasculares del tumor o en las células cancerosas en el complejo.

En una modalidad, la muestra biológica es una muestra de tejido de un paciente.

En otra modalidad, la presencia del VEGFR2 en las células endoteliales vasculares del tumor o en las células cancerosas en el complejo se detecta mediante inmunoensayo.

Breve descripción de las figuras

Las FIGURAS 1A-E muestran los resultados de la selección e identificación de scFv presentados en fagos contra VEGFR2. (A) Selección de fagos por afinidad que presentan la proteína recombinante VEGFR2-Fc. Después de cuatro rondas de selección por afinidad, la tasa de recuperación de los fagos se incrementó en 3,455 veces con respecto a la de la primera ronda. ufc, unidades formadoras de colonias. (B) Comparación de la unión de clones de fagos seleccionados a la proteína VEGFR2-Fc por ELISA con un título del fago de 1* 109 ufc. (C) La afinidad celular de unión a VEGFR2 de 10 clones de fagos se evaluó en células HUVEC mediante citometría de flujo con 1*1010 ufc. (D) Se purificaron scFv anti-VEGFR2 solubles y se analizaron mediante SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie. (E) Tinción inmunofluorescente de la vasculatura tumoral humana. Secciones congeladas de muestras quirúrgicas de pacientes con cáncer de pulmón se sondearon con scFv anti-VEGFR2, seguido de tinción con el anticuerpo anti etiqueta E y anticuerpo secundario conjugado a rodamina. El endotelio vascular se tiñó con el anticuerpo anti-CD31 humano y luego se incubó con el anticuerpo secundario conjugado a FITC. Los núcleos se tiñeron con DAPI; ConscFv, control scFv.

Las Figuras 2A-F muestran que scFv anti-VEGFR2 suprime la unión de VEGF-A y la activación de VEGFR2 en células HUVEC. (A) Análisis de la capacidad de competir de scFv anti-VEGFR2 con VEGF-A mediante ELISA. Se consideró que la cantidad de unión de VEGF-A a VEGFR2 inmovilizado en ausencia de competidores fue del 100 %. (B) La expresión de VEGFR2 fosforilado (Pho. VEGFR2) en células HUVEC tratadas con competidores de VEGF-A y scFv se detectó mediante Western blot. La cuantificación de VEGFR2 fosforilado se basó en la intensidad de luminiscencia y se normalizó al total de VEGFR2. (C a F) Mapeo de epítopes de R2S12. (C) Alineación de la secuencia del dominio 3 de VEGFR2 (VEGFR2-D3) de humanos (de 221 a.a. a 320 a.a. de SEQ ID NO: 74) y ratón (de 223 a.a. a 322 a.a. de SEQ ID NO: 80). Los residuos que difieren entre las dos especies están encuadrados. Los residuos implicados en las mutantes M1 y M2 están subrayados. Los círculos llenos y vacíos se usan para indicar los residuos de VEGFR2-D3 humano en contacto con los anticuerpos 1121B y 6.64, respectivamente. (D) Gráfico que representa la cadena principal del VEGFR2-D3; se resaltan los residuos NWEYPS (SEQ ID NO: 66) (M1) responsables de la unión a R2S12. (E) Modelo de la superficie de VEGFR2-D3. Los residuos NWEYPS (SEQ ID No : 66), es decir, el área M1, está delimitada por la línea negra. (F) Se indican los residuos que hacen contacto con 1121B y 6.64 en la superficie de VEGFR2-D3. También se indican los residuos de contacto de 1121B, que se encuentran en el área M1. (N, N terminal; C, C terminal.)

Las Figuras H3A-D muestran la maduración de la afinidad del anti-VEGFR2 hAb y el análisis de la actividad del hAb anti-VEGFR2-AF. (A) Aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de c Dr 3 (Vl-CDR3) de R2S12 (SEQ ID NO: 10) y R2S12Af (SEQ ID NO: 73). Los residuos que difieren entre R2S12 y R2S12AF están encuadrados. (B) Constantes cinéticas del anti-VEGFR2 y hAb anti-VEGFR2-AF, determinadas mediante el uso de IgG purificada y un BIACORE T100 ™. El valor de la Kd se calculó mediante el uso del software de evaluación BIACORE T100 ™. (C) Se realizó un ELISA competitivo para examinar la inhibición dependiente de la dosis de la unión de VEGF-A a VEGFR2 por el anticuerpo humano. Se atribuyó un valor del 100 % a la unión de 4 nM de VEGF-A al VEGFR2 inmovilizado en ausencia de competidores. Barra de error, SD; n = 4. (D) Determinación de la actividad de unión del anticuerpo anti-VEGFR2 a las células HUVEC mediante análisis de citometría de flujo. Concentración de anticuerpos: 0,1 pg/ml.

Las Figuras 4A-B muestran que el hAb anti-VEGFR2-AF inhibe la vía de señalización del VEGFR2 y altera la formación de la estructura capilar en las células HUVEC. (A) Se realizaron 4 ensayos de formación de estructura capilar mediante el uso p-laminillas recubiertas con MATRIGEL®. HUVEC (4 * 104 células por pocillo) se incubaron con FBS al 0,2 % y se trataron con 40 ng/ml de VEGF-A o 40 ng/ml de v Eg F-A junto con NHIgG. IMC-1121B o el anticuerpo anti-VEGFR2-AF durante 5 horas a 37 ° C. Las estructuras tubulares se observaron bajo contraste de fase y la longitud relativa del brote (panel inferior) y los puntos de ramificación (panel superior) se midieron cuantitativamente con el software ImageJ. Todos los datos se obtuvieron de tres experimentos independientes. (B) Las células HUVEC se trataron con 50 ng de VEGF-A o 100 nM de anti-VEGFR2-AF o IMC-112lB durante 10 min a 37 ° C. Se preparó proteína total de las células HUVEC tratadas y se examinó mediante análisis de transferencia Western, la a-tubulina se usó como control de carga.

Las Figuras 5A-F muestran la caracterización de la actividad de VEGFR2 en células de cáncer de próstata humano. (A) Análisis de expresión deVEGFR2 en las líneas celulares indicadas mediante RT-PCR cuantitativa. Se usaron células 293T como control negativo. La expresión de VEGFR2 se normalizó a la de GAPDH. (B) Las células PC-3 tratadas con VEGF-A se sometieron a ensayos de formación de colonias, MTT y de invasión. n = 6 en cada grupo. (C) Las células PC-3 se trataron con ARNhc dirigido a VEGFR2 (hcVEGFR2), y la expresión de VEGFR2 se analizó mediante RT-PCR cuantitativa. Se usó ARNhc de luciferasa (hcLuc) como un control negativo. (D) Se realizaron ensayos de MTT, formación de colonias e invasión de Transwell para analizar células hcVEGFR2-PC'-3 tratadas con VEGF-A. (E) Diagramas de caja que muestran la expresión relativa de VEGFR2 en tumores de próstata metastásicos en comparación con tumores benignos y primarios, según se determina mediante el uso de una base de datos de micromatrices pública. (F) Tinción inmunohistoquímica de una matriz de tejido de cáncer de próstata humano (PRC481, Pantomics) mediante el uso del anticuerpo anti-VEGFR2 (55B11, Cell Signaling) para analizar la expresión de la proteína VEGFR2 en tejidos de próstata normales y tumorales humanos.

Las Figuras 6A-E muestran el análisis de la eficacia terapéutica del hAb anti-VEGFR2-AF en un modelo de xenoinjerto de células PC-3 en ratón. (A) El programa de tratamiento. (B) Los perfiles de crecimiento tumoral de los ratones de cada grupo. (C) Peso corporal de cada grupo. (D) Al final del período de tratamiento, se disecó la masa tumoral de cada ratón. (E) Se midió el peso del tumor al final del período de tratamiento. Todos los datos se muestran como la media de nueve ratones por grupo; barras, SE; *, P<0,05.

Las Figuras 7A-E muestran que el hAb anti-VEGFR2-AF exhibe una mayor actividad antitumoral que el IMC-1121B en un modelo de xenoinjerto de células HL60 en ratón. (A) Análisis de sobrevivencia de Kaplan-Meier de los ratones de cada grupo. La sobrevivencia se prolongó significativamente en el grupo hAb anti-VEGFR2-AF en comparación con el grupo IMC-1121B según la prueba de rango logarítmico (P= 0,0284). (B) Peso corporal de los ratones de cada grupo. (C) Se diseccionaron los ovarios de cada ratón después de su muerte. Los ovarios de un ratón NSG sin leucemia se usaron como control normal. (D) Volumen del ovario de ratones tratados con IMC-1121B o anti-VEGFR2-AF. (E) Análisis morfométrico de cambios en los ganglios linfáticos (LN) en ratones portadores de tumores de leucemia. Las células de leucemia de ratones de los grupos indicados que habían hecho metástasis a los ganglios linfáticos se disecaron (n = 9 por cada grupo).

La Figura 8 muestra la construcción de vectores que expresan VEGFR2. Presentación esquemática de constructos que expresan mutantes por deleción o sustitución de dominios de la proteína VEGFR2 humana. Hay siete dominios similares a inmunoglobulinas en la región extracelular de VEGFR2, que están marcados de I a VII. TM: dominio transmembrana. Los identificadores de secuencia de 259NWEYPS264, 261TWHSPP266, 279TQSGSEM285 y 281PFPGTVA287 son SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69, respectivamente.

Las Figuras 9A-B muestran los resultados de la selección e identificación de scFv contra VEGFR2 mediante el uso de una biblioteca de scFv sintética presentada en fagos. (A) Maduración de la afinidad para R2S12. La biblioteca de scFv mutagénico R2S12-V l-CDR3 presentada en fagos se incubó durante 1 hora a 4°C con 0,1 pg de VEGFR2-Fc inmovilizado sobre perlas con proteína G DYNABEADS®. Subsecuentemente, las perlas se lavaron cuatro veces con PBS que contenía TWEEN™ 20 al 1 %. Después de cuatro rondas de selección por afinidad, la tasa de recuperación de los fagos se incrementó en 929 veces por encima a la de la primera ronda. (B) Comparación de la actividad de unión de las concentraciones indicadas de scFv de R2S12 y R2S12-AF con la proteína VEGFR2-Fc, según se ensayó mediante ELISA. Barra de error, SE.

Las Figuras 10A-C muestran que hAb anti-VEGFR2-AF antagoniza la actividad celular mediada por VEGF-A en células PC-3. (A) Se llevaron a cabo ensayos de Transwell para examinar la capacidad de invasión de las células PC-3 sometidas a los tratamientos indicados. Panel superior: Tinción de Giemsa de células invasoras. Amplificación de 100*; n = 3 en cada grupo; barra de escala, 150 pm. (B) Se sembraron un total de 1*103 células PC-3 en una placa de seis pocilios y se trataron con o sin 100 ng/ml de VEGF-A y 10 gg/ml de NHIgG, IMC-1121B o anticuerpo anti-VEGFR2-AF. La placa se incubó durante 7 días para permitir la formación de colonias. Las colonias celulares se visualizaron mediante tinción con cristal violeta. Se calculó el número relativo de colonias en cada pocillo después de la elución de la solución de cristal violeta cristal. n = 3 en cada grupo. (C) Ensayo de cicatrización de herida. Se incubaron células PC-3 en medio RPMI con FBS al 2 % y se estimularon mediante tratamiento con 100 ng/ml de VEGF-A en presencia o ausencia de 10 gg/ml de NHIgG, IMC-1121B o anti-VEGFR2-AF, individualmente. Las imágenes se tomaron después de 0, 16 y 36 horas de incubación. Barra de escala, 150 gm. n = 3 en cada grupo. Barra de error, SE.

Las Figuras 11A-B muestran los análisis del endotelio vascular y las células apoptóticas en el tejido tumoral después del tratamiento farmacológico. Se prepararon secciones de tumor congeladas de ratones de cada grupo al final del período de tratamiento. (A) Las secciones se tiñeron con un anticuerpo anti-CD31 para visualizar los vasos sanguíneos del tumor. El endotelio positivo para CD31 se midió cuantitativamente mediante el uso del software ImageJ. (B) Se analizaron las células apoptóticas en las secciones de tumor congeladas mediante el uso del ensayo TUNEL. Las células apoptóticas se cuantificaron mediante el uso del software ImageJ. Las secciones se tiñeron con DAPI para señalar todas las células. n = 5; Barra de escala, 100 gm; amplificación de 200*; Barra de error, SE; **, P < 0,01; ***, P <0,001.

Las Figuras 12A-B muestran el fenotipo histopatológico de los ovarios de ratones con xenoinjerto de leucemia humana después del tratamiento con anticuerpos. Se extrajeron ovarios de ratones portadores de células tumorales HL-60 después del tratamiento con solución salina, NHIgG, IMC-1121B o hAb anti-VEGFR2-AF. Los tejidos revelaron infiltración de células de leucemia al cortarlos y teñirlos con hematoxilina y eosina (H&E). El grupo tratado con Anti-VEGFR2-AF mostró menos vasos sanguíneos y retuvo algunos ovocitos primarios. n = 9 en cada grupo. (A) Ovario a una amplificación de 200x. Barra de escala, 500 gm. (B) Barra de escala, 150 gm.

Descripción detallada de las definiciones de la invención

El término "tratar" o "tratamiento" se refiere a la administración de una cantidad efectiva del compuesto a un sujeto que lo necesita, que tiene cáncer o un síntoma o predisposición a dicha enfermedad, con el propósito de curar, aliviar, mitigar, remediar, mejorar o prevenir la enfermedad, los síntomas de la misma o la predisposición a ella. Tal sujeto puede ser identificado por un profesional de la salud al basarse en los resultados de cualquier método de diagnóstico adecuado.

"Una cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de un compuesto activo que se requiere para conferir un efecto terapéutico al sujeto tratado. Las dosis efectivas variarán, como reconocen los expertos en la técnica, en dependencia de la vía de administración, el uso de excipientes y la posibilidad del uso conjunto con otro tratamiento terapéutico. El término "agente quimioterapéutico" se refiere a un agente farmacológico que se conoce que es útil en el tratamiento del cáncer.

La "Guidance for Industry and Reviewers Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers" publicada por el Departamento de Salud y Administración de Alimentos y Medicamentos humanos de EE. UU. describe que se puede obtener una "cantidad terapéuticamente efectiva" mediante cálculos a partir de la siguiente fórmula:

HED = dosis por animal en mg/kg x (peso del animal en kg/peso del humano en kg)0’33

El nombre comercial de ramucirumab (es decir, IMC-1121B) es CYRAMZA®.

La región del dominio 1 del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGFR2) es de 45 a.a. a 110 a.a., y el dominio 3 es de 224 a.a. a 320 a.a.

Identificadores de secuencia:

QQLDDIPIT (CDR3 de cadena ligera variable R2S12AF; SEC ID N.° 73); VGFR2 (receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular HUMANO; SEQ ID NO: 74); GLMTKK (SEQ ID NO: 75);

La VH región de R2S12 y R2S12-AF son iguales (SEQ ID NO: 76):

QVNLRESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFGSYTMNWVRQAPGKGLEWVASITSGSSYIFYT

DSVKGRFTISRDNSRSSFFFQMNSFRAEDTAIYYCARGSASAFDIWGQGTMVTVSS;

La VL región de R2S12 (SEQ ID NO: 77):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASDDIINYLNWYQQKPGEAPKLLIYDASILETGVPSRFSG

SGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDILPLTFGGGTKLEIK;

La Vl región de R2S12AF (SEQ ID NO: 78):

DIQMTQSPSSFSASVGDRVTITCKASDDIINYFNWYQQKPGEAPKFFIYDASIFETGVPSR

FSGSGSGTDFTFTISSFQPEDIATYYCQQLDDIPITFGGGTKFEIK;

Los residuos de aminoácidos que son diferentes entre R2S12 VL y R2S12AF VL están subrayados arriba.

La región constante de IgG1 humana (SEQ ID NO: 79); Secuencia de aminoácidos de VEGFR2 de ratón (SEQ ID NO: 80).

Abreviatura: regiones determinantes de complementariedad (CDR); Fab (fragmento, región de unión a antígeno); Región Fv (dominio variable).

EJEMPLOS

Materiales y Métodos

Aislamiento de fagos que se unen a VEGFR2 de una biblioteca scFv presentada en fagos

Para la selección se usó una biblioteca scFv presentada en fagos humanos no inmune con una complejidad de 6*1010 que se estableció previamente en nuestro laboratorio. La biblioteca scFv se sustrae de la unión no específica con proteína G DYNABEADS® (Invitrogen), y subsecuentemente se incubó con la proteína recombinante VEGFR2-Fc (R&D Systems) inmovilizada con DYnABeADS®. Después de lavar con PBS que contenía TWEEN™ 20 al 0,1 % (PBST0.1), los fagos unidos a VEGFR2-Fc se recuperaron mediante la infección de células E. coli TG1. Después de la determinación del título de fagos, se realizó la siguiente ronda de selección por afinidad.

Ensayo de unión de VEGF competitivo

Se mezclaron diversas concentraciones de scFv anti-VEGFR2 con VEGF-A humano 3 nM (Peprotech) y se adicionaron a placas de 96 pocillos recubiertas con 1 pg/ml de VEGFR2-Fcy prebloqueadas en Bs A al 1 %. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente y lavados con PBST, las moléculas de VEGF unidas se detectaron mediante el uso de mAb anti-VEGF (GeneTex) y un anti-ratón IgG de cabra marcado con HRP. La reacción se reveló con una mezcla de OPD y H2O2y subsecuentemente se puso fin a la reacción con la adición de HCl 3 N. La absorbancia se determinó mediante el uso de un lector de microplacas a 490 nm.

Tinción de la vasculatura humana del tumor con scFv anti-VEGFR2

Las muestras quirúrgicas de cáncer de pulmón humano se obtuvieron del Departamento de Patología de1Hospital Universitario Nacional de Taiwán. Las laminillas con secciones congeladas de tejido se lavaron con PBS y luego se fijaron con paraformaldehído. Después de lavar con PBS, las laminillas se bloquearon con suero normal de caballo (Vector) y se incubaron con el scFv. Después de lavar con PBST, se adicionó una mezcla de anticuerpo anti-etiqueta E de conejo (Bethyl Laboratories) y mAb CD31 (BD) antihumano de ratón, y las laminillas se incubaron durante 1 hora. Los cubreobjetos se tiñeron durante 1 hora con IgG anti-ratón marcada con FITC, IgG anti-conejo de cabra marcada con rodamina y DAPI, y se capturaron imágenes mediante el uso de un microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss, Axiovert 200M).

Ensayo de formación de tubos

MATRIGEL® (BD Biosciences) se descongeló a 4 °C durante toda la noche y se adicionaron 10 pl de MATRIGEL® a cada pocillo de p-laminillas para evaluar angiogénesis preenfriadas (Ibidi); las laminillas entonces se incubaron a 37 °C durante 15 minutos. Las células HUVEC ayunadas (4*104 células) se adicionaron al medio EBM-2 que contenía suero al 0,2 % con o sin 40 ng/ml de VEGF-A y anticuerpos anti-VEGFR2. Después de 24 horas de incubación, se evaluó la formación de tubos de células endoteliales con un microscopio invertido OLYMPUS y una cámara digital (OLYMPUS, DP-12). Las longitudes de los tubos y los puntos de ramificación se evaluaron cuantitativamente con el software ImageJ. El porcentaje de inhibición por anticuerpos se expresó como el porcentaje del de los pocillos tratados con VEGF-A sin competidor.

Análisis de conjuntos de datos clínicos

Los datos de micromatrices sin procesar se descargaron del sitio web Gene Expression Omnibus del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Los datos sin procesar se normalizaron. Se usó el perfil GEO GDS2545 / 1954_at/ KDR para el análisis del cáncer de próstata metastásico.

Construcción y expresión del anticuerpo humano anti-VEGFR2

La región Vh de R2S12, R2S12-AF e IMC-1121B (Lu y otros., (2003) "Tailoring in vitro selection for a picomolar affinity human antibody directed against vascular endothelial growth factor receptor 2 for enhanced neutralizing activity" J Biol Chem 278, 43496-43507) se clonaron por separado en el vector de expresión modificado pcDNA5-FRT-Gammal con un péptido señal y una región constante de lgG1 humana, mediante el uso de los sitios ^geI y Nhe1. Además, la región V1 de R2S12, R2S12-AF e IMC-1121B se clonaron por separado en el vector de expresión modificado p-Kappa-HuGs, mediante el uso de los sitios ^geI y EcoRV. Los plásmidos que contienen genes que codifican para la cadena pesada y ligera se combinaron en un vector biscistrónico para generar un único sistema de vector. Los plásmidos se transformaron en células FLPIN™-CHO (Invitrogen). Las células transfectadas se seleccionaron mediante el uso de higromicina B después de 2-3 semanas para establecer clones estables; estos clones se cultivaron en medio SFM4CHO (Thermo Scientific) para producir anticuerpos humanos. Después de 2 semanas de incubación, se colectó el medio de cultivo de los clones estables, se centrifugó y se filtró a través de una membrana de 0,45 pm. El sobrenadante luego se sometió a cromatografía en columna de proteína G (GE healthcare) para la purificación de IgG humana anti-VEGFR2. Después de la diálisis de eluyentes con PBS, se evaluó la concentración del anticuerpo mediante el uso del reactivo de Bradford (Thermo Scientific) y espectrofotometría.

Maduración de la afinidad de IgG humana anti-VEGFR2

La maduración de la afinidad se realizó como se describió previamente. Brevemente, construimos una biblioteca scFv sintética presentada en fagos que comprende el repertorio de genes de la Vh y Vl de R2S12, con mutaciones aleatorias introducidas en siete residuos de aminoácidos de Vl-CDR3. Esta biblioteca sintética se usó para realizar la selección por afinidad con DYNABEADS® inmovilizados con VEGFR2-Fc. Después de cuatro a cinco rondas de una rigurosa selección por afinidad in vitro, los clones positivos se cribaron e identificaron mediante ELISA. Los clones superiores de unión a VEGFR2 se identificaron mediante comparación con el clon parental respectivo.

Medición de la cinética de unión

La afinidad y la cinética de los anticuerpos anti-VEGFR2 se midieron mediante resonancia de plasmón de superficie en un BIAc Or E T100™ (GE healthcare). La proteína VEGFR2-Fc se acopló a un chip sensor Cm 5 activado por EDC y NHS en una celda de flujo BIACORE, y luego se bloqueó con etanolamina de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las fases asociadas y disociadas se monitorearon bajo un flujo continuo de 30 pl/min, mediante el uso de concentraciones de anticuerpo que oscilaban de entre 0,1 a 100 nM durante 5 min. La regeneración se realizó mediante la inyección de una solución amortiguadora regeneradora (NaCl 0,2 M, glicina 10 mM, pH 2,7). Para determinar las constantes de unión, los sensogramas se ajustaron globalmente a un modelo de interacción de muestra 1:1 mediante el uso del software BIAevaluation (GE healthcare).

Modelos animales

Los procedimientos que involucran a animales y su cuidado se llevaron a cabo de acuerdo con los lineamientos del Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Academia Sinica, de conformidad con las leyes y políticas nacionales e internacionales. Se adquirieron ratones diabéticos, no obesos con inmunodeficiencia grave combinada (NOD/SCID) del Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taiwán). El modelo de tumor de xenoinjerto de cáncer de próstata humano se desarrolló inyectando subcutáneamente 2*10® células PC-3 en el costado dorsal de un ratón macho de seis semanas de edad. Se monitoreó diariamente la salud general de los animales y se les midió el peso corporal dos veces por semana. El tamaño del tumor se midió con calibradores deslizantes y se calculó como largo x ancho2 * 0,52. Ratones con tumores del mismo tamaño (50 mm3) se asignaron aleatoriamente a diferentes grupos de tratamiento (n = 9) y se les inyectó por vía intravenosa IgG humana normal (NHIgG; Jackson ImmunoResearch), IMC-1121B, anticuerpos anti-VEGFR2-AF o un volumen equivalente de PBS a través de la vena de la cola. Se inyectó una dosis de anticuerpo de 20 mg/kg dos veces por semana durante cuatro semanas. Para la terapia de combinación, docetaxel (ScinoPharm Taiwán) también se administró por vía intravenosa a una dosis de 5 mg/kg una vez a la semana durante tres semanas. Al final del experimento, el tejido tumoral y los órganos viscerales se extrajeron y se fijaron para el análisis histológico.

Para estudios de injerto de leucemia sistémica, NOI/ SCID/IL2Ry-/' (NSG) se obtuvieron ratones del Centro Animal del Instituto de Biología Celular y Organísmica. Academia Sinica. A las hembras de seis semanas de edad se les inyectó por vía intravenosa 5*10® células HL-60 a través de la vena de la cola. Se monitoreó diariamente la salud general de los animales y se les midió el peso corporal dos veces por semana. A los 3 días después de la inoculación con células tumorales, los ratones se seleccionaron aleatoriamente (n = 9) para inyección intravenosa con 20 mg/kg de NHIgG, IMC-1121B, anticuerpos anti-VEGFR2-AF o un volumen equivalente de PBS, dos veces por semana. Los ratones se observaron diariamente en busca de signos de toxicidad y se registraron los tiempos de sobrevivencia. Al final del tratamiento, se extrajeron los órganos viscerales de cada ratón y se fijaron para un examen histológico adicional.

Cultivo celular

Se adquirieron células HUVEC (células endoteliales vasculares umbilicales humanas) de LONZA. Las líneas celulares HL-60 (leucemia promielocítica humana), PC-3 (cáncer de próstata humano), EA.hy926 (línea celular de vena umbilical humana) y 293T (célula de riñón embrionario humano) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC®). La línea hESC-H9 (células madre embrionarias humanas) se adquirió de WiCell, y la línea celular FLP-IN™-CHO se obtuvo de Invitrogen. Las células HUVEC se cultivaron en medio de crecimiento endotelial (EBM-2, LONZA). Las células HL-60 y PC-3 se cultivaron en medio RPMI 1640 (GIBCO™). EA.hy926 y se cultivaron células 293T en DMEM (GIBCO™). Las células FLP-IN™-CHO se mantuvieron en medio F12 de Ham. La línea hESC-H9 se cultivó como se describió previamente. Todas las líneas celulares se mantuvieron en medios condicionados suplementados con suero fetal bovino al 10 % (FBS; GIBCO™) y 100 pg/ml de penicilina/estreptomicina (P/S; GIBCO™) en una incubadora humidificada con 5 % de CO2 a 37 °C

Cribado de clones de fagos anti-VEGFR2 mediante ELISA

Los fagos seleccionados se examinaron adicionalmente mediante cribado ELISA. Las placas de 96 pocillos se recubrieron con 1 pg/ml de proteína VEGFR2-Fc, Met-Fc (R&D) o BSA (Sigma) en bicarbonato de sodio 0,1 M durante toda la noche a 4 °C. Después de bloquear con BSA al 1 % en PBS (p/v) durante 2 horas a temperatura ambiente, se agregaron 70 clones de fagos seleccionados al azar a las placas en una dilución 1:2 en BSA al 1 % y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de los lavados con PBST, las placas se incubaron con una dilución 1:2000 del anticuerpo de ratón anti-fago M13 (GE) conjugado con la enzima peroxidasa de rábano (HRP) durante 1 hora. Después del lavado con PBST, se desarrolló la reacción colorimétrica con el sustrato de peroxidasa ortofenilendiamina (OPD; Sigma) más H2O2 durante 15 min, y luego se puso fin a la reacción mediante la adición de HCl 3N. La absorbancia a 490 nm se determinó mediante el uso de un lector de microplacas (SpectraMax, Molecular Devices). El ADN plasmídico de los clones positivos se aisló y secuenció mediante el uso del conjunto de cebadores de secuenciación pCANTAB5.

Construcción de plásmido

El clon de ADNc humano que codifica la secuencia de VEGFR2 de longitud completa (NM_002253.2) se adquirió de Thermo Scientifics y se usó como plantilla de PCR para los siguientes constructos. Se construyeron varias longitudes de la región extracelular de VEGFR2 con péptido señal, dominio transmembrana y dominio citoplasmático truncado, como sigue (véase también la Figura 8): VEGFR2 (1-7), región extracelular de longitud completa de VEGFR2, que comprende los dominios 1-7 de los residuos Met1 a Leu813; VEGFR2 (2-7), que contiene los dominios 2-7 de los residuos Ala111 a Leu813; VEGFR2 (3-7), que contiene los dominios 3-7 de los residuos Ser208 a Leu813; VEGFR2 (4 7), que contiene los dominios 4-7 de los residuos Phe321 a Leu813; VEGFR2 (del2-3), en el que los dominios 2 y 3 de VEGFR2 se eliminaron mediante ligación de dos fragmentos que codifican el dominio 1 (Met1 a Glu140) y dominios 4 7 (Phe321 a Leu813); VEGFR2 (del3), en el que el dominio 3 de VEGFR2 se eliminó mediante ligación de dos fragmentos que codifican los dominios 1-2 (Met1 a Arg222) y 4-7 (Phe321 a Leu813); VEGFR2 (M1), una construcción mutagénica que contiene los siete dominios de la región extracelular de longitud completa de VEGFR2 (Met1 a Leu813), en el cual259NWEYPS264 (SEQ ID NO: 66) en el dominio 3 se reemplaza con 261TWHSPP266 (SEQ ID NO: 68) del homólogo de ratón; y VEGFR2 (M2), una construcción mutagénica que contiene los siete dominios de la región extracelular de longitud completa de VEGFR2 (Met1 a Leu813), en el cual279TQSGSEM285 (SEQ ID NO: 67) en el dominio 3 se reemplaza por 281PFPGTVA287 (SEQ ID NO: 69) del homólogo de ratón.

Expresión y purificación de scFv soluble

La cepa E. coli HB2151 se infectó con los clones PC-8, 12, 28, 29 o 45 del fago scFv anti-VEGFR2 y se prepararon extractos periplásmicos de bacterias. Se purificó scFv soluble en extractos periplásmicos mediante el uso de columnas de agarosa con proteína L (Thermo Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los scFv purificados se dializaron completamente con PBS y se analizaron mediante electroforesis SDS-PAGE en condiciones reductoras seguido de tinción con azul de Coomassie.

Ensayo de proliferación

Un total de 1*104 de células HUVEC se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron toda la noche. Las células luego se ayunaron en medio EBM-2 sin suero durante toda la noche. Subsecuentemente, se adicionaron a los pocillos 8 pg/ml del scFv seleccionado, junto con 40 ng/ml de VEGF en EBM-2 bajo en suero (0,2 %), y luego se incubaron durante 48 horas. La proliferación celular se evaluó mediante el uso del reactivo MTT (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Análisis de citometría de flujo

Aproximadamente 1*104 células HUVEC se incubaron con los clones de fagos anti-VEGFR2 seleccionados a 4 °C durante 1 hora en un amortiguador FACS (PBS que contenía suero fetal bovino al 1 %). Después de lavar las células con el amortiguador FACS, primero se incubaron con el Ab anti-fago M13 de ratón durante 1 hora a 4 °C, y luego con IgG anti-ratón de cabra conjugado A R-ficoeritrina (Jackson Immuno Research) durante 30 minutos a 4 °C. La citometría de flujo se realizó con un FACSCantoII (BD) y la intensidad de la fluorescencia de emisión se midió con el software FACS Diva (BD) para comparar cuantitativamente las afinidades de unión.

Abatimiento con un ARN de horquilla corta (ARNhc) mediada por lentivirus

El vector lentiviral pLKO_TRCN0000199129, que codifica la secuencia de ARNhc, ccggcgctgacatgtacggtc tat gctcgagcatag accgta cat gtcagcgttttttg (SEQ ID NO: 70), y se dirige al VEGFR2 humano, se obtuvo del Centro Nacional de Investigación de ARNi (Academia Sinica, Taiwán). El vector pLKO_TRCN0000072249 que codifica el ARNhc contra la luciferasa de luciérnaga se usó como control negativo. Para la producción de virus, el vector pLKO, el plásmido de envoltura pMD.G y el plásmido de empaquetamiento pCMV-AR8.91 se cotransfectaron en una proporción de 10: 1:9 en células 293T mediante el uso de LIPOFECTAMINE® 2000 (Invitrogen). A las 18 horas después de la transfección, los medios de cultivo se reemplazaron con DMEM fresco más FBS al 10 % y BSAal 1 %. El sobrenadante que contenía partículas de virus se recolectó después de la incubación durante 24 y 48 horas.

Las células PC-3 se sembraron a una densidad de 1*10® células en una placa de 60 mm un día antes de la transducción lentiviral. Se adicionó medio que contenía virus suplementado con 8 pg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich) a las células PC-3 y se incubó durante 24 horas. Subsecuentemente, las células transducidas se seleccionaron mediante incubación en medio de crecimiento que contenía 2 pg/ml de puromicina durante 3 días.

Tinción inmunohistoquímica

La tinción inmunohistoquímica se llevó a cabo como se describió previamente. Brevemente, las secciones se desparafinaron y se rehidrataron, y la recuperación de antígeno se realizó de forma concomitante mediante el uso del amortiguador Trilogy (Cell Marque). La actividad de peroxidasa endógena luego se bloqueó mediante incubación en H2O2 al 3 % en metanol durante 30 minutos. Después de los lavados con PBS, las secciones se incubaron con BSA al 1 % durante 30 minutos para bloquear la unión no específica. A continuación, las secciones se incubaron con anticuerpo anti-VEGFR2 (55B11, Cell Signaling) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar con PBST0.1, las secciones se trataron con el sistema de detección Super sensible IHC basado en polímero (Biogenex, San Ramon) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad de peroxidasa de rábano se detectó mediante el desarrollo de color con el sustrato cromogénico hidrocloruro de diaminobencidina (DAB) (0,02 %). Las laminillas se tiñeron ligeramente con hematoxilina (Sigma-Aldrich), se montaron con Permount (Fisher Scientific) y se examinaron mediante microscopía óptica.

Análisis por Transferencia Western

Las transferencias Western se realizaron mediante el uso de protocolos estándar, como se describió anteriormente. Los anticuerpos primarios se adquirieron de Cell Signaling Technology y se usaron a una dilución de 1000 veces para la detección de proteínas; los anticuerpos que se usaron son los siguientes: anti-VEGFR2 (clon 55B11), anti-fosfo-VEGFR2 (Tyr1175; clon 19A10), anti-FAK, anti-fosfo-FAK (Tyr397; clon D20B1), anti-p42/44 MAPK, anti-fosfo-p42/44 MAPK (Thr202/Tyr204; clon D13.14.4E), anti-Akt y anti-fosfo-Akt (Ser473).

Ensayo de inmunofluorescencia de secciones de tejido congelados

Para los estudios de vasos sanguíneos de tumores, las muestras se fijaron en OCT. Los bloques congelados se cortaron en secciones de 50 pm y las secciones de tejido tumoral congeladas se fijaron con paraformaldehído al 1 %, se permeabilizaron con TRlTON™-X 100 al 0,1 %, se bloquearon con suero normal de caballo (Vector) y luego se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) con el anticuerpo primario (CD31 anti-ratón de rata (PECAM-1) a una dilución 1:100; BD Bioscience). Subsecuentemente, las secciones de tejido se incubaron con el anticuerpo anti-rata de cabra conjugado a Alexa 549 (Invitrogen) a temperatura ambiente durante 1 hora. Los núcleos se tiñeron con DAPI y luego las secciones se montaron con solución de montaje fluorescente. Las imágenes de la inmunofluorescencia se adquirieron mediante el uso de un microscopio Zeiss Axiovert 200M. Las áreas positivas de las células endoteliales CD31 se cuantificaron mediante el conteo del área de píxeles y se normalizaron con tinción DAPI mediante el uso del software ImageJ con una amplificación de baja potencia.

Marcación de la dUTP final mediada por desoxinucleotidiltransferasa terminal(TUNEL)

Las secciones de tejido tumoral congeladas se fijaron con paraformaldehído al 1 % y se permeabilizaron con TRITON™-X 100 al 0,1 %, antes de incubarse con la mezcla de reacción de la marcación de la dUTP final mediada por desoxinucleotidiltransferasa terminal (Roche Diagnostics) a 37°C durante 1 hora. Después de lavar tres veces con PBS, las laminillas se incubaron con anticuerpo anti-DIG conjugado a FITC (1:2000) y DAPI (1:500). Las laminillas se montaron con solución de montaje y se visualizaron bajo un microscopio de fluorescencia. Las laminillas se examinaron de forma independiente por tres personas. Las áreas con células TUNEL positivas se cuantificaron mediante el conteo de áreas de píxeles y se normalizaron a la tinción DAPI mediante el uso del software ImageJ.

Tinción con hematoxilina y eosina (H&E)

Los tumores y los órganos indicados se diseccionaron de ratones y se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante toda la noche. La fijación y el procesamiento de las muestras se realizó de acuerdo con los procedimientos estándar. Las muestras se embebieron en parafina y se cortaron en secciones de 50 |jm. Se tiñeron secciones de tejido rehidratado embebidas en parafina con solución de hematoxilina de Mayer (Wako) durante 5 minutos y se lavaron con agua durante 1-2 minutos. Las laminillas luego se tiñeron con solución de eosina (Wako) durante 10 minutos. Los tejidos se visualizaron con microscopios Tissue Gnostics.

RT-PCR Cuantitativa

Las extracciones de ARN total se realizaron mediante el uso del reactivo de aislamiento TrizolRNA (Invitrogen). Subsecuentemente, se sintetizó ADNc mediante el uso de cebadores oligo (dT) (Fermentas) y transcriptasa reversa Super Script III (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores directos y reversos usados para amplificar el ADNc de VEGFR2 mediante PCR son los siguientes: VEGFR2-F: gaacatttgggaaatctcttgc (SEQE ID NO: 71); VEGFR2-R: cggaagaacaatgtagtctttgc (SEQ ID NO: 72). La PCR cuantitativa se realizó mediante el sistema LightCyclcr480 (Roche Applied Science). Los niveles de transcripción de VEGFR2 se normalizaron a los niveles de GAPDH de la misma muestra. Los valores de la proporción se calcularon en consecuencia para cada muestra. Las reacciones se realizaron por triplicado.

Resultados

Identificación de scFv presentado en fagos que se une a VEGFR2

Se usó una biblioteca scFv humana no inmune presentada en fagos para aislar los fagos que se unen a la proteína recombinante VEGFR2. Después de cuatro rondas de selección por afinidad, el título del fago unido aumentó hasta 3455 veces (Figura 1A). Mediante el cribado ELISA y la secuenciación de ADN, identificamos cinco clones de fagos distintos (R2PC8, R2PCl2, R2PC28, R2PC29, R2PC45; Tabla 1) que se unen en gran medida a VEGFR2-Fc, pero no a la proteína control c-Met-Fc (Figura 1B). Luego se usó el ensayo FACS de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) para confirmar que los cinco clones tienen la capacidad de unirse a VEGFR2 en la superficie celular; de los cinco clones, R2PC12 exhibió la mayor reactividad (Figura 1C). La Tabla 1 muestra la secuencia de aminoácidos de los dominios Vh y Vl de los scFv anti-VEGFR2.

Tabla 1

Dominios Vh

Dominios VL

FR1 CDR1 FR2 CDR2

Se muestran las regiones determinantes de la complementariedad 1-3 (CDR1-3) y las regiones marco 1-4 (FR1-4) para ambos dominios VhY Vl. Las familias de los dominios V se alinearon mediante la base de datos IMGT.

Subsecuentemente, se generaron proteínas scFv solubles a partir de los cinco clones del fago de unión a VEGFR2, que se designaron como R2S8, R2S12, R2S28, R2S29 y R2S45 (Figura 1D). La capacidad de unión de los scFv anti-VEGFR2 al endotelio vascular del tumor en muestras quirúrgicas de cáncer de pulmón humano se investigó mediante el uso de ensayos de tinción por inmunofluorescencia. Observamos que las señales fluorescentes de scFv anti-VEGFR2 aparentemente colocalizan con el marcador de células endoteliales CD31 (Figura 1E), lo que sugiere que estos scFv son capaces de reconocer específicamente la vasculatura del tumor.

Los scFv anti-VEGFR2 antagonizaron la interacción VEGF-A/VEGFR2 y la fosforilación de VEGFR2 inducida por VEGF-A

Para determinar si los scFv anti-VEGFR2 pueden bloquear la unión de VEGF-A a VEGFR2, se realizó un ensayo de unión competitiva en placa en el que concentraciones crecientes de scFv compitieron con el VEGF-A por la unión al VEGFR2 inmovilizado. La interacción de VEGF-A con VEGFR2 fue fuertemente suprimida por R2S8 y R2S12, con concentraciones inhibitorias máxima media (IC50) de 7,03 y 3,26 nM, respectivamente, mientras que R2S28 y R2S29 exhibieron una capacidad competitiva comparativamente débil (Figura 2a ). A continuación se investigó si los scFv podrían antagonizar la activación de VEGFR2 mediada por VEGF-A en las células HUVEC; R2S8 y R2S12 aparentemente inhibieron la fosforilación de residuos de tirosina de VEGFR2 por VEGF-A, y R2S12 exhibió la actividad de inhibición más fuerte (Figura 2B).

Identificación de epítopes de unión de scFv anti-VEGFR2

Para mapear el dominio de unión responsable del scFv anti-VEGFR2, se generaron una serie de mutantes de VEGFR2 por deleción, las cuales consisten de un péptido señal y el dominio transmembrana (Figura 8). Estas proteínas mutantes se expresaron ectópicamente en células 293T y se examinaron mediante tinción inmunofluorescente con R2S8, R2S12 y R2S28 (Tabla 2). Se encontró que R2S28 se unía a células que expresaban VEGFR2 (1-7), pero no a células que expresaban VEGFR2 (2-7) o VEGFR2 (4-7), lo que sugiere que el dominio 1 de VEGFR2 es necesario para la unión de R2S28. R2S8 y R2S12 se unieron a células 293T que expresan VEGFR2 (1-7) y VEGFR2 (2-7), pero no a células que expresan constructos que carecen del dominio 3, por ejemplo, VEGFR2 (4-7), VEGFR2 (del2-3) o VEGFR2 (del3), lo que indica además que sus epítopes de unión se encuentran dentro del dominio 3. La Tabla 2 muestra el mapeo de epítopes de scFv anti-VEGFR2.

Tabla 2

Además, se encontró que ambos scFv neutralizantes, R2S8 y R2S12, no reaccionaron de forma cruzada con la proteína VEGFR2 murina. La alineación de la secuencia de aminoácidos entre el VEGFR2 humano y murino reveló que el dominio 3, que tiene sólo el 67 % de identidad, es el más diverso de los siete dominios de la región extracelular de VEGFR2. Por lo tanto, se especuló que los distintos epítopes de R2S8 y R2S12 en el dominio 3 de VEGFR2 humano no se presentan en VEGFR2 murino. La comparación del dominio 3 de humano y ratón reveló que treinta residuos son diferentes y que estos residuos se agrupan en grupos. Para identificar los residuos de aminoácidos en el dominio 3 críticos para la unión de R2S8 y R2S12, se seleccionaron dos grupos principales (M1 y M2) para ensayos de mutagénesis, de la siguiente manera: los residuos NWEYPS humano (Se Q ID NO: 66) y TQs Gs e M (SEQ ID No : 67 ) se sustituyeron por residuos TWHSPP (SEQ ID NO: 68) y PFPGTVA (SEQ ID NO: 69) de ratón, respectivamente (Figura 2C). Los resultados de la tinción inmunofluorescente muestran que R2S8 y R2S12 no reconocen las células 293T que expresan la proteína mutante VEGFR2-M1. Por el contrario, las mutaciones en la región M2 de VEGFR2 no tuvieron ningún efecto sobre la unión a R2S8 y R2S12 (Tabla 2).

Se construyó un modelo molecular del dominio 3 de VEGFR2 a partir de información de la estructural cristalina previamente reportada y nuestros datos de la mutagénesis. Los modelos de cinta y superficie muestran que los residuos NWEYPS (SEQ ID NO: 66) (región M1) se localizan en una lámina p y en la superficie media del dominio 3 de VEGFR2 (Figuras 2D y 2E). Los residuos de contacto y la superficie de unión de los anticuerpos neutralizantes anti-VEGFR2, IMC-1121B y 6.64, se encuentran en el dominio 3 de VEGFR2 (Figuras 2C y 2F). Se observó que la región M1 está cerca de los epítopes de unión de los anticuerpos IMC-1121B y 6.64. Se encontró que dos residuos de unión, Asn259 y Glu261, del anticuerpo IMC-1121B se ubican en la región M i. Por lo tanto, los resultados sugieren que los epítopes de unión de R2S8 y R2S12 son muy probablemente diferentes de los de los anticuerpos IMC-1121B y 6.64.

Se realizó la maduración de la afinidad de R2S12 para generar un anticuerpo humano anti-VEGFR2-AF con mayor actividad de unión.

Los anticuerpos neutralizantes con alta afinidad son importantes para la eficacia terapéutica. Como se demostró que R2S12 exhibía la mayor actividad de unión y antagonismo de los scFv examinados, se mejoró aún más su actividad de unión mediante el uso de la presentación en fagos para la maduración de la afinidad. Después de cuatro rondas de selección rigurosa in vitro, se identificó un clon (R2S12AF) con una actividad de unión superior (Figuras 9A-B). Cuatro residuos dentro del Vl-CDR3 de R2S12-AF son diferentes de su clon parental, R2S12 (Figura 3A). Se ha demostrado que el formato scFv tiene un uso clínico limitado a causa de su corta vida media en suero (aproximadamente 3,5 horas) y su incapacidad para desencadenar funciones efectoras humanas. Para superar estos desafíos, se diseñó molecularmente las secuencias de codificación de scFv de R2S12y R2S12-AF dentro de la cadena principal de IgG1 humano para crear anticuerpos completamente humanos (hAb) anti-VEGFR2 y anti-VEGFR2-AF, respectivamente.

Se analizó la afinidad por VEGFR2 de ambos anticuerpos humanos mediante el uso de un BIACORE T100™. La medición de los parámetros cinéticos de anticuerpo-antígeno mostró que hAb anti-VEGFR2-AF posee una constante de afinidad sub-nmol/L (K^d = 0,264 nM) y un aumento de 8 veces en la afinidad de unión a VEGFR2 por encima del clon parental anti-VEGFR2 hAb (K^d = 2,1 nM; Figura 3B). Se realizaron ensayos competitivos en fase sólida para evaluar cuantitativamente la disrupción de la unión de VEGF-A/VECFR2 por anticuerpos individuales. La Figura 3C muestra que el valor de la IC50 de la unión de VEGF-A a VEGFR2 fue 0,88 nM para hAb anti-VEGFR2-AF, 1,87 nM para hAb anti-VEGFR2 y 1,42 nM para IMC-1121B. Estos datos indican que el hAb anti-VEGFR2-AF es superior a IMC-1121B en el bloqueo de la interacción VEGF/VEGFR2. Los resultados del análisis FACS de las células HUVEC demuestran además que el hAb anti-VEGFR2-AF exhibe una unión al VEGFR2 de la superficie celular más fuerte que IMC-1121B (Figura 3D).

El anticuerpo hAb anti-VEGFR2-AF inhibe la activación de la vía de señalización mediada por VEGFR2 e interrumpe la formación de estructuras capilares en HUVEC

Para dilucidar el potencial anti-angiogénico de hAb anti-VEGFR2-AF, se analizó el impacto de hAb anti-VEGFR2-AF sobre el crecimiento de células HUVEC, migración y formación de tubos. Se encontró que hAb anti-VEGFR2-AF suprimió la proliferación y migración de células HUVEc inducida por VEGF-A mediante el uso del ensayo de MTT y cicatrización de herida, respectivamente. Para investigar el efecto de hAb anti-VEGFR2-AF sobre la formación de tubos de células endoteliales (una etapa crítica en la angiogénesis), se examinaron las células HUVEC sobre capas de MATRIGEL® en ausencia o presencia de VEGF-A con hAb anti-VEGFR2-AF (Figura 4A). La capacidad de las células endoteliales para migrar y organizarse en estructuras capilares se evaluó y cuantificó mediante el uso de un fotomicroscopio invertido. Se verificó que hAb anti-VEGFR2-AF es más efectivo que IMC-1121B en la supresión de la formación de estructuras capilares desencadenada por VEGF-A, en base a las mediciones de la longitud del túbulo y el número de puntos de ramificación (Figura 4A).

Para investigar el mecanismo molecular que subyace a las propiedades anti-angiogénicas del hAb anti-VEGFR2-AF, se examinó las moléculas y vías de señalización mediante transferencia Western (Figura 4B). Se encontró que el hAb anti-VEGFR2-AF disminuye de manera eficiente la fosforilación de VEGFR-2 inducida por VEGF-A y sus moléculas de señalización río abajo, como Akt, MAPK y FAK. En particular, los niveles de VEGFR2, Akt y MAPK fosforilados en el grupo tratado con anti-VEGFR2-AF fueron más bajos que los del grupo tratado con IMC-1121B, mientras que la fosforilación de FAK solo se redujo marginalmente por el tratamiento con cualquiera de los anticuerpos (Figura 4B). Los resultados indican que el hAb anti-VEGFR2-AF inhibe significativamente varias etapas esenciales de la angiogénesis de las células endoteliales vasculares, lo que sugiere que este anticuerpo puede tener potencial antiangiogénico in vivo.

El anticuerpo hAb anti-VEGFR2-AF inhibe la función celular inducida por VEGF-A en células de cáncer de próstata humano que expresan VEGFR2

Se eligió la línea celular de cáncer de próstata humano PC-3 como modelo para estudiar la eficacia terapéutica de hAb anti-VEGFR2-AF en la inhibición del crecimiento tumoral. Se realizó un análisis cuantitativo de transcripción-PCR (qRT-PCR) para investigar la expresión endógena de VEGFR2 en células PC-3 (Figura 5A). Se conoce que las células HUVEC, EA.hy926 y hESC-H9 exhiben una alta expresión de ARNm de VEGFR2 y, por lo tanto, se usaron como controles positivos. Se encontró que el ARNm de VEGFR2 era fácilmente detectable en células PC-3, pero apenas detectable en las células control negativo 293T.

Para caracterizar la importancia funcional de VEGF-A/VEGFR2 en células PC-3, se analizó la actividad de las células PC-3 bajo tratamiento con VEGF-A. Se encontró que el tratamiento con VEGF-A fue capaz de mejorar diversas actividades celulares de las células PC-3, incluida la proliferación, la formación de colonias y la capacidad invasiva (Figura 5B). Se estableció el abatimiento de VEGFR2 en células PC-3 con ARNhc mediado por lentivirus (hcVEGFR2; Figura 5C), y se encontró que el abatimiento de VEGFR2 redujo la proliferación, formación de colonias y capacidad invasiva de las células PC-3 en comparación con las células PC-3 infectadas con el ARNhc control (hcLuc; Figura 5D). Se trató las células PC-3 con hAb anti-VEGFR2-AF y se demostró que las actividades celulares inducidas por VEGF-A pueden ser suprimidas por hAb anti-VEGFR2-AF (Figuras 10A-C). Por lo tanto, estos datos muestran que el eje VEGF/VEGFR2 es crucial para la capacidad clonogénica y tumorigénica de células PC-3.

Se Investigó el patrón de expresión de VEGFR2 en conjuntos de datos de micromatrices relevantes que están disponibles públicamente. Se descubrió que la cantidad de transcritos de VEGFR2 en el tumor de próstata metastásico fueron más altos que en el tumor primario (Figura 5E). Se usó un anticuerpo anti-VEGFR2 comercial para teñir una serie de tejidos de cáncer de próstata humano y revelamos que VEGFR2 es detectable en células tumorales y que su nivel de expresión está elevado en el adenocarcinoma de próstata de grado III en comparación con el grado I (Figura 5F). En muestras de tejido de próstata normal, el VEGFR2 está presente en el endotelio vascular, pero no en las células normales de la próstata.

La eficacia terapéutica de anti-VEGFR2-AF en xenoinjertos de cáncer de próstata humano

Se usó el modelo de tumor de próstata de xenoinjerto de células PC-3 para dilucidar la actividad antitumoral in vivo de hAb anti-VEGFR2-AF frente a IMC-1121B. El docetaxel es un agente quimioterapéutico de primera línea para pacientes con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración. Por lo tanto, también se investigó los efectos terapéuticos de la combinación de docetaxel y hAb anti-VEGFR2-AF o IMC-1121B. A los ratones NOD/SCID portadores dexenoinjertos de PC-3 se les administró IMC-1121B, hAb anti-VEGFR2-AF, docetaxel, hAb anti-VEGFR2-AF más docetaxel o IMC-1121B más docetaxel (Figura 6A). Para el día 38, la reducción del crecimiento del tumor alcanzó un 90 % para los ratones tratados con la combinación de hAb anti-VEGFR2-AF más docetaxel, 82 % para los ratones tratados con la combinación de IMC-1121B más docetaxel, 70 % para los ratones tratados con docetaxel, 52 % para ratones tratados con hAb anti-VEGFR2-AF, y 45 % para ratones tratados con IMC-1121B (Figura 6B). El peso corporal se usó como indicador sustituto del estado de salud de los ratones (Figura 6C). Los grupos hAb anti-VEGFR2-AF e IMC-1121B no mostraron cambios significativos en el peso corporal durante el período de tratamiento en comparación con el grupo NHIgG. El tratamiento con solo docetaxel provocó una notable pérdida de peso corporal (aproximadamente un 20 %). Los ratones tratados con docetaxel en combinación con otros anticuerpos perdieron una cantidad similar de peso corporal que los ratones tratados con solo docetaxel, lo que indica que hAb anti-VEGFR2-AF e IMC-1121B no aumentan la toxicidad inducida por docetaxel.

Se midió el peso de los tumores y se encontró que los pesos eran consistentes con el volumen del tumor (Figuras 6D y 6E). Además, se examinaron los tejidos tumorales en cada grupo mediante el uso de anticuerpos anti-CD31 para detectar vasos sanguíneos del tumor y el ensayo TUNEL para identificar células apoptóticas. Se encontró que el hAb anti-VEGFR2-AF es superior al IMC-1121B para reducir la densidad vascular del tumor y potenciar la apoptosis en células cancerosas (Figuras 11Ay 11B). Estos resultados muestran que el hAb anti-VEGFR2-AF es más efectiva que el IMC-1121B para atenuar el crecimiento tumoral, y que el hAb anti-VEGFR2-AF mejora significativamente la efectividad del docetaxel en el tratamiento de tumores de próstata humanos en ratones.

El anticuerpo hAb anti-VEGFR2-AF prolongó la sobrevivencia de ratones portadores de xenoinjertos de células de leucemia HL-60

La vía VEGF-A/VEGFR2 tiene funciones cruciales no únicamente en tumores sólidos, sino también en tumores líquidos, como leucemia o linfoma. Estudios anteriores proporcionaron evidencia de que IMC-1121B inhibe el crecimiento de células de leucemia HL-60 y prolonga la sobrevivencia en un modelo de ratón. Para comparar el efecto antileucemia de IMC-1121B con el de hAb anti-VEGFR2-AF, se desarrolló un modelo de xenoinjerto de células de leucemia HL-60 en ratones NSG. Los ratones recibieron inyecciones intravenosas de 5*10® células HL-60 y se trataron 3 días después con IMC-1121B, anti-VEGFR2-AF, NHIgG o PBS. Como se muestra en la Figura 7A, todos los ratones tratados con PBS o NHIgG murieron dentro de 36 días; sin embargo, los ratones portadores de leucemia tratados con anticuerpos contra VEGFR2 exhibieron una marcada extensión en el tiempo de sobrevivencia. Los ratones tratados con hAb anti-VEGFR2-AF sobrevivieron más tiempo (70 días; mediana = 53 días) que los tratados con IMC-1121B (56 días, mediana = 43 días). No se observaron cambios significativos en el peso corporal entre los grupos (Figura 7B).

Los exámenes histopatológicos post-mortem de todos los ratones no mostraron cambios patológicos obvios en el hígado, el bazo, el corazón o los riñones de los ratones de cada grupo. Los ovarios de los ratones portadores de leucemia estaban hinchados en comparación con los ovarios normales (Figura 7C). La tinción con H&E reveló que las células de leucemia metastásica habían infiltrado los ovarios (Figuras 12Ay 12B). El volumen ovárico promedio en el grupo tratado con hAb anti-VEGFR2-AF fue significativamente menor que en el grupo tratado con IMC-1121B (Figura 7D).

Además, los ganglios linfáticos con infiltración de leucemia se identificaron en uno de los nueve ratones tratados con hAb anti-VEGFR2-AF, mientras que los ganglios linfáticos con infiltración de leucemia estaban presentes en cinco de los nueve ratones tratados con IMC-1121B (Figura 7E).

La captación de VEGFR2 mediada por hAb anti-VEGFR2-AF en el endotelio del tumor no solo interrumpe la señalización inducida porVEGF-A, sino que también desencadena la citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad mediada por células dependientes del complemento (CDC) para matar directamente a las células diana, lo que puede mejorar la terapia antiangiogénica actual.

El hAb anti-VEGFR2-AF puede ser capaz de ejercer efectos de inhibición y de dirigirse a dos dianas, tanto células vasculares del tumor como células malignas, ya que las células tumorales también expresan VEGFR2. La capacidad de doble diana puede tener efectos sinérgicos sobre la terapia del cáncer. Se produjo un anticuerpo completamente humano, anti-VEGFR2-AF, que exhibió una unión superior a VEGFR2, y antagoniza la actividad de este receptor. De manera similar a IMC-1121B, el hAb anti-VEGFR2-AF se unió específicamente al VEGFR2 humano, pero no al VEGFR2 murino. En comparación con IMC-1121B, el hAb anti-VEGFR2-AF presentó una mayor eficacia antitumoral in vitro e in vivo, al interrumpir la señalización mediada por el eje VEGF-A/VEGFR2. Se demostró por primera vez que el anticuerpo anti-VEGFR2 puede mejorar la eficacia terapéutica del docetaxel en el tratamiento del cáncer de próstata. Los hallazgos sugieren que el hAb anti-VEGFR2-AF se puede usar potencialmente como un anticuerpo terapéutico para el tratamiento del cáncer al inhibir simultáneamente y directamente la angiogénesis y las células tumorales que expresan VEGFR2.

En resumen, en comparación con el anticuerpo humano anti-VEGFR2 IMC-1121B (Ramucirumab) aprobado por la FDA, el hAb anti-VEGFR2-AF tuvo una actividad significativamente superior y suprimió la formación de estructuras capilares mediada por VEGF-A in vitro. Se observó la expresión de VEGFR2 en la línea celular de cáncer de próstata humano (PC-3) y la línea celular de leucemia (HL-60), y se demostró que la expresión de VEGFR2 está asociada con la malignidad y la metástasis del cáncer de próstata humano. En modelos de ratón de xenoinjerto derivado de células PC-3, el tratamiento con hAb anti-VEGFR2-AF (en monoterapia o combinado con docetaxel) suprimió el crecimiento del tumor y la angiogénesis de manera más efectiva que el tratamiento con IMC-1121B. En ratones con leucemia derivada de células HL-60, el hAb anti-VEGFR2-AF mostró una eficacia más significativa que IMC-1121B para prolongar la sobrevivencia y reducir la metástasis de células leucémicas a los ovarios y los ganglios linfáticos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene una afinidad de unión específica a un epítope que se encuentra dentro del dominio 3 del receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGFR2; SEQ ID NO: 74), en donde el epítope dentro del dominio 3 del VEGFR2 se encuentra entre los residuos de aminoácidos 250 y 270 de SEQ ID NO: 74, y además en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada (Vh) y una región variable de cadena ligera (Vl), la Vh comprende Vh CDR1, Vh CDR2 y Vh CDR3 y la Vl comprende Vl CDR1, Vl CDR2 y VL CDR3, en donde:

la Vh CDR1, Vh CDR2 y Vh CDR3 comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente; y

la Vl CDR1, Vl CDR2 y Vl CDR3 comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, Asp Ala Ser y SEQ ID NO: 73, respectivamente.

2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende:

(a) una región variable de cadena pesada (Vh) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; y

(b) una región variable de cadena ligera (Vl) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78.

3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que es un fragmento variable de cadena sencilla, un fragmento Fab o un fragmento Fv.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.

5. Una composición que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 4 y un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable.

6. La composición de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente quimioterapéutico.

7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 4 para su uso en el tratamiento de un tumor en un sujeto que lo necesite.

8. La composición de acuerdo con la reivindicación 5 o 6 para su uso en el tratamiento de un tumor en un sujeto que lo necesite.

9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el tumor es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en cáncer de páncreas, mama, pulmón, leucemia, próstata y ovario.

10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, o la composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el tumor expresa VEGFR2.

11. Un método para detectar la presencia de VEGFR2 en células endoteliales vasculares del tumor o células cancerosas en una muestra biológica, que comprende:

(i) mezclar el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con la muestra biológica;