KR20160048929A - 표적 분자의 단리, 포획 및 분자 분석을 위한 방법 및 장치 - Google Patents

표적 분자의 단리, 포획 및 분자 분석을 위한 방법 및 장치 Download PDF

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비샬 굽타
데이빗 케이. 하세가와
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Abstract

표적 입자 분리 및 단리를 위한 방법 및 장치를 개시한다. 장치는 샘플을 유입하도록 구성된 주입 포트, 및 용리 완충액을 수용하도록 구성된 용리 흐름 포트를 포함한다. 흐름 챔버는 또한 흐름 챔버의 바닥부에 커플링된 전극을 포함하되, 여기서 전극은 적어도 제1 전극간 피치를 갖는 제1 구역 및 제2 전극간 피치를 갖는 제2 구역을 포함한다. 제1 구역은 제1 전계를 생성시키고 제2 구역은 전기 신호를 인가하였을 때 제1 전계와는 다른 규모의 제2 전계를 생성시킨다.

Description

표적 분자의 단리, 포획 및 분자 분석을 위한 방법 및 장치{METHOD AND APPARATUS FOR ISOLATION, CAPTURE AND MOLECULAR ANALYSIS OF TARGET PARTICLES}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 국제 PCR 출원은 미국 가출원 제61/871,624호(발명의 명칭: "APPARATUS AND METHOD FOR ISOLATION, CAPTURE AND MOLECULAR ANALYSIS OF TARGET PARTICLES DURING DIELECTROPHORESIS", 출원일: 2013년 8월 29)에 의한 우선권의 유익을 주장하며, 이 기초출원은 참고로 그의 전문이 본 명세서에 편입된다.
기술분야
본 발명은 대체로 표적 입자의 분리 및 단리를 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 새로운 디바이스 부품, 그러한 디바이스 부품을 적용한 장치, 및 표적 입자의 하나 이상의 유형의 개선된 효율적인 분리 및 단리를 제공하는 방법에 관한 것이다. 그러한 방법들은 연속적, 반연속적, 단계적(구간적 또는 간헐적), 또는 산발적인 미세유체의 처리를 수행하도록 디자인된 유전영동을 사용하는 통합 유체 디바이스를 채택한다. 디바이스 및 장치는 현탁물로부터 표적 입자를 농축 및 단리시킬 수 있는 챔버(들)를 적용하여서, 농축 및 단리된 표적 입자를 정량적으로 또는 정성적으로 분석할 수 있게 한다.
천백만명이 넘는 사람들이 매년 암으로 진단받고 있으며 2020년까지 매년 천육백만명의 새로운 사례들이 발생될 것으로 추정된다(Cho, Mol Cancer 2007; 6:25). 전통적으로, 병리학자들은 조직 샘플의 분석(예를 들어, 일련의 생검)을 기초로, 암의 초기 진단, 및 형태론적 분류 및 요법에 대한 환자의 반응성 평가에서 주요한 역할을 수행해 왔다.
일정 암, 예컨대 유방암의 다양한 유형에서, 치료에 대한 환자의 반응을 모니터링하는 것은 요법의 필수 성분인데, 반응도가 무병 및 총 생존율과 관련된 중요한 예후 정보를 제공할 수 있기 때문이다. 조직병리학은 잔류 종양 정도 및 종양 조직 내 퇴행적 변화를 기초로 치료 효율에 대한 정확한 평가를 제공한다. 그러나, 유방암 환자의 오직 20%만이 병리학적으로 완전한 반응을 성취하며, 이러한 사실은 요법의 초기 단계에서 치료 효율을 구체적으로 모니터링하는 보다 나은 방법을 요구한다(Avril, N. et al, The Journal of Nuclear Medicine, 50 (5) Suppl, May 2009, 55S-63S). 조기 식별이 생존에 핵심이고 비효율적인 요법의 조기 식별이 역시 고식적인 치료 선택의 숫자로 인해 전이성 유방 및 다른 유형의 암을 앓는 환자에서 매우 유용하다. 다양한 암의 치료적 처치 전 및 그 동안에 치료적 효능을 예측하는 새로운 방법, 특히 신속하고, 최소로 침윤적이며 치료 초기 단계에 이용가능한 방법이 치료를 개별화하고 가이드하며, 비효율적이거나 비생산적인 화학요법을 피하고/피하거나 최소화하고, 근 실시간 분석을 제공하고, 조기 재발 위험성의 환자에서 조기 검출을 가능하게 하는데 도움을 줄 수 있다.
암 질환 및 요법 반응의 분자적 결정인자의 이해는 개별화된 환자 치료를 가능하게 하는 다양한 접근법을 성장시키고 생성시켜왔다. 그러나, 개별 환자의 질환을 검사하는 현행 방법은 주로 조직 샘플(예를 들어, CT-유도 생검 또는 수술 재료)을 기반으로 한다. 이들 방법은 환자에 대해 침윤성의, 위험한 수집 과정, 종양 조직의 제한적인 접근성, 암 유형 및 위치에 대한 의존성, 및 환자의 종양에 대한 분자 정보를 구식에 되게 만드는, 전이 재발 수년 전에 수집된 환자의 보관 종양 샘플의 사용을 포함한 몇몇 한계를 갖는다. 이들 요인들의 조합은 환자에 대한 요법을 덜 효과적이게 하고 사회에 대해 불리한 경제적 영향을 야기한다. 또한, 전이성암의 성질 때문에, 종양학자들은 종종 특정 치료가 환자에게 유리한지를 결정하기 전에 수개월을 기다려야만 한다.
따라서, 종양학의 목표를 제공하여 그에 도달하고, 더 나아가서 예를 들어, 암의 조기 검출을 뒷받침하고, 실시간 모니터링하여, 의사에게 암 환자 생존율을 향상시키는 환자-특이적 요법을 만들 수 있는 능력을 제공함으로써 생명을 구하는데 도움이 되도록 보다 나은 기기를 개발해야할 필요가 있다.
보다 최근에, 게놈 및 단백질체 데이터의 주요한 팽창을 기반으로, 종양 공격성의 특징 및 암의 다양한 유형의 분자적 기원에 대한 우리의 이해가 상당한 진보를 이루었다. 암 세포는 세포 성장, 생존 및 전이를 조절하는 분자 경로에 교란을 초래하는, 유전자 재배열, 점돌연변이 및 유전자 증폭을 포함한 광범위한 유전적 변동을 표출한다. 이러한 변화는 그자체가 암성 종양을 갖거나, 또는 특정 작용 기전을 갖는 화학치료제로 치료받은 환자(적은 비율의 환자 내지 대부분의 환자)에서 명백할 경우, 이들 변화의 발견 및 정량화를 사용하여 표적 요법을 탐색 및 개발하기 위한 생체 마커를 동정할 수 있고, 질환을 치료하는데 사용된 화학치료 약물에 대한 임상 반응을 예측할 수 있다. 새로운 예측 생체마커의 동정은 요법에 대한 환자의 반응을 최소의-침윤성으로 신속하게 예측하고, 최고의 치료 양식을 선택하여, 요법 과정 동안뿐만 아니라 요법이후에도 치료에 대한 반응을 모니터링하여서, 종합적인 재발없는 생존 가능성을 개선시키는데 임상의에게 매우 유용한 도움을 제공할 수 있다. 상기의 장점들은 과소평가할 수 없다.
분자적 프로파일링은 암 요법에 대한 반응을 예측하고 모니터링하는데 특히 중요하다. 약물화 표적으로 종양에서 주요한 치료적 발전이 관찰되었다. 이들은 KIT 돌연변이-양성 위장 기질 종양(GIST)에서 KIT 키나제 억제제의 사용 및 BCR-ABL-양성 만성 골수성 백혈병(CML)에서 ABL 키나제 억제제의 사용을 포함한다. 통상의 고형 종양, 예컨대 유방, 폐 및 직결정 암은 치료하기가 어려운데, 아마도 부분적으로 상이한 분자적 이상을 갖는 환자의 각 서브셋에서, 그리고 때때로 종양 그 자체 내에서의 이종성때문이다. 이종성 질환 내에서 관련 분자 아형을 동정하고, 환자와 적절한 표적 작용제 또는 그들의 조합을 매칭시키는 것은 향후 치료 과정에서 결정적이다. 예를 들어, 비소세포 폐암(NSCLC)을 갖는 환자는 EGFR 티로신 키나제 억제제에 대해 10%의 비교적 중간정도의 반응률(RR)을 갖지만, RR은 근본적인 EGFR 돌연변이를 갖는 환자에서는 70%를 초과한다. 유사하게, NSCLC 및 EML4-ALK 융합을 갖는 환자는 ALK 억제제인 PF-02341066로부터 혜택을 얻을 가능성이 높다. 다른 조직학에서, 흑색종 및 근본적인 BRAF 돌연변이를 갖는 환자는 BRAF 억제제 PLX4032를 사용한 임상 I기 실험에서 60%의 전례없는 RR을 입증하였다. 갑상선 수질암 및 RET 돌연변이를 갖는 환자는 I기 환경에서 RET 억제제에 대해 견고한 반응이 입증되었고, 이는 이전 표준 요법의 치료 결과를 초월하는 것이다.
이들 관찰은 분자 프로파일링이 암요법에 특히 중요성을 가짐을 시사한다. 돌연변이 분석은 일반적으로 보관된 종양 조직 또는 신선한 생검 유래 조직에 대해 수행되고, 이의 사용에 대한 제한 요인일 수 있다. 분석을 위한 상당량의 조직은 약 25%-45% 환자에 대해서는 이용가능하지 않다. 따라서, 종양학자들이 이용가능한 최소량의 생물학적 재료로부터 최대량의 정보를 얻을 수 있게 하는 신규한 기술의 개발이 개인화된 암 요법의 이후 개발에서 그 무엇보다도 중요하다.
순환 종양 세포(CTC)는 원발성 암부위에서 전파되는 암 세포이고 분자적 진단 적용분야에서 이용할 수 있는 질환-관련 분자 정보를 보유한다. 저빈도(∼천만 말초 혈관 단핵 세포 중에 1 세포만큼 낮음)로 혈류에 존재하는 CTC는 실시간으로 환자의 종양을 평가하고 환자 종양을 프로파일링할 수 있는 최소의 침윤성 "액상 생검"을 제공하여서 종양학자들이 올바른 환자에 올바른 약물을 매칭시켜 치료 및 총 반응 결과를 개선시킬 수 있게 한다. 분자 CTC 정보는 환자에게 가장 효율적인 요법을 제공하기 위해 의사에게 필요하다. 환자의 종양을 프로파일링하기 위한 분자 기반 어세이를 수행하기 위해 적절한 수의 CTC가 요구된다.
최근의 기술들은 CTC의 검출 및 단리를 가능하게 하였다. 역사적으로, 이러한 세포의 검출 및 포획은 도전적이었다(Gupta, et al, Biomicrofluidics 6, 024133 (2012)). CTC 포획에 현재 사용되는 기술은 면역자성 분리법(Cohen, S.J., et al, J. Clin. Oncol. 26, 3213 (2008); Maheswaran, S., et al, N. Engl. J. Med. 359, 366 (2008), 막필터법(Desitter, I., et al, Anticancer Res. 31, 427 (2011), 미세전자기계 시스템 칩(Nagrath, S., et al, Nature 450, 1235 (2007)), 및 유전영동 장-흐름 분획법(DEP-FFF) 기술(Gupta, V., et al, ibid.)을 포함한다.
일반적으로, CTC 검출 방법은 다음의 2단계로 구성된다: 농축(단리) 공정 및 농축과 분리되거나 또는 분리되지 않은, 검출(동정) 공정(혈구계산 및 핵산 기술). CTC의 유전자 및 분자 특징은 전형적으로 형광발광 인시츄 혼성화법(FISH), 비교 게놈 혼성화법(CGH), PCR-기반 기술, 및 생체마커 형광발광 염색법에 의해 수행된다. 건강한 도너의 말초 혈액에는 정상적으로 부재하므로, CTC 계측치는 전이성, 직결장, 유방, 및 전립선 암을 갖는 환자에서 무진행 생존 및 전체 생존과는 음성적으로 관련있게 기술되었다(Budd, G.T., Cristofanilli, M., Ellis, M.J., Stopeck, A., Borden, E., Miller, M.C., Matera, J., Repollet, M., Doyle, G.V., Terstappen, L.W., Hayes, D.F. (2006), Circulating tumor cells versus imaging--predicting overall survival in metastatic breast cancer. Clin Cancer Res 12(21), 6403-6409).
또한 다음의 문헌들을 참조한다: De Bono, J.S., Scher, H.I., Montgomery, R.B., Parker, C, Miller, M.C., Tissing, H., Doyle, G.V., Terstappen, L.W., Pienta, K.J., Raghavan, D. (2008), Circulating tumor cells predict survival benefit from treatment in metastatic castration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res 14(19), 6302-6309; Cohen, S.J., Punt, C.J., Iannotti, N., Saidman, B.H., Sabbath, K.D., Gabrail, N.Y., Picus, J., Morse, M., Mitchell, E., Miller, M.C., Doyle, G.V., Tissing, H., Terstappen, L.W., Meropol, N.J. (2008), Relationship of circulating tumor cells to tumor response, progression- free survival, and overall survival in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol 26(19), 3213-3221; 및 Cristofanilli, M., Budd, G.T., Ellis, M.J., Stopeck, A., Matera, J., Miller, M.C., Reuben, J.M., Doyle, G.V., Allard, W.J., Terstappen, L.W., Hayes, D.F. (2004), Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer. N Engl J Med 351(8), 781-791.
대안적인 접근법에 대한 시급한 요구에도 불구하고, CTC를 이용하는 상업적 시장에서는 오직 하나의 FDA 허가 검사(Veridex, LLC의 CELLSEARCH(등록상표); Johnson & Johnson)만이 존재한다. The CELLSEARCH(등록상표) 검사는 오직 3가지 암 유형에 대해 FDA에서 승인한 항체-의존적 방법이다. 이 방법은 특이적 표면 생체마커, 즉 EpCAM이라고 알려진 상피 세포 부착 분자를 사용한 자성 분리를 수행한다. 그러나, 모든 암 세포가 이 마커를 발현하지는 않는다. 또한, CELLSEARCH(등록상표) 검사는 암에 대한 임의의 분자 정보를 생성시키는 능력을 제공하지 않는다. 또한, 다른 CTC 기술은 전혈 및 다양한 유형의 암으로부터 적절한 개수의 CTC를 효과적으로 포획하는 그 능력이 제한적이다. 따라서, 현재 이용가능한 기술은 종양학의 임상 실험을 수행하는 의사 및 약물 개발사들에게 진단, 예후 및 요법을 위해 CTC에 대한 예측 마커의 빠른 분석을 가능하게 하는 광범위하게 적용가능한, 효과적이고 경제적인 방법을 제공하는 도전을 해결해주지 못한다.
따라서, 표적 입자를 신속하고 효율적으로 동정할 수 있고 개선시킨 새로운 기기 및 방법에 대한 요구가 여전히 존재한다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따라서 얻을 수 있는, 예를 들어, 전통적인 화학요법, 분자적 표적화제 및 면역요법을 포함한, 암 치료 계획의 효율성을 예측하고 초기 단계에 평가하는 능력을 부여하고 그 능력을 개선시킬 수 있는 새로운 기기와 방법에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 대체로, 관심 샘플을 처리(예를 들어, 관심 표적 입자를 비표적 입자로부터 분리)하기 위한, 기기(또는 장치), 이러한 장치에 적용될 수 있는 성분 디바이스 또는 부분, 및 이 기술 및/또는 그들의 성분 부분을 적용하는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명의 장치는 대체로 표적 및 비표적 입자의 현탁물(예를 들어, 세포의 현탁물)로부터, 표적 입자, 예컨대 생존 및/또는 고정 순환 종양 세포 (CTC) 또는 전파 종양 세포(DTC)를 농축 및 단리할 수 있는 미세유체 챔버를 포함하는, 연속적, 반연속적, 단계식, 또는 간헐적 시스템의 유전영동을 사용하는 통합 유체 디바이스를 포함한다. 장치는 예를 들어 종양 상태 및/또는 질환 상태 예컨대 암의 진행에 상응하는 상태의 진단을 위한 분자 분석 방법을 사용하여, 표적 입자-함유 현탁액의 아개체군(즉, 현탁액의 표적 입자)의 정량 및/또는 정성 분석을 가능하게 한다.
일 측면에서, 본 발명은 표적 입자의 분리를 위한 하나 이상의 유체의 직접 또는 간접 흐름을 위한 챔버의 내부 영역을 한정하는 내면 및 외면을 구비한 챔버를 제공한다. 챔버는 바닥부 및 천정부를 포함하고 챔버 내부 영역은 유체, 예컨대 유체 현탁물을 수용하도록 구성 및 위치된다. 챔버는 챔버의 벽면의 외부 위치를 통해서 챔버의 외부 위치에서 챔버 안으로, 제1 유체, 예컨대 용리 완충액을 유입 또는 수용하도록 구성 및 위치된 1개 이상의 포트를 포함한다. 포트(들)는 챔버에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된다. 제2 포트 또는 일련의 포트는 챔버의 벽면의 외부 위치를 통해 챔버의 외부 위치로부터 챔버 안으로, 제2 유체, 예컨대 처리 및 분석되는 관심 샘플을 유입 또는 수용(예를 들어, 주입)하도록 구성 및 위치된다. 제2 포트(들)은 또한 챔버에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링된다. 따라서, 하나 이상의 유체 유형, 예컨대 관심 샘플 및 용리 완충액의 챔버로의 주입 시, 유체 현탁물이 생성될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 챔버는 챔버의 내부에 2개 이상의 영역을 한정하는, 2개 이상의 수평 배향, 및/또는 수직 배향된, 레벨 또는 스테이지를 포함할 수 있다. 스테이지는 각 레벨 간 연통되는 1개 이상의 채널에 의해 이격될 수 있다. 2개 이상의 영역은 서로 상이하거나, 또는 떨어져 있을 수 있거나, 또는 내부 챔버 영역 간에 유체 연통을 가능하게 하도록 직접 인접될 수 있다. 채널은 단일 챔버 내에 2개 또는 그 이상의 분리 영역 간에, 또는 단일 챔버 내 1개 이상의 챔버의 1개 이상의 영역(예를 들어, 2개 이상의 챔버) 간에 유체 연통 또는 유체의 전달을 가능하게 하도록, 또는 미세한 차이를 갖는 관심 입자의 동일한 한정 그룹 유래의 입자의 한가지 한정 그룹에서 다양한 것을 분리하도록 위치 및 구성되어야 한다.
본 발명의 실시형태에서, 제1 유체는 분리 및 처리 챔버의 제1 영역으로 주사 또는 주입될 수 있다. 제2 유체가 주사 또는 주입될 수 있지만, 제1 챔버로 함께 현탁물을 방출시키는 것이 가능하다. 제1 유체 주입은 제1 챔버의 제1 층인, 면 아래, 그 위, 또는 그로부터 직접 방출될 수 있다. 2개 이상의 내층이 챔버를 구성한다고 가정하면, 층들은 표적 입자의 상이한 배취, 또는 재한정 배취를 생성하거나 또는 구별하도록 필요에 따라 조합되거나 또는 분리된다. 따라서, 1개 이상의 내부 챔버 영역의 일련의 2개 이상의 내층은 중심 또는 분리 조합 영역(들)으로, 또는 1개 이상의 중심 또는 조합 또는 분리 영역(들)으로부터 나오도록 유도하게 위치되고 구성될 수 있다. 내부 영역은 챔버(또는 일련의 챔버의 제1층)로 주입되는 제1 액체, 또는 복수의 액체는 표적 세포 또는 입자의 적어도 한 세트를 표적 세포 또는 입자의 다른 세트, 또는 현탁물의 나머지로부터 제거하게 하거나 또는 그것을 보조하게 하는 하나 이상의 전자기력이 가해지도록 배향되고 구성된다.
따라서, 유체 현탁물(예를 들어, 샘플 및 완충액)은 제1 챔버 영역의 제1 부분에서 생성되거나 또는 조합되고 형성될 수 있거나, 또는 1개 이상의 챔버(들)는 1개 이상의 챔버의 같거나 또는 다른 포트(들)로부터 주입된 유체를 조합하는데 적용될 수 있고, 이후에 그들은 분리된다. 대안적으로, 제1 레벨에서의 챔버, 및 조합물, 예컨대 관심 표적 입자의 제1 부분의 제1 레벨의 부품은 챔버의 제1 영역(또는 레벨 또는 스테이지)로부터 챔버의 제2 영역(또는 레벨 또는 스테이지)으로 수송될 수 있다. 따라서, (1개 이상의) 챔버(들)의 내부는 각각 독립적으로 유체의 처리를 위한 2개 이상의 내부 영역(또는 서브챔버)을 한정한다. 관심 표적 입자는 캐스캐이드 또는 일련의 상호연결된 흐름 챔버 또는 분리된 입자를 더욱 구별, 분류, 또는 처리하도록 디자인된 처리 사건들을 통해서 비표적 입자로부터 분리되거나, 또는 표적 입자의 하나 이상의 군으로부터 분리된다. 이들 실시형태는 표적 입자의 유사군 또는 개별군의 동시 분리 및 처리를 가능하게 한다.
레벨을 제공하기 위한 챔버 내 영역 또는 입자를 구별하기 위한 개별 영역은 흐름 방향에 대해 수직으로 배향되거나 또는 다른 챔버 영역 보다 대략 일(1)도 위 또는 아래 내지 179도(예를 들어, 좌측에서 우측 또는 우측에서 좌측으로) 범위인 일부 다른 각으로 배향된 슬릿을 통해 연통될 수 있다. 따라서, 챔버 채널 또는 레벨 간에 입자의 이송을 허용하는 전극 세트 사이의 연통 또는 이송의 팔꿈치형 통로 또는 접합부(예를 들어, 도관)는 약 90도의 각으로 존재하거나, 또는 통로 또는 접합부 영역은 약 45도, 또는 약 30도, 또는 약 15도, 반사성의 슬랜트 또는 램프(오르막 또는 내리막) 상에서 유체를 이송시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 캐스캐이드로서 보일 수 있는 분리 스테이지를 적용하고 여기서 제1의 일련의 대상 및 표적 세포는 제1 레벨을 통해 흐르는 반면 제2의 일련의 대상 세포는 분리를 위해 제2 또는 제3 레벨로 유인된다. 전극은 각 챔버 채널의 바닥 레벨에 또는 다르게, 각 챔버 채널의 천정부 레벨에, 또는 한 챔버 채널의 바닥부 레벨 및 다른 챔버 채널의 천정부 레벨에, 또는 바닥 및 천정 전극 배열의 다양한 조합(예를 들어, 간헐적으로 상층 채널의 바닥부, 및 간혈적으로 하층 채널의 천정부 및/또는 바닥부에)에 위치할 수 있다. 이들 신규 기기 및 디바이스는 제2 표적 입자, 및 제3 표적 입자로부터, 표적 입자의 보다 나은 분리를 달성하기 위해 이전에 적용되지 않았던 표적 입자의 분리를 가능하게 한다.
1개 이상의 챔버는 또한, 본 발명의 개별 부분인, 1개 이상의 전극, 또는 일련의 전극을 포함할 수 있지만, 본 발명의 기기 또는 장치와 조합하여 적용될 수도 있다. 전극은 챔버(들)의 1개 이상의 바닥부(또는 천정부) 다음에(인접하여) 위치하거나 또는 이에 커플링될 수 있다. 본 발명의 전극(들)은 복수의 제1 전도성 트레이스 중 하나의 중간점에서 제1 구역 또는 전극간 갭 내 인접하거나 또는 회합된 제1 전도성 트레이스의 중간점까지 연장되는 제1 전극간 피치와 회합된 제1 구역을 포함하도록 구성되고 위치되며, 여기서 제1 구역은 제1 전기 신호가 인가될 때 제1 전계를 생성하도록 구성된다. 제2 구역은 대략 제1 영역, 예컨대 복수의 제2 전도성 트레이스 중 하나의 중간점(또는 초기 영역)에서 제2 구역 또는 전극간 갭의 인접하거나 또는 제2 전도성 트레이스의 중간점으로 연장되는 제2 전극간 피치와 회합될 수 있고, 여기서 제2 구역은 전기 신호를 인가할때 제1 전계와는 상이한 크기, 및/또는 상이한 전계 깊이, 및 상이한 공간 프로파일 중 적어도 하나를 갖는 제2 전계를 생성하도록 구성되고, 제1 전계 및 제2 전계는 유전영동을 통해 유체 현탁액으로부터 표적 입자를 분리하는 것을 용이하게 하는 유전영동력을 생성시키고; 폐기물 처리 포트는 유체 현탁물을 배출하도록 구성되며, 여기서 폐기물 처리 포트는 챔버에 커플링되며; 수집 포트는 표적 입자 농축 샘플을 수집하도록 구성되고, 여기서 수집 포트는 챔버에 커플링된다.
따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 2개의 레벨 및 2개의 흐름 영역을 구비한 하나의 챔버가 존재하는 실시형태를 제공한다. 2개의 레벨은 직렬식이지만, 하나 이상의 개재된 레벨에 의해 이격될 수도 있다. 샘플을 함유하는 제1 유체는 제1 포트를 통해 유입된다. 샘플이 없는 제2 유체는 제2 포트를 통해 유입된다. 제1 및 제2 유체는 챔버 내에 상층 및 하층 유체 레벨을 나누는 바닥부에 제작된 개방구(포트)를 통해 연결된다. 제2 유체의 유속은 제1 유체의 유속보다 크다. 제1 포트를 통해 유입되는 제1 유체는 1개 이상의 포트 개방구를 통해서 챔버의 하층 레벨 내 제2 유체로 샘플 및 제1 유체의 일부를 유인하는 압력 차이를 겪는다. 제1 유체에 현탁된 샘플 입자는 제1 포트를 통해 유입되고 그들이 챔버 내부 경로를 따라서 이동함에 따라 제1 전극력이 가해지게 된다. 음의 유전영동력이 가해지는 제1 유체 중 입자는 개방구로부터 밀어내지고 하층 레벨 중 제2 유체로 진입하는 것이 방지된다. 양의 유전영동력이 가해지는 제1 유체 중 입자는 레벨 간 개방구로 끌려가고 제2 유체로 그들의 통로를 조성한다. 개방구를 통해서 제2 유체로 진입한 입자는 하층 레벨의 챔버 내 경로를 따라서 이동함에 따라 다양한 지점에서 제2 전극력이 가해진다. 음의 유전영동력이 가해지는 제2 유체 중 입자는 챔버의 하층부의 루프로부터 밀려나서 챔버의 하층부의 바닥쪽 아래로 향하게 된다. 양의 유전영동에 의해서 개방구를 향하고 그를 통해 표적 입자(들)를 끌어들이도록 상층 레벨에 전기력을 부여하기 위해 인가되는 전압 주파수는 하부 챔버의 바닥부를 향하는 표적 입자(들)를 음으로 전기영동하여 밀어내도록 하층 레벨에 전기력을 제공하기 위해 인가되는 전압 주파수와 상이하다. 따라서, 적용되는 전기력(강도 및 주파수)에 따라서 상층 레벨을 따라 이동하는 입자는 개방구(1개 이상의 개방구)를 통해 통과하고 그들이 나타내게 되는 그들의 크기 및 구조 및/또는 유전체 특징 및/또는 특성을 기반으로 제2 하층 레벨로 끌어들여진다. 도시한 바와 같이, 표적 입자는 이 예에서 2개 이상의 개방구를 통해 선택적으로 분리되어서 챔버의 하층 레벨의 바닥부를 향해 가게 된다.
본 발명의 다른 측면은 흐름 챔버의 바닥부에 인접하거나 그에 고정되거나 또는 그에 커플링된 전극을 제공한다. 전극은 복수의 제1 전도 트레이스 중 하나의 중간점에서부터 제1 구역 내 인접하거나 또는 제1 전도성 트레이스의 중간점으로 연장되는 제1 전극간 피치와 회합된 제1 구역을 포함한다. 제1 구역은 전기 신호가 인가될 때 제1 전계를 생성하도록 구성되고; 제2 구역은 복수의 제2 전도성 트레이스 중 하나의 중간점에서 제2 구역 또는 제2 전극간 갭에서 인접 또는 제2 전도성 트레이스의 중간점으로 연장되는 제2 전극간 피치와 회합된다. 제2 구역은 전기 신호가 인가될 때 제1 전계와는 상이한 크기, 상이한 전계 깊이, 및 상이한 공간 프로파일 중 적어도 하나를 갖거나 또는 없는 제2 전계를 생성하도록 구성되고, 여기서 제1 전계 및 제2 전계는 유전영동력을 생성시킨다.
다른 측면에서, 본 발명은 흐름 챔버의 전기영동을 사용하여 유체 샘플 중 하나 이상의 일련의 표적 입자를 분리하는 방법을 제공한다. 이 방법은 표적 입자를 함유하는 샘플을 주입 포트로 연속적으로 유입시키는 단계; 흐름 포트로 용리 완충액을 연속적으로 유입시키는 단계로서, 여기서 샘플 및 용리 완충액은 흐름 챔버 중 유체 현탁물을 형성하는 것인 단계; 및 흐름 챔버의 한정된 영역 내 전계에 유체 현탁물을 노출시키는 단계를 포함한다.
전계는 챔버의 바닥부에 커플링된 전극에 의해 생성될 수 있고, 여기서 전극은 복수의 제1 전도성 트레이스 및 전기 신호가 인가되면 제1 전계를 생성시키는 제1 전극간 갭과 회합된 제1 구역; 및 복수의 제2 전도성 트레이스 및 전기 신호가 인가되면 제1 전계와는 다른 규모의 제2 전계를 생성하는 제2 전극간 갭과 회합된 제2 구역을 포함하고, 여기서 제1 전계 및 제2 전계는 유체 현탁물로부터 표적 입자를 분리하는 유전영동력을 생성시킨다; 그리고 d) 표적 입자를 수집하는 단계.
다른 측면에서, 본원은 흐름 챔버에서 유전영동을 사용하여 샘플 중 세포를 분리하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 a) 주입 포트로 세포를 함유하는 샘플을 연속적으로 유입시키는 단계; b) 흐름 포트로 용리 완충액을 연속적으로 유입시키는 단계로서, 여기서 샘플 및 용리 완충액이 흐름 챔버에서 유체 샘플을 형성시키는 것인 단계; c) 흐름 챔버의 한정된 영역 내 전계에 유체 현탁물을 노출시키는 단계로서, 전계는 챔버의 바닥부에 커플링된 전극에 의해 생성되고, 이때 전극은 복수의 제1 전도성 트레이스 및 전기 신호가 인가될 때 제1 전계를 생성하는 제1 전극간 갭과 회합된 제1 구역; 및 복수의 제2 전도성 트레이스 및 전기 신호가 인가될 때 제1 전계와는 다른 규모의 제2 전계를 생성시키는 제2 전극내 갭과 회합된 제2 구역을 포함하고, 여기서 제1 전계 및 제2 전계는 유체 현탁물로부터 표적 입자를 분리하는 유전영동력을 생성시키는 것인 단계; 및 d) 세포를 수집하는 단계를 포함한다.
본 발명은 연속 흐름 미세유체 디바이스의 유전영동을 통해서 말초 혈액으로부터 암 세포의 분리 효율을 향상시키는 방법을 개시한다. 전형적인 혈액 샘플 중 암 세포의 수는 매우 낮은데, 대체로 10억개 정상 혈액 세포 당 100 암세포 미만이다. 세포 분리 과정에 요구되는 시간을 감소시키기 위해서 혈액 샘플의 최소 희석이 요구되고, 따라서 혈액 샘플 중 세포간 평균 분리 거리는 작다. 세포는 매우 조밀하게 함께 싸여 있기 때문에, 유전체력이 선택적으로 정상 혈액 세포로부터 표적 암 세포를 분리할 수 있는 효율을 감소시키는 방식으로 상호작용할 수 있다. 입체 방해는 유전영동 세포 분리의 효율을 감소시킬 수 있는 특히 우세한 세포-세포 상호작용이고, 이러한 유해한 영향은 '진주 사슬' 형성이라고 알려진 입체 방해의 특정 형태에 의해 강화될 수 있다. 세포 사슬은 세포간 쌍극자-쌍극자 상호작용의 결과로서 형성될 수 있다. 유전영동 효과를 생성시키는데 필요한 전계의 인가 시에, 세포들은 전기적으로 극성이 되고 일렉트렛-미세자석의 전기 당량의 특징을 띤다. 양극화된 세포는 서로 끌어당겨서 세포의 사슬을 형성하고, 이러한 사슬은 우선적으로 유사하고 따라서 유전영동을 통해 효과적으로 분리가 가장 어려운 유전체 특징을 갖는 세포 간에 형성된다. 혈액 샘플 중 대부분의 세포는 암 세포에 대해 상이한 유전체 특징을 가지게 되며, 음의 유전영동에 의해 전극으로부터 선택적으로 반발된다. 이상적인 상황에서 암 세포는 양의 유전영동에 의해 전극에 대해 선택적으로 끌려가게 되지만, 쌍극자-쌍극자 상호작용에 의한 결과로서 진주 사슬에 포획되면 전극으로부터 반발되는데 세포 사슬의 전체적인 유전영동 특성이 단리된 혈액 세포의 그것과 상이하고, 보다 결정적으로는 또한 단리된 암 세포와 상이하다.
본원에서 우리는 세포간 쌍극자-쌍극자 상호작용이 어떻게 감소될 수 있으며 그와 동시에 정상 혈액 세포로부터 희귀 암 세포를 선택적으로 파악할 수 있는 유전영동력을 증가시키는 것을 기술한다. 이는 선택적으로 분리하려는 표적 암 세포 또는 다른 표적 입자의 전형적인 크기를 고려하여, 전극용으로 사용된 상호 얽힌 전도성 트레이스의 공간배치 및 너비의 세심한 선택에 의해 달성된다. 본 발명의 일 실시형태에서 1개 이상의 전도성 트레이스의 세트가 적용된다. 2 세트가 적용되면, 제1 세트는 주요 입력 샘플로부터 표적 세포를 추출하는 유체 출구 포트로 이어진다. 이러한 제1 세포 분리 과정에서 탈출한 표적 세포는 이후에 제1 세트와 같거나 또는 다른 너비 및 공간배치를 가질 수 있는, 제2의 전도성 트레이스의 세트 상에서의 유체 흐름에 의해 수행된다.
본 발명의 추가 실시형태는 제2 전도성 트레이스의 세트가 제작된 챔버 바닥부의 깊이는 제1 전도성 트레이스의 세트가 제작된 챔버 바닥부 깊이 보다 클 수 있다. 샘플은 챔버 바닥부에 근접한 레벨에서 제1 전도성 트레이스의 세트를 함유하는 챔버로 주사된다. 샘플 내 세포는 그들이 바닥부 위로 반발되어서 음의 유전영동에 의해 주요 유체 흐름 스트림으로 들어가지 않으면 이 레벨에 남아있는다. 그러나, 챔버 바닥부에 가까운 세포는 유전영동력 이외의 힘을 경험할 수 있고, 이의 우세한 예에는 리프트-오프 힘, 세포부착력 및 전도성 트레이스 상으로 세포가 통과함에 따른 인력의 정전력이 포함된다. 모든 세포는 순전하를 보유하고 전도성 표면에 가까울시에 정전기적으로 전도성 표면으로 세포를 끌기 위해 양극성의 '거울-이미지' 전하가 유도된다. 전도성 트레이스의 제2 세트가 제작되는 챔버 바닥부를 낮추어서, 전도성 트레이스의 제1 세트의 말단에 출구 포트 이후 유체 높이가 강하된다. 챔버 바닥부 깊이의 이러한 강하는 계단-유사 프로파일 또는 램프-유사 프로파일의 형태를 취할 수 있고, 유체 챔버의 바닥부와 루프 사이 총 높이의 10% 내지 20%의 깊이이다. 챔버 높이에서 이러한 차이는 제2 챔버의 바닥부를 밀링하거나, 또는 제1 챔버의 바닥부로 기재의 외층을 도입시켜 달성할 수 있다. 제1 인가 유전영동력을 탈출한 표적 세포는 따라서 유체 리프트-오프 힘에 의해 덜 영향받는듯하고, 쌍극자-쌍극자 힘 및 세포의 진주 사슬화가 감소되는 보다 약한 전계에 위치하게 된다. 전도성 트레이스의 제1 세트 상에서 분리를 탈출한 표적 세포의 높은 포획은 이들 트레이스의 공간배치 및 너비에 따라서, 전도성 트레이스의 제2 세트에 대한 주파수 및 전압 신호의 적절한 선택에 의해 달성될 수 있다.
본원을 보다 잘 이해하게 될 것이고, 상기 기술된 것 이외의 특징, 측면 및 장점은 이하의 구체적인 내용을 참조하면 명확해질것이다. 이러한 상세한 설명은 다음의 도면을 참조한다.
도 1은 본 발명의 실시형태에 따라 상이한 섹션을 구비한 예시적인 전극의 예시도;
도 2는 본 발명에 따른 챔버의 일 실시형태의 예시도;
도 3은 본 발명에 따른 챔버의 다른 실시형태의 예시도;
도 4는 본 발명에 따른 챔버의 다른 실시형태의 예시도;
도 5는 본 발명에 따른 2 레벨 및 2 흐름 영역을 구비한 한 챔버의 실시형태를 도시한 도면;
도 6은 본 발명에 따른 전극의 다른 예를 도시한 도면;
도 7은 본 발명에 따른 입자의 공혼합 또는 입자의 분리를 위한 챔버의 다른 예시적인 상이한 디자인;
도 8은 실시예 1에 기술된 바와 같은 전극 기하구조(E1 및 E2)에 대한 다양한 유속에서 SKOV3 난소암 세포의 회수를 보여주는 그래프;
도 9는 실시예 1에 기술된 바와 같은 전극 기하구조(E1 및 E2)에 대한 평균 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 감소의 비교를 도시한 그래프;
도 10은 상이한 전극 기하구조 및 부양 높이에 대한 본 발명의 전극에 의해 얻은 결과의 비교를 도시한 도면.
달리 정의하지 않으면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본원이 속하는 분야의 숙련가 중 한명이 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 또는 균등한 임의의 방법 및 재료를 본원의 실시 또는 테스트에서 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료를 이하에 기술한다.
본원에 따라서, 표적 입자를 분리, 농축 및/또는 단리할 수 있는 연속 흐름 미세유체 챔버에서 유전영동을 사용하는 통합 유체 디바이스에 대한 방법 및 장치를 개시한다. 본 발명의 방법 및 장치는 희귀 세포의 후속 분석을 할 수 있는 유체 현탁물 중 상이한 유형의 미립자 물질 및 가용성 물질의 구별을 위한 현존 유전영동 방법 및 장치를 진전시켰다. 구체적으로, 본 발명의 방법 및 장치는 세포의 현탁물로부터 생존 및/또는 고정 순환 종양 세포(CTC) 또는 전파 종양 세포(DTC)를 농축 및 단리할 수 있어서 종양 상태 및/또는 암의 상응하는 진행 상태의 진단을 위한 분자 분석 방법을 사용해 아개체군의 정량적 또는 정석적 분석을 할수 있는 연속 흐름 미세유체 챔버에서 유전영동을 사용하여, 샘플을 바람직하게 최소로 침습성 방법을 사용해 얻을 수 있다. 진전은 충분한 회수 효율 및 순도로 표적 입자를 산출하기 위해서 표적 입자 이동을 더 제어하도록 전극 위를 흐르는 표적 입자의 바람직한 이동 및 특별한 작업 상태에 보다 효율적으로 영향을 주게 디자인된 고유한 전극 패턴의 조합과 관련된다. CTC 및 DTC와 관련하여 구체적으로, 고유한 전극 패턴의 조합은 암 환자 혈액 샘플로부터 얻은 CTC 및 DTC를 사용한 분자 분석의 다수 방법을 할 수 있게 충분한 회수 효율 및 순도를 갖는 표적 입자를 산출하도록 CTC 및 DTC 이동을 더 제어하게 전극 상을 흐르는 CTC 및 DTC의 바람직한 이동에 보다 효과적으로 영향을 주도록 디자인된 한편 현행 분자 분석적 방법은 보다 침윤성 조직 생검을 통해 얻은 종양 세포를 요구한다.
표적 희귀 세포의 농축 및 단리를 위한 본 발명의 방법은 높은 처리량 및 세포-표지화 둘 모두에 독립적이다. 본원의 이러한 접근법은 전체 혈액으로부터 희귀 CTC 및 암 줄기 세포의 항체 독립적 단리를 위한 연속 흐름 미세유체 챔버 중 유전영동(DEP)을 기초로 한다. 혈액으로부터 희귀 세포의 농축에 의해서, 질환 상태의 분석을 가능케 한다. 본원에 기술된 방법은 표적 세포 개체군의 유의한 농축을 가능하게 하였거나 이들 희귀 세포가 현행 단백질, DNA, RNA 검출 방법을 사용한 분석을 할수 있게 한다.
본원의 세포 단리 기술은 상이한 강도, 규모, 전계 깊이 및/또는 공간 프로파일의 유전력을 생성하는 상이한 구역을 생성하도록 상호 얽힌 전극의 전기 트레이스의 너비 및 공간배치를 다양화시킨 신규 전극 디자인을 도입하여서, 전극 위를 흐르는 입자의 다수 신호 생성기의 필요를 회피한 점에서 당해 분야의 개선된 접근법이다. 이 디자인은 비상피 암 또는 낮거나 또는 음성의 상피 세포 부착 분자(EpCAM) 발현의 암을 포함한 광범위한 인간 암으로부터 생존 암 세포의 자성 비드 무함유 단리 또는 항체 무함유 분리를 할 수 있게 한다. 단리된 세포는 개질시킬 필요가 없으므로(즉, 표지화 또는 고정화하지 않음), 세포는 세포 특징화를 완료하기 위해 포획되고 RNA/DNA 및 단백질 분석에 대해 분석된다. 암 환자 유래의 생존, 미표지 CTC의 포획은 암 진행 및 치료와 연관된 생체마커의 진단, 예후 및 발견에 대해 유의한 개선을 일으켜서 개인화 의료를 용이하게 한다.
하우징/챔버 및 전극
일 측면에서, 본 발명은 유전영동을 사용하여 다른 물질로부터 적어도 하나의 물질을 분리하기 위한 흐름 챔버에 관한 것이다. 흐름 챔버는 바닥부를 갖는 챔버, 유체를 함유한 벽 및 용리 완충액이 연속적으로 흐름 포트를 통해 들어오고 제어된 속도로 흐름 챔버를 통해 이동할 수 있는 천정부를 포함한다. 흐름 챔버는 샘플, 예를 들어 제한없이, 복수의 표적 입자 및 복수의 비표적 입자를 함유하는, 세포 현탁물이 주입 포트를 통해 유입되게 한다. 샘플은 제어된 유속으로 주입 포트를 통해 챔버로 들어가서 용리 완충액과 혼합되어 유체 현탁물을 형성한다. 유체 현탁물이 흐름 챔버를 통해 이동하므로, 흐름 현탁물은 챔버의 바닥부 상에 위치하고 전기 신호 생성기에 연결된 상호 얽힌 전극에 의해 생성된 비균일한 전계에 의해 생성된 유전력을 경험한다. 유전 상태는 동시에 표적 입자에 대해 양성(유인) 힘이 발휘되고, 비표적 입자에 대해 음성(반발) 힘이 발휘되도록 확립될 수 있다.
흐름 챔버는 챔버의 바닥부에 커플링된 상호 얽힌 전극을 포함한다. 전극은 당해 분야의 숙련가에게 알려진 고도의 전도성 재료로 만들어질 수 있다. 적합한 전도성 재료는 예를 들어, 금, 구리 또는 플래티넘, 또는 티타늄, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일 실행에서, 전극은 전극에 의해 야기되는 세포 독성을 감소시키기 위해 금, 티타늄, 및/또는 플래티넘으로 제조된다. 전극은 예컨대 예를 들어 적층, 증발, 전기도금, 레이저 삭마 및 인가되는 전기 신호 전압이 일정한 화학 에칭 등의 과정을 사용해 제작될 수 있다.
전극은 AC 사인파 전압에 의해 구동되며, 이 전극은 공간적으로 비균질한 정적 AC 전계를 생성시키고, 샘플 중 현탁된 입자에 대해 유전영동 유도된 이동을 야기한다. 이러한 유전력은 전극면에 대해 정상 방향으로 작용하는 성분을 가지게 되고, 표적 입자가 전극면 쪽으로 이동하게 하고 비표적 입자는 전극면으로부터 멀리 이동하게 한다. 유전력이 흐름 챔버 중 유체 현탁물과 조합하여 사용될 경우, 유전력은 유체 현탁물에 대해 정상인 방향으로 배향되어 입자가 채널 내 상이한 위치를 차지하게 한다. 입자의 높이는 전극 기하구조의 함수인, 힘의 방향 및 규모, 인가된 전압 및 현탁된 입자의 상대적 양극성에 의존적이다. 예시적인 실시형태에서, 전극은 상이한 강도의 유전력을 생성하도록 구성된 2개 이상의 구역을 포함할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 샘플은 제1 유전력을 경험하면서 챔버의 제1 구역을 통해 흐르고, 제2 유전력을 경험하면서 챔버의 제2 구역을 통해 흐른다. 보다 구체적으로, 제1 구역에 의해 생성된 DEP는 표적 세포와의 쌍극자 상호작용을 제한하는 보다 짧은 전계 깊이를 갖는 반면, 제2 구역은 비표적 세포의 높은 부유를 달성하도록 더 긴 깊이의 전계를 갖는다. 트레이스 너비를 증가시키고 전극간 갭 너비를 단축시켜서, 표적 세포는 높은 유체 유속에서 보다 높은 회수를 가능하게 하는 전극면에 대한 더 강력한 DEP 유인을 경험한다.
용리 완충액 유속 및 샘플 주입 속도를 정확하게 제어하고, 샘플을 챔버의 바닥 상 슬릿을 통해 챔버로 유입시켜서, 표적 입자는 샘플 중 분자(표적 입자 포함)가 유인 또는 반발 DEP 힘을 만날 때까지 바닥부에 가깝게 머무른다. DEP 기반 분리의 효율을 개선시키기 위해서, 복수 구역이 일반 전극 내에 도입되어서 단일 발생기를 사용하여 상이한 영역 내에 상이한 힘 특징을 생성시키게 된다. 이러한 접근법은 복수의 발생기 및 복수의 개별 연결된 전극 부품에 대한 요구를 제거하는 한편 상이한 DEP 힘 특징의 복수 구역을 제공하게 된다.
도 1은 본원의 실시형태에 따른 유전력을 생성시키는데 사용된 전극(200)의 일 실시형태를 도시한다. 예시적인 실시형태에서, 전극(200)은 적어도 2 구역, 제 1 구역(205) 및 제2 구역(210)으로 구성된다. 제1 구역(205)에서, 전극(200)은 서로 제1 전극간 갭(220)에 의해 서로 멀리 공간화된 복수의 제1 전도성 트레이스(215)에 의해 한정된다. 제1 구역(205) 내 제1 전도성 트레이스(215) 각각은 제1 전도성 트레이스 너비(225)를 갖는다. 제2 구역(210)에서, 전극(200)은 제2 전극간 갭(235)에 의해 서로 멀리 공간화된 복수의 제2 전도성 트레이스(230)에 의해 한정된다. 제2 구역(210) 내 제2 전도성 트레이스(230) 각각은 제2 전도성 트레이스 너비(240)를 갖는다. 예시적인 실시형태에서, 제1 전도성 트레이스(215) 및 제1 전극간 갭(220)은 제1 전극 또는 제1 전극간 피치(245)를 한정하고 제2 전도성 트레이스(230) 및 전극간 갭(235)은 제2 전극 또는 제2 전극간 피치(250)를 한정한다. (250)은 전극간 갭(225, 235)의 중간점에서부터 회합된 전도성 트레이스(215, 230)의 중간점까지 연장된다. 일부 실시형태에서, 전극(200)은 3개 또는 그 이상의 구역을 활용하는데, 각각의 구역은 개별 전극간 갭 및 복수의 전도성 트레이스와 회합된다.
예시적인 실시형태에서, 제1 전도성 트레이스 너비(225) 및 제2 전도성 트레이스 너비(240)는 유체 현탁물에 발휘되는 유전체력이 각각 제1 구역(205) 및 제2 구역(210)에서 규모가 다르도록 상이한 너비이다. 역시 예시적인 실시형태에서, 단일 신호 발생기는 제1 구역(205) 및 제2 구역(210)에 단일 전압을 가하고 강도, 규모, 전계 깊이 및/또는 공간 프로파일이 상이한 유전체력을 생성시켜서, 복수의 신호 발생기에 대한 필요성을 제거한다. 또한 예시적인 실시형태에서, 제1 전극간 갭(220) 및 제2 전극간 갭(235)은 유전체력이 제1 전도성 트레이스 너비(225) 및 제2 전도성 트레이스 너비(240)에 의해 제어되도록 동일한 너비를 갖는다. 다른 실행에서, 제1 전극간 갭(220) 및 제2 전극간 갭(235)은 샘플에 대해 발휘되는 유전체력이 제1 구역(205) 및 제2 구역(210) 각각에서 규모가 상이하도록 상이한 너비이다. 이러한 실시형태에서, 단일 신호 발생기는 상이한 강도, 규모, 전계 깊이 및/또는 공간 프로파일의 유전체력이 발생되도록 제1 구역(205) 및 제2 구역(210) 둘 모두에 전압을 가하여서, 복수의 신호 발생기의 필요성을 제거한다. 또한 이러한 실시형태에서, 제1 전도성 트레이스 너비(225) 및 제2 전도성 트레이스 너비(240)는 동일한 너비이거나 또는 상이한 너비일 수 있다.
유사한 유전체 성질의 현탁된 세포의 고정 부피 분획의 경우, Kadaksham 등에 따르면, 그들의 출판물 ['Dielectrophoresis induced by clustering regimes of viable yeast cells', Electrophoresis, Vol. 26, pages 3738-3744, 2005]에서, 세포에 작용하는 유전영동력(FDEP)에 대한 세포간 쌍극자 상호작용력(FD)의 비율은 다음의 비율에 의존적이다:
Figure pct00001
상기 식에서, L은 전극간 갭(220, 235)이고 a는 세포 반경이다. 변수(P)가 1차수이면, 세포 간 쌍극자-쌍극자 상호작용 및 DEP 힘은 비슷한 규모이다. 이러한 경우, 본 발명자는 세포가 세포 사슬을 형성할 것으로 예상한다. Sancho 등에 따르면, 그들의 출판물 ['Interaction between cells in Dielectrophoresis and electrorotation experiments', Biomicrofuidics, Vol 4, 022802, 2010]에서, 세포의 사슬화는 세포가 전극에 대한 반발 또는 유인간 전이를 일으키는 전기 신호 주파수를 변경시킨다. 이는 표적 세포가 비표적 세포를 제거할 수 있는 효율을 감소시킨다. 그러나, 변수(P)가 1 차수보다 낮으면, 세포간 쌍극자-쌍극자 상호작용은 무시할만하고 본 발명자는 세포가 개별적으로 이동하여 그들의 천연 DEP 수집 특징을 나타낼 것으로 예상한다. 따라서, 변수(P)의 값을 감소시켜서 표적 입자는 비표적 입자로부터의 최소 간섭으로 개별적으로 조작될 수 있다. 본 발명자는 우리의 세포 분리 프로토콜에서 전형적으로 사용된 현탁된 세포의 부피 분획의 경우 30 미크론의 전극간 갭(220, 235)을 가지는 전극 기하구조에 대해 DEP 힘에 대한 쌍극자 상호작용력의 비율은 50 미크론의 전극간 갭(220, 235)을 갖는 전극 기하구조에 대해 1.6배 낮음을 발견하였다. 이는 표적 입자의 고도의 선택적이고 개별적인 조작을 가능하게 하고 회수율을 더 높일 수 있다.
상기 기술된 30 미크론의 바람직한 전극간 갭(220, 235)은 대략 10 미크론 직경의 세포에 적용된다. 입자 예컨대 0.1 미크론 차수 크기의 바이러스 캡시드를 본 발명의 방법에 따라 DEP에 의해 분리하고자 하면, 변수(P)를 1 차수 미만으로 유지하기 위해, 0.5 미크론 미만, 바람직하게는 약 0.3 미크론의 전극간 갭(220, 235)을 채택해야 한다. 유사하게 입자 예컨대 약 1 미크론 크기의 박테리아의 경우, 3 미크론의 전극간 갭(220, 235)이 바람직하다. 크기가 약 100 미크론보다 큰 입자 또는 세포의 경우 전극간 갭(220, 235)은 30 미크론보다 커야 한다.
부가적으로, 예시적인 실시형태에서, 제1 구역(205)은 제2 구역(210)의 상향에 주입 포트에 가깝게 위치한다. 제2 구역(210)은 제1 구역의 하류에 수집 슬롯에 가깝게 위치한다. 높이 및 보다 작은 갭 및 트레이스에 따라 힘이 신속하게 감소됨으로 인해, 제2 구역(240)의 전도성 트레이스의 너비 또는 제2 구역(210) 내 제2 전극간 갭(235) 및 제2 전도성 트레이스(230) 중 적어도 하나의 너비는 반발력의 도달 범위를 확장시켜, 샘플에 함유된 비표적 입자를 전극(200)으로부터 더욱 멀리 폐기물 처리 포트로 밀어내기 위해서, 제1 전극간 갭(220) 및 제1 전도성 트레이스 중 적어도 하나 또는 제1 구역(215)의 전도성 트레이스 너비에 따라 다양하다. 예를 들어, 제1 구역(205)은 약 30 미크론의 제1 전극간 갭(220) 및 약 30 미크론의 제1 전도성 트레이스 너비(215)를 가지며, 제2 구역(210)은 약 30 미크론의 제2 전극간 갭(235) 및 약 50 미크론의 제2 전도성 트레이스 너비(240)를 가질 수 있다.
제2 전도성 트레이스 너비(240)를 증가시키고 제2 전극간 갭(235)의 너비를 유지시켜서, 표적 입자는 전극(200)을 향하는 강한 DEP 유인력을 경험하고 비표적 입자는 전극(200)으로부터 멀리 강한 DEP 반발력을 경험하여서, 보다 고순도의 표적 입자가 보다 높은 유체 유속에서 수집될 수 있다. 다른 예에서, 제1 구역(205)은 약 30 미크론의 제1 전극간 갭(220) 및 약 30 미크론의 제1 전도성 트레이스 너비(225)를 가지며, 제2 구역(210)은 약 20 미크론의 제2 전극간 갭(235) 및 약 30 미?론의 제2 전도성 트레이스 너비(240)를 갖는다. 전극간 갭(235)의 너비는 감소시키고 제2 전도성 트레이스 너비(240)는 유지시켜서, 표적 입자는 전극(200)을 향한 강한 DEP 유인력을 경험하고 비표적 입자는 전극(200)으로부터 멀리 강한 DEP 반발력을 경험한다. 이러한 실시형태에서, 제1 구역(205)에 의해 생성된 유전영동력은 표적 입자와의 쌍극자 상호작용을 제한하도록 보다 짧은 전계 깊이를 가지는 반면, 제2 구역은 비표적 입자의 높은 부양을 달성하도록 보다 긴 전계 깊이를 갖는다. 다른 실행에서, 전극간 갭(220, 235) 및 전도성 트레이스 너비(225, 240)는 전극(200)이 본원에 기술된 바와 같이 기능하도록 임의 치수일 수 있다. 제2 전도성 트레이스 너비(240)를 증가시키고 제2 전극간 갭(235)의 너비를 유지시켜서, 비표적 입자는 전극(200)으로부터 멀리 강한 DEP 반발력을 경험하여서 높은 유체 유속에서 높은 회수가 가능하고 따라서 높은 순도 수준을 산출할 수 있다.
전극간 갭(220, 235) 및 전극(200)의 전도성 트레이스 너비(215, 240)는 유전영동을 겪는 세포의 부양 높이에 영향을 준다. 협소한 갭의 경우, 유전체력은 전극(200)의 표면 근처에서 더 높지만, 전극(200)의 표면으로부터의 거리가 증가될 수록 보다 빨리 쇠퇴하여 부양을 감소시킨다. 농축된 입자 현탁액의 쌍극자 상호작용은 전극간 갭(220, 235) 및 전도성 트레이스(225) 또는 전극간 너비(235, 240)에 의해 영향받는다. 이러한 상호작용은 유전영동 기반 분리의 선택적 수행을 위협할 수 있다. 따라서, 적어도 한 실시형태에서, 전극(200) 또는 전극(200)의 제1 구역은 표적 입자가 양극화된 전계의 영향 하에 오게 되면 최소 또는 감소된 입자 상호작용 구역(205)을 포함한다. 감소된 입자 상호작용 구역은 표적 입자가 양극화된 전계의 영향하에 오게 되면 표적 입자에 대한 유전영동력을 감소시킨다.
유전체력 스케일은 가해진 전압, 전극 갭(220, 235), 입자 반경 및 주파수-의존적 유전체 특성에 의존적이다. 구형 유전체 입자에 작용하는 DEP 힘은 다음에 의해 주어진다:
Figure pct00002
상기에서, R은 세포의 반경이고, εm은 매질의 절대 유전율이며, CM는 클라우시우스 모소티 인자이며, V는 가해진 전압이고, d는 전극간 갭이고 Erms는 전계의 제곱 평균 제곱근 값이다.
전극간 갭(220, 235)은 우세한 계수 인자로 간주된다. 따라서, 50 미크론에서 30 미크론으로 전극간 갭(220, 235)을 감소시켜서, DEP 힘은 4.6의 인자만큼 증가되어서 전극면 바로 위로 이동하는 세포의 속도를 유의하게 낮출 수 있다. 안정한 힘의 2차원 모델을 고려하여, 수평(x) 및 수직(y)의 정상 상태 속도는 다음에 의해 주어진다:
Figure pct00003
상기 식에서 η는 매질의 점도이고, ρp 및 ρm은 각각 입자 및 매질의 밀도이며 g는 중력 가속도이다. 높은 DEP 힘은 우수한 표적 입자 회수율을 유지하면서 주요 흐름 채널에서 높은 부피 유속을 사용할 수 있게 한다.
전극(200)은 플렉스 회로 상에 제작될 수 있다. 플렉스 회로는 흐름 챔버 바닥에 적층되어서 흐름 챔버의 바닥부를 형성할 수 있다. 다른 실시형태에서, 전극 트레이스 패턴은 흐름 챔버 바닥으로 직접 적용될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 주입 포트에서 수집 포트로 표적 입자의 전이는 흐름로의 층을 제거하여 개선될 수 있고 챔버 바닥에 대해 정확하게 플렉스를 배치시킬 필요성이 제거되므로 위치적 내성을 완화시킬 수 있다.
도 2에 예시한 바와 같이, 흐름 챔버는 연속한 전극의 2 세트 및 2 수집 포트를 구비한다. 샘플이 없는 제1 유체(F1)(예를 들어, F1은 용리 완충액임)는 연속하는 유속으로 입구 포트(P1)를 통해 유입되고 흐름 챔버에 층류 상태를 확립시킨다. 샘플을 함유하는 제2 유체(F2)는 제2 연속 유속으로 흐름 챔버의 바닥 상에 위치된 입구 포트(P2)를 통해 유입된다. 유체(F2)가 흐름 챔버로 들어가면, F2에 함유된 샘플 입자는 F1의 흐름 스트림으로 비말동반되어서 챔버를 통해 운반된다.
F1 및 F2의 유속의 균형을 유지하여서, 입자는 흐름 챔버의 바닥부 근처에 남겨진다. 흐름 챔버의 초기 영역에서 이온이 고전도성 영역에서 저전도성 영역으로 확산되어 제1 전극(E1)에 도달하기 전에 전도성의 균형 상태가 확립된다. 제1 전극(E1)은 이후 입자의 유전영동 반응에 영향을 주는 비균일한 전계를 형성하는 사인파 신호를 출력하는 신호 발생기에 연결된다. 신호의 특정 주파수에서, 표적 입자는 전극으로 양성적으로 유인되는 한편 비표적 입자는 동시에 반발된다. 표적 입자는 펌프에 연결된 수집 포트(P3)를 통해 유인된다. 수집 포트(P3)에 연결된 펌프는 표적 입자(O1)를 함유하는 유체의 하부층을 걷어내기 위해서 일정한 유속으로 작동된다.
흐름 챔버에 남은 유체는 제2 전극(E2)을 마주하게 되는 하류로 계속 가게 된다. 제2 전극(E2)은 제1 전극(E1)과 유사한 방식으로 동력공급된다. 이는 나머지 입자에서 유전영동 반응을 유도하며 나머지 표적 입자(O2)를 함유하는 유체의 하부층을 걷어내기 위해 일정한 유속으로 작동하는 펌프에 역시 연결된 수집 포트(P4)를 통해 임의의 나머지 표적 입자의 수집을 가능하게 한다. 나머지 유체는 수집 포트(P4)의 하류로 흐름을 계속하고 폐기물 포트(P5)를 통해 배출된다.
도 3에 예시된 바와 같이, 흐름 챔버는 연속하는 2 세트의 전극 및 2 수집 포트를 구비한다. 샘플이 없는 제1 유체(F1)(예를 들어, F1은 용리 완충액임)는 연속적인 유속으로 입구 포트(P1)를 통해 유입되고 흐름 챔버에 층류 상태를 확립한다. 샘플을 함유하는 제2 유체(F2)는 제2 연속 유속으로 흐름 챔버의 바닥 상에 위치된 입구 포트(P2)를 통해 유입된다. 유체(F2)가 흐름 챔버로 들어가면, F2에 함유된 샘플 입자는 F1의 흐름 스트림에 비말동반되고 챔버를 통해 운반된다.
F1 및 F2의 유속 균형을 유지하여서, 입자는 흐름 챔버의 바닥 근처에 남겨진다. 흐름 챔버의 초기 영역에서 이온은 고전도성 영역에서 저전도성 영역으로 확산되어서 제1 전극(E1)에 도달하기 전에 전도성의 균형 상태를 확립한다. 제1 전극(E1)은 이후에 입자의 유전영동 반응에 영향을 주는 비균일한 전계를 형성하는 사인파 신호를 출력하는 신호 발생기에 연결된다. 신호의 특별한 주파수에서, 표적 입자는 전극에 양성적으로 유인되는 한편 비표적 입자는 동시에 반발된다. 표적 입자는 펌프에 연결된 수집 포트(P3)를 통해 유인된다. 수집 포트(P3)에 연결된 펌프는 표적 입자(O1)를 함유하는 유체의 바닥층을 걷어내기 위해 일정한 유속으로 작동된다.
흐름 챔버에 남은 유체는 흐름 챔버가 흐름 속도의 감소가 일어나게 챔버의 바닥에서 계단식 전이를 겪는 하류로 계속 이어진다. 계단식 전이 후, 유체는 제2 전극(E2)을 만난다. 제2 전극(E2)은 제1 전극(E1)과 유사한 방식으로 동력공급된다. 이는 나머지 입자에서 유전영동 반응을 유도하며, 나머지 표적 입자(O2)를 함유하는 유체의 바닥층을 걷어내도록 일정한 유속으로 작동하는 역시 펌프에 연결된 수집 포트(P4)를 통해 임의의 나머지 표적 입자의 수집을 가능하게 한다. 나머지 유체는 수집 포트(P4)의 하류로 흐름을 계속하고 폐기물 포트(P5)를 통해 배출된다.
도 4에 도시된 바와 같이, 흐름 챔버의 다른 실시형태는 연속으로 2 세트의 전극 및 2 수집 포트를 구비한다. 샘플이 없는 제1 유체(F1)(용리 완충액)는 연속 유속으로 입구 포트(P1)를 통해 유입되고 흐름 챔버에 층류 상태를 확립시킨다. 샘플을 함유하는 제2 유체(F2)는 제2 연속 유속으로 흐름 챔버의 바닥 상에 위치된 입구 포트(P2)를 통해 유입된다. 유체(F2)가 흐름 챔버에 들어가면, F2에 함유된 샘플 입자는 F1의 흐름 스트림에 비말동반되고 챔버를 통해 운반된다.
F1 및 F2의 유속 균형을 유지하여서, 입자는 흐름 챔버의 바닥 근처에 남겨진다. 흐름 챔버의 초기 영역에서 이온이 고전도성 영역에서 저전도성 영역으로 확산되어서 제1 전극(E1)에 도달하기 전에 전도성의 균형 상태가 확립된다. 제1 전극(E1)은 이후에 입자의 유전영동 반응에 영향을 주는 비균일한 전계를 생성하는 사인파 신호를 출력하는 신호 발생기에 연결된다. 신호의 특별한 주파수에서, 표적 입자는 전극으로 양성적으로 유인되는 반면 비표적 입자는 동시에 반발된다. 표적 입자는 펌프에 연결된 수집 포트(P3)를 통해 유인된다. 수집 포트(P3)에 연결된 펌프는 표적 입자(O1)를 함유하는 유체의 바닥층을 걷어내기 위해 일정한 유속에서 작동된다. 흐름 챔버의 나머지 유체는 흐름 챔버가 흐름 속도를 감소시키게 되는 챔버 바닥부에서의 경사진 전이를 겪는 하류로 이어진다.
경사진 전이 이후, 유체는 제2 전극(E2)을 만난다. 제2 전극(E2)은 제1 전극(E1)과 유사한 방식으로 동력공급된다. 이는 나머지 입자에서 유전영동 반응을 유도하며, 나머지 표적 입자(O2)를 함유하는 유체의 바닥층을 걷어내기 위해 일정한 유속에서 작동되는 펌프에 역시 연결된 수집 포트(P4)를 통해 임의의 나머지 표적 입자의 수집을 가능하게 한다. 나머지 유체는 수집 포트(P4)의 하류로 흐름을 계속하고 폐기물 포트(P5)를 통해 배출된다.
도 5에 예시한 바와 같이, 본 발명에 따라 2 레벨 및 2 흐름 영역을 구비한 한 챔버의 다른 실시형태를 제시한다. 2개의 레벨은 직렬로 도시되어 있지만, 하나 이상의 개재된 레벨에 의해 이격될 수 있다. 샘플을 함유하는 제1 유체(F1)는 진입 영역(1)을 통해 유입된다. 샘플이 없는 제2 유체(F2)는 진입 영역(2)을 통해 유입된다. 유체(F1 및 F2)는 챔버에 상층 및 하층 유체 레벨을 나누는 바닥부에 제작된 개방구(포트)(P)를 통해 연결된다. 유체(F2)의 유속은 유체(F1)의 유속보다 크다.
영역(1)을 통해 유입되는 유체(F1)는 개방구(P)를 통해 챔버의 하층 레벨 내 유체(F2)로 유체(F1) 및 샘플을 구동시키는 압력 차이를 겪게된다. 영역(1)을 통해 유입된 유체(F1)에 현탁된 샘플 입자는 챔버의 내부로를 따라 이동하면서 제1 전극력(E1)을 겪게된다. 음의 유전영동력을 겪게되는 유체(F1)의 입자는 개방구로부터 반발되고 하층 레벨의 유체(F2)로 진입이 방지된다. 양의 유전영동력을 겪는 유체(F1)의 입자는 개방구(P)로 유인되고 유체(F2)로의 그 통로를 조성한다. 개방구(P)를 통해 유체(F2)로 진입하는 입자는 하층 레벨에서 챔버의 내부로를 따라 이동하면서 다양한 지점에서 제2 전극력(E2)을 겪는다. 음의 유전영동력을 겪는 유체(F2)의 입자는 챔버의 하부의 루프로부터 반발되어서 챔버의 하부의 바닥부쪽 아래로 향하게 된다. 양성 유전영동에 의해 개방구(P)를 향하고 그를 통해서 표적 입자(들)를 유인하도록 상층 레벨에서 전기력(E1)을 제공하기 위해 가해지는 전압 주파수는 하부 챔버의 바닥부를 향해서 음의 유전영동에 의해 표적 입자(들)를 밀어내게 하층 레벨에 전기력(E2)을 제공하기 위해 가해지는 전압 주파수와는 다르다. 따라서, 도시한 바와 같이, 적용되는 전기력(강도 및 주파수)에 의존적으로, 상층 레벨을 따라 이동하는 입자는 개방구(1개 이상의 개방구)를 통해 통과하고 그들이 나타내는 그들의 크기 및 구조 및/또는 유전체 특징 및/또는 특성을 기반으로 제2 하층 레벨로 유인된다. 도시한 바와 같이, 표적 입자는 이 예에서 2개 이상의 개방구를 통해 선택적으로 분리되고 챔버의 하층 레벨의 바닥부를 향해 가게 된다.
도 6에 도시한 바와 같이, 본 발명의 전극 디자인의 다른 실시형태는 개방구(P)의 모서리에 제작된 2개의 전극(E1 및 E2)을 구비한다. 여기에 도시된 개방구는 직사각형 슬릿의 형태를 취하지만, 임의의 형태, 예컨대 원형 형상일 수도 있다. 이러한 예에서 전극은 상호 얽힌 전극으로 도시되었지만, 원형 개방구를 둘러싼 원형 부품의 형태를 취할 수도 있다.
도 7에 도시한 바와 같이, 흐름 챔버 시스템(300)은 본원의 실시형태에 따라 물질을 단리하는데 사용된다. 흐름 챔버 시스템(300)은 전극(200), 흐름 챔버(305), 용리 완충액(310), 펌프(315), 용리 완충액 포트(320), 샘플(325), 주입기(330), 주입 포트(335), 표적 입자(340), 수집 포트(345), 흡입기(350), 비표적 입자(355), 폐기물 처리 포트(360), 입자 계측기(365), 표적 입자 농축 샘플(370) 및 표적 입자 고갈 샘플(375)을 포함한다.
작업 시, 흐름 챔버(305)는 용리 완충액 포트(320)를 통해서 용리 완충액(310)의 흐름을 수용하도록 구성된다. 용리 완충액은 펌프(315)에 의해 제어되는 그의 흐름 속도를 가질 수 있다. 흐름 챔버(305)는 주입 포트(335)를 통해 샘플(325)을 수용하도록 더 구성된다. 예시적인 실시형태에서, 샘플(325)은 표적 입자(340) 및 비표적 입자(355)를 포함한다. 주입 포트(335)를 통하는 샘플(325)의 유속은 주입기(330)에 의해 제어된다. 용리 완충액(310) 및 샘플(325)은 혼합되어 흐름 챔버(305)를 통해 하류로 이동하는 유체 현탁물을 형성한다. 유체 현탁물은 전극(200)에 의해 생성된 전계(예를 들어, 유전영동성)를 경험하고, 전계는 전극(200)의 제1 구역(205)(도 1에 도시) 및 제2 구역(210)(도 1에 도시)에서 다양한 강도를 갖는다. 다양한 전계 강도는 유체 현탁물에 대해 다양한 강도의 유전체력을 생성시킨다.
일 실시형태에서, 샘플(325)에 가해지는 유전체력은 샘플(325)을 표적 입자(340)와 비표적 입자(355)로 분리시키는 것을 용이하게 한다. 표적 입자(340)는 유인 유전체력을 경험하고 흐름 챔버(305)의 바닥부에 위치된 전극(200)을 향하고 수집 포트(345)를 통해 이동한다. 흡입기(350)는 수집 포트(345)를 통하는 표적 입자(340)의 흐름을 제어할 수 있다. 수집 포트를 통해 수집된 물질은 표적 입자 농축된 샘플(370)이다. 비표적 입자(355)는 전극(200)으로부터 멀리 그리고 폐기물 처리 포트(360)를 통해 밖으로 비표적 입자(355)를 반발시키는 음의 유전체력을 경험한다. 폐기물 처리 포트(360)를 통해 수집된 물질은 표적 입자 고갈 샘플(375)이다. 유전체력은 표적 입자 농축 샘플(370)가 표적 입자 고갈 샘플(375) 보다 표적 입자(340) 대 비표적 입자(355)의 비율이 더 높도록 표적 입자(340) 및 비표적 입자(355)를 분리시키는 것을 용이하게 한다.
일부 실시형태에서, 입자 계측기(365)는 폐기물 처리 포트(360) 및 수집 포트(345) 중 적어도 하나와 커플링될 수 있다. 입자 계측기(365)는 흐름 챔버(305)를 나가는 입자를 계측하도록 구성될 수 있고, 회수된 표적 입자(340)의 백분율, 및 표적 입자(340) 대 비표적 입자(355)의 비율 결정을 용이하게 할 수 있다.
일 실시형태에서, 흐름 챔버(305)는 용리 완충액(310) 및 샘플(325)가 수평 방향으로 흐름 챔버(305)를 통해 이동하도록 수평 방향으로 배향된다. 다른 실시형태에서, 흐름 챔버(305)는 용리 완충액(310) 및 샘플(325)이 수직 또는 경사 방향(수평 방향에 반대로)으로 흐름 챔버(305)를 통해 이동하여 임의의 침강력 성분을 제거 또는 감소시키도록 수직 또는 경사 방향으로 배향된다.
일 실시형태에서, 흐름 챔버(305)의 너비 및 길이에 대한 흐름 챔버(305)의 길이는 매우 작다. 따라서, 흐름 챔버(305)는 용리 완충액(310) 및 샘플(325)의 흐름 속도가 바닥부 및 천정부에서는 더 느리고 바닥부와 천정부 사이 중간에서는 더 높도록 포물선 흐름 프로파일로 층류를 확립할 수 있다.
또한, 예시적인 실시형태에서, 용리 완충액(310) 및 샘플(325)의 유속은 흐름 챔버(305)를 통해 이동함에 따라서 흐름 챔버(305)로 유입된 표적 입자(340)가 전극(200) 가까에 머무르는 것을 보장하도록 제어된다.
또한, 예시적인 실시형태에서, 전극(200)의 상향이고 주입 포트(335)에 가까운 흐름 챔버(305)의 바닥부는 적어도 하나의 표면 특징을 포함할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 적어도 하나의 표면 특징은 샘플(325) 및 용리 완충액(310)의 혼합을 용이하게 하는 범프, 포스트, 릿지, 및/또는 딤플을 포함한다. 적어도 하나의 표면 특징은 레이저 에칭, 엠보싱, 사출 성형, 레이저 삭마, 및/또는 본원에 기술된 바와 같이 표면 특징이 기능할 수 있는 임의의 다른 방법에 의해 형성될 수 있다. 적어도 일부 실행에서, 복수의 표면 특징은 쉐브론 패턴을 형성하도록 흐름 챔버(305)의 바닥부에 한정된다. 다른 실행에서, 표면 특징은 사인파 패턴, 구불구불한 패턴, 및/또는 표면 특징이 샘플(325) 및 용리 완충액(310)의 혼합을 용이하게 할 수 있는 임의의 다른 패턴으로 한정될 수 있다. 다르게, 흐름 챔버(305)의 바닥부는 전극(200)의 매끄러운 상향일 수 있다.
흐름 챔버 및 전극을 사용하는 방법
다른 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 흐름 챔버에서 유전영동을 사용하여 유체 샘플 중 표적 입자를 분리하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 a) 유체 주입 포트(335)로 표적 입자를 함유하는 샘플(325)을 연속적으로 유입시키는 단계; b) 흐름 포트(320)로 용리 완충액(310)을 연속적으로 유입시키는 단계로서, 여기서 샘플(325) 및 용리 완충액(310)은 흐름 챔버(305)에서 유체 샘플을 형성하는 것인 단계; c) 흐름 챔버의 한정 영역 내 유체 샘플에 대해 전계를 인가하는 단계로서, 전계는 흐름 챔버(305)의 바닥부에 커플링된 전극(200)에 의해 생성되고, 전극(200)은 적어도 하나의 제1 구역(205) 및 제2 구역(210)을 포함하며, 제1 구역(205)은 복수의 제1 전도성 트레이스(215) 및 제1 전극간 갭(220)과 회합되고 제2 구역(210)은 복수의 제2 전도성 트레이스(230) 및 제2 전극간 갭(235)과 회합되며, 전극(200)의 각 구역은 유전영동에 의해 유체 샘플로부터 표적 입자를 분리하는 전계를 생성하도록 구성된 것인 단계; 및 d) 표적 입자(340)를 수집하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용하는 "분리하는", "농축하는", "단리하는", 및 "정제하는"은 표적 입자가 샘플에 함유된 비표적 입자가 실질적으로 없도록 유체 샘플을 성분부로 나누는 것을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
다른 측면에서, 본원은 상기 기 술된 흐름 챔버에서 유전영동을 사용해 샘플 중 세포를 분리하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 a) 유체 주입 포트(335)로 세포 함유 샘플(325)을 연속적으로 유입시키는 단계; b) 흐름 포트(320)로 용리 완충액(310)을 연속적으로 유입시키는 단계로서, 여기서 샘플(325) 및 용리 완충액(310)은 흐름 챔버(305)에서 유체 현탁물을 형성시키는, 상기 용리 완충액(310)을 연속적으로 유입시키는 단계; c) 흐름 챔버의 한정된 영역 내 전계에 유체 현탁물을 노출시키는 단계로서, 여기서 전계는 챔버(305)의 바닥부에 커플링된 전극(200)에 의해 생성되며, 여기서 전극은 흐름 챔버(350)의 바닥부에 커플링된 전극(200)을 포함하고, 전극(200)은 전기 신호가 인가될 때 제1 전계를 생성하는 제1 전극간 갭(220) 및 복수의 제1 전도성 트레이스(215)와 회합된 적어도 하나의 제1 구역(205); 및 전기 신호가 인가될 때 제1 전계와는 다른 규모의 제2 전계를 생성하는 제2 전극간 갭(235) 및 복수의 제2 전도성 트레이스(230)와 회합된 제2 구역(210)을 포함하고, 제1 전계 및 제2 전계는 유체 현탁물로부터 표적 입자를 분리하는 유전영동력을 생성하는, 상기 노출시키는 단계; 및 d) 표적 입자(340)를 수집하는 단계를 포함한다.
표적 입자(340)는 챔버(305)의 하류 말단의 바닥에 위치한 수집 포트(345)를 통해 수집되는 한편, 비표적 입자(355)는 챔버(305)의 하류 말단에 위치한 폐기물 처리 포트(360)를 통해 흐른다. 구체적으로, 단리되는 표적 입자(340)는 암성 세포이고 비표적 입자(355)는 정상 세포이다. 그러나, 유기 및 무기 둘 모두의 다른 물질들이 본원의 시스템 및 방법을 사용해 분리될 수 있다. 또한, 비표적 입자(355) 및 표적 입자(340)로서 기술되었지만, 일부 실시형태에서 폐기물 처리 포트(360)를 통해 수집된 비표적 입자(355)는 표적 입자(340) 이외에도 바람직한 입자를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법에서 사용되는 용리 완충액은 약 5 mS/m 내지 약 50 mS/m를 포함하여, 약 5 mS/m 내지 약 250 mS/m의 전도성을 갖는다. 특히 적합한 전도성은 약 30 mS/m이다. 전계는 약 2 Vp-p 내지 약 8 Vp-p의 AC 전압을 포함한다. 인가된 전압의 주파수는 약 10㎑ 내지 약 30㎒를 포함한다. 흐름 챔버 내 용리 완충액 유속은 약 0.5 mL/분 내지 약 5 mL/분이다. 흐름 챔버 내 샘플 주입 속도는 약 0.01 mL/분 내지 약 1 mL/분이다. 흐름 챔버내 샘플 수집 유속은 약 0.01 mL/분 내지 약 1 mL/분이다.
본 발명의 방법을 이제 보다 구체적으로 기술한다. 처음에, 표본은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다양한 기술을 통해서 환자의 말초 순환계로부터, 또는 골수로부터 채취될 수 있다.
채취된 표본 중 종양 세포의 비율은 다양한 방법, 예컨대 Ficoll 또는 Percoll 등의 용액으로 구성된, 밀도 구배 원심분리; 기계적 농축, 예컨대 다양한 유형의 필터; 의도적으로 제공된 디바이스, 예를 들어 유전영동성-활성화 세포 분급기(DACS)를 통한 유전영동에 의한 분리를 통한 농축; 선택적 용해, 예컨대 관심없는 적혈구의 선택적 용해; 양성 선택(회수된 개체군에 대한 특이적 항체에 결합되는 비드 사용) 또는 음성 선택(미관심 세포 개체군의 고갈)에 의한 면역자성을 통한 면역자성 분리법으로서, 여기서 2가지 유형의 선택은 과정의 특이성을 증가시키기 위해 결합될 수 있는 것인 분리법; 특이적 형광발광 항체로 표지된 세포에 대한 FACS; 유리하게 상피 수용체(예컨대 EpCAM)에 대한 특이적 항체로 코팅된 표면이 제시된 미세유체 시스템에 의한 고체상 면역 분리법등을 사용해 농축될 수 있다. 대부분, 이러한 과정들은 자동화되어 있고, 모든 분급 과정은 밀도 구배 원심분리에 의한 분리가 선행되거나 또는 대안적으로 전체 혈액에 대해 적용될 수 있다.
당해 분야의 숙련가에게 알려진 다른 기술은 Miltenyi Biotech가 개발한 MACS 및 Stem-cell technologies가 개발한 Easy-sep이다. 대안적으로, 특별한 컬럼의 사용을 요구하지 않지만, 또한 웰 또는 시험관으로 작업 시 사용할 수도 있는 보다 큰 치수의 상자성 비드(예를 들어, 항-EpCAM Dynabead)를 사용하는 것이 가능하다.
적어도 한 유형의 종양 세포를 갖는 개체군으로 표본을 농축시키는 것은 경우에 따라서 하나 이상의 변수 예컨대 질량 밀도; 형태; 전기 특성; 화학적 특성; 물리적 특성; 표면 항원의 발현; 세포질내 항원의 발현; 유전체 특성; 자성 특성; 기하학적 특성(예를 들어, 크기); 광학 특성; 및 이들의 조합을 기초로 하는 세포의 선별에 의해 수행될 수 있다.
다음으로, 중양 세포를 함유하는 사전농축된 표본은 다른 세포 개체군으로부터 그들을 단리할 수 있는 상기 기술된 흐름 챔버를 포함하는 미세유체 디바이스에 삽입된다.
본 발명에 따른 방법은 생물학적 물질, 예컨대 세포, 세포 기관, 세포 응집체, 세포 응집체, 핵산, 단백질, 아미노산, 액상 구상체, 박테리아, 원생생물, 및 바이러스를 포함한, 표적 입자를 구별하는데 사용될 수 있다. 또한, 생물학적 물질은 예를 들어서, 세포 유형의 혼합물, 예컨대 모체 혈액 혼합물 중 태아 유핵 적혈 세포일 수 있다. 생물학적 물질은 또한 암 세포, 예컨대 폐암, 전립선암, 흑색종, 유방암, 췌장암, 간암, 신경아세포종 암, 직결장암, 유건종암, 백혈병, 림프종, 갑상선암, 수모세포종, 두경부암, 중피종, 포도막 흑색종, 방광암, 신장암, 섬유모낭종, 위장 폴립, 피부 편평 세포, 피부 기저 세포, 폐포 연부 육종, 골육종, 난소, 횡문근육종 및 교아세포종일 수 있다. 생물학적 물질은 예를 들어, 정상세포와의 혼합물에 존재하거나, 또는 혈액 기생충 예컨대 말라리아 기생충으로 감염된 적혈구일 수 있다.
본 발명의 장치 및 방법을 사용해 회수한 세포는 당해 분야의 숙련가에게 알려진 다양한 분석법을 더 수행할 수 있다. 예를 들어, 세포는 단백질, 유전자, 또는 염색체 특징규명, 세포 표지화, 예컨대 암 세포 동정을 위한 항-사이토케라틴 항체 및 정상 혈액 세포 동정을 위한 CD45로 표지화, 형광발광 인시츄 혼성화 프로브(FISH), 상피에서 간엽성 전이에 대한 마커 발현 측정, 줄기 세포 특징, PCR-기반 기술, 유전자 발현 분석, 및 이들의 조합이 수행될 수 있다.
본 발명의 장치 및 방법은 또한 약물을 사용한 치료 전 및 후에 환자로부터 혈액 표본을 얻고, 본원에 기술된 장치 및 방법을 사용해 희귀 세포를 농축하고 희귀 세포의 약동학적 마커의 발현을 측정하여서 약물 용량 선택을 가이드하는데 사용될 수 있다. 본원의 장치 및 방법은 또한 혈액 유래 희귀 세포를 농축하고, 동물에 희귀 세포를 이식하여서, 이종이식 종양을 발생시키고 그의 생물학 및/또는 약물 반응을 연구하여서 약물 반응도의 지표를 얻는데 사용될 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법은 또한 혈액으로부터 희귀 세포를 농축하고 그들을 생체외 다양한 약물에 노출시켜서 약물 반응도의 지표를 얻는데 사용될 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법은 또한 단일 세포 전체 게놈 증폭에 의해서 전립선암을 갖는 환자로부터 얻은 CTC에 대한 결실의 존재를 평가하는데 사용할 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법은 미기의 원발성 기원 암(CUP)을 갖는 환자에서 얻은 CTC의 발현 프로파일 및/또는 유전자 프로파일을 통해 기원 조직을 동정하여서, 가장 적절한 요법의 선택에 기본적인 정보를 얻는데 사용될 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법은 또한 세포 이동성 어세이, 침윤성 어세이, 및 집락형성성 어세이를 수행하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법은 또한 예후 지시자 및 잠재적인 치료 표적을 동정하기 위해서 단일 CTC 및/또는 DTC에 대한 유전자 발현 분석을 수행하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 장치 및 방법은 또한 예를 들어, 항암 약물 예컨대 화학요법제 또는 표적 치료 화합물, 소형 분자, 단일클론 항체, 면역요법, 백신, 유전자 요법, 나노입자, 리보자임 기반 치료제, 바이러스, 방사선, 수술, 열요법, 호르몬, 알킬화제, 항대사산물제, 항생제, 알칼로이드/식물 추출물, 및 이들의 조합으로 치료 전 및/또는 후에, 혈액으로부터 세포를 단리하는데 사용될 수 있다.
방법은 샘플에 삼유된 세포 및/또는 세포들을 입자와 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 입자는 예를 들어, 비드, 항체, 나노입자, 콜로이드, 리포솜, 금속 및 이들의 조합을 포함한다. 특히 적합한 실시형태에서, 세포는 다음의 양양을 갖는 항체에 커플링된 자성 입자로 표지될 수 있다: CD45 음성; CD45 및 GPA 음성; CD45 및 CD14 음성; CD45, CD14 및 GPA 음성; EpCAM 양성; CK 양성; EGFR 양성; 플렉틴 양성; 알파 페토 단백질 양성 ; MUC1-양성; HER2-양성; 및 이들의 조합. 또한 본 발명은 그로부터 핵산을 추출할 수 있는 생체분자, 예컨대 미생물, 세포 및 바이러스를 신속하게 동정할 수 있다.
이 방법은 샘플 중 함유된 세포 및/또는 세포들을 트레이서와 결합시키는 단계를 더 포함한다. 적합한 트레이서는 예를 들어, FISH 프로브, 형광단에 커플링된 항체, 크로모겐에 커플링된 항체, 미세비드에 커플링된 항체 및 이들의 조합을 포함한다. 항체는 단백질 예컨대 예를 들어 EpCAM, 사이토케라틴 8, 사이토케라틴 18, 사이토케라틴 19, 사이토케라틴 20, CD45, EGFR, IGFR, PSA, TTF1, HER2/neu, MUC-1, 플렉틴, 및 이들의 조합을 인식하는 에피토프에 대한 것이다.
바람직하게, 종양 세포는 순도가 95% 보다 높게 분석될 표본으로 구성되도록 단리된다. 보다 더 바람직하게, 종양 세포는 100%의 순도를 갖는 분석될 표본으로 구성되도록 단리된다.
본 발명에 따라 회수된 종양 세포는 다양한 유형일 수 있고, 상이한 수준의 해상도 및 감응도로 유전자 또는 염색체 특징규명을 할 수 있고 이전에 기술된 것들에 따라서 연구의 진단 목적에 따라서 다양한 유형의 분석을 세포에 대해 수행할 수 있다.
예를 들어, K-RAS 유전자의 돌연변이 존재를 검출하기 위해서 전이가 존재하는 환자에서 채취한 CTC의 서열분석을 진행하는 것이 가능하다. 전립선암의 경우, 단일 세포 전체 게놈 증폭을 통해서 CTC에 대한 결실 존재를 평가하는 것이 가능하다. 다시, 미지의 원발성 기원 암(CUP)의 경우에서, 유전자 프로파일 및/또는 CTC 발현 프로파일을 통해 기원 조직을 동정하여서, 가장 적절한 요법의 선택을 위해 기본적인 정보를 얻는 것이 가능하다.
구별되는 종양 세포의 경우에서, 이후 예후 지시자 및 가능한 치료 표적을 동정하기 위해 단일 CTC 및/또는 DTC에 대한 유전자 발현 분석을 수행하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법은 또한 미립자 물질 예컨대 무기 물질, 예컨대 미네랄, 크리스탈, 액상 구상체, 콜로이드, 유전체, 전도성, 반전도성 또는 절연 입자, 및 가스 기포를 구별하는데 사용될 수 있다. 부가적으로, 본원의 방법은 가용성 물질 예컨대 분자, 또는 분자 응집물, 예를 들어 단백질, 또는 핵산을 구별하는데 사용될 수 있다.
구별되는 입자는 임의 크기일 수 있다. 보다 구체적으로, 약 ∼10 nm 내지 약 ∼1 nm의 입자이고, 예를 들어 화학적 또는 생물학적 분자(단백질, DNA 및 RNA 포함), 분자의 조합물, 바이러스, 플라스미드, 박테리아, 세포 또는 세포 응집물, 원생생물, 배아 또는 다른 소형 유기체를 비롯하여, 비생물학적 분자, 이들의 조합물, 미네랄, 크리스탈, 액상 구상체, 콜로이드, 유전체, 전도성, 반전도성 또는 절연 입자, 및 가스 기포를 포함한다. 생존 세포를 사용하는 생물학적 적용을 위해서, 본원은 리간드, 염료, 항체 또는 다른 방법으로 변경시킬 필요 없이 세포를 분리할 수 있다. 세포는 분리 동안 및 그 이후에 미손상, 미변경 및 생존 상태로 남아있는다. 비생물학적 적용은 유사하게 이러한 변경을 요구하지 않는다. 그러나, 본원에 따른 장치 및 방법은 변경이 되더라도 그러한 생물학적 물질을 분리하는데 균등하게 적합함을 인식한다.
세포 또는 표적 입자는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 방법에 따라 분석될 수 있다. 적합한 분석은 예를 들어, 서열분석, 미세위성 분석, 비교 게놈 혼성화(CGH), 어레이 CGH, 종결점 PCR, 실시간 PCR, 메틸화 분석, 파이로서열분석에 의한 정량적 메틸화 분석, 바이설파이트-게놈-서열분석 PCR(BSP), 메틸화-특이적 PCR(MSP), DNA의 조합 바이설파이트 제한 분석(COBRA), 메틸화-감응성 단일 뉴클레오티드 프라이머 확장법(MS-SNuPE), 유전자 발현 분석, RT-PCR, 단일-세포 유전자 발현, 디지탈 PCR, 디지탈 드랍렛 PCR, ICE-콜드 PCR, 표지된 뉴클레오티드 프라이머 예컨대 SYBR GREEN(등록상표)을 사용한 PCR, 분자 비콘 프로브 예컨대 TaqMan(등록상표)을 사용한 PCR, 경쟁적 대립유전자-특이적 TaqMan(등록상표) PCR(CAST-PCR), SNP TaqMan(등록상표) PCR, 및 이들의 조합을 포함한다.
실시예
실시예 1
본 실시예에서, SKOV3 난소암 세포의 회수율을 상이한 용리 완충액 유속을 사용하여 전극(200)(도 2에 도시) 및 전극(100)(도 1에 도시) 간에 비교하였다.
구체적으로, PBMC에 SKOV3 난소암 세포를 섞었다. 수집된 데이터는 50 미크론의 전극간 갭(110) 및 50 미크론의 전도성 트레이스 너비(115)를 갖는 종래 전극을 이용하였다. 이러한 특정 예에서, 전극(200)은 제1 전극간 갭(220)이 30 미크론이고, 제1 전도성 트레이스 너비(225)가 30 미크론이며 제2 전극간 갭(235)이 30 미크론이고 제2 전도성 트레이스 너비(240)가 50 미크론인 2개 구역(205, 210)을 구비한다.
표 1은 상이한 용리 완충액 유속을 사용하여서 전극(100)과 비교한 전극(200)을 사용한 SKOV3 암세포의 회수율간 비교를 요약한 것이다.
전극 배열에 따른 회수율(%)의 비교
용리 완충액
유속(mL/분)		 전극 100을 사용한 세포 샘플로부터 SKOV3 난소암 세포의 회수율(%) 전극(200)을 사용한 세포 샘플로부터 SKOV3 난소암 세포의 회수율(%)
1.5 64.8 ± 3.5 70.6 ± 17.5
1.8 68.6 75.4 ± 5.7
2.1 52.5 ± 4.7 81.3 ± 7.8
2.4 54.2 ± 2 68.6 ± .2
2.7 47.2 ± 4.7 70 ± 8.6
표 1에 요약하고 도 8에 도시한 그래프로 예시한 바와 같이, 전극(200)은 종래 전극(100)과 비교 시 단리된 SKOV3 난소암 세포의 회수율 개선을 보여주었다.
표 2는 SKOV3 난소암 세포 대 수집 포트(345)를 통해 수집된 폐기 물질(PBMC)의 비율을 비교하여 얻은 단리된 SKOV3 난소암 세포의 순도가 전극(100)과 비교 시 본원의 전극(200) 적용에 의해 부정적으로 영향받지 않았음을 요약한다.
단리된 물질 대 폐기 물질의 비율
용리 완충액
재료 속도(mL/분)		 전극 100을 사용하여 수집 포트를 통해 수집된 폐기 물질에 대한 SKOV3 난소암 세포의 비율 전극(200)을 사용하여 수집 포트를 통해 수집된 폐기 물질에 대한 SKOV3 난소암 세포의 비율
1.5 521 ± 320 625 ± 340
1.8 906 2270 ± 802
2.1 5114 ± 2411 2508 ± 121
2.4 4462 ± 2212 6086 ± 3970
2.7 6833 ± 4680 2546 ± 863
실험적으로, 전극(100) 상에서 세포 속도는 전극(200) 보다 더 높아서 수집 슬롯에서 세포 탈출 흡인을 일으키는 것으로 관찰되었다. 결과적으로, 전극(200) 상에서 세포 회수는 도 9에 도시한 바와 같이 전극(100)에서 더 높았다. 회수에서 관찰된 개선은 또한 전극 패턴 전극(200)에서 보다 작은 갭으로 인한 낮은 쌍극자 상호작용의 결과일 수 있다.
세포의 쌍극자 사슬화는 높은 값으로 교차 주파수 이동을 일으킨다. 이는 비표적 세포와의 근접한 상호작용으로 인하여 음의 유전영동을 겪는 표적 세포의 결과로 인해 회수율을 감소시킬 수 있다.
도 9의 데이터는 또한 전극 갭의 감소가 혼합물(SKOV3 난소암 세포 및 PBMC)로부터 표적 세포(SKOV3 난소암 세포)의 순도에 부정적인 영향을 주지 않음을 보여주었다. 50 미크론의 전극 트레이스 및 30 미크론의 갭을 적용하여, 부양 높이가 50 미크론의 트레이스 및 공간을 갖는 전극과 동일하게 유지된다. 이는 높은 순도를 보장하였다. 전극(100) 및 전극(200)을 사용한 평균 PBMC 감소는 도 9에 도시하고 표 2에 요약한 바와 같이 2000배 더 높았다.
도 10에 도시한 바와 같이, 본 발명의 전극 디자인에 대한 지지 데이터는 50 ㎛ 갭 및 30 ㎛ 너비로 트레이스를 함유하는 제2의 상호 얽힌 전극 구역을 비교한다. 데이터는 COMSOL Multiphysics로 수행된 유한 요소 모의법으로 생성하였다. 이 방법은 부양 높이를 결정하기 위해서 침강 및 DEP 힘 간 힘 균형으로부터 생성된 평형 위치를 사용한다. 전압은 다양한 전극 치수에 대해 4.5 Vpk-pk로 일정하게 유지하였다. 전극 갭 및 너비는 20 ㎛ 갭 및 너비에서 출발하여 최대 70 ㎛ 갭 및 너비로 증가시켰다. 도 1을 참조하여, 전극간 너비(240) 및 전극간 갭(235)을 갖는 상호 얽힌 전극 구역은 전극간 갭(110) 및 전도성 트레이스 너비(115)를 함유하는 상호 얽힌 전극 기하구조와 유사한 부양 높이를 제공하여서, 비표적 입자를 ∼54 ㎛의 높이까지 부양시킬 수 있는 한편 20%만큼 전국 구조물의 유효 높이를 감소시킬 수 있다.
본원의 장치 및 방법은 희귀 세포의 후속 분석과 조합된 유체 현탁물 중 상이한 유형의 미립자 물질 및 가용 물질의 구별을 위한 현행 유전영동 방법 및 디바이스를 진보시켰다. 그러한 진보는 분자의 복수 방법 및 다른 분석이 가능하게 충분한 회수 효율 및 순도의 표적 입자를 산출하기 위해서 표적 입자 이동을 더 제어하도록 전극 상을 흐르는 표적 입자의 바람직한 이동 및 특정한 작동 조건에 더 효율적으로 영향을 미치게 디자인된 고유한 전극 패턴의 조합과 관련된다. 구체적으로, 본원의 장치 및 방법은 세포의 현탁물로부터 생존 및/또는 고정 순환 종양 세포(CTC) 또는 분산 종양 세포(DTC)를 농축 및 단리할 수 있고 종양 상태 및/또는 상응하는 암의 진행 상태의 진단을 위한 분자 분석 방법을 사용해 그 아개체군을 정성적으로 또는 정량적으로 분석하여서, 샘플을 최소의 침윤성 방법으로 얻을 수 있는 연속 흐름 미세유체 챔버의 유전영동을 사용한다.
상기의 관점에서, 본원의 몇몇 장점을 달성하고 다른 유리한 결과를 획득함을 볼 수 있다. 본원의 범주를 벗어나지 않고 상기 디바이스 및 방법에서 다양한 변화를 가할 수 있으므로, 상기 설명에 함유되고 첨부된 도면에 도시된 모든 주제는 예시로서 이해하고 의미를 제한하려는 것이 아니다.
본원의 성분 또는 이의 다양한 형식, 실시형태(들) 또는 측면들을 도입시, 단수 관사 "한", "하나", "그것" 및 "상기"는 하나 이상의 성분이 존재함을 의미하고자 한다. 용어 "포함하는", "함유하는" 및 "구비하는"은 포괄적인 것을 의미하고 열거된 성분들 이외의 추가 성분들이 존재할 수 있음을 의미한다.

Claims (20)

  1. 전극으로서,
    복수의 제1 전도성 트레이스 중 하나의 중간점에서부터 제1 전극 구역 내 인접한 제1 전도성 트레이스의 중간점으로 연장되는 제1 전극간 피치를 제공하는 상기 제1 전극 구역으로서, 전기 신호가 인가될 때 제1 전계를 생성하도록 구성된, 상기 제1 전극 구역; 및
    복수의 제2 전도성 트레이스 중 하나의 중간점에서 제2 전극 구역 내 인접한 제2 전도성 트레이스의 중간점으로 연장되는 제2 전극간 피치를 제공하는 상기 제2 전극 구역으로서, 전기 신호가 인가될 때 상기 제1 전계와는 다른 규모, 다른 전계 깊이 및 다른 공간 프로파일 중 적어도 하나를 생성하도록 구성된, 상기 제2 전극 구역을 포함하는, 전극.
  2. 전극으로서, 전기 신호가 인가될 때 제1 전계를 생성하도록 구성된 제1 구역, 및 전기 신호가 인가될 때 상기 제1 전계와는 다른 규모, 다른 전계 깊이 및 다른 공간 프로파일 중 적어도 하나를 갖는 제2 전계를 생성하도록 구성된 제2 구역을 포함하는, 전극.
  3. 샘플 내 입자 분리를 위한 챔버로서,
    외부 표면 영역 및 내부 표면 영역으로서, 내부 표면은 바닥부 및 천정부를 한정하는, 상기 외부 표면 영역 및 내부 표면 영역,
    상기 챔버의 내부 표면 영역과 유체 연통을 위해 위치된 제1 포트;
    상기 챔버의 상기 내부 표면 영역과 유체 연통을 위해 위치된 제2 포트; 및
    상기 챔버의 바닥부 영역에 고정된 전극 부품을 포함하되, 상기 전극은,
    복수의 제1 전도성 트레이스 중 하나의 중간점에서부터 제1 전극 구역의 인접한 제1 전도성 트레이스의 중간점으로 연장되는 제1 전극간 피치와 회합된 상기 제1 전극 구역으로서, 전기 신호가 인가될 때 제1 전계를 생성하도록 구성된, 상기 제1 전극 구역, 및
    복수의 제2 전도성 트레이스 중 하나의 중간점에서부터 제2 전극 구역의 인접한 제2 전도성 트레이스의 중간점으로 연장되는 제2 전극간 피치와 회합된 상기 제2 전극 구역으로서, 전기 신호가 인가될 때 상기 제1 전계와는 다른 규모, 다른 전계 깊이 및 다른 공간 프로파일 중 적어도 하나를 갖는 제2 전계를 생성하도록 구성된, 상기 제2 전극 구역을 포함하는, 샘플 내 입자 분리를 위한 챔버.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제1 전극간 피치는 상기 제2 전극간 피치와는 다른 너비를 갖는 것인 챔버.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 구역과 회합된 제1 전극간 갭 및 상기 제2 구역과 회합된 제2 전극간 갭은 너비가 동일하며, 상기 복수의 제1 전도성 트레이스와 회합된 제1 전도성 트레이스 너비 및 상기 복수의 제2 전도성 트레이스와 회합된 제2 전도성 트레이스 너비는 상이한 너비인, 샘플 내 입자 분리를 위한 챔버.
  6. 제3항에 있어서, 상기 제1 구역은 샘플에 대해 제1 유전영동력을 생성하기 위해 상기 제2 구역의 상류에 그리고 상기 제2 포트에 가깝게 위치되는, 샘플 내 입자 분리를 위한 챔버.
  7. 제6항에 있어서, 상기 제1 전극 구역은 상기 제2 전극 구역보다 전계의 깊이가 짧은, 샘플 내 입자 분리를 위한 챔버.
  8. 제3항에 있어서, 성가 제1 전극 구역은 플렉스 회로 상에 제작되고 흐름 챔버의 바닥부에 적층되는, 샘플 내 입자 분리를 위한 챔버.
  9. 제8항에 있어서, 상기 제2 전극 구역은 플렉스 회로 상에 제작되고 상기 흐름 챔버의 바닥부에 적층되는, 샘플 내 입자 분리를 위한 챔버.
  10. 제9항에 있어서, 상기 전극은 제3 전극간 갭 및 복수의 제3 전도성 트레이스와 회합된 제3 구역을 더 포함하고, 상기 제3 구역은 상기 전기 신호가 인가될 때 상기 제2 전계와는 다른 규모의 제3 전계를 생성하도록 구성된, 샘플 내 입자 분리를 위한 챔버.
  11. 제10항에 있어서, 상기 챔버는, 용리 완충액이 침강력 성분의 감소가 용이하도록, 수직, 또는 경사면 중 적어도 하나로 흐르도록 배향되는, 샘플 내 입자 분리를 위한 챔버.
  12. 제3항에 있어서, 상기 복수의 제1 전도성 트레이스 및 상기 복수의 제2 전도성 트레이스 중 적어도 하나는 유체 현탁물의 흐름에 따른 각으로 배향되는, 샘플 내 입자 분리를 위한 챔버.
  13. 흐름 챔버의 바닥부 및 전력 공급원에 커플링된 전극으로서,
    복수의 제1 전도성 트레이스 중 하나의 중간점에서부터 제1 구역 내 인접한 제1 전도성 트레이스의 중간점으로 연장되는 제1 전극간 피치와 회합된 상기 제1 구역으로서, 전기 신호가 인가될 때 제1 전계를 생성하도록 구성된, 상기 제1 구역; 및
    복수의 제2 전도성 트레이스 중 하나의 중간점에서 제2 구역 내 인접한 제2 전도성 트레이스의 중간점으로 연장되는 제2 전극간 피치와 회합된 상기 제2 구역으로서, 전기 신호가 인가될 때 상기 제1 전계와는 다른 규모, 다른 전계 깊이 및 다른 공간 프로파일 중 적어도 하나를 갖는 제2 전계를 생성하도록 구성된, 상기 제2 구역을 포함하되,
    상기 제1 전계와 상기 제2 전계는 유전영동력을 생성하는, 전극.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제1 전극간 피치는 상기 제2 전극간 피치와는 다른 너비를 갖는, 전극.
  15. 제13항에 있어서, 상기 제1 구역과 회합된 제1 전극간 갭 및 상기 제2 구역과 회합된 제2 전극간 갭은 너비가 동일하고, 상기 복수의 제1 전도성 트레이스와 회합된 제1 전도성 트레이스 너비 및 상기 복수의 제2 전도성 트레이스와 회합된 제2 전도성 트레이스 너비는 상이한 너비인, 전극.
  16. 흐름 챔버에서 유전영동을 사용하여 유체 샘플 중 표적 입자를 분리하는 방법으로서,
    a) 표적 입자를 함유하는 샘플을 주입 포트로 연속적으로 유입시키는 단계;
    b) 흐름 포트로 용리 완충액을 연속적으로 유입시키는 단계로서, 상기 샘플 및 상기 용리 완충액이 흐름 챔버 내에서 유체 현탁물을 형성하는, 상기 용리 완충액을 연속적으로 유입시키는 단계;
    c) 상기 흐름 챔버의 한정된 영역 내 전계에 상기 유체 현탁물을 노출시키는 단계로서, 상기 전계는 상기 챔버의 바닥부에 커플링된 전극에 의해 생성되되, 상기 전극은,
    전기 신호가 인가될 때 제1 전계를 생성하는 제1 전극간 갭 및 복수의 제1 전도성 트랙과 회합된 제1 구역; 및
    전기 신호가 인가될 때 상기 제1 전계와는 다른 규모의 제2 전계를 생성하는 제2 전극간 갭 및 복수의 제2 전도성 트랙과 회합된 제2 구역을 포함하며, 상기 제1 전계 및 상기 제2 전계는 상기 유체 현탁물로부터 상기 표적 입자를 분리하는 유전영동력을 생성하는, 상기 유체 현탁물을 노출시키는 단계; 및
    d) 상기 표적 분자를 수집하는 단계를 포함하는, 유체 샘플 중 표적 입자를 분리하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 용리 완충액은 전도성이 약 5 mS/m 내지 약 250 mS/m인, 유체 샘플 중 표적 입자를 분리하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 용리 완충액은 전도성이 약 30 mS/m인, 유체 샘플 중 표적 입자를 분리하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 샘플은 전도성이 약 5 mS/m 내지 약 250 mS/m인 샘플 완충액에 함유되는, 유체 샘플 중 표적 입자를 분리하는 방법.
  20. 제A1항에 있어서, 상기 전계는 약 2 Vp-p 내지 약 8 Vp-p의 AC 전압을 포함하고, 인가된 전압의 주파수는 약 10㎑ 내지 약 30㎒를 포함하는, 유체 샘플 중 표적 입자를 분리하는 방법.
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