DE102018211281A1

DE102018211281A1 - Mikrofluidische Vorrichtung und Verfahren zum Verdünnen und Separieren von Partikeln einer Probe

Info

Publication number: DE102018211281A1
Application number: DE102018211281.9A
Authority: DE
Inventors: Christoph Faigle
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2018-07-09
Filing date: 2018-07-09
Publication date: 2020-01-09

Abstract

Die Erfindung betrifft eine mikrofluidische Vorrichtung (100) und ein Verfahren (600) zur Separierung von Partikeln einer Probe (10), insbesondere von Zellen oder Nukleinsäuren einer biologischen Probe (10), umfassend eine Separationskammer (110) zur Separierung der Partikel aus der Probe (10), wobei die Separationskammer (10) mit einer mikrofluidischen Schlaufe (200) fluidisch verbunden ist, wobei die Schlaufe (200) Verdünnungsfluid (210) zum Verdünnen der Probe (10) umfasst und wobei die Separationskammer (110) einen Partikelausgang (113) für eine Ableitung der separierten Partikel und einen Schlaufenausgang (114) in die mikrofluidische Schlaufe (200) zu einem Filter (221) der Schlaufe (200) für ein Filtrieren des mit der Probe (10) vermischten Verdünnungsfluids (210) aufweist.

Description

Stand der Technik
Vollblutproben, die direkt aus dem Körper eines Patienten stammen, enthalten etwa 5 Milliarden rote und 5 Millionen weiße Blutkörperchen pro Milliliter. Aufgrund dieser hohen Zelldichte muss eine solche Probe für eine Analyse in mikrofluidischen Analysegeräten zunächst auf eine Konzentration von etwa 100.000 Zellen pro Milliliter verdünnt werden. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn für eine Analyse bestimmte Zellen von einem Rest der Probe getrennt werden, beispielsweise im Falle eines Nachweises von zirkulierenden Tumorzellen, um auf eine bearbeitbare Konzentration zu kommen. Die dafür erforderlichen großen Volumina von bis zu 500 Milliliter Verdünnungsflüssigkeit müssen dafür typischerweise in Pufferreservoirs außerhalb der mikrofluidischen Vorrichtung bereitgehalten werden, wie beispielsweise in US 2016/0209299 A1 und WO 2017/181186 A1 beschrieben.
Offenbarung der Erfindung
Vorteile der Erfindung
Vor diesem Hintergrund betrifft die Erfindung eine mikrofluidische Vorrichtung zur Verdünnung und Separierung von Partikeln einer Probe. Wie eingangs angeführt, kann es sich bei der Probe insbesondere um eine biologische Probe, insbesondere eine Probe einer menschlichen oder tierischen Körperflüssigkeit wie beispielsweise eine Blutprobe handeln. Unter Partikeln sind dabei insbesondere Zellen oder Nukleinsäuren menschlichen oder tierischen Ursprungs zu verstehen. Beispielsweise handelt es sich um eine mikrofluidische Vorrichtung zur Separierung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Blutprobe, insbesondere aus einer Vollblutprobe.
Die mikrofluidische Vorrichtung umfasst eine Separationskammer zur Separierung der Partikel aus der Probe, wobei die Separationskammer mit einer mikrofluidischen Schlaufe fluidisch verbunden ist. Bei der mikrofluidischen Vorrichtung kann es sich insbesondere um eine mikrofluidsche Kartusche handeln, auch als Lab-on-a-Chip-Kartusche bezeichnet, welche beispielsweise über eine zweite Analyse- oder Steuervorrichtung betrieben wird. Beispielsweise wird die Kartusche in die zweite Vorrichtung für eine Prozessierung einer in die Kartusche eingegebenen Probe aufgenommen. Beispielsweise handelt es sich bei der Separationskammer oder bei der mikrofluidischen Vorrichtung um eine Flusszelle, welche unter Ausnutzung von Dielektrophorese Zellen trennen kann wie beispielsweise in Salmanzadeh et al., „Isolation of rare cancer cells from blood cells using dielectrophoresis," 2012 Annual International Conference ofthe IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, San Diego, CA, 2012, pp. 590-593, doi: 10.1109/EMBC.2012.6346000 beschrieben.
Unter einer mikrofluidischen Schlaufe können insbesondere ein oder mehrere miteinander fluidisch verbundene Kanäle verstanden werden, welche eine zirkulierende Beförderung eines Fluids ermöglichen, beispielsweise ein in sich geschlossener Kanal. Die Schlaufe umfasst Verdünnungsfluid zum Verdünnen der Probe, insbesondere eine Flüssigkeit wie beispielsweise eine Pufferlösung.
Die Separationskammer weist einen ersten Ausgang, im Weiteren als Partikelausgang bezeichnet, auf, durch welchen die separierten Partikel vom Rest der verdünnten Probe örtlich getrennt werden können. Ferner umfasst die Separationskammer einen zweiten Ausgang, im Weiteren als Schlaufenausgang bezeichnet, welcher die Separationskammer mit der mikrofluidische Schlaufe fluidisch verbindet, so dass das mit der Probe vermischte Verdünnungsfluid zu einem Filter der Schlaufe für ein Filtrieren befördert werden kann.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung hat den Vorteil, dass eine für die Verdünnung der Probe erforderliche Menge an Verdünnungsfluid gering gehalten werden kann, da das Verdünnungsfluid vorteilhafterweise aufgrund der Schleife mit integriertem Filter mehrfach verwendet werden kann. Das über die Schlaufe zirkulierende Verdünnungsfluid kann vorteilhafterweise mehrfach zur Verdünnung von unterschiedlichen, insbesondere sukzessiven Teilen der Probe eingesetzt werden. Somit wird vorteilhafterweise Verdünnungsflüssigkeit eingespart, wodurch Müll vermieden und Kosten reduziert werden. Durch die Erfindung ist es ferner möglich, die erforderliche Menge an Verdünnungsfluid direkt in der mikrofluidischen Vorrichtung vorzulagern. Somit kann vorteilhafterweise zum einen auf externe Behälter verzichtet werden und zum anderen muss kein fluidischer Anschluss an die Vorrichtung zur externen Eingabe von Verdünnungsfluid in die Vorrichtung vorgesehen sein.
Das Verdünnungsfluid kann in der mikrofluidischen Schleife vorgelagert sein. Alternativ oder zusätzlich umfasst die mikrofluidische Vorrichtung in einer vorteilhaften Ausgestaltung eine Vorratskammer mit Verdünnungsfluid, wobei die Vorratskammer vorzugsweise Teil der Schlaufe ist oder mit der Schlaufe fluidisch verbunden ist. Dies hat den Vorteil, dass Verdünnungsfluid örtlich und mengenmäßig wohldefiniert in der Vorrichtung vorgelagert werden kann.
In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung der Erfindung weist die Separationskammer einen Probeneingang zum Einleiten der Probe in die Separationskammer und einen Schlaufeneingang zum Einleiten von Verdünnungsfluid aus der Schlaufe in die Separationskammer auf. Mit anderen Worten umfasst die Separationskammer somit mindestens vier Öffnungen, nämlich den Probeneingang, den Schlaufeneingang, den Schlaufenausgang und den Partikelausgang. Somit erfolgt die Verdünnung der Probe durch das Verdünnungsfluid in der Separationskammer. Vorzugsweise sind dabei der Probeneingang und den Schlaufeneingang in einem ersten Bereich der Separationskammer und der Schlaufenausgang und der Partikelausgang in einem davon räumlich getrennten zweiten Bereich der Separationskammer angeordnet. Vorzugsweise ist ein zwischen dem ersten Bereich und dem zweiten Bereich angeordneter dritter Bereich ein Bereich, in welchem die Separation der Partikel stattfindet, als im Falle einer oben genannten Flusszelle der Bereich, in welchem die Dielektrophorese stattfindet. Dies hat den Vorteil, dass eine Vermischung der Probe mit der Verdünnungsflüssigkeit wohldefiniert vor der Separation stattfinden kann.
Alternativ oder zusätzlich kann die Schlaufe mit einem Kanal zum Einleiten der Probe in die Separationskammer fluidisch verbunden sein, um ein Vermischen der Probe mit dem Verdünnungsfluid vor dem Einleiten der Probe in die Separationskammer zu ermöglichen. Dies bewirkt vorteilhafterweise eine Sicherstellung einer Verdünnung der Probe vor der Separation. In diesem Fall kann in einer weiteren Ausgestaltung auf den Schlaufeneingang verzichtet werden, da die mit Verdünnungsfluid vermischte Probe über den Kanal und über den Probeneingang in die Separationskammer eintreten kann.
In einer besonders bevorzugten Weiterbildung der Erfindung weist die mikrofluidische Schlaufe einen Ausgang auf, über welchen durch den Filter ausfiltrierte Teile, insbesondere ausfiltrierte Zellen, des mit der Probe vermischten Verdünnungsfluids entfernt werden können. Dies hat den Vorteil, dass der Filter freigehalten werden kann. Beispielsweise ist dieser Ausgang mit einer Kammer für Abfälle verbunden.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung umfasst die mikrofluidische Schlaufe eine Pumpeinrichtung. Damit kann vorteilhafterweise das Zirkulieren von Verdünnungsfluid in der Schlaufe unterstützt werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zum Separierung von Partikeln einer Probe, insbesondere von Zellen oder Nukleinsäuren einer biologischen Probe, welches vorzugsweise mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung durchgeführt werden kann. Dabei wird die Probe mit einem Verdünnungsfluid vor der Separierung in der Vorrichtung vermischt und das mit der Probe vermischte Verdünnungsfluid nach der Separierung durch den Filter der mikrofluidischen Schlaufe für eine erneute Verwendung des Verdünnungsfluids gefiltert.
Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auch auf die oben ausgeführten Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwiesen.
Figurenliste
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen schematisch dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert. Für die in den verschiedenen Figuren dargestellten und ähnlich wirkenden Elemente werden gleiche Bezugszeichen verwendet, wobei auf eine wiederholte Beschreibung der Elemente verzichtet wird.
Es zeigen

1 ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung und
2 ein Flussdiagramm eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Ausführungsformen der Erfindung
1 zeigt ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen mikrofluidischen Vorrichtung 100. Beispielsweise zeigt 1 einen Ausschnitt einer mikrofluidischen Kartusche 100 zur Separierung von zirkulierenden Tumorzellen aus einer Vollblutprobe. Die Vorrichtung 100 umfasst eine Separationskammer 110, welche über einen Probeneingang 111 fluidisch mit einer Probenkammer 120 verbunden ist. Die Probenkammer 120 kann dabei beispielsweise eine nicht vorbearbeitete Probe oder eine bereits vorbearbeitete, insbesondere filtrierte Probe, umfassen. Beispielsweise umfasst die Probenkammer 120 eine Probe 10 mit weißen Blutkörperchen und Tumorzellen. Bei der Separationskammer 110 kann es sich insbesondere um eine Flusszelle handeln, in welcher über Dielektrophorese die Tumorzellen von den weißen Blutkörperchen getrennt werden und über einen Partikelausgang 113 aus der Separationskammer 110 befördert werden können.
Die Separationskammer 110 ist mit einer mikrofluidischen Schlaufe 200 fluidisch verbunden, wobei die Schlaufe 200 Verdünnungsfluid 210 zum Verdünnen der Probe 10 umfasst. Wie in 1 dargestellt, ist die Separationskammer 110 an zwei Stellen mit der Schlaufe 200 fluidisch verbunden. Über eine als Schlaufeneingang 112 bezeichnete Öffnung 112 kann Verdünnungsfluid 210 aus der Schlaufe 200 in die Separationskammer 110 eintreten. Über einen als Schlaufenausgang 114 bezeichnete Öffnung 114 kann die verdünnte und von Partikeln separierte Probe 10 in die mikrofluidische Schlaufe 200 eintreten. Alternativ oder zusätzlich kann die Schlaufe 200 mit einem Kanal 250 zum Einleiten der Probe 10 in die Separationskammer 110 fluidisch verbunden ist, um ein Vermischen der Probe 10 mit dem Verdünnungsfluid 210 vor dem Einleiten der Probe 10 in die Separationskammer 110 zu ermöglichen. Jede dieser Öffnungen 111, 112, 113, 114 kann in besonderen Ausgestaltungen der Erfindungen Ventile zur Kontrolle zum Verschließen umfassen.
Die Schlaufe umfasst eine Filterkammer 220 mit einem Filter 221 zum Filtrieren der über den Schlaufenausgang 114 in die Schlaufe 200 eingetretenen verdünnten Probe 10. Der Filter 221, beispielsweise ein Silikafilter mit angepasster Porengröße, dient dabei insbesondere zum Ausfiltern der in Probe 10 enthaltenen Zellen, in diesem Beispiel der weißen Blutkörperchen, welche über einen Ausgang 222 der Filterkammer 220 abgeführt werden können. Bei der gefilterten verdünnten Probe 10 handelt es sich dann wieder um Verdünnungsfluid 210, welches über die Schlaufe 200 zum Verdünnen weiterer Probe 10 zurückgeführt werden kann. Die Schlaufe 200 kann zum Unterstützen der Zirkulation eine Pumpe 231 beispielsweise in einer Pumpkammer 230 der Schlaufe 200 umfassen. Die Pumpe 231, beispielsweise eine Membranpumpe, kann dabei durch Fluidik oder Mechanik der Vorrichtung 100 oder durch extern einwirkende Aktuation betrieben werden. Das Verdünnungsfluid 210 kann in der Schlaufe 200 und/oder in einer Vorratskammer 240 der Schlaufe 200 vorgelagert sein. Als Verdünnungsfluid eignet sich für biologische Proben insbesondere eine biologische Pufferlösung wie beispielsweise eine phosphatgepufferte Salzlösung. Die Vorrichtung 100 mit den beschriebenen Kammern und insbesondere der Schlaufe kann dabei wie in der Mikrofluidik üblich aus Kunststoff gefertigt sein, beispielsweise mit Polycarbonaten im Spritzgussverfahren.
2 zeigt ein Ablaufdiagramm 600 zu einem Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens, welches beispielsweise mit dem oben beschriebenen Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Vorrichtung 100 durchgeführt werden kann. Dabei wird die Probe 10 in einem ersten Schritt 601 mit dem Verdünnungsfluid 210 vor der Separierung in der Vorrichtung 100 vermischt. Anschließend wird das mit der Probe 10 vermischte Verdünnungsfluid 210 nach der Separierung in der Separationskammer 110 in einem zweiten Schritt 602 durch den Filter 221 der mikrofluidischen Schlaufe 200 für eine erneute Verwendung des Verdünnungsfluids 210 gefiltert.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2016/0209299 A1 [0001]
WO 2017/181186 A1 [0001]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Salmanzadeh et al., „Isolation of rare cancer cells from blood cells using dielectrophoresis,“ 2012 Annual International Conference ofthe IEEE Engineering in Medicine and Biology Society, San Diego, CA, 2012, pp. 590-593, doi: 10.1109/EMBC.2012.6346000 [0003]

Claims

Mikrofluidische Vorrichtung (100) zur Separierung von Partikeln einer Probe (10), insbesondere von Zellen oder Nukleinsäuren einer biologischen Probe (10), umfassend eine Separationskammer (110) zur Separierung der Partikel aus der Probe (10), dadurch gekennzeichnet, dass die Separationskammer (10) mit einer mikrofluidischen Schlaufe (200) fluidisch verbunden ist, wobei die Schlaufe (200) Verdünnungsfluid (210) zum Verdünnen der Probe (10) umfasst und wobei die Separationskammer (110) einen Partikelausgang (113) für eine Ableitung der separierten Partikel und einen Schlaufenausgang (114) in die mikrofluidische Schlaufe (200) zu einem Filter (221) der Schlaufe (200) für ein Filtrieren des mit der Probe (10) vermischten Verdünnungsfluids (210) aufweist.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung (100), insbesondere die mikrofluidische Schlaufe (200), eine Vorratskammer (240) mit Verdünnungsfluid (210) umfasst.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Separationskammer (110) einen Probeneingang (111) zum Einleiten der Probe in die Separationskammer (110) und einen Schlaufeneingang (112) zum Einleiten von Verdünnungsfluid (210) aus der Schlaufe (200) in die Separationskammer (110) aufweist.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schlaufe (200) mit einem Kanal (250) zum Einleiten der Probe (10) in die Separationskammer (110) fluidisch verbunden ist, um ein Vermischen der Probe (10) mit dem Verdünnungsfluid (210) vor dem Einleiten der Probe (10) in die Separationskammer (110) zu ermöglichen.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mikrofluidische Schlaufe (200) einen Ausgang (222) zur Entfernung von über den Filter (221) ausfiltrierten Teilen, insbesondere von ausfiltrierten Zellen, des mit der Probe (10) vermischten Verdünnungsfluids (210) aufweist.
Mikrofluidische Vorrichtung (100) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mikrofluidische Schlaufe (200) eine Pumpeinrichtung (231) umfasst.
Verfahren (600) zum Separierung von Partikeln einer Probe (10), insbesondere von Zellen oder Nukleinsäuren einer biologischen Probe (10), durch eine Separationskammer (110) einer mikrofluidischen Vorrichtung (100), wobei die Probe (10) mit einem Verdünnungsfluid (210) vor der Separierung in der Vorrichtung (100) vermischt wird, wobei das mit der Probe (10) vermischte Verdünnungsfluid (210) nach der Separierung durch einen Filter (221) einer mikrofluidischen Schlaufe (200) der Vorrichtung (100) für eine erneute Verwendung des Verdünnungsfluids (210) gefiltert wird.